CN112322766B - 一种基于微滴式数字pcr技术的三七粉精准定量方法 - Google Patents

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    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Abstract

本发明公开了一种利用微滴式数字PCR技术对三七粉成分进行定量检测的方法，以及在该方法中应用到的以三七单拷贝核基因甘油二酯激酶基因（diacylglycerol kinase 1 gene，DGK1）所设计的引物和探针组合。该方法通过建立三七粉质量与DNA浓度、DNA浓度与基因拷贝数的线性关系，最终构建三七粉质量与核基因拷贝数的线性关系，从而计算出三七粉含量。使用本发明的微滴数字PCR方法，能够实现特异、快速、准确的三七粉定量检测，为维护消费者利益及三七粉市场监管提供技术支撑。

Description

一种基于微滴式数字PCR技术的三七粉精准定量方法
技术领域
本发明涉及食品检测技术领域，具体而言，本发明涉及一种利用微滴式数字PCR技术对三七粉进行定量的检测方法，包括在该方法中应用到的以单拷贝核基因甘油二酯激酶基因（diacylglycerol kinase 1 gene，DGK1）为靶序列所设计的引物和探针组合，建立三七粉质量与DNA浓度，DNA浓度与基因拷贝数的关系，以DNA浓度为中间量构建三七粉质量与核基因拷贝数的关系，从而测定三七粉含量。
背景技术
三七 [Panax notoginseng（Burk.）F. H. Chen] 是名贵的中药材，同时被列为可用于保健食品的原料。三七中含三七皂苷、黄酮苷、氨基酸与挥发油等有效成分，具有补血、止血、降血脂、改善心肌功能等多种功效。近年来随着人们对三七研究的深入，三七相关的保健食品也呈现出了多元化、高质化、高值化，市场需求量逐年攀增。但由于三七对生态环境要求较高，产区难以扩大和转移，同时三七生长存在连作障碍问题，导致三七产量增长空间受限，价格居高不下。受经济利益驱动，市场中三七掺杂使假问题屡见不鲜，影响了正常的市场秩序。
三七粉是三七的主要制品之一，市场中存在将大米粉、土豆粉、大豆粉等常见的价格较低的可食用粉掺杂到三七粉中的问题。失去原有形态特征的三七粉，给掺杂、掺假带来了较大的便利。目前对三七粉的掺伪鉴别主要采用传统显微性状鉴定和理化分析方法，这些方法存在操作相对复杂、检测结果受三七的生长环境、采收时间、贮藏条件的影响以及无法准确定量等局限性。寻求三七粉的准确定性和精准定量方法是解决三七粉掺假问题的关键，可促进三七保健食品产业链的良性发展。
微滴式数字PCR是近年来迅速发展起来的核酸定量技术，基于油包水原理将含有核酸分子的反应体系生成数万或数百万个微滴，实现理论上的单分子扩增。微滴式数字PCR可消除外源DNA背景对靶基因检测的影响，可实现对低丰度的基因组样品精准检测。微滴式数字PCR技术具有较强的绝对定量能力，不依赖于标准品和标准曲线即可得到目标基因拷贝数，并且有很高的灵敏度、稳定性和重复性。三七粉特异、快速、准确的定量检测问题亟待解决，目前，还未见关于利用微滴式数字PCR定量检测三七粉的相关研究报道。
发明内容
本发明目的在于提供用于三七粉定量检测方法。针对上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明的发明人根据三七单拷贝核基因DGK1设计了能特异性鉴别三七源性成分的寡核苷酸引物和探针组合，能从样品DNA中高效特异扩增出一段96 bp的三七特异性基因片段。所述引物包含上游引物和下游引物，上游引物为Panax notoginseng-F：AGACCTATCATGATGATTACTCTTCC，下游引物为Panax notoginseng-R：GAATAGGAGTATGGAAACAGGTAAGAC；所述探针为Panax notoginseng-P：TACCAATCCCAGCGTA，在探针的5’ 端连接有一个荧光报告基团FAM，3’ 端连接有一个荧光淬灭基团MGB。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供一种基于微滴式数字PCR的三七粉定量检测方法，建立三七粉质量与DNA浓度、DNA浓度与基因拷贝数关系，以DNA浓度为中间量构建基因拷贝数和三七粉质量关系，进而测定三七粉含量。包括使用针对三七源性成分的特异性引物和探针组合。
