CN109913570A - 用于鉴别川贝母真伪或用于检测川贝母掺伪程度的pcr引物和方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于鉴别川贝母真伪或用于检测川贝母掺伪程度的PCR引物和方法。该PCR引物包括川贝母真品鉴别引物和/或川贝母伪品鉴别引物；其中，川贝母真品鉴别引物以川贝母ITS1区的第75位碱基“C”为3'未端，川贝母伪品鉴别引物则以伪川贝母ITS1区的第75位碱基“T”为3'未端，本申请在两种引物3'端第3、9、10位碱基处均引入碱基错配，获得如SEQ ID No.1或2的川贝母真品鉴别引物和如SEQ ID No.3或4的川贝母伪品鉴别引物。采用本申请的PCR引物对川贝母样品进行鉴定，能够准确快捷的鉴别出川贝母真伪或检测出川贝母掺伪程度。

Description

用于鉴别川贝母真伪或用于检测川贝母掺伪程度的PCR引物 和方法

技术领域

本发明属于川贝母鉴定技术领域，具体涉及一种用于鉴别川贝母真伪或用于检测川贝母掺伪程度的 PCR引物和方法。

背景技术

中药川贝母属于百合科贝母属植物，是川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母或太白贝母的干燥鳞茎，主产于四川及其邻近诸省，被收录于历年的《中华人民共和国药典》中。川贝母药用价值高，市场需求量大，且滥挖滥采等原因，导致川贝母的野生植物资源锐减，进而使得川贝母的价格逐年上涨，优质川贝母每公斤的价格最高可至上万元。在经济利益驱使下，市场上以浙贝母、平贝母、伊贝母、湖北贝母混充川贝母的现象十分普遍。这严重影响了药品的安全有效性，因此川贝母的真伪鉴别意义重大。

传统的川贝母鉴别方法有性状鉴别、显微鉴别、薄层鉴别等方法，这些鉴别方法容易受到药材生长环境、生长年限以及产地加工等诸多影响，在川贝母鉴别上存在一定的局限性。例如，研究发现栽培的川贝母和暗紫贝母不含贝母素乙，而中国药典规定：川贝母在薄层鉴别反应中，应出现贝母素乙斑点。这就会出现薄层鉴别法将栽培的川贝母和暗紫贝母鉴定为伪品的情况。

DNA鉴别被公认为是最准确的中药材鉴别方法。最常用且最准确的川贝母DNA鉴别方法是中国药典 2015年版收录的聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性法(PCR-RFLP法)(胡伟、陈伟盛、林秀旎、侯惠婵，聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)鉴定川贝母药材的方法优化[J]，药物分析杂志，2017，37(09):1716-1720)。PCR-RFLP法是一种鉴别单个川贝母真伪的方法。该法首先提取单个川贝母基因组DNA，然后用川贝母特异引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，最后将PCR扩增产物进行酶切，酶切时间2～3小时不等；酶切后，川贝母真品会在在100～200bp之间出现两条酶切条带。

然而制药企业通常一次购买川贝母在200kg以上，按中国药典规定，至少需要抽取25～50g左右川贝母样品进行检测。而25～50g左右的川贝母大约有50～100颗，如果使用PCR-RFLP法进行鉴别，需要进行50～100次PCR-RFLP反应，存在工作量较大，实验时间较长且成本高昂等问题。所以在生产中，常常只取10颗左右川贝母进行真伪鉴别，但是这种取样方法并不能反应样品的整体情况，不能准确反应样品的掺伪程度。尤其是在临床上，川贝母常以粉末形式使用，这更方便了不法分子使用混伪品冒充或掺入川贝母；而混合样品由于DNA不纯，所以也很难用药典PCR-RFLP法来检测混合粉末样品中的掺伪程度。以上问题，导致实际生产中不能对川贝母相关制品进行有效的质量控制。综上所述，急需开发一种技术来解决川贝母特别是川贝粉样品的掺伪程度的鉴别问题。

发明内容

本申请的发明目的是提供一种用于鉴别川贝母真伪或用于检测川贝母掺伪程度的PCR引物和方法。

为实现上述发明目的，本申请的技术方案如下：

一种用于鉴别川贝母真伪的PCR引物，包括用于鉴别川贝母真品的引物对或用于鉴别川贝母伪品的引物对，所述的用于鉴别川贝母真品的引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物具有如SEQ ID No.1 或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列(以下简称“川贝母真品鉴别引物”)：5'-GGCACTATGCTAGCCCTCCC-3' (SEQ ID No.1)；5'-GGCACTATGCTAGCCCTTCC-3'(SEQ ID No.2)；

所述的用于鉴别川贝母伪品的引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物具有如SEQ ID No.3或 SEQ ID No.4所示的核苷酸序列(以下简称“川贝母伪品鉴别引物”)：5'-GGCACTATGCTAGCCCTCCT-3' (SEQ ID No.3)；5'-GGCACTATGCTAGCCCTTCT-3'(SEQ IDNo.4)；

本申请以川贝母ITS1区为参照设计了两条用以鉴别川贝母真品的特异性上游引物和两条用以鉴别川贝母伪品的特异性上游引物，其中，川贝母真品鉴别引物以川贝母ITS1区的第75位碱基“C”为3'未端，川贝母伪品鉴别引物则以伪川贝母(包括浙贝母、平贝母、伊贝母、湖北贝母)ITS1区的第75位碱基“T”为3'未端。为了进一步提高引物的特异性，本申请在川贝母真品鉴别引物和川贝母伪品鉴别引物3'端(3'->5' 方向)的第3、9、10位碱基处引入碱基错配，最终获得如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2的川贝母真品鉴别引物和如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4的川贝母伪品鉴别引物。

实证研究发现，在川贝母真品鉴别引物和川贝母伪品鉴别引物3'端的第3位碱基处引入碱基C或碱基 T对引物的扩增结果没有影响，而在川贝母真品鉴别引物和川贝母伪品鉴别引物3'端的第9位、第10位引入碱基T、A或G时，引入的碱基不同会对扩增结果造成较大影响。其中，以在第9位引入碱基A、在第 10位引入碱基T时，川贝母真品鉴别引物和川贝母伪品鉴别引物的扩增结果较佳；但单个错配碱基的引入 (任一位置)和双错配碱基的引入(第3和9位、第3和10位、第9和10位)均不能完全避免假阳性扩增结果的出现，只有当同时在第3、9、10位碱基处引入特定的错配碱基时，获得的川贝母真品鉴别引物和川贝母伪品鉴别引物在进行扩增时才不会出现假阳性结果。

实证研究发现，不引入碱基错配、或者碱基错配的引入位置和引入数量不恰当时，都会出现假阳性扩增结果，而采用上述的川贝母真品鉴别引物或川贝母伪品鉴别引物对川贝母样品进行鉴定，能够避免假阳性结果出现，从而增强了引物的特异性，确保了鉴别结果的准确性。

在上述的用于鉴别川贝母真伪的PCR引物中，所述的用于鉴别川贝母真品的引物对包括具有如SEQ ID No.5所示核苷酸序列的下游引物，所述的用于鉴别川贝母伪品的引物对包括具有如SEQ ID No.5所示核苷酸序列的下游引物。在上述引物对中，上游引物是关键，当上游引物固定后，对下游引物的碱基序列进行细微调整所得的引物，同样可以准确的鉴别川贝母的真伪。

