CN101921846A - 一种多重基因表达的分析方法 - Google Patents
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Abstract
一种多重基因表达的分析方法，其特征在于：首先提取总RNA，利用各个基因相对应的嵌合引物，反转录获得各个基因的cDNA混合物，所述嵌合引物由含特定酶切位点的通用引物和各基因特异引物组成；然后利用包括所述含有特定酶切位点的通用引物进行PCR扩增得到各个基因表达标签的PCR产物；通过包括酶切、连接将代表各个基因的表达标签串联到一起，再将串联子克隆到载体上进行测序、分析；所述嵌合引物中通用引物的特定酶切位点与PCR扩增出的各基因表达标签的酶切位点不相重合。本发明多重基因表达的分析方法操作简便，成本低廉，适用范围广，可同时对至少20个基因进行表达分析。本发明方法的建立将为多基因的表达分析提供了有力工具。
Description
技术领域
本发明涉及一种多重基因表达分析方法，特别涉及多个样本中多个基因表达的检测方法。
背景技术
随着DNA高通量测序技术的发展，以人类基因组计划为代表的一大批基因组计划相继完成，功能基因组学的研究越来越受到人们的关注。其中，功能基因组学分析的一个重要方面就是了解基因在生物体发育过程中的时空表达特征，以及在生物体发育过程中的作用。从整体出发对生物体的全部基因表达的时续性和空间性进行分析，了解基因组的功能活动和相互作用。因此，多基因表达谱分析对于阐明一系列复杂的生命科学基本问题和重大医学问题等均具有重要的意义。目前，多基因表达分析在药物靶标筛选，疾病诊断，病原物的侵染致病分子机理研究等方面均得到了广泛应用。多基因表达谱研究已逐渐成为寻找生命过程中重要基因和蛋白的最为重要手段之一。目前，主要的多基因表达谱分析方法主要有基因芯片(gene chip)，MPSS(Massive parallel signature sequencing)，SAGE(serial analysis of gene expression)和多重定量PCR(Multiplex real-time RT-PCR)等方法。
利用基因芯片(又称DNA芯片)分析基因表达开始于1995年，其基本原理是，将大量探针分子固定于支持物上，然后与标记的样品cDNA杂交，杂交信号阳性的探针分子就是在组织或细胞中表达的基因，若同时将两组或多组有表达差异的组织或细胞cDNA分别与芯片杂交，芯片上信号分子的分布和强度就会有所不同，根据信号分布和强度就可以判断基因差异表达的情况。DNA microarray是非PCR技术基础的新方法，具有如下优点：①高度并行性。利用DNA芯片技术获得大量并行数据并进行分析。并行性使实验速度加快，同时芯片上代表基因的可比性加强。DNA芯片的一次反应几乎能够分析整个人的基因。②微量化。芯片技术减少了实验消耗，最小化了反应体积，但增加了样品浓度，加速了反应动力学。③多样性。芯片技术能够在一次反应中分析多个样本。新的标记和检测方法的采用，如多色荧光标记，使一块芯片能比较多个样本。这样就使得比较分析非常精确而避免了芯片间的变异造成的误差；④自动化。先进的制造技术使得芯片的制造自动化，计算机的引入使得数据的采集和分析自动化。这也是DNA microarray的最突出 特点。但是，该技术同时存在一些缺点：①价格昂贵，使用该方法的成本与其他方法相比要高的多；②需要大量的RNA，每次需50mg～200mg总RNA，对于低拷贝数的mRNA需要量更大，所以分析少量的临床标本存在困难；③需要完善的基因数据信息，无法获得未知基因，需要一系列克隆或已知基因的寡核苷酸，对于未完成测序工作的生物样本不适用该方法；④与其他方法相比，灵敏度较低，定量特性较差。
MPSS(Massive parallel signature sequencing)技术是由美国科学家Brenner等于2000年发明了一种新的基因表达分析技术。该技术是利用限制性内切酶和荧光检测知识，发展出的一种辨认和测定细胞每一个cDNA克隆片段末端16～20bp序列的方法，从而查明细胞内所有基因的表达情况。MPSS技术的主要优点是操作简便，速度快，时间短。MPSS分析系统自动化程度较高，诸如微球体阵列的制作，反应液的供排、各种反应条件的控制，图像的处理和数据的分析已经完全自动化，可同时分析数以万计的基因数目，甚至超过了SAGE的一次性分析能力(SAGE的一次性可分析上千个基因)，同时不需要耗费时间做大量的PCR实验，不需要对cDNA模板做特殊的处理，也不用对探针序列进行提前选择。更为重要的是MPSS可根据荧光信号对基因表达水平做定量的分析，能提供基因末端序列信息，这一点MPSS与RT-PCR、SAGE等常规方法不同。另外，MPSS对基因末端序列与常规测序不同的是，它不需要进行基因片段的分离、克隆再逐一测序，而是具备了DNA芯片、cDNA微阵列荧光分析法直接读出序列的优点，可同时获得大量cDNA末端序列，从而简化了测序过程，这符合后基因组时代基因功能分析的高通量、自动化、微型化的要求。当然该技术同DNA芯片技术一样，需要较为昂贵的硬件和相配套的软件的协同运做，因此目前还亟需降低仪器检测的成本，加强推广和普及工作。
SAGE是1995年由Velculesce等建立的一种新的基因表达模式研究技术，是一个非常有效的分析基因表达的方法。SAGE技术的基本原理是：第一，在一个转录体系中，每种转录本都可以用一个特异的固定长度寡核苷酸序列(9～14bp)来代表，这些短序列称为SAGE标签(SAGE tag)。第二，通过一定的实验步骤，将这些SAGE标签从cDNA中分离出来制备成一个SAGE标签库，然后连接成标签多聚体进行克隆测序，并将得到的短序列核苷酸顺序以连续的数据形式进行处理，就能对数以千计的mRNA转录物进行分析，每种标签在全部标签中所占的比例可以反映它所代表的转录本在整个转录体系中的表达丰度。SAGE方法的主要优点是SAGE的数据是定量的，累积的。只要足够的测序工作的完成，SAGE就可以精确地定量地分析整个细胞或组织的基因表达的变化。另外，SAGE数据具有可比性。SAGE数据可以和现有的和将来按类似的方式建立的SAGE文库 中的数据进行比较。随着SAGE数据库中数据的增多，该法的优势越来越显现出来。SAGE另一特点是，它的数据可以和由均一化的EST文库或差减文库的EST数据相互补充。虽然，SAGE要求高通量的测序能力，但是测定同样数量的SAGE序列所代表的基因数量是测定同样数量的EST序列的20倍。但是，SAGE技术也存在一些不足：1、用SAGE标签来代表一个基因不是十分可靠，由于标签太短有可能会导致基因识别错误。2、由于一些用于构建SAGE文库的内切酶的局限性，某些转录本不能被SAGE标签所代表。另外，由于存在单核苷酸多态性和剪切位点的可选择性，一个转录本可能由多个SAGE标签所表示。以上这些问题尽管只占SAGE标签所代表的基因的很小部分，但在进行数据分析时，需加以考虑。
Multiplex real-time RT-PCR技术根据荧光能量传递原理，融合了PCR技术的高效扩增、探针技术的高特异性、光谱技术的高敏感性和高精确性等优点，可直接探测PCR过程中荧光信号的变化获得定量结果。根据荧光定量PCR多通道激发光源，多个滤光片的检测体系以及标记不同荧光染料的探针，可达到同时检测多个基因的目的。但是，该技术也存在一些不足：1、其检测通量受到滤光片种类的限制。2、在一个反应体系中进行多对引物的PCR扩增检测并且得到较为准确的结果，扩增反应条件的优化和确定是该技术应用成功与否关键。3、当反应体系中不同基因的表达量差异很大的情况下，表达量较高的基因会在前几个循环就会消耗大量原料，使PCR反应很快达到平台期，而此时一些表达量很低的基因还没有达到荧光可以检测到的水平，这样就导致PCR结果无法真实的反应基因表达的实际情况。
以上提到的方法中，DNA microarray，Massive parallel signature sequencing(MPSS)，serial analysis of gene expression(SAGE)检测通量高，通常可以同时检测上千个甚至上万个基因的转录水平，因此上述几种技术常用于全基因表达谱的分析。但是，我们在研究过程中常常会对一些重要的信号转导途径或某些重要的代谢途径感兴趣。而且，目前的大量的研究表明，一些与某种特定的疾病相关的基因个数通常只有几十个。在针对某些特定的疾病进行大量药物筛选时，由于药物种类很多，会导致样本数量很大，但所要分析的基因的数目却不多，一般只有几十个基因。在这种情况下，用以上提到的高通量方法进行某些特定的基因表达水平分析，会导致成本较高，而且数据量过大直接影响分析结果，很难满足我们的实际需要。Multiplex real-time RT-PCR技术由于其检测通量过小，扩增条件优化较为困难，检测限等因素也不适合在上述情况下应用。最近，Beckman公司建立了基于毛细管电泳和荧光检测相结合的方法(GeXP quantitative analysis method) 进行多基因表达分析，取得了较好的效果；但是该方法需要毛细管电泳和荧光检测等较为昂贵的专用设备，直接影响该方法的广泛使用。因此，建立一种具有较高检测通量、成本低、操作简便的多基因表达的分析方法十分必要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多重基因表达的分析方法，本发明方法成本低、操作简便快捷。
