BR112020019618A2 - Resumoanticorpo ou combinação de anticorpo e método usando o mesmo para detecção de um antígeno relacionado a micobactérias em uma amostra de urina de um sujeito - Google Patents

Abstract

anticorpo para a detecção de um antígeno associado a micobactérias em uma amostra de urina in vitro de um sujeito, em que o referido antígeno compreende manlam (lipoarabinomanano terminado com manose), o referido anticorpo se ligando especificamente às referidas moléculas de manlam da referida urina, em que o referido anticorpo se liga ao referido manlam com uma afinidade possuindo uma kd de 3x10-8 m ou menos, e em que o referido anticorpo se liga a moléculas lam que não são terminadas ou que são terminadas com fosfato de inositol com uma afinidade tendo uma kd de 10-3 m ou mais; e um anticorpo para uso respectivo.

Description

ANTICORPO OU COMBINAÇÃO DE ANTICORPO E MÉTODO USANDO O MESMO PARA DETECÇÃO DE UM ANTÍGENO RELACIONADO A MICOBACTÉRIAS EM UMA AMOSTRA DE URINA DE UM SUJEITO CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A presente invenção, em pelo menos algumas modalidades, se refere a um anticorpo ou combinação de anticorpos e método usando o mesmo para a detecção de um antígeno relacionado a micobactérias em uma amostra de urina de um sujeito e, em particular, a tal anticorpo ou combinação de anticorpos e método que é capaz de diferenciar entre micobactérias causadoras de doenças e outras espécies bacterianas com um alto grau de precisão.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO

[002] A tuberculose (TB) é o assassino número um nas doenças infecciosas. Em 2016, 10,4 milhões de pessoas adoeceram com TB e 1,7 milhões morreram da doença, tornando-a a nona causa de morte em todo o mundo e a principal causa de um agente infeccioso (Organização Mundial da Saúde 2017). A TB também é a causa mais comum de mortalidade em pessoas que vivem com HIV (PLHIV), com uma estimativa de 374.000 mortes em 2016 (Organização Mundial da Saúde 2017). O risco de desenvolver TB é estimado em cerca de 30 vezes maior em PLHIV do que em pessoas sem HIV (Getahun & Ford 2016). A maioria das mortes por TB poderia ter sido evitada com o diagnóstico precoce, no entanto, a TB frequentemente não é diagnosticada. Globalmente, havia uma lacuna estimada em 4,1 milhões de casos entre o incidente estimado e os casos de TB notificados (Organização Mundial da Saúde 2017). Essa lacuna se deve às limitações dos testes estabelecidos e à falta de testes precisos, baratos e rápidos adequados para os ambientes típicos de atenção primária em países de baixa e média renda (LMICs) onde a TB é prevalente.

[003] Os métodos tradicionais de diagnóstico são lentos (cultura de escarro) ou insensíveis (baciloscopia de escarro). Técnicas modernas, como sequenciamento ou o teste de PCR em tempo real Xpert® MTB/RIF, tornaram-se mais disponíveis, mas requerem instalações especializadas, são caras ou são inacessíveis para muitas das populações em LMICs que estão em maior risco de contrair TB (Pai et al. 2016). As limitações dos diagnósticos de TB existentes são especialmente agudas para PLHIV devido à alta mortalidade associada à TB não tratada nesta população. Além disso, embora a maioria dos testes seja baseada na análise de amostras de escarro, muitas PLHIV com TB têm TB extrapulmonar (~25%) ou são incapazes de produzir amostras de escarro. Uma meta-análise de estudos de desempenho clínico Xpert (Steingart et al. 2014) indicou que a sensibilidade combinada para pacientes HIV-positivos foi menor em comparação com pacientes HIV-negativos (99% vs. 86%). Este resultado foi pelo menos parcialmente explicado pela maior proporção de baciloscopia negativa em pacientes HIV-positivos combinada com menor sensibilidade agrupada do teste Xpert em baciloscopia de escarro negativa em relação à baciloscopia de escarro positiva (67% vs. 98%). Em um estudo citado, o Xpert foi apenas 43% sensível para detectar TB com baciloscopia negativa em pacientes HIV-positivos (Lawn et al. 2011). Embora a sensibilidade do Xpert Ultra recentemente desenvolvido fosse superior à do Xpert em pacientes com HIV, a sensibilidade melhorada veio às custas de uma diminuição na especificidade (Dorman et al. 2017).

[004] A detecção e o tratamento precoces de todos os pacientes com TB são um componente-chave da Estratégia para Acabar com a TB da OMS e um requisito para cumprir a terceira Meta de Desenvolvimento Sustentável (Uplekar et al. 2015), mas alcançar isso exigirá um novo ponto de atendimento sensível (POC) abordagens para diagnosticar TB ativa em locais como postos de saúde locais ou clínicas onde os pacientes procuram atendimento pela primeira vez. A ausência de um teste POC preciso que possa informar rapidamente as decisões de tratamento leva a perdas significativas de pacientes no estágio inicial da cascata de cuidados, o que leva ao aumento da morbimortalidade (Cazabon et al. 2017). Portanto, a OMS lista um “teste rápido baseado em biomarcador, sem escarro para detectar TB” como uma necessidade crítica não atendida em um relatório de perfil de produto alvo de alta prioridade (TPP) (Organização Mundial da Saúde 2014).

[005] Tem havido considerável interesse na identificação de antígenos micobacterianos que estão presentes no soro ou na urina de pacientes com TB ativa. Esses antígenos representam alvos potenciais para testes de diagnóstico que não exigiriam a coleta de amostras de escarro e que poderiam ser desenvolvidos em formatos de teste rápido baseados em imunoensaios de baixo custo. O lipoarabinomanano (LAM), um lipopolissacarídeo da parede celular do Mycobacterium tuberculosis (Mtb) e fator de virulência, tem atraído mais atenção como biomarcador diagnóstico para TB. O LAM tem muitas características atrativas como biomarcador: é derivado de bactérias, abundante na parede celular do Mtb, estável ao calor e possui epítopos estruturais exclusivos do Mtb. Existem muitas evidências de que o LAM pode ser encontrado na urina de muitos pacientes com TB (Sarkar et al. 2014) e estudos em estágios anteriores indicam que também pode ser encontrado no escarro (Pereira Arias-Bouda et al. 2000; Cho et al. 1990) e sangue (Crawford et al. 2017; Sada et al. 1992).

[006] Desde os primeiros relatos de LAM no escarro em 1990 (Cho et al. 1990), no sangue em 1992 (Sada et al. 1992) e na urina em 1997 (Svenson 1997), as características atrativas do LAM como alvo diagnóstico inspiraram um quarto de século de pesquisa em diagnósticos baseados em LAM, incluindo o desenvolvimento de ELISA comercial e testes rápidos (fluxo lateral). O único teste LAM atualmente no mercado para diagnóstico clínico de TB, o teste Alere Determine TB LAM® (LF-LAM) da Abbott Diagnostics, é um teste de fluxo lateral para medir LAM na urina que usa anticorpos policlonais de coelho. Outro teste, um teste ELISA da Otsuka Pharmaceutical para medir LAM no escarro, recebeu recentemente a marca CE para uso na Europa, mas só está sendo usado como uma ferramenta para avaliar a resposta ao tratamento em testes de medicamentos para TB (Kawasaki et al. 2018).

[007] Apesar do grande entusiasmo inicial após a introdução de kits para medir LAM na urina e numerosos estudos clínicos avaliando seu desempenho, a adoção desses testes tem sido limitada. A principal razão para a baixa adoção tem sido a sensibilidade clínica relativamente baixa dos testes em todo o espectro de casos de TB incidentes. Uma meta-análise abrangente de estudos avaliando o teste Alere LF-LAM para o diagnóstico de TB em PLHIV revelou que o teste tinha precisão diagnóstica limitada: 44% de sensibilidade combinada para diagnóstico de TB em casos de HIV+ em 92% de especificidade combinada em 3.037 pacientes (Organização Mundial da Saúde 2015). Esta análise formou a base da recomendação muito limitada da OMS de usar apenas o Alere LF-LAM para diagnosticar TB em pessoas imunocomprometidas que vivem com HIV/AIDS (PLHIV) com contagens de CD4 ≤100 células/µl e com sintomas de TB (Organização Mundial da Saúde 2015). Apesar de sua baixa sensibilidade, o teste com Alere LF-LAM, seguido por tratamento imediato, mostrou reduzir significativamente a mortalidade de 8 semanas em um grande ensaio pragmático, randomizado, de grupo paralelo e multicêntrico em pacientes HIV+ internados em dez hospitais africanos (Peter et al. 2016), mas até agora apenas a República Centro-Africana e o Zimbábue têm diretrizes sobre como integrar o Alere LF-LAM em testes de diagnóstico e houve uma aceitação muito limitada nos LMICs (MSF & Stop-TB Partnership 2017).

[008] Apesar dos numerosos estudos que foram conduzidos com o teste LF-LAM e testes ELISA anteriores, há grandes questões sem resposta sobre o LAM urinário como um biomarcador de TB que são essenciais para entender se há um caminho para melhorar o desempenho clínico dos testes LAM. Mais importante ainda, não é compreendido se os níveis de LAM na urina de pacientes com TB LF- LAM-negativos - especialmente pacientes HIV- e pacientes HIV+ com contagens de CD4 altas - são simplesmente muito baixos para serem medidos pelo teste atual, mas podem ser medidos por um teste com limites de detecção aprimorados. Em segundo lugar, a disponibilidade e abundância dos epítopos LAM mais relevantes e característicos de Mtb na urina são mal compreendidas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[009] Os testes diagnósticos atuais para tuberculose (TB) baseados na medição de lipoarabinomanano micobacteriano (LAM) na urina têm muitos atributos desejáveis para uso em países de baixa e média renda, como baixo custo e facilidade de uso, mas são insuficientemente sensíveis. No entanto, testes baseados em urina com maior precisão (ou seja, com maior sensibilidade clínica) seriam claramente desejáveis.

[010] A presente invenção supera essas desvantagens da técnica anterior ao fornecer um anticorpo ou combinação de anticorpos e método usando os mesmos para a detecção de um antígeno relacionado a micobactérias em uma amostra de urina de um sujeito. O anticorpo ou combinação de anticorpos e método é capaz de diferenciar entre micobactérias causadoras de doenças e outras espécies bacterianas com um alto grau de precisão.

[011] De acordo com pelo menos algumas modalidades, é fornecido um anticorpo para a detecção de um antígeno associado a micobactérias em uma amostra de urina in vitro de um sujeito, em que o referido antígeno compreende ManLAM (Lipoarabinomanano terminado com manose), o referido anticorpo se ligando especificamente às referidas moléculas de ManLAM da referida urina, em que o referido anticorpo se liga ao referido ManLAM com uma afinidade possuindo uma KD de 3x10-8 M ou menos, e em que o referido anticorpo se liga a moléculas LAM que não são terminadas ou que são terminadas com fosfato de inositol com uma afinidade tendo uma KD de 10-3 M ou mais.

[012] Opcionalmente, o ManLAM compreende ManLAM terminado com MTX, caracterizado pelas as terminações de manosídeo serem ainda modificadas por ligação de uma fração 5-desoxi-5-metiltio-xilo.

[013] Opcionalmente, o ManLAM terminado com MTX compreende ManLAM terminado com MTX-Man2 caracterizado por dois resíduos ligados a alfa 1-2-Manp que são adicionalmente substituídos com um resíduo de metilxilose ligado a alfa 1-4.

[014] Opcionalmente, o anticorpo se liga a um epítopo do referido ManLAM compreendendo uma característica Manp.

[015] Opcionalmente, o anticorpo se liga a um epítopo do referido ManLAM caracterizado por apresentar um motivo selecionado do grupo que consiste em Glycan7, Glycan8, Glycan9, Glycan10 e Glycan11.

[016] Opcionalmente, o epítopo é ainda caracterizado como apresentando uma porção de MTX-dimanose.

[017] Opcionalmente, o anticorpo é adequado para detectar a presença de uma micobactéria de crescimento lento em um sujeito usando uma amostra da urina do sujeito.

[018] Opcionalmente, o anticorpo é adequado para detectar o antígeno associado a Mycobacterium tuberculosis ou M. bovis.

[019] De acordo com pelo menos algumas modalidades, o anticorpo é capaz de detectar especificamente um antígeno associado a micobactérias causadoras de doenças e de distinguir marcadores associados a tais bactérias dos de outros tipos de bactérias.

[020] Opcionalmente, o anticorpo não apresenta reação cruzada com um marcador de micobactérias de crescimento rápido na urina do sujeito.

[021] Opcionalmente, o anticorpo não apresenta reação cruzada com um marcador associado a M. fortuitum, M. smegmatis M. abscessus ou M. chelonae.

[022] Opcionalmente, o anticorpo mostra reatividade pelo menos 10 vezes menor a um marcador associado a uma micobactéria de crescimento lento selecionada do grupo que consiste em M. gordonae. M. intracellulare e M. avium.

[023] Opcionalmente, o anticorpo detecta o antígeno associado ao referido Mycobacterium tuberculosis ou M. bovis com reatividade pelo menos 1500 vezes maior em comparação com a detecção de espécies bacterianas não micobacterianas.

[024] Opcionalmente, as espécies bacterianas não micobacterianas compreendem um ou mais dentre Gordonia bronchialis, Nocardia asteróides, Rhodococcus sp., Tsukamurella paurometabolum., Candida albicans, Corynebacterium urealyticum, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Steptocococcus audalactiae, Steptocococcus audalactilaphylococcus audalactiae, Steptocococcus audalactiae, Pudomylaphococure, agudalapticiase, Steptocugus, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenza, Enterococcus faecalis, Enterobacter aerogenes ou Chlamydia trachomatis.

[025] De acordo com pelo menos algumas modalidades, o anticorpo pode compreender uma pluralidade ou combinação de anticorpos, preferencialmente usados em um imunoensaio. Mais preferencialmente, o imunoensaio é um imunoensaio em sanduíche, no qual um anticorpo "captura" o antígeno enquanto um segundo anticorpo detecta a presença do antígeno capturado. Cada anticorpo se liga a um epítopo diferente no antígeno, para evitar competir um com o outro fora do antígeno. O anticorpo de detecção pode ter uma afinidade de ligação mais baixa para o antígeno do que o anticorpo de captura.

[026] De acordo com pelo menos algumas modalidades, o anticorpo conforme descrito neste documento é adequado para uso como um anticorpo de captura em um imunoensaio em sanduíche para detectar o antígeno.

[027] Opcionalmente, o anticorpo é adequado para uso como um anticorpo de detecção em um imunoensaio em sanduíche para detectar o antígeno.

[028] De acordo com pelo menos algumas modalidades, é fornecido um método para detectar diferencialmente uma presença de micobactérias causadoras de doenças em um sujeito, compreendendo o contato de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores com a urina do sujeito; detectar a ligação do referido anticorpo a um antígeno na urina; se o referido anticorpo se ligar especificamente ao referido antígeno na urina com uma afinidade tendo uma KD de 3x10-8 M ou menos, determinar que a referida micobactéria causadora de doença caracterizada pelas referidas moléculas ManLAM está presente no corpo do sujeito.

[029] Opcionalmente, o anticorpo liga-se a um antígeno da referida micobactéria causadora de doença na urina com um sinal pelo menos três vezes maior do que a um antígeno de micobactéria não causadora de doença.

[030] Opcionalmente, o método compreende ainda a aplicação de um primeiro anticorpo à urina, sendo o referido primeiro anticorpo caracterizado de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, para se ligar ao referido antígeno; e aplicar um segundo anticorpo à urina para se ligar a um segundo antígeno, em que o referido segundo anticorpo não se liga ao mesmo antígeno que o primeiro anticorpo, e em que os referidos primeiro e segundo antígenos compreendem as referidas moléculas ManLAM; em que um dos referidos primeiro e segundo anticorpos é um anticorpo de captura e em que o outro dos referidos primeiro e segundo anticorpos é um anticorpo de detecção em um imunoensaio.

[031] Opcionalmente, o segundo anticorpo é caracterizado por se ligar a estruturas de poli-arabinose das referidas moléculas ManLAM com uma afinidade tendo uma KD de 3x10-5 M ou menos.

[032] Opcionalmente, o anticorpo liga-se especificamente a ara4 e/ou ara6.

[033] Opcionalmente, o método compreende ainda o contato da urina com um anticorpo selecionado do grupo que consiste em anticorpos MoAb1, 13H3, 27D2 e A194-01. O anticorpo MoAb1 é descrito na Patente US NºUS9512206, incorporada por referência como se totalmente estabelecido neste documento na medida necessária para apoiar as reivindicações. O anticorpo A194-01 é descrito na Publicação do Pedido de Patente US NºUS2017016058, incorporada por referência como se totalmente estabelecido neste documento na medida necessária para apoiar as reivindicações.