用于鉴别川贝母真品的引物对或用于鉴别川贝母伪品的引物对单独使用可以对川贝母样品的真伪进行鉴定，用于鉴别川贝母真伪的PCR方法包括以下步骤：

(1)提取川贝母样品的基因组DNA；

可以采用植物基因组DNA提取试剂盒提取川贝母样品的基因组DNA。

(2)以提取的基因组DNA为模板，利用所述的用于鉴别川贝母真伪的PCR引物进行扩增；

PCR体系为：2×SYBR PCR缓冲液2μL，上游引物(10μmoL/L)0.3μL，下游引物(10μmoL/L)0.3 μL，基因组DNA 200ng，无菌双蒸水补足至20μL；

PCR反应程序为：94℃预变性4min；扩增40个循环，每个循环包括以下步骤：94℃30s，68℃30s，扩增结束后采用琼脂糖凝胶电泳对扩增引物进行检测；

(3)根据扩增结果确定川贝母样品的真伪。

若采用用于鉴别川贝母真品的引物对进行扩增出现了目标扩增条带，则川贝母样品为真品；若采用用于鉴别川贝母伪品的引物对进行扩增出现了目标扩增条带，则川贝母样品为伪品。

鉴于所述用于鉴别川贝母真伪的PCR引物的扩增特异性，本申请还提供了一种用于鉴别川贝母真伪的 PCR试剂盒，该试剂盒中包含了所述的用于鉴别川贝母真伪的PCR引物。

用于鉴别川贝母真品的引物对和用于鉴别川贝母伪品的引物对单独使用只能对川贝母的真伪做定性分析，可以实现对川贝母纯样品的真伪鉴定。而若想对川贝母混合样品进行掺伪程度的鉴定必须同时使用上述两对引物对。因此，本申请还提供了一种用于检测川贝母掺伪程度PCR引物，包括用于鉴别川贝母真品的引物对和用于鉴别川贝母伪品的引物对，所述的用于鉴别川贝母真品的引物对包括具有如SEQ ID No.1或2所示核苷酸序列的上游引物，所述的用于鉴别川贝母伪品的引物对包括具有如SEQ ID No.3或4 所示核苷酸序列的上游引物。

在上述的用于检测川贝母掺伪程度的PCR引物中，所述的用于鉴别川贝母真品的引物对还包括具有如 SEQ ID No.5所示核苷酸序列的下游引物，所述的用于鉴别川贝母伪品的引物对还包括具有如SEQ ID No.5 所示核苷酸序列的下游引物。

本申请还提供了一种用于检测川贝母掺伪程度的PCR方法，该PCR方法包括以下步骤：

(1)提取川贝母样品的基因组DNA；

其中，可以采用植物基因组DNA提取试剂盒提取川贝母样品的基因组DNA；

(2)以提取的基因组DNA为模板，利用所述的用于检测川贝母掺伪程度的PCR引物分别进行实时荧光定量PCR扩增并获取C_t值；

其中，实时荧光定量PCR体系为：2×SYBR PCR缓冲液2μL，上游引物(10μmoL/L)0.3μL，下游引物(10μmoL/L)0.3μL，基因组DNA 200ng，无菌双蒸水补足至20μL；

实时荧光定量PCR反应程序为：94℃预变性4min；扩增40个循环，每个循环包括以下步骤：94℃30 s，68℃30s，扩增结束后读板，获取荧光信息；

(3)根据下式计算川贝母样品的掺伪程度：掺伪程度＝1/[(1+2^-(C _t真 ^-C _t伪 ⁾]×100％；

其中，C_t真表示采用用于鉴别川贝母真品的引物对进行荧光定量PCR扩增获得的C_t值，C_t伪表示采用用于鉴别川贝母伪品的引物对进行实时荧光定量PCR扩增获得的C_t值。

采用本申请的方法用于检测川贝母掺伪程度时，提取基因组DNA后无需进行酶切，只需同时进行两次实时荧光定量PCR扩增即可检测出川贝母样品中伪贝母(浙贝母、平贝母、伊贝母、湖北贝母)的掺伪程度，具有操作简单、准确度高、重复性好和特异性强的优点，可以在短时间内对大量的待测川贝母样品进行快速且准确的掺伪程度检测，大大地节约了经济和时间成本。

鉴于所述的用于检测川贝母掺伪程度的PCR引物的扩增特异性，本申请还提供了一种用于检测川贝母掺伪程度的实时荧光定量PCR试剂盒，该试剂盒中包含了所述的用于检测川贝母掺伪程度的PCR引物。

与现有技术相比，本申请的有益效果体现在：

本发明在PCR引物的上游引物3'端(3'->5'方向)的第3、9、10位碱基处引入碱基错配，使得PCR 引物具有优良的扩增特异性，鉴别结果准确性高，可以快速、准确地对川贝母样品的真伪进行鉴定，同时，提取基因组DNA后无需进行酶切，只需同时进行两次实时荧光定量PCR扩增即可检测出川贝母样品中伪贝母(浙贝母、平贝母、伊贝母、湖北贝母)的掺伪程度，具有操作简单、准确度高、重复性好和特异性强的优点，可以在短时间内对大量的待测川贝母样品进行快速且准确的掺伪程度检测，大大地节约了经济和时间成本。

附图说明

图1a、图1b、图1c、图1d、图1e、图1f分别是采用中国药典收录的PCR-RFLP技术，使用引物对5 对川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母标准品进行真伪鉴定的结果。图2a、图 2b、图2c、图2d分别是采用中国药典收录的PCR-RFLP技术，使用引物对5对浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母标准品进行真伪鉴定的结果。图3a、图3b、图3c、图3d、图3e、图3f分别是采用本发明用于鉴别川贝母真伪的PCR方法，使用本发明的引物对1对川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母标准品进行真伪鉴定的结果。图4a、图4b、图4c、图4d分别是采用本发明用于鉴别川贝母真伪的PCR方法，使用本发明的引物对1对浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母标准品进行真伪鉴定的结果。图5a、图5b、图5c、图5d、图5e、图5f分别是采用本发明用于鉴别川贝母真伪的PCR方法，使用本发明的引物对2对川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母标准品进行真伪鉴定的结果。图6a、图6b、图6c、图6d分别是采用本发明用于鉴别川贝母真伪的PCR方法，使用本发明的引物对2对浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母标准品进行真伪鉴定的结果。图7a、图7b、图7c、图 7d、图7e、图7f分别是采用本发明用于鉴别川贝母真伪的PCR方法，使用本发明的引物对3对川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母标准品进行真伪鉴定的结果。图8a、图8b、图8c、图8d分别是采用本发明用于鉴别川贝母真伪的PCR方法，使用本发明的引物对3对浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母标准品进行真伪鉴定的结果。图9a、图9b、图9c、图9d、图9e、图9f分别是采用本发明用于鉴别川贝母真伪的PCR方法，使用本发明的引物对4对川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母标准品进行真伪鉴定的结果。图10a、图10b、图10c、图10d分别是采用本发明用于鉴别川贝母真伪的PCR方法，使用本发明的引物对4对浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母标准品进行真伪鉴定的结果。图11为利用中国药典收录的PCR-PFLP技术对10批市售川贝母进行鉴别的电泳图谱；图 12为采用本发明的引物对1对10批市售川贝母进行鉴别的电泳图谱；图13为采用本发明的引物对2对 10批市售川贝母进行鉴别的电泳图谱；图14为采用本发明的引物对3对10批市售川贝母进行鉴别的电泳图谱；图15为采用本发明的引物对4对10批市售川贝母进行鉴别的电泳图谱；图11至图15中，泳道M 为DNA Marker I，泳道1为川贝母，泳道2为平贝母，泳道3-12为市售川贝母CBM-1至CBM-10。图16a、图16b、图16c、图16d分别是采用本发明用于鉴别川贝母真伪的PCR方法，使用本发明的引物对6对浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母标准品进行真伪鉴定的结果。图17a、图17b、图17c、图17d、图17e、图17f分别是采用本发明用于鉴别川贝母真伪的PCR方法，使用本发明的引物对7对川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母标准品进行真伪鉴定的结果。图18为采用引物对8对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图19为采用引物对9对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图20为采用引物对10对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图21为采用引物对11对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图22为采用引物对12对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图23为采用引物对13对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图24为采用引物对14对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图25为采用引物对 15对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图26为采用引物对16对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图 27为采用引物对17对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图28为采用引物对18对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图29为采用引物对19对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图30为采用引物对20对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图31为采用引物对21对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图32为采用引物对22对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图33为采用引物对23对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图34为采用引物对24对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图35为采用引物对25对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图36为采用引物对26对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图37为采用引物对27对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图38为采用引物对28对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图39为采用引物对29对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图40为采用引物对30对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图41为采用引物对31对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图42为采用引物对32对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图43为采用引物对33对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图44为采用引物对34对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图45为采用引物对35对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图46为采用引物对36对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图47为采用引物对37对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图48为采用引物对38对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图49 为采用引物对39对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图50为采用引物对40对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图51为采用引物对41对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图52为采用引物对42对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图53为采用引物对43对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图54为采用引物对44对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图55为采用引物对45对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图56为采用引物对46对平贝母标准品进行鉴别的电泳图谱；图57为采用引物对47对川贝母标准品进行鉴别的电泳图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案做进一步详细说明。

