KR20200138790A

KR20200138790A - 대상체의 소변 샘플에서 마이코박테리아와 관련된 항원을 검출하기 위한 항체 또는 항체 조합 및 이를 사용하는 방법

Info

Publication number: KR20200138790A
Application number: KR1020207031228A
Authority: KR
Inventors: 브로거 토비아스
Original assignee: 파운데이션 오브 이노베이티브 뉴 다이아그노스틱스
Priority date: 2018-03-29
Filing date: 2019-03-29
Publication date: 2020-12-10
Also published as: JP2021521462A; CN112005117A; EP3775904A1; US20210025887A1; WO2019186486A1; BR112020019618A2

Abstract

대상체의 시험관내 샘플 소변에서 마이코박테리아와 연관된 항원을 검출하기 위한 항체로서, 여기서 상기 항원은 Man LAM(만노스 캡핑 리포아라비노만난)을 포함하고, 상기 항체는 상기 소변 유래의 상기 Man LAM 분자에 특이적으로 결합하며, 상기 항체는 3×10^-8 M 이하의 KD를 갖는 친화도로 상기 Man LAM에 결합하고, 여기서 상기 항체는 10^-3 M 이상의 KD를 갖는 친화도로 이노시톨 포스페이트로 캡핑되거나 캡핑되지 않은 LAM 분자에 결합하는 항체; 및 이를 사용하기 위한 방법.

Description

대상체의 소변 샘플에서 마이코박테리아와 관련된 항원을 검출하기 위한 항체 또는 항체 조합 및 이를 사용하는 방법

본 발명은 적어도 일부 실시형태에서 대상체의 소변 샘플에서 마이코박테리아와 관련된 항원을 검출하기 위한 항체 또는 항체 조합 및 이를 사용하는 방법, 구체적으로 이와 같은 항체 또는 항체 조합 및 질환을 유발하는 마이코박테리아와 다른 박테리아 종을 높은 정확도로 구별할 수 있는 방법에 관한 것이다.

결핵(TB)은 사망자가 제일 많은 전염병이다. 2016년에는, 1,040만명이 TB에 걸렸고, 170만 명이 이 질환으로 사망하여 전세계 9번째 주요 사망 원인이면서 감염원으로부터의 주요 원인이 되었다(World Health Organization 2017). TB는 또한 HIV에 걸린 사람들(PLHIV)의 가장 흔한 사망 원인으로, 2016년에 374,000명이 사망한 것으로 추정된다(World Health Organization 2017). TB 발병 위험은 HIV가 없는 사람에서보다 PLHIV에서 약 30배 더 높은 것으로 추정된다(Getahun & Ford 2016). TB로 인한 사망의 대부분은 조기 진단으로 예방될 수 있었지만, TB는 종종 진단되지 않은 상태에 있다. 전 세계적으로 추정된 사건과 보고된 TB 사례 사이에는 410만 건의 사례 차이가 있는 것으로 추정된다(World Health Organization 2017). 이러한 차이는 기존 테스트의 한계와 TB가 만연한 저소득 및 중소득 국가(LMIC)에서 전형적인 1차 진료 환경에 적합한 정확하고 저렴하며 신속한 테스트의 부족으로 인한 것이다.

전통적인 진단 방법은 느리거나(객담 배양) 둔감하다(객담 도말 현미경검사). 염기서열결정 또는 Xpert® MTB/RIF 실시간 PCR 테스트와 같은 최신 기법이 더 많이 이용 가능하게 되었지만, 특수 시설이 필요하거나, 비용이 많이 들거나, 또는 다르게는 TB에 걸릴 위험이 가장 큰 LMIC의 다수의 집단은 접근할 수 없다(Pai et al. 2016). 기존 TB 진단의 한계는 이 집단에서 치료되지 않은 TB와 연관된 높은 사망률로 인해 특히 PLHIV에 대해 심각하다. 추가적으로, 대부분의 테스트는 객담 샘플의 분석을 기반으로 하는 반면, TB가 있는 많은 PLHIV는 폐외 TB가 있거나(약 25%) 그렇지 않으면 객담 샘플을 생성할 수 없다. Xpert 임상 성능 연구의 메타 분석(Steingart et al. 2014)은, HIV-양성 환자에 대한 통합 민감도가 HIV-음성 환자에 비하여 더 낮다(99% 대 86%)는 것을 나타내었다. 이러한 결과는 적어도 부분적으로, 도말-양성 객담에 비해 도말-음성 객담에서 Xpert 테스트의 더 불량한 통합 민감도와 결합된 HIV-양성 환자의 도말-음성 비율이 더 높은 것(67% 대 98%)으로 설명되었다. 인용된 연구에서, Xpert는 HIV-양성 환자에서 도말-음성 TB를 검출하는 데 단지 43%만 민감했다(Lawn et al. 2011). 최근 개발된 Xpert Ultra의 민감도는 HIV가 있는 환자에서의 Xpert의 민감도보다 우수했지만, 민감도가 개선되면서 특이성은 감소하였다(Dorman et al. 2017).

모든 TB 환자의 조기 발견 및 치료는 WHO의 TB 근절 전략의 핵심 구성요소이며 세 번째 지속 가능한 발전 목표(Sustainable Development Goal; Uplekar et al. 2015)를 충족하기 위한 요구사항이지만, 이를 달성하려면 환자가 처음 치료를 받는 지역 보건소 또는 병원과 같은 환경에서 활동성 TB를 진단하기 위한 새로운 민감한 현장 진단(point-of-care: POC) 접근법이 필요할 것이다. 치료 결정을 신속하게 알릴 수 있는 정확한 POC 테스트의 부재는 치료 캐스케이드의 초기 단계에서 상당한 환자 손실을 초래하며, 이는 이환율 및 사망률의 증가를 초래한다(Cazabon et al. 2017). 따라서, WHO는 우선 순위가 높은 목표 약품 특성(target product profile: TPP) 보고서(World Health Organization 2014)에서 중요한 미충족 필요사항으로서 "TB를 검출하는 신속한 바이오마커-기반의, 비-객담 기반 테스트"를 열거한다.

활동성 TB 환자의 혈청 또는 소변에 존재하는 마이코박테리아 항원을 식별하는 데 상당한 관심이 있어왔다. 이 항원은 객담 샘플의 수집을 필요로 하지 않고 저비용 면역검정(immunoassay)-기반의 신속한 테스트 형식으로 개발될 수 있는 진단 테스트의 잠재적인 표적을 나타낸다. 결핵균(마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis): Mtb)의 세포벽 리포다당류 및 발병 인자인 리포아라비노만난(LAM)은 TB에 대한 진단 바이오마커로서 가장 주목을 받고 있다. LAM은 바이오마커로서 다수의 매력적인 특징을 가진다: 이는 박테리아 유래이고, Mtb의 세포벽에 풍부하며, 열에 안정적이고, Mtb에 특유한 구조적 에피토프를 가지고 있다. LAM이 다수의 TB 환자의 소변에서 발견될 수 있다는 광범위한 증거가 있으며(Sarkar et al. 2014), 초기 단계 연구는 LAM이 또한 객담(Pereira Arias-Bouda et al. 2000; Cho et al. 1990) 및 혈액(Crawford et al. 2017; Sada et al. 1992)에서도 발견될 수 있음을 나타낸다.

1990년 객담(Cho et al. 1990), 1992년 혈액(Sada et al. 1992), 및 1997년 소변(Svenson 1997)에서 LAM이 처음 보고된 이래로, 진단 표적으로서 LAM의 매력적인 특징은 상업용 ELISA 및 신속한 (측방 유동(lateral flow)) 테스트의 개발을 포함하여 LAM-기반 진단에 대한 25년의 연구의 영감이 되었다. 현재 TB의 임상 진단용으로 시장에 나와 있는 유일한 LAM 테스트인, Abbott Diagnostics사의 Alere Determine TB LAM® 테스트(LF-LAM)는 토끼 다클론성 항체를 사용하는, 소변에서 LAM을 측정하기 위한 측방 유동 테스트이다. 객담에서 LAM을 측정하기 위한, 또 다른 테스트인 Otsuka Pharmaceutical사의 ELISA 테스트는 최근 유럽에서 사용하기 위한 CE 마크를 받았지만, TB 약물 시험에서 치료에 대한 반응을 평가하기 위한 도구로서만 사용되고 있다(Kawasaki et al. 2018).

소변에서 LAM을 측정하기 위한 키트의 도입 후 초기의 강한 흥분 및 상기 키트의 성능을 평가하는 수많은 임상 연구에도 불구하고, 이들 테스트의 채택은 제한적이었다. 채택률이 낮은 주된 이유는 부수적인 TB 사례의 범위 전반에 걸쳐 테스트의 임상 민감도가 상대적으로 낮기 때문이었다. PLHIV에서 TB를 진단하기 위한 Alere LF-LAM 테스트를 평가하는 연구의 포괄적인 메타 분석 결과, 테스트의 진단 정확도가 제한적인 것으로 나타났다: 3037명의 환자에서의 92% 통합 특이성의 HIV+ 사례에서 TB 진단에 대한 44%의 통합 민감도(World Health Organization 2015). 이 분석은 CD4 수가 100개 세포/㎕ 이하이고 TB 증상이 있는 HIV/AIDS(PLHIV)에 걸린 살아있는 사람의 TB를 진단하기 위해 Alere LF-LAM만을 사용하는 매우 제한적인 WHO 권고사항의 기초를 형성하였다(World Health Organization 2015). 이 분석의 낮은 민감도에도 불구하고, Alere LF-LAM으로 테스트한 후 즉각적인 치료는 10개의 아프리카 병원의 HIV+ 입원환자에서 대규모의 실용적인 무작위화 병행설계 다중심 시험에서 8주 사망률을 현저하게 감소시키는 것으로 나타났지만(Peter et al. 2016), 지금까지 중앙아프리카공화국 및 짐바브웨만 진단 테스트에서 Alere LF-LAM을 통합하는 방법에 대한 지침을 가지고 있고, LMIC에서 이해가 매우 제한적이었다(MSF & Stop-TB Partnership 2017).

LF-LAM 테스트 및 이전 ELISA 테스트로 수행된 수많은 연구에도 불구하고, LAM 테스트의 임상 성능을 개선할 경로가 있는지 여부를 이해하는 데 중요한 TB 바이오마커로서 소변 LAM에 대한 주요한 미응답 질문이 있다. 가장 중요한 것은, LF-LAM-음성 TB 환자, 특히 CD4 수가 높은 HIV+ 환자 및 HIV- 환자의 소변 중 LAM 수준은 단순히 현재 테스트로 측정하기에는 너무 낮지만, 검출 한계가 개선된 테스트로 측정될 수 있는지 여부가 이해되지 않는다는 것이다. 둘째, 소변에서 가장 관련성이 높고 Mtb-특징을 가진 LAM 에피토프의 이용 가능성 및 풍부함은 잘 알려져 있지 않다.

소변에서 마이코박테리아 리포아라비노만난(LAM)의 측정을 기반으로 한 결핵(TB)에 대한 현재의 진단 테스트는, 저비용 및 사용 용이성과 같은 저소득 및 중소득 국가에서 사용하기에 다수의 바람직한 속성을 가지지만, 민감도가 충분하지 않다. 그러나, 정확도가 더 높은(즉, 임상 민감도가 더 높은) 소변 기반 테스트는 분명히 바람직할 것이다.

본 발명은 대상체의 소변 샘플에서 마이코박테리아와 관련된 항원을 검출하기 위한 항체 또는 항체 조합 및 이를 사용하는 방법을 제공함으로써 배경기술의 이러한 단점을 극복한다. 항체 또는 항체 조합 및 방법은 질환-유발 마이코박테리아와 다른 박테리아 종을 높은 정확도로 구별할 수 있다.

적어도 일부 실시형태에 따르면, 대상체의 시험관내 샘플 소변에서 마이코박테리아와 연관된 항원을 검출하기 위한 항체가 제공되며, 여기서 상기 항원은 ManLAM(만노스 캡핑 리포아라비노만난(Mannose capped Lipoarabinomannan))을 포함하고, 상기 항체는 상기 소변 유래의 상기 ManLAM 분자에 특이적으로 결합하며, 상기 항체는 3×10^-8 M 이하의 KD를 갖는 친화도로 상기 ManLAM에 결합하고, 여기서 상기 항체는 10^-3 M 이상의 KD를 갖는 친화도로 이노시톨 포스페이트로 캡핑되거나 캡핑되지 않은 LAM 분자에 결합한다.

선택적으로 ManLAM은 MTX-캡핑 ManLAM을 포함하며, 만노사이드 캡은 5-데옥시-5-메틸티오-자일로 모이어티의 부착에 의해 추가로 변형되는 것을 특징으로 한다.

선택적으로 MTX-캡핑 ManLAM은, 알파 1-4-연결 메틸자일로스 잔기로 추가로 치환된 2개의 알파 1-2-Manp-연결 잔기를 특징으로 하는 MTX-Man2-캡핑 ManLAM을 포함한다.

선택적으로 항체는 Manp 특성을 포함하는 상기 ManLAM의 에피토프에 결합한다.

선택적으로 항체는 글리칸7, 글리칸8, 글리칸9, 글리칸10 및 글리칸11로 이루어진 군으로부터 선택되는 모티프의 특성으로 특징지어지는 상기 ManLAM의 에피토프에 결합한다.

선택적으로 에피토프는 MTX-다이만노스 부분의 특성으로 추가로 특징지어진다.

선택적으로 항체는 대상체 유래의 소변 샘플을 사용하여 대상체에서 느리게 성장하는 마이코박테리아의 존재를 검출하는 데 적합하다.

선택적으로 항체는 결핵균(마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)) 또는 소결핵균(마이코박테리움 보비스(M. bovis))과 연관된 항원을 검출하는 데 적합하다.

적어도 일부 실시형태에 따르면, 항체는 질환-유발 마이코박테리아와 연관된 항원을 특이적으로 검출할 수 있고, 이와 같은 박테리아와 연관된 마커를 다른 유형의 박테리아와 구별할 수 있다.

선택적으로 항체는 대상체의 소변에서 빠르게 성장하는 마이코박테리아 유래의 마커와 교차반응하지 않는다.

선택적으로 항체는 마이코박테리움 포르투이툼(M. fortuitum), 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis), 마이코박테리움 압세수스(M. abscessus), 또는 마이코박테리움 켈로네(M. chelonae)와 연관된 마커와 교차반응하지 않는다.

선택적으로 항체는 마이코박테리움 고르도네(M. gordonae), 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellulare), 및 마이코박테리움 아비움(M. avium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 느리게 성장하는 마이코박테리아와 연관된 마커와 적어도 10배 더 낮은 반응성을 나타낸다.

선택적으로 항체는 비-마이코박테리움 박테리아 종의 검출에 비해 적어도 1500배 더 높은 반응성으로 상기 마이코박테리움 투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 보비스와 연관된 항원을 검출한다.

선택적으로 비-마이코박테리움 박테리아 종은 고르도니아 브론키알리스(Gordonia bronchialis), 노카르디아 아스테로이드(Nocardia asteroids), 로도코쿠스 종(Rhodococcus sp.), 츠카무렐라 파우로메타볼럼(Tsukamurella paurometabolum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 코리네박테리움 우레알리티쿰(Corynebacterium urealyticum), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 크렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae), 스트렙토코쿠스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스타필로코쿠스 사프로파이티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 또는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 중 하나 이상을 포함한다.

적어도 일부 실시형태에 따르면, 항체는, 바람직하게는 면역검정에 사용되는 항체의 복수 또는 조합을 포함할 수 있다. 보다 바람직하게는, 면역검정은 샌드위치 면역검정(sandwich immunoassay)이고, 여기서 하나의 항체는 항원을 "포획"(capture)하는 한편, 제2 항체는 포획된 항원의 존재를 검출한다. 각각의 항체는 항원에서 상이한 에피토프에 결합하여, 항원에서 서로 경쟁하는 것을 회피한다. 검출 항체는 포획 항체보다 항원에 대한 더 낮은 결합 친화도를 가질 수 있다.

적어도 일부 실시형태에 따르면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체는 항원을 검출하기 위한 샌드위치 면역검정에서 포획 항체로서 사용하기에 적합하다.

선택적으로 항체는 항원을 검출하기 위한 샌드위치 면역검정에서 검출 항체로서 사용하기에 적합하다.

적어도 일부 실시형태에 따르면, 상기 청구항 중 어느 하나에 따른 항체를 대상체의 소변과 접촉시키는 단계; 소변 중 항원에 대한 상기 항체의 결합을 검출하는 단계; 상기 항체가 3×10^-8 M 이하의 KD를 갖는 친화도로 소변 중 상기 항원에 특이적으로 결합하면, 상기 ManLAM 분자를 특징으로 하는 상기 질환-유발 마이코박테리아는 대상체의 신체에 존재하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법이 제공된다.

선택적으로 항체는 비-질환 유발 마이코박테리아(non-disease causing mycobacteria)의 항원보다 적어도 3배 더 큰 신호로 소변 중 상기 질환-유발 마이코박테리아의 항원에 결합한다.

선택적으로 상기 방법은 제1 항체를 소변에 적용하여 상기 항원에 결합시키는 단계로서, 상기 제1 항체는 상기 청구항 중 어느 한 항에 따른 것임을 특징으로 하는, 상기 결합시키는 단계; 및 제2 항체를 소변에 적용하여 제2 항원에 결합시키는 단계를 더 포함하되, 상기 제2 항체는 제1 항체와 동일한 항원에 결합하지 않고, 상기 제1 및 제2 항원은 상기 ManLAM 분자를 포함하며; 면역검정에서 상기 제1 및 제2 항체 중 하나는 포획 항체이고 상기 제1 및 제2 항체 중 다른 하나는 검출 항체이다.