[034] Opcionalmente, o método compreende ainda o contato da urina com uma combinação de uma pluralidade dos anticorpos MoAb1, 13H3, 27D2 ou A194- 1 em um imunoensaio em sanduíche.

[035] Opcionalmente, o método compreende ainda o contato da urina com uma combinação dos anticorpos MoAb1 e A194-1 em um imunoensaio em sanduíche.

[036] Opcionalmente, o método compreende ainda a aplicação do anticorpo MoAb1 a uma amostra com um segundo anticorpo adequado para atingir uma fold change de 3 ou mais entre os sinais médios de amostras de sujeitos que sofrem de tuberculose em comparação com amostras de sujeitos sem tuberculose usando um diagnóstico padrão de referência adequado para classificação dos sujeitos.

[037] Opcionalmente, o diagnóstico padrão de referência é baseado na cultura de micobactérias ou métodos baseados em PCR para classificar os sujeitos.

[038] Opcionalmente, o método compreende ainda a aplicação do anticorpo MoAb1 a uma amostra para detectar pelo menos 20% mais sujeitos que sofrem de tuberculose em comparação com amostras de sujeitos sem tuberculose usando um ensaio padrão comparativo adequado, em que o referido ensaio padrão comparativo adequado compreende o Alere LF-LAM.

[039] Opcionalmente, o sinal de imunoensaio em sanduíche específico do antígeno ManLAM detectado em uma amostra de urina de um sujeito sem tuberculose está abaixo de 11 pg ManLAM/ml para pelo menos 70% das amostras em uma população.

[040] Opcionalmente, o sinal está abaixo do limite de detecção para pelo menos 80% das amostras na população.

[041] Opcionalmente, o sinal está abaixo do limite de detecção para pelo menos 90% das amostras na população.

[042] Opcionalmente, o sinal está abaixo do limite de detecção para pelo menos 95% das amostras na população.

[043] Opcionalmente, o sinal está abaixo do limite de detecção para pelo menos 97% das amostras na população.

[044] Opcionalmente, o sinal de imunoensaio em sanduíche específico do antígeno ManLAM detectado em uma amostra de urina de um sujeito com tuberculose está acima de 11 pg ManLAM/ml para pelo menos 40% das amostras em uma população.

[045] Opcionalmente, o sinal está acima do limite de detecção para pelo menos 50% das amostras na população.

[046] Opcionalmente, o sinal está acima do limite de detecção para pelo menos 60% das amostras na população.

[047] Opcionalmente, o sinal está acima do limite de detecção para pelo menos 75% das amostras na população.

[048] Opcionalmente, o sinal está acima do limite de detecção para pelo menos 90% das amostras na população.

[049] Opcionalmente, o método compreende ainda a detecção de micobactérias causadoras de TB no sujeito na ausência do vírus HIV.

[050] Opcionalmente, uma AUC (área sob a curva) de um imunoensaio baseado na ligação dos referidos anticorpos ao referido antígeno para classificação diagnóstica binária de sujeito que sofre de tuberculose versus sujeitos sem tuberculose é de pelo menos 0,70.

[051] Opcionalmente, a AUC é de pelo menos 0,80.

[052] Opcionalmente, a AUC é de pelo menos 0,85.

[053] Opcionalmente, a AUC é de pelo menos 0,90.

[054] Opcionalmente, a AUC é de pelo menos 0,95.

[055] Opcionalmente, a AUC é de pelo menos 0,98.

[056] Opcionalmente, o método compreende ainda a aplicação de uma combinação do anticorpo MoAb1 ou o anticorpo 13H3 como o primeiro anticorpo, e o anticorpo A194-01 ou o anticorpo 27D2 como o segundo anticorpo para detectar um antígeno associado com micobactérias em uma amostra de urina in vitro de um sujeito, em um imunoensaio em que um dos primeiro e segundo anticorpos é o anticorpo de captura e o outro do primeiro e segundo anticorpos é o anticorpo de detecção.

[057] Opcionalmente, a detecção é realizada usando um imunoensaio, em que a combinação tem sensibilidade clínica pelo menos 20% maior do que o teste Alere LF-LAM.

[058] Opcionalmente, o método compreende ainda diagnosticar o sujeito com tuberculose de acordo com a presença da referida micobactéria causadora da doença no corpo do sujeito.

[059] Opcionalmente, o diagnóstico compreende ainda detectar a presença de uma infecção tubercular ativa no sujeito.

[060] Opcionalmente, o método compreende ainda monitorar a eficácia do tratamento do sujeito para tuberculose de acordo com a presença da referida micobactéria causadora da doença.

[061] Opcionalmente, o método compreende ainda concentrar o referido antígeno compreendendo ManLAM na amostra antes da detecção com o imunoensaio para aumentar ainda mais a sensibilidade clínica.

[062] Opcionalmente, a concentração do referido antígeno compreende a aplicação de grânulos magnéticos ou ultrafiltração à amostra.

[063] Opcionalmente, o método compreende ainda a diferenciação entre a presença de uma micobactéria causadora de doença no sujeito e uma micobactéria não causadora de doença no sujeito.

[064] Opcionalmente, o método compreende ainda detectar especificamente a presença de uma micobactéria causadora de doença no sujeito na presença de bactérias contaminantes de um ambiente do sujeito.

[065] Opcionalmente, bactéria contaminante compreende um ou mais dentre Gordonia bronchialis, Nocardia asteroids, Rhodococcus sp., Tsukamurella paurometabolum, Candida albicans, Corynebacterium urealyticum, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Steptocococcus agalactiae, Staphylococcus saprophyticus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenza, Enterococcus faecalis, Enterobacter aerogenes, ou Chlamydia trachomatis, ou micobactérias não tuberculosas.

[066] Opcionalmente, o método compreende ainda o aquecimento da urina antes de contatar o referido anticorpo.

[067] De acordo com pelo menos algumas modalidades, o status de HIV do sujeito não tem impacto significativo na capacidade da combinação de anticorpos e método para determinar se o sujeito está sofrendo de uma infecção por micobactéria causadora de doença. Um antígeno compreendendo Lipoarabinomanano (LAM) é detectável na urina de sujeitos com tuberculose (TB) HIV positivos e negativos.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[068] A invenção é descrita neste documento, a título de exemplo, tendo como referência as figuras em anexo. Com referência específica agora às figuras em detalhe, se enfatiza que os elementos específicos mostrados são por meio de exemplo e para propósito de discussão ilustrativa somente das modalidades preferidas da presente invenção e se apresentam na causa de fornecer o que se acredita ser a descrição mais útil e prontamente compreendida dos princípios e aspectos conceptuais da invenção. A este respeito, nenhuma tentativa é feita para mostrar os detalhes estruturais da invenção em mais detalhe do que é necessário para um entendimento fundamental da invenção, a descrição tirada com os desenhos tornando aparente para aqueles qualificados na técnica como as vários formas da invenção podem ser incorporadas na prática. Nas figuras:

[069] Figuras 1A-C. Resultados da triagem para identificar pares de anticorpos para detecção de LAM. (A) Esquema do imunoensaio em sanduíche usado para triagem e medições. (B) Mapas de calor que mostram a capacidade de cada combinação de pares de anticorpos de captura (linhas) e detecção (colunas) para detectar 10 ng/mL de LAM purificado de Mtb cultivado (mapa de calor à esquerda) e LAM na urina de indivíduos TB-positivo, HIV-positivos (mapa de calor à direita). Os mapas de calor exibem a relação sinal/branco (S/B). O valor no mapa de calor LAM urinário representa o valor máximo para amostras de urina de dois indivíduos. Os nomes dos anticorpos são codificados por cores com base nos epítopos LAM que eles visam, conforme determinado pela ligação a matrizes de glicano e os epítopos são listados ao lado dos nomes dos anticorpos de captura (ver Figura 2B e Figura 7 para detalhes dos resultados de mapeamento de epítopo). As combinações de anticorpos que mostram alta reatividade com LAM e LAM purificados na urina de indivíduos TB-positivos, HIV-positivos são indicadas com uma caixa vermelha. (C) Esquema de LAM ilustrando os diferentes epítopos listados no mapa de calor.

[070] As Figuras 1D-1E mostram a estrutura de 61 estruturas de oligossacarídeos que foram usadas para mapeamento de epítopos de anticorpos. Os oligossacarídeos selecionados (Gly 16, Gly 22 e Gly 44) foram ainda usados para o desenvolvimento de anticorpos monoclonais de coelho. A chave é mostrada na Figura 1F.

[071] A Figura 2A mostra sinais de imunoensaio em função da concentração de LAM para os anticorpos anti-LAM de melhor desempenho; MoAb1 como um anticorpo de captura combinado com o A194-01 como um anticorpo de detecção. Os pontos mostram o sinal de imunoensaio medido ao testar amostras em branco (n = 10) e 7 níveis de LAM (n = 4 por nível). As linhas sólidas mostram o ajuste 4PL aos dados. As linhas tracejadas mostram o sinal que fornece uma relação S/B de 1,375 e o limite de detecção LAM associado (LOD) calculado a partir das curvas ajustadas para ambos os pares.

[072] A Figura 2B mostra os resultados do mapeamento de epítopos usando matrizes de glicano. Reatividade de anticorpos monoclonais em uma concentração de 0,039 µg/mL para estruturas de oligossacarídeos selecionadas. As áreas verdes escuras representam forte ligação, áreas brancas sem ou baixa cegueira. A figura inclui todos os glicanos para os quais a reatividade sobre o fundo foi mostrada para pelo menos um anticorpo. A denominação na coluna um refere- se às Figuras 1D-1E.

[073] Figura 3. (A) Mapa de calor mostrando as concentrações medidas de LAM para todas as amostras de urina testadas (colunas da tabela) para cinco anticorpos de captura quando pareados com o anticorpo de detecção A194-01. As amostras são agrupadas por doadores de TB e HIV. A linha inferior da tabela fornece o grau de teste Alere LF-LAM para cada amostra para comparação (apenas as amostras com resultados de teste Alere LF-LAM positivos são coloridas). (B) O resultado da Figura 3A para o imunoensaio em sanduíche usando o par de anticorpos de captura MoAb1/detecção A194-01 são representados novamente em formato de gráfico de dispersão. O gráfico mostra o sinal medido em relação ao branco (S/B) (eixo esquerdo) e as concentrações de LAM (eixo direito) para cada amostra de urina em função do status de TB e HIV do doador. A linha laranja tracejada mostra o limite do ensaio (S/B = 1,375). Os valores de concentração são significativos apenas para pontos acima do limite do ensaio. Os pontos são coloridos pelos resultados do teste Alere LF-LAM para as mesmas amostras. Gráficos de dispersão para os outros 3 anticorpos de captura combinados com 194- 01 como um anticorpo de detecção podem ser encontrados na Figura 3C. A Figura 3C mostra o sinal medido em relação ao branco (S/B) (eixo esquerdo) e as concentrações de LAM (eixo direito) para cada amostra de urina em função do status de TB e HIV do doador. Cada gráfico mostra os resultados para um dos 3 anticorpos de captura no painel de anticorpos de captura quando pareado com o anticorpo de detecção A194-01. A linha laranja tracejada mostra o limite do ensaio (S/B = 1,375). Os valores de concentração são significativos apenas para pontos acima do limite do ensaio. Os pontos são coloridos pelos resultados do teste Alere LF-LAM para as mesmas amostras.

[074] A Figura 4 mostra um gráfico da concentração medida de LAM para um conjunto de quatro amostras de urina de pacientes TB+ HIV+ usando a combinação de anticorpo de captura MoAb1/detecção A194-01. As barras claras foram as concentrações medidas quando as amostras foram testadas sem pré- tratamento. As barras escuras representam os resultados quando as amostras foram tratadas termicamente (85 °C durante 10 minutos) antes do teste.

[075] Figura 5. Sinais de ensaios (A-B) para sujeitos TB+ divididos por (b) status de HIV e contagem de CD4 (em células por µL) e (C) teste Alere LF-LAM. Os asteriscos indicaram diferenças significativas na condição mais à esquerda (teste de Mann-Whitney, p <0,05).

[076] Figura 6. O gráfico mostra a sensibilidade e especificidade clínica observada (com intervalos de confiança de 95%) para cada anticorpo de captura candidato quando pareado com o anticorpo de detecção A194-01. O gráfico também mostra os requisitos de sensibilidade e especificidade alvo mínimo (triângulo) e ótimo (diamante) definidos pela OMS em seu documento de requisitos de perfil de produto alvo (TPP) para testes de TB POC usados para dois cenários de caso de uso diferentes: (i) detecção definitiva/diagnóstico de TB (símbolos roxos) ou (ii) triagem para identificar os pacientes que devem se submeter a mais testes de confirmação para TB (símbolos verdes). O marcador que representa o desempenho de um ensaio idealmente estaria acima e à esquerda do marcador que representa o requisito para um caso de uso (a área de interesse é destacada). Intervalos de confiança de Wilson de 95% de confiança são indicados.

[077] A Figura 7 mostra os resultados do mapeamento de epítopos usando matrizes de glicano. Reatividade de anticorpos monoclonais em seis concentrações de anticorpos diferentes para todas as 61 estruturas das Figuras 1D-1F e três pontos de controle negativo (duas vezes BSA e tampão) e um ponto de controle positivo (LS).

[078] Figura 8: Gráficos em floresta de sensibilidade e especificidade e diferenças entre Anticorpos Sob Teste e Alere LF-LAM em relação aos padrões de referência microbiológicos e compostos. (A) Todas as coortes combinadas usando um modelo de efeito aleatório bivariado para análise, (B) para as três coortes separadamente e (C) para a análise agrupada usando um modelo de efeito aleatório bivariado em três estratos de CD4. *As estimativas de sensibilidade e especificidade com base na análise usando um modelo de efeito aleatório bivariado são indicadas com um asterisco. MRS denota padrão de referência microbiológico, padrão de referência composto CRS, diferença de sensibilidade ΔSn, diferença de especificidade ΔSp, vírus da imunodeficiência humana HIV e intervalo de confiança CI.

[079] Figura 9: Diagramas de Venn. Proporções de (A) todos os diagnósticos de TB confirmados microbiologicamente (n = 141), e (B) diagnósticos de TB confirmados microbiologicamente em pacientes com CD4≤100 células/µl (n = 74), que poderiam ser feitos realizando uma única urina Anticorpos Under Medição do teste, urina Alere LF-LAM, urina Xpert, escarro Xpert ou teste de baciloscopia de escarro em amostras obtidas 24 horas após a admissão para a Coorte2. As tabelas abaixo dos diagramas de Venn relatam o rendimento do diagnóstico por método de teste. "Casos de TB perdidos pelos métodos acima" incluem aqueles feitos por cultura micobacteriana positiva em qualquer espécime coletado em qualquer ponto durante a admissão do paciente e/ou diagnósticos feitos com base no teste Xpert em qualquer espécime coletado após as primeiras

24 horas. Os números embutidos no diagrama de Venn representam o número de casos de TB diagnosticados por um determinado ensaio ou ensaios.

DESCRIÇÃO DE PELO MENOS ALGUMAS MODALIDADES

[080] Os ensaios LAM para a detecção de antígeno (s) na urina de um sujeito associado a micobactérias causadoras de doença são altamente desejáveis, porque tais testes seriam baratos e fáceis de administrar, mesmo em condições médicas e clínicas desafiadoras. A presente invenção, em pelo menos algumas modalidades, refere-se a reagentes de ensaio e métodos melhorados, para fornecer imunoensaios sensíveis para LAM usando anticorpos direcionados a uma variedade de epítopos de LAM.

[081] No geral, 8 anticorpos candidatos para LAM que foram desenvolvidos usando diferentes abordagens e que direcionaram uma variedade de motivos LAM diferentes foram avaliados. Esses anticorpos foram selecionados para identificar os pares de anticorpos que forneceram a melhor sensibilidade analítica para a detecção de LAM em formato sanduíche. Os melhores pares candidatos foram avaliados em um estudo de caso-controle retrospectivo de 75 amostras de urina de adultos HIV+ e HIV- que se apresentaram em centros de atenção primária com sintomas clínicos de TB. A reatividade cruzada dos pares candidatos também foi avaliada para bactérias e microrganismos não-TB potencialmente interferentes.