本发明是这样实现的：
一种多重基因的表达分析方法，其特征在于：首先提取总RNA，利用各个基因相对应的嵌合引物，在同一反应管中反转录获得各个基因的cDNA混合物，所述嵌合引物由含特定酶切位点的通用引物和各基因特异引物组成；然后利用包括所述含有特定酶切位点的通用引物进行PCR扩增得到各个基因表达标签的PCR产物；通过包括酶切、连接将代表各个基因的表达标签串联到一起，再将串联子克隆到载体上进行测序、分析；所述嵌合引物中通用引物的特定酶切位点与PCR扩增出的各基因表达标签的酶切位点不相重合。在此，操作者可根据实际情况变更上述嵌合引物中通用引物的特定酶切位点，只要满足该特定酶切位点与PCR扩增出的各基因表达标签的酶切位点不一致即可。
本发明嵌合引物的5′端为含特定酶切位点的通用引物，本发明嵌合引物的3′端为各基因特异引物。
为了减少引物的非特异性，本发明含特定酶切位点的通用引物含17个以上的碱基，为了降低成本，本发明含特定酶切位点的通用引物含碱基数量优选为18-25个。
本发明各基因特异引物含16个以上的碱基，为了使反应过程中各引物Tm值尽量保持一致，本发明各基因特异引物含碱基数量优选为16-25个。
本发明利用包括所述含有特定酶切位点的通用引物进行PCR扩增具体是，先以本发明反转录得到的cDNA为模板，利用各基因相对应的嵌合引物，在PCR前1-2或1-3或1-4或1-5个循环富集各个基因的表达标签；然后在以后的PCR循环中利用本发明含有特定酶切位点的通用引物进行扩增。
上述富集各个基因的表达标签的PCR循环优选为PCR前1-3个循环；上述PCR循环共为25-35个，优选为28个。
本发明PCR前面富集各个基因表达标签的循环所用嵌合引物与剩余的循环所用的通用引物的摩尔比为1∶50。
具体地说，一种多重基因表达的分析方法，包括以下步骤：
(1)提取待分析样本的总RNA，利用各个基因相对应的嵌合引物，反转录获得各个基因的cDNA混合物；所述嵌合引物由位于5′端的含有17个以上碱基的含特定酶切位点的通用引物和位于3′端的含有16个以上碱基的各基因特异引物组成；
(2)利用上述的各个基因相对应的嵌合引物，以上述反转录获得的cDNA为模板，在PCR的前1-3个循环富集各个基因的表达标签，在各表达标签的末端均含有特定的限制性酶切位点；
(3)在接下来的PCR的4-28个循环中，利用上述通用引物进行扩增，得到末端均含有特定的限制性酶切位点的各个基因的表达标签的PCR产物；上述嵌合引物中通用引物的特定酶切位点与PCR扩增出的各基因表达标签的酶切位点不相重合；所述PCR前1-3个循环所用嵌合引物与接下来的PCR4-28个循环所用的通用引物的摩尔比为1∶50；
(4)沉淀回收上述(3)步骤所得的PCR产物，并利用各个标签末端含有的酶切位点，对所述PCR产物进行酶切，回收得到酶切产物；
(5)利用连接酶将上述酶切后的PCR产物串联起来，形成串联子，电泳回收500bp以上的串联子，再将串联子连接到制备好的用相同的限制性内切酶酶切克隆载体上；为了测定信息量更大、便于统计分析，同时为了降低成本，所述电泳回收的串联子优选为500-1200bp。
(6)挑取上述多个克隆进行测序，利用Blast软件对测序结果进行分析，确定个基因表达标签的数量和比例，明确各基因的相对表达水平。
本发明方法具有如下的有益效果：
(1)整个过程操作简便，常规仪器即可满足本发明方法的实施，不需要特殊仪器，成本低。
(2)本发明方法通量较高，可同时对至少20个基因进行表达分析。
(3)本发明方法是基于PCR的一种基因定量方法，灵敏度较高，对于一些表达量较低基因的检测效果好；
(4)本发明方法的检测是利用测序后的结果统计得出个基因的表达水平，对于一些核酸序列较为相似的基因之间的表达分析具有明显的优势。
(5)本发明多重基因表达的分析方法操作简便，成本低廉，适用范围广，可同时对至少20个基因进行表达分析。本发明方法的建立将为多基因的表达分析提供了有力工具。
附图说明
图1：本发明多重基因表达分析方法(MgC-GEP method)的主要流程图。
图2A本发明实施例1中的扩增标签酶切效果检测电泳图 1为酶切前、2为酶切后。
图2B本发明实施例1中的酶切扩增标签串联子检测电泳图1为连接后的串联子。
图2C本发明实施例1中克隆串联子长度检测电泳图 1-15为随机挑选的15个阳性克隆。
图3利用本发明实施例1中的多重基因表达分析方法和定量PCR分析酵母中多个基因在弱酸诱导条件下的相对表达量图。
图4：利用定量PCR分析受到真菌侵染的东亚飞蝗不同组织中多个基因的表达水平图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1 在弱酸诱导条件下酵母中多个基因表达水平的分析方法
1.菌株和载体
酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae W303-1A购于江南大学菌种保藏中心。
大肠杆菌菌株JM109购于北京鼎国生物公司。
pUC19-T载体购于大连宝生(TaKaRa)生物公司。
2.酿酒酵母总RNA的提取
酵母细胞接种于新鲜的YPD液体培养基中，接种终浓度为OD600为0.1，30℃，250rpm培养至OD600为1-1.1之间。将培养的菌液平均分成2份，在其中一份中加入终浓度为8mM的山梨酸钾(BBI公司)，30℃，250rpm诱导培养20min后，室温4000g，2min同时收集诱导和非诱导的酵母菌体，冰水洗涤，液氮速冻后，保存于-80℃。利用SV Total RNAIsolation System(Promega公司)提取酵母的总RNA，再用无RNA酶的DNA酶(TaKaRa公司)37℃处理提取的RNA 30min，再加入终浓度为2mM的EDTA，65℃ 10min终止反应。
3.利用串联子同时分析酵母中多个基因的表达
在NCBI的GenBank中查找到酵母中与弱酸条件相关的部分基因(20个)，利用BeaconDesigner 2.0软件(Bio-Rad公司)设计引物序列，所设计引物均为嵌合引物，引物中3′端为加入的与个基因对应的16-20碱基的特异序列，5′端上游引物中为18碱基的通用引物序列，下游引物中为19碱基的通用引物序列(如表1所示)，在上下引物的通用序列中分别加有不同的酶切位点，其中上游引物中加有BamHI位点，下游引物中加有HindIII位点。 以上所有嵌合引物的平均Tm值67.3±1.8℃，各引物之间的Tm值最大相差不超过5℃。所有扩增产物长度为85±7碱基。
表1.利用串联子方法分析酵母基因表达所用引物
*下划线部分为所加入的酶切位点；斜体部分为通用引物序列。
利用所设计的嵌合引物，以提取的酵母在不同培养条件夏的总RNA作为模板，进行反转录。反转录体系为：500ng总RNA，混合的0.16μM下游嵌合引物，200U反转录酶(Promega公司)，25U RNA酶抑制剂(TaKaRa公司)，5μl M-MLV 5×反应缓冲液，0.5mM dNTP，反应体系为25μl。反应条件为70℃ 5min，42℃ 60min，72℃ 10min。再利用反转录产物作为模板进行扩增。扩增反应体系为：2μl反转录产物，0.02μM混合的上游嵌合引物，2.5U Taq酶(Bioflux公司)，0.2mM dNTP，5μl 10×PCR反应缓冲液(Bioflux公司)，1μM通用上游引物，1μM通用下游引物。扩增条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ for 35s，28个循环；70℃ 10min。利用酚氯仿抽提扩增产物，加入等体积异丙醇-20℃静置10min，12000rpm 10min离心，去上清，70％乙醇漂洗沉淀2次，将沉淀溶于Lo TE缓冲液中(3mM Tris-HCl，pH 7.5；0.2mM EDTA，pH 7.5)。利用BamHI和HindIII酶切扩增产物，3％琼脂糖凝胶电泳酶切产物并回收(图2A)，再利用T4 DNA连接酶连接回收的酶切产物，将各个基因的标签序列串联起来，将连接产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收长度范围在500-1200碱基之间的串联子(图2B)，并将串联子克隆到用BamHI和HindIII酶切的pUC19-T的载体上。最后，将连接产物转化大肠杆菌。随机挑选15个克隆进行扩增检测，发现所挑取克隆均为阳性克隆，并且插入片段均在500碱基以上(图2C)。