선택적으로 제2 항체는 3×10^-5 M 이하의 KD를 갖는 친화도로 상기 ManLAM 분자의 폴리-아라비노스에 결합하는 것을 특징으로 한다.

선택적으로 항체는 ara4 및/또는 ara6에 특이적으로 결합한다.

선택적으로 상기 방법은 소변을 MoAb1, 13H3, 27D2 및 A194-01로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체와 접촉시키는 단계를 더 포함한다. MoAb1 항체는 미국 특허 번호 US9512206에 기재되어 있으며, 이는 청구범위를 뒷받침하는 데 필요한 정도로 본 명세서에 완전히 제시된 것처럼 참조로 포함된다. A194-01 항체는 미국 특허 출원 공개 번호 US2017016058에 기재되어 있으며, 이는 청구범위를 뒷받침하는 데 필요한 정도로 본 명세서에 완전히 제시된 것처럼 참조로 포함된다.

선택적으로 상기 방법은 샌드위치 면역검정에서 소변을 복수의 MoAb1, 13H3, 27D2 또는 A194-1 항체의 조합과 접촉시키는 단계를 더 포함한다.

선택적으로 상기 방법은 샌드위치 면역검정에서 소변을 MoAb1 및 A194-1 항체의 조합과 접촉시키는 단계를 더 포함한다.

선택적으로 상기 방법은 대상체의 분류를 위한 적합한 참조 표준 진단을 사용하여 결핵이 없는 대상체 유래의 샘플과 비교하여 결핵을 앓고 있는 대상체 유래의 샘플의 중앙 신호 사이에 3 이상의 배수 변화를 달성하기에 적합한 제2 항체를 포함하는 샘플에 MoAb1 항체를 적용하는 단계를 더 포함한다.

선택적으로 참조 표준 진단은 대상체를 분류하기 위한 마이코박테리아 배양 또는 PCR 기반 방법을 기반으로 한다.

선택적으로 상기 방법은 적합한 비교 표준 검정을 사용하여 결핵이 없는 대상체 유래의 샘플과 비교하여 결핵을 앓고 있는 대상체를 적어도 20% 더 검출하기 위해 샘플에 MoAb1 항체를 적용하는 단계를 더 포함하며, 상기 적합한 비교 표준 검정은 Alere LF-LAM을 포함한다.

선택적으로 결핵이 없는 대상체 유래의 소변 샘플에서 검출된 ManLAM 항원 특이적 샌드위치 면역검정 신호는 모집단에서 샘플의 적어도 70%에 대해 11 pg ManLAM/㎖ 미만이다.

선택적으로 신호는 모집단에서 샘플의 적어도 80%에 대해 검출 한계 미만이다.

선택적으로 신호는 모집단에서 샘플의 적어도 90%에 대해 검출 한계 미만이다.

선택적으로 신호는 모집단에서 샘플의 적어도 95%에 대해 검출 한계 미만이다.

선택적으로 신호는 모집단에서 샘플의 적어도 97%에 대해 검출 한계 미만이다.

선택적으로 결핵이 있는 대상체 유래의 소변 샘플에서 검출된 ManLAM 항원 특이적 샌드위치 면역검정 신호는 모집단에서 샘플의 적어도 40%에 대해 11 pg ManLAM/㎖ 초과이다.

선택적으로 신호는 모집단에서 샘플의 적어도 50%에 대해 검출 한계 초과이다.

선택적으로 신호는 모집단에서 샘플의 적어도 60%에 대해 검출 한계 초과이다.

선택적으로 신호는 모집단에서 샘플의 적어도 75%에 대해 검출 한계 초과이다.

선택적으로 신호는 모집단에서 샘플의 적어도 90%에 대해 검출 한계 초과이다.

선택적으로 상기 방법은 HIV 바이러스의 부재 하에 대상체에서 TB 질환-유발 마이코박테리아를 검출하는 단계를 더 포함한다.

선택적으로 결핵을 앓고 있는 대상체 대 결핵이 없는 대상체의 2원 진단 분류를 위한 상기 항원에 대한 상기 항체의 결합을 기반으로 한 면역검정의 AUC(곡선하 면적)는 적어도 0.70이다.

선택적으로 AUC는 적어도 0.80이다.

선택적으로 AUC는 적어도 0.85이다.

선택적으로 AUC는 적어도 0.90이다.

선택적으로 AUC는 적어도 0.95이다.

선택적으로 AUC는 적어도 0.98이다.

선택적으로 상기 방법은 제1 항체로서 MoAb1 항체 또는 13H3 항체, 및 제2 항체로서 A194-01 항체 또는 27D2의 조합을 적용하여 대상체 유래의 시험관내 소변 샘플에서 마이코박테리아와 연관된 항원을 검출하는 단계를 더 포함하며, 여기서 면역검정에서 제1 및 제2 항체 중 하나는 포획 항체이고 제1 및 제2 항체 중 다른 하나는 검출 항체이다.

선택적으로 검출은 면역검정을 사용하여 수행되며, 여기서 조합은 Alere LF-LAM 테스트보다 임상 민감도가 적어도 20% 더 높다.

선택적으로 상기 방법은 대상체의 신체에서 상기 질환-유발 마이코박테리아의 존재에 따라 결핵이 있는 대상체를 진단하는 단계를 더 포함한다.

선택적으로 진단은 대상체에서 활동성 결핵 감염의 존재를 검출하는 것을 더 포함한다.

선택적으로 상기 방법은 상기 질환-유발 마이코박테리아의 존재에 따라 결핵에 대한 대상체의 치료 효능을 모니터링하는 단계를 더 포함한다.

선택적으로 상기 방법은 임상 민감도를 추가로 증가시키기 위해 면역검정을 이용한 검출 전에 샘플에서 ManLAM을 포함하는 상기 항원을 농축시키는 단계를 더 포함한다.

선택적으로 상기 항원을 농축시키는 것은 샘플에 자기 비드 또는 한외여과를 적용하는 것을 포함한다.

선택적으로 상기 방법은 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재와 대상체에서 비-질환 유발 마이코박테리아를 구별하는 단계를 더 포함한다.

선택적으로 상기 방법은 대상체의 환경으로부터 오염 박테리아의 존재 하에 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 특이적으로 검출하는 단계를 더 포함한다.

선택적으로 오염 박테리아는 고르도니아 브론키알리스, 노카르디아 아스테로이드, 로도코쿠스 종, 츠카무렐라 파우로메타볼럼, 칸디다 알비칸스, 코리네박테리움 우레알리티쿰, 에스케리치아 콜라이, 크렙시엘라 뉴모니에, 스트렙토코쿠스 아갈락티에, 스타필로코쿠스 사프로파이티쿠스, 슈도모나스 아에루기노사, 스타필로코쿠스 아우레우스, 프로테우스 미라빌리스, 프로테우스 불가리스, 나이세리아 고노레아, 헤모필루스 인플루엔자, 엔테로코쿠스 페칼리스, 엔테로박터 아에로게네스, 또는 클라미디아 트라코마티스, 또는 비결핵성 마이코박테리아 중 하나 이상을 포함한다.

선택적으로 상기 방법은 상기 항체를 접촉하기 전에 소변을 가열하는 단계를 더 포함한다.

적어도 일부 실시형태에 따르면, 대상체의 HIV 상태는 대상체가 질환 유발 마이코박테리아에 의한 감염을 앓고 있는지 여부를 결정하는 항체 조합의 능력 및 방법에 현저하게 영향을 미치지 않는다. 리포아라비노만난(LAM)을 포함하는 항원은 HIV 양성 및 HIV 음성 결핵(TB) 대상체의 소변에서 검출 가능하다.

본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 단지 예로서 본 명세서에서 설명된다. 이제 상세한 도면을 구체적으로 참조하면, 나타낸 특정 사항은 단지 예로서 그리고 본 발명의 바람직한 실시형태의 예시적인 논의의 목적을 위한 것이며, 본 발명의 원리 및 개념적 측면의 가장 유용하고 용이하게 이해되는 설명인 것으로 여겨지는 것을 제공하기 위해 제시된다. 이와 관련하여, 본 발명의 근본적인 이해에 필요한 것보다 더 상세하게 본 발명의 구조적 세부 사항을 나타내려는 시도는 이루어지지 않으며, 도면과 함께 취해진 설명은 본 발명의 여러 형태가 어떻게 실제로 구현화될 수 있는지를 당업자에게 명백하게 한다. 도면에서:
도 1a 내지 1c는 LAM을 검출하기 위한 항체 쌍을 식별하기 위한 스크리닝 결과. (a) 스크리닝 및 측정에 사용된 샌드위치 면역검정의 개략도. (b) 배양된 Mtb 유래의 정제된 LAM(좌측 열지도) 및 TB-양성, HIV-양성 개체 유래 소변에서의 LAM(우측 열지도) 10 ng/㎖를 검출하는 포획(행) 및 검출(열) 항체의 각각의 쌍별 조합의 능력을 나타내는 열지도. 열지도는 신호 대 블랭크(S/B) 비율을 나타낸다. 소변 LAM 열지도의 값은 2명의 개체 유래의 소변 샘플에 대한 최대값을 나타낸다. 항체 이름은 글리칸 어레이에 대한 결합에 의해 결정된 바와 같이 표적으로 하는 LAM 에피토프를 기반으로 색으로 표시되며, 에피토프는 포획 항체의 이름 옆에 열거된다(에피토프 맵핑 결과의 상세 내용은 도 2b 및 도 7 참조). TB-양성, HIV-양성 개체 유래의 소변에서 정제된 LAM 및 LAM과 높은 반응성을 나타내는 항체 조합은 빨강색 박스로 표시되어 있다. (c) 열지도에 열거된 상이한 에피토프를 예시하는 LAM의 개략도.
도 1d 내지 1e는 항체 에피토프 맵핑에 사용된 61개의 올리고당 구조체의 구조를 도시한다. 선택된 올리고당(Gly 16, Gly 22 및 Gly 44)은 토끼 단클론성 항체의 개발에 추가로 사용되었다. 핵심사항은 도 1f에 도시되어 있다.
도 2a는 최고 성능의 항-LAM 항체, 즉 검출 항체로서 A194-01과 조합한 포획 항체로서의 MoAb1에 대한 LAM 농도의 함수로서의 면역검정 신호를 도시한다. 점은 블랭크 샘플(n = 10) 및 7개 레벨의 LAM(레벨당 n = 4)을 테스트할 때 측정된 면역검정 신호를 나타낸다. 실선은 데이터에 맞는 4PL을 나타낸다. 파선은 1.375의 S/B 비율을 제공하는 신호 및 두 쌍에 대한 적합 곡선으로부터 계산된 연관된 LAM 검출 한계(LOD)를 나타낸다.
도 2b는 글리칸 어레이를 사용한 에피토프 맵핑 결과를 도시한다. 선택된 올리고당 구조체에 대한 0.039 ㎍/㎖의 농도에서 단클론성 항체의 반응성. 암록색 영역은 강한 결합을 나타내고, 백색 영역은 결합이 없거나 낮음을 나타낸다. 도면은 적어도 하나의 항체에 대해 배경에 대한 반응성이 나타난 모든 글리칸을 포함한다. 제1 칼럼의 이름은 도 1d 내지 도 1e를 참조한다.
도 3. (a) A194-01 검출 항체와 쌍을 형성할 때 5가지의 포획 항체에 대해 테스트된 모든 소변 샘플(표의 열)에 대해 측정된 LAM 농도를 나타내는 열지도. 공여자 TB 및 HIV 상태로 샘플을 그룹화한다. 표의 맨 아래 행은 비교를 위해 각각의 샘플에 대한 Alere LF-LAM 테스트 등급을 제공한다(양성 Alere LF-LAM 테스트 결과가 있는 샘플만 색상이 지정됨). (b) MoAb1 포획/A194-01 검출 항체 쌍을 사용한 샌드위치 면역검정에 대한 도 3a의 결과를 산점도 형식으로 재플롯팅한다. 플롯은 공여자의 TB 및 HIV 상태에 따른 각각의 소변 샘플에 대하여 측정된 신호 대 블랭크(S/B) 비율(좌측 축) 및 LAM 농도(우측 축)를 나타낸다. 주황색 파선은 검정 임계값(S/B = 1.375)을 나타낸다. 농도 값은 검정 임계값을 초과하는 점에 대해서만 의미가 있다. 점은 동일한 샘플에 대한 Alere LF-LAM 테스트의 결과에 의해 색상이 지정된다. 검출 항체로서 194-01과 결합된 다른 3가지 포획 항체에 대한 산점도는 도 3c에서 확인할 수 있다. 도 3c는 공여자의 TB 및 HIV 상태에 따른 각각의 소변 샘플에 대하여 측정된 신호 대 블랭크(S/B) 비율(좌측 축) 및 LAM 농도(우측 축)를 나타낸다. 각각의 플롯은 A194-01 검출 항체와 쌍을 형성할 때 포획 상체 패널에서 3가지 포획 항체 중 하나에 대한 결과를 나타낸다. 주황색 파선은 검정 임계값(S/B = 1.375)을 나타낸다. 농도 값은 검정 임계값을 초과하는 점에 대해서만 의미가 있다. 점은 동일한 샘플에 대한 Alere LF-LAM 테스트의 결과에 의해 색상이 지정된다.
도 4는 MoAb1 포획/A194-01 검출 항체 조합을 사용하여 TB+HIV+ 환자 유래의 4가지 소변 샘플 세트에 대해 LAM의 측정된 농도의 플롯을 도시한다. 연한 색의 막대는 전처리없이 샘플을 테스트하였을 때 측정된 농도이다. 어두운 색의 막대는 샘플을 열 처리(10분 동안 85℃)하였을 때의 결과를 나타낸다.
도 5. (A 내지 B) (B) HIV 상태 및 CD4 수(㎕당 세포) 및 (C) Alere LF-LAM 테스트에 의해 분류된 TB+ 대상체에 대한 검정 신호. 별표는 맨 좌측 상태와 유의한 차이를 나타냈다(맨-휘트니 검정(Mann-Whitney test), p < 0.05).
도 6. 플롯은 A194-01 검출 항체와 쌍을 형성할 때 각각의 후보 포획 항체에 대해 관찰된 임상 민감도 및 특이성(95%의 신뢰 구간을 가짐)을 도시한다. 플롯은 또한 다음과 같은 2가지 상이한 사용 사례 시나리오에 사용된 POC TB 테스트에 대한 목표 약품 특성(TPP)에서 WHO가 설정한 최소(삼각형) 및 최적(다이아몬드)의 목표 민감도 및 특이성 요구조건을 도시한다: (i) TB의 확정적인 검출/진단(자주색 기호) 또는 (ii) TB에 대한 추가 확인 테스트를 받아야 하는 환자를 식별하기 위한 분류(녹색 기호). 검정의 성능을 나타내는 마커는 이상적으로 사용 사례에 대한 요구조건을 나타내는 마커의 위쪽과 좌측에 있을 것이다(관심 영역이 강조표시되어 있음). 95% 신뢰 윌슨(Wilson) 신뢰 구간이 표시되어 있다.
도 7은 글리칸 어레이를 사용한 에피토프 맵핑의 결과를 도시한다. 도 1d 내지 도 1f의 61가지 모든 구조 및 3개 음성 대조군 스팟(BSA 및 완충액의 2배) 및 1개 양성 대조군 스팟(LS)에 대한 6가지 상이한 항체 농도에서 단클론성 항체의 반응성.
도 8: 미생물 및 복합 참조 표준에 대한 테스트 대상 항체(Antibodies Under Test) 및 Alere LF-LAM 사이의 민감도, 특이성 및 차이점에 대한 포레스트 플롯(forest plot). (a) 분석을 위해 이변수 무작위-효과 모델을 사용하여 결합된 모든 코호트의 경우, (b) 3가지 코호트에 대해 개별적인 경우, 및 (c) 3가지 CD4 계층에서 이변수 무작위-효과 모델을 사용한 통합 분석의 경우. *이변수 무작위-효과 모델을 사용한 분석을 기반으로 한 민감도 및 특이성 추정치는 별표로 표시되어 있다. MRS는 미생물 참조 표준, CRS는 복합 참조 표준, ΔSn은 민감도 차이, ΔSp는 특이성 차이, HIV는 인간 면역결핍 바이러스 및 CI는 신뢰 구간을 나타낸다.
도 9: 벤 다이어그램. (a) 모든 미생물학적으로 확인된 TB 진단(n = 141), 및 (b) CD4가 100개 세포/㎕ 이하인 환자(n = 74)에서 미생물학적으로 확인된 TB 진단의 비율로서, 이는 코호트 2의 입원 후 24시간 이내에 수득한 샘플에 대한 단일 소변의 테스트 대상 항체 측정, 소변 Alere LF-LAM, 소변 Xpert, 객담 Xpert 또는 객담 도말 현미경검사 테스트를 수행함으로써 이루어질 수 있었다. 벤 다이어그램 아래의 표는 테스트 방법에 따른 진단 수율을 기록한다. "상기 방법이 누락한 TB 사례"는 환자의 입원 동안 임의의 시점에 수집한 임의의 시료에 대한 양성 마이코박테리아 배양에 의해 이루어진 것 및/또는 처음 24시간 후에 수집된 임의의 시료에 대한 Xpert 테스트를 기반으로 한 진단을 포함한다. 벤 다이어그램 내에 포함된 숫자는 주어진 검정 또는 검정들에 의해 진단된 TB 사례의 수를 나타낸다.

