CN110004243B - 一种基于微滴数字pcr定量检测红薯成分的试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于微滴数字PCR定量检测红薯成分的试剂盒及其应用，属于分子生物学检测领域。基于微滴数字PCR定量检测红薯成分的试剂盒，包括BETA‑AMY基因的上游引物、β‑AMY基因的下游引物和β‑AMY基因的探针；所述试剂盒在定量检测样品中红薯成分的应用。红薯成分定量检测的微滴数字PCR方法，利用数字PCR系统探测红薯特异性单拷贝物种基因β‑AMY荧光信号，测得的红薯特异性单拷贝物种基因β‑AMY拷贝数浓度，根据拷贝数浓度(拷贝数/μL)与红薯质量(mg)的线性关系计算得到红薯成分的含量。本发明可对红薯成分进行特异性定量检测，具有简便、快速，检测灵敏度高的特点。

Description

一种基于微滴数字PCR定量检测红薯成分的试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，尤其涉及一种基于微滴数字PCR定量检测红薯成分的试剂盒及其应用。

背景技术

红薯富含淀粉，红薯淀粉是农作物中营养种类多的食品之一。但目前市场上也存在两方面的问题：一方面是红薯加工过程中混入掺杂其他来源，如木薯、玉米淀粉等低价值淀粉，另一方面在一些成本相对较高的淀粉如马蹄淀粉中掺入价格较低的红薯淀粉。

现有技术中，测定红薯源成分的方法有普通生物显微镜、扫描电镜、激光粒度分析、快速黏度分析和小角X射线散射(SAXS)、实时荧光PCR技术。但是上述技术在用于混合样品中红薯源成分的定量检测时，检测效果并不理想。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于微滴数字PCR定量检测红薯成分的试剂盒及其应用，以实现红薯源成分的特异性定量检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于微滴数字PCR定量检测红薯成分的试剂盒，包括β-AMY基因的上游引物、β-AMY基因的下游引物和β-AMY基因的探针；

所述β-AMY基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述β-AMY基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述β-AMY基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

优选的，所述试剂盒还包括2×ddPCR^TM预混液。

本发明还提供了上述方案所述的试剂盒在定量检测样品中红薯成分中的应用。

优选的，所述定量检测红薯成分的方法，包括以下步骤：

1)提取系列梯度质量的红薯的基因组DNA；

2)以步骤1)中红薯基因组DNA为扩增模板，基于微滴式数字PCR扩增β-AMY基因；

3)读取和分析步骤2)中微滴式数字PCR反应扩增结果，得到β-AMY基因的拷贝浓度；

4)建立红薯质量与β-AMY基因的拷贝浓度的线性关系；

5)采用微滴式数字PCR反应扩增样品中β-AMY基因，读取和分析微滴式数字PCR反应扩增结果，得到样品的β-AMY基因的拷贝浓度；

6)将待测样品的β-AMY基因的拷贝浓度代入步骤4)中得到的线性关系中换算，得到样品中红薯成分的含量；

所述步骤1)～4)和步骤5)之间没有时间顺序限制。

优选的，步骤2)和步骤5)中所述微滴式数字PCR的反应体系如下：2×ddPCR^TM预混液10μL、10μmol/μL的上游引物0.5μL、10μmol/μL的下游引物浓度0.5μL、10μmol/μL探针0.5μL，扩增模板2μL，补水至20μL。

优选的，步骤2)中所述微滴式数字PCR的反应程序如下：95℃，5min，1℃/s；94℃，15s，1℃/s，60℃，1min，1℃/s，共40个循环；98℃，10min，1℃/s。

优选的，步骤1)中红薯基因组DNA的提取方法包括试剂盒法和CTAB法。

优选的，步骤1)中红薯的系列梯度质量包括5mg、15mg、30mg、40mg和50mg。

优选的，步骤4)中红薯质量与β-AMY基因的拷贝数浓度的线性关系为y＝19.596x-21.83，R²＝0.9807；其中y表示β-AMY基因的拷贝数浓度，单位为拷贝数/μL；x表示红薯的质量，单位为mg。

优选的，所述样品包括饲料或食品。

本发明的有益效果：本发明提供的一种基于微滴数字PCR定量检测红薯成分的试剂盒，是以红薯基因组单拷贝基因β-AMY基因为检测对象，设计特异的引物和探针，建立基于微滴式数字PCR定量方法扩增长度105bp的β-AMY基因，从而实现对红薯成分的特异性定量检测。实施例1的红薯成分的特异性实验表明，采用本发明提供的引物探针对红薯、紫薯、木薯、马铃薯、耦、芋头、碗豆、高梁、胡萝卜、蕃茄、大米、大豆和大麦作物等样品进行检测，仅对红薯和紫薯(红薯的一种)样品有特异的检出，说明本发明的检测试剂盒具有良好的特异性。

