CN101463389A - 一种基于荧光通用引物的多重定量rt-pcr基因表达谱分析方法 - Google Patents
一种基于荧光通用引物的多重定量rt-pcr基因表达谱分析方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及基于荧光通用引物的多重定量RT－PCR基因表达谱分析方法，包括下列步骤：(1)通用引物及上下游嵌合特异引物的引物序列设计，通用引物的长度为20bp，上游通用引物5’端用Fam荧光标记，嵌合特异引物长度为38bp，3’端为特异引物序列段，5’端为通用引物序列段；(2)多重RT－PCR反应过程；(3)测序仪凝胶电泳予以分析检测。本发明适用于10－30个基因/反应的研究特定药物代谢途径或信号传导通路等特定候选基因表达分析，是一种对于定量的、高通量的、经济的基因表达分析简单最佳的多重解决方案。
Description
技术领域
本发明涉及涉及生物技术基因表达分析领域，具体涉及一种基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法。
背景技术
随着现代分子生物学技术和相关检测仪器的发展，基因表达谱分析也迅速发展起来。基因表达谱分析在分析基因功能，确定转录调控途径，阐明信号传导或代谢通路，研究表达水平多态性等方面中都发挥着至关重要的作用，并为分子药物、疾病诊断和治疗领域提供了帮助。
人类复杂性状疾病的研究和相关基因的定位是当前的研究热点。糖尿病、癌症、早老性痴呆和精神分裂症等疾病的遗传机理和相关效应基因仍不为人知。通过全基因组转录图谱来查找候选基因(candidate genes)是复杂性疾病研究的第一步，也对进一步理解人类复杂性疾病和分子药物的研发提供了帮助。转录图谱也被用于癌症诊断和疗效比较等临床分析中。基因表达谱可以用于肿瘤分类，进一步研究发现大约30个基因的表达情况可用来预测肿瘤对化学治疗药剂的生物反应状况。
全基因组表达芯片(Genome-wide microarrays)能成功的从各种反应条件下筛选出差异表达的基因，这些基因也被作为候选基因进行假设验证和功能分析。芯片技术的优势是通量大，一次实验所能检测的基因量很大，样本量也较多，但同时也存在着明显的劣势就是芯片的定量准确度较低，并且实验成本很高，只能在经济实力雄厚的实验室推广。基因表达分析中最常用的技术就是实时逆转录定量PCR(real-time qPCR)，它具有Northern blots等技术所不具有的定量分析能力，因此被广泛的用于基因表达定量分析中。Real-time qPCR技术被证明具有稳定性好、灵敏度高和7个数量级的定量线性等优势，但同时它也具有检测通量小、样本处理费时费力成本高等缺点。
有研究表明人类细胞大约还含有3万个基因，每个细胞平均有大约1万个基因参加表达，而10到50个基因表达和一种特定的疾病相关，10到50个基因和一个特定的通路和药物反应相关。考虑到多基因性状(multigenic traits)受到基因-环境的相互作用影响，发现它们的生物学基础需要在不同的环境条件下处理大量的样本，需要针对对适量的基因在适量的个体或样本中进行分析，因此一种中通量的基因表达分析方法亟待开发。这种基因表达谱检测平台能解决基因表达中高通量与低成本的瓶颈，一种对于定量的、高通量的、经济的基因表达分析简单最佳的多重解决方案。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种定量通量高(10-30个基因/反应)、成本低、样本需要量低、检测灵敏性高的多基因表达分析方法。
本发明针对11个目的基因和3个看家基因设计了荧光通用引物和嵌合特异引物。通用引物的长度为20bp，上游通用引物5’端用Fam荧光标记，通用引物对小鼠基因组特异。嵌合特异引物长度为38bp，3’端为特异引物序列段(18bp)，5’端为通用引物序列段(20bp)。设计的特异引物段要求理论退火温度均为55℃，并且有相似的GC含量。扩增产物的长度在100～400bp间，相邻产物长度差为5～7bp。
本发明的方法有两种优化方案：1.单序列荧光通用引物方案；设计单序列荧光通用引物，使通用引物的上下游序列采用同一序列。这样可以减少通用引物的引物二聚体对扩增反应影响，提高通用引物的扩增效率。2.上游嵌合特异引物降落式(Touchdown)PCR结合荧光通用引物补加方案。在PCR反应过程前期加入一个上游嵌合特异引物的降落式(Touchdown)PCR过程，使各个目的基因的上游嵌合特异引物能最佳退火，同时通用引物的补加也能克服扩增反应初期的通用引物二聚体影响，提高了反应效率。