实施例中使用到的实验材料包括：甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母，均收集自各贝母主产地，经过贵州医科大学生药学教研室刘春花副教授鉴定。川贝母标准品(批号：121000-201108)、平贝母标准品(批号：120924-201410)、伊贝母标准品(批号：120929-201005)、湖北贝母标准品(批号： 120962-201005)、浙贝母标准品(批号：120972-201405)均购自中国食品药品检定研究院；其他10组样品CBM-1至CBM-10为市售川贝母。

实施例中使用到的试剂包括：DNA提取试剂盒(货号DP321)、DNA Marker I(货号MD101)和50bp DNA Ladder(货号MD108)均购自北京天根生化科技有限公司；GelRed(货号41003)购自BIOTIUM公司；SYBR荧光定量PCR试剂(货号RR820Q)、6×Loading Buffer(货号9156)均购自Takara公司；KOD-plus 酶(货号F0934K)均购自Toyobo公司；Sma I酶(货号ER0661)购自Thermo公司。

实施例中使用到的仪器包括：凝胶成像仪(Syngene，型号G:BOX ChemiXL1.4)；荧光定量PCR仪 (BIO-RAD，型号CFX-96)；电泳仪(BIO-RAD，型号Powerpac^TM Basic)；高速冷冻离心机(Thermo，型号Fresco 17)；振荡恒温孵育器(艾本森，型号TMC)。

对比例1

采用中国药典收录的PCR-RFLP技术分别对川贝母基原(川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母)、川贝母伪品(浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母)进行鉴别，鉴别方法包括：

(1)基因组DNA的提取

每种贝母各取6个批次，首先进行样品处理：

①取50g川贝母依次用灭菌水、75％乙醇和双蒸水清洗，置于超净工作台晾干；②晾干后称重，并用手术刀在超净工作台中将每颗川贝母除去外皮，从每颗川贝母的内部切下50分之一原质量备用；③将切下的川贝母样品混合，转至另一个研钵中，研磨成细粉；④将细粉混匀，并取0.5g细粉进行基因组提取。

然后使用DNA提取试剂盒进行DNA提取：

①称取川贝母粉末0.5g于5ml的离心管中；②加入2ml裂解液和110μl的RNase A(10mg/ml)，旋涡振荡1min，室温放置10min；③加入2.5ml中和液充分混匀，涡旋振荡1min；④13,000g离心10min，将上清转移至新的离心管中；⑤向上清液中加入0.7倍体积的异丙醇，充分混匀。12,000rpm离心2min，弃上清，保留沉淀；⑥加入600μl 70％乙醇，涡旋振荡5s，12,000rpm离心2min，弃上清。重复步骤⑥一次；⑦开盖倒置，室温5-10min，彻底晾干残余的乙醇；⑧加入20μl ddH2O，65℃水浴10-60min溶解 DNA，其间轻弹混匀数次助溶，最终得到川贝母基因组DNA溶液。

(2)普通PCR扩增

以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，借助如下引物对5，在KOD-plus酶的作用下扩增序列：

引物对5(收录于：《中华人民共和国药典》2015年版一部川贝母)：

上游引物5：5'-CGTAACAAGGTTTCCGTAGGTGAA-3'(SEQ ID No.6)；

下游引物：5'-GCTACGTTCTTCATCGAT-3'(SEQ ID No.7)。

PCR反应条件为：反应体积为30μL PCR，其中10×PCR缓冲液3μL，MgCl₂(25mmoL/L)2.4μL， dNTP(10mmoL/L)0.6μL，上游引物(30μmoL/L)0.5μL，下游引物(30μmoL/L)0.5μL，基因组DNA 200ng，KOD-plus酶(5U/μL)0.2μL，无菌双蒸水补足至30μL。

反应程序为：94℃预变性4min；扩增30个循环，每个循环包括以下步骤：95℃变性30s，58℃退火 30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。

(3)酶切鉴定

取步骤(2)的PCR反应液，置于1.5mL离心管中，利用Sma I酶对其进行酶切，鉴定样品的真伪。

酶切反应体系为：10×酶切缓冲液2μL，PCR反应液6μL，Sma I酶(10U/μL)0.5μL，无菌水补足至20μL。反应条件为：30℃、2h。

(4)利用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果

利用1.5％琼脂糖凝胶电泳及借助凝胶成像系统来分析步骤(3)酶切反应的结果，其中，电泳条件为：恒压，电压为5V/cm；电泳时间为30min。其结果分别如图1和图2所示。

如图1所示，经Sma I酶切后，川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母样品在100～250bp之间出现了2条酶切条带，与中国药典规定相符，说明本实验所用到的样品均为真品；如图 2所示，浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母样品在100～250bp之间没有酶切条带，不符合中国药典对川贝母基原的规定，说明本实验所用到的样品均为川贝母伪品。

实施例1

本实施例一种用于鉴别川贝母真伪的PCR方法，分别采用下述引物对1、引物对2、引物对3、引物对4对川贝母基原(川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母)、川贝母伪品(浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母)进行鉴别，各引物对的上游引物均在3'端(3'->5'方向)的第3、9、 10位碱基处引入碱基错配。鉴别方法包括：

(1)基因组DNA的提取：与实施例1中步骤(1)相同；

(2)PCR扩增

以步骤(1)获得的基因组DNA为模板，分别采用下述引物对进行PCR扩增：

其中，引物对1包括：上游引物1：5'-GGCACTATGCTAGCCCTCCC-3'(SEQ ID No.1)；

引物对2包括：上游引物2：5'-GGCACTATGCTAGCCCTTCC-3'(SEQ ID No.2)；

引物对3包括：上游引物3：5'-GGCACTATGCTAGCCCTCCT-3'(SEQ ID No.3)；

引物对4包括：上游引物4：5'-GGCACTATGCTAGCCCTTCT-3'(SEQ ID No.4)；

各引物对的下游引物均为：5'-AGAGCCGAGATATCCGTTGC-3'(SEQ ID No.5)；

PCR反应体系均为：2×SYBR PCR缓冲液2μL，上游引物(10μmoL/L)0.3μL，下游引物(10μmoL/L) 0.3μL，基因组DNA 200ng，无菌双蒸水补足至20μL。PCR反应程序为：94℃预变性4min；扩增40个循环，每个循环包括以下步骤：94℃30s，68℃30s。

