CN110408682B

CN110408682B - 利用双重数字pcr定量检测食品中赤小豆和红豆成分的方法

Info

Publication number: CN110408682B
Application number: CN201910375189.5A
Authority: CN
Inventors: 梁颖婕; 刘津; 易敏英; 刘婧文; 董洁; 高东微; 李志勇; 关丽军
Original assignee: Guangzhou Customs Technology Center
Current assignee: Guangzhou Customs Technology Center
Priority date: 2019-05-07
Filing date: 2019-05-07
Publication date: 2022-06-17
Anticipated expiration: 2039-05-07
Also published as: CN110408682A

Abstract

本发明提供了一种利用双重数字PCR定量检测食品中赤小豆和红豆成分的方法，其采用双通道检测法，利用数字PCR系统同时探测两种荧光信号，将红豆物种特异性基因序列和赤小豆红豆通用基因序列检测的探针分别标记为FAM和VIC，通过在同一PCR反应体系中测得的所述红豆物种特异性基因序列和所述赤小豆红豆通用基因序列的拷贝数浓度，计算得到红豆占赤小豆和红豆的DNA拷贝数百分比，换算得到红豆成分占赤小豆和红豆成分的质量百分比。本方法可准确、快速地为检测出红豆成分在赤小豆与红豆混合物中的质量百分比含量。

Description

利用双重数字PCR定量检测食品中赤小豆和红豆成分的方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种利用双重数字PCR定量检测食品中赤小豆和红豆成分的方法。

背景技术

赤小豆(Vigna umbellata)与红豆(Vigna angularis)同属豆科豇豆属植物，是日常饮食中常见的粗粮。中医认为赤小豆具有行血补血、健脾去湿、利水消肿之效，是《卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知》(卫法监发[2002]51号)中《既是食品又是药品的物品名单》所列食药同源物品之一。由于赤小豆和红豆外观相似、口味相近，容易发生混淆或掺假。例如，声称具有健脾祛湿和利水消肿功效的五谷杂粮粉，市面上的赤小豆糕和赤小豆沙等食品，配料表中以红豆代替赤小豆掺入。

现有的食品标准检测方法中无针对赤小豆和红豆的相关检测方法。加工食品中已经失去完整外观形态特征的赤小豆和红豆配料难以得到有效鉴别。在甄别上述混淆或掺假行为方面存在明显的技术空白，不能满足相关食品真实性的检验监管的技术需求。

为保障饮食安全，维护公平合法贸易，建立食品中赤小豆和红豆成分双重数字PCR定量检测方法，可对食品中红豆成分占赤小豆和红豆成分的质量百分比进行精准定量。

发明内容

本发明的目的在于针对以上要解决的缺点与不足，提供一种利用双重数字PCR准确、有效地定量检测食品中赤小豆和红豆成分的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种利用双重数字PCR定量检测食品中赤小豆和红豆成分的方法，其采用双通道检测法，利用数字PCR系统同时探测两种荧光信号，将红豆物种特异性基因序列和赤小豆红豆通用基因序列检测的探针分别标记为FAM和VIC，通过在同一PCR反应体系中测得的所述红豆物种特异性基因序列和所述赤小豆红豆通用基因序列的拷贝数浓度，计算得到红豆占赤小豆和红豆的DNA拷贝数百分比，换算得到红豆成分占赤小豆和红豆成分的质量百分比。