질환-유발 마이코박테리아와 연관된 대상체의 소변에서 항원(들)을 검출하기 위한 LAM 검정은 매우 바람직한데, 이는 이와 같은 테스트가 심지어 까다로운 의학적 및 임상 조건 하에서도 비용이 저렴하고 실시하기에 용이하기 때문이다. 적어도 일부 실시형태에서, 본 발명은 다양한 LAM 에피토프를 표적으로 하는 항체를 사용하여 LAM에 대한 민감한 면역검정을 제공하는 개선된 검정 시약 및 방법에 관한 것이다.

상이한 접근법을 사용하여 개발되고 다양한 LAM 모티프를 표적으로 하는 LAM에 대한 전체 8가지의 후보 항체를 평가하였다. 이러한 항체를 스크리닝하여 샌드위치 형식에서 LAM 검출을 위한 최상의 분석 감도를 제공하는 항체 쌍을 식별하였다. 그 다음, 최고의 후보 쌍을 TB의 임상 증상이 있는 1차 진료 현장에서 제시된 HIV+ 및 HIV- 성인 유래의 75개 소변 샘플의 후향적 사례-대조 연구에서 평가하였다. 또한 후보물의 교차 반응성도 잠재적으로 간섭하는 비-TB 박테리아 및 미생물에 대해 평가하였다.

어떤 방식으로도 국한되는 것을 바라지 않지만, 본 발명의 일 양태는 면역검정 형식에서 전체 샘플 세트에 걸쳐 우수한 민감도[93% (CI: 80% 내지 97%)] 및 특이성[97%(CI: 85% 내지 100%)]을 보인 항체 쌍에 관한 것이다(도 5). 중요한 것은, 심지어 분석이 HIV- 대상체로 제한된 때에도 검정이 높은 민감도[80%(CI: 55% 내지 93%)]를 나타내었다는 것이다. 대조적으로, LAM에 대한 상업용 Alere LF-LAM 스트립 테스트는 전체 민감도가 33%(CI: 20% 내지 48%)이고 HIV-하위집단에 대한 민감도는 단지 13%(CI: 4% 내지 38%)임을 나타내었다. 선택된 쌍은, TB-유발 마이코박테리아 유래의 LAM에 상대적으로 특이적인 메틸티오-d-자일로스(MTX) 구조를 표적으로 하는 포획 항체를 사용하였으며; 빠르게 성장하는 마이코박테리아 또는 LAM-생성 비-마이코박테리아인 방선균(악티노마이세테스; actinomycetes), 다른 일반적인 요로 감염 또는 잠재적인 교차 반응 세포에 대하여는 어떠한 교차 반응성도 관찰되지 않았다(표 2a). 또 다른 TB에 덜 특이적인 포획 항체가 더 높은 분석 감도를 제공하지만 더 낮은 임상 특이성을 제공하므로, 이러한 특이성은 중요한 것으로 보인다.

실시예 1 - 소변에서 질환 유발 마이코박테리아와 연관된 항원의 검출을 위한 LAM-기반 검정

이 실시예는 질환 유발 마이코박테리아와 연관된 소변에서 하나 이상의 항체를 검출하기 위한 예시적인 LAM-기반 검정에 관한 것이다.

재료 및 방법

항체 및 대조 재료

Mtb 균주 아오야마-B(Aoyama-B) 유래의 정제된 LAM을 Nacalai USA, Inc.(미국 샌디에이고 소재)로부터 입수하였다. 마이코박테리움 스메그마티스 유래의 포스포이노시톨-캡핑 LAM(PILAM) 및 Mtb 및 소결핵균의 비활성 전체 세포 용해물을 Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository(BEI, 미국 매너서스 소재)로부터 입수하였다. 교차 반응성 테스트를 위해, 다수의 상이한 박테리아 및 진균 균주의 살아있는 전체 세포 스톡을, 동결건조 세포의 바이알 또는 글리세롤 중 동결 세포 현탁액으로서 ATCC로부터 입수하였다. 동결건조 세포를 인삼 완충 생리식염수(PBS) 중 2% 소혈청 알부민(BSA) 0.5㎖에 현탁시켰다. 그 다음, 스톡 세포 현탁액을 동일한 완충액에서 연속 희석하여 테스트 샘플을 생성하였다.

Abe Pinter/Rutgers 박사(A194-01)를 포함한 대학 및 영리 그룹의 협력에 의해 감사하게도 다수의 기존 단클론성 및 다클론성 항-LAM 항체가 제공되었다(Choudhary et al. 2018; Kaur et al. 2002; US 특허 출원 공개 US2017016058). 상업용 항-LAM 토끼 다클론성 항체(Viro Poly)는 Virostat, Inc.(미국 웨스트브룩 소재)에서 구입하였다.

MoAb1, MoAb2, MoAb3은 BCG로 면역화되고 ManLAM에 대해 패닝된 닭(MoAb2) 및 토끼(MoAb1 및 MoAb3)에서 생성된 ScFv 라이브러리의 파지 디스플레이에 의해 Otsuka Pharmaceutical사에서 단리한 재조합 항체이다(미국 특허 번호 US9512206). 이들 항체는 가변 영역 서열을 합성하고 이들 서열을 표준 IgG1 벡터에 삽입한 다음 플라스미드를 Expi293 세포로 형질감염시킴으로써 발현되었다.

추가적으로, 2가지 재조합 토끼 단클론성 항체(13H3 및 27D2) 및 토끼 다클론성 항체(Imm Poly)를 새로 생산하였다. 단클론성 항체는 면역원으로서 소혈청알부민과 결합된 합성 LAM 올리고당 단편을 사용하여 생성되었다(앨버타 대학교의 Todd Lowary 박사 제공). 간단히 말해서, 토끼를 65㎍ BSA-Ara6(ID 44), 65㎍ BSA-Ara7(ID 16) 및 65㎍ BSA-Ara22(ID 22)로 면역화시키고, 올리고당 구조의 설명을 위해 제7일 및 제14일에 동일한 혼합물로 부스팅했다(도 1d 참조). 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 제28일에 수집하고 96 웰 플레이트에서 배양하였다. LAM에 대한 결합 및 BSA에 대한 낮은 교차 반응성에 대하여 간접 ELISA에 의해 상청액을 테스트하였다. 원하는 활성을 갖는 웰의 항체 유전자를 클로닝하고, HEK293 세포에서 발현시킨 다음, 간접 ELISA에 의해 테스트하여 정제된 LAM 및 열-사멸 Mtb H37Ra에 대해 가장 반응성이 높은 항체(13H3 및 27D2)를 확인하였다. 250㎍ 정제 LAM, 200㎍ 열 사멸 Mtb H37Ra 및 불완전 프로인트 아주반트(ICFA)의 혼합물로 토끼를 면역화시키고 제28일, 제47일 및 제67일에 동일한 면역원으로 부스팅시킴으로써 다클론성 항체(Imm Poly)를 생성하였다. 제76일에 수집한 혈청을 단백질 A 칼럼 상에서 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다.

13H3은 다음과 같은 번역된 가변 영역 서열을 가진다:

13H3 중쇄(밑줄친 서열은 불변 영역의 시작을 나타낸다):

13H3 카파 사슬: (밑줄친 서열은 불변 영역의 시작을 나타낸다)

27D2는 다음과 같은 번역된 가변 영역 서열을 가진다: 11H3/11K2

27D2 중쇄(밑줄친 서열은 불변 영역의 시작을 나타낸다):

27D2 카파 사슬: (밑줄친 서열은 불변 영역의 시작을 나타낸다)

모든 항체를 분석하여 항체의 결합 부위에 의해 인식되는 올리고당 에피토프를 식별하였다. 문헌[Choudhary et al. 2018에 기재된 바와 같은 다양한 세트의 61가지의 올리고당 구조를 제시하는 글리칸 어레이에 대한 항체의 결합을 측정함으로써 에피토프 식별을 수행하였다. 구조 세트는 도 1d 내지 도 1f에 도시되어 있다. 간단히 말하면, 앞서 기재된 문헌[Gadikota et al. 2003; Joe et al. 2006; Joe et al. 2007; Sahloul & Lowary 2015]과 같이 올리고당 단편을 합성한 다음, BSA에 접합하고 사용하여 마이크로어레이를 생성하였다. 항체의 연속 희석액을 37℃에서 30분 동안 슬라이드에서 배양하고, 세척 후, 40분 동안 형광 표지된 2차 항-종 항체로 염색하였다. GenePix 4000B 스캐너(Molecular Devices사, 미국 서니베일 소재)를 사용하여 형광 신호를 측정하고 각각의 스폿의 강도를 ProMicroarray Image Analysis Software 6.1을 사용하여 정량화하였다.

LAM 면역검정

다중 샌드위치 면역검정 형식(도 1a) 및 전기화학발광(ECL) 검출을 이용하는 LAM에 대한 면역검정은 Meso Scale Diagnostics, LLC(MSD)의 시판 기기 및 멀티웰 플레이트 소모품 상에서 수행하였다(Debad et al. 2004). MSD의 U-PLEX® 96-웰 플레이트에서 검정을 실행하였다. 플레이트의 각각의 웰의 바닥에는 통합 스크린-인쇄 탄소 잉크 전극 상에 고정된 10개로 나뉘어진 배열의 결합 시약이 있다. 10가지 결합 시약은 각각 10개의 독점 링커의 세트 중 하나에 결합한다. U-PLEX 검정에서, 상이한 포획 시약은 상이한 링커에 결합된다. 포획 항체-링커 접합체의 혼합물을 웰에 첨가하고 링커의 상보적 어레이 요소(또는 "스팟") 상에서 링커가 자가조립될 수 있게 함으로써 필요에 따라 플레이트에서 포획 시약의 어레이를 형성한다. 항-LAM 항체의 어레이를 사용하여 단일 다중 측정에서 다중 포획 항체의 성능을 비교하였다.

U-PLEX 패키지 삽입물의 절차에 따라 검정에 사용하기 위한 항체를 준비하였다. 포획 시약을 Sulfo-NHS-LC-Biotin(Thermo Fisher Scientific사)으로 바이오틴화시키고 바이오틴-스트렙트아비딘 결합을 통해 U-PLEX 링커에 결합시켰다. 검출 항체를 MSD SULFO-TAGTM ECL 표지로 표지화하였다. 포획 항체 어레이를 준비하기 위해, 최대 10개의 항체-링커 접합체를 U-PLEX 정지 완충액 중에서 항체당 2.9 ㎍/㎖의 농도로 결합시키고, 이 혼합물 50㎕를 U-PLEX 플레이트의 각각의 웰이 첨가하였다. 플레이트를 진탕시키면서 1시간 동안 인큐베이션하여 항체 어레이를 조립시킨 다음 세척하였다. 플레이트를 즉시 사용하거나 필요할 때까지 4℃에서 건조 파우치에 보관하였다.

달리 나타내지 않는 한, 검정은 인간 항-마우스 항체(HAMA) 또는 다른 비-특이적 항체 결합 단백질 유래의 비-특이적 신호를 방지하는 차단 성분을 포함하는 MSD의 시판 희석제를 사용하여 하기 프로토콜에 따라서 실행하였다. 포획 항체 어레이를 상기 기재한 바와 같이 U-PLEX 플레이트에서 미리 형성하였다. MSD 희석제 22(25㎕)를 U-PLEX 플레이트의 각각의 웰에서 25㎕의 샘플과 합하고, 혼합물을 진탕시키면서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 샘플 중 LAM을 웰 중 포획 항체 어레이에 결합시켰다. 웰을 세척하여 미결합 샘플을 제거한 후, 25㎕의 2 ㎍/㎖ SULFO-TAG 표지 검출 항체(카세인이 보충된 MSD 희석제 3)를 첨가하고 진탕하면서 추가 1시간 동안 인큐베이션하여 면역검정 샌드위치를 완성하였다. 웰을 세척하여 미결합 검출 항체를 제거한 후, 웰을 150㎕의 2×MSD 판독 완충액 T로 채우고, MSD Sector® S 600 ECL 플레이트 판독기 상에서 ECL을 측정하였다. 플레이터 판독기는 MSD 플레이트에서 전극에 전압을 가하여 결합 검출 항체로부터 ECL을 유도하고, 냉각된 CCD 카메라를 사용하여 각각의 어레이 스팟으로부터 방출되는 빛을 정량화한다(Debad et al. 2004). 항체 쌍을 스크리닝하는 동안, 포획 항체 및 검출 항체 A194-01, 27D2, 13H3, MoAb1, MoAb2, MoAb3, Imm Poloy의 모든 가능한 조합을 Mtb 배양액 유래의 정제된 LAM 및 TB+/HIV+ 개체 유래의 소변을 이용하여 평가하였다(도 1b). 포획 항체(MoAb1, 13H3, 27D2, MoAb3) 및 A194-01 또는 27D2 검출 항체의 어레이를 결합한 특정 패널에서 보다 상세한 검정 평가를 수행하였다(도 3a).

LAM 정량화

LAM 농도를 계산하기 위해, 정제된 LAM(MSD 희석제 100 중에 희석됨)을 이용한 8점 검량선을 각각의 검정 플레이트에서 이중으로 실행하였다. ECL 신호 대 LAM 농도의 관계는 4-모수 로지스틱(4-PL) 함수에 적합하였다. ECL 신호를 4-PL 핏에 백피팅(back-fitting)함으로써 테스트 샘플에 대한 LAM 농도를 계산하였다. 예시적인 검량선은 도 2a에 도시되어 있다.

소변 샘플 준비

임의의 항-LAM 항체를 비활성화시키기 위해, 85℃에서 10분 동안 열처리함으로써 분석 전에 샘플을 전처리하였다.

샘플 수집 및 진단 테스트

본 후향적 사례-대조 연구를 위해, FIND(스위스 제네바 소재)의 바이오뱅크로부터 총 75개의 소변 샘플을 선택하였다. 이들 샘플은 이전에 TB의 임상 증상이 있지만, 샘플 수집 당시 TB 치료를 받지 않은 방글라데시(n = 5), 페루(n = 19), 남아프리카(n = 15) 및 베트남(n = 36)에서 1차 진료 현장에 있는 성인의 연구에서 수집되었다. 환자를 등록하기 전에 지역 윤리 위원회의 승인을 받고 환자 동의서를 받았으며, 개인 식별 정보는 FIND 또는 연구원이 사용할 수 없었다.

FIND는 샘플의 수집 및 처리를 위해 표준화된 프로토콜을 사용한다. 간략히 말하면, 환자와 처음 접촉했을 때 소변을 수집하고, 같은 날(전형적으로 4시간 이내) 이를 처리하고, 분취한 다음 냉동(-80℃)시켰다. HIV 혈청 테스트 및 CD4 계수를 위해 WHO 사전검증 IVD를 사용하였다. 환자 분류에 사용하기 위해, 모든 참가자에 대해 객담 샘플(전형적으로, 처음 24시간에 2개)을 또한 수집하고, 액체 배양물(MGIT, BD)(미국 프랭클린 레이크 소재) 및 고체 배양물(뢰벤슈타인-옌슨(Loewenstein-Jensen) 배지를 사용하여 최대 6회까지 오염을 제거하고 배양하였다. 지이-닐센(Ziehl-Neelson) 또는 아우라민-O(Auramine-O) 형광 현미경검사에 의해 배양액 중 Mtb 복합체의 존재를 확인하여, 신속한 종분화 검정(rapid speciation assay)(Capilia TB 테스트, TAUNS사, 일본 소재) 또는 분자 방법을 사용하여 항산균(acid-fast bacilli)인 MPT64 항원 검출을 식별하였다.

환자 분류 및 복합 참조 표준

다른 곳에 기재된 바와 같이 임상 및 실험실 결과를 기반으로 하여 복합 참조 표준을 사용하여 환자를 분류하였다(Broger et al. 2017). TB-양성(TB+)은 적어도 하나의 양성 배양이 있는 환자였다. 모든 TB+ 환자는 현미경검사 결과가 양성이었다. 모든 객담 샘플에서 4개 초과의 배양물에 대하여 도말 음성이고 배양 음성이며, 결핵 치료 없이 증상 해소 및 2개월 추적 방문에서 음성 객담 배양 결과를 보인 환자를 TB-로 분류하였다. 대상체를 HIV 신속 진단법을 기반으로 HIV+ 또는 HIV-로 추가로 분류하였다(도 3a, 하기 참조).

LAM에 대한 신속 진단법

제조업체의 지침에 따라서 Alere LF-LAM 테스트를 사용하여 소변 샘플을 테스트하였다. 독립적으로 제조업체가 제공한 참조 카드와 테스트 라인 강도를 비교하고 결과를 등급화한 3명의 다른 기술자가 스트립을 판독하였다. 문서화를 위해, 모든 스트립을 스캔하였다.

결과

항체 생성 및 선택

샌드위치 면역검정에 사용하기 위한 잠재적으로 유용한 항체 쌍을 식별하기 위해, 기존 항체 라이브러리를 포획 및 검출 항체의 모든 가능한 쌍별 조합으로 테스트하였다(A194-01, 27D2, 13H3, MoAb1, MoAb2, MoAb3, Imm Poloy, Viro Poly). 그 다음, 각각의 쌍을 테스트하여 블랭크 샘플에 대한 배경 신호, 배양된 Mtb 유래의 정제된 LAMdp 대한 특정 신호, 및 높은 수준의 LAM(Alere LF-LAM 테스트에 의한 양성 기준))을 함유하는 것으로 알려진 2명의 TB-양성 HIV-양성 인간 대상체 유래의 소변 중 소변 LAM에 대한 특정 신호를 평가하였다. 샘플을 보존하기 위해, 각각의 테스트 웰에는 포획 항체의 어레이가 있지만 단일 검출 항체를 사용하여 개발하였다. 이러한 다중화 접근법은 최대 10개 쌍의 포획 및 검출 항체가 단일 웰에서 동시에 평가받을 수 있게 한다.

