JP2014520544A - 核酸増幅 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図3
Description
本方法はいかなる緩衝剤も必要せず、最小限の緩衝剤だけが存在することが望ましい。緩衝剤は、少量の強酸または塩基が加えられるとき、あるいは、本件の場合、少量のプロトンがヌクレオチドの取り込み中に放出されるときにpHがわずかに変化するように、選択された作用点付近の溶液の酸度(pH)を維持するために用いられる弱酸とその共役塩基である。緩衝剤は、pHの変化に対して緩衝を与えるという主たる目的を有する混合物に加えられた化合物である。本明細書で使用されているように、その主目的が干渉以外であるか、あるいは、その緩衝効果が、混合物中の別の化合物よりもはるかに少ない化合物は、緩衝剤ではない。核酸増幅反応のための緩衝剤は、一般に、6と8.5の間のpKa値を有しており、6と9の間の緩衝範囲を有している。例えば、アンモニウム(NH4+)は一定の緩衝能力を有しているが、その主な目的は、pH8の混合物で作用する9.24のpKaで混合物を緩衝することではなく、それはトリスと比較してさほど強い緩衝液ではない。
図4のフローチャートに例証されるように、DNAサンプルが調製されて、1つ以上のチャンバーまたはウェルに分けられてもよい。チャンバーまたはウェルはそれぞれ、マイクロチップ上のISFETに晒される。DNAはループ媒介等温増幅用試薬と結合する。以下は個々に好ましい試薬および濃度であり、組み合わせは試薬の最も好ましいキットである:
・1マイクロリットル当たり少なくとも0.3ユニットのBstポリメラーゼ
・1Mのベタインの濃度
・5uMのプライマーの総濃度
・5mMの硫酸マグネシウムの濃度
・1mMのトリスの濃度
・ゼロの硫酸アンモニウムの濃度
・組み合わせた流体のpHを8.5pHに設定する、1.2mMのNaOHの濃度
・5mMの塩化アンモニウムの濃度、および
・50mMの塩化カリウムの濃度。
本方法は、図4の選択肢Aによる好ましい実施形態において、例証されるように、核酸鎖中の1つ以上の塩基を特定するために使用されてもよい。特定は単一塩基または特徴的な配列であってもよい。独自の配列が特定される場合、病状に関連するある塩基を特定することは可能であり、塩基についてのこの知識は、診断のための方法を提供することができる。対象となる塩基の例としては、特徴的な配列、一塩基多型(SNP)、欠失、挿入、短いタンデム反復(STP)、および、受け継がれるまたは体細胞的に由来する突然変異体が挙げられる。病原体の検出も可能であり、それによって、該方法は生物の存在、または、生物の菌株の存在を検知することもある。
該方法は、図4の選択肢Bで例証されるように、サンプル中のDNAの量を定量化するために使用されてもよい。任意の時間のプロトン濃度は、流体中のDNAの量と、以前の生成されたプロトンの蓄積量に比例し、それは検知領域から離れて拡散してはいない。任意の時間に反応開始からシグナルが変化したことを知り、これを標準と比較することで、当業者は、増幅の開始時のサンプル中のDNAの量を決定することができる。したがって、当業者は、サンプル中の出発DNAの量を決定するために、現在の量と時間から過去に遡って作業する。
本方法は、DNAポリメラーゼとともにトリ骨髄芽球症ウイルス(AMV RTase)などの逆転写酵素(RTase)を用いてRNA鋳型を検知するために使用されてもよい。cDNAは鋳型RNAから合成され、現在の技術で増幅され、その後、pHセンサーまたはpH指示薬を用いて検知可能である。
ほとんどの化合物が混合物に一定の緩衝能を供している一方で、完全な貢献は理想的に最小化される。しかしながら、酵素を安定させるために最小の緩衝液が必要とされることもある。緩衝剤(仮に存在する場合)、総試薬緩衝能、および濃度の選択は、増幅反応によって生じる予想されるプロトンを考慮してなされなければならない。生成されたプロトンの量は、出発鋳型の量、増幅条件、および増幅時間(過剰なヌクレオチド、酵素、およびプライマーを想定して)に依存する。出発鋳型はドナーに依存し、得られた生体サンプルのタイプと増幅時間は、検査のオペレーターまたは製造業者によって選ばれてもよい。しかしながら、増幅時間、生体サンプルのタイプ、およびドナーのタイプについての知識から、当業者は、生成されるプロトンの予想量(または量の範囲)を計算することができる。
β=dn/d(p[H+])
ここで、nは追加されたOH−またはH+の量であり、d(p[H+])は、水素イオン濃度の余対数における結果として生じる無限小の変化である。
β=2.17mΜ/>0.5
β<4.34mΜ