本发明提供的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于包括下列步骤：
(1)通用引物及上下游嵌合特异引物的引物序列设计：
通用引物的长度为20bp，上游通用引物5’端用Fam荧光标记，通用引物对小鼠基因组无非特异性匹配。针对11个目的基因和3个看家基因设计嵌合特异引物长度为38bp，3’端为特异引物序列段(18bp)，5’端为通用引物序列段(20bp)
(2)多重RT-PCR反应过程：
a逆转录反应阶段，利用下游嵌合特异引物(chimeric reverse primer，3’端为一段基因特异序列，5’端为一段通用引物序列)逆转录合成目的基因的cDNA第一链；
b PCR反应过程，前3个循环，上游嵌合特异引物将通用引物序列加到目的基因DNA片段的两端；PCR反应的余下循环，高浓度的荧光通用引物取代上游嵌合特异引物完成整个PCR反应过程；
c根据荧光标记的PCR产物长度的不同，用AB1377测序仪凝胶电泳予以分析检测。
步骤1中所述的通用引物设计上采用上下游同一序列作为通用引物序列。
步骤2中所述的PCR反应过程，前期加入一个上游嵌合特异引物的降落式(Touchdown)PCR过程，为11个循环。
本发明结合了终点PCR法(end-point PCR)和荧光检测法(fluorescent detection)，将多对嵌合特异引物的PCR反应转变为一对通用引物的PCR反应大大降低了PCR反应的复杂性，并且所有待扩目的基因片段也在一对通用引物的作用下被等效率扩增、比例的放大，从而实现多重定量检测。本发明适用于10-30个基因/反应的研究特定药物代谢途径或信号传导通路等特定候选基因表达分析，是一种对于定量的、高通量的、经济的基因表达分析简单最佳的多重解决方案。
附图说明
图1为本发明的原理示意图，图中以一个目的基因模板表示
(A)为利用下游嵌合特异引物的逆转转录反应；
(B)为逆转录反应生成的目的基因cDNA单链；
(C)为PCR反应的前三个循环，由上游嵌合特异引物引导，将通用引物序列加到cDNA模板两端；
(D)为PCR反应余下循环，由通用荧光引物取代嵌合引物完成扩增；
(E)为荧光标记的PCR产物通过ABI Prism 377型核酸分析仪予以分析检测。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1.通用引物及上下游嵌合特异引物的引物序列设计
试验步骤：
(1)通用引物的设计：根据GenBank数据库的水稻序列信息，设计了两条20bp长的序列作为通用引物。设计原则是保证该引物在小鼠基因组上进行PCR反应无产物条带，避免通用引物带来非特异产物。通用引物的理论退火温度控制在55℃。上游通用引物5’端用Fam荧光标记。通用引物序列为Fam-cgggctacgctatctacgac(上游)与cgggcagtaagtaccgttgt(下游)。
(2)上下游嵌合特异引物的设计：根据GenBank数据库的11个小鼠目的基因和3个看家基因的cDNA序列信息，设计了14对18bp长的序列作为嵌合特异引物3’端的特异引物序列段。设计的特异引物段要求理论退火温度均为55℃，并且有相似的GC含量，设计完后在5’端加上通用引物序列。扩增产物的长度控制在100～400bp间，相邻产物长度差为5～7bp。
目的基因和看家基因的嵌合特异引物的序列为：
(3)所有引物尽量选择在mRNA特异的序列上设计，并经Blast和Oligomaster软件分析减少非特异扩增和引物二聚体对反应的影响。
2.样本RNA的制备
试验步骤：
(1)总RNA抽提采用TRIzol法。微量分光光度仪(U-008OD，HITACHI)控制抽提RNA的OD260/280在1.7～2.0间，浓度调整到1μg/μL。
(2)用DNase I(Invitrogen)消化TRIzol抽提的总RNA中混有的少量DNA污染。DNase I消化反应体系为RNA1μL、10×Reaction Buffer 1μL、DNase I(1U/μL)1μL，补水至10μL。反应过程为20℃15min，然后加1μL EDTA(25mM)，65℃ 10min使Dnase I失活。反应后的RNA浓度是100ng/μL。
3.多重RT-PCR反应及产物检测分析
试验步骤：