本发明提供了所述的试剂盒在定量检测样品中红薯成分的应用，所述定量检测样品中红薯成分的应用是基于微滴式数字PCR定量方法，操作步骤简便，并且能够快速获得检测结果。同时，本发明提供的应用，对于质量百分比5％和25％样本进行定量检测，检测结果红薯含量分别为4.15％和21.33％，回收率分别为83.06％和85.31％，三个平行之间的RSD值在6.33％～6.95％之间。这说明本发明的方法可对质量百分比为5％及以上的红薯成分进行准确定量，适用范围广且检测灵敏度较高。

附图说明

图1为实施例1中的特异性测试图；

图2为实施例2中红薯质量与拷贝数浓度线性关系；

图3为实施例3中红薯DNA浓度拷贝数测试结果热点图；

图4为实施例3中红薯DNA浓度梯度LOD测试热点图；

图5为实施例3中红薯DNA浓度梯度LOQ测试热点图；

图6为实施例4中红薯模拟样品测试结果热点图。

具体实施方式

本发明提供了一种基于微滴数字PCR定量检测红薯成分的试剂盒，包括β-AMY基因的上游引物、β-AMY基因的下游引物和β-AMY基因的探针；

所述β-AMY基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述β-AMY基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述β-AMY基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

在本发明中，所述上游引物、下游引物和探针依据红薯成分基因组单拷贝基因-红薯β-淀粉酶基因(Ipomoea batatas beta-amylase gene)设计获得；所述β-AMY基因的上游引物、下游引物和探针的来源没有特殊限制，委托本领域所熟知的基因合成公司即可；所述上游引物和下游引物扩增β-AMY基因的长度为105bp

(attaatgcacttttaaaggcggaccatggtccatgggtacacagtagaaggattgtcattttcctgttatatcaatcattcccttaatggacggtattgggaggg，SEQ ID No.4)；所述探针的5’端连接有一个荧光报告基团FAM，所述探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1。

本发明中，所述试剂盒优选的还包括2×ddPCR^TM预混液。本发明对所述2×ddPCR^TM预混液的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的适用于微滴式数字PCR的来源即可。在本发明实施例中，所述2×ddPCRT^M预混液购自伯乐公司。

本发明还提供了上述方案所述的试剂盒在定量检测样品中红薯成分的应用。

在本发明中，所述定量检测红薯成分的方法，优选包括以下步骤：

1)提取系列梯度质量的红薯的基因组DNA；

2)以步骤1)中红薯基因组DNA为扩增模板，基于微滴式数字PCR扩增β-AMY基因；

3)读取和分析步骤2)中微滴式数字PCR反应扩增结果，得到BETA-AMY基因的拷贝浓度；

4)建立红薯质量与β-AMY基因的拷贝浓度的线性关系；

5)采用微滴式数字PCR反应扩增样品中β-AMY基因，读取和分析微滴式数字PCR反应扩增结果，得到样品的β-AMY基因的拷贝浓度；

6)将待测样品的β-AMY基因的拷贝浓度代入步骤4)中得到的线性关系中换算，得到样品中红薯成分的含量；

所述步骤1)～4)和步骤5)之间没有时间顺序限制。

在本发明中，红薯基因组DNA的提取方法优选包括试剂盒法和CTAB法；所述试剂盒法中所用的试剂盒优选为Wizard Genomic DNA purification kit(Promega，A1120)。所述CTAB法为本领域常规的CTAB法即可。

在本发明中，所述红薯的系列梯度质量优选的包括5mg、15mg、30mg、40mg和50mg。本发明对所述红薯的品种和来源没有特殊限制，本领域所熟知的红薯品种和常见来源均可适用本发明提供的应用。

