CN107488707A

CN107488707A - 用于貉源性成分数字pcr精准定量检测的引物探针及方法和试剂盒

Info

Publication number: CN107488707A
Application number: CN201610408967.2A
Authority: CN
Inventors: 陈颖; 黄文胜; 吴亚君; 葛毅强; 任君安; 邓婷婷
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2016-06-12
Filing date: 2016-06-12
Publication date: 2017-12-19

Abstract

本发明涉及用于貉源性成分精准定量的寡核苷酸引物与探针。本发明还涉及用于测定貉源性成分的数字PCR检测方法，所述方法包括使用针对貉源性成分的单拷贝核基因的特异性寡核苷酸引物和探针。本发明还涉及用于精准定量检测貉源性成分的数字PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括用于数字PCR检测貉源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针。本发明还涉及针对貉源性成分的单拷贝持家基因的特异性寡核苷酸引物和探针在精准定量检测貉源性成分基因拷贝数中的应用。本发明还涉及针对貉源性成分的单拷贝持家基因的特异性寡核苷酸引物和探针在精准定量检测貉源性成分绝对质量分数中的应用。使用本发明的数字PCR定量检测方法和试剂盒，能够特异、灵敏、精准地测定鲜肉及初加工肉制品中貉源性成分含量。

Description

用于貉源性成分数字PCR精准定量检测的引物探针及方法和试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于貉源性成分定量检测的寡核苷酸引物和探针，用于测定貉源性成分的数字PCR检测方法，用于精准定量貉源性成分的数字PCR检测试剂盒以及貉源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针在检测样品中貉源性成分中的应用。

背景技术

肉及其制品营养丰富，蛋白质含量约为10%-20%，畜肉中含丰富的B族维生素，禽肉中不饱和脂肪酸含量较高，如人体必需的亚油酸，约占总脂肪含量的20%。全国范围内肉制品的产量和消费量持续升高，2013年我国成为全球肉类生产第一大国，年产量达8536万吨，伴随而来的是近年来肉制品的掺假掺杂事件频繁发生。2013年，我国部分地区开展了肉及其制品的掺假情况调查，结果显示有25.6%的样品与标识不符，肉制品掺假情况较明显，熟制牛肉和食用羊肉卷是肉类掺假高危品。而貉肉本身也是一种肉质鲜美高级滋补营养野味食品，细嫩鲜美、营养丰富、滋补身体，还可入药，其胆、睾丸是名贵中药材。有些不法商家将其他肉代替貉肉进行销售，或者将貉肉掺入其他肉中冒充牛羊肉。以上肉制品掺假事件严重干扰了我国的肉业生产，不仅成为制约肉品质量提升的主要因素，而且严重损害了消费者的经济利益和知情权，甚至涉及宗教信仰等问题。

然而，目前基于肉类的检测方法基本上都是定性和半定量检测，国家相关标准也只能进行成分的定性检测，无法进行精准定量检测。虽然目前质监、食药监等部门下属的很多实验室均具备一定的肉类DNA鉴定技术，但只能确定“掺假肉”中掺了哪些肉类，而不能判断其掺杂肉的含量。因此很难判断掺杂肉是故意添加还是无意污染，导致难以判定违法厂商的责任，使不少不法商贩得以逃脱惩罚。

目前，肉类定性或半定量检测常采用实时荧光PCR技术，这种技术可以通过Ct值与模板量建立标准曲线，并以此初步确定模板中目标基因的拷贝数。但是，利用实时荧光PCR技术对肉类成分定量检测存在以下问题：（1）每次进行检测操作都需要同时进行已知浓度标准品的扩增并制作标准曲线，提高了检测成本且工作量过大；（2）标准品与实际样品PCR扩增效率的差别可能会引起定量结果产生偏差；（3）通过标准曲线得到了模板拷贝数的准确度存在一定误差。因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高、准确度高的貉源性成分的检测方法和定量方法，进行食品中貉源性成分的检测。