挑取300个大肠杆菌的阳性克隆送上海生工公司进行测序，测序引物为：M13-47(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′) 和 RV-M(5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)。根据测序结果利用本地BLAST统计各基因标签的数量、比例，在统计结果过程中，以Act1基因的标签作为内标，得到各个基因的相对表达水平。结果表明，在这些基因中有7个基因(YNR030W，YDR343C，YGR088W，YBR054W，YNR001C，YDR533C，YDL222C)在弱酸诱导条件下上调表达，有11个基因 (YML123C，YEL046C，YLR180W，YLR355C，YLR419W，YLR300W，YNL300W，YLR372W，YAL059W，YPL122C，YPR149W)的表达受到弱酸的抑制。
为了进一步验证以上结果，将以上基因进行定量PCR分析。利用Beacon Designer 2.0软件(Bio-Rad公司)设计所用引物(表2)。以提取的各样品的总RNA，利用oligo-dT引物进行反转录合成cDNA，以该cDNA为模板进行定量PCR，所用试剂为SYBR-GreenPCR Master Mix试剂盒(Bio-Rad公司)。反应条件为：95℃ 15 sec；95℃ 15 sec，53.5℃15 sec，72℃ 15sec，40个循环。以Act1基因作为内标，双Delta法计算各个基因的表达水平。结果如图3所示，定量PCR结果与本发明利用串联子分析各个基因的表达结果基本一致，说明利用串联子可以有效地对多个基因同时进行表达水平分析。
表2.利用定量PCR分析酵母中基因表达所用引物
| 基因名称 | 上游引物(5′-3′) | 下游引物(5′-3′) |
| YPL122C | CGCATTGGAAGTTGGCAAAG | TCGGAAGTCAGCATCAAAGC |
| YNR030W | CAGGAGCAGCACATCTATGG | CTCGCCGCCTGGATAATTC |
| YDR343C | TCATGGGCTGTTTGGTCTTC | GTCGTAGTTGGCACCTCTTC |
| YGR088W | CCACGTCTTGTCGGATACTG | GTTCGGGTGTCATTGTTTGC |
| YPR149W | AACACCCAACATAGGCACAG | TGATACCAACGGCCAACAC |
| YCL040W | TCAGACTGCCCACCACTC | CACAACGGAACCATCACAAC |
| YBR054W | AGGAGCACCCAGGTTACAG | AGCAATCAACCAGCAGACAG |
| YNR001C | TGGTCGTGCCAATCAAGAAG | AACTCTCCCTGCGTTCAAAG |
| YDR533C | TGGGATGAGCATTCCTTAGC | TCGGCATTCACCTCTTTTGG |
| YDL222C | ACAGGTTGCTATGTGAAGGC | TGGTCCGAGTAGGTAGAGTG |
| YML123C | GCTGGTGTTGGTTTCTTGAC | TTGACTTGGACCTGGCATAC |
| YEL046C | TGTCCAACCAGATTGCCATC | GGAACCACCATCGCTTGAG |
| YLR180W | TCGTCATCGGTGGTCCTC | CGGCATAAGCGGCAGAAC |
| YLR355C | TTACGGTTCCCAAGGTTACG | GAGCGGCATCGGACAAC |
| YLR419W | CAACTGCCTGCCTGGAAG | CGACCTGAGTGGATTTACCC |
| YLR300W | GTTTGCTGCCGCTTTGAC | TGCCTCCACATAACGTCTTG |
| YNL300W | ACCGTTGCTGCCATTGC | GGTGGTGGTGTTAGCTTGG |
| YLR372W | CAGTTGCCGACCAGTTCC | ACCCGTTAGCCAAGAAAGTC |
| YAL059W | ATCGGATGCTCTTGAACCAG | CTCATTCTTGGCTGCTGTTC |
| Act1 | TCTGAGGTTGCTGCTTTGG | CCGACGATAGATGGGAAGAC |
实施例2 东亚飞蝗在绿僵菌感染后不同组织中多个基因表达的分析方法
为了验证本发明提供的方法可以同时检测多个基因的表达谱，发明人作了如下实验：
1.菌株和昆虫
金龟子绿僵菌菌体CQMa102：为杀蝗专一菌株，分离自重庆缙云山自然感病的黄脊竹蝗，购于重庆大学基因工程中心。该菌株由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，CGMCC菌株号0877，于中国科学院微生物研究所也可购买。将活化的CQMa102用灭菌水配成浓度为1×105个孢子/ml的孢子悬浮液，均匀涂在直径为9cm的1/4SDAY平板上(100μl/皿)，26℃培养15d，完全产孢。将孢子刮下后放在干燥器中干燥后用棉籽油涡旋分散，静置10-15min，吸取中层孢子油悬浮液，采用新鲜煤油(透明)稀释测定浓度，根据浓度将配好的孢子油悬浮液用棉籽油稀释至1×108个孢子/ml备用。
大肠杆菌菌株JM109购于北京鼎国生物公司。
pUC19-T载体购于大连宝生(TaKaRa)生物公司。
东亚飞蝗新羽化雄成虫，购于重庆大学基因中心昆虫室。
2.东亚飞蝗不同组织总RNA的提取
选取羽化后4天的东亚飞蝗健康雄虫，随机分成12组，每组20头虫，其中6组分别于背板接种浓度为1×108的绿僵菌孢子悬液5μl，蝗虫接种后放入生测笼中，调节温度26-28℃，相对湿度40-70％，每天更换新鲜麦苗或人工饲料，以棉籽油接种为阴性对照。分别于处理后4h、8h、12h、24h、48h和72h提取脂肪体，中肠和血淋巴的总RNA，共36组。
另取羽化后4天的东亚飞蝗健康雄虫，随机分成12组，每组20头虫，其中6组分别于翅膀上用毛刷刷上浓度为1×108的绿僵菌孢子悬液，对照组翅膀上仅刷棉籽油，分别于处理后4h、8h、12h、24h、48h和72h提取翅膀的总RNA，共12组。
用无RNA酶的DNA酶(TaKaRa公司)37℃处理提取的RNA 30min，再加入终浓度为2mM的EDTA，65℃10min终止反应。
3.利用串联子同时分析绿僵菌感染东亚飞蝗后多个组织中多个基因的表达谱
在NCBI的GenBank中查找到东亚飞蝗中与真菌感染免疫相关的基因(9个，其中包含一个内参基因armadillo)，利用Beacon Designer 2.0软件(Bio-Rad公司)设计引物序列，所设计引物均为嵌合引物，引物中3′端为加入的与个基因对应的16-20碱基的特异序列， 5′端上游引物中为18碱基的通用引物序列，下游引物中为19碱基的通用引物序列(如表3所示)，在上下引物的通用序列中分别加有不同的酶切位点，其中上游引物中加有BamHI位点，下游引物中加有HindIII位点。以上所有嵌合引物的平均Tm值66.8±1.9℃，各引物之间的Tm值最大相差不超过5℃。所有扩增产物长度为77±5碱基。
表3利用串联子方法分析东亚飞蝗中基因表达所用引物
*下划线部分为所加入的酶切位点；斜体部分为通用引物序列。
