CN103710441B

CN103710441B - 检测大豆种质资源的引物、探针和检测方法

Info

Publication number: CN103710441B
Application number: CN201310686866.8A
Authority: CN
Inventors: 凌杏园; 潘广; 章桂明; 王敖雪; 程颖慧; 龙海; 向才玉; 叶奕优
Original assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Current assignee: Animal and Plant Inspection and Quarantine Technology Center of Shenzhen Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau
Priority date: 2013-12-13
Filing date: 2013-12-13
Publication date: 2015-10-28
Anticipated expiration: 2033-12-13
Also published as: CN103710441A

Abstract

本申请公开了检测大豆种质资源的引物、探针和检测方法。本申请针对大豆UNK2基因设计了两对引物和一条探针；其中，第一引物对和第二引物对可分别进行常规PCR检测和基于染料法的实时荧光PCR检测，探针与第二引物对配合可进行基于探针法的实时荧光PCR检测。本申请的引物能够特异性的检测出受检样品中的大豆种质成分，而对其它近似品种如豌豆、绿豆、大红豆、鹰嘴豆等没有扩增信号，特异性强，稳定性好，为大豆种质资源的检测鉴定提供了一种新的选择。在本申请的引物基础上建立的大豆种质资源检测方法，简单实用，具有很好特异性和稳定性，特别适合农业、检验检疫和食品安全等部门的大豆种质鉴定查验、资源保护和成分等的快速检测。

Description

检测大豆种质资源的引物、探针和检测方法

技术领域

本申请涉及核酸分子检测领域，特别是涉及用于检测大豆种质资源的引物、探针和检测方法。

背景技术

据海关总署发布的数据称，2012年进口大豆5838万吨，增长11.2%；与此同时，国内的大豆生产和加工不断萎缩，2011年国内大豆产量仅1千余万吨，我国大豆对外依存度达到80%。在这种背景下，我国大豆进口量逐年增长。因此，对大豆种质资源的检测也显得尤为重要。另外，随着转基因农产品的流行，在对转基因大豆及转基因大豆源性的加工产品的检测过程中，也会用到大豆种质资源检测。

UNK2基因来源于华盛顿大学医学院承担的大豆EST（expressed sequencetags）公共项目而构建的大豆cDNA文库。Ruibo Hu(2009)等在筛选大豆定量RT-PCR（qRT-PCR）内源基因时发现基因UNK2在大豆不同组织、不同发育期和各种环境条件下的表达非常稳定，这表明该基因是大豆的一种管家基因（homekeeping）。因该基因的功能未知，故取名unknown，即UNK2基因。

发明内容

本申请的目的是对UNK2基因进行研究，以期提供一种新的大豆种质资源检测的引物、探针和检测方法。

为了实现上述目的，本申请采用了以下技术方案：

本申请的一方面公布了检测大豆种质资源的引物，该引物包括第一引物对、第二引物对中的至少一对引物；第一引物对的上游/下游引物分别含有Seq IDNo.1所示序列和Seq ID No.2所示序列；第二引物对的上游/下游引物分别含有Seq ID No.3所示序列和Seq ID No.4所示序列；

Seq ID No.1：5’-gctatggaacgagaagtagttgagagt-3’

Seq ID No.2：5’-agctgcactatctttgtggaaggtaa-3’

Seq ID No.3：5’-aaacttgagcaggtatccagaggcc-3’

Seq ID No.4：5’-ggatgctttacaaacctttcacaccttgt-3’。

需要说明的是，本申请所设计的两对引物都是针对大豆种质资源设计的特异性检测引物。

本申请的另一方面公布了本申请的引物在大豆种质资源检测中的应用，其中，大豆种质资源检测包括基于常规PCR或实时荧光PCR的检测。需要说明的是，本申请的引物是针对大豆种质资源设计的特异性检测引物；可以理解，这些引物除了可以直接用于一般的常规PCR检测或实时荧光PCR检测以外，同样的，可以用于基因芯片检测或DHPLC中，用以扩大检测信号；或者，用于其它的以常规PCR或实时荧光PCR为基础的检测方法。