(3)琼脂糖凝胶电泳检测

按照实施例1步骤4)的方法，对步骤2)的扩增样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，其结果分别如图3、图4、图5、图6、图7、图8、图9和图10所示。

其中，如图3和图4所示，在引物对1的扩增下，川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母样品均扩出了200bp左右的条带(图3)，而浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母样品未扩增出200bp左右的条带(图4)。如图5和图6所示，在引物对2的扩增下，川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母样品均扩出了200bp左右的条带(图5)，而浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母样品未扩增出200bp左右的条带(图6)。说明当PCR反应模板为川贝母真品时，引物对1 和引物对2能扩增出符合理论大小的条带，而当PCR反应模板为川贝母伪品时，引物对1和引物对2不能引发PCR扩增。引物对1和引物对2均能以扩增出PCR产物的方式来鉴别川贝母真品，而不能以扩增出 PCR产物的方式来鉴别川贝母伪品。

如图7和图8所示，在引物对3的扩增下，川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母样品均未扩增出条带(图7)；而浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母扩增出200bp的DNA条带(图 8)。如图9和图10所示，在引物对4的扩增下，川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母样品均未扩增出条带(图9)；而浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母扩增出200bp的DNA条带 (图10)。说明当PCR反应模板为川贝母伪品时，引物对3和引物对4能扩增出符合理论大小的条带，而当PCR反应模板为川贝母真品时，引物对3和引物对4不能引发PCR扩增。引物对3和引物对4均能以扩增出PCR产物的方式来鉴别川贝母伪品，而不能以扩增出PCR产物的方式来鉴别川贝母真品。

实施例2

按照对比例1的方法，采用引物对5对10组市售川贝母样品CBM-1至CBM-10进行真伪鉴定，其结果如图11所示。同时按照实施例1的方法，分别采用引物对1～4对10组市售川贝母样品CBM-1至CBM-10 进行真伪鉴定，其结果分别如图12、图13、图14和图15所示。

按照中国药典的规定，川贝母标准品经Sma I酶切后，产生两条新的条带且大小在100～250bp之间。从图11可以看出，泳道1(川贝母标准品)在100～250bp之间有两条带，证明其是川贝母真品；泳道2 (平贝母标准品)在100～250bp之间没有条带，说明其不是川贝母真品；泳道3、4、7、8、10和12在 100～250bp之间有两条带，说明CBM-1、CBM-2、CBM-5、CBM-6、CBM-8和CBM-10六批药材是真品，而泳道5、6、9和11没有条带，说明CBM-3、CBM-4、CBM-7和CBM-9四批药材是伪品。这与对比例 1的结果相一致。

根据本发明的设计，川贝母真品在经引物对1和引物对2扩增后，应该出现一条200bp左右的条带。从图12(引物对1)和图13(引物对2)可以看出，泳道1(川贝母标准品)在200bp左右有单一条带，泳道2(平贝母标准品)无条带；泳道3、4、7、8、10和12在200bp左右有单一条带，说明当模板为川贝母真品基因组DNA时，引物对1、2能引发扩增；而泳道5、6、9和11无条带，说明当模板为川贝母伪品基因组DNA时，引物对1、2不能引发扩增。实验结果与实施例1的结果一致。

根据本发明的设计，川贝母伪品在经引物对3和引物对4扩增后，应该出现一条200bp左右的条带。从图14(引物对3)和图15(引物对4)可以看出，泳道1(川贝母标准品)无条带，泳道2(平贝母标准品)在200bp左右有单一条带；泳道3、4、7、8、10和12无条带，说明当模板为川贝母真品基因组 DNA时，引物对3、4不能引发扩增；而泳道5、6、9和11在200bp左右有单一条带，说明当模板为川贝母伪品基因组DNA时，引物对3和4能引发扩增。实验结果与实施例1的结果一致。

对比例2

采用与实施例1相同的方法，利用引物对6对川贝母伪品(浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母)进行鉴别，利用引物对7对川贝母基原(川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母) 进行鉴别，其中引物对6的上游引物6除了在3'端(3'->5'方向)的第3、9、10位碱基处未引入碱基错配外，其余碱基序列与上游引物1或2相同，下游引物为SEQ ID No.5；

上游引物6：5'-GGCACTATGCCCGCCCTGCC-3'(SEQ ID No.8)；

而引物对7的上游引物7除了在3'端(3'->5'方向)的第3、9、10位碱基处未引入碱基错配外，其余碱基序列与上游引物3或4相同，下游引物为SEQ ID No.5；

上游引物7：5'-GGCACTATGCCCGCCCTGCT-3'(SEQ ID No.9)

PCR扩增结果分别如图16和图17所示。

由图16可见，在引物对6的作用下，浙贝母、平贝母、伊贝母和湖北贝母样品均扩增出200bp左右的条带。这一检测结果与实施例1的结果不相符，说明当PCR反应模板为川贝母伪品时，未引入碱基错配的引物对6会引发假阳性扩增，导致无法鉴别川贝母样品的真伪。

由图17可见，在引物对7的作用下，川贝母、甘肃贝母、暗紫贝母、瓦布贝母、梭砂贝母和太白贝母各有部分批次的样品扩增出200bp左右的条带，这一检测结果与实施例1不相符。说明当PCR反应模板为川贝母真品时，未引入碱基错配的引物对7会引发假阳性扩增，导致无法鉴别川贝母样品的真伪。

对比例3

在上游引物6的3'端(3'->5'方向)的第2位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物8： 5'-GGCACTATGCCCGCCCTGTC-3'(SEQ ID No.10)。利用上游引物8和下游引物(SEQ IDNo.5)组成的引物对8对6批平贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果如图18所示。

在上游引物7的3'端(3'->5'方向)的第2位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物9： 5'-GGCACTATGCCCGCCCTGTT-3'(SEQ ID No.11)。利用上游引物9和下游引物(SEQ IDNo.5)组成的引物对9对6批川贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果如图19所示。

由图18可见，在引物对8的作用下，平贝母样品均扩增出200bp左右的条带，这一检测结果与引物对6的检测结果相符。由图19可见，在引物对9的作用下，川贝母样品均扩增出200bp左右的条带，这一检测结果与引物对7结果相符。说明只在3'端(3'->5'方向)的第2位碱基处引入错配碱基T，不能提高引物对川贝母真伪的辨识度。

对比例4

在上游引物6的3'端(3'->5'方向)的第3位碱基处引入错配碱基C，获得上游引物10： 5'-GGCACTATGCCCGCCCTCCC-3'(SEQ ID No.12)；在上游引物6的3'端(3'->5'方向)的第3位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物11：5'-GGCACTATGCCCGCCCTTCC-3'(SEQ IDNo.13)。分别利用上游引物10、上游引物11与下游引物(SEQ ID No.5)组成的引物对10、引物对11分别对6批平贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果分别如图20和图21所示。

由图20和图21可见，在引物对10(图20)或引物对11(图21)的作用下，平贝母有3批样品扩增出200bp左右的条带，有3批样品未扩增出条带。与引物对6的扩增结果(样品均扩增出200bp左右的条带)相比，这一检测结果表明，在3'端(3'->5'方向)的第3位碱基处引入错配碱基C或T均可提高引物对川贝母真伪的辨识度，但是仍然会出现将伪品鉴定为川贝母真品的情况。