利用所设计的嵌合引物，以提取的感病前后东亚飞蝗不同组织的总RNA作为模板，进行反转录。反转录体系为：500ng总RNA，混合的0.16μM下游嵌合引物，200U反转录酶(Promega公司)，25U RNA酶抑制剂(TaKaRa公司)，5μl M-MLV 5×反应缓冲液，0.5mM dNTP，反应体系为25μl。反应条件为70℃ 5min，42℃ 60min，72℃ 10min。再利用反转录产物作为模板进行扩增。扩增反应体系为：2μl反转录产物，0.02μM混合的上游嵌合引物，2.5U Taq酶(Bioflux公司)，0.2mM dNTP，5μl 10×PCR反应缓冲液 (Bioflux公司)，1μM通用上游引物，1μM通用下游引物。扩增条件为：95℃ 5min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ for 35s，28个循环；70℃ 10min。利用酚氯仿抽提扩增产物，加入等体积异丙醇-20℃静置10min，12000rpm 10min离心，去上清，70％乙醇漂洗沉淀2次，将沉淀溶于Lo TE缓冲液中(3mM Tris-HCl，pH 7.5；0.2mM EDTA，pH 7.5)。利用BamHI和HindIII酶切扩增产物，3％琼脂糖凝胶电泳酶切产物并回收，再利用T4DNA连接酶连接回收的酶切产物，将各个基因的标签序列串联起来，将连接产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，回收长度范围在500-1200碱基之间的串联子，并将串联子克隆到用BamHI和HindIII酶切的pUC19-T的载体上。最后，将连接产物转化大肠杆菌。随机挑选15个克隆进行扩增检测，发现所挑取克隆均为阳性克隆，并且插入片段均在500碱基以上。
每个样品挑取40个大肠杆菌的阳性克隆送上海生工公司进行测序，测序引物为：M13-47(5′-C GCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)和RV-M(5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)。根据测序结果利用本地BLAST统计各基因标签的数量、比例，在统计结果过程中，以Act1基因的标签作为内标，得到各个基因的相对表达水平。
结果表明(见表4)，在脂肪体中，Gnbp-like、Spatzle、Toll9、Myd88、Tube和Cactus的表达量在绿僵菌感染后8h上调表达，其表达量分别上调3.9、14、5.5、3.4、2.1和3.9倍。同时，我们还利用多基因表达谱检测方法获得了8个基因在中肠、血淋巴和翅膀中的表达情况，结果显示，在绿僵菌侵染东亚飞蝗以后72小时内，8个基因在血淋巴和翅膀均发生了不同程度的上调表达改变；而中肠中8个基因则表现为与对照组无明显差别。
表4 绿僵菌感染东亚飞蝗后不同组织中多个基因的表达谱
a：差异极显著；b：差异显著；-：无显著性差异
为了进一步验证以上结果，将以上基因进行定量PCR分析。利用Beacon Designer 2.0软件(Bio-Rad公司)设计所用引物(见表5)。以提取的各样品的总RNA，利用oligo-dT引物进行反转录合成cDNA，以该cDNA为模板进行定量PCR，所用试剂为SYBR-GreenPCR Master Mix试剂盒(Bio-Rad公司)。反应条件为：95℃ 15sec；95℃ 15sec，54.0℃ 15sec，72℃ 15sec，40个循环。以armadillo基因作为内标，双Delta法计算各个基因的表达水平。结果如图4所示，定量PCR结果与利用串联子分析各个基因的表达结果基本一致，
说明利用串联子可以有效地对多个基因同时进行表达水平分析。
表5 利用定量PCR引物检测东亚飞蝗感病前后脂肪体中各基因的表达引物
| 基因名称 | 上游引物(5′-3′) | 下游引物(5′-3′) |
| Gnbp-like | GCTGCCTCCACGACGG | CTGCTGATGCTGCTGCTG |
| Spatzle | ACGGAGACCTGTGTATCAAACC | CTGAGGCCACCAATTTCTTCTG |
| Toll9 | ATATGCTACTGGAAGTGGCGATAC | TGGATTCTGCTTTATTTGGCTTGTC |
| Myd88 | CTACTGATGAAGGACTGCCAAG | AAACTTGTTCTGTGGGATTTGC |
| Cactus | CGCACGTACCAGCACCATG | CACCACACCAGACAACCAGATG |
| Armadillo | GCAGCCAGCAACCAGGAG | ACCATCTGTCCACGGATAATAGC |
结果表明(见图4)，Gnbp-like、Spatzle、Toll9、Myd88、Tube和Cactus的表达量在仍旧是在绿僵菌侵染后8h上调表达，其表达量分别上调4、19、8、4和5倍。由此可见，我们用定量PCR检测得到的上述基因的表达变化与本发明的多基因表达谱检测方法得到的结果是基本一致的，说明利用串联子可以有效地对多个基因同时进行表达水平分析。
序列表
<110>重庆大学
<120>一种多重基因表达的分析方法
<140>201010232000.6
<141>2010-07-20
<160>114
<210>1
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YPL122C基因的5’端特异性引物序列
<400>1
AGGTGACAGG ATCCAATACG GTGTGGTTGT AGAGG 35
<210>2
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YPL122C基因的3’端特异性引物序列
<400>2
GTACGACTCA AAGCTTGGAC CAACAAGTCC AGGCTAA 37
<210>3
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YNR030W基因的5’端特异性引物序列
<400>3
AGGTGACAGG ATCCAATATT CGGTATCTTT GGCTTG 36
<210>4
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YNR030W基因的3’端特异性引物序列
<400>4
GTACGACTCA AAGCTTGGAT GATACTGATG GCGGAAC 37
<210>5
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YDR343C基因的5’端特异性引物序列
<400>5
AGGTGACAGG ATCCAATAGA GGTGCCAACT ACGACG 36
<210>6
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YDR343C基因的3’端特异性引物序列
<400>6
GTACGACTCA AAGCTTGGAT ATCATCGTGA GCCATTTC 38
<210>7
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YGR088W基因的5’端特异性引物序列
<400>7
AGGTGACAGG ATCCAATACG GATACTGGTT TTGAA 35
<210>8
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YGR088W基因的3’端特异性引物序列
<400>8
GTACGACTCA AAGCTTGGAT TCAGCAGCCT TATCTCC 37
<210>9
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YPR149W基因的5’端特异性引物序列
<400>9
AGGTGACAGG ATCCAATAAC CCTGATGTCT GTTTTC 36
<210>10
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YPR149W基因的3’端特异性引物序列
<400>10
GTACGACTCA AAGCTTGGAC AGAACCAAAG GCACCA 36
<210>11
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YCL040W基因的5’端特异性引物序列
<400>11
AGGTGACAGG ATCCAATAAC CTTTCCAGTT GTCATCC 37
<210>12
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YCL040W基因的3’端特异性引物序列
<400>12
GTACGACTCA AAGCTTGGAG TCAATTTCAA TATGCGACA 39
<210>13
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YBR054W基因的5’端特异性引物序列
<400>13
AGGTGACAGG ATCCAATAAA ATTTTTTACG CTAGATACG 39
<210>14
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YBR054W基因的3’端特异性引物序列