数字PCR(digital polymerase chain reaction, dPCR)是在荧光PCR基础上发展起来的基因绝对拷贝数定量技术，它可以实现单分子DNA的绝对定量，并且它具有测量独立性，无需任何校准物，解决了实时荧光PCR需要Ct值和标准曲线确定拷贝数而产生的结果不准确等问题。目前，该技术已初步应用于肉类产品的定量检测。随着我国对肉类掺假检验能力需求的日益强烈，dPCR 技术的出现为肉类成分定量检测开辟了新的途径，使得食品中肉类成分的定量分析与溯源成为可能。利用dPCR技术提升定量检测方法的准确性与实用价值将成为肉类食品精准定量检测技术发展的一个重要方向。

因此，本领域需要一种快速、特异性好、灵敏度高的貉源性成分的检测方法，能够定量检测貉肉、肉肠、肉卷、肉罐头等样品中貉源性成分含量。

发明内容

本发明的一个目的在于，提供精准定量貉源性成分的特异性寡核苷酸引物和荧光标记探针。

本发明的另一个目的在于，提供精准定量貉源性成分的数字PCR检测方法。

本发明的另一个目的在于，提供精准定量貉源性成分的数字PCR定量检测试剂盒。

本发明的还一个目的在于，提供貉源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针在精准定量检测貉源性成分中的应用。

针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明的发明人根据貉单拷贝持家基因F2基因（chromosomal coagulation factorII, F2基因，染色体凝血因子II基因）设计了能特异性鉴别貉源性成分的寡核苷酸引物对和探针，能从样品DNA中高效特异扩增出一段较短的貉特异性基因片段。根据本发明的一个实施方案，本发明提供用于数字PCR方法精准定量检测貉源性成分的特异性寡核苷酸引物对和荧光标记探针，所述引物对和探针是根据F2基因序列在不同物种中具有差异性的特点而设计的。所述引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物为Racoon Dog-F：TTGACTCCCAGGGCAGTCTCAG（SEQ ID No.1），所述下游引物为Racoon Dog-R：GAGCCTAATGTGCCCTCCATG（SEQ ID No.2）；所述探针为Racoon Dog-P：TAGCGCCACCTTCAGCCCAGGGC（SEQ ID No.3），在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在一个实施方案中，本发明提供的貉源性成分的特异性检测组合物，所述组合物包含特异性寡核苷酸引物对和探针。在一个优选的实施方案中，本发明提供了用于数字PCR方法定量检测貉源性成分的组合物，所述组合物包含貉肉特异性寡核苷酸引物对和探针，其中所述貉特异性引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

根据本发明的另一个实施方案，本发明提供貉源性成分的数字PCR定量检测方法，所述方法包括使用针对貉源性成分的特异性寡核苷酸引物对和探针，所述引物对和探针是根据F2基因序列在不同物种中具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，本发明的貉源性成分的数字PCR定量检测方法中，所使用的貉特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQID No.2；所述探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在一个实施方案中，所述的PCR扩增条件为95℃，5min（1℃/s）；95℃15 s，60℃1 min（1℃/s），共50个循环；98℃10 min（1℃/s）。

根据本发明的另一个实施方案，本发明提供用于精准定量检测貉源性成分的试剂盒，所述试剂盒包括本发明用于数字PCR方法检测貉源性成分的特异性寡核苷酸引物对以及探针和使用说明书。在本发明的试剂盒优选实施方案中，本发明的貉源性成分定量检测特异性寡核苷酸引物对是根据F2基因序列在不同物种中具有差异性的特点而设计的。在一个实施方案中，所述试剂盒的貉特异性寡核苷酸引物对由上游引物和下游引物组成，所述上游引物的碱基序列为SEQ ID No.1，所述下游引物的碱基序列为SEQ ID No.2；所述试剂盒中探针的碱基序列为SEQ ID No.3，在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。根据本发明的另一个实施方案，本发明提供用于精准定量检测貉源性成分的试剂盒，所述试剂盒包括本发明的用于数字PCR方法鉴别貉源性成分的特异性寡核苷酸引物对和探针以及使用说明书。在试剂盒的一个优选实施方案中，所述试剂盒中包含貉特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1、SEQ ID No.2和貉特异性探针SEQ ID No.3，在貉F2基因探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于快速定量检测貉源性成分的数字PCR扩增条件的描述。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的说明书中给出的PCR扩增条件是95℃，5 min；95℃15 s，60℃1 min（1℃/s），共50个循环；98℃10 min（1℃/s）。在一个具体的实施方案中，本发明用于貉源性成分定量检测的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阴性对照品和阳性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。