[082] Sem desejar ser limitado de qualquer forma, um aspecto da presente invenção se refere a um par de anticorpos que demonstrou, no formato de imunoensaio, excelente sensibilidade [93% (CI: 80% -97%)] e especificidade [97% (CI: 85% -100%)] em todo o conjunto de amostra (Figura 5). É importante ressaltar que o ensaio mostrou alta sensibilidade [80% (CI: 55% -93%)] mesmo quando a análise foi limitada aos sujeitos com HIV-. Em contraste, o teste comercial de fita Alere LF-LAM para LAM mostrou uma sensibilidade geral de 33% (CI: 20%-48%) e uma sensibilidade para a subpopulação de HIV- de apenas 13% (CI: 4% -38%). O par selecionado usou um anticorpo de captura que tem como alvo a estrutura da metiltio-d-xilose (MTX), que é relativamente específica para LAM de micobactérias causadoras de TB; nenhuma reatividade cruzada foi observada para micobactérias de crescimento rápido ou para actinomicetos não micobacterianos produtores de LAM, outras infecções comuns do trato urinário ou células com potencial de reação cruzada (Tabela 2A). Esta especificidade parece ser importante, pois outro anticorpo de captura menos específico para TB forneceu maior sensibilidade analítica, mas especificidade clínica mais fraca. EXEMPLO 1 - ENSAIOS BASEADOS EM LAM PARA DETECÇÃO DE UM

ANTÍGENO ASSOCIADO À DOENÇA QUE CAUSA MICOBACTERIA NA URINA

[083] Este exemplo refere-se a um ensaio ilustrativo baseado em LAM para a detecção de um ou mais antígenos na urina associados a micobactérias causadoras de doenças. Materiais e Métodos Anticorpos e materiais de controle

[084] O LAM purificado da cepa Mtb Aoyama-B foi obtido da Nacalai USA, Inc. (San Diego, EUA). LAM terminado com fosfoinosotiol (PILAM) de M. smegmatis e lisados de células inteiras inativas de Mtb e M. bovis foram obtidos do Biodefense and Emerging Infections Research Resources Repository (BEI, Manassas, EUA). Para o teste de reatividade cruzada, estoques de células vivas inteiras de uma série de diferentes cepas de bactérias e fungos foram obtidos da ATCC como frascos de células liofilizadas ou suspensões de células congeladas em glicerol. As células liofilizadas foram suspensas em 0,5 mL de albumina de soro bovino (BSA) a 2% em solução salina tamponada com fosfato (PBS). As suspensões de células de estoque foram então diluídas em série no mesmo tampão para criar amostras de teste.

[085] Uma série de anticorpos anti-LAM monoclonais e policlonais existentes foram gentilmente fornecidos por grupos acadêmicos e comerciais colaboradores, incluindo o Dr. Abe Pinter/Rutgers (A194-01) (Choudhary et al. 2018; Kaur et al. 2002; Publicação do Pedido de Patente US NºUS2017016058). Um anticorpo policlonal de coelho anti-LAM comercial (Viro Poly) foi adquirido de Virostat, Inc. (Westbrook, EUA).

[086] MoAb1, MoAb2, MoAb3 são anticorpos recombinantes isolados na Otsuka Pharmaceutical por exibição de fago de bibliotecas ScFv geradas a partir de galinhas (MoAb2) e coelhos (MoAb1 e MoAb3) imunizados com BCG e selecionados contra ManLAM (Patente US NºUS9512206). Estes anticorpos foram expressos sintetizando as sequências da região variável e inserindo-as em vetores IgG1 padrão e transfectando os plasmídeos em células Expi293.

[087] Além disso, dois anticorpos monoclonais de coelho recombinantes (13H3 e 27D2) e um anticorpo policlonal de coelho (Imm Poly) foram produzidos de novo. Os anticorpos monoclonais foram gerados usando fragmentos de oligossacarídeo LAM sintéticos acoplados a albumina de soro bovino (fornecido pelo Dr. Todd Lowary, Universidade de Alberta) como o imunogênio. Resumidamente, um coelho foi imunizado com 65 µg de BSA-Ara6 (ID 44), 65 µg de BSA-Ara7 (ID 16) e 65 µg de BSA-Ara22 (ID 22) e reforçado com a mesma mistura nos dias 7 e 14 (ver Figura 1D) para uma descrição das estruturas de oligossacarídeos). Células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) foram coletadas no dia 28 e cultivadas em placas de 96 poços. Os sobrenadantes foram testados por ELISA indireto quanto à ligação ao LAM e baixa reatividade cruzada ao BSA. Os genes de anticorpos de poços com a atividade desejada foram clonados, expressos em células HEK293 e testados por ELISA indireto para identificar os anticorpos (13H3 e 27D2) com maior reatividade para LAM purificado e Mtb H37Ra morto por calor. O anticorpo policlonal (Imm Poly) foi produzido imunizando um coelho com uma mistura de 250 µg de LAM purificado, 200 µg de Mtb H37Ra morto pelo calor e Adjuvante de Freunds Incompleto (ICFA) e reforçando com o mesmo imunogênio nos dias 28, 47 e 67. O soro coletado no dia 76 foi purificado por cromatografia de afinidade em uma coluna de Proteína A.

[088] 13H3 tem a seguinte sequência de região variável traduzida:

[089] 13H3 Cadeia pesada (a sequência sublinhada indica o início da região constante):

METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTASGSDIFTYYMNW VRQARGKGLEWIGYINTGGSAWYSSWAKGRFTISRTSTTVTLKMTSPTTEDTAT YFCARAIGGGAAGGDLWGQGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAP

[090] Cadeia 13H3 Kappa: (a sequência sublinhada indica o início da região constante)

[091] MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAIVMTQTPSSKSVPVGDTVTINCQ

ASESVANNNDLAWYQQKPGHSPKLLIYFASTLASGVPSRFKGSGFGTQFTLTISG AQCDDAATYYCTGYKGFNTDGMAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAA

[092] 27D2 tem a seguinte sequência de região variável traduzida: 11H3/11K2

[093] Cadeia pesada 27D2 (a sequência sublinhada indica o início da região constante):

[094] METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEEFGGRLVTPGTPLTLTCTVSGF

SLSRKWMSWVRQAPGKGLEWIGIITDSGSTYYASWVNGRFTISKTSTTVTLKITS PSTEDTATYFCGKDDYIYGDLWGSGTLVTVSSGQPKAPSVFPLAP

[095] Cadeia Kappa 27D2: (a sequência sublinhada indica o início da região constante)

[096] MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAQVLTQTPASVSAAVGGTVTISCQ

SSQSVYNNNWLAWYQQKPGQPLKQLIYAASSLASGVPSRFKGSGSGTQFTLTIS DLECDDAATYYCQGGYTTHARAFGGGTEVVVKGDPVAPTVLIFPPAA

[097] Todos os anticorpos foram analisados para identificar os epítopos de oligossacarídeos reconhecidos pelos seus sítios de ligação. A identificação do epítopo foi realizada medindo a ligação dos anticorpos a matrizes de glicano que apresentam um conjunto diverso de 61 estruturas de oligossacarídeos, conforme descrito em (Choudhary et al. 2018). O conjunto de estruturas é mostrado nas Figuras 1D-1F. Resumidamente, fragmentos de oligossacarídeos foram sintetizados conforme descrito anteriormente (Gadikota et al. 2003; Joe et al. 2006; Joe et al. 2007; Sahloul & Lowary 2015) conjugados com BSA e usados para gerar microarrays. Diluições em série de anticorpos foram incubadas nas lâminas por 30 minutos a 37 °C e, após lavagem, durante 40 minutos coradas com anticorpos anti- espécies secundários marcados com fluorescência. Sinais de florescência foram medidos usando um scanner GenePix 4000B (Molecular Devices, Sunnyvale, EUA) e a intensidade de cada ponto foi quantificada usando ProMicroarray Image Analysis Software 6.1. Imunoensaios LAM

[098] Os imunoensaios para LAM empregando um formato de imunoensaio em sanduíche multiplexado (Figura 1A) e detecção de eletroquimioluminescência (ECL) foram realizados em instrumentação comercial e consumíveis de placa de múltiplos poços da Meso Scale Diagnostics, LLC. (MSD) (Debad et al. 2004). Os ensaios foram executados em placas de 96 poços U-PLEX® da MSD. No fundo de cada poço da placa há uma matriz de 10 plex de reagentes de ligação imobilizados em um eletrodo de tinta de carbono impresso em tela integrado. Cada um dos 10 reagentes de ligação se liga a um de um conjunto de 10 ligantes proprietários. Em ensaios U-PLEX, diferentes reagentes de captura são acoplados a diferentes ligantes. As matrizes dos reagentes de captura nas placas são formadas conforme necessário, adicionando uma mistura do anticorpo de captura - conjugados de ligante ao poço e permitindo que os ligantes se automontem em seus elementos de matriz complementares (ou "pontos"). Matrizes de anticorpos anti-LAM foram usadas para comparar o desempenho de anticorpos de captura múltipla em uma única medição multiplexada.

[099] Os anticorpos foram preparados para uso nos ensaios de acordo com os procedimentos na bula do U-PLEX. Os reagentes de captura foram biotinilados com Sulfo-NHS-LC-Biotina (Thermo Fisher Scientific) e acoplados via ligação de estreptavidina-biotina a ligantes U-PLEX. Os anticorpos de detecção foram marcados com o marcador MSD SULFO-TAGTM ECL. Para preparar as matrizes de anticorpos de captura, até10 conjugados de anticorpo-ligante foram combinados em Tampão de Interrupção U-PLEX a uma concentração de 2,9 µg/mL por anticorpo e 50 µL desta mistura foram adicionados a cada poço das placas U-PLEX. As placas foram incubadas durante uma hora com agitação para permitir que as matrizes de anticorpos se montassem e depois lavados. As placas foram usadas imediatamente ou armazenadas a 4 °C em uma bolsa dessecada até que fossem necessárias.

[100] A menos que indicado de outra forma, os ensaios foram executados de acordo com o seguinte protocolo usando diluentes comerciais de MSD que incluem componentes de bloqueio para evitar sinais não específicos de anticorpos humanos anticamundongo (HAMAs) ou outras proteínas de ligação a anticorpos não específicos. Matrizes de captura de anticorpos foram pré-formados em uma placa U-PLEX conforme descrito acima. O Diluente MSD 22 (25 µL) foi combinado com 25 µL de amostra em cada poço da placa U-PLEX e a mistura foi incubada com agitação durante 1 hora à temperatura ambiente para ligar LAM na amostra à matriz de captura de anticorpos no poço. Depois de lavar os poços para remover a amostra não ligada, 25 µL de anticorpo de detecção marcado com SULFO-TAG 2 µg/mL (em MSD Diluent 3 suplementado com caseína) foi adicionado e incubado por uma hora adicional com agitação para completar o imunoensaio em sanduíche.

Depois de lavar os poços para remover o anticorpo de detecção não ligado, os poços foram cheios com 150 uL de tampão de leitura T 2 X MSD e o ECL foi medido em um leitor de placas MSD Sector® S 600 ECL. O leitor de placas aplica uma voltagem aos eletrodos nas placas MSD para induzir ECL dos anticorpos de detecção ligados e usa uma câmera CCD arrefecida para quantificar a emissão de luz de cada ponto da matriz (Debad et al. 2004). Durante a triagem de pares de anticorpos, todas as combinações possíveis de anticorpos de captura e detecção de anticorpos A194-01, 27D2, 13H3, MoAb1, MoAb2, MoAb3, Imm Poloy, Viro Poly foram avaliadas com LAM purificado de cultura Mtb e urina de indivíduos TB+/HIV+ (Figura 1B). A avaliação de ensaio mais detalhada foi realizada em um painel específico que combinou uma matriz de anticorpos de captura (MoAb1, 13H3, 27D2, MoAb3) e os anticorpos de detecção A194-01 ou 27D2 (Figura 3A). Quantificação LAM

[101] Para calcular as concentrações de LAM, uma curva de calibração de 8 pontos com LAM purificado (diluído em MSD Diluent 100) foi executada em duplicata em cada placa de ensaio. A relação do sinal ECL com a concentração LAM foi ajustada a uma função logística de 4 parâmetros (4-PL). As concentrações de LAM para as amostras de teste foram calculadas por retrocesso de sinais ECL para o ajuste 4-PL. Uma curva de calibração exemplificativa é mostrada na Figura 2A. Preparação de Amostra de Urina

[102] Para inativar quaisquer anticorpos anti-LAM, as amostras foram pré- tratadas antes da análise por tratamento térmico a 85 °C durante 10 minutos. Coleta de amostras e testes de diagnóstico

[103] Para este estudo caso-controle retrospectivo, um total de 75 amostras de urina foram selecionadas do biobanco FIND (Genebra, Suíça). Essas amostras foram coletadas anteriormente em estudos de adultos que se apresentaram em sítios de atenção primária em Bangladesh (n = 5), Peru (n = 19), África do Sul (n = 15) e Vietnã (n = 36) com sintomas clínicos de TB, mas não receber tratamento para TB no momento da coleta da amostra. A aprovação pelo Comitê de Ética local e o consentimento informado do paciente foram obtidos antes da inscrição dos pacientes e nenhuma informação de identificação pessoal estava disponível para o FIND ou para os pesquisadores.

[104] FIND usa protocolos padronizados para coleta e processamento de amostras. Resumidamente, a urina foi coletada no primeiro contato com o paciente, processada, aliquotada e congelada (-80 °C) no mesmo dia (normalmente em 4 horas). IVDs pré-qualificados da OMS foram usados para testes sorológicos de HIV e contagem de CD4. Para uso na classificação de pacientes, amostras de escarro (normalmente duas nas primeiras 24h) também foram coletadas para todos os participantes, descontaminadas e cultivadas até 6 vezes usando cultura líquida (MGIT, BD, Franklin Lakes, EUA) e cultura sólida (Loewenstein- Mídia Jensen). A presença do complexo Mtb em culturas foi confirmada por microscopia de fluorescência de Ziehl-Neelson ou Auramine-O para identificar bacilos álcool-ácido resistentes, detecção de antígeno MPT64 usando ensaios de especiação rápida (como o teste Capilia TB, TAUNS, Japão) ou métodos moleculares. Classificação de pacientes e padrão de referência composto

[105] Os pacientes foram classificados usando um padrão de referência composto com base em achados clínicos e laboratoriais, conforme descrito em outro lugar (Broger et al. 2017). TB-positivos (TB+) eram pacientes com pelo menos uma cultura positiva. Todos os pacientes com TB+ tiveram resultados de microscopia positivos. Os participantes com baciloscopia negativa e cultura negativa em ≥4 culturas em todas as amostras de escarro e que exibiram resolução dos sintomas na ausência de tratamento para tuberculose e resultados negativos de cultura de escarro na visita de acompanhamento de 2 meses foram classificados como TB-. Os sujeitos foram ainda classificados como HIV+ ou HIV- com base em testes rápidos de HIV (Tabela 3A, ver abaixo). Testes rápidos para LAM

[106] As amostras de urina foram testadas usando o teste Alere LF-LAM executado de acordo com as instruções do fabricante. A tira foi lida por três técnicos diferentes, independentemente, que compararam a intensidade da linha de teste com o cartão de referência fornecido pelo fabricante e classificaram os resultados. Para documentação, todas as tiras foram digitalizadas. Resultados

Geração e Seleção de Anticorpos

[107] Para identificar pares de anticorpos potencialmente úteis para uso em imunoensaios em sanduíche, uma biblioteca pré-existente de anticorpos foi testada (A194-01, 27D2, 13H3, MoAb1, MoAb2, MoAb3, Imm Poloy, Viro Poly) em todas as combinações de pares possíveis de captura e anticorpo de detecção. Cada par foi então testado para avaliar seu sinal de fundo para uma amostra em branco, seu sinal específico para LAM purificado de Mtb cultivado e seu sinal específico para LAM urinário na urina de dois sujeitos humanos HIV-positivos, TB-positivos conhecidos por conterem um alto nível de LAM (com base na positividade com o teste Alere LF-LAM). Para conservar a amostra, cada poço de teste tinha uma série de anticorpos de captura, mas foi desenvolvido usando um único anticorpo de detecção. Esta abordagem de multiplexação permitiu que até 10 pares de anticorpos de captura e detecção fossem avaliados em paralelo em um único poço.

[108] A Figura 1B fornece mapas de calor exibindo a razão de sinal para branco (S/B) alcançada com cada par de anticorpos. A figura também agrupa e codifica anticorpos por cor com base na especificidade dos anticorpos para diferentes epítopos LAM (Figura 1C), conforme caracterizado usando matrizes de glicano ((Choudhary et al. 2018) e Figura 2B). Muitos pares de anticorpos mostraram alta reatividade ao LAM purificado, mas eram relativamente fracos na detecção de LAM urinário. Em particular, apenas dois anticorpos (A194-01 e 27D2) foram úteis como anticorpos de detecção para detectar LAM na urina. O anticorpo A194-01 foi o mais sensível dos dois, dando sinais 2 a 5 vezes maiores na urina do paciente. Ambos os anticorpos têm como alvo estruturas tetra-arabinosídeo linear (Ara4) ou hexa-arabinosídeo ramificado (Ara6) no domínio arabinano de LAM. A especificidade de 27D2 para Ara6 confirmou a utilidade de fragmentos de glicanos LAM sintéticos acoplados a BSA como imunogênios para o desenvolvimento de anticorpos com especificidade para epítopos LAM definidos. Surpreendentemente, um anticorpo (MoAb2) forneceu sinais elevados quando usado como um anticorpo de detecção para medir LAM purificado de Mtb cultivado, mas não ao medir LAM urinário. Os estudos de matriz de glicano indicam que este anticorpo tem como alvo epítopos LAM, os caps di- ou trimanosídeo (Man2 ou Man3), que são relativamente específicos para Mtb (Mishra et al. 2011; Chan et al. 2015). Sem querer se limitar a uma única hipótese, é possível que as cápsulas Manp (Man1, Man2, Man2) sem MTX não sejam estáveis na urina, por exemplo, porque podem ser degradadas (por exemplo, por enzimas ou outro mecanismo) e, portanto, esses epítopos não estão disponíveis na maioria das amostras de urina.