本申请的另一方面公布了检测大豆种质资源的探针，该探针与本申请的第二引物对配合使用，用于大豆种质资源的实时荧光PCR检测；探针含有Seq IDNo.5所示序列；

Seq ID No.5：5’-cagagcacagcccaatcagactccaaa-3’。

优选的，探针的5’端含有FAM荧光标记。需要说明的是，实时荧光PCR检测探针的荧光标记有很多种，荧光标记的选择通常都是根据具体所采用的检测仪器而定的；而实时荧光PCR仪中通常都含有的FAM荧光检测通道，因此，本申请的优选方案中使用FAM荧光标记本申请的探针。

本申请的另一方面公布了一种大豆种质资源的常规PCR检测方法，包括采用本申请的两对引物中的至少一对，以大豆UNK2基因为模板进行常规PCR扩增。需要说明的是，本申请所设计的两对引物都是针对大豆种质资源设计的特异性检测引物；因此，都可以用于常规PCR扩增检测。

本申请的另一方面公布了一种大豆种质资源的实时荧光PCR检测方法，包括本申请的引物，以大豆UNK2基因为模板进行实时荧光PCR扩增。需要说明的是，实时荧光PCR检测分为两大类，第一大类为荧光染料法，第二大类为探针法；荧光染料法，以SYBR Green荧光染料为例，该染料在游离状态下发出微弱的荧光，而结合于双链DNA的小沟区域后具有绿色激发波长，从而实现实时检测PCR的扩增情况；由于本申请的两对引物都是特异性的引物，因此，可以结合荧光染料直接进行实时荧光PCR检测。用于本申请的实时荧光PCR的荧光染料采用常规使用的荧光染料即可，在本申请不做具体限定。

进一步的，本申请还公布了第二大类的实时荧光PCR检测方法，该方法包括采用本申请的第二引物对和本申请的探针配合，以大豆UNK2基因为模板进行实时荧光PCR扩增。

本申请的另一面还公布了一种大豆种质资源的检测试剂盒，该试剂盒中包括本申请的两对引物中的至少一对。需要说明的是，如前面所述，该试剂盒中的引物都是针对大豆种质资源设计的特异性引物，可以用于大豆种质资源的检测，因此，该试剂盒不仅限于常规PCR或实时荧光PCR检测，还可以用于基于常规PCR或实时荧光PCR的其它检测，比如基因芯片检测、DHPLC检测等。

本申请的一种方案中，公布了大豆种质资源的实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒中包括本申请的第一引物对。需要说明的是，该试剂盒中采用的实时荧光PCR具体为染料法的实时荧光PCR，由于实时荧光PCR中常规使用的荧光染料都可以用于本申请，因此，本申请中对荧光染料不做具体限定；另外，可以理解，也可以在本申请的第一引物对的基础上，根据探针设计原则，设计探针，从而将染料法的实时荧光PCR改为探针法的实时荧光PCR，只要采用了本申请的第一引物对，都在本申请的保护范围内。还需要说明的是，可以理解，该试剂盒中，除了引物对以外，还包括其它的实时荧光PCR检测所需的试剂，在此不累述。

本申请的另一种方案中，公布了大豆种质资源的实时荧光PCR检测试剂盒，该试剂盒中包括本申请的第二引物对和本申请的探针。

由于采用以上技术方案，本申请的有益效果在于：

本申请的检测大豆种质资源的引物能够特异性的检测出受检样品中的大豆种质成分，而对其它近似品种如豌豆、绿豆、大红豆等没有扩增信号，特异性强，为大豆种质资源的检测鉴定提供了一种新的选择。