优选地，本发明的方法包括以下步骤：

步骤1.提取含有赤小豆和红豆成分的待测样本DNA；

步骤2.设计并合成所述红豆物种特异性基因序列的引物和探针序列以及所述赤小豆红豆通用基因序列的引物和探针序列；

步骤3.进行双重数字PCR反应；

步骤4.采用FAM和VIC双通道荧光检测读取并分析荧光信号；

步骤5.根据荧光信号检测结果计算所述红豆占赤小豆和红豆的DNA拷贝数百分比，换算得到红豆成分占赤小豆和红豆成分的质量百分比；

其中，所述红豆占赤小豆和红豆的DNA拷贝数百分比

其中a为红豆特异性基因拷贝数浓度，b为赤小豆红豆通用基因拷贝数浓度，f为校正系数，f＝1.18；

其中，所述红豆成分占赤小豆和红豆成分的质量百分比，通过建立其对拷贝数百分比的关系式，利用拷贝数百分比求得。

优选地，所述步骤1包括将所述食品样本粉碎和均质后，采用试剂盒法提取样本DNA。

优选地，所述步骤2中，所述红豆物种特异性基因序列的引物和探针序列如下：

红豆特异性基因-F：CACTACTGCTCTCTCCCTCAAAAC(SEQ ID NO.1)；

红豆特异性基因-R：AGATTGGGAAAGATTCGTTGG(SEQ ID NO.2)；

红豆特异性基因-P：FAM-TCTTATCACAAGCCCTTCCCTGCATC-BHQ1(SEQ ID NO.3)。

优选地，所述步骤2中，所述赤小豆红豆通用基因序列的引物和探针序列如下：

赤小豆红豆通用基因-F：TCTCTGTGGGTTGTGGATTCTC(SEQ ID NO.4)；

赤小豆红豆通用基因-R：CATCCCTCACCTCCACTTCC(SEQ ID NO.5)；

赤小豆红豆通用基因-P：VIC-TCGTTGTTGTGATAAAAGGCAATATCTGC-BHQ1(SEQ IDNO.6)。

优选地，所述双重数字PCR反应包括微滴数字PCR反应(droplet digital PCR,ddPCR)和芯片数字PCR(chip digital PCR,cdPCR)反应。

更优选地，所述ddPCR反应条件为：95℃，5分钟，1℃/秒；94℃，15s，1℃/秒，60℃，1分钟，1℃/秒，共49个循环；12℃保存反应产物。

更优选地，所述ddPCR反应体系为20μL，各组分如下：2×ddPCR^TM预混液10μL；浓度为10pmol/μL的引物各0.8μL，浓度为10pmol/μL的探针各0.4μL，DNA模板2μL，补水至20μL。

更优选地，所述cdPCR反应条件为：96℃，10分钟；60℃，2分钟，98℃，30秒，49个循环；60℃，2分钟；10℃保存反应产物。

更优选地，所述cdPCR反应体系为15μL，各组分如下：

预混液7.5μL；浓度为10pmol/μL的引物各0.6μL、浓度为10pmol/μL的探针各0.3μL，DNA模板1.5μL，补水至15μL。

数字PCR是一种基于单分子扩增的核酸检测技术，以泊松分布原理为理论基础，对样本中特定基因片段进行拷贝数浓度定量测定可以避免复杂的食品配料组成、加工工艺和食品状态等因素引起的结果偏差。以往利用数字PCR技术测定食品中物种成分含量的发明，主要集中在动物源性成分方面。本方法首次开展了食品中植物源性成分的数字PCR定量测定发明，建立了红豆占赤小豆和红豆DNA拷贝数百分比与食品中红豆占赤小豆和红豆成分质量百分比的关系式，利用数字PCR技术测定食品中两种DNA拷贝数浓度，计算红豆占赤小豆和红豆DNA拷贝数百分比，根据关系式换算得到食品中红豆成分的质量百分比含量。

红豆(Vigna angularis)又称赤豆，属于蔷薇目豆科菜豆族豇豆属的植物红豆树的种子，赤小豆(Vigna umbellata)又称饭豆，和红豆同属于豇豆属。根据本发明设计的红豆特异性引物探针能够对红豆成分进行特异性检测，赤小豆和红豆通用引物探针能够同时对红豆和赤小豆进行特异性检测。

本方法对赤小豆和红豆DNA拷贝数浓度进行定量测定，拷贝数浓度绝对定量限为6拷贝/微升，红豆占赤小豆和红豆DNA拷贝数百分比定量限为1％；食品中红豆成分占赤小豆和红豆成分的质量百分比定量限为1％。本方法可准确、快速地检测出食品中红豆成分占赤小豆和红豆成分的质量百分比含量。

附图说明

图1是拷贝数百分比定量限验证实验数据分析图(ddPCR)。

图2是拷贝数百分比定量限验证实验结果2D图(cdPCR)。

图3是质量百分比-拷贝数百分比关系式(ddPCR)。

图4是质量百分比-拷贝数百分比关系式(cdPCR)。

图5是质量百分比定量限验证实验结果1D图(ddPCR)。

图6是质量百分比定量限验证实验结果2D图(cdPCR)。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明利用双重数字PCR定量检测食品中红豆成分的方法如下：

1、样本的制备与基因组DNA模板的提取：取样本(赤小豆、红豆、赤小豆与红豆的混合物等)10g，使用研磨仪进行粉碎和均质，条件为1800转/分、3分钟。

称取样本30mg于1.5mL离心管内，采用试剂盒法提取样本DNA，试剂盒可选用：Kurabo QuickGene DNA提取试剂盒DT-S、Wizard Genomic DNA purification kit(Promega，A1120)、PSS核酸自动提取仪等DNA提取方法。本领域技术人员熟知这些DNA提取方法，从而分别提取相应样本的DNA。