在上游引物7的3'端(3'->5'方向)的第3位碱基处引入错配碱基C，获得上游引物12： 5'-GGCACTATGCCCGCCCTCCT-3'(SEQ ID No.14)；在上游引物7的3'端(3'->5'方向)的第3位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物13：5'-GGCACTATGCCCGCCCTTCT-3'(SEQ IDNo.15)。分别利用上游引物12、上游引物13与下游引物(SEQ ID No.5)组成的引物对12、引物对13对6批川贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果分别如图22和图23所示。

由图22和图23可见，在引物对12(图22)或引物对13(图23)的作用下，川贝母有3批样品扩增出200bp左右的条带，有3批样品未扩增出条带。与引物7扩增结果相比(样品均扩增出200bp左右的条带)，这一检测结果表明，在3'端(3'->5'方向)的第3位碱基处引入错配碱基C或T，可提高引物对川贝母真伪的辨识度，但是仍然会出现将川贝母真品鉴定为伪品的情况。

对比例5

在上游引物6的3'端(3'->5'方向)的第4位碱基处引入错配碱基A，获得上游引物14： 5'-GGCACTATGCCCGCCCAGCC-3'(SEQ ID No.16)；在上游引物6的3'端(3'->5'方向)的第5位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物15：5'-GGCACTATGCCCGCCTTGCC-3'(SEQ IDNo.17)；在上游引物6 的3'端(3'->5'方向)的第6位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物16：5'-GGCACTATGCCCGCTCTGCC-3' (SEQ ID No.18)；在上游引物6的3'端(3'->5'方向)的第7位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物17： 5'-GGCACTATGCCCGTCCTGCC-3'(SEQ IDNo.19)；在上游引物6的3'端(3'->5'方向)的第8位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物18：5'-GGCACTATGCCCTCCCTGCC-3'(SEQ ID No.20)。

分别利用上游引物14、上游引物15、上游引物16、上游引物17、上游引物18与下游引物(SEQ ID No.5) 组成的引物对14、引物对15、引物对16、引物对17、引物对18对6批平贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果分别如图24、图25、图26、图27和图28所示。

上游引物7的3'端(3'->5'方向)的第4位碱基处引入错配碱基A，获得上游引物19：5'-GGCACTATGCCCGCCCAGCT-3'(SEQ ID No.21)；在上游引物7的3'端(3'->5'方向)的第5位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物20：5'-GGCACTATGCCCGCCTTGCT-3'(SEQ ID No.22)；在上游引物7 的3'端(3'->5'方向)的第6位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物21：5'-GGCACTATGCCCGCTCTGCT-3' (SEQ ID No.23)；在上游引物7的3'端(3'->5'方向)的第7位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物22： 5'-GGCACTATGCCCGTCCTGCT-3'(SEQ ID No.24)；在上游引物7的3'端(3'->5'方向)的第8位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物23：5'-GGCACTATGCCCTCCCTGCT-3'(SEQ ID No.25)。

分别利用上游引物19、上游引物20、上游引物21、上游引物22、上游引物23与下游引物(SEQ ID No.5) 组成的引物对19、引物对20、引物对21、引物对22和引物对23对6批川贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果分别如图29、图30、图31、图32和图33所示。

由图24、图25、图26、图27和图28可见，在引物对14(图24)、引物对15(图25)、引物对16(图 26)、引物对17(图27)和引物对18(图28)的作用下，平贝母样品均扩增出200bp左右的条带，这一检测结果与引物6的检测结果相符。由图29、图30、图31、图32和图33可见，在引物对19(图29)、引物对20(图30)、引物对21(图31)、引物对22(图32)和引物对23(图33)的作用下，川贝母样品均扩增出200bp左右的条带，这一检测结果与引物7的检测结果相符。说明在3'端(3'->5'方向)的第4 位、第5位、第6位、第7位或第8位碱基处引入错配碱基不能提高引物对川贝母真伪的辨识度。

对比例6

在上游引物6的3'端(3'->5'方向)的第9位碱基处分别引入错配碱基A、T和G，获得上游引物24： 5'-GGCACTATGCCAGCCCTGCC-3'(SEQ ID No.26)；上游引物25：5'-GGCACTATGCCTGCCCTGCC-3' (SEQ ID No.27)；以及上游引物26：5'-GGCACTATGCCGGCCCTGCC-3'(SEQ ID No.28)。分别利用上游引物24、上游引物25、上游引物26与下游引物(SEQ ID No.5)组成的引物对24、引物对25、引物对 26对6批平贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果分别如图34、图35和图36所示。

如图34可见，在引物对24的作用下，平贝母有3批样品扩增出200bp左右的条带，有3批样品未扩增出条带。与引物对6的扩增结果相比(平贝母样品均扩增出200bp左右的条带)，这一检测结果表明在 3'端(3'->5'方向)的第9位碱基处引入错配碱基A，可提高引物对川贝母真伪的辨识度，但是仍然会出现将伪品鉴定为川贝母真品的情况。

如图35，在引物对25的作用下，平贝母有5批样品扩增出200bp左右的条带，有1批样品未扩增出条带。如图36，在引物对26的作用下，平贝母有4批样品扩增出200bp左右的条带，有2批样品未扩增出条带。与引物对6的扩增结果相比(平贝母样品均扩增出200bp左右的条带)，这一检测结果表明在3' 端(3'->5'方向)的第9位碱基处引入错配碱基T或G，可提高引物对川贝母真伪的辨识度，但是仍然会出现将伪品鉴定为川贝母真品的情况，且真伪辨识度提高程度较引物对24差。

在上游引物7的3'端(3'->5'方向)的第9位碱基处分别引入错配碱基A、T和G，获得上游引物27： 5'-GGCACTATGCCAGCCCTGCT-3'(SEQ ID No.29)；上游引物28：5'-GGCACTATGCCTGCCCTGCT-3' (SEQ ID No.30)；以及上游引物29：5'-GGCACTATGCCGGCCCTGCT-3'(SEQ ID No.31)。分别利用上游引物27、上游引物28、上游引物29与下游引物(SEQ ID No.5)组成的引物对27、引物对28、引物对29对6批川贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果分别如图37、图38和图39所示。

如图37，在引物对27的作用下，川贝母有3批样品扩增出200bp左右的条带，有3批样品未扩增出条带。与引物对7的扩增结果相比(川贝母样品均扩增出200bp左右的条带)，这一检测结果说明在3'端 (3'->5'方向)的第9位碱基处引入错配碱基A，可提高引物对川贝母真伪的辨识度，但是仍然会出现将川贝母真品鉴定为伪品的情况。

如图38，在引物对28的作用下，川贝母有4批样品扩增出200bp左右的条带，有2批样品未扩增出条带。如图39，在引物对29的作用下，川贝母有4批样品扩增出200bp左右的条带，有2批样品未扩增出条带。可见与引物对7的扩增结果相比(川贝母样品均扩增出200bp左右的条带)，这一检测结果说明在3'端(3'->5'方向)的第9位碱基处引入错配碱基T或G，可提高引物对川贝母真伪的辨识度，但是仍然会出现将川贝母真品鉴定为伪品的情况，且真伪辨识度提高程度较引物对27差。

对比例7

在上游引物6的3'端(3'->5'方向)的第10位碱基处分别引入错配碱基T、A和G，得上游引物30： 5'-GGCACTATGCTCGCCCTGCC-3'(SEQ ID No.32)；上游引物31：5'-GGCACTATGCACGCCCTGCC-3' (SEQ ID No.33)；以及上游引物32：5'-GGCACTATGCGCGCCCTGCC-3'(SEQ ID No.34)。分别利用上游引物30、上游引物31、上游引物32与下游引物(SEQ ID No.5)组成的引物对30、引物对31、引物对 32对6批平贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果分别如图40、图41和图42所示。

