JP2009183213A - モモ検出用プライマーセットおよびモモ検出方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】モモの、trnS-trnG intergenic spacer遺伝子に由来するDNA断片を特異的に増幅する、モモ検出用プライマーセットであって、特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、別の特定の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとから構成される、モモ検出用プライマーセット。(但し、ある特定の塩基配列の組合せを有するオリゴヌクレオチドから構成されるプライマーセットは、除く。)
【選択図】なし
Description
(1) モモのtrnS-trnG intergenic spacer遺伝子に由来するDNA断片を特異的に増幅するモモ検出用プライマーセットであって、配列番号1または2または4に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号3または5に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとから構成される、モモ検出用プライマーセット(但し、配列番号4に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号5に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとから構成されるプライマーセットは除く)。
5’- aattggtcgtaataaaaagtcaaaa-3’(配列番号1)
5’- tggtcgtaataaaaagtcaaaa-3’(配列番号2)
5’- cgtaaacgctctaattttaatgg-3’(配列番号3)
5’- aattggtcgtaataaaaagtcaata-3’(配列番号4)
5’- cgtaaacgctctaattttaatag-3’(配列番号5)
(2) 試料から抽出したDNAを鋳型とし、(1)に記載のいずれかのプライマーセットを用いてPCRを行い、該PCRにより得られた増幅産物の有無を検出する工程を含む、モモの検出方法。
(3) 前記増幅産物の塩基配列からプライマー配列を除いた塩基配列が、配列番号6に示す塩基配列の829番目にあるモモ特徴的塩基部分「g」を含むかどうかを指標として前記増幅産物がモモ由来DNAから増幅されたものであるかどうかを確認する工程を含む、(2)に記載の方法。
(4) (1)に記載のプライマーセットを含む、モモ検出用キット。
上記のように、「モモに共通し、その他の果物と区別できる塩基」はプライマーの3’末端に設定されている。もし、プライマーの3’末端から2番目の塩基を標的とするモモやモモ近縁種の配列とは異なるミスマッチ塩基とすれば、モモのDNAに対してはプライマーの3’末端から2番目の1塩基のみがのみがミスマッチとなるが、モモ近縁種のDNAに対しては少なくとも3’末端から1番目と2番目の2塩基が連続してミスマッチすることになる。そうすることで、例えばアニーリング温度がPCR装置の違い等によって多少異なる場合でも、モモDNAのみを検出し、モモ近縁種DNAを誤って検出しないようなPCR温度条件を得られるだろうと考えた。この考え方に基づき、設計したプライマーのオリゴヌクレオチドの3’末端から2番目の塩基をミスマッチ塩基に置換した。
配列番号1:5’- aattggtcgtaataaaaagtcaaaa-3’
配列番号2:5’- tggtcgtaataaaaagtcaaaa-3’
配列番号3:5’- cgtaaacgctctaattttaatgg-3’
配列番号4:5’- aattggtcgtaataaaaagtcaata-3’
配列番号5:5’- cgtaaacgctctaattttaatag-3’
(実施例1)モモ検出用プライマーの設計および合成
モモ検出用プライマーの設計にあたり、モモ(Prunus persica)を検出対象とし、また、モモ以外の植物は検出してはならないものと設定した。
モモ:Prunus persica(AY500733)
桜桃:Prunus avium(AY871252)
すもも:Prunus salicina(AY500722)
あんず:Prunus armeniaca(AY500725)
うめ:Prunus mume(AY500726)
アーモンド:Prunus dulcis(AY500730)
スピノサモモ:Prunus spinosa(AY500720)
プルーン:Prunus domestica(AY500719)
プルーンの一種:Prunus insititia(AY500718)
サクラ属の一種:Prunus davidiana(AY500731)
サクラ属の一種:Prunus mira(AY500732)
ジューンベリーの近縁種:Amelanchier arborea (EF127115)
サンザシの近縁種:Crataegus laevigata(EF127093)
(1) DNA試料の調製