根据本发明的再一个实施方案，本发明提供本发明的用于数字PCR方法检测貉源性成分的特异性寡核苷酸引物和探针在检测样品中貉源性成分中的应用。在一个优选的实施方案中，本发明提供样品中貉源性成分的特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2 和特异性探针SEQ ID No.3，在貉F2基因探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。在另一个实施方案中，本发明还提供本发明的试剂盒在定量检测样品中貉源性成分的应用。优选地，在本发明的上述应用中，所述方法包括本发明的貉特异性寡核苷酸引物对和探针。更优选的，在本发明的上述应用中，所述试剂盒包括本发明的貉特异性寡核苷酸引物对和探针在检测貉源性成分中的应用。

本发明以貉DNA为检测基础，根据F2基因序列在不同物种中具有差异性的特点，比对分析了貉F2基因序列。根据这些序列设计引物，利用数字PCR法定量检测样品中的貉源性成分。

数字PCR技术(digital polymerase chain reaction，dPCR)是通过将微量样品分级作大倍数稀释和细分，直至每个细分试样中所含有的待测分子数不会超过1个后，再将所有细分试样同时在相同条件下进行PCR 放大，按照泊松分布原理逐个进行计数的一种技术，是一种绝对定量测量方法。从而可定量检测数字PCR中貉源性成分。

本发明的方法巧妙地运用了PCR技术的DNA高效扩增、核酸杂交的特异性和荧光检测技术的快速和敏感性，具有操作简单、省时省力、结果可靠和准确灵敏等优点。本发明的按照引物序列制成的试剂盒，用于此类产品的定性、定量检测，具有灵敏度高、特异性强、结果稳定可靠且避免交叉污染造成假阳性的优点。使用本发明的PCR检测方法和PCR检测试剂盒，可用于貉源性成分定性和精准定量检测，其简单、快速、特异且灵敏的特点适合用于国内外市场上貉肉、肉肠、肉卷、肉罐头等样品中貉源性成分的定量检测。

附图说明

图1显示的是数字PCR特异性扩增貉肉F2基因的结果，其中使用特异性寡核苷酸引物对SEQ ID No.1和SEQ ID No.2及SEQ ID No.3检测，其中基线上方为貉样品的扩增曲线，基线下方为狐狸、狗、水貂、绵羊、山羊、牛、马、驴、猪、兔、鸡、鸭、鹅、大鼠、小鼠等15种样品及空白对照（无菌双蒸水）。

图2是显示数字PCR精准定量检测貉及其他肉成分的结果图，其中从左到右依次为貉肉、狗肉、狐狸肉、水貂肉、绵羊肉、山羊肉、牛肉、马肉、驴肉、猪肉、兔肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、大鼠肉、小鼠肉及空白对照（无菌双蒸水）。

图3是对数字PCR精准定量检测貉源性成分的灵敏度进行评价，将貉样品基因组DNA溶液先进行5倍稀释后再进行3个梯度的10倍稀释，图中从左至右一依次为原液稀释5倍、原液稀释10倍、原液稀释100倍、原液稀释1000倍及空白对照（无菌双蒸水）。