[109] As diferenças nas reatividades relativas ao LAM de cultura e urina também foram observadas para anticorpos de captura. Quase todos os anticorpos de captura forneceram sinais elevados para LAM purificado de Mtb cultivado quando combinado com A194-01 como o anticorpo de detecção, incluindo anticorpos direcionados à estrutura ramificada Ara4 e Ara6 (A194-01, 27D2, 13H3), os caps Man2 ou Man3 (MoAb3 e MoAb2) e Man2 ou Man3. De acordo com seu comportamento como um anticorpo de detecção, quando MoAb2 (que tem como alvo principal Man2 e Man3 caps) foi usado como um anticorpo de captura, ele também forneceu nenhum ou muito baixo sinal para LAM urinário. O MoAb1 que tem como alvo o Manp-MTX forneceu os sinais mais elevados na urina de indivíduos TB+/HIV-. Sem desejar se limitar a uma única hipótese, é possível que o motivo MTX proteja Manp da degradação resultante da presença desses epítopos na urina do paciente. Como resultado, o MoAb1 é um anticorpo de captura atraente, muito reativo e específico. Para comparar de forma eficiente o potencial clínico desses reagentes de ligação e para obter um maior entendimento da abundância de estruturas LAM na urina, oito pares foram desenvolvidos e avaliados usando um painel multiplexado de quatro anticorpos de captura cobrindo uma gama de especificidades de epítopo (13H3, 27D2, MoAb1, MoAb3) e dois anticorpos de detecção (A194-01 e 27D2). Desempenho do Ensaio Analítico

[110] A Figura 2A mostra a curva de calibração criada executando 8 níveis de LAM purificado para o par de anticorpos de melhor desempenho (MoAb1 como captura combinado com A194-01 como anticorpo de detecção). A curva representa o sinal do ensaio em função da concentração de LAM. Os coeficientes de variação (CVs) intraplaca para a amostra em branco (sem LAM) foi ≤15% para todos os quatro anticorpos de captura com A194-01 como anticorpo de detecção (Tabela 1A). Tabela 1A

Resultados Usando A194-01 como Anticorpo de Detecção Sinal em Branco Sinal Cal Est. LOD Captura Ab ECL [LAM] (pg/mL)

ECL ECL CV CV a S/B = 1,375 13H3 1,128 7% 3% 210 27D2 6,492 6% 4% 2,500 MoAb1 264 12% 3% 11 MoAb3 2,062 6% 5% 59 Tabela 1A. A tabela resume o desempenho analítico de quatro anticorpos de captura anti-LAM diferentes quando combinados com o anticorpo de detecção A194-01. Os resultados foram determinados a partir de curvas de calibração de 8 pontos, conforme descrito na Figura 2A. As primeiras duas colunas de dados mostram o sinal médio e o CV para a amostra em branco (n = 14). O terceiro mostra o CV médio para padrões de calibração fornecendo sinais acima do limite de detecção de 1,375 vezes acima do sinal em branco (com base em 4 repetições por concentração de LAM). A coluna final mostra as estimativas para LOD com base na concentração de LAM que se espera que forneça um sinal igual ao limite de detecção calculado pelo ajuste posterior para o melhor ajuste 4-PL à curva de calibração.

[111] Com base nesses resultados, um sinal de 37,5% acima do branco (S/B = 1,375) foi definido como um limite de sinal que foi de pelo menos 2,5 desvios padrão acima do sinal do branco para todos os ensaios. Os CVs para os sinais em branco foram dominados pelo ruído eletrônico do sistema (± 30 contagens); conforme os sinais aumentaram acima dos sinais em branco, os CVs diminuíram consideravelmente. Em média, os CVs para níveis de LAM acima desse limite estavam entre 3 e 4% para todos os 12 pares. A Tabela 1A e a Figura 2A também fornecem os limites de detecção (LODs) com base no limiar do sinal. Devido ao sinal mais alto para as proporções de fundo fornecidas pelos anticorpos de captura MoAb1, este anticorpo de captura forneceu detecção mais sensível de calibradores LAM purificados e LODs de 11 pg/ml. Quando usado como um anticorpo de detecção, 27D2 forneceu resultados que foram altamente correlacionados aos resultados obtidos usando A194-10 (dados não mostrados), mas tendeu a fornecer sinais mais baixos e limites de detecção mais altos. Devido à alta correlação e especificidades de epítopo semelhantes dos dois anticorpos, a análise é focada nos resultados obtidos com o anticorpo de detecção A194-01 mais sensível. No entanto, 27D2 pode ser usado como um substituto de A194-01 no lado do detector. Preparação de Amostras

[112] Antes do teste no ensaio, as amostras de urina foram tratadas termicamente a 85°C durante 10 minutos para inativar quaisquer anticorpos anti- LAM que possam estar presentes nas amostras. Poucas evidências foram encontradas de que os anticorpos interferentes estavam presentes nessas amostras, pois os sinais geralmente não foram alterados ou aumentaram apenas ligeiramente pelo tratamento térmico (Figura 4). No entanto, como o tratamento térmico não pareceu ter nenhum impacto negativo na detecção de LAM, foi decidido manter a etapa de tratamento térmico no trabalho subsequente.

[113] Para avaliar os efeitos da matriz no desempenho do ensaio, os seguintes experimentos foram realizados: (i) experimentos de recuperação de pico para mostrar que LAM adicionado em amostras clínicas de urina forneceu os níveis de LAM medidos esperados, quando comparados a uma curva de calibração gerada usando padrões de calibração LAM preparados em um diluente calibrador sintético (como na Figura 2A) e (ii) experimentos de linearidade de diluição para mostrar que os níveis medidos em amostras de urina diminuíram linearmente com a diluição da urina no diluente calibrador. As recuperações médias para os experimentos de pico e diluição estavam na gama aceita de 80% a 120% para todos os anticorpos de captura, exceto para 27D2 (Tabela 1B). 27D2 teve recuperações de pico consistentemente baixas, indicando que pode estar sujeito a algum grau de interferência da matriz que não era corrigível pelo aquecimento das amostras. Tabela 1B Anticorpo de Captura 13H3 27D2 MoAb1 MoAb3 Amostr a Status TB+HIV 1 + 100% 52% 102% 90%

TB+HIV 2 + 106% 56% 102% 95% TB+HIV 3 + 98% 67% 107% 112% 4 TB-HIV- 95% 72% 104% 97% 5 TB-HIV- 101% 62% 52% 31% 6 TB-HIV- 90% 58% 91% 73% 7 TB-HIV- 100% 71% 117% 104% Média 99% 63% 96% 86% Amostr a Status TB+HIV 1 + 107% 104% 105% 126% TB+HIV 2 + 120% 98% 94% 157% TB+HIV 3 + 94% < LOD 121% 100% TB+HIV 4 + 88% < LOD 99% 110% 5 TB+HIV- 102% 101% 101% 125% Média 102% 101% 104% 124%

[114] A Tabela 1B mostra a recuperação do pico e a linearidade de diluição para cada um dos quatro anticorpos de captura quando pareados com o anticorpo de detecção A194-01. A recuperação do pico é a concentração de LAM medida para o LAM purificado adicionado a uma amostra de urina, em relação ao valor teórico esperado. Cada entrada é a recuperação média para três concentrações (300, 3.000 e 30.000 pg/ml) de pico de LAM adicionado a uma amostra. A recuperação na diluição é a concentração de LAM medida para uma amostra de urina LAM-positiva diluída em relação ao valor esperado com base no LAM urinário medido na amostra não diluída (os níveis de LAM nas amostras não diluídas variaram de aproximadamente 1.000 a aproximadamente 200.000 pg/mL). Cada valor é a recuperação média para quatro diluições variando de 1:2 a 1:16. A tabela também mostra os valores médios em todas as amostras testadas. Reatividade cruzada

[115] Os ensaios LAM foram testados para reatividade cruzada contra um painel de 10 diferentes espécies de micobactérias e 20 diferentes microrganismos não micobacterianos que poderiam estar potencialmente presentes em amostras de urina. A Tabela 2A fornece as razões de sinal para branco medidas com cada anticorpo de captura quando pareado com o anticorpo de detecção A194-01. Tabela 2A Anticorpo de Captura 13H3 27D2 MoAb1 MoAb3 Sinal de ensaio para amostra em branco Branco 1,897 13,744 235 5,414 Razão de sinal para branco (S/B) para diluição de 1:1.000 de espécies de Mycobacterium M. tuberculosis, H37Rv* 1,342 439 1,977 99 M. bovis* 778 321 3,324 136 M. fortuitum 556 372 ND 691 M. smegmatis 4,033 669 ND 1,791 M. abscessus 37 23 ND 109 M. chelonae 9 5,2 ND 28 M. gordonae* 11 4 25 8 M. intracellulare* 3 3 129 18 M. avium* ND ND 1,4 3 M. kansasii* 4 2 10 7 Razão de sinal para branco (S/B) para diluição de 1:100 de não micobactérias (S/B > 1,375 para pelo menos um ensaio)

Anticorpo de Captura Gordonia bronchialis 2 9 ND 59 Nocardia asteroides 2 25 ND 62 Rhodococcus sp. 14 170 ND 359 Tsukamurella paurometabolu m 26 57 ND 42 Organismos com S/B ≤ 1,375 em 1:100 de diluição para todos os anticorpos de captura Candida albicans, Corynebacterium urealyticum, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus saprophyticus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenza, Enterococcus faecalis, Enterobacter aerogenes, Chlamydia trachomatis

[116] A Tabela 2A mostra a reatividade cruzada dos ensaios LAM para um conjunto de microrganismos. Os resultados são fornecidos para os quatro anticorpos de captura indicados quando pareados com o anticorpo de detecção A194-01. As razões de sinal para branco (S/B) listadas foram medidas em uma diluição de 1:10.000 (amostras micobacterianas) ou diluição de 1:100 (amostras não micobacterianas) de preparações de estoque obtidas de ATCC ou BEI. Os dados são mostrados apenas para organismos que deram razões S/B maiores do que o limite do ensaio (1,375) para pelo menos um anticorpo de captura na diluição listada. Os microrganismos com reatividade cruzada indetectável para todos os ensaios com base neste limite estão listados na parte inferior da tabela. Todas as preparações testadas eram células vivas inteiras, exceto para Mtb e M. bovis (lisados de células inteiras mortas) e M. smegmatis (PILAM purificado a partir de lisados celulares). ND (não detectável) indica que (i) a razão S/B medida foi inferior a 1,375 ou (ii) o sinal no ponto do anticorpo de captura específico era muito baixo em relação aos sinais nos outros pontos (< 0,2%) para com precisão medir a reatividade cruzada. As micobactérias de crescimento lento são indicadas com um asterisco*.

[117] Na concentração mais alta testada (diluição 1:100 do estoque ATCC ou materiais BEI), apenas quatro das espécies não micobacterianas forneceram valores S/B maiores do que o limite de ensaio de 1,375 para pelo menos um anticorpo de captura (Nocardia asteroids, Gordonia bronchialis (Tsukamura), Rhodococcus sp., Tsukamurella paurometabolum). A força da reatividade cruzada para essas quatro espécies variou consideravelmente entre os diferentes anticorpos de captura. 27D2 e MoAb3 mostraram as reatividades cruzadas mais fortes para todas as quatro espécies. O 13H3 também apresentou reação cruzada com as quatro espécies, mas apresentou sinais que foram uma a duas ordens de magnitude menor. MoAb1 forneceu a melhor discriminação e não exibiu reatividade cruzada mensurável contra qualquer uma das espécies não micobacterianas nas concentrações testadas.

[118] Como esperado, todos os anticorpos de captura forneceram sinais fortes para as espécies de micobactérias causadoras de TB Mtb e M. bovis; o teste de diluições 1:1.000 dessas preparações bacterianas deu sinais que estavam acima dos níveis de saturação para os ensaios. Grandes diferenças, no entanto, foram observadas na reatividade cruzada dos diferentes anticorpos de captura para outras espécies de micobactérias testadas nesta diluição. Todos os anticorpos de captura, exceto MoAb1, forneceram reatividade cruzada muito alta para as espécies de crescimento rápido M. fortuitum e M. smegmatis e forneceram sinais de saturação na diluição de 1:1000. Em contraste, quando MoAb1 foi usado como o anticorpo de captura, a reatividade cruzada para essas duas espécies foi pelo menos três ordens de magnitude menor do que a dos outros anticorpos de captura; e abaixo do limite de detecção. Com exceção de M. intracellulare, MoAb1 também tendeu a ter menor reatividade cruzada para as outras espécies de mycobacterium, embora os sinais para essas espécies tendessem a ser mais baixos e as diferenças entre os anticorpos de captura tendessem a ser menores. No geral, a combinação Captura MoAb1/Detecção A194-01 mostrou excelente especificidade sem reatividade cruzada para todos os microrganismos não-micobacterianos, agora reatividade cruzada para micobactérias de crescimento rápido e apenas reatividade cruzada de baixo nível para micobactérias não tuberculosas de crescimento lento (pelo menos 10 vezes menos reatividade em comparação com Mtb). Teste de Amostras Clínicas

[119] A Tabela 3A fornece as características da população do estudo. Tabela 3A TB negativo TB Positivo Todos os HIV HIV

HIV HIV Sujeitos negativ positiv negativo positivo o o Categoria Nºde Sujeitos Todos os 75 20 15 15 25 sujeitos Gênero Feminino 21 6 3 5 7 Masculino 49 9 12 10 18 NA 5 5 0 0 0 Idade 0 a 20 1 1 0 0 0 21 a 40 45 5 9 12 19 41 a 60 25 13 6 2 4 61+ 2 1 0 1 0 NA 2 0 0 0 2 Local Banglades 5 5 0 0 0 h Peru 19 3 14 2 0 África do 15 2 0 5 8 Sul Vietnã 36 10 1 8 17 Contagem de CD4

<= 100 14 0 0 0 14 células/uL > 100 8 0 0 0 8 células/uL NA 53 20 15 15 3 Alere Negativo 62 20 15 13 14 Positivo 13 0 0 2 11

[120] A Tabela 3A mostra as características da população do estudo discriminadas por TB e HIV. NA indica que a informação para a característica especificada não estava disponível para um sujeito de estudo. As contagens de células CD4 estavam disponíveis apenas para sujeitos TB/HIV+.

[121] As amostras eram do repositório FIND (Genebra, Suíça) de amostras clínicas de TB e foram selecionadas para incluir uma gama de localizações geográficas (Ásia, África e América do Sul) e para cobrir as diferentes combinações de TB e HIV. As contagens de CD4 estavam disponíveis para a maioria dos sujeitos TB+/HIV+ e incluíam sujeitos acima e abaixo do limite de 100 células/uL usado no algoritmo da OMS para identificar pacientes imunocomprometidos com maior probabilidade de se beneficiar do teste Alere LF-LAM. De acordo com os estudos clínicos sobre o desempenho clínico do teste Alere, a sensibilidade do teste Alere para este painel de amostras de urina foi de 44% (11/25) para sujeitos HIV+, mas apenas 13% (2/15) para sujeitos com HIV-.

[122] A Figura 3A é um mapa de calor que mostra as concentrações medidas de LAM para o conjunto de amostra completo em função do status de TB e HIV. O mapa de calor compara as concentrações medidas com os quatro anticorpos de captura quando A194-01 foi usado como o anticorpo de detecção. Todas as capturas mostraram concentrações mensuráveis de LAM na maioria das amostras de urina de indivíduos HIV+/TB+, mas apenas MoAb1 e 13H3 detectaram LAM na urina de uma proporção significativa de indivíduos HIV-/TB+. Destes dois, apenas MoAb1 forneceu boa discriminação de indivíduos TB+ e TB-, uma vez que o 13H3 detectou LAM ou estruturas relacionadas com LAM na urina de muitos dos indivíduos TB-. As diferenças de desempenho para o MoAb1 e os outros três anticorpos de captura (13H3, 27D2, MoAb3) são mostradas mais claramente nos gráficos de dispersão nas Figuras 3B e 3C. Qualitativamente, os sinais de 13H3 e MoAb1 para amostras de doadores TB+ foram bem separados do limite de ensaio. O comportamento desses dois anticorpos com amostras de TB-, entretanto, foi consideravelmente diferente. 13H3 deu uma ampla distribuição de sinais para amostras TB-. Em contraste, os sinais para amostras de TB- usando o anticorpo de captura MoAb1 mais específico de TB- foram compactados perto do sinal em branco com o sinal mais alto para uma amostra de TB- com um valor S/B de cerca de 1,8 e todas as outras amostras fornecendo sinais abaixo o LOD de 11 pg/ml. A codificação de cores pelo resultado do teste Alere LF-LAM mostra que os sinais LAM detectáveis com o teste Alere estão uma a duas ordens de magnitude acima dos limites de detecção para o imunoensaio usando o anticorpo de captura MoAb1, e que havia uma série de amostras de indivíduos TB+ que foram detectáveis com o imunoensaio, mas não com o teste de Alere, levando a um aumento drástico da sensibilidade do imunoensaio baseado em Capture MoAb1/Detector A194-01.