在本申请的引物基础上，本申请还建立了大豆种质资源常规PCR检测方法、实时荧光PCR检测方法，该检测方法简单实用，特异性强，特别适合于检验检疫等部门。

附图说明

图1是本申请实施例中第一引物对常规PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果图；其中S1-S3、S5-S30为29个不同的大豆栽培种，Y1-Y7为七个不同的野生大豆，S31为日本红豆，S32为日本蚕豆，S33为越南大豆，S34为卡塔尔绿豆，S36为越南芸豆，M为DNA分子量标准DL2000；DNA分子量标准DL2000中由下到上的条带大小为：100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp；

图2是本申请实施例中第二引物对实时荧光PCR检测结果图；

图3是本申请实施例中第一引物对的常规PCR灵敏度检测结果图；其中，M为DNA分子量标准DL2000，1～3为稀释样品A1，4～6为稀释样品A2，7～9为稀释样品A3，10～12为稀释样品A4，13～15为稀释样品A5，16～18为稀释样品A6，19～21为稀释样品A7，22～24为稀释样品A8，25～27为稀释样品A9，W为水空白对照，P为阳性对照；

图4是本申请实施例中第二引物对和探针的实时荧光PCR灵敏度检测结果图；其中，A1、A2、A3、A4、A5、A6和A7为A1-A7七个稀释样品的扩增曲线，每个稀释样品有三个重复，因此，有三条扩增曲线；

图5是本申请实施例中第一引物对常规PCR特异性检测结果图；其中，W为水空白对照，M为DNA分子量标准DL2000，S35为越南赤豆，S37为绿豆，S38为赤小豆，S39为眉豆，S40为红芸豆，S41为大红豆，S42为白芸豆，S43为豌豆，S44为黑芸豆，S45为鹰嘴豆，YM为玉米，DM为大米，FQ为番茄，TD为马铃薯，MH为棉花，XM为小麦，YC为油菜，P为阳性对照大豆S33样品；

图6是本申请实施例中第二引物对实时荧光PCR特异性检测结果图；其中，S33为阳性对照大豆S33样品的扩增曲线。

具体实施方式

本申请的发明人在对大豆及其近似种进行研究时发现，现有使用的针对大豆Lectin内源基因的检测方法，不能有效的区分大豆和鹰嘴豆；因此，有必要再探究一种新的检测方法。鉴于UNK2基因在大豆不同组织、不同发育期和各种环境条件下的表达都非常稳定，本申请的发明人推测，如果在其它豆类植物中也存在相对应的基因序列，并且不同豆类植物的相对应的基因序列又各有差异，UNK2基因就可以作为大豆种质资源的鉴定基因。在这种构思的引导下，本申请的发明人以Genbank等基因序列数据库为基础，研究比对了其它豆类植物的与UNK2相对应的基因序列。以研究比对结果为基础，进一步的研究设计出了本申请的两对特异性的检测引物对和一条检测探针。从而率先提出了基于UNK2基因的大豆种质资源分子检测鉴定方法。

需要说明的是，本申请的两对引物都是针对UNK2基因设计的特异性检测引物，具有很强的特异性，即可用常规PCR扩增，也可以直接用于实时荧光PCR扩增。用于实时荧光PCR扩增时，可以直接采用染料法，只采用特异性引物进行；在本申请的一个改进的方案中，还特别设计了针对第二引物对的探针，从而建立另外一个新的基于引物和探针的实时荧光PCR检测方法。

下面通过具体实施例并结合附图对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅仅对本申请进行进一步的说明，不应理解为对本申请的限制。

实施例

一、材料和方法

1.材料

供试材料共51份；如表1所示，其中大豆栽培种S1-S3、S5-S27共27份，野生大豆Y1-Y7共7份，全部由有东北农业大学王敖学教授和东北农业科学研究院李柱刚研究员无偿提供；S29、S30、S33三个大豆种质，和S31红豆、S32蚕豆、S34绿豆、S35赤豆、S36芸豆五个豆类种子来源于深圳进口农产品实验室的暂时预留样品；S37绿豆、S38赤小豆、S39眉豆、S40红芸豆、S41大红豆、S42白芸豆、S43豌豆、S44黑芸豆、S45鹰嘴豆共9种豆类种子购自于深圳本地市场。