<400>14
GTACGACTCA AAGCTTGGAT GGGAAAGCCA AAAACC 36
<210>15
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YNR001C基因的5’端特异性引物序列
<400>15
AGGTGACAGG ATCCAATAAC TGAGGCTTCG TTCTACAC 38
<210>16
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YNR001C基因的3’端特异性引物序列
<400>16
GTACGACTCA AAGCTTGGAT AGCTCTGGCA ACACCA 36
<210>17
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YDR533C基因的5’端特异性引物序列
<400>17
AGGTGACAGG ATCCAATAAC TGGTAACAGG TGTGAATC 38
<210>18
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YDR533C基因的3’端特异性引物序列
<400>18
GTACGACTCA AAGCTTGGAT CTTACGGCAG TGGAGTG 37
<210>19
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YDL222C基因的5’端特异性引物序列
<400>19
AGGTGACAGG ATCCAATAAG CCTCAACCTA CAACCAC 37
<210>20
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YDL222C基因的3’端特异性引物序列
<400>20
GTACGACTCA AAGCTTGGAG AAAGAACTTG CCATTGC 37
<210>21
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YML123C基因的5’端特异性引物序列
<400>21
AGGTGACAGG ATCCAATACC GCACAAGAAC AAGATGG 37
<210>22
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YML123C基因的3’端特异性引物序列
<400>22
GTACGACTCA AAGCTTGGAT CTTCATCACT GGTGTCG 37
<210>23
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YEL046C基因的5’端特异性引物序列
<400>23
AGGTGACAGG ATCCAATATG TCTCAAGCGA TGGTGG 36
<210>24
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YEL046C基因的3’端特异性引物序列
<400>24
GTACGACTCA AAGCTTGGAT AGTCACCGTT GGAAGGAA 38
<210>25
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YLR180W基因的5’端特异性引物序列
<400>25
AGGTGACAGG ATCCAATAAG AGCGCAACTA AAGTCCG 37
<210>26
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YLR180W基因的3’端特异性引物序列
<400>26
GTACGACTCA AAGCTTGGAT GTCTCTTGGG ATGACTTTT 39
<210>27
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YLR355C基因的5’端特异性引物序列
<400>27
AGGTGACAGG ATCCAATACG ATGCCGCTCA ATCAGAA 37
<210>28
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YLR355C基因的3’端特异性引物序列
<400>28
GTACGACTCA AAGCTTGGAC CTTGGTCAAC AATGGCT 37
<210>29
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YLR419W基因的5’端特异性引物序列
<400>29
AGGTGACAGG ATCCAATACT CGGCTATTGG GCTTGC 36
<210>30
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YLR419W基因的3’端特异性引物序列
<400>30
GTACGACTCA AAGCTTGGAC CCACAAGTTA CACAGCGT 38
<210>31
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YLR300W基因的5’端特异性引物序列
<400>31
AGGTGACAGG ATCCAATATA TGACCACGGT TCCCTCG 37
<210>32
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YLR300W基因的3’端特异性引物序列
<400>32
GTACGACTCA AAGCTTGGAC CACCAATGTT GACACCAC 38
<210>33
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YNL300W基因的5’端特异性引物序列
<400>33
AGGTGACAGG ATCCAATAGT AGATGTTACC ACCACCCC 38
<210>34
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YNL300W基因的3’端特异性引物序列
<400>34
GTACGACTCA AAGCTTGGAT GGAGACCATA GATGTAGTA 39
<210>35
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YLR372W基因的5’端特异性引物序列
<400>35
AGGTGACAGG ATCCAATAAC TGGTGTCAAG ACCTCTA 37
<210>36
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YLR372W基因的3’端特异性引物序列
<400>36
GTACGACTCA AAGCTTGGAG CTTTCCTGGA AGAGACCT 38
<210>37
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YAL059W基因的5’端特异性引物序列
<400>37
AGGTGACAGG ATCCAATACC ATTTCTCGTG CCAAGTAC 38
<210>38
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母YAL059W基因的3’端特异性引物序列
<400>38
GTACGACTCA AAGCTTGGAT ATCCCAGCCA GCCTTTC 37
<210>39
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母Act1基因的5’端特异性引物序列
<400>39
AGGTGACAGG ATCCAATAGT GGTTACTCTT TCTCCAC 37
<210>40
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母Act1基因的3’端特异性引物序列
<400>40
GTACGACTCA AAGCTTGGAC GGACAATTTC TCTTTCAG 38
<210>41
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母基因表达的5’端引物中的通用引物序列
<400>41
AGGTGACAGG ATCCAATA 18
<210>42
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析酵母基因表达的3’端引物中的通用引物序列