进一步地，该检测方法包括如下步骤：
（1）将三七整个主根打粉，过筛，制得三七粉样本；
（2）提取三七粉样本中的基因组DNA，并测定DNA浓度，建立三七粉质量与DNA浓度的线性关系；
（3）将提取的三七粉DNA进行梯度稀释，通过微滴式数字PCR检测不同浓度DNA的核基因拷贝数，建立DNA浓度与靶基因拷贝数的线性关系；
（4）根据步骤（2）和（3）建立的线性关系，以DNA浓度为中间量，构建三七粉质量与核基因拷贝数的线性回归方程；
进一步地，所述步骤（3）中，微滴式数字PCR反应体系总体积为20 µL，包括：10 µLof 2×ddPCR Supermix for probe (No dUTP) (Bio-Rad, USA)，引物Panax notoginseng-F与Panax notoginseng-R各1.8 µL，0.5 µL 探针Panax notoginseng-P：TACCAATCCCAGCGTA，模板DNA 1 µL，加ddH2O补足至20 µL。
进一步地，所述步骤（3）中，微滴式数字PCR的扩增反应条件为：95 ℃预变性10min；94 ℃变性30 s，56-60 ℃退火1 min，进行40次循环；98 ℃10 min的热失活，并冷却至4 ℃；升降温速度为2 ℃/s。
进一步地，所述引物Panax notoginseng-F与Panax notoginseng-R的终浓度为900 nmol/L，所述探针Panax notoginseng-P：TACCAATCCCAGCGTA的终浓度为250 nmol/L。
本发明具有以下有益效果：
本发明通过探寻三七粉质量与基因拷贝数的关系，建立了一种基于微滴式数字PCR技术的三七粉精准定量检测方法。该方法包括基于单拷贝核基因DGK1设计的三七源性成分特异性引物和荧光探针组合。本发明在不依赖标准物的情况下，可实现三七粉的精准定量，该方法特异性强、快速、准确，具有重要的实际意义。
附图说明
图1是本发明实施例中基于微滴式数字PCR技术验证三七源性引物和探针的特异性检测结果图，其中1. 三七 2. 人参 3. 西洋参 4. 竹节参 5. 屏边三七 6. 羽叶三七7. 姜状三七 8. 越南人参 9. 大米粉 10. 土豆粉 11. 大豆粉 12. 空白对照；
图2是本发明实施例中的三七粉质量与DNA浓度的线性关系图；
图3是本发明实施例中的DNA浓度与核基因拷贝数的线性关系图。
具体实施方式
通过实施例的方式对本发明做进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。
实施例1：
本实施例通过如下试验对所设计的三七引物和探针组合特异性进行验证。
（1）主要仪器、试剂
仪器：组织研磨器（TissueLyzer Ⅱ，德国Qiagen公司），核酸蛋白分析仪（DU640，德国Beckman公司），PCR仪、QX200微滴生成仪、读数仪（Bio-Rad， USA）。
试剂：2×ddPCR Supermix for probe (No dUTP)，微滴生成油 (Bio-Rad, USA)，Biomiga（Biomiga，USA）植物基因组提取试剂盒。
引物、探针由上海生工生物工程技术服务有限公司，序列如下：
上游引物为Panax notoginseng-F：AGACCTATCATGATGATTACTCTTCC，下游引物为Panax notoginseng-R：GAATAGGAGTATGGAAACAGGTAAGAC；探针为Panax notoginseng-P：TACCAATCCCAGCGTA，在探针的5’ 端连接有一个荧光报告基团FAM，3’ 端连接有一个荧光淬灭基团MGB。
（2）DNA提取
利用Biomiga植物基因组提取试剂盒，分别提取30 mg三七、人参、西洋参、竹节参、屏边三七、羽叶三七、姜状三七、越南人参、大米粉、土豆粉、大豆粉的DNA作为模板，用于微滴式数字PCR检测。