图4是利用本发明建立的数字PCR技术对市售肉制品进行检测的结果。从左至右依次为貉肉、肉肠、肉卷、肉罐头和空白对照（无菌双蒸水）。

具体实施方式

通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

本实施例为通过如下试验对貉的引物对和探针进行特异性评价。

本发明的发明人首次通过实时荧光PCR（探针法）检测貉F2基因序列，可以确定貉引物探针组合的特异性。反应体系为：2×TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5 μL；探针(10 μM) 0.5 μL；上、下游引物(10 μM)各1 μL；模板DNA 5 μL；加ddH₂O至总体积为25 μL。反应程序为95℃ 10 min；95℃ 15 s；60℃ 1 min，40个循环。

所使用的检测貉源性成分的引物及探针序列为：

引物序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，探针序列为SEQ ID No.3，,在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

所使用的检测主要仪器：

微量移液器(10 µL、100 µL、1000 µL，Eppendorf)、荧光定量PCR仪(ABI 7500，AppliedBiosystems)、高速台式离心机(Pico17 Thermo)等。

检测主要试剂：

氯仿、异丙醇分别购于北京六合通公司；CTAB裂解液(20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris、0.02 mol/L Na₂-EDTA)、CTAB沉淀液(5 g/L CTAB，0.04 mol/L NaCl)、1.2 mol/L NaCl均为本实验自行配制；2×TaqMan Universal PCR Master Mix购于AB公司；引物及探针由上海英潍捷基生物科技有限公司合成等。

检测主要步骤：

1 DNA提取

检测样本：(1) 貉肉、狐狸肉、狗肉、水貂肉、绵羊肉、山羊肉、牛肉、马肉、驴肉、猪肉、兔肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、大鼠肉、小鼠肉等16种样品用于特异性分析。

称取0.1 g样品至一洁净2.0 mL离心管中，加入1.5 mL CTAB裂解液，65℃ 1 h，间期上下颠倒混匀几次；8000 rpm 15 min，取1 mL上清液至1只洁净2.0 mL离心管中，加入700 μL氯仿，剧烈混匀30 s，14500 rpm 10 min，分别取650μL上清液至洁净2.0 mL离心管中，加入1300 μL CTAB沉淀液，剧烈混匀30 s，室温静置1 h；14500 rpm 10 min，弃上清液，加入350 μL 1.2 M NaCl，剧烈振荡30 s，再加入350 μL氯仿，剧烈混匀30 s，14500 rpm 10min；分别取上清液320μL，加入0.8倍体积异丙醇，混匀后，-20℃ 1 h，14500 rpm 20 min，弃上清液，加入500 μL 70%乙醇，混匀后，14500 rpm 20min，弃上清液，晾至风干，加入100μL ddH₂O溶解，4℃储存备用。

2 实时荧光PCR检测所用引物和探针

引物序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；

探针序列为SEQ ID No.3，3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

3 实时荧光PCR反应体系：

2×TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5 μL

探针(10 μM) 0.5μL

上游引物(10 μM) 1 μL

下游引物(10 μM) 1 μL

模板DNA 5μL

加ddH₂O至总体积为 25μL

注：每次PCR检测均设立相应的空白对照(用配制反应体系的超纯水代替DNA模板，检测试剂是否受到污染)；

4 实时荧光PCR反应参数：

95℃ 10 min

95℃ 15 s

60℃ 1 min

40个循环。

注：不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。

如图1所示，利用实时荧光PCR特异性检测貉的F2基因序列时，除貉样品出现典型的扩增曲线外，其它样品：狗肉、狐狸肉、水貂肉、绵羊肉、山羊肉、牛肉、马肉、驴肉、猪肉、兔肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、大鼠肉、小鼠肉等15种样品及空白对照（无菌双蒸水）均未出现扩增曲线，充分说明本实验设计的引物探针对狐狸样品特异。

实施例2

本实施例为通过如下试验，使用貉F2基因的引物对和探针，经数字PCR定量检测貉基因的拷贝数及对貉引物探针的灵敏度评价。

本发明的发明人首次通过数字PCR（探针法）检测貉F2基因序列，可以确定貉引物探针组合的特异性。反应体系为：2 × ddPCR Master Mix (Bio-Rad, USA) 10 μL；探针(10 μM) 0.5 μL；上、下游引物(10 μM)各1 μL；模板DNA 5 μL；加ddH₂O至总体积为20 μL。反应程序为95℃，5min（1℃/s）；94℃15 s，60℃1 min（1℃/s），共50个循环；98℃10 min（1℃/s）。扩增结束后，通过微滴分析仪读取貉F2基因拷贝数。