表1实验研究材料

表中，1-33号样品均由东北农业大学和东北农业科学研究院提供，35-42号样品由深圳进口农产品实验室提供，43-51号样品购买自超市。

2.供试材料的DNA提取

由于大豆种质特别是野生大豆种子非常有限，因此先取大豆种子先行发芽，待其长成小苗后，取幼苗用于基因组DNA的提取；购买自超市的豆类样品直接提取DNA。基因组DNA用Qiagen公司试剂盒DNeasy Plant Mini kit提取。具体提取步骤见试剂盒说明书。基因组DNA浓度和质量经Nanodrop2000C核酸测定仪测定后最终调整为50ng/μl。

3.引物和探针设计

针对大豆的UNK2基因，根据比对结果，从中选取具有特异性的区域或位点，设计特异性检测引物对及探针。引物对和探针序列如表2所示。

表2引物探针序列

4.PCR反应体系和反应条件

常规PCR反应体系为25uL，其中含Mg离子的2×PCR Mix12.5uL，浓度100ng/uL的DNA模板3uL，浓度10umol/L的上游/下游引物各1uL，用双蒸水补足体积至25uL。设置水空白对照，水空白对照中用水代替DNA模板，其余相同。反应条件：94℃预变性5min；然后进入40个循环，循环设置为：94℃30s，61℃60s，72℃，90s；循环结束后72℃延伸10min。

实时荧光PCR扩增反应体系20uL，其中2×TaqMan Enviromental Mix2.010uL，浓度10ng/uL的DNA模板3uL，浓度10umol/L的上游/下游引物各2uL，浓度10umol/L的探针1uL，用双蒸水补足体积至20uL。扩增条件：95℃预变性10min；然后进入40个循环，循环设置为：95℃变性15sec，60℃退火1min。在退火阶段收集荧光信号。

5.序列测定

常规PCR产物先用2%琼脂糖凝胶进行电泳，再用刀片挖取靶标DNA胶带。胶条中的DNA用QIAquick Gel Extraction Kit加以纯化以回收。回收DNA用于DNA序列的测定。DNA序列的测定由深圳华大基因科技有限公司完成。

6.电泳分析

采用2%琼脂糖凝胶电泳PCR产物。制胶：称取2g琼脂糖，加100毫升TAE电泳缓冲液，仔细加热熔解2-3次，直到透亮。加入2微升溴化乙啶，终浓度0.5约微克/毫升，轻摇使之混匀，不可产生气泡，然后铺胶。

上样：取5ul扩增产物，加1ul6×样品缓冲液，混合后点样。

电泳：加电压5伏/厘米，电泳20-30分钟。

7.灵敏度试验

将黄豆S33样品的DNA，用10倍梯度系列稀释成10ng/uL～0.0001pg/uL共9个浓度梯度的稀释样品，编号A1～A9，如表3所示，按照所建立的方法进行灵敏度试验。

表3稀释样品

样品

A1

A2

A3

A4

A5

A6

A7

A8

A9

浓度

10ng/uL

1ng/uL

0.1ng/uL

0.01ng/uL

1pg/uL

0.1pg/uL

0.01pg/uL

0.001pg/uL

0.0001pg/uL

具体的，每个样品做3个重复，分别进行以第一引物对为基础的常规PCR检测，和以第二引物对和探针为基础的实时荧光PCR检测。两个检测方法中均设置水空白对照和原始浓度的S33大豆样品DNA阳性对照。