サンプルは、モモとして、白鳳、川中島白桃、黄金桃、フレーバートップ、秀峰、蟠桃の6品種(種子)、モモ以外の植物試料として、モモ近縁種の中でプライマーが結合すると予想される塩基配列がプライマーと最も高い相同性を示した、桜桃(種子)を用いた。種子については種皮をかみそりで直接手を触れないように剥き、胚を取り出してDNA抽出に用いた。種子は約0.1gを2ml容チューブ(eppendorf社製)に入れ、φ7mm径のジルコニアビーズ(株式会社ニッカトー製)1粒を入れてRetsch MM 300(QIAGEN社製)により細かく粉砕した。種子の粉砕物約0.1gを15mlのバッファー G2(QIAGEN社製)、100μlのProteinase K(20mg/ml)(QIAGEN社製)、20μlのRNase A(100mg/ml)(QIAGEN社製)を入れた50mlチューブに加え、混合した後、50℃で2時間保温した。混合液を2mlチューブに移し替え、約20,000×gで5分間遠心分離し、その上清液を得た。得られた上清液を、予め1mlのバッファー QBT(QIAGEN社製)で平衡化したGenomic-tip 20/G(QIAGEN社製)に供してDNAをtipに吸着させた。その後、6mlのバッファーQC(QIAGEN社製)でtipを洗浄し、予め50℃に加温してある1mlのバッファーQF(QIAGEN社製)でDNAを溶出させた。イソプロパノール沈澱により回収した沈澱物を50μlのTE緩衝液(pH8.0)に溶解した。DNA溶液を分光光度計で220〜350nmのスペクトルを測定し、260nmに極大値がみられたものを、260nmの吸光度から溶液中のDNA濃度を計算した。モモについては、DNA溶液をTE緩衝液(pH8.0)で20ng/μlに希釈し、さらにサケ精子DNA 20ng/μl含有TE緩衝液(pH8.0)で段階希釈したものをPCRの鋳型DNA試料とした。桜桃については、DNA溶液をTE緩衝液(pH8.0)で20ng/μlに希釈したものをPCRの鋳型DNA試料とした。なお、PCR 1反応液には、モモDNA試料として500fg、50fg、5fgを用い、桜桃DNA試料として50ngを用いた。
上記のようにして調製した各鋳型DNA試料を用いてPCRを行った。
PCR反応は、下記表1のPCR反応液組成とPCR反応条件で、フォワードプライマーに配列番号1、リバースプライマーに配列番号3を用い、0.2mlチューブに入れ、PCR装置にABI PRISM 7700(アプライドバイオシステムズ社製:PCR装置としてはGeneAmp PCR System 9600と同等の装置)を使用して行った。
PCR反応後の溶液8μlをそれぞれエチジウムブロマイド含有の3%アガロースゲル電気泳動に供した。同時に分子量マーカーとして20bp DNA Ladder、および100bp DNA Ladder(タカラバイオ株式会社)を100bpのバンドのDNA量が5ngになるように供し、UV照射で視覚化することで、PCR増幅産物の有無および断片長の確認を行い、さらにPCR増幅産物の断片が100bpのバンド5ngよりも明瞭に確認できるかの判定を行った。
試料はモモDNA 500fg、およびモモ近縁種の中の代表としてプライマー配列との相同性が高く増幅の恐れがある桜桃DNA 50ngを用いた。
配列番号1の3’末端から2番目に、本来「a」であるところを、モモおよびモモ近縁種の塩基配列とミスマッチする「t」に置換した塩基配列(配列番号4)を有するオリゴヌクレオチド(5’- aattggtcgtaataaaaagtcaata-3’)、配列番号3の3’末端から2番目に、本来「g」であるところを、モモおよびモモ近縁種の塩基配列とミスマッチする「a」に置換したした塩基配列(配列番号5)を有するオリゴヌクレオチド(5’- cgtaaacgctctaattttaatag-3’)を、それぞれ通常のオリゴヌクレオチド合成法に従って合成した。
試料は実施例2で調製した鋳型DNA試料、すなわちモモDNA 5fg、50fg、500fg、およびモモ近縁種の代表としてプライマー配列との相同性が高く増幅の恐れがある桜桃DNA 50ngを用いた。
(1) DNA試料の調製
サンプルは、モモとして、白鳳、川中島白桃、黄金桃、フレーバートップ、秀峰、蟠桃の6品種(種子)、モモ以外の植物試料として、すもも(種子)、あんず(種子)、桜桃(種子)、うめ(種子)、アーモンド(葉)、プルーン(種子)、リンゴ(種子)、洋ナシ(種子)、ナシ(種子)、いちご(果実)、ラズベリー(果実)、アロエベラ(葉)、パイナップル(果実)、パパイヤ(果実)、オレンジ(果実)、ミカン(果実)、メロン(果実)、柿(種子)、いちじく(果実)、マンゴー(果実)、バナナ(果実)、アボカド(果実)、ブルーベリー(果実)、ぶどう(果実)、キウイ(果実)、コメ(種子)、大豆(種子)、とうもろこし(種子)、小麦(種子)、ばれいしょ(塊茎)、にんじん(根)、たまねぎ(鱗茎)、白菜(葉)、ほうれんそう(葉)、きゅうり(果実)、トマト(果実)の計36種を用いた。
上記のようにして調製した各鋳型DNA試料を用いてPCRを行った。
PCR反応は、下記表4のPCR反応液組成とPCR反応条件で、フォワードプライマーに配列番号2、リバースプライマーに配列番号5を用い、0.2mlチューブに入れ、PCR装置にGeneAmp PCR System 9700またはGeneAmp PCR System 9600を使用して行った。