도 1b는 각각의 항체 쌍으로 달성된 신호 대 블랭크(S/B)의 비율을 표시하는 열지도를 제공한다. 이 도면은 또한 글리칸 어레이를 사용하여 특징지어진(문헌[Choudhary et al. 2018)] 및 도 2b) 상이한 LAM 에피토프에 대한 항체의 특이성을 기반으로 하여(도 1c) 항체를 그룹화하고 색으로 구분한다. 다수의 항체 쌍은 정제된 LAM에 대해 높은 반응성을 나타내었지만, 소변 LAM을 검출하는 데는 상대적으로 약하였다. 특히, 소변에서 LAM을 검출하기 위한 검출 항체로서 단지 2개의 항체(A194-01 및 27D2)만 유용하였다. A194-01 항체는 2가지 항체 중 더 민감하여 환자 소변에서 2 내지 5배 더 높은 신호를 제공하였다. 이들 항체는 모두 LAM의 아라비난 도메인에서 선형 테트라-아라비노사이드(Ara4) 또는 분지형 헥사-아라비노사이드(Ara6) 구조를 표적으로 한다. Ara6에 대한 27D2의 특이성은 정의된 LAM 에피토프에 대한 특이성을 갖는 항체의 개발을 위한 면역원으로서 BSA에 결합된 합성 LAM 글리칸 단편의 유용성을 확인하였다. 놀랍게도, 하나의 항체(MoAb2)는 배양된 Mtb 유래의 정제된 LAM을 측정하기 위한 검출 항체로서 사용될 때 높은 신호를 제공하였지만, 소변 LAM을 측정할 때에는 그렇지 않았다. 글리칸 어레이 연구는 이러한 항체가 Mtb에 상대적으로 특이적인 LAM 에피토프인 다이- 또는 트라이-만노사이드 캡(Man2 또는 Man3)을 표적으로 한다는 것을 나타낸다(Mishra et al. 2011; Chan et al. 2015). 단일 가설에 국한되고자 하는 것은 아니지만, MTX가 없는 Manp(Man1, Man2, Man2) 캡은 소변에서 안정적이지 않은데, 이는 예를 들어 상기 캡이 (예를 들어, 효소 또는 또 다른 메커니즘에 의해) 분해될 수 있고 따라서 이러한 에피토프는 대부분의 소변 샘플에서 사용할 수 없기 때문이다.

포획 항체의 경우 배양액 및 소변 유래의 LAM에 대한 상대적 반응성의 차이도 또한 관찰되었다. 거의 모든 포획 항체는, 분지형 Ara4 및 Ara6 구조(A194-01, 27D2, 13H3), Man2 또는 Man3 캡(MoAb3 및 MoAb2) 및 Man2 또는 Man3을 표적으로 하는 항체를 포함하여, 검출 항체로서 A194-01과 결합될 때 배양된 Mtb 유래의 정제된 LAM에 대하여 높은 신호를 제공하였다. 검출 항체로서의 거동과 일치하여, MoAb2(주로 Man2 및 Man3 캡을 표적으로 함)가 포획 항체로 사용되었을 때, 이는 또한 소변 LAM에 대해 신호를 제공하지 않거나 매우 낮은 신호를 제공하였다. Manp-MTX를 표적으로 하는 MoAb1은 TB+/HIV- 개체 유래의 소변에서 가장 높은 신호를 제공하였다. 단일 가설에 국한되고자 하는 것은 아니지만, MTX 모티프는 분해로부터 Manp를 보호하여 환자 소변에서 이들 에피토프의 존재를 초래할 수 있다. 그 결과, MoAb1은 매력적이고, 매우 반응성이 높으며, 특이적인 포획 항체이다. 이들 결합 시약의 임상 잠재력을 효율적으로 비교하고 소변 내에 풍부한 LAM 구조에 대한 이해를 증가시키기 위해, 다양한 에피토프 특이성을 포괄하는 4가지 포획 항체(13H3, 27D2, MoAb1, MoAb3) 및 2개의 검출 항체(A194-01 및 27D2)의 다중 패널을 사용하여 8개의 쌍을 개발하고 평가하였다.

분석적 검정 성능

도 2a는 최고 성능의 항체 쌍(포획 항체로서 MoAb1이 검출 항체로서 A194-01과 결합됨)에 대해 8개 수준의 정제된 LAM으로 실행하여 생성된 검량선을 나타낸다. 곡선은 LAM 농도의 함수로서 검정 신호를 플롯팅한다. 블랭크(LAM 없음) 샘플에 대한 플레이트 내 변이 계수(CV)는 검출 항체로서 A194-01을 이용하는 4가지 포획 항체 모두에 대하여 15% 이하였다(표 1A).

[표 1A]

표 1A. 상기 표는 A194-01 검출 항체와 결합했을 때 4가지 상이한 항-LAM 포획 항체의 분석 성능을 요약한다. 결과는 도 2A에 기재된 바와 같이 8점 검량선으로부터 결정되었다. 처음 2개의 데이터 열은 블랭크 샘플(n = 14)에 대하여 평균 신호 및 CV를 나타낸다. 세 번째는 검량 표준에 대하여 평균 CV를 나타내어 블랭크 신호보다 1.375배 더 높은 검출 임계값을 초과하는 신호를 제공한다(LAM 농도당 4개의 복제물을 기반으로 함). 마지막 열은 검량선에 가장 잘 맞는 4-PL에 대한 백피팅에 의해 계산된 검출 임계값과 동일한 신호를 제공할 것으로 예상되는 LAM 농도를 기반으로 한 LOD에 대한 추정치를 나타낸다.

이러한 결과를 기반으로 하여, 블랭크보다 37.5% 높은 신호(S/B = 1.375)를 모든 검정에 대해 블랭크 신호보다 적어도 2.5 표준 편차 높은 신호 임계값으로 정의하였다. 블랭크 신호에 대한 CV는 시스템의 전자 노이즈(± 30 카운트)에 의해 지배되었는데; 신호가 블랭크 신호를 초과하여 증가함에 따라, CV는 상당히 감소하였다. 평균적으로, 이러한 임계값을 초과하는 LAM 수준에 대한 CV는 12쌍 모두에 대해 3 내지 4%였다. 표 1A 및 도 2a는 또한 신호 임계값을 기반으로 한 검출 한계(LOD)를 제공한다. MoAb1 포획 항체가 제공하는 더 높은 신호 대 배경 비율로 인해, 이 포획 항체는 정제된 LAM 교정기의 더 민감한 검출 및 11 pg/㎖의 LOD를 제공하였다. 검출 항체로서 사용될 때, 27D2는 A194-10를 사용하여 수득한 결과와 높은 상관관계가 있는 결과를 제공하였지만(데이터는 나타내지 않음), 더 낮은 신호 및 더 높은 검출 한계를 제공하는 경향이 있었다. 2가지 항체의 높은 상관관계 및 유사한 에피토프 특이성으로 인해, 분석은 보다 민감한 A194-01 검출 항체를 이용하여 수득한 결과에 초점을 맞춘다. 그러나 27D2는 검출기 측에서 A194-01의 대체품으로서 사용될 수 있다.

샘플 준비

분석에서 테스트하기 전에, 소변 샘플을 85℃에서 10분 동안 열처리하여 샘플에 존재할 수 있는 임의의 항-LAM 항체를 불활성화시켰다. 신호가 일반적으로 열처리에 의해 변경되지 않거나 단지 약간만 증가하였기 때문에, 간섭 항체가 이들 샘플에 존재한다는 증거는 거의 발견되지 않았다(도 4). 그러나, 열처리가 LAM 검출에 대하여 어떠한 부정적인 영향을 미치는 것으로 보이지 않았으므로, 후속 작업에서 열처리 단계를 유지하는 것으로 결정했다.

검정 성능에 대한 매트릭스 효과를 평가하기 위해, 다음과 같은 실험을 수행하였다: (i) 합성 교정기 희석제에서 제조된 LAM 교정 표준을 사용하여 생성된 검량선과 비교할 때, 임상 소변 샘플에 섞인 LAM이 예상되는 측정된 LAM 수준을 제공하였음을 나타내는 스파이크 회복 실험(도 2a에서와 같음) 및 (ii) 소변 샘플 중 측정된 수준이 소변의 교정기 희석제로의 희석에 다라 선형적으로 감소하였음을 나타내는 희석 선형 실험. 스파이크 및 희석 실험에 대한 평균 회수율은 27D2를 제외한 모든 포획 항체에 대하여 80% 내지 120%의 허용 범위 내에 있었다(표 1b). 27D2는 지속적으로 낮은 스파이크 회수율을 가졌는데, 이는 샘플을 가열함으로써 정정 가능하지 않은 어느 정도의 매트릭스 간섭을 받을 수 있음을 나타낸다.

[표 1B]

표 1B는 A194-01 검출 항체와 쌍을 형성할 때 4가지 포획 항체 각각에 대한 스파이크 회수 및 희석 선형성을 나타낸다. 스파이크 회수는, 이론적 예상 값에 대하여, 소변 샘플에 섞은 정제된 LAM에 대해 측정된 LAM 농도이다. 각각의 항목은 샘플에 섞은 LAM의 3가지 농도(300, 3,000 및 30,000 pg/㎖)에 대한 평균 회수율이다. 희석에 대한 회수율은 희석되지 않은 샘플 중 측정된 소변 LAM을 기반으로 한 예상 값에 대하여 희석된 LAM-양성 소변 샘플에 대한 측정된 LAM 농도이다(희석되지 않은 샘플 중 LAM 수준은 대략 1,000 내지 대략 200,000 pg/㎖의 범위임). 각각의 값은 1:2 내지 1:16 범위의 4가지 희석에 대한 평균 회수율이다. 표는 또한 테스트된 모든 샘플에 걸친 평균값을 나타낸다.

교차 반응성

소변 샘플에 잠재적으로 존재할 수 있는 10가지의 상이한 마이코박테리아 종 및 20가지의 비-마이코박테리아 미생물 패널에 대하여 교차-반응성에 대해 LAM 검정을 테스트하였다. 표 2A는 A194-01 검출 항체와 쌍을 형성할 때 각각의 포획 항체로 측정된 신호 대 블랭크 비율을 제공한다.

[표 2A]

표 2A는 미생물 세트에 대한 LAM 검정의 교차-반응성을 나타낸다. 결과는 A194-01 검출 항체와 쌍을 형성할 때 표시된 4가지 포획 항체에 대하여 제공되어 있다. ATCC 또는 BEI로부터 입수한 스톡 제제의 1:10,000 희석(마이코박테리아 샘플) 또는 1:100 희석(비-마이코박테리아 샘플)에서 열거된 신호 대 블랭크(S/B) 비율을 측정하였다. 데이터는 열거된 희석에서 적어도 하나의 포획 항체에 대하여 검정 임계값(1.375)보다 큰 S/B 비율을 제공한 유기체에 대해서만 나타나 있다. 이러한 임계값을 기준으로 모든 검정에 대하여 검출 가능하지 않은 교차-반응성을 가진 미생물은 표의 하단에 열거되어 있다. 테스트한 모든 제제는 Mtb 및 소결핵균(사멸된 전체 세포 용해물) 및 마이코박테리움 스메그마티스(세포 용해물로부터 정제된 PILAM)을 제외하고 살아있는 전체 세포였다. ND(검출 불가)는 (i) 측정된 S/B 비율이 1.375 미만이거나 (ii) 특정 포획 항체 지점 상의 신호가 다른 지점 상의 신호에 비하여 너무 낮아서 정확하게 교차-반응성을 측정할 수 없음을 표시한다(<0.2%). 느리게 성장하는 마이코박테리아는 별표*로 표시되어 있다.

테스트한 가능 높은 농도(스톡 ATCC 또는 BEI 물질의 1:100 희석)에서, 비-마이코박테리아 종 중 단지 4가지만(노카르디아 아스테로이드, 고르도니아 브론키알리스(츠카무라(Tsukamura)), 로도코쿠스 종, 츠카무렐라 파우로메타볼럼) 적어도 하나의 포획 항체에 대하여 1.375의 검정 임계값을 초과하는 S/B 값을 제공하였다. 이들 4가지 종에 대한 교차 반응성의 강도는 상이한 포획 항체에 걸쳐 상당히 다양하였다. 27D2 및 MoAb3은 4가시 모든 종에 대하여 가장 강한 교차-반응성을 나타내었다. 13H3은 또한 4가지 종과 교차-반응하였지만, 신호가 10 내지 100배 더 낮았다. MoAb1은 최상의 차별성을 제공하였고, 테스트된 농도에서 비-마이코박테리아 종 중 어느 것에 대하여 측정가능한 교차-반응성을 나타내지 않았다.

예상된 바와 같이, 모든 포획 항체는 TB-유발 마이코박테리아 종인 Mtb 및 소결핵균에 대하여 강한 신호를 제공하였으며; 이들 박테리아 제제의 1:1,000 희석물의 테스트는 검정에 대해 포화 수준을 초과하는 신호를 제공하였다. 그러나, 이러한 희석에서 테스트된 다른 마이코박테리아 종에 대한 상이한 포획 항체의 교차-반응성에서 큰 차이를 관찰하였다. MoAb1를 제외한 모든 포획 항체는 빠르게 성장하는 마이코박테리움 포르투이툼 및 마이코박테리움 스메그마티스 종에 대하여 매우 높은 교차-반응성을 제공하였고 1:1000 희석에서 포화 신호를 제공하였다. 대조적으로, MoAb1이 포획 항체로서 사용될 때, 이들 2가지 종에 대한 교차-반응성은 다른 포획 항체보다 적어도 1000배 더 낮았고; 검출 한계 미만이었다. 마이코박테리움 인트라셀룰라레를 제외하고, 다른 마이코박테리아 종에 대한 신호는 더 낮은 경향이 있고 포획 항체들 간의 차이는 더 작은 경향이 있었지만, MoAb1은 또한 다른 마이코박테리아 종에 대해 교차-반응성이 더 낮은 경향이 있었다. 전체적으로, 포획 MoAb1/검출 A194-01 조합은 모든 비-마이코박테리아 미생물에 대한 교차-반응성 없이 우수한 특이성을 나타내었으며, 이제 빠르제 성장하는 마이코박테리아에 대한 교차-반응성 및 느리게 성장하는 비결핵성 마이코박테리아에 대한 단지 낮은 수준의 교차 반응성(Mtb와 비교하여 적어도 10배 더 낮은 반응성)을 나타내었다.

임상 샘플 테스트

표 3A는 연구 모집단의 특징을 제공한다.

[표 3A]

표 3A는 TB 및 HIV 상태로 분류된 연구 모집단의 특징을 나타낸다. NA는 명시된 특징에 대한 정보가 연구 대상체에 대하여 이용 가능하지 않음을 표시한다. CD4 세포 수는 TB/HIV+ 대상체에 대해서만 이용 가능하였다.

샘플은 TB 임상 샘플의 FIND(스위스 제네바 소재) 저장소의 것이며, 다양한 지리적 위치(아시아, 아프리카 및 남아메리카)를 포함하고, TB 및 HIV 상태의 상이한 조합을 포괄하도록 선택하였다. CD4 수는 TB+/HIV+ 대상체의 대부분에 대하여 이용 가능하였으며 Alere LF-LAM 테스트에서 가장 혜택을 받을 가능성이 높은 면역력이 약화된 환자를 식별하기 위한 WHO 알고리즘에서 사용되는 100개 세포/㎕ 임계값 초과 및 미만인 대상체를 포함하였다. Alere 테스트의 임상 성능에 대한 임상 연구와 일치하여, 이러한 소변 샘플의 패널에 대하여 Alere 테스트의 민감도는 HIV+ 대상체에 대하여 44%(11/25)이었지만, HIV- 대상체에 대하여는 단지 13%(2/15)이었다.

도 3a는 TB 및 HIV 상태에 따라 전체 샘플 세트에 대하여 측정된 LAM 농도를 나타내는 열지도이다. 열지도는 A194-01이 검출 항체로서 사용될 때 4가지 포획 항체를 이용하여 측정한 농도를 비교한다. 모든 포획 항체는 HIV+/TB+ 대상체 유래의 소변 샘플의 대부분에서 LAM의 측정가능한 농도를 나타내었지만, MoAb1 및 13H3만이 상당한 비율의 HIV-/TB+ 대상체 유래의 소변에서 LAM을 검출하였다. 13H3은 다수의 TB- 대상체 유래의 소변에서 LAM 또는 LAM 관련 구조를 검출하였기 때문에, 이들 2가지 중에서, 단지 MoAb1만 TB+ 및 TB- 대상체의 양호한 구별을 제공하였다. MoAb1 및 다른 3가지 포획 항체(13H3, 27D2, MoAb3)에 대한 성능의 차이는 도 3b 및 3c의 산점도에서 더 명확하게 도시되어 있다. 정성적으로, TB+ 공여자 유래의 샘플에 대한 13H3 및 MoAb1로부터의 신호는 검정 임계값으로부터 잘 분리되었다. 그러나, TB- 샘플을 이용한 이들 2가지 항체의 거동은 상당히 상이하였다. 13H3은 TB- 샘플에 대하여 신호의 광범위한 분포를 제공하였다. 대조적으로, 더욱 TB-특이적인 MoAb1 포획 항체를 사용한 TB- 샘플에 대한 신호는 S/B 값이 약 1.8인 TB-샘플 및 LOD가 11 pg/㎖ 미만인 신호를 제공하는 다른 모든 샘플에 대하여 가장 높은 신호를 갖는 블랭크 신호 근처에 빽빽하게 채워져 있었다. Alere LF-LAM 테스트에 의한 색상 코딩은 Alere 테스트를 이용하여 검출 가능한 LAM 신호가 MoAb1 포획 항체를 사용한 면역검정에 대한 검출 한계보다 10 내지 100배 더 높고, Alere 테스트가 아닌 면역검정을 이용하여 검출 가능한 TB+ 대상체 유래의 많은 샘플이 있어 포획 MoAb1/검출기 A194-01-기반 면역검정의 감도를 크게 증가시켰음을 나타낸다.