8.特异性试验

用17份非大豆样品用于常规PCR和实时荧光PCR扩增，检测所建立方法的特异性；同时，采用大豆S33作为阳性对照样品。该17份非大豆样品为：越南赤豆S35、绿豆S37、赤小豆S38、眉豆S39、红芸豆S40、大红豆S41、白芸豆S42、豌豆S43、黑芸豆S44、鹰嘴豆S45、玉米、大米、番茄、马铃薯、棉花、小麦、油菜。其中，玉米、大米、番茄、马铃薯、棉花、小麦、油菜样品由本实验室保存，即深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心。

9.试剂盒制备

将所设计的引物和探针以干粉形式或溶解成高浓度溶液形式保存，以作为试剂盒试剂使用。另外，标配的试剂盒中，还可以包括市场上购买的常规PCR或实时荧光PCR反应液等。

二、实验结果及分析

1.常规PCR扩增结果

采用设计的第一引物对，分别以提取的1-40和42号样品的DNA为模板进行常规PCR扩增，共计41个检测样品，结果如图1所示，除了1号样品S1和19号样品S20两个大豆样品没有任何扩增信号以外，其余的28个大豆栽培种和7个野生大豆都有一个扩增条带，且扩增条带大小一致；另外，四个非大豆样品的豆类种子：日本红豆S31、日本蚕豆S32、卡塔尔绿豆S34、越南芸豆S36以及水空白对照都没有扩增条带；另外，图1中的M为DNA分子量标准DL2000，条带由下到上的大小为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp。凝胶电泳结果表明，第一引物对及其检测的靶标序列具有良好的稳定性和特异性。其中，没有扩增出靶标条带的S1和S20经验证分析，属于样品DNA问题，在更换DNA后可以扩增出与其它大豆样品相同大小的条带。采用保存的作为试剂盒的引物干粉进行实验，在经过半年的保存后仍然能够使用，其扩增效果与刚合成回来的引物相当，具有良好的稳定性。

与此同时，本例还将第一引物对作为染料法实时荧光PCR的引物进行了实时荧光PCR检测，检测体系和条件参见第一部分，第4小节的实时荧光PCR扩增反应体系和条件，所不同的是，加入的不是2×TaqMan Enviromental Mix2.0而是SYBR GreenⅠ反应液，另外，也没有使用任何探针，其余相同。实验结果与常规PCR扩增的结果相同，在采用更换后的S1和S20样品DNA后，30个大豆栽培种和7个野生大豆都有有效的扩增曲线，而四个非大豆样品的豆类种子和水空白对照没有扩增曲线。

2.基因组序列

将以上常规PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳分离，挖取胶带并回收其中的DNA，DNA经测序获得UNK2基因片段的基因组序列。测序结果显示该扩增片段序列长660bp，测定序列为Seq ID No.6所示序列。经DNA和cDNA序列比较发现有含2个内含子，该两内含子的长度分别为119bp和194bp。大内含子序列以GT开始，以AG结束，含有典型的真核生物GT-AG内含子结构，是最常见的内含子；小内含子序列以AT起始，以TG结尾，含真核生物AU-AG类次要内含子的部分特征。测序结果显示的片段大小与凝胶电泳显示的片段大小相当，与预期相同。

3.实时荧光PCR方法

采用第二引物对和探针，分别以提取的51个样品的DNA为模板进行实时荧光PCR检测，结果如图2所示，27个国内大豆栽培种、7个国内大豆野生种、3个分别来源于加拿大、韩国和越南的大豆种质均有扩增曲线；而14个其它非大豆种质和水空白对照均无扩增曲线；表明所设计的第二引物对和探针及其实时荧光PCR检测方法可以特异性地检测鉴定大豆种质，并且特异性强、稳定性好。另外，采用保存半年以上的引物和探针干粉稀释成使用浓度进行实验，实验结果与新合成的引物和探针效果相当，没有明显差异，试剂存储稳定性良好。