（3）反应体系
PCR反应体系总体积为20 µL，包括：10 µL of 2×ddPCR Supermix for probe(No dUTP)，浓度为10 µmol/L的引物Panax notoginseng-F与Panax notoginseng-R各1.8µL，0.5 µL (10 µmol/L) 探针Panax notoginseng-P，模板DNA 1 µL，加ddH2O补足至20 µL。引物终浓度为900 nmol/L，探针终浓度为250 nmol/L。
（4）微滴生成
将反应体系转入微滴生成卡中，在每个油孔中加入70 µL微滴生成油，盖上橡胶垫后放入微滴生成仪中。将反应微滴转移到96孔板中，封好铝膜。
（5）反应程序
95 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，56℃退火1 min，进行40次循环；98 ℃10min的热失活，并冷却至4 ℃；升降温速度为2 ℃/s。
（6）读数与结果分析
反应结束后，将96孔板放入Bio-Rad QX200微滴读数仪中进行检测。结果如图1所示，所设计的引物探针具有良好的特异性，可以扩增出三七DNA样本，对于其他近缘种、易掺伪品以及空白对照反应体系，均没有显著扩增。
实施例2：
本实施例通过如下试验建立三七粉质量与DNA浓度、DNA浓度与基因拷贝数的线性关系，进而构建三七粉质量与DNA拷贝数的线性关系，最终实现测定三七粉质量，包括以下步骤：
（1）利用Biomiga试剂盒提取不同质量梯度三七粉的基因组DNA，每个质量梯度做 三个重复。采用核酸蛋白分析仪测定DNA浓度。以三七粉质量M （mg）为横坐标，以DNA浓度Y1 （ng/µL）为纵坐标，建立标准曲线，得到三七粉质量与DNA浓度的线性关系。其中，三七整个 主根打粉，过200目筛制得三七粉样品。称取质量分别为10 mg，15 mg，20 mg，25 mg，30 mg， 35 mg，40 mg，45 mg，50 mg的三七粉提取DNA。结果如图2所示，三七粉质量与DNA浓度的线 性回归方程为
Figure DEST_PATH_IMAGE001
，R2值为0.996。
（2）将梯度浓度的三七粉DNA进行微滴式数字PCR检测。DNA梯度浓度为45 ng/µL，40 ng/µL，35 ng/µL，30 ng/µL，25 ng/µL，20 ng/µL，15 ng/µL，10 ng/µL，5 ng/µL。
仪器：组织研磨器（TissueLyzer Ⅱ，德国Qiagen公司），核酸蛋白分析仪（DU640，德国Beckman公司），PCR仪、QX200微滴生成仪、读数仪（Bio-Rad， USA）。
试剂：2×ddPCR Supermix for probe (No dUTP)，微滴生成油 (Bio-Rad, USA)，Biomiga（Biomiga，USA）植物基因组提取试剂盒。
引物、探针由上海生工生物工程技术服务有限公司，序列如下：
上游引物为Panax notoginseng-F：AGACCTATCATGATGATTACTCTTCC，下游引物为Panax notoginseng-R：GAATAGGAGTATGGAAACAGGTAAGAC；探针为Panax notoginseng-P：TACCAATCCCAGCGTA，在探针的5’ 端连接有一个荧光报告基团FAM，3’ 端连接有一个荧光淬灭基团MGB。
PCR反应体系总体积为20 µL，包括：10 µL of 2×ddPCR Supermix for probe(No dUTP)，浓度为10 µmol/L的引物Panax notoginseng-F与Panax notoginseng-R各1.8µL，0.5 µL (10 µmol/L) 探针Panax notoginseng-P，模板DNA 1 µL，加ddH2O补足至20 µL。引物终浓度为900 nmol/L，探针终浓度为250 nmol/L。
将反应体系转入微滴生成卡中，在每个油孔中加入70 µL微滴生成油，盖上橡胶垫后放入微滴生成仪中。将反应微滴转移到96孔板中，封好铝膜。