<400>42
GTACGACTCA AAGCTTGGA 19
<210>43
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YPL122C基因的5’端特异性引物序列
<400>43
CGCATTGGAA GTTGGCAAAG 20
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YPL122C基因的3’端特异性引物序列
<400>44
TCGGAAGTCA GCATCAAAGC 20
<210>45
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YNR030W基因的5’端特异性引物序列
<400>45
CAGGAGCAGC ACATCTATGG 20
<210>46
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YNR030W基因的3’端特异性引物序列
<400>46
CTCGCCGCCT GGATAATTC 19
<210>47
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YDR343C基因的5’端特异性引物序列
<400>47
TCATGGGCTG TTTGGTCTTC 20
<210>48
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YDR343C基因的3’端特异性引物序列
<400>48
GTCGTAGTTG GCACCTCTTC 20
<210>49
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YGR088W基因的5’端特异性引物序列
<400>49
CCACGTCTTG TCGGATACTG 20
<210>50
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YGR088W基因的3’端特异性引物序列
<400>50
GTTCGGGTGT CATTGTTTGC 20
<210>51
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YPR149W基因的5’端特异性引物序列
<400>51
AACACCCAAC ATAGGCACAG 20
<210>52
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YPR149W基因的3’端特异性引物序列
<400>52
TGATACCAAC GGCCAACAC 19
<210>53
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YCL040W基因的5’端特异性引物序列
<400>53
TCAGACTGCC CACCACTC 18
<210>54
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YCL040W基因的3’端特异性引物序列
<400>54
CACAACGGAA CCATCACAAC 20
<210>55
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YBR054W基因的5’端特异性引物序列
<400>55
AGGAGCACCC AGGTTACAG 19
<210>56
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YBR054W基因的3’端特异性引物序列
<400>56
AGCAATCAAC CAGCAGACAG 20
<210>57
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YNR001C基因的5’端特异性引物序列
<400>57
TGGTCGTGCC AATCAAGAAG 20
<210>58
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YNR001C基因的3’端特异性引物序列
<400>58
AACTCTCCCT GCGTTCAAAG 20
<210>59
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YDR533C基因的5’端特异性引物序列
<400>59
TGGGATGAGC ATTCCTTAGC 20
<210>60
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YDR533C基因的3’端特异性引物序列
<400>60
TCGGCATTCA CCTCTTTTGG 20
<210>61
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YDL222C基因的5’端特异性引物序列
<400>61
ACAGGTTGCT ATGTGAAGGC 20
<210>62
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YDL222C基因的3’端特异性引物序列
<400>62
TGGTCCGAGT AGGTAGAGTG 20
<210>63
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YML123C基因的5’端特异性引物序列
<400>63
GCTGGTGTTG GTTTCTTGAC 20
<210>64
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YML123C基因的3’端特异性引物序列
<400>64
TTGACTTGGA CCTGGCATAC 20
<210>65
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YEL046C基因的5’端特异性引物序列
<400>65
TGTCCAACCA GATTGCCATC 20
<210>66
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YEL046C基因的3’端特异性引物序列
<400>66
GGAACCACCA TCGCTTGAG 19
<210>67
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YLR180W基因的5’端特异性引物序列
<400>67
TCGTCATCGG TGGTCCTC 18
<210>68
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YLR180W基因的3’端特异性引物序列
<400>68
CGGCATAAGC GGCAGAAC 18
<210>69
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YLR355C基因的5’端特异性引物序列
<400>69
TTACGGTTCC CAAGGTTACG 20
<210>70
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YLR355C基因的3’端特异性引物序列
<400>70
GAGCGGCATC GGACAAC 17
<210>71
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YLR419W基因的5’端特异性引物序列
<400>71
CAACTGCCTG CCTGGAAG 18
<210>72
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YLR419W基因的3’端特异性引物序列
<400>72
CGACCTGAGT GGATTTACCC 20
<210>73
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YLR300W基因的5’端特异性引物序列
<400>73
GTTTGCTGCC GCTTTGAC 18
<210>74
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YLR300W基因的3’端特异性引物序列
<400>74
TGCCTCCACA TAACGTCTTG 20
<210>75