[123] A Tabela 4 fornece a sensibilidade e especificidade medidas dos ensaios LAM para o conjunto de amostras de teste. Como um indicador da separação entre os sinais de ensaio para os grupos TB- e TB+, a Tabela 4 também fornece os valores da área sob a curva (AUC) da análise da curva de operação do receptor (ROC). Tabela 4 Sensibilidade Especificidade AUC Status de Captura % % (95% HIV Ab Correto/Total (95% Correto/Total (95% de de CI) de CI) CI) 97% 93% 0,98 (85% MoAb1 37/40 (80% 34/35 (0,95- - Todos -97%) 1,00) 100%) 70% 86% 0,81 13H3 28/40 30/35 (55% (71% (0,71-

-82%) -94%) 0,91) 97% 35% 0,73 (85% 27D2 14/40 (22% 34/35 (0,62- - -50%) 0,85) 100%) 53% 80% 0,73 MoAb3 21/40 (37% 28/35 (64% (0,61- -67%) -90%) 0,84) 100% 80% 0,95 (84% MoAb1 12/15 (55%- 20/20 (0,87- - 93%) 1,00) 100%) 40% 85% 0,60 13H3 6/15 (20% 17/20 (64% (0,40- -64%) -95%) 0,80) HIV Neg. 95% 13% 0,50 (76% 27D2 2/15 (4% - 19/20 (0,30- - 38%) 0,70) 100%) 27% 80% 0,54 MoAb3 4/15 (11% 16/20 (58% (0,34- -52%) -92%) 0,74) 100% 93% 0,99 (87% (70% MoAb1 25/25 14/15 (0,97- - - 1,00) 100%) 100%) HIV Pos. 88% 87% 0,96 13H3 22/25 (70% 13/15 (62% (0,90- -96%) -96%) 1,00) 48% 100% 0,89 27D2 12/25 15/15 (30% (80% (0,80-

-67%) - 0,99) 100%) 68% 80% 0,88 MoAb3 17/25 (48% 12/15 (55%- (0,76- -83%) 93%) 0,99) 100% 33% 0,66 (90% Todos 13/40 (20% 35/35 (0,59- - -48%) 0,74) 100%) 100% 13% 0,57 Teste (84% HIV Neg. 2/15 (4% - 20/20 (0,48- Alere - 38%) 0,66) 100%) 100% 44% 0,72 (80% HIV Pos. 11/25 (27% 15/15 (0,62- - -63%) 0,82) 100%)

[124] A Tabela 4 mostra a precisão dos ensaios LAM usando o painel selecionado de quatro anticorpos de captura (Abs) e A194-01 como um anticorpo de detecção em comparação com o Alere LF-LAM no mesmo conjunto de amostra. A tabela fornece a sensibilidade medida (amostras TB+ classificadas corretamente/número total de amostras TB+) e especificidade (amostras TB- classificadas corretamente/número total de amostras TB-) para cada um dos quatro anticorpos de captura. Os valores foram calculados para o conjunto de amostras completo (Todos) ou para os subconjuntos de amostras de indivíduos HIV e HIV+. Intervalos de confiança de 95% (IC) para a proporção foram calculados usando o método de Wilson. A tabela também fornece os valores de AUC da análise ROC, incluindo limites de confiança conforme determinado por bootstrapping. Para comparação, as três linhas inferiores apresentam as métricas de desempenho análogas para o teste Alere LF-LAM para o mesmo conjunto de amostra.

[125] Devido à sua combinação de alto sinal para amostras TB+ (incluindo amostras de indivíduos HIV-) e distribuição restrita de sinais abaixo do LOD para amostras TB-, o valor de AUC para o ensaio usando o anticorpo de captura MoAb1 [0,98 (0,95-1,00)] - foi significativamente melhor do que a AUC para os outros anticorpos de captura. Ao examinar apenas as amostras de HIV, a diferença entre MoAb1 [0,95 (0,87 - 1,00)] e 13H3 [0,60 (0,40-0,80)] foi ainda maior.

[126] As diferenças de AUC foram refletidas na maior precisão observada do ensaio usando MoAb1 [sensibilidade geral = 93% (80% -97%; 37/40), especificidade = 97% (85% -100%; 34/35) em um corte de 11 pg/ml], em relação a 13H3 [sensibilidade geral = 70% (55% -82%, 28/40), especificidade = 86% (71% - 94%); 30/35 com um corte de 210 pg/ml)]. O ensaio usando o anticorpo de captura MoAb1 foi cerca de 3 vezes mais sensível do que o ensaio Alere LF-LAM [sensibilidade geral = 33% (20-48%; 13/40), especificidade 100% (90-100%; 35/35)] enquanto mantém uma alta especificidade. O ensaio usando o anticorpo de captura MoAb1 foi perfeito na identificação de amostras TB+/HIV+ [sensibilidade MoAb1 = 100% (87% -100%; 25/25)].

[127] A Figura 5 mostra as associações do sinal do ensaio (para o ensaio usando o anticorpo de captura MoAb1 e o anticorpo de detecção A194-01) com contagens de CD4 e resultados do teste Alere LF-LAM. Os indivíduos HIV+ que estavam fortemente imunossuprimidos (CD4 &lt; 100 células/µl) tinham níveis significativamente mais elevados de LAM do que os indivíduos HIV (Figura 5B). Os níveis aumentados de LAM pareceram correlacionar-se com a imunossupressão, visto que não houve diferença significativa entre indivíduos HIV+ com contagens de CD4 > 100 células/µL e indivíduos HIV. Confirmando a imagem qualitativa da Figura 3B, a Figura 5A mostra que o alto grau de Alere LF-LAM está associado a sinais de ensaio muito altos. A figura também destaca o número significativo de indivíduos TB+ que apresentam sinais baixos, mas detectáveis pelo imunoensaio, mas não são detectados pelo teste de Alere. Suporte adicional para especificidade do anticorpo de captura MoAb1

[128] Embora a sensibilidade e especificidade observadas do par de anticorpos MoAb1/A194-01 tenham sido excelentes, os sinais observados para indivíduos TB+/HIV- tendiam a ser baixos e próximos do limiar do ensaio: a urina de indivíduos TB+/HIV- forneceu uma mediana S/B valor de apenas 2,1. Experimentos adicionais deveriam gerar maior confiança de que esses sinais refletem o resultado de um evento de ligação específico e não são o resultado de variações no fundo do ensaio não específico.

[129] No primeiro conjunto de experimentos, foi confirmado que a concentração de LAM em amostras de urina gerou um aumento correspondente nos sinais de ensaio. A Tabela 2B mostra o efeito da concentração de 7 amostras de urina com baixos níveis de LAM em um quinto do seu volume original usando um dispositivo de ultrafiltração centrífuga (Amicon) com um peso molecular de corte de 10 kD. Tabela 2B [LAM] (pg/mL) em Mancha de MoAb1 Amostra Status 5X 1X Amostra Razão concentrado 1 TB-HIV- ND ND - 2 TB-HIV- ND ND - 3 TB-HIV- ND ND - 4 TB-HIV- ND ND - 5 TB-HIV- ND ND - 6 TB-HIV- ND ND - 7 TB-HIV- ND ND - 8 TB+HIV- 52 229 4,4 9 TB+HIV- 29 93 3,2 10 TB+HIV- 49 232 4,7 11 TB+HIV+ 42 147 3,5 12 TB+HIV+ 43 147 3,4 13 TB+HIV+ 42 141 3,4 14 TB+HIV+ 74 360 4,9

[130] A Tabela 2B mostra os resultados após as amostras de urina sem LAM detectável (de indivíduos TB-HIV) ou baixos níveis de LAM detectável (de indivíduos TB+ HIV- e TB+ HIV+) foram testadas para LAM usando o par de anticorpo MoAb1 - A194-01. As amostras foram medidas sem concentração (1X

Amostra) ou após 5 vezes a concentração usando um dispositivo de ultrafiltração centrífuga com um corte de 10 kD (5X Concentrado). A etapa de pré-tratamento da amostra (85 °C, 10 min.) Foi realizada antes da concentração. “ND” indica que o sinal do ensaio estava abaixo do limite de detecção para o ensaio. A coluna Razão fornece a razão das concentrações medidas de LAM no concentrado 5X para a amostra 1X.

[131] A concentração das amostras levou a aumentos na concentração de LAM medida entre 3,2 e 4,9 vezes, o que se aproxima do aumento teórico de 5 vezes esperado. Em contraste, quando as amostras de doadores de TB- com níveis de LAM indetectáveis passaram pelo mesmo processo de concentração, os níveis permaneceram indetectáveis, de modo que a simples concentração de urina negativa não foi suficiente para gerar esse efeito. Um experimento semelhante foi realizado em um subconjunto de amostras LAM-positivas usando um dispositivo com um corte de 100 kD e determinou que cerca de 90% do LAM passou para o filtrado (dados não mostrados). Este resultado sugere que a espécie medida está entre 10 e 100 kD em peso molecular e é consistente com estudos anteriores que caracterizam o peso molecular de LAM de Mtb (Venisse et al. 1993).

[132] Além disso, foi confirmado que MoAb1 imobilizado poderia ser usado para depletar LAM de amostras de urina. As experiências de depleção foram realizadas em placas de estreptavidina de grande mancha MSD revestidas com MoAb1 marcado com biotina para fornecer uma área de superfície elevada do anticorpo. As amostras tratadas termicamente foram incubadas nestes poços (1 hora à temperatura ambiente com agitação) antes de transferir as amostras para placas de ensaio LAM para medir os níveis restantes de LAM. Conforme mostrado na Tabela 3B, a aplicação deste protocolo de depleção a 10 amostras de urina de indivíduos com TB+ com uma ampla gama de níveis de LAM levou a uma diminuição média nos níveis de LAM de 56% (IQR: 47% - 61%) em relação a uma amostra que não sofrer depleção. Tabela 3B Mancha de MoAb1 Amostra Status % de Depleção

Simulado [LAM] com MoAb1 (pg/mL) placebo 1 TB+/HIV- 141 2% 58% 2 TB+/HIV- 610 3% 45% 3 TB+/HIV- 804 3% 67% 4 TB+/HIV- 307 2% 30% 5 TB+/HIV+ 63,060 2% 30% 6 TB+/HIV+ 781 2% 75% 7 TB+/HIV+ 5,539 1% 56% 8 TB+/HIV+ 424 -4% 56% 9 TB+/HIV+ 114 19% 62% 10 TB+/HIV+ 296 1% 52%

[133] A Tabela 3B mostra os resultados após as amostras de urina tratadas termicamente com uma gama de níveis de LAM (de indivíduos TB+/HIV- e TB+/HIV+) foram incubadas nos poços de uma placa de estreptavidina de grande mancha MSD revestida com MoAb1 rotulado com biotina por uma hora à temperatura ambiente com agitação para tentar esgotar o LAM das amostras. Como controle, as amostras também foram incubadas em poços que não estavam revestidos com o anticorpo (a condição “simulado com placebo”). Os níveis de LAM foram então medidos nas amostras depletadas, bem como nas amostras não depletadas originais, usando o ensaio LAM multiplex com A194-10 como anticorpo de detecção. As concentrações relatadas de LAM são para as amostras não depletadas. A tabela também relata a redução percentual na concentração de LAM medida (% de esgotamento) para amostras que foram depletadas usando MoAb1 ou usando a condição "Simulado com placebo".

[134] A presença de MoAb1 na etapa de depleção foi necessária, como uma condição simulada em que o protocolo de depleção foi realizado na ausência do anticorpo apenas forneceu uma redução média nos níveis de LAM de 2% (IQR: 1% - 3%). Discussão

[135] Este estudo caso-controle buscou determinar se LAM é detectável na urina de pacientes HIV-/TB+ e HIV+/TB+ usando um imunoensaio ECL altamente sensível com um LOD na faixa femtomolar (fM). O estudo empregou um formato multiplexado para permitir a avaliação simultânea de vários anticorpos de diferentes especificidades, para caracterizar como a especificidade do anticorpo afeta o desempenho clínico.

[136] Os resultados do ensaio ECL usando o par de anticorpos monoclonais de melhor desempenho (MoAb1 de Captura/Detector A194-01) mostraram sensibilidade quase 3 vezes maior e especificidade estatisticamente indistinguível para a detecção de casos de tuberculose em comparação com o Alere LF-LAM em um pequeno conjunto de 75 amostras de urina de quatro países coletadas de pacientes bem caracterizados com tuberculose presumida. Todos os pacientes HIV+ e uma fração significativa de pacientes HIV- tinham concentrações detectáveis de LAM acima do limite de detecção do ensaio de 11 pg/ml (0,6 pM). O limite de detecção do ensaio foi de 25 a 50 vezes abaixo do ponto de corte do teste Alere LF-LAM, que está na faixa de 250 a 500 pg/ml (Nakiyingi et al. 2014; Savolainen et al. 2013) e falha na detecção de pacientes com TB com concentrações mais baixas de LAM. Os resultados sugerem que melhorias na sensibilidade analítica para a detecção de LAM podem levar diretamente a melhorias na sensibilidade clínica para o diagnóstico de TB.

[137] O principal fator para o aumento da sensibilidade diagnóstica com especificidade quase perfeita para o imunoensaio foi a identificação de um par único de anticorpos monoclonais bem definidos com especificidades de ligação a epítopos LAM distintos que estão presentes na urina de pacientes com TB. Em uma triagem de cada combinação de pares possível de um conjunto de anticorpos anti- LAM de fontes diferentes, muitos pares foram encontrados que foram capazes de detectar LAM purificada a partir de cultura Mtb, mas apenas um pequeno subconjunto mostrou boa sensibilidade para detectar LAM ou LAM relacionadas com estruturas na urina do paciente. A escolha do anticorpo de detecção pareceu ser especialmente importante para a detecção sensível de LAM na urina e dois anticorpos (A194-01 e, em menor extensão, 27D2) foram identificados que forneceram um desempenho substancialmente melhor como anticorpos de detecção do que os outros candidatos. O mapeamento de epítopos desses anticorpos mostrou que ambos os anticorpos têm como alvo os domínios arabinano de LAM, incluindo os motivos Ara4 linear e Ara6 ramificado (hexa-Araf), indicando que essas estruturas são relativamente abundantes na urina de pacientes com TB. Estudos de manipulação de anticorpos de A194-01 mostraram que a conversão em uma estrutura Fab monomérica resulta em uma grande perda de atividade de ligação (Pinter 2017), sugerindo que a ligação multivalente de IgG completa a dois motivos arabinanos dentro de uma molécula LAM pode ser importante para a ligação. A capacidade de aumentar a avidez por meio de ligação multivalente pode, por sua vez, desempenhar um papel na utilidade única deste anticorpo como anticorpo de detecção.

[138] Como a maioria dos anticorpos candidatos funcionou razoavelmente bem como anticorpos de captura para detectar LAM na urina, a seleção de um anticorpo de captura ideal é principalmente conduzida pela especificidade do anticorpo. Os anticorpos direcionados aos motivos Ara4 linear e Ara6 ramificado A194-01, Imm 27D2), quando emparelhados com A194-01, foram todos capazes de detectar LAM em pelo menos algumas amostras de urina. Deste conjunto de anticorpos de captura específicos de arabinano, o 13H3 tendeu a ter os sinais mais elevados para a urina de indivíduos TB+, mas mostrou especificidade relativamente baixa (86%) com algumas amostras TB- dando sinais altos acima do sinal em branco. Embora tenha sido possível desenvolver um ensaio LAM usando o par 13H3/A194-01, os resultados sugerem que o desempenho dos ensaios LAM urinários usando apenas anticorpos direcionados a epítopos de arabinano não específicos de TB pode, em última análise, ser limitado por reatividade cruzada com LAM urinário de outras fontes, como micobactérias não TB (NTB) ou organismos relacionados da ordem dos actinomicetos. Em particular, as estruturas Ara6 não são exclusivas para Mtb LAM e os estudos de reatividade cruzada confirmaram que o par 13H3/A194-01 reage de forma cruzada com os actinomicetos não micobacterianos Nocardia, Goronia, Rhodococcus e Tsukamurella, que são todos conhecidos por produzir LAM com estruturas Ara6 (Mishra et al. 2011; Briken et al. 2004). É provável que os anticorpos policlonais usados no teste Alere LF-LAM e nos testes ELISA comerciais anteriores tenham limitações semelhantes. Uma tentativa de melhorar um teste ELISA comercial mais antigo, o teste Clearview TB, concentrando a urina antes da análise, descobriu que a sensibilidade poderia ser significativamente melhorada, mas também encontrou uma diminuição correspondente na especificidade (Savolainen 2013). Da mesma forma, a necessidade de reduzir os resultados falsos positivos do teste Alere LF-LAM levou o fabricante a revisar o cartão de referência do teste para um ponto de corte de ensaio mais alto em 2014, o que aumentou a especificidade, mas diminuiu a sensibilidade. Além disso, a reatividade cruzada do teste Alere LF-LAM com Actinomyces e Nocardia residentes na boca é provavelmente a razão de o ensaio não ser específico o suficiente para a detecção de LAM no escarro (Dheda et al. 2010). Verificou-se também que o teste Alere LF-LAM era suscetível à reatividade cruzada de fontes ambientais de LAM, como biofilmes na tubulação de lavadores de placa, enfatizando a importância da especificidade do anticorpo, bem como a necessidade de proteção contra fontes potenciais de interferentes ambientais ao usar anticorpos não específicos para TB.