由图40可见，在引物对30的作用下，平贝母有3批样品扩增出200bp左右的条带，有3批样品未扩增出条带。与引物对6的扩增结果相比(平贝母样品均扩增出200bp左右的条带)，这一检测结果说明在 3'端(3'->5'方向)的第10位碱基处引入错配碱基T，可提高引物对川贝母真伪的辨识度，但是仍然会出现将伪品鉴定为川贝母真品的情况。

由图41可见，在引物对31的作用下，平贝母有4批样品扩增出200bp左右的条带，有2批样品未扩增出条带。由图42可见，在引物对32的作用下，平贝母有4批样品扩增出200bp左右的条带，有2批样品未扩增出条带。与引物对6的扩增结果相比(平贝母样品均扩增出200bp左右的条带)，这一检测结果说明在3'端(3'->5'方向)的第10位碱基处引入错配碱基A或G，可提高引物对川贝母真伪的辨识度，但是仍然会出现将伪品鉴定为川贝母真品的情况，且真伪辨识度的提高程度较引物对30差。

在上游引物7的3'端(3'->5'方向)的第10位碱基处分别引入错配碱基T、A和G，获得上游引物33： 5'-GGCACTATGCTCGCCCTGCT-3'(SEQ ID No.35)；上游引物34：5'-GGCACTATGCACGCCCTGCT-3' (SEQ ID No.36)；以及上游引物35：5'-GGCACTATGCGCGCCCTGCT-3'(SEQ ID No.37)。分别利用上游引物33、上游引物34、上游引物35与下游引物(SEQ ID No.5)组成的引物对33、引物对34、引物对 35对6批川贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果分别如图43、图44和图45所示。

由图43可见，在引物对33的作用下，川贝母有4批样品扩增出200bp左右的条带，有2批样品未扩增出条带。与引物对7的扩增结果相比(川贝母样品均扩增出200bp左右的条带)，这一检测结果说明在 3'端(3'->5'方向)的第10位碱基处引入错配碱基T，可提高引物对川贝母真伪的辨识度，但是仍然会出现将川贝母伪品鉴定为真品的情况。

由图44可见，在引物对34的作用下，川贝母有5批样品扩增出200bp左右的条带，有1批样品未扩增出条带。由图45可见，在引物对35的作用下，川贝母有5批样品扩增出200bp左右的条带，有1批样品未扩增出条带。与引物对7的扩增结果相比(川贝母样品均扩增出200bp左右的条带)这一检测结果，说明在3'端(3'->5'方向)的第10位碱基处引入错配碱基A或G，可提高引物对川贝母真伪的辨识度，但是仍然会出现将川贝母伪品鉴定为真品的情况，且真伪辨识度的提高程度较引物对33差。

对比例8

在上游引物6的3'端(3'->5'方向)的第11位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物36： 5'-GGCACTATGTCCGCCCTGCC-3'(SEQ ID No.38)。利用上游引物36和下游引物(SEQ IDNo.5)组成的引物对36对6批平贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果如图46所示。

在上游引物7的3'端(3'->5'方向)的第11位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物37：5'-GGCACTATGTCCGCCCTGCT-3'(SEQ ID No.39)。利用上游引物37和下游引物(SEQ IDNo.5)组成的引物对37对6批川贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果如图47所示。

由图46可见，在引物对36的作用下，平贝母样品均扩增出200bp左右的条带，这一检测结果与引物 6结果相符。由图47可见，在引物对37的作用下，川贝母样品均扩增出200bp左右的条带。这一检测结果与引物对7的扩增结果相符。说明只在3'端(3'->5'方向)的第11位碱基处引入错配碱基T，不能提高引物对川贝母真伪的辨识度。

对比例9

在上游引物6的3'端(3'->5'方向)的第3位碱基处引入错配碱基C，同时在第9位碱基处引入错配碱基A，获得上游引物38：5'-GGCACTATGCCAGCCCTCCC-3'(SEQ ID No.40)；

在上游引物6的3'端(3'->5'方向)的第3位碱基处引入错配碱基T，同时在第9位碱基处引入错配碱基A，获得上游引物39：5'-GGCACTATGCCAGCCCTTCC-3'(SEQ ID No.41)。

分别利用上游引物38、上游引物39和下游引物(SEQ ID No.5)组成的引物对38、引物对39对6批平贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果分别如图48和图49所示。

由图48可见，在引物对38的作用下，平贝母有1批样品扩增出200bp左右的条带，有5批样品未扩增出条带。由图49可见，在引物对39的作用下，平贝母有2批样品扩增出200bp左右的条带，有4批样品未扩增出条带。与引物对6的扩增结果相比(平贝母样品均扩增出200bp左右的条带)，这一检测结果说明在第3、9位碱基处分别引入错配碱基C/T、A，可提高引物对川贝母真伪的辨识度。

而将引物对38与引物对10(第3位碱基处引入错配碱基C，3批样品扩增出200bp左右的条带)和引物对24(第9位碱基处引入错配碱基A，3批样品扩增出200bp左右的条带)相比；将引物对39与引物对11(第3位碱基处引入错配碱基T，3批样品扩增出200bp左右的条带)和引物对24相比。结果表明，双碱基错配比单碱基错配的川贝母真伪辨识度要高，但是仍然会出现将伪品鉴定为川贝母真品的情况，假阳性现象难以完全避免。

在上游引物7的3'端(3'->5'方向)的第3位碱基处引入错配碱基C，同时在第9位碱基处引入错配碱基A，获得上游引物40：5'-GGCACTATGCCAGCCCTCCT-3'(SEQ ID No.42)；

在上游引物7的3'端(3'->5'方向)的第3位碱基处引入错配碱基T，同时在第9位碱基处引入错配碱基A，获得上游引物41：5'-GGCACTATGCCAGCCCTTCT-3'(SEQ ID No.43)。

分别利用上游引物40、上游引物41和下游引物(SEQ ID No.5)组成的引物对40、引物对41对6批川贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果分别如图50和图51所示。

由图50和图51可见，在引物对40(图50)和引物对41(图51)的作用下，川贝母样品均有2批样品扩增出200bp左右的条带，而有4批样品未扩增出条带；与引物对7的扩增结果相比(6批川贝母样品均扩增出200bp左右的条带)，这一检测结果说明在3'端(3'->5'方向)的第3、9位碱基处分别引入错配碱基C/T、A，可提高引物对川贝母真伪的辨识度。

而将引物对40与引物对12(第3位碱基处引入错配碱基C，3批样品扩增出200bp左右的条带)和引物对27(第9位碱基处引入错配碱基A，3批样品扩增出200bp左右的条带)相比；将引物对41与引物对13(第3位碱基处引入错配碱基T，3批样品扩增出200bp左右的条带)和引物对27相比。结果表明，双碱基错配比单碱基错配的川贝母真伪辨识度要高，但是仍然会出现将真品鉴定为川贝母伪品的情况，假阳性现象难以完全避免。

对比例10

在上游引物6的3'端(3'->5'方向)的第3位碱基处引入错配碱基C，同时在第10位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物42：5'-GGCACTATGCTCGCCCTCCC-3'(SEQ ID No.44)；

在上游引物6的3'端(3'->5'方向)的第3位碱基处引入错配碱基T，同时在第10位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物43：5'-GGCACTATGCTCGCCCTTCC-3'(SEQ ID No.45)。

分别利用上游引物42、上游引物43和下游引物(SEQ ID No.5)组成的引物对42、引物对43对6批平贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果分别如图52和图53所示。