2、设计并合成所述红豆物种特异性基因序列的引物和探针序列以及所述赤小豆红豆通用基因序列的引物和探针序列，所述的引物和探针的核苷酸序列如下：

3、进行双重数字PCR反应

(1)仪器

QX200^TM Droplet Digital PCR系统：包括热循环仪(C1000 Touch^TM thermalcycler)、微滴生成仪(droplet generator)、微滴分析仪(droplet reader)和封膜仪(PCRplate sealer)4个部分，购自美国Bio-rad公司。

QuantStudio^TM 3D Digital PCR系统：包括PCR系统(Dual Flat Block

PCR System 9700)、芯片装载仪(Digital Chip Loader)和芯片分析仪(Digital PCRInstrument)3个部分，购自美国Applied Biosystems by Life Technologies公司。

E4-200XLS+单通道电动移液枪购自美国瑞宁公司。

(2)试剂

ddPCR：ddPCR^TM预混液(Super Mix for Probes,no dUTP)、微滴生成油(DropletGeneration Oil)、微滴分析油(Droplet Reader Oil)、微滴生成卡槽(Droplet GeneratorDG8 Cartridge)、微滴生成卡槽胶垫(Droplet Generator DG8 Gasket)和96孔板，购自美国Bio-Rad公司。

cdPCR：

预混液(3D Digital PCR Master Mix v2)、芯片试剂盒(3DDigital PCR20K Chip Kit v2，包含芯片、芯片盖、刷头、封油注射器)，购自美国AppliedBiosystems by Life Technologies公司。

QuickGene基因提取试剂盒(Cat.#DT-S)

引物和探针均由上海闪晶分子生物科技有限公司合成。

(3)供试样本

每种方法除供试样本不同之外，其操作步骤、试剂用量及反应条件等均相同。具体的供试样本及得到的实验数据以下面实施例中详述。

(4)反应体系的配制和分散

ddPCR反应体系为20μL，各组分如下：2×ddPCR^TM预混液(MasterMix)10μL；浓度为10pmol/μL的引物各0.8μL，浓度为10pmol/μL的探针各0.4μL，DNA模板2μL，补水至20μL。分别将20μL的反应体系和70μL微滴生成油加入微滴生成卡槽中，盖上胶垫后放入微滴生成仪中进行微滴生成，待微滴生成结束后用单通道电动移液枪将生成的微滴(大约40μL)全部转移至96孔板中，用封膜仪进行封膜后置于热循环仪中进行PCR反应。

cdPCR反应体系为15μL，各组分如下：

预混液(MasterMix)7.5μL；浓度为10pmol/μL的引物各0.6μL、浓度为10pmol/μL的探针各0.3μL，DNA模板1.5μL，补水至15μL。将配制好的15μL反应体系通过芯片装载仪自动加载到芯片上的微孔中，体系加载完成后立即使用封油注射器将封油覆盖于芯片表面并将芯片密封。密封后的芯片放置于PCR系统上进行扩增。

(5)反应程序

ddPCR反应条件：95℃，5分钟(1℃/s)；94℃15秒(1℃/秒)，60℃1分钟(1℃/秒)，共49个循环；12℃保存反应产物。

cdPCR反应条件：96℃10分钟；60℃2分钟，98℃30秒，49个循环；60℃2分钟；10℃保存反应产物。

4、荧光信号读取和分析

本标准中荧光读取采用FAM和VIC双通道荧光检测。

荧光收集结束后，根据反应热点图确定荧光阈值，进行阴性点与阳性点的区分。

ddPCR数据读取：扩增结束后将96孔板置于微滴分析仪中读取荧光信号，并用QuantaSoft V1.3.2软件分析实验数据。

cdPCR数据读取：扩增结束后，待芯片恢复至室温，将芯片置于芯片分析仪中读取并初步分析芯片结果，再经由QuantStudio^TM 3D AnalysisSuiteTM Cloud Software二次分析实验数据。