표 4는 테스트 샘플 세트에 대한 LAM 검정의 측정된 감도 및 특이성을 제공한다. TB- 및 TB+ 기에 대한 검정 신호 간의 분리를 나타내는 지표로서, 표 4는 또한 수신자 판단 곡선(receiver operating curve: ROC) 곡선 분석으로부터의 곡선하 면적(AUC) 값을 제공한다.

표 4는 동일한 샘플 테스트에서 Alere LF-LAM과 비교하여 4가지 포획 항체(Ab) 및 검출 항체로서 A194-01의 선택된 패널을 사용한 LAM 검정의 정확도를 나타낸다. 표는 4가지 포획 항체 각각에 대해 측정된 민감도(올바르게 분류된 TB+ 샘플/TB+ 샘플의 총수) 및 특이성(올바르게 분류된 TB- 샘플/TB- 샘플의 총수)를 제공한다. 이 값은 HIV- 및 HIV+ 대상체 유래의 샘플의 전체 샘플 세트(전부) 또는 하위세트에 대해 계산되었다. 비율에 대한 95% 신뢰 구간(CI)은 윌슨 방법(Wilson's method)을 사용하여 계산되었다. 표는 또한 부트스트래핑(bootstrapping)에 의해 결정된 바와 같은 신뢰 한계를 포함한 ROC 분석으로부터의 AUC 값을 제공한다. 비교를 위해, 아래 3개 행은 동일한 샘플 세트에 대한 Alere LF-LAM 테스트에 대한 유사한 성능 메트릭스를 제시한다.

TB+ 샘플(HIV- 대상체 유래의 샘플을 포함함)에 대한 높은 신호와 TB- 샘플에 대한 LOD 미만인 신호의 빽빽한 분포의 조합으로 인해, MoAb1 포획 항체를 사용한 검정에 대한 AUC 값[0.98(0.95 - 1.00)]은 다른 포획 항체에 대한 AUC보다 현저하게 더 좋았다. HIV- 샘플만을 검사했을 때, MoAb1[0.95(0.87 - 1.00)] 및 13H3[0.60(0.40-0.80)] 간의 차이는 훨씬 더 컸다.

AUC 차이는, 13H3[전체 민감도 = 70%(55% 내지 82%, 28/40), 특이성 = 86%(71% 내지 94%); 210 pg/㎖의 컷오프에서 30/35]에 대하여, MoAb1을 사용한 검정의 더 높은 관찰 정확도에 반영되었다[11 pg/㎖의 컷오프에서, 전체 민감도 = 93%(80% 내지 97%; 37/40), 특이성 = 97%(85% 내지 100%; 34/35)]. MoAb1 포획 상체를 사용한 검정은, 높은 특이성을 유지하면서, Alere LF-LAM 검정보다 약 3배 더 민감하였다[전체 민감도 = 33%(20 내지 48%; 13/40), 특이성 100%(90 내지 100%; 35/35)]. MoAb1 포획 항체를 사용한 검정은 TB+/HIV+ 샘플을 식별하는 데 완벽하였다[MoAb1 민감도 = 100%(87% 내지 100%; 25/25)].

도 5는 CD4 수 및 Alere LF-LAM 테스트 결과와 함께 (MoAb1 포획 항체 및 A194-01 검출 항체를 사용한 검정에 대한) 검정 신호의 연관성을 나타낸다. 강력하게 면역억제된 HIV+ 대상체(CD4가 100개 세포/㎕ 이하)는 HIV- 대상체보다 LAM의 수준이 현저하게 더 높았다(도 5B). CD4 수가 100개 세포/㎕ 초과인 HIV+ 대상체와 HIV- 대상체 간에 유의한 차이가 없었으므로, 증가된 LAM 수준은 면역억제와 상관관계가 있는 것으로 보였다. 도 3b로부터 정성적 그림을 확인하면, 도 5A는 높은 Alere LF-LAM 등급이 매우 높은 검정 신호와 연관되어 있음을 나타낸다. 이 수치는 또한 Alere 테스트로는 검출되지 않지만, 면역검정에 의해 낮지만 검출 가능한 신호를 가진 상당한 수의 TB+ 대상체를 강조한다.

MoAb1 포획 항체의 특이성에 대한 추가적인 지원

MoAb1/A194-01 항체 쌍의 관찰된 민감도 및 특이성은 우수하였지만, TB+/HIV- 대상체에 대하여 관찰된 신호는 낮거나 검정 임계값 근처에 있는 경향이 있었다: TB+/HIV- 대상체 유래의 소변은 단지 2.1의 S/B 중앙값을 제공하였다. 추가적인 실험은 이들 신호가 특정 결합 이벤트의 결과를 반영하고 비특이적 검정 배경에서 변화의 결과가 아니라는 더 큰 신뢰를 생성하는 것이었다.

첫 번째 실험 세트에서, 소변 샘플 중 LAM을 농축하면 검정 신호에서 상응하는 증가가 발생한다는 것을 확인하였다. 표 2B는 10 kD 분자량 컷오프가 있는 원심 한외여과 장치(아미콘(Amicon))를 사용하여 LAM의 수준이 낮은 7개의 소변 샘플을 원래 부피의 1/5로 농축시키는 것의 효과를 나타낸다.

[표 2B]

표 2B는 검출 가능한 LAM이 없거나(TB-HIV-대상체 유래) 검출 가능한 LAM의 수준이 낮은(TB+HIV- 및 TB+HIV+ 대상체 유래) 소변 샘플을 MoAb1 - A194-01 항체 쌍을 사용하여 LAM에 대하여 검정한 후의 결과를 나타낸다. 농축 없이(1× 샘플) 또는 10 kD 컷오프가 있는 원심 한외여과 장치를 사용하여 5배 농축(5× 농축물) 후 샘플을 측정하였다. 샘플 전처리 단계(85℃, 10분)를 농축 전에 수행하였다. "ND"는 검정 신호가 검정에 대한 검출 임계값 미만임을 표시한다. 비율 열은 1× 샘플에 대하여 5× 농축물에서 LAM의 측정된 농도의 비율을 제공한다.

샘플의 농도는 측정된 LAM 농도를 3.2배 내지 4.9배 증가시켰으며, 이는 예상되는 이론적 5배 증가에 근접한다. 대조적으로, 검출 불가능한 LAM 수준을 가진 TB- 공여자 유래의 샘플이 동일한 농축 공정을 거쳤을 때, 그 수준은 검출 불가능한 상태로 남아 있었기 때문에, 음성 소변의 단순한 농도는 이러한 효과를 생성하기에 충분하지 않았다. 유사한 실험을 100 kD 컷오프를 갖는 장치를 사용하여 LAM-양성 샘플의 하위세트에 대하여 수행하고, LAM의 대략 90%가 여과액으로 통과하는 것을 결정하였다(데이터는 나타내지 않음). 이러한 결과는 측정된 종의 분자량이 10 내지 100 kD이고 Mtb 유래의 LAM의 분자량을 특성화한 이전 연구와 일치함을 시사한다(Venisse et al. 1993).

추가적으로, 고정된 MoAb1이 소변 샘플 유래의 LAM을 고갈시키는데 사용될 수 있음을 확인하였다. 항체의 높은 표면적을 제공하기 위해 바이오틴-표지 MoAb1로 코팅된 MSD 대형 스팟 스트렙트아비딘 플레이트에서 고갈 실험을 수행하였다. 나머지 LAM 수준을 측정하기 위해 샘플을 LAM 검정 플레이트로 옮기기 전에 이들 웰에서 열처리된 샘플을 인큐베이션하였다(진탕하면서 상온에서 1시간). 표 3B에 나타낸 바와 같이, 광범위한 LAM 수준을 갖는 TB+ 대상체 유래의 10개 소변 샘플에 이러한 고갈 프로토콜을 적용으로 고갈을 겪지 않은 샘플에 비해 LAM 수준에서 56%(IQR: 47% 내지 61%)의 중앙값 감소를 초래하였다.

[표 3B]

표 3B는 바이오틴-표지 MoAb1로 코팅된 MSD 대형 스팟 스트렙트아비딘 플레이트의 웰에서 다양한 LAM 수준을 갖는 열처리된 소변 샘플(TB+/HIV- 및 TB+/HIV+ 대상체 둘 다로부터 유래)을 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하여 샘플로부터 LAM을 고갈시키고자 한 결과를 나타낸다. 대조군으로서, 항체로 코팅되지 않은 웰에서 샘플을 또한 배양하였다("모의" 조건). 그 다음, 검출 항체로서 A194-10을 이용한 다중 LAM 검정을 사용하여, 고갈된 샘플뿐만 아니라, 원래 비고갈 샘플에서 LAM 수준을 측정하였다. 기록된 LAM 농도는 비고갈 샘플에 대한 것이다. 표는 또한 MoAb1을 사용하거나 모의 조건을 사용하여 고갈된 샘플에 대하여 측정된 LAM 농도(% 고갈)에서의 감소율을 기록한다.

항체의 부재 하에서 고갈 프로토콜을 수행한 모의 조건은 단지 2%(IQR: 1% 내지 3%)의 LAM 수준의 중앙값 감소를 제공하였으므로, 고갈 단계에서 MoAb1의 존재가 요구되었다.

논의

이 사례-대조 연구는 LOD가 펨토몰(fM) 범위인 매우 민감한 ECL 면역검정을 사용하여 HIV-/TB+ 및 HIV+/TB+ 환자의 소변에서 LAM이 검출 가능한지의 여부를 결정하고자 하였다. 이 연구는 항체 특이성이 임상 성능에 영향을 미치는 방법을 특성화하기 위해, 상이한 특이성의 여러 항체를 동시에 평가할 수 있는 다중 형식을 이용하였다.

단클론성 항체(포획 MoAb1/검출기 A194-01)의 최고 성능의 쌍을 사용한 ECL 검정 결과는 4개 국가에서 추정 TB가 있는 잘 특성화된 환자로부터 수집한 75개 소변 샘플의 작은 세트에서 Alere LF-LAM에 비하여 결핵 사례 검출에 대해 거의 3배 더 높은 민감도 및 통계적으로 구별할 수 없는 특이성을 나타내었다. 모든 HIV+ 및 HIV- 환자의 상당 부분이 검정 검출 한계인 11 pg/㎖(0.6 pM) 초과의 농도에서 검출 가능한 LAM을 가졌다. 검정의 검출 한계는 250 내지 500 pg/㎖의 범위에 있는 Alere LF-LAM 테스트의 컷오프보다 25 내지 50배 더 낮았고(Nakiyingi et al. 2014; Savolainen et al. 2013), LAM 농도가 더 낮은 TB 환자는 검출하지 못하였다. 결과는 LAM의 검출에 대한 분석 민감도의 개선이 TB 진단을 위한 이상 민감도의 개선으로 이어진다는 것을 시사한다.

면역검정에 대한 거의 완벽한 특이성에서 진단 민감도의 증가에 대한 주요 동인은 TB 환자의 소변에 존재하는 별개의 LAM 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 잘 정의된 단클론성 항체의 고유한 쌍을 식별하는 것이었다. 상이한 공급원 유래의 항-LAM 항체의 세트의 가능한 쌍별 조합 각각의 스크리닝에서, 다수의 쌍은 Mtb 배양 유래의 정제된 LAM을 검출할 수있지만, 환자 소변에서 LAM 또는 LAM-관련 구조를 검출하는 데는 단지 작은 하위세트만 양호한 민감도를 나타내었다. 검출 항체의 선택은 소변에서 LAM의 민감한 검출에 특히 중요한 것으로 보였으며, 2가지 항체(A194-01, 및 더 적은 정도의 27D2)는 다른 후보보다 검출 항체로서 실질적으로 더 양호한 성능을 제공하였음을 확인하였다. 이들 항체의 에피토프 맵핑은 이들 항체 모두 선형 Ara4 및 분지형 Ara6(헥사-Araf) 모티프를 모두 포함하여 LAM의 아라비난 도메인을 표적으로 한다는 것을 나타내었으며, 이는 이들 구조가 TB 환자의 소변에 상대적으로 풍부하다는 것을 나타낸다. A194-01의 항체 조작 연구는 단량체 Fab 구조로의 전환은 결합 활성의 큰 손실을 초래하며(Pinter 2017), 이는 LAM 분자 내의 2개의 아라비난 모티프에 대한 전체 IgG의 다가 결합이 결합에 중요할 수 있음을 시사한다. 다가 결합을 통해 결합력을 증가시키는 능력은 결국 검출 항체로서 이러한 항체의 고유한 유용성에 있어서 역할을 할 수 있다.

대부분의 후보 항체는 소변에서 LAM을 검출하기 위한 포획 항체로서 합리적으로 잘 작동하므로, 최적의 포획 항체의 선택은 주로 항체 특이성에 의해 이루어진다. A194-01과 쌍을 형성할 때 선형 Ara4 및 분지형 Ara6 모티프 A194-01, Imm 27D2)를 둘 다 표적으로 하는 항체는 모두 적어도 일부 소변 샘플에서 LAM을 검출할 수 있다. 아라비난-특이적 포획 항체의 이러한 세트 중에서, 13H3은 TB+ 대상체 유래의 소변에 대하여 가장 높은 신호를 갖는 경향이 있었지만, 일부 TB- 샘플에서 비교적 낮은 특이성(86%)을 나타내어 블랭크 신호보다 높은 신호를 제공하였다. 13H3/A194-01 쌍을 사용하는 LAM 검정을 개발할 수 있었지만, 결과는 비-TB 특이적 아라비난 에피토프를 표적으로 하는 항체만을 사용하는 소변 LAM 검정의 성능이 궁극적으로 비-TB 마이코박테리아(NTB) 또는 방선균목(actinomycetales order)의 관련 유기체와 같은 다른 공급원 유래의 소변 LAM과의 교차 반응성에 의해 제한될 수 있음을 시사한다. 특히, Ara6 구조는 Mtb LAM에 고유하지 않으며 교차-반응성 연구는 13H3/A194-01 쌍이 비-마이코박테리아 방선균인 노카르디아(Nocardia), 고로니아(Goronia), 로도코쿠스 및 츠카무렐라와 교차-반응한다는 것을 확인하였으며, 상기 방선균은 모두 Ara6 구조를 가진 LAM을 생성하는 것으로 알려져 있다(Mishra et al. 2011; Briken et al. 2004). Alere LF-LAM 테스트 및 이전 시판 ELISA 테스트에서 사용된 다클론성 항체는 유사한 한계를 가질 가능성이 높다. 분석 전에 소변을 농축시킴으로써 오래된 시판 ELISA 테스트인 Clearview TB 테스트를 개선시키려는 시도로 민감도를 현저하게 개선시킬 수 있음을 발견하였지만, 이에 상응하는 특이성 감소도 또한 발견하였다(Savolainen 2013). 유사하게, Alere LF-LAM 테스트에서 우양성 결과를 감소시켜야 할 필요성으로 인해 제조업체는 2014년에 더 높은 검정 컷오프로 테스트의 참조 카드를 수정하였는데, 이는 특이성은 증가시켰지만 민감도는 감소하였다. 또한, 구강내 방선균 및 노카르디아에 대한 Alere LF-LAM 테스트의 교차-반응성은 검정이 객담에서 LAM 검출에 충분히 특이적이지 않은 이유일 가능성이 높다(Dheda et al. 2010). 또한 Alere LF-LAM 테스트는 플레이트 세척기의 배관에 있는 바이오필름과 같은 LAM의 환경 공급원으로부터의 교차-반응성에 민감하여, 항체 특이성의 중요성뿐만 아니라 비-TB 특이적 항체를 사용할 때 환경 간섭 물질의 잠재적인 공급원에 대하여 보호해야 할 필요성 모두를 강조한다.

상대적으로 비특이적인 LAM 에피토프를 표적으로 하는 13H3과 같은 항체에 추가적으로, 보다 TB-특이적인 구조, 예컨대 Man2 및 Man3 모티프(MoAb2), 및 MTX-Man2 및 MTX-Man3 모티프(MoAb1)를 표적으로 하는 포획 항체를 평가하였다. 둘 다 Mtb 배양물 유래의 정제된 LAM에 대하여 강한 신호를 제공하였지만, 오직 MoAb1만이 TB 환자 유래의 소변 샘플에서 LAM을 검출하였으며, 이는 소변 LAM의 임의의 Man2 또는 Man3 캡 모티프의 많은 부분이 MTX 변형을 제시하여야 함을 나타낸다. 놀랍게도, 테스트는 MoAb1과 A194-01 검출 항체의 쌍 형성이 13H3/A194-01 쌍과 같은 TB+ 그룹에서 유사한 반응성을 제공하였지만, MoAb1 포획 항체는 높은 임상 특이성을 달성할 수 있음을 나타내었다. 상이한 항체 쌍의 관찰된 임상 민감도 및 특이성의 그래프 비교로 나타낸 바와 같이(도 6), MoAb1/A194-01 쌍은 최고의 전체 임상 민감도(93%) 및 특이성(97%)를 제공하였다. 높은 전체 민감도는 TB+HIV- 대상체 유래의 소변에서 LAM을 검출하기 위한 이러한 쌍의 우수한 민감도를 크게 반영하였다(80%). 도 6은 또한 이러한 쌍의 관찰된 성능을 POC TB 테스트에 대한 WHO 정확도 목표와 비교하고, 검정이 후속 TB 테스트를 위해 환자를 식별하기 위한 분류에 사용하기 위해 POC TB 테스트에 대한 목표 사양뿐만 아니라, 진단에 사용하기 위한 보다 엄격한 요구조건을 충족할 수 있다는 격려를 제공한다.