[139] Além de anticorpos como 13H3 que têm como alvo epítopos LAM relativamente não específicos, anticorpos de captura que se direcionam a mais estruturas específicas de TB-, como os motivos Man2 e Man3 (MoAb2), e os motivos MTX-Man2 e MTX-Man3 (MoAb1), foram avaliados. Ambos forneceram sinais fortes para LAM purificado de cultura Mtb, mas apenas MoAb1 detectou LAM em amostras de urina de pacientes com TB, indicando que uma grande fração de qualquer motivo de capa Man2 ou Man3 em LAM urinário deve apresentar a modificação MTX. Surpreendentemente, o teste mostrou que emparelhar MoAb1 com o anticorpo de detecção A194-01 forneceu reatividade semelhante no grupo TB+ como o par 13H3/A194-01, mas que o anticorpo de captura MoAb1 foi capaz de atingir alta especificidade clínica. Conforme mostrado em uma comparação gráfica da sensibilidade clínica observada e especificidades dos diferentes pares de anticorpos (Figura 6), o par MoAb1/A194-01 forneceu a melhor sensibilidade clínica geral (93%) e especificidade (97%). A alta sensibilidade geral refletiu amplamente a excelente sensibilidade deste par para detectar LAM na urina de indivíduos TB+ HIV- (80%). A Figura 6 também compara o desempenho observado deste par com as metas de precisão da OMS para testes de TB POC e fornece incentivo de que o ensaio pode atender às especificações de destino para testes de TB POC para uso em triagem para identificar pacientes para testes de TB de acompanhamento, bem como os requisitos mais rigorosos para uso em diagnóstico.

[140] Sem desejar se limitar a uma única hipótese, é possível que a especificidade do epítopo do anticorpo de captura MoAb1 seja responsável por sua capacidade de fornecer detecção sensível, mantendo a especificidade clínica, conforme comprovado pelos resultados do teste de reatividade cruzada do par MoAb1/A194-01. Nenhuma reatividade cruzada foi observada para os organismos mais comuns responsáveis por infecções do trato urinário e, em contraste com o ensaio que emprega 13H3, nenhuma reatividade cruzada detectável para os actinomicetos não micobacterianos produtores de LAM Nocardia, Goronia, Rhodococcus e Tsukamurella foi observada. A captura de MoAb1 também proporcionou melhor discriminação das micobactérias produtoras de TB- (Mtb e M. bovis) da maioria das outras espécies de micobactérias. Em particular, nenhuma reatividade cruzada detectável foi observada com as micobactérias de crescimento rápido M. fortuitum, M. smegmatis, M. abscessus e M. chelonae, que produzem LAM com pouca ou nenhuma modificação de MTX (Joe et al. 2006). Em contraste, a captura de 13H3 deu sinais de ensaio de saturação ou quase saturação para as concentrações testadas de M. fortuitum e M. smegmatis. Um baixo nível de reatividade cruzada, para MoAb1, foi observado com M. gordonae, M. intracellulare, M. avium e M. kansasii de NTM de crescimento lento, embora os sinais observados para essas espécies fossem consideravelmente mais baixos do que aqueles medidos para a cepas causadoras de TB-. Também foi descoberto que este par não era suscetível ao contaminante ambiental desconhecido do tipo LAM das lavadoras de placa que gerou sinais para o teste Alere LF-LAM. A especificidade de TB- do anticorpo MoAb1 também é empregada em um ELISA desenvolvido por Otsuka para detecção de LAM no escarro que, em contraste com o teste Alere LF- LAM, não apresenta reação cruzada com LAM produzido por espécies prevalentes de actinomicetos orais (Kawasaki et al. 2018).

[141] Embora o LAM fosse detectável em quase todos os pacientes HIV positivos e negativos usando o par de anticorpos MoAb1/A194-01, o estudo confirmou descobertas anteriores de aumento das concentrações de LAM em pacientes HIV positivos com contagens baixas de CD4. As amostras de pacientes coinfectados com TB/HIV com contagens de CD4 baixas ≤ 100 células/µl apresentaram concentrações de LAM significativamente maiores, com amostras selecionadas tendo > 10 ng/ml de LAM. As concentrações em amostras de pacientes coinfectados com TB/HIV com contagens de CD4 altas > 100 células/µl e indivíduos imunocompetentes TB/HIV-negativos estavam na faixa de 11 a 1000 pg/ml e inferior (Figura 5 e Figura 3B). Este efeito é bem conhecido em grandes estudos de coorte com o Alere LF-LAM (Shah et al. 2016). A infecção renal por TB foi proposta como uma explicação para as altas concentrações de LAM em pacientes coinfectados por TB/HIV com contagens de CD4 baixas (Cox et al. 2015; Wood et al. 2012). Os mecanismos subjacentes que levam à antigenúria de LAM em pacientes imunocompetentes e HIV negativos deste estudo permanecem obscuros. Existem algumas evidências sugerindo que LAM é secretada ativamente por macrófagos alveolares infectados (Strohmeier & Fenton 1999). Esse processo ativo seria consistente com as importantes propriedades imunomoduladoras de LAM, que provavelmente favorecem a sobrevivência da TB in vivo (Lawn 2012). O processo também resultaria em LAM livre de células ou fragmentos de LAM na corrente sanguínea que poderiam passar para a urina através da filtração glomerular. Um estudo dos níveis séricos de LAM e sua correlação com os níveis urinários está em andamento. Resumo dos Resultados

[142] O desempenho aprimorado do ensaio indica que o desenvolvimento de ensaios de detecção de LAM aprimorados para o diagnóstico e triagem de TB em todos os HIV positivos, mas possivelmente também em pacientes HIV negativos e imunocompetentes, é bastante viável. No entanto, é necessário um ensaio com um LOD na faixa picomolar baixa ou até mesmo femtomolar e anticorpos altamente específicos. Embora o ensaio desenvolvido seja altamente sensível e possa fornecer uma ferramenta útil em um ambiente de laboratório, ele não foi projetado como um teste de ponto de atendimento para uso em ambientes de cuidados primários típicos em ambientes de baixa e média renda, onde instalações de laboratório e pessoal treinado podem não estar disponíveis. Alguns dos ensaios de fluxo lateral mais sensíveis atingem sensibilidades na faixa de baixo pM; por exemplo, um ensaio de detecção de antígeno da malária desenvolvido recentemente relatou um LOD de 2,5 pM HRP-2 (= 80 pg/ml), que está próximo da sensibilidade analítica necessária (Das et al. 2017). Outros propuseram etapas de concentração de antígeno, mas a complexidade e o custo do ensaio podem ser um desafio. FIND e parceiros planejam transferir as descobertas deste estudo para uma plataforma de detecção de POC simples, mas sensível. Exemplo 2 - Mapeamento de epítopo realizado com anticorpos

[143] O mapeamento de epítopos foi realizado com MoAb1, MoAb2 e MoAb3.

[144] A Tabela 5 mostra uma descrição dos anticorpos. Tabela 5 Nome de Especificações anticorpo MoAb1 Maior afinidade contra Mtb LAM em comparação com LAM de micobactérias não tuberculosas (NTM) MoAb2 Reage amplamente com

LAM micobacteriana MoAb3 Reage amplamente com

LAM micobacteriana

2. Materiais e Métodos

[145] Os três anticorpos (MoAb1, MoAb2, MoAb3) foram analisados para identificar os epítopos de oligossacarídeos reconhecidos por seus locais de ligação. A identificação do epítopo foi realizada medindo a ligação dos anticorpos a matrizes de glicano apresentando um conjunto diverso de 61 estruturas de oligossacarídeos (Figuras 1D-1F). Resumidamente, fragmentos de oligossacarídeos foram sintetizados como descrito anteriormente (Joe, M. et al. The 5-desoxi-5-metiltio- xilofuranose residual in mycobacterial lipoarabinomanan. Absolute stereochemistry, linkage position, conformation, and immunomodulatory activity. Geléia. Chem. Soc. 128, 5059–5072 (2006); Gadikota, R.R., Callam, C.S., Appelmelk, B.J. & Lowary, T.L. Synthesis of Oligosaccharide Fragments of Mannosylated Lipoarabinomannan Appropriately Functionalized for Neoglycoconjugate Preparation. J. Carbohydr. Chem. 22, 149–170 (2003); Joe, M., Bai, Y., Nacario, R. C. & Lowary, T. L. Synthesis of the docosanasaccharide arabinan domain of mycobacterial arabinogalactan and a proposed octadecasaccharide biosynthetic precursor. J. Am. Chem. Soc. 129, 9885–9901 (2007); Sahloul, K. & Lowary, T. L. Development of an Orthogonal Protection Strategy for the Synthesis of Mycobacterial Arabinomannan Fragments. J. Org. Chem. 80, 11417–11434 (2015); Zheng, R. B. et al. Insights into Interactions of Mycobacteria with the Host Innate Immune System from a Novel Array of Synthetic Mycobacterial Glycans. ACS Chem. Biol. 12, 2990–3002 (2017)).

[146] Os fragmentos foram então conjugados com BSA e usados para gerar microarranjos. Oito diluições em série de anticorpos (0,6 ng/ml, 2,4 ng/ml, 9,8 ng/ml, 39 ng/ml, 156 ng/ml, 625 ng/ml, 2,5 µg/ml e 10 µg/ml) foram incubadas em as lâminas durante 30 minutos a 37 °C e, após lavagem, durante 40 minutos coradas com anticorpos anti-espécies secundários marcados com fluorescência (Cy™ 3 AffiniPure Goat anti-coelho IgG da Jackson ImmunoResearch). Depois de repetir a lavagem e a secagem, os sinais de florescência foram medidos usando um scanner GenePix 4000B (Molecular Devices, Sunnyvale, EUA) e a intensidade sobre o fundo de cada ponto foi quantificada usando ProMicroarray Image Analysis Software 6.1. Resultados e Discussão

[147] A Figura 7 mostra a reatividade dos três anticorpos monoclonais em oito concentrações diferentes para todas as 61 estruturas de oligossacarídeos, três pontos de controle negativos e um positivo.

[148] MoAb2 reconheceu preferencialmente a LAM terminada com dimanose com fraca reatividade a estruturas mono- e trissubstituídas. Isso é consistente com a especificidade desse anticorpo para Mtb e a falta de reatividade com M. smegmatis PILAM (Glycan49). A reatividade para a LAM terminado com dimanose foi fortemente inibida pela adição de MTX (compare a reatividade de Glycan3 com Glycan 7), indicando que MoAb2 reconheceu preferencialmente o glicano de di-manose não modificado. A análise de microarranjos mostrou ainda que MoAb2 reagiu fortemente com vários glicoconjugados contendo Manp que não continham nenhum açúcar de Araf. Esses epítopos compartilhavam uma estrutura de manose com resíduos Manp adicionais ligados por ligações α-(1→2) ou α-(1→3) ao final ou Manp intermediário desta estrutura e, portanto, assemelhava-se tanto à cadeia principal de manano quanto às estruturas de terminação de cadeia. MoAb2 também reagiu razoavelmente bem com Glycan59, uma estrutura pentassacarídica que continha ligações Manp-(1→3)-α-Manp em ambas as extremidades da molécula. Estes resultados indicam claramente que este anticorpo depende unicamente do componente contendo Manp e não requer nenhum dos resíduos Araf adjacentes para reconhecimento. Manp é uma característica conservada em Mtb e outras micobactérias de crescimento lento, mas não ocorre em espécies de crescimento rápido de terminação, como M. smegmatis. No entanto, o Exemplo 1 do teste na urina sugere que o Manp não modificado (isto é, o glicano di-manose não modificado) não está disponível para ligação na urina da maioria dos pacientes com TB. Sem desejar limitar-se por uma única hipótese, uma possível razão é a degradação deste epítopo (por exemplo, por enzimas humanas como 1,2- manosidases) na ausência de MTX. Portanto, os anticorpos que têm como alvo motivos Manp não modificados podem não ser úteis para o diagnóstico para detectar ManLAM na urina de pacientes.

[149] Em contraste, MoAb1 era exclusivamente específico para estruturas terminadas por Manp que foram posteriormente substituídas com um resíduo de metiltio-xilose ligada a α-(1→4) (MTX). MoAb1 possuía a maior reatividade com as estruturas terminadas com dimanose modificada com MTX (Glycan7) e trimanose (Glycan9) e reatividade mais fraca com as estruturas monomanose modificadas com MTX (Glycan8, Glycan10, Glycan11). MoAb1 reconhece estruturas em que o motivo MTX-Man estava presente no braço ligado a α-(1→5)-linked (Glycan10) or α-(1→3) (Glycan11) de Ara6, sugerindo que a estrutura poli-Araf pode não ser crítica para o reconhecimento e que a ligação ocorre principalmente na porção

MTX-dimanose. A substituição de MTX foi identificada em todos os isolados de Mtb analisados até o momento e um relatório recente descreveu um agrupamento de cinco genes dedicado à biossíntese do motivo de terminação de MTX de Mtb LAM (Angala et al. 2017). M. smegmatis também possui todos esses genes, portanto, a falta de reatividade de MoAb1 com M. smegmatis e outras micobactérias de crescimento rápido está presumivelmente relacionada à ausência de terminação de Manp em PILAM, que impede a formação desse epítopo. Em contraste com o MoAb2, as estruturas de MTX-Manp parecem estar disponíveis para ligação na urina de pacientes com TB. Sem querer se limitar a uma única hipótese, uma possível explicação é que MTX protege as unidades Manp da degradação por enzimas ou outros mecanismos de degradação que podem ocorrer no corpo de um paciente com TB.

[150] MoAb3 reconheceu estruturas Ara4 e Ara6 não terminadas com baixa afinidade e reagiu mais fortemente com Ara4-Man1 (Glycan2), estruturas Ara4 e Ara 6 terminadas por dimmanose (Glycan3 e Glycan6) e com estrutura Ara4-Man2 modificada com MTX (Glycan7). A reatividade foi menor com estruturas limitadas por mono- e trimanose modificadas com MTX (Glycan8 e Glycan9). Em contraste com MoAb2, MoAb3 não reconheceu nenhuma das estruturas de polimanose (Glycan17, Glycan50, Glycan59), sugerindo que a presença da(s) estrutura(s) Ara é importante para a ligação de MoAb3. Em contraste com os outros dois anticorpos, MoAb3 teve uma reatividade mais ampla, incluindo ligação fraca a Ara4 terminado com fosfo-mio-inositol (Glycan49).

[151] A Tabela 6 mostra um resumo dos resultados da ligação do anticorpo. Tabela 6 Nome de Especificidade Comentário anticorpo do epítopo principal MoAb2 Man2 não Possível ligação ao núcleo e às terminações modificado de manano. Este tipo de estruturas LAM normalmente não está presente na urina de pacientes com TB, o que pode ser explicado pela possível degradação das terminações de Man2 por enzimas ou outros mecanismos no corpo humano. MoAb1 MTX-Man2 A ligação é independente de Ara. Este anticorpo é particularmente importante para a detecção de LAM na urina usando imunoensaios. MTX parece proteger o Man2 da degradação no corpo humano e, por exemplo, na urina. MoAb3 Man1-Ara4 Reatividade fraca para estruturas Ara não Man2-Ara4 tampadas e PI-Ara4 Man2-Ara6 MTX-Man2-Ara Resumo dos resultados

[152] Ambos, MoAb2 e MoAb1 são específicos para epítopos que estão presentes apenas em Mtb e outras micobactérias de crescimento lento, mas não ocorrem em micobactérias de crescimento rápido, como M. smegmatis ou M. fortuitum, o que explica a capacidade dos anticorpos em distinguir micobactérias de crescimento rápido lento e micobactérias de crescimento lento. Além disso, explica a excelente análise dos ensaios com base nesses anticorpos. Devido à ausência de terminações de Man2 não modificadas na urina dos pacientes, o MoAb2 não parece um anticorpo importante para imunoensaios diagnósticos baseados na detecção de LAM na urina. Em contraste, MoAb1 detecta estruturas Manp revestidas com MTX que parecem presentes e estáveis na urina. Embora MoAb3 demonstre reatividade sobreposta a glicanos que também são relevantes para os dois anticorpos de captura, a presença de estruturas Ara parece ser importante para MoAb3, sugerindo que o anticorpo se liga a um epítopo ligeiramente diferente.