5、拷贝数百分比的计算

根据荧光信号检测结果计算所述红豆占赤小豆和红豆DNA拷贝数百分比。

红豆占赤小豆和红豆DNA拷贝数百分比

a——红豆特异性基因拷贝数浓度(拷贝/微升)；

b——赤小豆红豆通用基因拷贝数浓度(拷贝/微升)；

f——校正系数，f＝1.18。

6、质量百分比-拷贝数百分比关系式的建立

制备以赤小豆为基质，掺入不同质量百分比的红豆，得到不少于5个质量百分比的系列红豆/赤小豆混合样本。例如，制备红豆成分质量百分比为0.5％、1％、5％、10％、20％、40％和50％的红豆/赤小豆粉末混合样本。每个样本称取3个平行，每个平行30mg，分别进行DNA提取，每个称样平行DNA稀释10倍后，分别进行1个平行的ddPCR和cdPCR。利用数据分析软件建立质量百分比-拷贝数百分比关系式。

7、质量百分比的换算

将步骤5中计算得到的待测样本拷贝数百分比代入步骤6中所述质量百分比-拷贝数百分比关系式，换算得到待测样本中红豆成分占赤小豆和红豆成分质量百分比含量。

8、质量控制

(1)样本检测的质量控制

a.样本平行间的相对标准偏差计算

样本数字PCR反应应设置3个平行，在保证检测结果拷贝数浓度大于定量检测限的情况下，并且阳性反应数量低于总反应数量80％的前提下，3个平行样本拷贝数浓度的相对标准偏差(RSD)需满足RSD≤25％，其3个平行样本所测得的平均值作为该样本的红豆/赤小豆和红豆基因含量进行后续分析。

b.有效微反应数的控制

数字PCR体系分割过程中产生的有效微反应的总数量不得低于平台理论数的60％(即12000个)；阳性体系的数量不得超过总体系数量的80％。

c.空白对照的质量控制

数字PCR空白对照理论检测结果应为零。但在实际检测中，允许有极少量阳性体系数出现。空白对照中阳性微反应体系数应小于实际有效体系数的0.03％。

以上质控条件中有一项不符合者，实验结果应放弃，并重新进行数字PCR实验。

(2)性能指标的确证

a.拷贝数浓度绝对定量限

以RSD≤25％作为有效定量数据的判断依据，拷贝数浓度绝对定量限为检测结果RSD≤25％时的最低拷贝数浓度。对系列稀释浓度的赤小豆和红豆DNA进行数字PCR定量检测，每个浓度设置3个平行，计算各浓度平行检测结果的RSD值。本方法对红豆和赤小豆DNA的拷贝数浓度绝对定量限为6拷贝/微升。

b.拷贝数百分比定量限和回收率

以RSD≤25％和回收率80％～120％作为有效定量数据的判断依据，拷贝数百分比定量限为检测结果RSD≤25％和回收率80％～120％时的最低拷贝数百分比。对系列掺比拷贝数百分比的赤小豆和红豆DNA进行数字PCR定量检测，每个拷贝数百分比设置3个平行，计算各拷贝数百分比平行检测结果的RSD值和回收率。本方法对红豆占赤小豆和红豆DNA的拷贝数百分比定量限为1％。

c.质量百分比定量限和回收率

以RSD≤25％和回收率80％～120％作为有效定量数据的判断依据，质量百分比定量限为检测结果RSD≤25％和回收率80％～120％时的最低质量百分比。对系列掺比质量百分比的食品进行DNA提取和数字PCR定量检测，每个质量百分比设置3个平行，计算各质量百分比平行检测结果的RSD值和回收率。本方法对红豆占赤小豆和红豆成分的质量百分比定量限为1％。

实施例1：拷贝数绝对定量限的验证

供试样本：为验证本方法的拷贝数绝对定量限，分别提取赤小豆和红豆基因组DNA并进行系列稀释，得到300、100、20、10、5、1拷贝/微升的系列稀释浓度的红豆DNA和赤小豆DNA。用红豆物种特异性引物探针检测系列稀释的红豆DNA，用赤小豆红豆通用引物探针分别检测系列稀释的赤小豆和红豆DNA，每个实验均进行3个平行的ddPCR和cdPCR实验，所得实验结果见表1。

表1红豆和赤小豆DNA拷贝数绝对定量限的验证(ddPCR和cdPCR)

由表1所示的结果可见，对于红豆特异性基因，在ddPCR平台上，当红豆DNA拷贝数浓度为1.33拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值大于25％，当红豆DNA拷贝数浓度大于等于5.22拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值小于25％，红豆DNA拷贝数浓度的绝对定量限为5.22拷贝/微升。在cdPCR平台上，当红豆DNA拷贝数浓度为1.40拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值均大于25％，当红豆DNA拷贝数浓度大于等于5.33拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值小于25％，红豆DNA拷贝数浓度的绝对定量限为5.33拷贝/微升。