所使用的检测貉源性成分的引物及探针序列为：

所使用的检测主要仪器：

微量移液器(10 µL、100 µL、1000 µL，Eppendorf)、数字PCR仪(BIO-RAD, QX200)、高速台式离心机(Pico17 Thermo)等。

检测主要试剂：

氯仿、异丙醇分别购于北京六合通公司；CTAB裂解液(20 g/L CTAB，1.4 mol/L NaCl，0.1 mol/L Tris、0.02 mol/L Na₂-EDTA)、CTAB沉淀液(5 g/L CTAB，0.04 mol/L NaCl)、1.2 mol/L NaCl均为本实验自行配制；2×ddPCR Master Mix (Bio-Rad, USA)购于BIO-RAD公司；引物及探针由上海英潍捷基生物科技有限公司合成等。

检测主要步骤：

1 DNA提取

检测样本：(1) 貉肉、狐狸肉、狗肉、水貂肉、绵羊肉、山羊肉、牛肉、马肉、驴肉、猪肉、兔肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、大鼠肉、小鼠肉等16种样品用于特异性分析；(2)将提取的貉DNA溶液用无菌水先进行5倍稀释，再进行1倍稀释后，再进行2个梯度的10倍稀释后作为模板，用于分析引物探针组合的灵敏度。

称取0.1 g样品粉末至一洁净2.0 mL离心管中，加入1.5 mL CTAB裂解液，65℃ 1h，间期上下颠倒混匀几次；8000 rpm 15 min，取1 mL上清液至1只洁净2.0 mL离心管中，加入700 μL氯仿，剧烈混匀30 s，14500 rpm 10 min，分别取650μL上清液至洁净2.0 mL离心管中，加入1300 μL CTAB沉淀液，剧烈混匀30 s，室温静置1 h；14500 rpm 10 min，弃上清液，加入350μL 1.2 M NaCl，剧烈振荡30 s，再加入350μL氯仿，剧烈混匀30 s，14500 rpm10 min；分别取上清液320μL，加入0.8倍体积异丙醇，混匀后，-20℃ 1 h，14500 rpm 20min，弃上清液，加入500μL 70%乙醇，混匀后，14500 rpm 20min，弃上清液，晾至风干，加入100μL ddH₂O溶解，4℃储存备用。

2 数字PCR检测所用引物和探针

引物序列为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；

3 数字PCR反应体系：

2×ddPCR Master Mix 10 μL

探针(10 μM) 0.5μL

上游引物(10 μM) 1μL

下游引物(10 μM) 1μL

模板DNA 5μL

加ddH₂O至总体积为 20μL

4 数字PCR反应参数：

95℃ 5 min（1℃/s）

94℃ 15 s（1℃/s）

60℃ 1 min（1℃/s）

50个循环

98℃ 10 min（1℃/s）

注：不同仪器应将PCR各试剂及反应参数做适当调整。

如图2所示，利用数字PCR特异性检测貉的F2基因序列时，如图2所示，利用数字PCR精准定量检测貉及其他样品时，成功检测出貉肉的量为148 copies/μL，而其他样品如狗肉、狐狸肉、水貂肉、绵羊肉、山羊肉、牛肉、马肉、驴肉、猪肉、兔肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、大鼠肉、小鼠肉及空白对照均无扩增，表明该方法可准确检测貉样品的含量。

为确定貉特异性引物探针组合的灵敏度，将貉肉样品基因组DNA先进行5倍稀释，再进行1倍稀释后，再进行2个梯度的10倍稀释后作为模板，用于分析引物探针组合的灵敏度，分别按上述条件进行数字PCR扩增，结果如图3所示。原液稀释5倍、10倍、100倍及1000倍后的含量分别为1505 copies/μL、168 copies/μL、15.2 copies/μL、1.1 copies/μL，实验结果表明，表明貉源性成分精准定量检测方法的定量灵敏度在1.1 copies/μL以下。