[153] Exemplo 3 - Dados Adicionais com Anticorpos MoAb1 para Captura e A194-01 para Detecção ('Anticorpos Sob Teste' ou 'Anticorpos S. Teste' nas Figuras)

[154] Essa combinação de anticorpos foi usada para obter dados clínicos adicionais, indicando a eficácia desse par de anticorpos para detectar LAM na urina. Métodos

Concepção do estudo e população de estudo

[155] Amostras de urina biobancadas foram avaliadas de pacientes internados (> 18 anos) vivendo com HIV, coletadas em três estudos de coorte prospectivos independentes em dois hospitais distritais sul-africanos. Os critérios para a seleção de uma coorte foram a disponibilidade de amostras de urina congeladas para uma coorte completa de PLHIV hospitalizadas em ambientes endêmicos de TB, nos quais uma investigação abrangente foi realizada para identificar TB ou diagnósticos alternativos. Diretrizes nacionais padrão para o manejo de TB e HIV foram usadas nas três coortes. Para a primeira coorte (“Coorte1”), adultos com sintomas de TB, capazes de produzir expectoração, foram inscritos independentemente da contagem de CD4, na admissão ao Hospital Khayelitsha (KH) entre fevereiro de 2016 e agosto de 2017. A coorte 1 excluiu pacientes apenas com doença extrapulmonar. A segunda coorte ("Coorte 2") inscreveu adultos independentes das contagens de CD4 que foram internados em enfermarias médicas para adultos no Hospital GF Jooste entre junho de 2012 e outubro de 2013, independentemente da sua capacidade de produzir expectoração ou se relataram ou não sintomas de TB.2,11 Para a Coorte 2, a equipe do estudo tentou sistematicamente coletar urina, sangue e dois escarros para teste dentro de 24 horas da admissão. A terceira coorte (“Coorte 3”) inscreveu PLHIV hospitalizadas em KH com CD4≤350 células/µl nas quais TB foi considerado o diagnóstico mais provável na apresentação entre janeiro de 2014 e outubro de

2016.

[156] Todas as coortes excluíram pacientes que já estavam recebendo terapia anti-TB. Nas Coortes 1 e 2, a inscrição foi feita consecutivamente. A Coorte3 usou um método de seleção aleatória após identificar todos os pacientes potencialmente elegíveis diariamente. Em todas as coortes, os pacientes foram inscritos na admissão ao hospital. Amostras de escarro, sangue e urina para teste padrão de referência de M.tb foram coletadas no momento da inscrição e amostras clínicas adicionais foram obtidas durante a admissão hospitalar e no acompanhamento. A coleta de escarro entre as coortes foi realizada por uma enfermeira experiente ou pesquisador clínico treinado e a indução do escarro foi realizada, quando necessário, conforme descrito anteriormente.

[157] Todas as atividades relacionadas ao estudo foram aprovadas pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos (HREC) da Universidade da Cidade do Cabo (UCT). O consentimento informado por escrito foi obtido dos pacientes, de acordo com os protocolos do estudo. A participação no estudo não afetou o padrão de atendimento. Os relatórios seguiram as diretrizes STARD. O teste retrospectivo de LAM na urina foi supervisionado pelo patrocinador, FIND, e foi realizado na UCT em abril de 2018. Métodos de laboratório

[158] Alíquotas de urina congelada de urina não processada foram descongeladas à temperatura ambiente e misturadas manualmente. As amostras que não foram utilizadas imediatamente para o teste foram armazenadas a 4 °C por um máximo de 4 horas. O teste Alere LF-LAM foi realizado seguindo as instruções do fabricante. O par de anticorpos sob teste, conforme descrito acima (anticorpos MoAb1 para captura e A194-01 para detecção) foi testado como segue. Resumidamente, a urina foi adicionada a um tubo de reagente contendo A194-01 marcado com ouro até a linha do indicador (aproximadamente 200 µl), misturada e incubada por 40 minutos à temperatura ambiente. Após misturar novamente, duas gotas de urina/reagente do tubo foram adicionadas à tira de teste que é um imunoensaio de ponto de cuidado de fluxo lateral com o anticorpo de captura MoAb1 imobilizado na linha de 'teste'. Caso o antígeno esteja presente na urina, o anticorpo de captura MoAb1 captura o complexo antígeno-A194-01-ouro na linha 'teste' para formar o complexo MoAb1-antígeno-A194-01-ouro em formato sanduíche. O resultado foi lido em 10 minutos. Nenhum dispositivo de leitura é necessário e o resultado foi interpretado por uma inspeção visual completa. Qualquer linha vista na linha 'teste' foi considerada positiva para TB.

[159] Ambos os ensaios foram lidos independentemente por dois leitores cegos para os resultados do teste de índice ou comparador, respectivamente, o estado do paciente e todos os outros resultados do teste. Após a interpretação inicial do teste independente, os leitores compararam os resultados e, em caso de discordância, inspecionaram novamente a tira de teste para estabelecer o resultado de consenso final (por acordo mútuo) que foi usado para análise. Em caso de falha do ensaio, o teste foi repetido uma vez.

[160] Para o teste padrão de referência, as amostras foram processadas usando protocolos padronizados em laboratórios credenciados centralizados do Serviço Nacional de Laboratórios de Saúde da África do Sul. O teste padrão de referência foi realizado em todas as amostras de escarro disponíveis e incluiu GeneXpert MTB/RIF (Xpert, Cepheid, Sunnyvale, EUA; testes anteriores ao lançamento de Xpert Ultra MTB/RIF), microscopia de fluorescência após coloração com Auramina O, cultura líquida MGIT (Becton Dickinson, Franklin Lakes, EUA) e cultura sólida em meio Löwenstein-Jensen (LJ).

[161] A presença do complexo Mtb em cultura sólida e líquida foi confirmada com a detecção do antígeno MPT64 e/ou os ensaios de sonda da linha MTBDRplus (Hain Lifesciences, Nehren, Alemanha). As hemoculturas de todos os participantes foram feitas em frascos de cultura BACTEC™ Myco/F Lytic (Becton Dickinson, Franklin Lakes, EUA) e os testes de diagnóstico in vitro pré-qualificados da OMS foram usados para o teste de HIV (testes de diagnóstico rápido) e contagem de células CD4 (citometria de fluxo). Para o teste urinário Xpert, 20-40 ml de urina foram centrifugados e após a remoção do sobrenadante, o pélete foi ressuspenso no volume de urina residual e 0,75 ml foi testado usando Xpert.2 Para as Coortes 2 e 3, amostras respiratórias e não respiratórias adicionais como líquido pleural, líquido cefalorraquidiano e aspirados com agulha fina de tecido, quando clinicamente indicado, e testados com cultura MGIT ou Xpert. As informações clínicas, os resultados do par de resultados de Anticorpos Sob Teste e Alere LF- LAM não estavam disponíveis para os avaliadores do padrão de referência no momento do teste. Categorias padrão de referência

[162] Os pacientes foram designados a quatro categorias de diagnóstico usando uma combinação de achados clínicos e laboratoriais. Isso foi feito por investigadores clínicos cegos para indexar os resultados dos testes antes da análise dos dados. “TB definitiva” incluiu pacientes com Mtb confirmado microbiologicamente (qualquer cultura ou qualquer Xpert MTB/RIF (“Xpert”) positivo para Mtb durante a admissão). “Não-TB” eram pacientes com todas as microscopias, culturas e testes Xpert negativos para Mtb (e pelo menos um resultado de cultura não contaminado), que não iniciaram o tratamento anti-TB e estavam vivos ou melhoraram em três meses de acompanhamento. “Possível TB” eram pacientes que não satisfaziam os critérios para “TB definida”, mas apresentavam características clínicas/radiológicas sugestivas de TB e iniciaram o tratamento para TB. Os pacientes que não se enquadraram em nenhuma dessas categorias foram considerados “inclassificáveis” para este estudo de precisão diagnóstica e removidos das análises principais. Em uma análise de sensibilidade, a categoria “inclassificável” foi incluída para avaliar o impacto das exclusões na precisão do diagnóstico. Análise estatística

[163] Precisão (sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo (PPV), valor preditivo negativo (NPV), razão de verossimilhança positiva (LR +) e razão de verossimilhança negativa (LR-)) do LFA com o par de Anticorpos Sob Teste e Alere LF-LAM foi determinado por comparação com um padrão de referência microbiológico (MRS), bem como um padrão de referência composto (CRS). “TB definitiva” versus “Não -TB” foi usado para alocar os pacientes em grupos de padrão de referência positivo versus negativo. O grupo “possível TB” foi considerado negativo em um MRS, mas positivo em um CRS. De acordo com o protocolo, a precisão do diagnóstico foi determinada separadamente para cada coorte. A heterogeneidade foi avaliada usando o teste Q de Cochran.

[164] Para estimar a sensibilidade e especificidade combinadas entre coortes e estratos de CD4, realizamos uma análise post-hoc com um modelo de efeitos aleatórios bivariado Bayesiano para explicar as diferenças de desenho do estudo. Os resultados são apresentados com intervalos de confiança de 95% (IC 95%) com base no método de pontuação de Wilson. O IC de 95% das diferenças (Δ) nas porcentagens (para Anticorpos Sob Teste emparelhados e Alere LF-LAM) foi calculado usando o método de pontuação do Tango. A diferença entre dois testes foi considerada significativa se 0% não foi incluído no IC 95% da diferença. A estatística kappa de Cohen foi usada para calcular a concordância de resultados positivos e negativos entre os dois leitores independentes dos testes LAM. Em uma análise post-hoc adicional, o número total de pacientes com TB confirmados microbiologicamente, (definido como a detecção de Mtb por cultura ou Xpert em pelo menos uma amostra clínica de qualquer tipo) foi usado como denominador para calcular o rendimento diagnóstico comparativo de um único teste de Anticorpos Sob Teste, Alere LF-LAM, teste de escarro Xpert (versão em cartucho G4) e baciloscopia de escarro de amostras coletadas nas primeiras 24 horas após a apresentação. Esta análise foi restrita à Coorte 2, uma vez que esta coorte foi projetada para avaliar o rendimento diagnóstico tentando sistematicamente coletar essas amostras diagnósticas (sangue, urina e duas amostras de escarro sempre que possível) em todos os pacientes nas primeiras 24 horas após a admissão. A análise dos dados foi realizada com R (versão 3.5.1) e Matlab versão 2017b. Resultados Pacientes

[165] No geral, 1.188 pacientes eram elegíveis e considerados para teste retrospectivo; 220 pacientes foram excluídos da análise principal devido à indisponibilidade de uma amostra de urina (n = 93), falha nos testes de Anticorpos Sob Teste (n = 6) ou por serem não classificáveis (n = 121). As principais razões para ser “inclassificável” foram morte antes que um diagnóstico pudesse ser feito (n = 62) e perda de acompanhamento quando um estado vital ou uma melhora no estado clínico era necessário para o diagnóstico (n = 17). Dos 968 pacientes incluídos na análise principal, 600 (62%) foram classificados como TB definitiva, 91 (9%) como TB possível e 277 (29%) como não TB. O padrão de referência microbiológico para o diagnóstico de TB foi informado por um total de 6.397 exames de cultura e Xpert (em média 6,2/paciente) e incluiu 3.261 exames de escarro e

3.136 de amostras sem escarro. Um total de 236 pacientes (24,4%) não conseguiu fornecer uma amostra de escarro. O diagnóstico definitivo de TB foi baseado nos resultados de amostras sem escarro em 19,5% dos pacientes (117/600). A prevalência de TB foi de 49%, 38% e 82% para as Coortes 1, 2 e 3, respectivamente. A maioria dos pacientes eram adultos jovens imunocomprometidos (idade média: 35 anos), com contagem média de CD4 de 113 células/µl, 153 células/µl e 59 células/µl para as Coortes 1, 2 e 3, respectivamente. Em todas as coortes, 45% tinham uma história de tratamento prévio de TB e todos os pacientes das Coortes 1 e 3 e 90% da Coorte 2 tinham uma triagem de sintomas da OMS positiva para TB. Precisão de Anticorpos Sob Teste e Alere LF-LAM

[166] A análise mostrou uma sensibilidade de 70,4% (IC 95%: 53,0–83 ·1) para os Anticorpos Sob Teste em comparação com 42,3% (31,7-51,8) para Alere LF-LAM contra o MRS: uma diferença de 28,1% (21,5–34,4) entre os dois testes (Figura 8). A maior sensibilidade de Anticorpos Sob Teste contra MRS foi observada na Coorte 3 (81,0%), que inscreveu pacientes com imunossupressão mais avançada relacionada ao HIV (ou seja, mais pacientes com contagem de CD4 abaixo de 100 células/µl), em comparação com a Coorte 2 (65,9%) e Coorte 1 (59,6%). Há uma relação inversa do aumento da sensibilidade (para ambos os ensaios) com a diminuição da contagem de CD4 quando os pacientes foram estratificados pela contagem de CD4. Em pacientes com contagem de CD4 abaixo de 100 células/µl, os Anticorpos Sob Teste tiveram uma sensibilidade de 84,2% (71,4–91,4) em comparação com 57,3% (42,2–69,6) de Alere LF -LAM: uma diferença de 26,9% (16,8–36,7) entre os dois testes.

Uma diferença semelhante na sensibilidade (31,8%; 22,7–40,3) foi observada em pacientes mais imunocompetentes (CD4> 200 células/µl), mas a sensibilidade geral foi menor nesta população para ambos os ensaios; 44,0% 297 (29,7–58,5) para Anticorpos Sob Teste e 12,2% (4,6–23,7) para Alere LF-LAM.

Usando o CRS, as sensibilidades de ambos os ensaios foram ligeiramente menores: a estimativa geral do ponto de Anticorpos Sob Teste foi de 64,9% (50,1–76,7) e a de Alere LF-LAM 38,2% (28,1- 47,3). Uma vez que os intervalos de confiança de 95% das diferenças na sensibilidade entre os Anticorpos Sob Teste e Alere LF-LAM não se sobrepõem a zero (no geral, nas três coortes e dentro dos estratos de CD4), os Anticorpos Sob Teste foram estatisticamente considerados significativamente mais sensíveis do que Alere LF-LAM (Figura 8). Contra o MRS, as estimativas de especificidade foram 90,8% (86,0-94,4) e 95,0% (87,7-98,8) para Anticorpos Sob Teste e Alere LF-LAM respectivamente, representando um não estatisticamente - diferença significativa (- 4,2%; 12,7–4,4). Usando o CRS, as estimativas gerais de especificidade foram aumentadas para 95,7% (92,0-98,0) para Anticorpos Sob Teste e 98,2% (95,7-99,6) para Alere LF-LAM, respectivamente, novamente representando uma diferença estatisticamente não significativa (-2,5%; -11,2–6,3). A especificidade do ensaio de anticorpos sob teste foi menor entre aqueles com CD4 ≤ 100 células/µl (91,2% usando o CRS) em comparação com aqueles com CD4 > 100 células/µl (Figura 8).