对于赤小豆红豆通用基因，在ddPCR平台上，当红豆DNA拷贝数浓度为1.63拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值大于25％，当红豆DNA拷贝数浓度大于等于5.32拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值小于25％，红豆DNA拷贝数浓度的绝对定量限为5.32拷贝/微升；当赤小豆DNA拷贝数浓度为1.33拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值大于25％，当赤小豆DNA拷贝数浓度大于等于5.10拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值小于25％，赤小豆DNA拷贝数浓度的绝对定量限为5.10拷贝/微升。在cdPCR平台上，当红豆DNA拷贝数浓度为1.22拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值均大于25％，当红豆DNA拷贝数浓度大于等于5.43拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值小于25％，红豆DNA拷贝数浓度的绝对定量限为5.43拷贝/微升；当赤小豆DNA拷贝数浓度为0.89拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值大于25％，当赤小豆DNA拷贝数浓度大于等于5.70拷贝/微升时，三个平行之间的RSD值小于25％，赤小豆DNA拷贝数浓度的绝对定量限为5.70拷贝/微升。

为了本方法的应用，本方法对红豆和赤小豆DNA拷贝数浓度绝对定量限取整数为6拷贝/微升。

实施例2：拷贝数百分比定量限的验证

供试样本：为验证本方法的拷贝数百分比定量限，以已知拷贝数浓度的赤小豆DNA为基质，掺入已知拷贝数浓度的红豆DNA，得到系列掺比拷贝数百分比分别为100％、50％、10％、1％和0.1％的赤小豆和红豆DNA混合样本。分别进行3个平行的ddPCR和cdPCR实验，所得实验结果见图1和图2。

由图1和图2所示的结果可见，对于拷贝数百分比分别为100％、50％、10％、1％的红豆基因组DNA样本，在ddPCR平台上的检测结果分别为105.11％、50.79％、9.02％、0.94％，三个平行之间的RSD值在1.49％～3.94％之间，回收率在90.15％～105.11％之间；在cdPCR平台上的检测结果分别为105.72％、52.08％、10.47％、0.93％，三个平行之间的RSD值在2.47％～13.09％之间，回收率在92.93％～105.72％之间。对于拷贝数百分比为0.1％的样本，测得的拷贝数浓度低于绝对定量限6拷贝/微升，且回收率超出了有效数值，不是有效定量数据。因此，本方法的拷贝数百分比定量限为1％。

实施例3：质量百分比-拷贝数百分比关系式的建立

供试样本：为建立质量百分比-拷贝数百分比关系式，以赤小豆为基质，掺入不同质量百分比的红豆，得到质量百分比为0.5％、1％、5％、10％、20％、40％、50％的红豆和赤小豆粉末混合样本。每个样本称取3个平行，每个平行30mg，分别进行DNA提取，每个称样平行DNA稀释10倍后，分别进行1个平行的ddPCR和cdPCR。利用数据分析软件建立质量百分比-拷贝数百分比关系式，所得关系式见图3和图4。对于质量百分比为0.5％的样本，拷贝数百分比的回收率不满足有效定量数据的判断依据，检测结果不是有效定量数据。因此，关系式的建立采用质量百分比为1％、5％、10％、20％、40％和50％的检测结果。

在ddPCR平台建立的质量百分比-拷贝数百分比关系式如图3所示，关系式为：y＝1.057x+0.8997，其中，x为质量百分比，y为拷贝数百分比，R²为0.9999。

在cdPCR平台建立的质量百分比-拷贝数百分比关系式如图4所示，关系式为：y＝1.066x+0.8121，其中，x为质量百分比，y为拷贝数百分比，R²为0.9988。

实施例4：质量百分比定量限的验证

供试样本：为验证本方法的质量百分比定量限，以赤小豆为基质，掺入不同质量的红豆并制成混合样本，得到系列红豆质量掺比分别为0.5％、1％、5％、10％和50％的混合样本。每个样本称取3个平行，每个平行30mg，分别进行DNA提取，每个称样平行DNA稀释10倍后，分别进行1个平行的ddPCR和cdPCR，所得实验结果见图5和图6。

质量百分比定量限验证实验结果1D图(ddPCR)如图5所示，其中，E06、F06、G06为红豆质量百分比1％的样本；F05、G05、A06为红豆质量百分比5％的样本；G04、A05、B05为红豆质量百分比10％的样本；A04、B04、C04为红豆质量百分比50％的样本。