4.灵敏度检测

以第一引物对为基础的常规PCR的灵敏度检测如图3所示，检测灵敏度可达到0.01ng/uL。以第二引物对和探针为基础的实时荧光PCR的灵敏度检测如图4所示，灵敏度高达0.01pg/uL。在浓度大于等于0.01ng/uL时，常规PCR和实时荧光PCR两种方法均具有较好的扩增且重现性较好；在浓度为0.1pg/uL时，实时荧光PCR检测的三个重复中仅出现两个典型扩增。比较实时荧光PCR和常规PCR的灵敏度检测结果，实时荧光PCR的检测灵敏度是常规PCR的1000倍，但是，实时荧光PCR在低浓度的样品检测中稳定性较差，特别是在0.01pg/uL时，稳定性明显下降。综合考虑实时荧光PCR的稳定性因素，实时荧光PCR在大于1pg/uL既检测低限为总DNA质量3pg以上的浓度检测结果较为准确，因为反应体系加了3uL基因组DNA；根据大豆的单倍体基因组大小约为1115Mb，估算约为1.1pg，而我们的方法等同于检测到3个拷贝左右的目的基因。

5.特异性检测

用大豆UNK2基因设计的第二引物对和探针对17份非大豆实验材料进行实时荧光PCR检测，第一引物对进行常规PCR扩增；同时，设置水空白对照和阳性对照，阳性对照采用大豆S33样品。该17份非大豆样品为：越南赤豆S35、绿豆S37、赤小豆S38、眉豆S39、红芸豆S40、大红豆S41、白芸豆S42、豌豆S43、黑芸豆S44、鹰嘴豆S45、玉米、大米、番茄、马铃薯、棉花、小麦、油菜。

常规PCR扩增产物采用琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图5所示，越南赤豆S35、绿豆S37、赤小豆S38、眉豆S39、红芸豆S40、大红豆S41、白芸豆S42、豌豆S43、黑芸豆S44、鹰嘴豆S45、玉米、大米、番茄、马铃薯、棉花、小麦、油菜和水空白对照均没有扩增条带，只有阳性样品大豆S33有扩增出靶标条带。需要说明的是，图5中阳性对照大豆S33样品出现两条带，根据分析，下面一条带属于典型的引物二聚体条带，可能是由于引物污染造成，这不影响靶标片段的扩增。

实时荧光PCR检测结果如图6所示，该结果与常规PCR结果一致，17份非大豆材料和水空白对照都没有扩增曲线，只有阳性对照大豆S33样品有出现扩增曲线。

常规PCR和实时荧光PCR结果表明，本例设计的两对引物和探针均具有很好的特异性，能够从其它作物中特异性的检测出大豆种质。

以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims

1.检测大豆种质资源的引物组，其特征在于：所述引物组包括第一引物对、第二引物对中的至少一对引物；

所述第一引物对的上游/下游引物分别为Seq ID No.1所示序列和Seq IDNo.2所示序列；

所述第二引物对的上游/下游引物分别为Seq ID No.3所示序列和Seq IDNo.4所示序列。

2.根据权利要求1所述的引物组在大豆种质资源检测中的应用，所述大豆种质资源检测包括基于常规PCR或实时荧光PCR的检测。

3.一种大豆种质资源的常规PCR检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1所述的引物组，以待测样本的DNA为模板进行常规PCR扩增。

4.一种大豆种质资源的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1所述引物组，以待测样本的DNA为模板进行实时荧光PCR扩增。

5.根据权利要求4所述的实时荧光PCR检测方法，其特征在于：还包括采用权利要求1所述的第二引物对和探针配合，以待测样本的DNA为模板进行实时荧光PCR扩增；所述探针为Seq ID No.5所示序列。

6.一种大豆种质资源的检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括权利要求1所述的引物组。

7.一种大豆种质资源的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括权利要求1所述的第一引物对。

8.一种大豆种质资源的实时荧光PCR检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中包括权利要求1所述的第二引物对和探针，所述探针为Seq ID No.5所示序列。