在本发明中，以红薯基因组DNA为扩增模板，基于微滴式数字PCR扩增β-AMY基因。

在本发明中，所述微滴式数字PCR的反应体系优选如下：2×ddPCR^TM预混液10μL、10μmol/μL的上游引物0.5μL、10μmol/μL的下游引物浓度0.5μL、10μmol/μL探针0.5μL，扩增模板2μL，补水至20μL。配制得到20μL的反应体系后，将20μL的反应体系和70μL微滴生成油加入微滴生成卡槽中，盖上胶垫后放入微滴生成仪中进行微滴生成，待微滴生成结束后用单通道电动移液枪将生成的微滴全部转移至96孔板中，封膜后置于热循环仪中进行PCR反应。所述微滴式数字PCR的反应程序如下：95℃，5min，1℃/s；94℃，15s，1℃/s，60℃，1min，1℃/s，共40个循环；98℃，10min，1℃/s。微滴式数字PCR扩增是通过将常规的PCR反应体系分隔成大量微滴扩增体系。将分隔后的PCR反应体系进行扩增后，逐一检查每一个小的反应体系中是否产生阳性荧光信号。通过泊松分布得到的微反应中的拷贝数。所述微滴数字PCR数据读取方法优选具有如下：扩增结束后将96孔板置于微滴分析仪中读取荧光信号，并用QuantaSoft V1.3.2软件分析实验数据。

在本发明中，红薯质量与β-AMY基因的拷贝浓度的线性关系为y＝19.596x-21.83，R2＝0.9807；其中y表示β-AMY基因的拷贝数浓度，单位为拷贝数/μL；x表示红薯的质量，单位为mg。

在本发明中，所述样品包括含有红薯成分的物质，优选包括饲料或食品。

在本发明中，所述定量检测红薯成分过程中质量控制包括有效微反应数的控制和空白对照的质量控制。有效微反应数的控制是在数字PCR体系分割过程中产生的有效微反应的总数量不得低于平台理论数的60％(即12000个)；所述空白对照的质量控制是数字PCR空白对照理论检测结果应为零。但在实际检测中，允许有极少量阳性体系数出现。空白对照中阳性微反应体系数应小于实际有效体系数的0.03％。以上质控条件中有一项不符合者，实验结果应放弃，并重新进行数字PCR实验；所述定量检测红薯成分过程中性能指标是指对梯度浓度的DNA样品进行数字PCR定量检测其拷贝数，每个浓度设置10个平行，计算各浓度平行检测结果的RSD值。以RSD≤25％作为有效定量数据的判断依据，定量检测限LOQ为检测结果RSD≤25％时的最低拷贝数浓度。LOD为10个平行中不少于9个能检出的最低拷贝数浓度。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1特异性试验

从红薯、紫薯、木薯、马铃薯、耦、芋头、碗豆、高梁、胡萝卜、蕃茄、大米、大豆和大麦作物提取DNA中提取基因组DNA，采用所述β-AMY基因的上游引物(attaatgcac ttttaaaggcggac，SEQ ID No.1)、β-AMY基因的下游引物(ccctcccaat accgtccatt，SEQ ID No.2)和β-AMY基因的探针(tgggtacaca gtagaaggat tgtcattttc c，SEQ ID No.3)进行荧光定量PCR扩增。所述荧光定量PCR的反应程序如下：95℃，5min，1℃/s；94℃，15s，1℃/s，60℃，1min，1℃/s，共40个循环；98℃，10min，1℃/s。

上述13种作物中只有红薯和紫薯样品有特异的检出(有典型的S形扩增曲线的为红薯和紫薯)，其中紫薯是红薯的一种，其他作物均无检出(见图1)。这表明本发明设计的引物探针特异于红薯的检测，物异性良好。

实施例2红薯质量(mg)与拷贝数浓度(copies/μL)的线性关系

称取梯度质量红薯粉样品5mg，15mg，30mg，40mg，50mg，采用Wizard Genomic DNApurification kit(Promega，A1120)提取基因组DNA，采用20μL数字PCR反应体系(2×ddPCRTM预混液10μL；浓度为10μmol/μL的引物各0.8μL，浓度为10μmol/μL的探针0.4μL，DNA模板2μL，补水至20μL。ddPCR反应条件为：95℃，5min(1℃/s)；94℃，15s(1℃/s)，60℃，1min(1℃/s)，共40个循环；98℃，10min(1℃/s)，12℃保存反应产物。)

获得的数据如表1，建立红薯质量(mg)与拷贝数浓度(拷贝数/μL)线性关系数据如图2。红薯质量与β-AMY基因的拷贝浓度的线性关系为y＝19.596x-21.83，R2＝0.9807；其中y表示β-AMY基因的拷贝浓度，单位为拷贝数/μL；x表示红薯的质量，单位为mg。