质量百分比定量限验证实验结果2D图(cdPCR)如图6所示。

根据实验结果计算拷贝数百分比，代入实施例3的质量百分比-拷贝数百分比关系式中换算出质量百分比。对于红豆质量百分比分别为1％、5％、10％、50％的供试样本，在ddPCR平台上的检测结果分别为0.83％、5.21％、10.29％、49.89％，三个平行之间的RSD值在4.94％～17.34％之间，回收率在82.77％～104.28％之间；在cdPCR平台上的检测结果分别为0.83％、4.85％、9.99％和49.05％，三个平行之间的RSD值在1.63％～11.78％之间，回收率在82.60％～99.86％之间。对于质量百分比为0.5％的混合样本，测得的拷贝数浓度低于绝对定量限6拷贝/微升，且回收率超出了有效数值，不是有效定量数据。因此，本方法的质量百分比定量限为1％。

序列表

<110> 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心

<120> 利用双重数字PCR定量检测食品中赤小豆和红豆成分的方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cactactgct ctctccctca aaac 24

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

agattgggaa agattcgttg g 21

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcttatcaca agcccttccc tgcatc 26

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tctctgtggg ttgtggattc tc 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catccctcac ctccacttcc 20

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcgttgttgt gataaaaggc aatatctgc 29

Claims

1.一种利用双重数字PCR定量检测食品中赤小豆和红豆成分的方法，其特征在于：采用双通道检测法，利用数字PCR系统同时探测两种荧光信号，将红豆物种特异性基因序列和赤小豆红豆通用基因序列检测的探针分别标记为FAM和VIC，通过在同一PCR反应体系中测得的所述红豆物种特异性基因序列和所述赤小豆红豆通用基因序列的拷贝数浓度，计算得到红豆占赤小豆和红豆的DNA拷贝数百分比，换算得到红豆成分占赤小豆和红豆成分的质量百分比；

所述方法包括以下步骤：

步骤1.提取含有赤小豆和红豆成分的待测样本的DNA；

步骤3.进行双重数字PCR反应；

步骤4.采用FAM和VIC双通道荧光检测读取并分析荧光信号；

其中，所述红豆占赤小豆和红豆的DNA拷贝数百分比

，其中a为红豆特异性基因拷贝数浓度，b为赤小豆红豆通用基因拷贝数浓度，f为校正系数，f=1.18；

其中，所述红豆成分占赤小豆和红豆成分的质量百分比，通过建立其对拷贝数百分比的关系式，利用拷贝数百分比求得；

所述步骤2中，所述红豆物种特异性基因序列的引物和探针序列如下：

红豆特异性基因-F：CACTACTGCTCTCTCCCTCAAAAC；

红豆特异性基因-R：AGATTGGGAAAGATTCGTTGG；

红豆特异性基因-P：FAM-TCTTATCACAAGCCCTTCCCTGCATC-BHQ1；

所述步骤2中，所述赤小豆红豆通用基因序列的引物和探针序列如下：

赤小豆红豆通用基因-F：TCTCTGTGGGTTGTGGATTCTC；

赤小豆红豆通用基因-R：CATCCCTCACCTCCACTTCC；

赤小豆红豆通用基因-P：VIC-TCGTTGTTGTGATAAAAGGCAATATCTGC-BHQ1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1包括将食品样本粉碎和均质后，采用试剂盒法提取样本DNA。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述双重数字PCR反应包括ddPCR反应和cdPCR反应。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述ddPCR反应条件为：95℃，5分钟，1℃/秒；94℃，15秒，1℃/秒，60℃，1分钟，1℃/秒，共49个循环；12℃保存反应产物。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述ddPCR反应体系为20 μL，各组分如下：2×ddPCRTM预混液 10 μL；浓度为10 pmol/μL的引物各0.8 μL，浓度为10 pmol/μL的探针各0.4 μL，DNA模板2 μL，补水至20 μL。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述cdPCR反应条件为：96℃，10分钟；60℃，2分钟，98℃，30秒，49个循环；60℃，2分钟；10℃保存反应产物。

7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述cdPCR反应体系为15 μL，各组分如下：2×QuantStudio® 预混液7.5 μL；浓度为10 pmol/μL的引物各0.6 μL、浓度为10 pmol/μL的探针各0.3 μL，DNA模板1.5 μL，补水至15 μL。