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YNL300W基因的5’端特异性引物序列
<400>75
ACCGTTGCTG CCATTGC 17
<210>76
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YNL300W基因的3’端特异性引物序列
<400>76
GGTGGTGGTG TTAGCTTGG 19
<210>77
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YLR372W基因的5’端特异性引物序列
<400>77
CAGTTGCCGA CCAGTTCC 18
<210>78
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YLR372W基因的3’端特异性引物序列
<400>78
ACCCGTTAGC CAAGAAAGTC 20
<210>79
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YAL059W基因的5’端特异性引物序列
<400>79
ATCGGATGCT CTTGAACCAG 20
<210>80
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中YAL059W基因的3’端特异性引物序列
<400>80
CTCATTCTTG GCTGCTGTTC 20
<210>81
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中Act1基因的5’端特异性引物序列
<400>81
TCTGAGGTTG CTGCTTTGG 19
<210>82
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR分析酵母中Act1基因的3’端特异性引物序列
<400>82
CCGACGATAG ATGGGAAGAC 20
<210>83
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中Gnbp-like基因的5’端特异性引物序列
<400>83
AGGTGACAGG ATCCAATAAC AGCACCGTCA CCACT 35
<210>84
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中Gnbp-like基因的3’端特异性引物序列
<400>84
GTACGACTCA AAGCTTGGAA TACAGGCAGG CTTTCCATT 39
<210>85
<211>34
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中Gnbp2基因的5’端特异性引物序列
<400>85
AGGTGACAGG ATCCAATAAG GCGGAGGGAA CTGG 34
<210>86
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中Gnbp2基因的3’端特异性引物序列
<400>86
GTACGACTCA AAGCTTGGAT GGACCTGTTG TTCACG 36
<210>87
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中Spatzle基因的5’端特异性引物序列
<400>87
AGGTGACAGG ATCCAATAGC TTGTGGGTAC GGAGAC 36
<210>88
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中Spatzle基因的3’端特异性引物序列
<400>88
GTACGACTCA AAGCTTGGAG CACTGGTTTG ATACA 35
<210>89
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中Toll9基因的5’端特异性引物序列
<400>89
AGGTGACAGG ATCCAATATC GCAGTCAGTG GTGTCAA 37
<210>90
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中Toll9基因的3’端特异性引物序列
<400>90
GTACGACTCA AAGCTTGGAG ATGTTGTGCC ATGTGTA 37
<210>91
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中18Wheeler基因的5’端特异性引物序列
<400>91
AGGTGACAGG ATCCAATAGC GGAACAACAC TCTTACC 37
<210>92
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中18Wheeler基因的3’端特异性引物序列
<400>92
GTACGACTCA AAGCTTGGAA AAGGTGTTGT CTTCTATGTA 40
<210>93
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中Myd88基因的5’端特异性引物序列
<400>93
AGGTGACAGG ATCCAATAAG GACTGCAAGG GACTGG 36
<210>94
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中Myd88基因的3’端特异性引物序列
<400>94
GTACGACTCA AAGCTTGGAA ACCAACTGTG CCAGACCT 38
<210>95
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中Tube基因的5’端特异性引物序列
<400>95
AGGTGACAGG ATCCAATACA TTGCCTGCTG AACTGGAA 38
<210>96
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中Tube基因的3’端特异性引物序列
<400>96
GTACGACTCA AAGCTTGGAT TGAGGAGGCA ACTTTCTAA 39
<210>97
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中Cactus基因的5’端特异性引物序列
<400>97
AGGTGACAGG ATCCAATATC GGGTAACACT GCTCTGC 37
<210>98
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中Cactus基因的3’端特异性引物序列
<400>98
GTACGACTCA AAGCTTGGAA TCTCCATTGA GGCACGCTA 39
<210>99
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中Armadillo基因的5’端特异性引物序列
<400>99
AGGTGACAGG ATCCAATACA CGAGGGACTT CTTATGAG 38
<210>100
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中Armadillo基因的3，端特异性引物序列
<400>100
GTACGACTCA AAGCTTGGAT CTGTGTATCC TGGAATGCT 39
<210>101
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中基因表达的5’端引物中的通用引物序列
<400>101
AGGTGACAGG ATCCAATA 18
<210>102
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用串联子方法分析东亚飞蝗中基因表达的3’端引物中的通用引物序列
<400>102
GTACGACTCA AAGCTTGGA 19
<210>103
<211>16
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR引物检测东亚飞蝗感病前后脂肪体中Gnbp-like基因的5’端特异性引物序
列
<400>103
GCTGCCTCCA CGACGG 16
<210>104