したがって、混合物の緩衝能は、所望の0.5よりも大きなpHの変化を達成するためには、4.34mM未満に設定されなければならない。
Claims (22)
- 核酸を等温で増幅する際に使用される混合物を形成するために組み合わせ可能な試薬のキットであって、
試薬のキットは、マグネシウム塩、第4級アンモニウム塩、アルカリ塩基を含む、ことを特徴とするキット。 - 混合物の緩衝能は、混合物に当てられたセンサーによって検知される閾値のpH変化により分割された増幅中に放出されたプロトンの予想される濃度未満に設定される、ことを特徴とする請求項1に記載のキット。
- 混合物の緩衝能は、混合物に当てられたセンサーによって検知される閾値のpH変化により分割された増幅中に放出されたプロトンの予想される濃度の2分の1未満に設定される、ことを特徴とする請求項1に記載のキット。
- 検知される閾値のpH変化は前記センサーの検出限界である、ことを特徴とする請求項2または3に記載のキット。
- 増幅の動作条件での混合物の緩衝能は、10mM未満、好ましくは5mM未満、より好ましくは1mM未満である、ことを特徴とする請求項1乃至4のいずれかに記載のキット。
- 混合物中の緩衝剤の濃度は、5mM未満、より好ましくは3mM未満、2mM未満、または1mM未満である、ことを特徴とする請求項1乃至5のいずれかに記載のキット。
- 硫酸化合物の濃度は、もしそれが存在する場合、15mM未満、好ましくは10mM未満、8mM未満、5mM未満、または、1mM未満である、ことを特徴とする請求項1乃至6のいずれかに記載のキット。
- 第4級アンモニウム塩、好ましくは塩化アンモニウムの濃度は、2mMから15mMの間にある、ことを特徴とする請求項1乃至7のいずれかに記載のキット。
- アルカリ塩基の濃度は、混合物のpHを、6から9、好ましくは7から8.8、より好ましくは8から8.6の間で設定する、ことを特徴とする請求項1乃至8のいずれかに記載のキット。
- アルカリ塩基はNaOH、KOH、またはLiOHのうちの1つである、ことを特徴とする請求項1乃至9のいずれかに記載のキット。
- 核酸の増幅で使用される1つ以上のプライマーをさらに含み、プライマーは、増幅が標的核酸の存在を示すように、対立遺伝子に特異的である、ことを特徴とする請求項1乃至10のいずれかに記載のキット。
- 等温の増幅は、鎖置換増幅、好ましくは、ループ媒介等温増幅(LAMP)である、ことを特徴とする請求項1乃至11のいずれかに記載のキット。
- 混合物の緩衝能は、増幅がない状態で放出される予想される量のプロトンをほぼ遮蔽する、ことを特徴とする請求項1乃至12のいずれかに記載のキット。
- 鎖置換酵素、ヌクレオチド、およびプライマーをさらに含み、これらの少なくとも1つは残りの試薬とは別々に保管される、ことを特徴とする請求項1乃至13のいずれかに記載のキット。
- 核酸の増幅をモニタリングする方法であって、
該方法は、
pHセンサーまたはpH指示薬に対して、請求項1乃至14のいずれかの試薬のキットを用いて、核酸と増幅混合物を提供する工程、
等温の増幅を用いて核酸を増幅する工程、および、
pHセンサーまたはpH指示薬を用いて、増幅によるpHの変化を検知する工程を含む、方法。 - pH指示薬は比色用色素または蛍光色素である、ことを特徴とする請求項15に記載の方法。
- pHセンサーはイオン感受性電界効果トランジスタ(ISFET)である、ことを特徴とする請求項15に記載の方法。
- あらかじめ決められた量の変化以上に混合物のpHを変化させるために必要な反応時間を決定する工程と、
前記反応時間に基づいて核酸の出発濃度を定量化する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項15乃至17のいずれか1つに記載の方法。 - 混合物は、参照電極、好ましくは銀−塩化銀電極と流体連通する、ことを特徴とする請求項15乃至18のいずれか1つに記載の方法。
- 混合物は、核酸の標的の一塩基多型(SNP)に相補的な少なくとも1つの塩基を有する1つ以上の対立遺伝子に特異的なプライマーを含み、前記方法は、pHセンサーまたはpH指示薬によって検知されるように、増幅が進行するかどうかに依存して、核酸の前記少なくとも1つの塩基を特定する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項15乃至19のいずれか1つに記載の方法。
- 増幅は、混合物の緩衝能の10%以上、混合物のプロトン濃度を変化させる、ことを特徴とする請求項15乃至20のいずれか1つに記載の方法。
- 請求項1乃至14のいずれか1つのキットを使用して核酸を等温で増幅する工程を含む方法。
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