단일 가설에 국한되고자 하는 것은 아니지만, MoAb1 포획 항체의 에피토프 특이성은 MoAb1/A194-01 쌍의 교차-반응성 테스트 결과에 의해 뒷받침되는 바와 같이, 임상 특이성을 유지하면서 민감한 검출을 제공하는 능력의 원인일 수 있다. 요로 감염의 원인이 되는 가장 일반적인 유기체에 대해서는 교차-반응성이 관찰되지 않았고, 13H3을 이용한 검정과 대조적으로, LAM-생성 비-바이코박테리아 방선균인 노카르디아, 고로니아, 로도코쿠스 및 츠카무렐라에 대하여 검출 가능한 교차-반응성이 관찰되지 않았다. MoAb1 포획은 또한 대부분의 다른 마이코박테리아 종들로부터 TB-생성 마이코박테리아(Mtb 및 소결핵균)의 보다 양호한 구별을 제공하였다. 특히, 빠르게 성장하는 마이코박테리아인 마이코박테리움 포르투이툼, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 압세수스, 또는 마이코박테리움 켈로네를 이용한 검출 가능한 교차-반응성은 관찰되지 않았으며, 이들 마이코박테리아는 MTX 변형이 거의 없이 LAM을 생성한다(Joe et al. 2006). 대조적으로, 13H3 포획은 마이코박테리움 포르투이툼 및 마이코박테리움 스메그마티스의 테스트된 농도에 대해 포화 또는 거의 포화인 검정 신호를 제공하였다. 느리게 성장하는 NTM의 마이코박테리움 고르도네, 마이코박테리움 인트라셀룰라레, 마이코박테리움 아비움 및 마이코박테리움 칸사시를 이용하여 MoAb1에 대해 낮은 수준의 교차-반응성이 관찰되었지만, TB-유발 군주에 대하여 관찰된 것보다 이들 종에 대해 관찰된 신호가 상당히 더 낮았다. 또한 이 쌍은 Alere LF-LAM 테스트에 대한 신호를 생성하는 플레이트 세척기로부터의 알려지지 않은 환경 LAM-유사 오염물질에 취약하지 않은 것으로 확인되었다. MoAb1 항체의 TB-특이성은 또한 Alere LF-LAM 테스트와 대조적으로 널리 퍼져 있는 구강 방선균 종에 의해 생성된 LAM과 교차-반응하지 않는 객담에서 LAM 검출을 위해 오츠카가 개발한 ELISA에서도 이용된다(Kawasaki et al. 2018).

LAM은 MoAb1/A194-01 항체 쌍을 사용하여 HIV-양성 및 HIV-음성 환자 거의 전부에서 검출 가능하지만, 연구는 CD4 수가 낮은 HIV-양성 환자에서 LAM 농도가 증가했다는 조기 발견을 확인하였다. CD4 수가 100개 세포/㎕ 이하로 낮은 TB/HIV 동시 감염 환자 유래의 샘플은 LAM 농도가 상당히 더 높았으며, 이 때 선택된 샘플은 10 ng/㎖ LAM을 가졌다. CD4 수가 100개 세포/㎕ 초과로 높은 TB/HIV 동시 감염 환자 및 TB/HIV-음성 면역적격 대상체 유래의 샘플에서의 농도는 11 내지 1000 pg/㎖ 범위에 있고 더 낮았다(도 5 및 도 3b). 이러한 효과는 Alere LF-LAM을 이용한 대규모 코호트 연구로부터 잘 알려져 있다(Shah et al. 2016). 신장 TB 감염은 CD4 수가 낮은 TB/HIV 동시 감염 환자에서 높은 LAM 농도에 대한 설명으로 제안되었다(Cox et al. 2015; Wood et al. 2012). 이 연구의 면역 적격 및 HIV-음성 환자에서 LAM 항원함유뇨(antigenuria)로 이어지는 근본적인 메커니즘은 명확하지 않다. LAM이 감염된 폐포 대식세포에서 활발하게 분비된다는 일부 증거가 있다(Strohmeier & Fenton 1999). 이와 같은 활성 과정은 생체내에서 TB의 생존에 유리한 LAM의 중요한 면역조절 특성과 일치할 것이다(Lawn 2012). 이 과정은 또한 혈류에서 무-세포 LAM 또는 LAM 단편을 생성할 것이며, 상기 단편은 사구체 여과를 통해 잠재적으로 소변으로 들어갈 수 있다. 혈청 중 LAM 수준과 소변 수준과의 상관 관계에 대한 연구가 현재 진행 중이다.

결과 요약

검정의 성능 개선은 모든 HIV 양성뿐만 아니라, 가능하게는 HIV 음성 및 면역 적격 환자에서도 TB 진단 및 스크리닝을 위한 향상된 LAM-검출 검정의 개발이 상당히 실현 가능함을 나타낸다. 그러나, 낮은 피코몰 또는 심지어 펨토몰 범위의 LOD와 매우 특이적인 항체를 이용한 검정이 요구된다. 개발된 검정이 매우 민감하고 실험실 환경에서 유용한 도구를 제공할 수 있지만, 실험실 시설 및 훈련된 직원이 이용 가능하지 않을 수 있는 저소득 및 중소득 환경의 전형적인 1차 진료 환경에서 사용하기 위한 현장 진단 테스트로서 설계되지 않는다. 가장 민감한 측면 유동 검정 중 일부는 낮은 pM 범위의 민감도에 이르렀으며; 예를 들어 최근 개발된 말라리아 항원 검출 검정은 필요한 분석 민감도에 근접한 2.5 pM HRP-2(=80 pg/㎖)의 LOD를 보고하였다(Das et al. 2017). 다른 이들은 항원 농축 단계를 제안했지만 검정 복잡성과 비용이 난제일 수 있었다. FIND 및 파트너는 이 연구의 결과를 단순하지만 민감한 POC 검출 플랫폼으로 전송할 계획이다.

실시예 2 - 항체로 수행된 에피토프 맵핑

MoAb1, MoAb2 및 MoAb3을 이용하여 에피토프 맵핑을 수행하였다.

표 5는 항체의 설명을 나타낸다.

2. 재료 및 방법

3가지 항체(MoAb1, MoAb2, MoAb3)를 분석하여 이들의 결합 부위에 의해 인식되는 올리고당 에피토프를 식별하였다. 61가지 올리고당 구조의 다양한 세트를 제시하는 글리칸 어레이에 대한 항체의 결합을 측정함으로써 에피토프 식별을 수행하였다(도 1d 내지 1f). 간단히, 올리고당 단편을 앞서 기재된 바와 같이 합성하였다(Joe, M. et al. The 5-deoxy-5-methylthio-xylofuranose residue in mycobacterial lipoarabinomannan. Absolute stereochemistry, linkage position, conformation, and immunomodulatory activity. J. Am. Chem. Soc. 128, 5059-5072 (2006); Gadikota, R. R., Callam, C. S., Appelmelk, B. J. & Lowary, T. L. Synthesis of Oligosaccharide Fragments of Mannosylated Lipoarabinomannan Appropriately Functionalized for Neoglycoconjugate Preparation. J. Carbohydr. Chem. 22, 149-170 (2003); Joe, M., Bai, Y., Nacario, R. C. & Lowary, T. L. Synthesis of the docosanasaccharide arabinan domain of mycobacterial arabinogalactan and a proposed octadecasaccharide biosynthetic precursor. J. Am. Chem. Soc. 129, 9885-9901 (2007); Sahloul, K. & Lowary, T. L. Development of an Orthogonal Protection Strategy for the Synthesis of Mycobacterial Arabinomannan Fragments. J. Org. Chem. 80, 11417-11434 (2015); Zheng, R. B. et al. Insights into Interactions of Mycobacteria with the Host Innate Immune System from a Novel Array of Synthetic Mycobacterial Glycans. ACS Chem. Biol. 12, 2990-3002 (2017)).

그 다음 단편을 BSA에 접합하고 마이크로어레이를 생성하는 데 사용하였다. 항체의 8가지 연속 희석액(0.6 ng/㎖, 2.4 ng/㎖, 9.8 ng/㎖, 39 ng/㎖, 156 ng/㎖, 625 ng/㎖, 2.5 ㎍/㎖, 및 10 ㎍/㎖)을 슬라이드 상에서 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 세척한 후 40분 동안 형광 표지된 2차 항-종 항체(Jackson ImmunoResearch사의 Cy™3 AffiniPure 염소 항-토끼 IgG)로 염색하였다. 세척 및 건조를 반복한 후, GenePix 4000B 스캐너(Molecular Devices사, 미국 서니베일 소재)를 사용하여 형광 신호를 측정하고, ProMicroarray Image Analysis Software 6.1을 사용하여 각각의 지점의 배경에 대한 강도를 정량화하였다.

결과 및 논의

도 7은 61개 모든 올리고당 구조에 대한 8가지 상이한 농도, 3개의 음성 및 1개의 양성 대조군 지점에서 3가지 단클론성 항체의 반응성을 나타낸다.

MoAb2는 모노- 및 트라이 치환 구조에 대하여 반응성이 약한 다이만노스-캡핑 LAM을 우선적으로 인식하였다. 이는 Mtb에 대한 이 항체의 특이성, 및 마이코박테리움 스메그마티스 PILAM(글리칸49)와의 반응성 결여와 일치한다. 다이만노스-캡핑 LAM에 대한 반응성은 MTX의 첨가에 의해 강하게 억제되었으며(글리칸 3 내지 글리칸 7의 반응성을 비교), 이는 MoAb2가 비변형 다이만노스 글리칸을 우선적으로 인식하였음을 나타낸다. 마이크로어레이 분석은 MoAb2가 Araf 당을 함유하지 않은 여러 Manp-함유 글리코접합체와 강하게 반응하였음을 추가로 나타내었다. 이들 에피토프는 이 구조의 말단 또는 중간 Manp에 대한 α-(1→2) 또는 α-(1→3) 결합에 의해 연결된 추가적인 Manp 잔기와 만노스 구조를 공유하므로, 만난 백본 및 캡핑 구조 둘 다와 유사하였다. MoAb2는 또한 분자의 양쪽 말단에서 Manp-(1→3)-α-Manp 연결을 함유한 오당류 구조인 글리칸 59와 상당히 잘 반응하였다. 이러한 결과는 이 항체가 단지 Manp-함유 성분에만 의존하고 인식을 위해 임의의 인접한 Araf 잔기를 필요로 하지 않음을 분명히 나타낸다. Manp는 Mtb 및 다른 느리게 성장하는 마이코박테리아에서 보존된 특성이지만, 캡핑한 빠르게 성장하는 종, 예컨대 마이코박테리움 스메그마티스에서는 일어나지 않는다. 그러나 소변에서의 테스트의 실시예 1은 비변형 Manp(즉, 비변형 다이-만노스 글리칸)는 대부분의 TB 환자의 소변에서의 결합에 이용할 수 없음을 시사한다. 단일 가설에 국한되고자 하는 것은 아니지만, 가능한 이유는 MTX의 부재 시 이 에피토프의 분해(예를 들어, 1,2-만노시다제와 같은 인간 효소에 의함) 때문이다. 따라서, 비변형 Manp 모티프를 표적으로 하는 항체는 환자의 소변에서 ManLAM을 검출하는 데 진단적으로 유용하지 않을 수 있다.

대조적으로, MoAb1은 α-(1→4)-연결 메틸티오-자일로(MTX) 잔기로 추가로 치환된 Manp-캡핑 구조에 고유하게 특이적이었다. MoAb1은 MTX-변형 다이만노스(글리칸7) 및 트라이만노스(글리칸9) 캡핑 구조와 가장 큰 반응성을 가졌고, MTX-변형 모노-만노스 구조(글리칸8, 글리칸10, 글리칸11)와 더 약한 반응성을 가졌다. MoAb1은 MTX-Man 모티프가 Ara6의 α-(1→5)-연결(글리칸10) 또는 α-(1→3)-연결(글리칸11) 암(arm)에 존재하는 구조를 인식하며, 이는 폴리-Araf 구조가 인식에 중요하지 않을 수 있고 결합이 주로 MTX-다이만노스 위치에서 일어난다는 것을 시사한다. MTX 치환은 현재까지 분석된 모든 Mtb 분리주에서 식별되었으며, 최근 보고서는 Mtb LAM의 MTX 캡핑 모티프의 생합성을 전담하는 5개 유전자 클러스터를 기재하였다(Angala et al. 2017). 마이코박테리움 스메그마티스는 또한 이들 유전자를 전부 가지고 있으므로, MoAb1와 마이코박테리움 스메그마티스 및 다른 빠르게 성장하는 마이코박테리아의 반응성의 결여는 아마도 PILAM에서 Manp 캡핑의 부재와 관련이 있으며, 이는 이러한 에피토프의 형성을 배제한다. MoAb2와 대조적으로 MTX-Manp 구조는 TB 환자의 소변에서 결합에 사용할 수 있는 것으로 보인다. 단일 가설에 국한되고자 하는 것은 아니지만, 가능한 설명은 MTX가 TB 환자의 신체에서 발생할 수 있는 효소의 분해 또는 다른 분해 메커니즘으로부터 Manp 단위를 보호한다는 것이다.

MoAb3은 친화성이 낮은 비캡핑 Ara4 및 Ara6 구조를 인식하고 Ara4-Man1(글리칸2), 다이만노스 캡핑 Ara4 및 Ara6 구조(글리칸3 및 글리칸6)와, 그리고 MTX-변형 Ara4-Man2 구조(글리칸7)와 가장 강하게 반응하였다. MTX-변형 모노- 및 트라이만노스 캡핑 구조(글리칸8 및 글리칸9)에서는 반응성이 더 낮았다. MoAb2와 대조적으로, MoAb3은 임의의 폴리만노스 구조(글리칸17, 글리칸50, 글리칸59)를 인식하지 않았는데, 이는 Ara 구조(들)의 존재가 MoAb3의 결합에 중요함을 시사한다. 다른 2가지 항체와 대조적으로, MoAb3은 포스포-미오(myo)-이노시톨-캡핑 Ara4(글리칸49)에 대한 약한 결합을 포함하여 더 광범위한 반응성을 가졌다.

표 6은 항체 결합 결과의 요약을 나타낸다.

결과 요약

MoAb2와 MoAb1은 둘 다 Mtb 및 다른 느리게 성장하는 마이코박테리아에만 존재하는 에피토프에 특이적이지만, 마이코박테리움 스메그마티스, 마이코박테리움 포르투이툼과 같은 빠르게 성장하는 마이코박테리아에서는 일어나지 않으며, 이는 느리게 성장하는 마이코박테리아와 빠르게 성장하는 마이코박테리아를 구별하는 항체 능력을 설명한다. 이는 이러한 항체를 기반으로 한 검정의 우수한 분석을 추가로 설명한다. 환자의 소변에서 비변형 Man2 캡의 부재로 인해, MoAb2는 소변에서 LAM의 검출을 기반으로 하는 진단 면역검정에 중요한 항체가 아닌 것으로 보인다. 대조적으로 MoAb1은 소변에 존재하고 안정적인 것으로 보이는 MTX 캡핑 Manp 구조를 검출한다. MoAb3은 2가지 포획 항체와도 또한 관련된 글리칸에 대해 중복되는 반응성을 나타내지만, Ara 구조의 존재는 MoAb3에 중요한 것으로 보이며, 이는 항체가 약간 상이한 에피토프에 결합함을 시사한다.

실시예 3 - 포획용 항체 MoAb1 및 검출용 항체 A194-01을 이용한 추가적인 데이터(도면에서 '테스트 대상 항체' 또는 '항체 U. 테스트')

이 항체 조합을 추가의 임상 데이터를 얻는 데 사용하였으며, 이는 소변에서 LAM을 검출하기 위한 이러한 항체 쌍의 효능을 나타낸다.

방법

연구 설계 및 연구 모집단

바이오뱅크 소변 샘플을 HIV가 있는 살아있는 입원환자(18세 초과)로부터 평가하였으며, 2개의 남아프리카의 지역 병원에서 3개의 독립적인 전향적 코호트 연구에서 수집하였다. 코호트 선택의 기준은 TB 발병 환경에서 입원한 PLHIV의 전체 코호트에 대해 동결된 소변 샘플을 이용할 수 있다는 것이었으며, 여기에서 TB 또는 대체 진단을 식별하기 위해 포괄적인 작업을 수행하였다. 3개의 모든 코호트에 걸쳐 TB 및 HIV 관리에 대한 표준 국가 지침을 사용하였다. 제1 코호트("코호트1")에 있어서 객담을 생성할 수 있는 TB 증상이 있는 성인은 2016년 2월 내지 2017년 8월 사이에 칼리챠 병원(Khayelitsha Hospital: KH)에 입원할 때 CD4 수와는 관계없이 등록되었다. 코호트1은 폐외 질환이 있는 환자만 제외하였다. 제2 코호트("코호트2")는 객담을 생성하는 능력 또는 TB 증상을 보고하였는지 여부에 관계없이, 2012년 6월 내지 2013년 10월 사이에 GF 주스테(GF Jooste) 병원의 성인 의료 병동에 입원한, CD4 수와 관계없이 성인을 등록하였다.2,11 코호트2에 있어서, 연구진은 입원 후 24시간 이내에 테스트를 위해 소변, 혈액 및 2개의 객담을 체계적으로 수집하려고 시도했다. 제3 코호트("코호트3")는 2014년 1월 내지 2016년 10월 사이에 제시하는 대로 TB가 가장 가능성이 높은 진단으로 간주되는 CD4가 350개 세포/㎕로 KH에 입원한 PLHIV를 등록하였다.