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR引物检测东亚飞蝗感病前后脂肪体中Gnbp-like基因的3’端特异性引物序
列
<400>104
CTGCTGATGC TGCTGCTG 18
<210>105
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR引物检测东亚飞蝗感病前后脂肪体中Spatzle基因的5’端特异性引物序列
<400>105
ACGGAGACCT GTGTATCAAA CC 22
<210>106
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR引物检测东亚飞蝗感病前后脂肪体中Spatzle基因的3’端特异性引物序列
<400>106
CTGAGGCCAC CAATTTCTTC TG 22
<210>107
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR引物检测东亚飞蝗感病前后脂肪体中Toll9基因的5’端特异性引物序列
<400>107
ATATGCTACT GGAAGTGGCG ATAC 24
<210>108
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR引物检测东亚飞蝗感病前后脂肪体中Toll9基因的3’端特异性引物序列
<400>108
TGGATTCTGC TTTATTTGGC TTGTC 25
<210>109
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR引物检测东亚飞蝗感病前后脂肪体中Myd88基因的5’端特异性引物序列
<400>109
CTACTGATGA AGGACTGCCA AG 22
<210>110
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR引物检测东亚飞蝗感病前后脂肪体中Myd88基因的3’端特异性引物序列
<400>110
AAACTTGTTC TGTGGGATTT GC 22
<210>111
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR引物检测东亚飞蝗感病前后脂肪体中Cactus基因的5’端特异性引物序列
<400>111
CGCACGTACC AGCACCATG 19
<210>112
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR引物检测东亚飞蝗感病前后脂肪体中Cactus基因的3’端特异性引物序列
<400>112
CACCACACCA GACAACCAGA TG 22
<210>113
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR引物检测东亚飞蝗感病前后脂肪体中Armadillo基因的5’端特异性引物序
列
<400>113
GCAGCCAGCA ACCAGGAG 18
<210>114
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<223>用于扩增利用定量PCR引物检测东亚飞蝗感病前后脂肪体中Armadillo基因的3’端特异性引物序
列
<400>114
ACCATCTGTC CACGGATAAT AGC 23
Claims (10)
1.一种多重基因表达的分析方法，其特征在于：首先提取总RNA，利用各个基因相对应的嵌合引物，反转录获得各个基因的cDNA混合物，所述嵌合引物由含特定酶切位点的通用引物和各基因特异引物组成；然后利用包括所述含有特定酶切位点的通用引物进行PCR扩增得到各个基因表达标签的PCR产物；通过包括酶切、连接将代表各个基因的表达标签串联到一起，再将串联子克隆到载体上进行测序、分析；所述嵌合引物中通用引物的特定酶切位点与PCR扩增出的各基因表达标签的酶切位点不相重合。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述嵌合引物的5′端为含特定酶切位点的通用引物，所述嵌合引物的3′端为各基因特异引物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述含特定酶切位点的通用引物含17个以上的碱基。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述各基因特异引物含16个以上的碱基。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述含特定酶切位点的通用引物含碱基数量为18-25个。
6.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述各基因特异引物含碱基数量为16-25个。
7.如权利要求4所述的方法，其特征在于：利用包括所述含有特定酶切位点的通用引物进行PCR扩增具体是，先以所述反转录得到的cDNA为模板，利用各基因相对应的嵌合引物，在PCR前1-2或1-3或1-4或1-5个循环富集各个基因的表达标签；然后在以后的PCR循环中利用所述含有特定酶切位点的通用引物进行扩增。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于：所述PCR前面富集各个基因表达标签的循环所用嵌合引物与剩余的循环所用的通用引物的摩尔比为1∶50。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：所述PCR循环共为25-35个；在所述PCR前1-3个循环富集各个基因的表达标签，然后在以后的PCR循环中利用所述含有特定酶切位点的通用引物进行扩增。
10.如权利要求1所述的方法，包括如下步骤：
a.提取待分析样本的总RNA，利用各个基因相对应的嵌合引物，在同一反应管中反转录获得各个基因的cDNA混合物；所述嵌合引物由位于5′端的含有17个以上碱基的含特定酶切位点的通用引物和位于3′端的含有16个以上碱基的各基因特异引物组成；
b.利用所述的各个基因相对应的嵌合引物，以所述反转录获得的cDNA为模板，在PCR的前1-3个循环富集各个基因的表达标签，在各表达标签的末端均含有特定的限制性酶切位点；
c.在接下来的PCR的4-28个循环中，利用所述通用引物进行扩增，得到末端均含有特定的限制性酶切位点的各个基因的表达标签的PCR产物；所述PCR前1-3个循环所用嵌合引物与接下来的PCR4-28个循环所用的通用引物的摩尔比为1∶50；
d.沉淀回收所述c步骤所得的PCR产物，并利用各个表达标签末端含有的酶切位点，对所述PCR产物进行酶切，回收得到酶切产物；
e.利用连接酶将所述酶切后的PCR产物串联起来，形成串联子，电泳回收500bp以上的串联子，再将串联子连接到制备好的用相同的限制性内切酶酶切克隆载体上；
f.挑取所述多个克隆进行测序，利用Blast软件对测序结果进行分析。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102229931A (zh) * | 2011-05-23 | 2011-11-02 | 重庆大学 | 一种病原丝状真菌特异性启动子及其应用 |
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| WO2005095650A1 (en) * | 2004-04-01 | 2005-10-13 | Stichting Sanquin Bloedvoorziening | A method of genotyping blood cell antigens and kit suitable for genotyping blood cell antigens |
| CN101463389A (zh) * | 2008-12-18 | 2009-06-24 | 东华大学 | 一种基于荧光通用引物的多重定量rt-pcr基因表达谱分析方法 |
-
2010
- 2010-07-20 CN CN2010102320006A patent/CN101921846B/zh active Active
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| CN102229931A (zh) * | 2011-05-23 | 2011-11-02 | 重庆大学 | 一种病原丝状真菌特异性启动子及其应用 |
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