(1)逆转录反应体系为5×Reaction Buffer 4μL、MgCl2(25mM)4.8μL、dNTP Mix(2mM)1μL、ImProm-II Reverse Transcriptase(Promega)1μL、下游嵌合引物(总浓度10μM)2μL、RNA template(100ng/μL)2～3μL，补水至20μL。反应过程为25℃5min，42℃60min，70℃15min。
(2)PCR反应体系为PCR Buffer 10×1μL、MgCl2(25mM)0.6μL、dNTP Mix(2mM)1μL、5×Q-Solution 2μL、DNA Polymerase(Qiagen)(5U/μL)0.1μL、cDNA template(10～15ng/μL)1μL、上游嵌合特异引物对(总浓度10μM)0.5μL、通用上下游引物对(10μM)0.5μL，补水至10μL。反应过程为95℃ 15min；94℃ 30s，55℃ 90s，72℃ 60s，35 cycles；72℃ 10min。
(3)各取PCR反应产物1μL、DNA分子标准1μL、3×上样缓冲液1μL混匀。上述混合物经95℃变性3min，迅速置于冰浴2min，立即上377测序仪(Applied Biosystems Inc.)检测，电泳条件为电压3KV，电泳时间2.5h。电泳结果经GeneScan和GeneMapper ID软件分析获得产物大小、峰高、峰面积等数据。产物大小由DNA分子标准得出，峰高用来预判目的基因的表达强度，峰面积(即PCR产物条带荧光强度)用于计算目的基因的相对表达量，公式如下：
目的基因相对表达量＝目的基因峰面积÷看家基因峰面积的几何平均数
实施例2
2品系15天龄小鼠睾丸组织的性发育起始候选基因的表达分析——上游嵌合特异引物降落式(Touchdown)PCR结合荧光通用引物补加优化方法
试验步骤：
(1)解剖小鼠取睾丸组织，TRIzol Reagent(Invitrogen)抽提组织的总RNA。用DNase I消化TRIzol抽提的总RNA中混有的少量DNA污染。
(2)下游特异引物逆转录合成目的基因的cDNA单链模板。逆转录反应体系为5×Reaction Buffer 4μL、MgCl2(25mM)4.8μL、dNTP Mix(2mM)1μL、ImProm-II ReverseTranscriptase(Promega)1μL、下游嵌合引物(总浓度10μM)2μL、RNA template(100ng/μL)2～3μL，补水至20μL。反应过程为25℃5min，42℃60min，70℃15min。
(3)上游嵌合特异引物降落式(Touchdown)PCR结合荧光通用引物补加扩增。PCR反应分为两个阶段进行，第一个阶段为前11个循环的Touchdown PCR循环，退火温度为60℃～50℃，每一个循环退火温度降低1℃。第二个阶段为通用引物对补加后的30个循环的PCR扩增，退火温度为55℃。反应体系为PCR Buffer 10×1μl、MgCl2(25mM)0.6μl、dNTP Mix(2mM)1μl、5×Q-Solution 2μl、DNA Polymerase(5units/μl)0.1μl、cDNA模板(10～15ng/μl)1μl、上游嵌合特异引物对(总浓度10μM)0.5μl、通用上下游引物对(10μM)0.5μl，补水至10μl。反应过程为95℃15min；94℃ 30s，退火90s，72℃60s，35cycles；72℃10min。
(4)ABI377测序仪检测PCR反应产物。上样样本体系为PCR反应产物1μl(视浓度大小可稀释)、DNA分子标准(Rox荧光标记，分子片段大小为79bp、105bp、131bp、15Ibp、201bp、254bp、306bp)1μl、3×蓝色葡聚糖上样缓冲液1μl。配完上样体系经变性后(95℃3min后迅速置于冰浴放置5min)上377测序仪检测分析结果，电泳条件为电压3KV，电泳时间2.5h。电泳结果经GeneScan和GeneMapper ID软件分析得到片段大小、各个目的产物的峰高值及峰面积值等有关数据。产物大小由DNA分子标准得出，峰高用来预判目的基因的表达强度，峰面积(即PCR产物条带荧光强度)用于计算目的基因的相对表达量，公式如下：
目的基因相对表达量＝目的基因峰面积÷看家基因峰面积的几何平均数
(5)计算目的基因的相对表达量，筛选2品系小鼠睾丸组织间差异表达的基因。
Claims (9)
1.一种基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于：包括下列步骤：
(1)通用引物及上下游嵌合特异引物的引物序列设计