모든 코호트는 항-TB 요법을 이미 받고 있는 환자는 제외하였다. 코호트 1 및 2에서는, 등록이 연속적으로 이루어졌다. 코호트3은 모든 잠재적으로 자격이 있는 환자를 매일 식별한 후 무작위 선택 방법을 사용하였다. 모든 코호트에서, 환자는 병원에 입원시 등록되었다. 등록시 M.tb 참조 표준 테스트를 위한 객담, 혈액 및 소변 시료를 수집하였고, 병원 입원 동안 및 후속 조치시 추가적인 임상 샘플을 수득하였다. 숙련된 간호사 또는 훈련된 임상 연구자가 코호트 전체에 걸친 객담 수집을 수행하였으며, 필요한 경우 앞서 기재한 바와 같이 객담 유도를 수행하였다.

모든 연구-관련 활동은 케이프타운 대학교(UCT)의 인체 연구 윤리 위원회(Human Research Ethics Committee: HREC)의 승인을 받았다. 연구 프로토콜에 따라서, 환자로부터 서면 동의를 얻었다. 연구 참여는 표준 치료에 영향을 미치지 않았다. 보고는 STARD 지침을 따랐다. 후향적 소변 LAM 테스트는 후원자인 FIND가 감독하였으며, 2018년 4월에 UCT에서 수행하였다.

실험실 방법

처리되지 않은 소변의 동결 소변 분취량을 주위 온도로 해동하고, 수동으로 혼합하였다. 테스트에 즉시 사용하지 않은 샘플은 4℃에서 최대 4시간 동안 보관하였다. 제조업체의 지침에 따라 Alere LF-LAM 테스트를 수행하였다. 상기 기재된 바와 같은 테스트 대상 항체의 쌍(포획용 항체 MoAb1 및 검출용 항체 A194-01)을 다음과 같이 테스트하였다. 간단히, 금으로 표지한 A194-01을 함유하는 시약 튜브에 지시선(대략 200㎕)까지 소변을 첨가하고, 혼합한 다음, 40분 동안 주위 온도에서 인큐베이션하였다. 다시 혼합한 후, 튜브의 소변/시약 2방울을 '테스트' 라인에 고정된 MoAb1 포획 항체를 이용하여 측면 유동 현장 진단 면역검정인 테스트 스트립에 첨가하였다. 항원이 소변에 존재하는 경우, MoAb1 포획 항체는 '테스트' 라인에서 항원-A194-01-금 복합체를 포획하여 샌드위치 형식으로 MoAb1-항원-A194-01-금 복합체를 형성한다. 결과는 10분 이내에 판독되었다. 어떠한 판독 장치도 필요하지 않으며, 철저한 육안 검사로 결과를 해석하였다. '테스트'라인에 표시된 임의의 라인은 TB 양성인 것으로 간주되었다.

각각 지표 또는 비교 테스트의 테스트 결과, 환자 상태 및 다른 모든 테스트 결과를 알지 못하는 2명의 판독자가 두 가지 검정을 독립적으로 판독하였다. 초기의 독립적인 테스트 해석 후, 판독자들은 결과를 비교하고, 불일치가 있는 경우 테스트 스트립을 재검사하여 분석에 사용된 최종 합의 결과(상호 합의에 의함)를 설정하였다. 검정 실패의 경우, 테스트를 한 번 반복하였다.

참조 표준 테스트를 위해, 남아프리카 국립 보건 연구소의 중앙집중식 공인 실험실에서 표준화된 프로토콜을 사용하여 시료를 처리하였다. 참조 표준 테스트는 모든 이용 가능한 객담 시료에 대해 수행하였으며 GeneXpert MTB/RIF(Xpert, Cepheid사, 미국 서니베일 소재; 테스트는 Xpert 울트라 MTB/RIF의 출시보다 앞섬), 아우라민 O 염색 후 도말 형광 현미경검사, MGIT 액체 배양(Becton Dickinson사, 미국 프랭클린 레익스 소재) 및 뢰벤슈타인-옌센(

: LJ) 배지에서의 고체 배양을 포함하였다.

MPT64 항원 검출 및/또는 MTBDRplus 라인 프로브 검정(Hain Lifesciences사, 독일 네렌 소재)으로 고체 및 액체 배양에서 Mtb 복합체의 존재를 확인하였다. BACTEC™ Myco/F 용해 배양 바이알(Becton Dickinson사, 미국 프랭클린 레익스 소재)에서 모든 참가자의 혈액 배양을 수행하였으며, WHO 사전검증된 시험관내 진단 테스트를 HIV 테스트(신속 진단 테스트) 및 CD4 세포 계수(유세포 분석)에 사용하였다. 소변 Xpert 테스트를 위해, 20 내지 40㎖ 소변을 원심분리하고 상청액을 제거한 다음, 펠릿을 잔류 소변량에 재현탁시키고, Xpert를 사용하여 0.75㎖를 테스트하였다. 2 코호트 2 및 3의 경우, 추가 호흡 및 비호흡 샘플, 예컨대 흉수, 뇌척수액 및 조직 미세 바늘 흡인물을 수득하고, 임상적으로 지시된 경우, MGIT 배양 또는 Xpert를 사용하여 테스트하였다. 임상 정보, 테스트 대상 항체의 쌍으로부터의 결과 및 Alere LF-LAM 결과는 테스트 당시 참조 표준의 평가자는 이용할 수 없었다.

참조 표준 카테고리

임상 및 실험실 결과의 조합을 사용하여 4가지 진단 카테고리로 환자를 지정하였다. 데이터 분석 이전에 색인 테스트 결과를 알지 못하는 임상 연구자가 이를 수행하였다. "확정 TB"는 미생물학적으로 확인된 Mtb(입원 동안 Mtb에 대해 양성인 임의의 배양물 또는 임의의 Xpert MTB/RIF("Xpert"))가 있는 환자를 포함하였다. "비-TB"는 Mtb에 대해 음성인 모든 현미경검사, 배양물 및 Xpert 테스트가 있는 환자이며, 항-TB 치료를 시작하지 않았고, 3개월 추적 관찰시 살아있거나 개선된 환자이다. "가능성 TB"는 "확정 TB"에 대한 기준을 만족하지 않지만, TB를 시사하는 임상적/방사선학적 특성을 가지고 TB 치료를 시작한 환자이다. 이들 카테고리 중 어느 것에도 속하지 않는 환자는 이러한 진단 정확도 연구에서 "분류 불가능"으로 간주되어 주요 분석에서 제거되었다. 민감도 분석에서는, 진단 정확도에 제외 항목이 미치는 영향을 평가하기 위해 "분류 불가능" 카테고리를 포함하였다.

통계 분석

테스트 대상 항체의 쌍과 LF-LAM을 이용한 LFA의 정확도(민감도, 특이성, 양성 예측치(PPV), 음성 예측치(NPV), 양성 가능성 비율(LR+) 및 음성 가능성 비율(LR-))를 미생물학 참조 표준(MRS)뿐만 아니라 복합 참조 표준(CRS)과의 비교에 의해 결정하였다. "확정 TB" 대 "비-TB"를 사용하여 참조 표준 양성 대 음성 그룹으로 환자를 할당하였다. "가능성 TB" 그룹은 MRS 내에서는 음성으로 간주되었지만, CRS 내에서는 양성으로 간주되었다. 프로토콜에 따라, 진단 정확도를 각각의 코호트에 대하여 별도로 결정하였다. 코크란 Q-테스트(Cochran's Q-test)를 사용하여 이질성을 평가하였다.

코호트 및 CD4 계층에 걸쳐 통합 민감도 및 특이성을 추정하기 위해, 본 발명자들은 연구 설계 차이를 설명하기 위해 베이지안 이변수 무작위(Bayesian bivariate random)-효과 모델을 이용한 사후 분석을 수행하였다. 결과는 윌슨 점수 방법을 기반으로 한 95% 신뢰 구간(95% CI)으로 제시되어 있다. 탱고(Tango)의 점수 방법을 사용하여 (테스트 대상 항체와 Alere LF-LAM 쌍에 있어서) 백분율의 차이(Δ)의 95% CI를 계산하였다. 0%가 차이의 95% CI에 포함되지 않은 경우 2가지 테스트 사이의 차이는 융한 것으로 간주하였다. 코헨(Cohen)의 카파 통계를 사용하여 LAM 테스트의 2명의 독립적인 판독자 사이에서 양성 및 음성 결과의 일치를 계산하였다. 추가적인 사후 분석에서, 미생물학적으로 확인된 TB 환자의 총수(임의의 유형의 적어도 하나의 임상 시료에서 Xpert 또는 배양물에 의한 Mtb의 검출로 정의됨)를 분모로 사용하여 제시 후 처음 24시간 이내에 수집한 샘플로부터 테스트 대상 항체, Alere LF-LAM, 객담 Xpert(카트리지 버전 G4) 및 객담 도말 현미경관찰 테스트의 단일 테스트의 비교 진단 수율을 계산하였다. 이 분석은 코호트2로 제한되었는데, 이는 이 코호트가 입원 후 처음 24시간 이내에 모든 환자에서 이러한 진단 샘플(가능한 경우 혈액, 소변 및 2개의 객담 샘플)을 체계적으로 수집하고자 시도함으로써 진단 수율을 평가하도록 설계되었기 때문이다. R(버전 3.5.1) 및 매트랩(Matlab) 버전 2017b을 이용하여 데이터 분석을 수행하였다.

결과

환자

전체적으로, 1188명의 환자가 후향적 테스트를 받을 자격이 있고 그런 것으로 고려되었으며; 220명의 환자는 소변 샘플을 이용할 수 없거나(n = 93), 테스트 대상 항체 테스트에 실패했거나(n = 6), 분류 불가능(n = 121)하였기 때문에 주요 분석에서 제외되었다. "분류 불가능"에 대한 주된 이유는 진단이 이루어질 수 있기 전의 사망(n = 62) 및 진단을 위해 생명 유지 상태 또는 임상 상태의 개선이 필요한 경우 추적 관찰 상실(n = 17)이었다. 주요 분석에 포함된 968명의 환자 중, 600명(62%)은 확정 TB로, 91명(9%)은 가능한 TB로, 277명(29%)은 비-TB로 분류되었다. TB 진단에 대한 미생물학 참조 표준은 총 6,397건의 배양 및 Xpert 테스트(평균 6.2/환자)를 통해 정보를 얻었으며, 객담 샘플에 대해 3,261건의 테스트 및 비-객담 샘플에 대해 3,136건의 테스트를 포함하였다. 총 236명의 환자(24.4%)는 객담 샘플을 제공할 수 없었다. 확정 TB 진단은 환자의 19.5%에 대한 비-객담 샘플의 결과를 기반으로 하였다(117/600). TB 유병률은 코호트 1, 2 및 3 각각에 대하여 49%, 38%, 및 82%였다. 대부분의 환자는 젊은 면역력이 약화된 성인(연령 중앙값: 35세)이었고, 코호트 1, 2 및 3 각각에 대하여 CD4 수의 중앙값은 113개 세포/㎕, 153개 세포/㎕, 및 59개 세포/㎕였다. 모든 코호트에 걸쳐, 45%는 이전 TB 치료 이력이 있었고, 코호트 1 및 3의 모든 환자 및 코호트 2의 90%는 TB에 대한 양성 WHO 증상 선별 검사를 받았다.

테스트 대상 항체 및 Alere LF-LAM의 정확도

분석 결과는 MRS에 대한 Alere LF-LAM의 경우 42.3%(31.7-51.8)와 비교하여 테스트 대상 항체의 경우 70.4%(95% CI: 53.0-83.1)의 민감도를 나타내었으며: 2가지 테스트 사이의 차이는 28.1%(21.5-34.4)이다(도 8). 코호트3에서 MRS에 대한 가장 높은 테스트 대상 항체 민감도(81.0%)를 관찰하였으며, 코호트3은 코호트2(65.9%) 및 코호트1(59.6%)과 비교하여 보다 진행된 HIV-관련 면역 억제가 있는 환자(즉, CD4 수가 100개 세포/㎕ 이하인 더 많은 환자)가 있는 환자를 등록하였다. CD4 수로 환자를 계층화하였을 때 민감도 증가(두 검정 모두에 대해)와 CD4 수의 감소에 역관계가 있다. CD4 수가 100개 세포/㎕인 환자에서, 테스트 대상 항체는 Alere LF-LAM의 57.3%(42.2-69.6)와 비교하여 84.2%(71.4-91.4)의 민감도를 가졌으며: 2가지 테스트 사이의 차이는 26.9%(16.8-36.7)이다. 민감도에서의 유사한 차이(31.8%; 22.7-40.3)가 더 많은 면역 적격 환자(CD4가 200개 세포/㎕ 초과임)에서 관찰되었지만, 두 검정에 있어서 전체적인 민감도는 이 집단에서 더 낮았다; 테스트 대상 항체에 있어서 44.0% 297 (29.7-58.5) 그리고 Alere LF-LAM에 있어서 12.2%(4.6-23.7). CRS를 사용하면, 두 검정의 민감도는 약간 더 낮았다: 전체적인 테스트 대상 항체 포인트 추정치는 64.9%(50.1-76.7)이고 Alere LF-LAM의 포인트 추정치는 38.2%(28.1-47.3)였다. 테스트 대상 항체와 Alere LF-LAM 사이의 민감도 차이의 95% 신뢰 구간이 0과 겹치지 않았으므로(전체, 3가지 코호트에서, 및 CD4 계층 내에서), 테스트 대상 항체는 통계적으로 Alere LF-LAM보다 상당히 더 민감한 것으로 간주되었다(도 8). MRS에 대하여, 특이성의 추정치는 테스트 대상 항체 및 Alere LF-LAM 각각에 대해 90.8%(86.0-94.4) 및 95.0%(87.7-98.8)였으며, 이는 통계적으로 유의하지 않은 차이(-4.2%; 12.7-4.4)를 나타낸다. CRS를 사용하면 특이성의 전체적인 추정치는 각각 테스트 대상 항체의 경우 95.7%(92.0-98.0)이고 Alere LF-LAM의 경우 98.2%(95.7-99.6)로 증가하였으며, 다시 말하면 이는 통계적으로 유의하지 않은 차이(-2.5%; -11.2-6.3)를 나타내었다. 테스트 대상 항체 검정의 특이성은 CD4가 100개 세포/㎕ 초과인 것과 비교하여 CD4가 100개 세포/㎕ 이하인 것(CRS를 사용하여 91.2%)에서 더 낮았다(도 8). CRS를 사용하는, 11가지의 테스트 대상 항체 위양성 샘플 중 8가지는 CD4 수가 100개 세포/㎕ 이하인 환자의 것이었다. CRS를 사용하는, 3가지 상이한 코호트에 대한 PPV는 테스트 대상 항체 및 Alere LF-LAM 각각에 대하여 90.6-99.4% 및 93.8-100.0%의 범위였다. NPV는 테스트 대상 항체 및 Alere LF-LAM 각각에 대하여 24.8-71.8% 및 13.7-62.5%의 범위였다. 양성 가능성 비율(LR+)은 테스트 대상 항체 및 Alere LF-LAM 각각에 대하여 8.9-18.5 및 13.8-17.3의 범위였다. 음성 가능성 비율(LR-)은 테스트 대상 항체 및 Alere LF-LAM 각각에 대하여 0.3-0.4 및 0.6-0.7의 범위였다.

입원 후 24시간 이내 진단 수율

코호트2의 총 420명의 환자가 진단 수율의 분석에 적격이었다. 적격 환자 중에서, 단지 36.4%(153/420)만이 입원 후 처음 24시간 이내에 객담 샘플을 생성할 수 있는 반면, 99.5%(418/420)는 이 코호트에 대하여 앞서 기재한 바와 같이, 소변 샘플을 제공할 수 있었다. 총 141명의 환자가 미생물학적으로 TB를 확인하였다. 신속한 테스트를 사용하여 입원 후 처음 24시간 후에 수집된 샘플에서 TB 사례를 총 59.6%(84/141)가 진단할 수 있었다: 객담 Xpert로부터 26.2%(37/141), 그리고 11㎖의 입력 부피를 이용하여 소변 Xpert로부터 41.8%(59/141). TB 진단의 나머지 40.4%(57/141) 처음 24시간 후에 달성할 수 없었으며, 환자 입원 동안 임의의 시점에서 수집한 임의의 시료에 대해 마이코박테리아 배양물에 의해 확립되었으며, 20 내지 40 ㎖ 소변 유래의 농축된 샘플에 대하여 수행한 Xpert에 의해 진단되고/거나 처음 24시간 후에 수집된 시료에 대한 Xpert 테스트에 의해 진단되었다. 배양 및 Xpert 테스트를 위해 수집된 추가적인 시료는 복수, 혈액, 소변, 객담, 뇌척수액, 위세척액, 고름 또는 흉수를 포함하였다). 도 9는 처음 24시간의 다른 신속한 진단의 진단 수율과 비교하여 테스트 대상 항체와 Alere LF-LAM의 진단 수율을 예시한다. Alere LF-LAM에 의해 43.3%(61/141)인 것과 비교하여, 테스트 대상 항체의 도입으로, 제시 후 몇 시간 이내에 TB 사례의 64.5%(91/141)가 침상에서 신속하게 진단받을 수 있었다. 입원 후 처음 24시간 이내에 객담 Xpert와 테스트 대상 항체의 조합은 미생물학적으로 확인된 사례의 72.3%(102/141)를 진단할 수 있었다. 객담 도말 현미경검사와 테스트 대상 항체의 조합은 진단의 69.5%(98/141)를 산출하였다.