由图52可见，在引物对42的作用下，平贝母有1批样品扩增出200bp左右的条带，有5批样品未扩增出条带；由图53可见，在引物对43的作用下，平贝母有2批样品扩增出200bp左右的条带，有4批样品未扩增出条带；与引物对6的扩增结果相比(平贝母样品均扩增出200bp左右的条带)，这一检测结果说明在第3、10位碱基处分别引入错配碱基C/T、T，可提高引物对川贝母真伪的辨识度。

而将引物对42与引物对10(第3位碱基处引入错配碱基C，3批样品扩增出200bp左右的条带)和引物对30(第10位碱基处引入错配碱基T，3批样品扩增出200bp左右的条带)相比后发现、将引物对 43与引物对11(第3位碱基处引入错配碱基T，3批样品扩增出200bp左右的条带)和引物对30相比后发现，双碱基错配比单碱基错配的川贝母真伪辨识度要高，但是仍然会出现将伪品鉴定为川贝母真品的情况，假阳性现象难以完全避免。

在上游引物7的3'端(3'->5'方向)的第3位碱基处引入错配碱基C，同时在第10位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物44：5'-GGCACTATGCTCGCCCTCCT-3'(SEQ ID No.46)；

在上游引物7的3'端(3'->5'方向)的第3位碱基处引入错配碱基T，同时在第10位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物45：5'-GGCACTATGCTCGCCCTTCT-3'(SEQ ID No.47)。

分别利用上游引物44、上游引物45和下游引物(SEQ ID No.5)组成的引物对44、引物对45对6批川贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果分别如图54和图55所示。

由图54和图55可见，在引物对44和引物对45的作用下，川贝母样品均有2批样品扩增出200bp左右的条带，而有4批样品未扩增出条带；与引物对7的扩增结果相比(6批川贝母样品均扩增出200bp左右的条带)，这一检测结果说明在3'端(3'->5'方向)的第3、10位碱基处分别引入错配碱基C/T、T，可提高引物对川贝母真伪的辨识度。

而将引物对44与引物对12(第3位碱基处引入错配碱基C，3批样品扩增出200bp左右的条带)和引物对33(第10位碱基处引入错配碱基T，4批样品扩增出200bp左右的条带)相比；将引物对45与引物对13(第3位碱基处引入错配碱基T，3批样品扩增出200bp左右的条带)和引物对33相比。结果表明，双碱基错配比单碱基错配的川贝母真伪辨识度要高，但是仍然会出现将真品鉴定为川贝母伪品的情况，假阳性现象难以完全避免。

对比例11

在上游引物6的3'端(3'->5'方向)的第9位碱基处引入错配碱基A，同时在第10位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物46：5'-GGCACTATGCTAGCCCTGCC-3'(SEQ ID No.48)。利用上游引物46和下游引物(SEQ ID No.5)组成的引物对46对6批平贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果如图56所示。

由图56可见，在引物对46的作用下，平贝母有2批样品扩增出200bp左右的条带，有4批样品未扩增出条带；与引物对6的扩增结果相比(平贝母样品均扩增出200bp左右的条带)，这一检测结果说明在第9、10位碱基处分别引入错配碱基A、T，可提高引物对川贝母真伪的辨识度。

而将引物对46与引物对24(第9位碱基处引入错配碱基A，3批样品扩增出200bp左右的条带)和引物对30(第10位碱基处引入错配碱基T，3批样品扩增出200bp左右的条带)相比后发现，双碱基错配比单碱基错配的川贝母真伪辨识度要高，但是仍然会出现将伪品鉴定为川贝母真品的情况，假阳性现象难以完全避免。

在上游引物7的3'端(3'->5'方向)的第9位碱基处引入错配碱基A，同时在第10位碱基处引入错配碱基T，获得上游引物47：5'-GGCACTATGCTAGCCCTGCT-3'(SEQ ID No.49)。利用上游引物47和下游引物(SEQ ID No.5)组成的引物对47对6批川贝母标准品进行鉴别，鉴别方法与实施例1相同，鉴别结果如图57所示。

由图57可见，在引物对47的作用下，川贝母样品均有2批样品扩增出200bp左右的条带，而有4批样品未扩增出条带；与引物对7的扩增结果相比(6批川贝母样品均扩增出200bp左右的条带)，这一检测结果说明在3'端(3'->5'方向)的第9、10位碱基处分别引入错配碱基A、T，可提高引物对川贝母真伪的辨识度。

而将引物对47与引物对27(第9位碱基处引入错配碱基A，3批样品扩增出200bp左右的条带)和引物对33(第10位碱基处引入错配碱基T，4批样品扩增出200bp左右的条带)相比后发现，双碱基错配比单碱基错配的川贝母真伪辨识度要高，但是仍然会出现将真品鉴定为川贝母伪品的情况，假阳性现象难以完全避免。

实施例3

本实施例一种用于检测川贝母掺伪程度的实时荧光定量PCR方法，包括以下步骤：

(1)配制真伪混合样品

取川贝母、浙贝母和平贝母标准品粉末，将川贝母分别与浙贝母、平贝母两两混合，获得两种真伪混合样品，每种真伪混合样品均含有9个真伪混合样品，9个真伪混合样品中伪品含量(质量百分数)依次为90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％。

(2)基因组DNA的提取

按照与实施例1步骤(1)相同的方法，提取各个真伪混合样品的基因组DNA。

(3)荧光定量PCR扩增

以步骤(2)提取的基因组DNA为模板，分别利用引物对1和引物对3进行扩增，荧光定量PCR反应体系为：2×SYBR PCR缓冲液2μL，上游引物(10μmoL/L)0.3μL，下游引物(10μmoL/L)0.3μL，基因组DNA 200ng，无菌双蒸水补足至20μL。

反应程序为：94℃预变性4min；扩增40个循环，每个循环包括以下步骤：94℃30s，68℃30s，读板获取荧光信息，获取C_t值；

(4)数据分析

按下式计算各混合样品的掺伪比例：掺伪程度＝1/[(1+2^-(C _t真 ^-C _t伪 ⁾]×100％；

其中，C_t真表示采用用于鉴别川贝母真品的引物对进行荧光定量PCR扩增获得的C_t值，C_t伪表示采用用于鉴别川贝母伪品的引物对进行实时荧光定量PCR扩增获得的C_t值。

实施例4

本实施例一种用于检测川贝母掺伪程度的实时荧光定量PCR方法，本实施例的检测方法与实施例3 相同，但步骤(3)中采用引物对2和引物对4。实施例3和实施例4的检测结果见表1、表2。

表1川贝母与浙贝母混合样品的掺伪比例检测结果

表2川贝母与平贝母混合样品的掺伪比例检测结果

由表1、表2的数据可见，引物对1和引物对3的组合、引物对2和引物对4的组合均能很好的检测川贝母中各伪品的掺伪程度，检测结果准确。当然，从表中数据可以看出，引物对1也可以和引物对4组合，引物对2也可以和引物对3组合。

实施例5和6

实施例5：本实施例一种用于检测川贝母掺伪程度的实时荧光定量PCR方法，本实施例的检测方法与实施例3相同，但步骤(1)中采用川贝母标准品与市售川贝母伪品配制真伪混合样品，并采用引物对1 和引物对3进行PCR扩增。

实施例6：本实施例一种用于检测川贝母掺伪程度的实时荧光定量PCR方法，本实施例的检测方法与实施例5相同，但步骤(3)中采用引物对2和引物对4。实施例5和实施例6的检测结果见表3。

表3由川贝母标准品与市售川贝母伪品组成的真伪混合样品的掺伪比例检测结果

由表3的数据可以看出，引物对1和引物对3的组合、引物对2和引物对4的组合均能很好的检测川贝母中各伪品的掺伪程度，检测结果准确。当然，从表中数据可以看出，引物对1也可以和引物对4组合，引物对2也可以和引物对3组合。