95 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火1 min，进行40次循环；98 ℃10min的热失活，并冷却至4 ℃；升降温速度为2 ℃/s。
反应结束后，将96孔板放入Bio-Rad QX200微滴读数仪中进行检测。结果如图3所 示，三七粉DNA浓度Y1 （ng/µL）与DNA拷贝数（C）线性关系为
Figure 556423DEST_PATH_IMAGE002
，R2值 为0.9985。
根据所建立的三七粉质量与DNA浓度、与DNA拷贝数的回归方程得到三七粉质量 （M）与DNA拷贝数（C）的线性关系为：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
。
（3）方法准确性的验证试验
将已知含量的大米粉、土豆粉、大豆粉与三七粉混合，提取30 mg混合样品的DNA，根据步骤（2）进行微滴式数字PCR检测，并根据步骤（2）中所得到的三七粉质量与DNA拷贝数的线性方程计算混合样品中三七粉含量。结果如表1，三七粉测量值与实际值相近，偏差为-10.4%~11.65%，RSD值均小于25%。综上，本发明提供的基于数字PCR技术三七粉定量检测方法具有良好的精确度，可较好的应用于实际检测中。
以上所述仅为本发明的较佳实例，但本发明的保护范围并不局限于此，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围内。
表1 已知混合成分中三七粉质量的检测
Figure 411247DEST_PATH_IMAGE004
序列表
<110> 中国检验检疫科学研究院
<120> 一种基于微滴式数字PCR技术的三七粉精准定量方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> 三七(Panax notoginseng)
<400> 1
agacctatca tgatgattac tcttcc 26
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> 三七(Panax notoginseng)
<400> 2
gaataggagt atggaaacag gtaagac 27
<210> 3
<211> 16
<212> DNA
<213> 三七(Panax notoginseng)
<400> 3
taccaatccc agcgta 16

Claims (3)

1.一种基于微滴式数字PCR技术的三七粉精准定量方法，其特征在于，以三七单拷贝核基因所设计的引物和探针组合物，建立三七粉质量与DNA浓度、DNA浓度与基因拷贝数关系，以DNA浓度为中间量构建基因拷贝数和三七粉质量关系，进而测定三七粉含量；所述单拷贝核基因为甘油二酯激酶基因1（diacylglycerol kinase 1 gene，DGK1），所设计的引物和探针如下：其中上游引物为Panax notoginseng -F：AGACCTATCATGATGATTACTCTTCC；下游引物为Panax notoginseng -R：GAATAGGAGTATGGAAACAGGTAAGAC；探针为Panax notoginseng -P：TACCAATCCCAGCGTA，其中探针的5’端连接有一个荧光报告基团FAM，3’端连接有一个荧光淬灭基团MGB。
2.根据权利要求1所述的三七粉精准定量方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）将三七主根打粉，过筛，制得三七粉；提取不同梯度质量三七粉的基因组DNA，并测定DNA浓度，建立三七粉质量与DNA浓度的线性关系；
（2）将权利要求1中的引物和探针组合物加入不同梯度浓度三七粉DNA的反应体系中，进行微滴式数字PCR检测，建立DNA浓度与DNA拷贝数的线性关系；
（3）根据步骤（1）与步骤（2）建立的线性关系，以DNA浓度为中间量，建立三七粉质量与DNA拷贝数的线性关系。
3.根据权利要求2所述的三七粉精准定量方法，其特征在于，所述步骤（2）中，退火温度为56-60℃。
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