JP2014520544A5 - - Google Patents

Description

本発明の第１の態様によれば、核酸を等温で増幅する際に使用される混合物を形成するために組み合わせ可能な試薬のキットが提供され、試薬のキットは、マグネシウム塩、第４級アンモニウム塩、アルカリ塩基を含む。混合物の緩衝能は当該混合物に当てられたセンサーによって検出されるｐＨ変化の閾値によって割られた増幅中に放出されたプロトンの濃度の予測値未満に設定されてもよい。

混合物の緩衝能は、当該混合物に当てられたセンサーによって検出されるｐＨ変化の閾値によって割られた増幅中に放出されたプロトンの濃度の予測値の２分の１未満に設定されてもよい。

Claims (15)

1. 核酸を等温で増幅する際に使用される混合物を形成するために組み合わせ可能な試薬のキットであって、
   試薬のキットは、マグネシウム塩、ＮａＯＨ、ＫＯＨ又はＬｉＯＨから選択されるアルカリ塩基、および第４級アンモニウム塩、塩化アンモニウム、または塩酸グアニジンの少なくとも１つを含み、
   ここで該混合物は、１０ｍＭ未満の緩衝能を有する、ことを特徴とするキット。
2. 混合物の緩衝能は、当該混合物に当てられたセンサーによって検出されるｐＨ変化の閾値によって割られた増幅中に放出されたプロトンの濃度の予測値未満に設定される、ことを特徴とする請求項１に記載のキット。
3. 混合物の緩衝能は、当該混合物に当てられたセンサーによって検出されるｐＨ変化の閾値によって割られた増幅中に放出されたプロトンの濃度の予測値の２分の１未満に設定される、ことを特徴とする請求項１に記載のキット。
4. 検知されるｐＨ変化の閾値は前記センサーの検出限界である、ことを特徴とする請求項２または３に記載のキット。
5. 増幅の動作条件での混合物の緩衝能は、５ｍＭ未満である、ことを特徴とする請求項１乃至４のいずれかに記載のキット。
6. 混合物は、緩衝剤をさらに含み、緩衝剤は、トリス、Ｈｅｐｅｓ、ＢｉｃｉｎｅおよびＭＯＰＳから成る群から選択される、ことを特徴とする請求項１乃至５のいずれかに記載のキット。
7. 混合物中の緩衝剤の濃度は、５ｍＭ未満である、ことを特徴とする請求項６に記載のキット。
8. 混合物は、硫酸化合物をさらに含み、混合物中の硫酸化合物の濃度は、１５ｍＭ未満である、ことを特徴とする請求項１乃至７のいずれかに記載のキット。
9. 混合物中の第４級アンモニウム塩、塩化アンモニウム、または塩酸グアニジンの濃度は、２ｍＭから１５ｍＭの間にある、ことを特徴とする請求項１乃至８のいずれかに記載のキット。
10. アルカリ塩基の濃度を、混合物のｐＨが、６から９の間になるように設定する、ことを特徴とする請求項１乃至９のいずれかに記載のキット。
11. 核酸の増幅で使用される１つ以上のプライマーをさらに含み、プライマーは、増幅が標的核酸の存在を示すように、対立遺伝子に特異的である、ことを特徴とする請求項１乃至１０のいずれかに記載のキット。
12. 核酸の増幅をモニタリングする方法であって、
    該方法は、
    ｐＨセンサーまたはｐＨ指示薬に対して、請求項１乃至１１のいずれかの試薬のキットを用いて、核酸と混合物を提供する工程、
    等温の増幅を用いて核酸を増幅する工程、および、
    ｐＨセンサーまたはｐＨ指示薬を用いて、増幅によるｐＨの変化を検知する工程を含む、方法。
13. あらかじめ決められた量の変化以上に混合物のｐＨを変化させるために必要な反応時間を決定する工程と、
    前記反応時間に基づいて核酸の出発濃度を定量化する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
14. 混合物は、核酸の標的の一塩基多型（ＳＮＰ）に相補的な少なくとも１つの塩基を有する１つ以上の対立遺伝子に特異的なプライマーを含み、前記方法は、ｐＨセンサーまたはｐＨ指示薬によって検知されるように、増幅が進行するかどうかに依存して、核酸の前記少なくとも１つの塩基を特定する工程をさらに含む、ことを特徴とする請求項１２または１３に記載の方法。
15. 増幅は、混合物の緩衝能の１０％以上混合物のプロトン濃度を変化させる、ことを特徴とする請求項１２乃至１４のいずれか１つに記載の方法。