表1红薯质量(mg)与拷贝数浓度(拷贝数/μL)线性关系数据

实施例3红薯DNA浓度检测的LOD和LOQ测定

采用DNA浓度梯度为34，6.8，1.36，0.27和0.09ng/μL，每个梯度设三个平行，数据如表2和图3，由表3可知，LOQ为10个平行均可检出且其平行实验的拷贝数浓度的RSD小于25％，为2.77拷贝/μL。

LOD以10个平行中不少于9个能检出的最低拷贝数浓度。红薯DNA浓度梯度LOD、LOQ测试结果参见表3、图4和图5。由表3可知LOD为10个平行均能检测出来的最低拷贝数浓度为0.81拷贝/μL。

表2红薯DNA浓度拷贝数测试结果

表3红薯DNA浓度梯度LOD、LOQ测试结果

实施例4模拟样品检测

供试样本：以大豆粉为基质，在其中掺入质量百分比为1％、5％和25％红薯粉，用

试管研磨机进行混匀，制备混合样各10g。每个样品称取3个平行，每个平行50mg，分别进行基因组DNA提取，每个称样平行分别进行1个平行的ddPCR。检测结果见图6。以回收率和RSD评价本方法的准确度和精密度，以回收率在80～120％和RSD≤25％作为质量百分比定量数据的评价标准。

图6中，B01、C01、D01为红薯质量百分比1％的样本，E01、F01、G01为质量百分比5％的样本，H01、B1、B02为质量百分比25％的样本，数据如表4。

表4质量百分比测试结果

经过线性关系换算结果可知，对于质量百分比分别5％和25％样本，在ddPCR检测结果分别为4.15％和21.33％，回收率分别83.06％和85.31％，三个平行之间的RSD值在6.33％～6.95％之间。根据评价标准，本方法可对质量百分比为5％及以上的红薯成分进行准确定量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 一种基于微滴数字PCR定量检测红薯成分的试剂盒及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

attaatgcac ttttaaaggc ggac 24

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ccctcccaat accgtccatt 20

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgggtacaca gtagaaggat tgtcattttc c 31

<210> 4

<211> 105

<212> DNA

<213> 红薯( sweet potato)

<400> 4

attaatgcac ttttaaaggc ggaccatggt ccatgggtac acagtagaag gattgtcatt 60

ttcctgttat atcaatcatt cccttaatgg acggtattgg gaggg 105

Claims (10)

1.一种基于微滴数字PCR定量检测红薯成分的试剂盒，其特征在于，包括β-AMY基因的上游引物、β-AMY基因的下游引物和β-AMY基因的探针；

所述β-AMY基因的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述β-AMY基因的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述β-AMY基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2×ddPCR^TM预混液。

3.权利要求1或2所述的试剂盒在定量检测样品中红薯成分中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述定量检测红薯成分的方法，包括以下步骤：

1)提取系列梯度质量的红薯的基因组DNA；

2)以步骤1)中红薯基因组DNA为扩增模板，基于微滴式数字PCR扩增β-AMY基因；

3)读取和分析步骤2)中微滴式数字PCR反应扩增结果，得到β-AMY基因的拷贝浓度；

4)建立红薯质量与β-AMY基因的拷贝浓度的线性关系；

5)采用微滴式数字PCR反应扩增样品中β-AMY基因，读取和分析微滴式数字PCR反应扩增结果，得到样品的β-AMY基因的拷贝浓度；

6)将待测样品的β-AMY基因的拷贝浓度代入步骤4)中得到的线性关系中换算，得到样品中红薯成分的含量；

所述步骤1)～4)和步骤5)之间没有时间顺序限制。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)和步骤5)中所述微滴式数字PCR的反应体系如下：2×ddPCR^TM预混液10μL、10μmol/μL的上游引物0.5μL、10μmol/μL的下游引物浓度0.5μL、10μmol/μL探针0.5μL，扩增模板2μL，补水至20μL。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2)中所述微滴式数字PCR的反应程序如下：95℃，5min，1℃/s；94℃，15s，1℃/s，60℃，1min，1℃/s，共40个循环；98℃，10min，1℃/s。

7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤1)中红薯基因组DNA的提取方法包括试剂盒法和CTAB法。

8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤1)中红薯的系列梯度质量包括5mg、15mg、30mg、40mg和50mg。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤4)中红薯质量与β-AMY基因的拷贝浓度的线性关系为y＝19.596x-21.83，R²＝0.9807；其中y表示β-AMY基因的拷贝浓度，单位为拷贝数/μL；x表示红薯的质量，单位为mg。

10.根据权利要求3～9任意一项所述的应用，其特征在于，所述样品包括饲料或食品。

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