通用引物的长度为20bp，上游通用引物5’端用Fam荧光标记，嵌合特异引物长度为38bp，3’端为特异引物序列段，5’端为通用引物序列段；
(2)多重RT-PCR反应过程：
a逆转录反应阶段，下游嵌合特异引物逆转录合成目的基因的cDNA第一链；
b PCR反应过程，前3个循环，上游嵌合特异引物将通用引物序列加到目的基因DNA片段的两端；PCR反应的余下循环，高浓度的荧光通用引物取代上游嵌合特异引物完成整个PCR反应过程；
(3)测序仪凝胶电泳予以分析检测。
2.根据权利要求1所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于：步骤(1)中设计扩增产物的长度在100～400bp间，相邻产物长度差为5～7bp。
3.根据权利要求1所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于：步骤(1)中所述的通用引物为上下游同一序列。
4.根据权利要求1所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于：步骤(2)中所述的PCR反应过程，前期加入一个上游嵌合特异引物的降落式PCR过程，为11个循环。
5.根据权利要求1或2或3或4所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于：所述的通用引物根据水稻序列设计，引物序列为：FWD，5’-cgggctacgctatctacgac-3’，REV，5’-cgggcagtaagtaccgttgt-3’。
6.根据权利要求1或2或3所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于：所述的嵌合特异引物根据11个小鼠目的基因和3个看家基因的cDNA序列信息设计，引物序列为：
phf6 FWD：cgggctacgctatctacgacCGCAAAGGAAGACCGAGA
REV：cgggcagtaagtaccgttgtTGGACCTGCTGTCTTCTGG 产物长度：98bp
Placl FWD：cgggctacgctatctacgacATCCGCATCAAGGCTGTC
REV：cgggcagtaagtaccgttgtGATGAGCCCTTGGAAGCA 产物长度：114bp
Tmem32 FWD：cgggctacgctatctacgacCCCACGAGCATGAACACA
REV：cgggcagtaagtaccgttgtAGGCGGGGTTCCTATCAA 产物长度：122bp
Usp26 FWD：cgggctacgctatctacgacATGCCCAGACACAGCACA
REV：cgggcagtaagtaccgttgtTGACACCGAACCATTCCA 产物长度：138bp
Ddx26b FWD：cgggctacgctatctacgacACGTGGCATTGAGGGAAA
REV：cgggcagtaagtaccgttgtTCATGGAGGCGGACGTAT 产物长度：145bp
PPIA FWD：cgggctacgctatctacgacACGCCACTGTCGCTTTTC
REV：cgggcagtaagtaccgttgtTGCAAACAGCTCGAAGGA 产物长度：152bp
mospd1 FWD：cgggctacgctatctacgacTTCCGAGGAGCCAGTGTT
REV：cgggcagtaagtaccgttgtTGGCACTGGATCCCACTT 产物长度：164bp
Hsbst2 FWD：cgggctacgctatctacgacTTCGGCCAGGTTTGTACC
REV：cgggcagtaagtaccgttgtAGGTGACGGCCAAAAGTG 产物长度：178bp
Gm773 FWD：cgggctacgctatctacgacAACCACATCACGGCAGGT
REV：cgggcagtaagtaccgttgtTCCAGGAAAGCCATTTGC 产物长度：187bp
Mbnl3 FWD：cgggctacgctatctacgacTGGGCGTGGAGACAGTTT
REV：cgggcagtaagtaccgttgtGGCCTGACTTT TGCCAGA 产物长度：197bp
Gapdh FWD：cgggctacgctatctacgacCAATGTGTCCGTCGTGGA
REV：cgggcagtaagtaccgttgtGGCATCGAAGGTGGAAGA 产物长度：218bp