モモ(白鳳)から得られた標的増幅産物の塩基配列をダイレクトシーケンス法により確認したところ、標的増幅産物のプライマー配列を除いた塩基配列は以下の塩基配列を有していた。
5’- ttaaaagaaaagatgggatcataaaacaa -3’(配列番号7)
(1) モモ標準試料の調製
モモの果皮を剥き、種子を取り除いた果肉部分を凍結乾燥後粉砕し、直ちに等量の炭酸カルシウムを混ぜて均一化した。これをモモ標準試料とした。
モモ標準試料2gを50mLチューブに採取し、タンパク質抽出用緩衝液(0.5% SDS、2% 2-メルカプトエタノール、0.5M NaCl、0.1M Tris-HCl (pH8.6))20mLを加え、よく混合して固形物を分散させ、室温下16時間振とう抽出した。抽出液を10,000×gで30分間遠心分離した後、上清を孔径0.8μmのミクロフィルターでろ過し、タンパク質抽出液とした。得られたタンパク質抽出液16μlについて、2-D Quant kit(GEヘルスケア バイオサイエンス社製)を用い、キットの説明に従ってタンパク質濃度を定量した。
モモを含む可能性があると思われた、市場によく見られる食品を候補に挙げ、そのうちモモDNAの検出が困難と思われた加工食品を選択した。その中から、モデル加工食品の1つ目には、加工工程においてDNAの分解が最も激しいと考えられ、検出できない可能性が高いと考えられるジャムを選定した。2つ目には、モデル加工食品中のDNA量が多いため、添加したモモのDNA濃度が相対的に薄くなり、検出できない可能性が高いと考えられる、クッキーを選定した。
ジャムは図6、クッキーは図7に示すように作製した。ジャム、クッキーともに、モモ標準試料 添加品/無添加品を作製した。添加品については、モデル加工食品の最終重量あたりのモモタンパク質が10μg/gとなるようにモモ標準試料を添加した。なお、添加品については、ジャム、クッキーとも、それぞれ2回反復で作製し、無添加品はそれぞれ1回作製した。
実施例2の(1)と同様にして、粉砕均一化したモデル加工食品2gからそれぞれ1回DNAを抽出しDNA濃度を測定した。20ng/μlより濃いものについてはTE緩衝液(pH8.0)で20ng/μlに希釈し、20ng/μlより薄いものについては、そのままのものをDNA試料とした。添加品から抽出したDNA試料は、モモタンパク質10μg/gに相当する。また、モモ標準試料を添加したジャムから抽出したDNA試料を、添加しなかったジャムから抽出したDNA試料で10倍希釈したものを、ジャム1/10希釈DNA試料とした。クッキーでも同様にして作製したものをクッキー1/10希釈DNA試料とした。1/10希釈DNA試料は、モモタンパク質1μg/gに相当する。これらDNA試料2.5μlを1反応液あたりのPCRに用いた。
調製したそれぞれのDNA試料について2回反復で、実施例6の(2)と同様にしてPCR反応を行った。
実施例2の(3)と同様に、アガロース電気泳動によって確認した。
(8) 標的増幅産物の塩基配列の確認
実施例7と同様にして塩基配列を確認した。
(9) 検出結果および塩基配列の確認結果
作製したモデル加工食品に添加したモモタンパク質量、およびモモ検出PCR法での標的増幅産物の検出結果を表5に示す。電気泳動図を図8に示す。
Claims (4)
- モモのtrnS-trnG intergenic spacer遺伝子に由来するDNA断片を特異的に増幅するモモ検出用プライマーセットであって、配列番号1または2または4に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと、配列番号3または5に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとから構成される、モモ検出用プライマーセット(但し、配列番号4に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと配列番号5に示す塩基配列を有するオリゴヌクレオチドとから構成されるプライマーセットは除く)。
5’- aattggtcgtaataaaaagtcaaaa-3’(配列番号1)
5’- tggtcgtaataaaaagtcaaaa-3’(配列番号2)
5’- cgtaaacgctctaattttaatgg-3’(配列番号3)
5’- aattggtcgtaataaaaagtcaata-3’(配列番号4)
5’- cgtaaacgctctaattttaatag-3’(配列番号5) - 試料から抽出したDNAを鋳型とし、請求項1に記載のいずれかのプライマーセットを用いてPCRを行い、該PCRにより得られた増幅産物の有無を検出する工程を含む、モモの検出方法。
- 前記増幅産物の塩基配列からプライマー配列を除いた塩基配列が、配列番号6に示す塩基配列の829番目にあるモモ特徴的塩基部分「g」を含むかどうかを指標として前記増幅産物がモモ由来DNAから増幅されたものであるかどうかを確認する工程を含む、請求項2に記載の方法。
- 請求項1に記載のプライマーセットを含む、モモ検出用キット。
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