实施例3

本实施例提供精准定量貉源性成分的试剂盒。所述试剂盒包括本发明用于数字PCR方法定量检测貉源性成分的特异性寡核苷酸引物对和探针以及使用说明书。所述试剂盒包括引物对SEQ ID No.1、SEQ ID No.2 和探针SEQ ID No.3，探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM，所述使用说明书中给出了PCR扩增条件，该条件为反应程序为95℃，5min（1℃/s）；94℃15 s，60℃1 min（1℃/s），共50个循环；98℃10min（1℃/s）。对于不同仪器，反应参数做适当调整。

为确保建立的方法具有可行性，选取3份市售样品，包括貉肉肠、肉卷、肉罐头等，与实施例1所述的方法相同，进行数字PCR检测，其中以无菌双蒸水作为试剂盒空白对照品，以貉DNA作为试剂盒阳性对照品。

如图4所示，在阴性对照无扩增，阳性对照鲜貉肉的含量为389 copies/μL时，貉肉肠、肉卷和肉罐头中貉肉含量分别为208 copies/μL和610 copies/μL和119 copies/μL，表明该方法能定量检测出貉源性成分。

实施例4

本实施例提供精准定量貉源性成分绝对质量分数的试剂盒。所述试剂盒包括本发明用于数字PCR方法定量检测貉源性成分的特异性寡核苷酸引物对和探针以及使用说明书。所述试剂盒包括引物对SEQ ID No.1、SEQ ID No.2 和探针SEQ ID No.3，探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM，所述使用说明书中给出了PCR扩增条件，该条件为反应程序为95℃，5min（1℃/s）；94℃15 s，60℃1 min（1℃/s），共50个循环；98℃10 min（1℃/s）。对于不同仪器，反应参数做适当调整。

以10 mg、110 mg、300 mg、500 mg和800 mg的貉肉分别与500 mg火鸡肉混合均匀后，与实施例2所述的方法相同，进行数字PCR检测，其中以无菌双蒸水作为试剂盒空白对照品，以貉DNA作为试剂盒阳性对照品。分别以所测得的10 mg、110 mg、300 mg、500 mg和800mg貉肉的F2基因拷贝数与测得的500 mg火鸡肉的Prolactin receptor基因的拷贝数比值做一线性关系曲线，并得到线性方程。并以此方程计算未知样品的质量。

为确保建立的方法具有可行性，选择4份市售样品，包括羊肉卷、羊肉肠、狗肉肠、狗肉汤等，取800 mg市售样品分别与500 mg火鸡肉混合，与实施例2所述的方法相同，分别进行数字PCR检测，其中以无菌双蒸水作为试剂盒空白对照品，以貉DNA作为试剂盒阳性对照品。计算市售样品与火鸡样品的基因拷贝数之比，通过得到的线性方程，计算市售样品的绝对质量。

虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明意欲涵盖落在附属权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。

Claims

1.用于数字PCR方法定量检测貉源性成分的特异性寡核苷酸引物对和探针组合物，Racoon Dog-F：TTGACTCCCAGGGCAGTCTCAG，所述下游引物为Racoon Dog-R：GAGCCTAATGTGCCCTCCATG；所述探针为Racoon Dog-P：TAGCGCCACCTTCAGCCCAGGGC。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中在探针的3’端连接有一个荧光淬灭基团BHQ1，5’端连接有一个荧光报告基团FAM。

3.通过数字PCR方法定量检测貉源性成分的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求1-2所述的引物探针组合物和使用说明书。

4.定量检测貉源性成分的数字PCR方法，所述方法包括使用权利要求1-2所述的引物探针组合物和权利要求3所述的试剂盒。

5.权利要求1-2所述的引物探针组合物和权利要求3所述的试剂盒在检测肉制品中貉源性成分的应用。