실패율 및 판독자 일치

전체적으로, 1.6%(18/1095)의 테스트 대상 항체 검정은 1번째 시도에서 실패하였다. 반복할 수 있는 15건 중, 3건은 2번째 시도에서 실패하여, 총 전체 오류율은 1.9%(21/1110 테스트)였다. Alere LF-LAM 오류율은 1번째 시도에서 0.4%(4/1095)였고 전부 4번의 반복 테스트는 2번째 시도에서 결과를 제공하였다. 요약하자면, 테스트 대상 항체 검정은 Alere LF-LAM과 유사한 실패율을 가지며, 이와 같은 검정의 제조에 일반적으로 사용되는 표준 품질 관리 조치에 의해 테스트 대상 항체 검정 실패율을 추가로 감소시킬 수 있다. 동일한 테스트의 2개의 독립적인 맹검 시각 판독의 일치는 테스트 대상 항체 및 Alere LF-LAM 둘 다에 대해 높았다. 테스트 대상 항체는 97.0%(938/967; 카파 계수 0.94)의 일치율을 가진 한편, Alere LF-LAM의 판독자 간의 일치는 96.7%(934/966; 카파 계수 0.92)였다.

논의

고부담 환경에서 968명의 입원한 PLHIV의 이러한 평가에서, 테스트 대상 항체 현장 진단 검정은 비슷한 특이성을 유지하면서 Alere LF-LAM보다 현저하게 더 높은 비율의 TB 환자를 식별하였다. 모든 하위 분석에서, 테스트 대상 항체의 민감도는 Alere LF-LAM보다 현저하게 더 높았다(범위, 22 내지 35%). 사망 위험이 가장 높은 환자(CD4가 100개 세포/㎕ 이하인 환자)에서, 테스트 대상 항체는 84.2%의 가장 높은 민감도를 가졌으며, 이는 Alere LF-LAM보다 26.9% 더 높았다. 객담 Xpert와 조합하여, 테스트 대상 항체는 입원 첫날 미생물학적으로 확인된 TB의 거의 3/4를 진단할 수 있었다. Alere LF-LAM에 대한 WHO 권고사항의 기초를 형성한 메타 분석은 PLHIV에서 전체 민감도의 45%를 보고하였고, 이는 이 연구에서 나타낸 Alere LF-LAM 민감도 42.3%와 유사하며, 이는 평가된 모집단이 WHO 메타 분석의 모집단과 유사함을 시사한다.

종합적으로, 이러한 결과는 임상 실무에서 구현되고 적절한 치료와 연계될 경우, 테스트 대상 항체 현장 진단 검정은 많은 입원한 환자에서 HIV-연관 TB의 조기 진단을 가능하게 함으로써 생명을 구할 수 있음을 시사한다. 테스트 대상 항체의 포인트 추정치는 Alere LF-LAM과 비교하여 더 낮았다. 테스트 대상 항체와 Alere LF-LAM 간의 특이성의 차이는 상당하지 않았지만, Alere LF-LAM과 테스트 대상 항체 둘 다의 특이성 감소는 완전한 민감도가 결여된 불완전한 참조 표준에 의해 부분적으로 설명될 수 있었다. 기존 참조 표준은 특히 면역력이 약화된 PLHIV에서 TB를 식별하는 능력이 제한되어 있는데, 이러한 환자는 희균나병 및/또는 폐외 TB를 가질 가능성이 더 높기 때문에 진단을 더 어렵게 한다.

불완전한 참조 표준은 더 민감한 테스트에 불균형적으로 영향을 미치고 증가된 위양성, 즉, 더 민감한 테스트 대상 항체 검정의 경우에 더 낮은 특이성을 초래할 수 있다. 이 연구에서 CD4 수가 감소함에 따라 보이는 특이성 감소와 MRS와 비교하여 CRS에 의해 보이는 특이성 개선은 이러한 설명을 추가로 뒷받침한다. 일반적인 요로 병원균 및 빠르게 성장하는 비결핵성 마이코박테리아에 대한 교차-반응성은 테스트 대상 항체에 대한 이전 연구(실시예 1, 표 2A)에서 제외되었다.

참고 문헌

명확성을 위해 별개의 실시형태의 맥락으로 기재된 본 발명의 특정 특성이 또한 단일 실시형태의 조합으로 제공될 수 있음이 이해된다. 반대로, 간결함을 위해 단일 실시형태의 맥락으로 기재된 본 발명의 다양한 특성은 또한 개별적으로 또는 임의의 적합한 하위 조합으로 제공될 수 있다.

본 발명이 이의 특정 실시형태와 함께 기재되었지만, 많은 대안, 수정 및 변형이 당업자에게 명백할 것임이 분명하다. 따라서, 첨부된 청구범위의 사상 및 넓은 범주에 속하는 이와 같은 대안, 수정 및 변형을 모두 포괄하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적으로 그리고 개별적으로 본 명세서에 참조로 포함되도록 나타낸 것과 동일한 정도로, 본 명세서에서 전문이 명세서에 참조로 포함된다. 추가적으로, 본 출원에서 참조문헌의 인용 또는 식별은 이와 같은 참조문헌이 본 발명의 선행 기술로서 이용 가능하다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안 된다.

Claims

대상체의 시험관내 샘플 소변에서 마이코박테리아와 연관된 항원을 검출하기 위한 항체로서, 상기 항원은 ManLAM(만노스 캡핑 리포아라비노만난(Mannose capped Lipoarabinomannan))을 포함하고, 상기 항체는 상기 소변 유래의 상기 ManLAM 분자에 특이적으로 결합하며, 상기 항체는 3×10^-8 M 이하의 KD를 갖는 친화도로 상기 ManLAM에 결합하고, 상기 항체는 10^-3 M 이상의 KD를 갖는 친화도로 이노시톨 포스페이트로 캡핑되거나 캡핑되지 않은 LAM 분자에 결합하는, 항체.
제1항에 있어서, 상기 ManLAM은 MTX-캡핑 ManLAM을 포함하며, 만노사이드 캡은 5-데옥시-5-메틸티오-자일로 모이어티의 부착에 의해 추가로 변형되는 것을 특징으로 하는, 항체.
제2항에 있어서, 상기 MTX-캡핑 ManLAM은, 알파 1-4-연결 메틸자일로스 잔기로 추가로 치환된 2개의 알파 1-2-Manp-연결 잔기를 특징으로 하는 MTX-Man2-캡핑 ManLAM을 포함하는, 항체.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 Manp 특징을 포함하는 상기 ManLAM의 에피토프에 결합하는, 항체.
제4항에 있어서, 상기 항체는 글리칸7, 글리칸8, 글리칸9, 글리칸10 및 글리칸11로 이루어진 군으로부터 선택되는 모티프의 특징으로 특징지어지는 상기 ManLAM의 에피토프에 결합하는, 항체.
제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 에피토프는 MTX-다이만노스 부분의 특징으로 추가로 특징지어지는, 항체.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체 유래의 소변 샘플을 사용하여 대상체에서 느리게 성장하는 마이코박테리아의 존재를 검출하는 데 적합한, 항체.
제7항에 있어서, 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 또는 마이코박테리움 보비스(M. bovis)와 연관된 항원을 검출하는 데 적합한, 항체.
제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 항체는 대상체의 소변에서 빠르게 성장하는 마이코박테리아 유래의 마커와 교차반응하지 않는, 항체.
제9항에 있어서, 상기 항체는 마이코박테리움 포르투이툼(M. fortuitum), 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis), 마이코박테리움 압세수스(M. abscessus), 또는 마이코박테리움 켈로네(M. chelonae)와 연관된 마커와 교차반응하지 않는, 항체.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 마이코박테리움 고르도네(M. gordonae), 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellulare), 및 마이코박테리움 아비움(M. avium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 느리게 성장하는 마이코박테리아와 연관된 마커와 적어도 10배 더 낮은 반응성을 나타내는, 항체.
제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체는 비-마이코박테리움 박테리아 종의 검출에 비해 적어도 1500배 더 높은 반응성으로 상기 마이코박테리움 투베르쿨로시스 또는 마이코박테리움 보비스와 연관된 항원을 검출하는, 항체.
제12항에 있어서, 상기 비-마이코박테리움 박테리아 종은 고르도니아 브론키알리스(Gordonia bronchialis), 노카르디아 아스테로이드(Nocardia asteroids), 로도코쿠스 종(Rhodococcus sp.), 츠카무렐라 파우로메타볼럼(Tsukamurella paurometabolum), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 코리네박테리움 우레알리티쿰(Corynebacterium urealyticum), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 크렙시엘라 뉴모니에(Klebsiella pneumoniae), 스트렙토코쿠스 아갈락티에(Streptococcus agalactiae), 스타필로코쿠스 사프로파이티쿠스(Staphylococcus saprophyticus), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 엔테로코쿠스 페칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes), 또는 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 중 하나 이상을 포함하는, 항체.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항원을 검출하기 위한 샌드위치 면역검정(sandwich immunoassay)에서 포획 항체(capture antibody)로서 사용하기에 적합한, 항체.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항원을 검출하기 위한 샌드위치 면역검정에서 검출 항체로서 사용하기에 적합한, 항체.
대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법으로서, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 항체를 대상체의 소변과 접촉시키는 단계; 소변 중 항원에 대한 상기 항체의 결합을 검출하는 단계; 상기 항체가 3×10^-8 M 이하의 KD를 갖는 친화도로 소변 중 상기 항원에 특이적으로 결합하면, 상기 ManLAM 분자를 특징으로 하는 상기 질환-유발 마이코박테리아는 상기 대상체의 신체에 존재하는 것으로 결정하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 항체는 비-질환 유발 마이코박테리아(non-disease causing mycobacteria)의 항원보다 적어도 3배 더 큰 신호로 상기 소변 중 상기 질환-유발 마이코박테리아의 항원에 결합하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 제1 항체를 상기 소변에 적용하여 상기 항원에 결합시키는 단계로서, 상기 제1 항체는 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 것임을 특징으로 하는, 상기 결합하는 단계; 및 제2 항체를 소변에 적용하여 제2 항원에 결합시키는 단계를 더 포함하되, 상기 제2 항체는 제1 항체와 동일한 항원에 결합하지 않고, 상기 제1 및 제2 항원은 상기 ManLAM 분자를 포함하며; 면역검정에서 상기 제1 항체와 상기 제2 항체 중 하나는 포획 항체이고 상기 제1 항체와 상기 제2 항체 중 다른 하나는 검출 항체인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제18항에 있어서, 상기 제2 항체는 3×10^-5 M 이하의 KD를 갖는 친화도로 상기 ManLAM 분자의 폴리-아라비노스에 결합하는 것을 특징으로 하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 항체는 ara4 및/또는 ara6에 특이적으로 결합하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 소변을 MoAb1, 13H3, 27D2 및 A194-01 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체와 접촉시키는 단계를 더 포함하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제21항에 있어서, 샌드위치 면역검정에서 상기 소변을 복수의 MoAb1, 13H3, 27D2 또는 A194-1 항체의 조합과 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제22항에 있어서, 샌드위치 면역검정에서 상기 소변을 MoAb1 및 A194-1 항체의 조합과 접촉시키는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체의 분류를 위한 적합한 참조 표준 진단을 사용하여 결핵이 없는 대상체 유래의 샘플과 비교하여 결핵을 앓고 있는 대상체 유래의 샘플의 중앙 신호 사이에 3 이상의 배수 변화를 달성하기에 적합한 제2 항체를 포함하는 샘플에 MoAb1 항체를 적용하는 단계를 포함하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제23항에 있어서, 상기 참조 표준 진단은 대상체를 분류하기 위한 마이코박테리아 배양 또는 PCR 기반 방법을 기반으로 하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제21항 또는 제22항에 있어서, 적합한 비교 표준 검정을 사용하여 결핵이 없는 대상체 유래의 샘플과 비교하여 결핵을 앓고 있는 대상체를 적어도 20% 더 검출하기 위해 샘플에 MoAb1 항체를 적용하는 단계를 더 포함하되, 상기 적합한 비교 표준 검정은 Alere LF-LAM을 포함하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 결핵이 없는 대상체 유래의 소변 샘플에서 검출된 ManLAM 항원 특이적 샌드위치 면역검정 신호는 모집단에서 샘플의 적어도 70%에 대해 11 pg ManLAM/㎖ 미만인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제27항에 있어서, 상기 신호는 상기 모집단에서 상기 샘플의 적어도 80%에 대해 검출 한계 미만인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제28항에 있어서, 상기 신호는 모집단에서 상기 샘플의 적어도 90%에 대해 검출 한계 미만인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제29항에 있어서, 상기 신호는 상기 모집단에서 상기 샘플의 적어도 95%에 대해 검출 한계 미만인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제30항에 있어서, 상기 신호는 상기 모집단에서 상기 샘플의 적어도 97%에 대해 검출 한계 미만인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제21항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 결핵이 있는 대상체 유래의 소변 샘플에서 검출된 ManLAM 항원 특이적 샌드위치 면역검정 신호는 모집단에서 상기 샘플의 적어도 40%에 대해 11 pg ManLAM/㎖ 초과인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제32항에 있어서, 상기 신호는 상기 모집단에서 상기 샘플의 적어도 50%에 대해 검출 한계 초과인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제33항에 있어서, 상기 신호는 상기 모집단에서 상기 샘플의 적어도 60%에 대해 검출 한계 초과인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제34항에 있어서, 상기 신호는 상기 모집단에서 상기 샘플의 적어도 75%에 대해 검출 한계 초과인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제35항에 있어서, 상기 신호는 상기 모집단에서 상기 샘플의 적어도 90%에 대해 검출 한계 초과인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제16항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, HIV 바이러스의 부재 하에 대상체에서 TB 질환-유발 마이코박테리아를 검출하는 단계를 더 포함하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제16항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원에 대한 상기 항체의 결합을 기반으로 한 면역검정의 AUC(곡선하 면적)는 적어도 0.70인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제38항에 있어서, 상기 AUC는 적어도 0.80인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제39항에 있어서, 상기 AUC는 적어도 0.85인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제40항에 있어서, 상기 AUC는 적어도 0.90인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제41항에 있어서, 상기 AUC는 적어도 0.95인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제42항에 있어서, 상기 AUC는 적어도 0.98인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제16항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 항체로서 MoAb1 항체 또는 13H3 항체, 및 제2 항체로서 A194-01 항체 또는 27D2의 조합물을 적용하여 대상체 유래의 시험관내 소변 샘플에서 마이코박테리아와 연관된 항원을 검출하는 단계를 포함하되, 면역검정에서 상기 제1 항체 및 상기 제2 항체 중 하나가 포획 항체이고 상기 제1 항체와 상기 제2 항체 중 다른 하나가 검출 항체인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제44항에 있어서, 상기 검출은 면역검정을 사용하여 수행되되, 상기 조합물은 Alere LF-LAM 테스트보다 임상 민감도가 적어도 20% 더 높은 것인, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제16항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 신체에서 상기 질환-유발 마이코박테리아의 존재에 따라 결핵이 있는 대상체를 진단하는 단계를 더 포함하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제46항에 있어서, 상기 진단은 상기 대상체에서 활동성 결핵 감염의 존재를 검출하는 것을 더 포함하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제47항에 있어서, 상기 질환-유발 마이코박테리아의 존재에 따라 결핵에 대한 상기 대상체의 치료 효능을 모니터링하는 단계를 더 포함하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제16항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 임상 민감도를 추가로 증가시키기 위해 상기 면역검정을 이용한 검출 전에 상기 샘플에서 ManLAM을 포함하는 상기 항원을 농축시키는 단계를 더 포함하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제49항에 있어서, 상기 항원을 농축시키는 단계는 상기 샘플에 자기 비드 또는 한외여과를 적용하는 것을 포함하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제16항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재와 상기 대상체에서 비-질환 유발 마이코박테리아를 구별하는 단계를 더 포함하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제16항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체의 환경으로부터 오염 박테리아의 존재 하에 상기 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 특이적으로 검출하는 단계를 더 포함하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제52항에 있어서, 상기 오염 박테리아는 고르도니아 브론키알리스, 노카르디아 아스테로이드, 로도코쿠스 종, 츠카무렐라 파우로메타볼럼, 칸디다 알비칸스, 코리네박테리움 우레알리티쿰, 에스케리치아 콜라이, 크렙시엘라 뉴모니에, 스트렙토코쿠스 아갈락티에, 스타필로코쿠스 사프로파이티쿠스, 슈도모나스 아에루기노사, 스타필로코쿠스 아우레우스, 프로테우스 미라빌리스, 프로테우스 불가리스, 나이세리아 고노레아, 헤모필루스 인플루엔자, 엔테로코쿠스 페칼리스, 엔테로박터 아에로게네스, 또는 클라미디아 트라코마티스, 또는 비결핵성 마이코박테리아 중 하나 이상을 포함하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.
제16항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체를 접촉시키기 전에 상기 소변을 가열하는 단계를 더 포함하는, 대상체에서 질환-유발 마이코박테리아의 존재를 차별적으로 검출하는 방법.