对比例12-14

对比例12：本实施例一种用于检测川贝母掺伪程度的实时荧光定量PCR方法，本实施例的检测方法与实施例3相同，但步骤(1)中只配制川贝母与平贝母标准品的真伪混合样品，且步骤(3)中采用引物对38和引物对40进行扩增。:

对比例13：本实施例一种用于检测川贝母掺伪程度的实时荧光定量PCR方法，本实施例的检测方法与实施例3相同，但步骤(1)中只配制川贝母与平贝母标准品的真伪混合样品，且步骤(3)中采用引物对42和引物对44进行扩增。

对比例14：本实施例一种用于检测川贝母掺伪程度的实时荧光定量PCR方法，本实施例的检测方法与实施例3相同，但步骤(1)中只配制川贝母与平贝母标准品的真伪混合样品，且步骤(3)中采用引物对46和引物对47进行扩增。对比例12、对比例13和对比例14的检测结果见表4。

表4由川贝母与平贝母标准品组成的真伪混合样品的掺伪程度检测结果

由表4的数据可见，引物对38和引物对40的组合、引物对42和引物对43的组合、引物对46和引物对47的组合，不能真实地反应川贝母中平贝母的掺伪程度，说明在普通的PCR反应中出现假阳性扩增的引物对不能用于检测川贝母中伪品的掺伪程度。

序列表

<110> 贵州医科大学

<120> 用于鉴别川贝母真伪或用于检测川贝母掺伪程度的PCR引物和方法

<160> 49

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 1

ggcactatgc tagccctccc 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 2

ggcactatgc tagcccttcc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 3

ggcactatgc tagccctcct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 4

ggcactatgc tagcccttct 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 5

agagccgaga tatccgttgc 20

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 6

cgtaacaagg tttccgtagg tgaa 24

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 7

gctacgttct tcatcgat 18

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 8

ggcactatgc ccgccctgcc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 9

ggcactatgc ccgccctgct 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 10

ggcactatgc ccgccctgtc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 11

ggcactatgc ccgccctgtt 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 12

ggcactatgc ccgccctccc 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 13

ggcactatgc ccgcccttcc 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 14

ggcactatgc ccgccctcct 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 15

ggcactatgc ccgcccttct 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 16

ggcactatgc ccgcccagcc 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 17

ggcactatgc ccgccttgcc 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 18

ggcactatgc ccgctctgcc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 19

ggcactatgc ccgtcctgcc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 20

ggcactatgc cctccctgcc 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 21

ggcactatgc ccgcccagct 20

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 22

ggcactatgc ccgccttgct 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 23

ggcactatgc ccgctctgct 20

<210> 24

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 24

ggcactatgc ccgtcctgct 20

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 25

ggcactatgc cctccctgct 20

<210> 26

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 26

ggcactatgc cagccctgcc 20

<210> 27

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 27

ggcactatgc ctgccctgcc 20

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 28

ggcactatgc cggccctgcc 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 29

ggcactatgc cagccctgct 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 30

ggcactatgc ctgccctgct 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 31

ggcactatgc cggccctgct 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 32

ggcactatgc tcgccctgcc 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 33

ggcactatgc acgccctgcc 20

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 34

ggcactatgc gcgccctgcc 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 35

ggcactatgc tcgccctgct 20

<210> 36

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 36

ggcactatgc acgccctgct 20

<210> 37

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 37

ggcactatgc gcgccctgct 20

<210> 38

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 38

ggcactatgt ccgccctgcc 20

<210> 39

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 39

ggcactatgt ccgccctgct 20

<210> 40

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 40

ggcactatgc cagccctccc 20

<210> 41

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 41

ggcactatgc cagcccttcc 20

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 42

ggcactatgc cagccctcct 20

<210> 43

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 43

ggcactatgc cagcccttct 20

<210> 44

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 44

ggcactatgc tcgccctccc 20

<210> 45

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 45

ggcactatgc tcgcccttcc 20

<210> 46

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 46

ggcactatgc tcgccctcct 20

<210> 47

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 47

ggcactatgc tcgcccttct 20

<210> 48

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 48

ggcactatgc tagccctgcc 20

<210> 49

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列(Unknown)

<400> 49

ggcactatgc tagccctgct 20

Claims (10)

1.一种用于鉴别川贝母真伪的PCR引物，包括用于鉴别川贝母真品的引物对或用于鉴别川贝母伪品的引物对，其特征在于，所述的用于鉴别川贝母真品的引物对包括具有如SEQID No.1或SEQ ID No.2所示核苷酸序列的上游引物，所述的用于鉴别川贝母伪品的引物对包括具有如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示核苷酸序列的上游引物。

2.如权利要求1所述的用于鉴别川贝母真伪的引物，其特征在于，所述的用于鉴别川贝母真品的引物对包括具有如SEQ ID No.5所示核苷酸序列的下游引物，所述的用于鉴别川贝母伪品的引物对包括具有如SEQ ID No.5所示核苷酸序列的下游引物。

3.一种用于检测川贝母掺伪程度的PCR引物，包括用于鉴别川贝母真品的引物对和用于鉴别川贝母伪品的引物对，其特征在于，所述的用于鉴别川贝母真品的引物对包括具有如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示核苷酸序列的上游引物，所述的用于鉴别川贝母伪品的引物对包括具有如SEQ ID No.3或SEQ ID No.4所示核苷酸序列的上游引物。

4.如权利要求3所述的用于检测川贝母掺伪程度的PCR引物，其特征在于，所述的用于鉴别川贝母真品的引物对包括具有如SEQ ID No.5所示核苷酸序列的下游引物，所述的用于鉴别川贝母伪品的引物对包括具有如SEQ ID No.5所示核苷酸序列的下游引物。

5.一种用于鉴别川贝母真伪的PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取川贝母样品的基因组DNA；

(2)以提取的基因组DNA为模板，利用如权利要求1所述的PCR引物进行PCR扩增；

(3)根据扩增结果确定川贝母样品的真伪。

6.一种用于检测川贝母掺伪程度的PCR方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取川贝母样品的基因组DNA；

(2)以提取的基因组DNA为模板，利用如权利要求3所述的PCR引物分别进行实时荧光定量PCR扩增并获取C_t值；

(3)根据下式计算川贝母样品的掺伪程度：

掺伪程度＝1/[(1+2^-(C _t真 ^-C _t伪 ⁾]×100％；

其中，C_t真表示采用用于鉴别川贝母真品的引物对进行荧光定量PCR扩增获得的C_t值，C_t伪表示采用用于鉴别川贝母伪品的引物对进行荧光定量PCR扩增获得的C_t值。

7.如权利要求6所述的用于检测川贝母掺伪程度的PCR方法，其特征在于，步骤(1)中，采用植物基因组DNA提取试剂盒提取川贝母样品的基因组DNA。

8.如权利要求6所述的用于检测川贝母掺伪程度的PCR方法，其特征在于，步骤(2)中，实时荧光定量PCR体系为：2×SYBR PCR缓冲液2μL，上游引物(10μmoL/L)0.3μL，下游引物(10μmoL/L)0.3μL，基因组DNA 200ng，无菌双蒸水补足至20μL；

实时荧光定量PCR反应程序为：94℃预变性4min；扩增40个循环，每个循环包括以下步骤：94℃30s，68℃30s，扩增结束后读板，获取荧光信息。

9.一种用于鉴别川贝母真伪的PCR试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的用于鉴别川贝母真伪的PCR引物。

10.一种用于检测川贝母掺伪程度的实时荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括如权利要求3所述的用于检测川贝母掺伪程度的PCR引物。