FhI1 FWD：cgggctacgctatctacgacCAGGTGCAAAGGGTGCTT
REV：cgggcagtaagtaccgttgtTGGCCTTGTTGCACTTCA 产物长度：249bp
Cxxlb/Cxxla FWD：cgggctacgctatctacgacATGGCGAGATGGACAAGC
REV：cgggcagtaagtaccgttgtCGAACACCCGCTTCATCT 产物长度：256bp
Beta-actin FWD：cgggctacgctatctacgacCAACTGGGACGACATGgA
REV：cgggcagtaagtaccgttgtCCATCACAATGCCTGTGG 产物长度：270bp
7.根据权利要求1或2或3或4所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于：步骤(2)中所述的逆转录反应体系为5×Reaction Buffer 4μL、4.8μL浓度为25mM的MgCl2、1μL浓度为2mM的dNTP Mix、1μL浓度为1U/μL的ImProm-II Reverse Transcriptase、下游嵌合引物2μL总浓度10μM、2～3μL浓度为100ng/μL的RNAtemplate，补水至20μL，反应过程为25℃5min，42℃60min，70℃15min。
8.根据权利要求1或2或3或4所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于：步骤(2)中所述的PCR反应过程反应体系为PCR Buffer 10×1μL、0.6μL浓度为25mM的MgCl2、1μL浓度为2mM的dNTP Mix、5×Q-Solution2μL、0.1μL浓度为5U/μL DNA Polymerase、1μL浓度为10～15ng/μL的cDNA template、上游嵌合特异引物对0.5μL总浓度10μM、0.5μL通用上下游引物对10μM，补水至10μL，反应过程为95℃ 15min；94℃ 30s，55℃ 90s，72℃ 60s，35cycles；72℃ 10min。
9.根据权利要求4所述的基于荧光通用引物的多重定量RT-PCR基因表达谱分析方法，其特征在于：所述降落式PCR反应过程退火温度为60℃～50℃，每一个循环退火温度降低1℃。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| CNA2008102072386A CN101463389A (zh) | 2008-12-18 | 2008-12-18 | 一种基于荧光通用引物的多重定量rt-pcr基因表达谱分析方法 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101921846A (zh) * | 2010-07-20 | 2010-12-22 | 重庆大学 | 一种多重基因表达的分析方法 |
| CN112899351A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-06-04 | 东华大学 | 一种双重荧光定量pcr检测pdx模型小鼠细胞浸润状态试剂盒 |
-
2008
- 2008-12-18 CN CNA2008102072386A patent/CN101463389A/zh active Pending
Cited By (4)
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| CN101921846A (zh) * | 2010-07-20 | 2010-12-22 | 重庆大学 | 一种多重基因表达的分析方法 |
| CN101921846B (zh) * | 2010-07-20 | 2012-11-14 | 重庆大学 | 一种多重基因表达的分析方法 |
| CN112899351A (zh) * | 2021-02-03 | 2021-06-04 | 东华大学 | 一种双重荧光定量pcr检测pdx模型小鼠细胞浸润状态试剂盒 |
| CN112899351B (zh) * | 2021-02-03 | 2022-08-26 | 东华大学 | 一种双重荧光定量pcr检测pdx模型小鼠细胞浸润状态试剂盒 |
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