Oito das 11 amostras falso-positivas de anticorpos sob teste, usando o CRS, eram de pacientes com contagens de CD4 ≤ 100 células/µl. Usando CRS, o PPV para as três coortes diferentes variou de 90,6–99,4% e 93,8–100,0% para Anticorpos Sob Teste e Alere LF-LAM, respectivamente. O NPV variou de 24,8-71,8% e 13,7-62,5% para Anticorpos Sob Teste e Alere LF-LAM, respectivamente. As razões de verossimilhança positivas (LR +) variaram de 8,9-18,5 e 13,8-17,3 para Anticorpos Sob Teste e Alere LF-LAM, respectivamente. As razões de verossimilhança negativa (LR-) variaram de 0,3–0,4 e 0,6–0,7 para Anticorpos Sob Teste e Alere LF-LAM, respectivamente. Rendimento diagnóstico em 24 horas após a admissão

[167] Um total de 420 pacientes da Coorte2 foram elegíveis para uma análise de rendimento diagnóstico. Entre os pacientes elegíveis, apenas 36,4% (153/420) conseguiram produzir uma amostra de escarro nas primeiras 24 horas de internação, enquanto 99,5% (418/420) foram capazes de fornecer uma amostra de urina, conforme descrito anteriormente para esta coorte. Um total de 141 pacientes tiveram TB confirmada microbiologicamente. Um total de 59,6% (84/141) dos casos de TB puderam ser diagnosticados em amostras coletadas nas primeiras 24 horas de admissão por meio de testes rápidos: 26,2% (37/141) de teste escarro Xpert e 41,8% ( 59/141) da urina Xpert utilizando 1ml de volume de entrada. Os restantes 40,4% (57/141) dos diagnósticos de TB não puderam ser alcançados nas primeiras 24 horas e foram estabelecidos por cultura de micobactérias em qualquer amostra coletada em qualquer momento durante a admissão do paciente, diagnosticada por Xpert realizada em amostras concentradas de 20- 40ml de urina e/ou diagnosticado pelo teste Xpert em amostras coletadas após as primeiras 24 horas. As amostras adicionais coletadas para cultura e teste Xpert incluíram líquido ascítico, sangue, urina, escarro, líquido cefalorraquidiano, lavagem gástrica, pus ou líquido pleural). A Figura 9 ilustra o rendimento do diagnóstico de Anticorpos Sob Teste e Alere LF- LAM em comparação com o de outros diagnósticos rápidos nas primeiras 24 horas. Com a introdução dos Anticorpos Sob Teste, 64,5% (91/141) dos casos de TB poderiam ter sido rapidamente diagnosticados à beira do leito, dentro de algumas horas de apresentação, em comparação com 43,3% (61/141) com Alere LF -LAM. Uma combinação de teste Xpert de escarro e Anticorpos Sob Teste nas primeiras

24 horas após a admissão teria sido capaz de diagnosticar 72,3% (102/141) dos casos confirmados microbiologicamente. Uma combinação de baciloscopia de escarro e Anticorpos Sob Teste teria gerado 69,5% (98/141) dos diagnósticos. Taxa de falha e acordo do leitor

[168] No total, 1,6% (18/1095) dos ensaios de anticorpos sob teste falharam na primeira tentativa. Dos 15 que puderam ser repetidos, três falharam na segunda tentativa, resultando em uma taxa de erro geral total de 1,9% (21/1110 testes). A taxa de erro do Alere LF-LAM foi de 0,4% (4/1095) na primeira tentativa e todos os quatro testes de repetição deram um resultado na segunda tentativa. Em suma, o ensaio de Anticorpos Sob Teste tem uma taxa de falha semelhante como Alere LF- LAM e a taxa de falha do ensaio de Anticorpos Sob Teste pode ser ainda mais reduzida por medidas de controle de qualidade padrão, uma vez que são comumente usados na fabricação de tais ensaios. A concordância de duas leituras visuais, cegas e independentes do mesmo teste foi elevada para ambos os Anticorpos Sob Teste e Alere LF-LAM. Anticorpos Sob Teste teve uma taxa de concordância de 97,0% (938/967; coeficiente kappa 0,94), enquanto a concordância entre leitores de Alere LF-LAM foi de 96,7% (934/966; coeficiente kappa 0,92). Discussão

[169] Nesta avaliação de 968 PLHIV hospitalizadas em um ambiente de alta carga, o ensaio de ponto de atendimento de Anticorpos Sob Teste identificou uma proporção significativamente maior de pacientes com TB do que Alere LF-LAM, mantendo uma especificidade comparável. Em todas as subanálises, a sensibilidade dos Anticorpos Sob Teste foi significativamente maior (variação, 22- 35%) do que Alere LF-LAM. Em pacientes com maior risco de morrer (pacientes com CD4≤100 células/µl), os Anticorpos Sob Teste apresentaram a maior sensibilidade de 84,2%, que foi 26,9% maior do que Alere LF-LAM. Combinado com o teste Xpert de escarro, o Anticorpos Sob Teste pode diagnosticar quase três quartos da TB confirmada microbiologicamente no primeiro dia de hospitalização. A meta-análise que formou a base da recomendação da OMS para Alere LF-LAM relatou uma sensibilidade geral de 45% em PLHIV, que é semelhante à sensibilidade de Alere LF-LAM de 42,3% observada neste estudo, sugerindo que a população avaliada é semelhante às populações na meta-análise da OMS.

[170] Coletivamente, esses resultados sugerem que, se implementado na prática clínica e associado ao tratamento adequado, o ensaio de ponto de atendimento de Anticorpos Sob Teste pode salvar vidas, permitindo o diagnóstico precoce de TB associada ao HIV em uma grande proporção de pacientes hospitalizados. As estimativas pontuais da especificidade dos Anticorpos Sob Teste foram inferiores em comparação com Alere LF-LAM. Embora as diferenças na especificidade entre os Anticorpos Sob Teste e Alere LF-LAM não fossem significativas, a especificidade reduzida, tanto do Alere LF-LAM quanto dos Anticorpos Sob Teste, poderia ser parcialmente explicada por um padrão de referência imperfeito que carece de sensibilidade completa. O padrão de referência existente é especialmente limitado em sua capacidade de identificar TB em PLHIV imunocomprometidas, pois esses pacientes têm maior probabilidade de ter doença paucibacilar e/ou TB extrapulmonar, tornando o diagnóstico mais difícil.

[171] É possível que um padrão de referência imperfeito possa afetar desproporcionalmente um teste mais sensível e resultar em falsos positivos aumentados, ou seja, menor especificidade neste caso do ensaio de Anticorpos Sob Teste mais sensível. A especificidade decrescente observada com a contagem decrescente de CD4 neste estudo e a especificidade melhorada observada com o CRS em comparação com o MRS reforçam ainda mais esta explicação. A reatividade cruzada para patógenos comuns do trato urinário e micobactérias não tuberculosas de crescimento rápido foi excluída em estudos anteriores (Exemplo 1, Tabela 2A) para os Anticorpos Sob Teste. Referências Angala, S. kumar et al., 2017. Biosynthesis of the Methylthioxylose Capping Motif of Lipoarabinomannan in Mycobacterium tuberculosis. ACS Chemical Biology, 12 (3), pp.682–691. Disponível em: http://pubs.acs.org/doi/10.1021/acschembio.6b01071. Briken, V. et al., 2004. Mycobacterial lipoarabinomannan and related lipoglycans: From biogenesis to modulation of the immune response. Molecular Microbiology, 53(2), pp.391–403.

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Por outro lado, várias características da invenção que são, por concisão, descritas no contexto de uma única modalidade, também podem ser fornecidas separadamente ou em qualquer subcombinação adequada.

Embora a invenção tenha sido descrita em conjunto com suas modalidades específicas, é evidente que muitas alternativas, modificações e variações serão evidentes para os versados na técnica.

Consequentemente, pretende-se abranger todas essas alternativas, modificações e variações que se enquadram no espírito e no amplo escopo das reivindicações anexas.

Todas as publicações, patentes e pedidos de patente mencionado nesta especificação são incorporadas em sua plenitude nisto por referência na especificação na mesma medida como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse indicado especificamente e individualmente para ser incorporadas neste documento por referência.

Além disso, a citação ou identificação de qualquer referência no presente peido não deverá ser interpretada como uma admissão de que essa referência está disponível como estado da técnica à presente invenção.

Claims (54)

REIVINDICAÇÕES:

1. Anticorpo para a detecção de um antígeno associado a micobactérias em uma amostra de urina in vitro de um sujeito, caracterizado pelo fato de que o referido antígeno compreende ManLAM (Lipoarabinomanano terminada com manose), o referido anticorpo se ligando especificamente às referidas moléculas de ManLAM da referida urina, em que o referido anticorpo se liga ao referido ManLAM com uma afinidade possuindo uma KD de 3x10-8 M ou menos, e em que o referido anticorpo se liga a moléculas LAM que não são terminadas ou que são terminadas com fosfato de inositol com uma afinidade tendo uma KD de 10 -3 M ou mais.

2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o ManLAM compreende ManLAM terminado com MTX, caracterizado pelas as terminações de manosídeo serem ainda modificadas por ligação de uma fração 5-desoxi-5-metiltio-xilo.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o ManLAM terminado com MTX compreende ManLAM terminado com MTX- Man2 caracterizado por dois resíduos ligados a alfa 1-2-Manp que são adicionalmente substituídos com um resíduo de metilxilose ligado a alfa 1-4.

4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo se liga a um epítopo do referido ManLAM compreendendo uma característica Manp.

5. Anticorpo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga a um epítopo do referido ManLAM caracterizado por apresentar um motivo selecionado do grupo que consiste em Glycan7, Glycan8, Glycan9, Glycan10 e Glycan11.

6. Anticorpo, de acordo com as reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo fato de que o referido epítopo é ainda caracterizado como apresentando uma porção de MTX-dimanose.

7. Anticorpo de acordo com as reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que é adequado para detectar a presença de uma micobactéria de crescimento lento em um sujeito usando uma amostra da urina do sujeito.

8. Anticorpo da reivindicação 7, caracterizado pelo fato de ser adequado para detectar o antígeno associado a Mycobacterium tuberculosis ou M. bovis.

9. Anticorpo, de acordo com as reivindicações 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não reage de maneira cruzada com um marcador de micobactérias de crescimento rápido na urina do sujeito.

10. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não reage de forma cruzada com um marcador associado a M. fortuitum, M. smegmatis M. abscessus ou M. chelonae.

11. Anticorpo de acordo as reivindicações 7-9, caracterizado pelo fato de que o anticorpo mostra reatividade pelo menos 10 vezes menor a um marcador associado a uma micobactéria de crescimento lento selecionada do grupo que consiste em M. gordonae. M. intracellulare e M. avium.

12. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7-11, caracterizado pelo fato de que o anticorpo detecta o antígeno associado ao referido Mycobacterium tuberculosis ou M. bovis com reatividade pelo menos 1500 vezes maior em comparação com a detecção de espécies bacterianas não micobactérias.

13. Anticorpo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que as espécies bacterianas não micobacterianas compreendem um ou mais dentre Gordonia bronchialis, Nocardia asteroides, Rhodococcus sp., Tsukamurella paurometabolum., Candida albicans, Corynebacterium urealyticum, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Steptocococcus audalactiae, Steptocococcus audalactilaphylococcus audalactiae, Steptocococcus audalactiae, Pudomylaphococure, agudalapticiase, Steptocugus, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenza, Enterococcus faecalis, Enterobacter aerogenes ou Chlamydia trachomatis.

14. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de ser adequado para uso como anticorpo de captura em um imunoensaio em sanduíche para detecção do antígeno.

15. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de ser adequado para uso como um anticorpo de detecção em um imunoensaio em sanduíche para detectar o antígeno.

16. Método para detectar diferencialmente uma presença de micobactérias causadoras de doenças em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende o contato de um anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores com a urina do sujeito; detectar a ligação do referido anticorpo a um antígeno na urina; se o referido anticorpo se ligar especificamente ao referido antígeno na urina com uma afinidade tendo uma KD de 3x10 -8 M ou menos, determinar que a referida micobactéria causadora de doença caracterizada pelas referidas moléculas ManLAM está presente no corpo do sujeito.

17. Método de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo liga-se a um antígeno da referida micobactéria causadora de doença na urina com um sinal pelo menos três vezes maior do que a um antígeno de micobactéria não causadora de doença.

18. Método de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a aplicação de um primeiro anticorpo à urina, sendo o referido primeiro anticorpo caracterizado de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, para se ligar ao referido antígeno; e aplicar um segundo anticorpo à urina para se ligar a um segundo antígeno, em que o referido segundo anticorpo não se liga ao mesmo antígeno que o primeiro anticorpo, e em que os referidos primeiro e segundo antígenos compreendem as referidas moléculas ManLAM; em que um dos referidos primeiro e segundo anticorpos é um anticorpo de captura e em que o outro dos referidos primeiro e segundo anticorpos é um anticorpo de detecção em um imunoensaio.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o referido segundo anticorpo é caracterizado como se ligando a estruturas de poliarabinose das referidas moléculas ManLAM com uma afinidade tendo um KD de 3x10-5 M ou menos.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo se liga especificamente a ara4 e/ou ara6.

21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende o contato da urina com um anticorpo selecionado a partir do grupo que consiste nos anticorpos MoAb1, 13H3, 27D2 e A194-01.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que compreende o contato da urina com uma combinação de uma pluralidade dos anticorpos MoAb1, 13H3, 27D2 ou A194-1 em um imunoensaio em sanduíche.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que compreende o contato da urina com uma combinação dos anticorpos MoAb1 e A194-1 em um imunoensaio em sanduíche.

24. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21-23, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a aplicação do anticorpo MoAb1 a uma amostra com um segundo anticorpo adequado para atingir uma fold change de 3 ou mais entre os sinais médios de amostras de sujeitos que sofrem de tuberculose em comparação com amostras de sujeitos sem tuberculose usando um diagnóstico padrão de referência adequado para classificação dos sujeitos.

25. Método, de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o referido diagnóstico padrão de referência é baseado em cultura de micobactérias ou métodos baseados em PCR para classificar indivíduos.

26. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que método compreende a aplicação do anticorpo MoAb1 a uma amostra para detectar pelo menos 20% mais sujeitos que sofrem de tuberculose em comparação com amostras de sujeitos sem tuberculose usando um ensaio padrão comparativo adequado, em que o referido ensaio padrão comparativo adequado compreende o Alere LF-LAM.

27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21-26, caracterizado pelo fato de que o sinal de imunoensaio em sanduíche específico do antígeno ManLAM detectado em uma amostra de urina de um sujeito sem tuberculose está abaixo de 11 pg ManLAM/ml para pelo menos 70% das amostras em uma população.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que o sinal está abaixo do limite de detecção para pelo menos 80% das amostras na população.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o sinal está abaixo do limite de detecção para pelo menos 90% das amostras na população.

30. Método, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o sinal está abaixo do limite de detecção para pelo menos 95% das amostras na população.

31. Método, de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que o sinal está abaixo do limite de detecção para pelo menos 97% das amostras na população.

32. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 21-31, caracterizado pelo fato de que o sinal de imunoensaio em sanduíche específico do antígeno ManLAM detectado em uma amostra de urina de um sujeito com tuberculose está acima de 11 pg ManLAM/ml para pelo menos 40% das amostras em uma população.

33. Método, de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o sinal está acima do limite de detecção para pelo menos 50% das amostras na população.

34. Método, de acordo com a reivindicação 33, caracterizado pelo fato de que o sinal está acima do limite de detecção para pelo menos 60% das amostras na população.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o sinal está acima do limite de detecção para pelo menos 75% das amostras na população.

36. Método, de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o sinal está acima do limite de detecção para pelo menos 90% das amostras na população.

37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a detecção de micobactérias causadoras de tuberculose no indivíduo na ausência do vírus HIV.

38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que uma AUC (área sob a curva) de um imunoensaio com base na ligação dos referidos anticorpos ao referido antígeno é de pelo menos 0,70.

39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a referida AUC é de pelo menos 0,80.

40. Método, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que a referida AUC é de pelo menos 0,85.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que a referida AUC é de pelo menos 0,90.

42. Método, de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que a referida AUC é de pelo menos 0,95.

43. Método, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que a referida AUC é de pelo menos 0,98.

44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações acima, caracterizado pelo fato de que o método compreende a aplicação de uma combinação do anticorpo MoAb1 ou o anticorpo 13H3 como o primeiro anticorpo, e o anticorpo A194-01 ou o anticorpo 27D2 como o segundo anticorpo para detectar um antígeno associado com micobactérias em uma amostra de urina in vitro de um sujeito, em um imunoensaio em que um dos primeiro e segundo anticorpos é o anticorpo de captura e o outro do primeiro e segundo anticorpos é o anticorpo de detecção.

45. Método, de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a referida detecção é realizada usando um imunoensaio, em que a combinação tem pelo menos 20% de sensibilidade clínica maior do que o teste Alere LF-LAM.

46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda diagnosticar o sujeito com tuberculose de acordo com a presença da referida micobactéria causadora da doença no corpo do sujeito.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que o referido diagnóstico compreende ainda detectar a presença de uma infecção tubercular ativa no sujeito.

48. Método, de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que compreende ainda monitorar a eficácia do tratamento do sujeito para tuberculose de acordo com a presença da referida micobactéria causadora da doença.

49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda concentrar o referido antígeno compreendendo ManLAM na amostra antes da detecção com o imunoensaio para aumentar ainda mais a sensibilidade clínica.

50. Método, de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a referida concentração do referido antígeno compreende a aplicação de grânulos magnéticos ou ultrafiltração à amostra.

51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a diferenciação entre a presença de uma micobactéria causadora de doença no indivíduo e uma micobactéria não causadora de doença no indivíduo.

52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda detectar especificamente uma presença de uma micobactéria causadora de doença no indivíduo na presença de bactérias contaminantes de um ambiente do indivíduo.

53. Método de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que a referida bactéria contaminante compreende um ou mais dentre Gordonia bronchialis, Nocardia asteroides, Rhodococcus sp., Tsukamurella paurometabolum., Candida albicans, Corynebacterium urealyticum, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Steptocococcus agalactiae, Staphylococcus saprophyticus, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenza, Enterococcus faecalis, Enterobacter aerogenes, ou Chlamydia trachomatis, ou micobactérias não tuberculosas.

54. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o aquecimento da urina antes de entrar em contato com o referido anticorpo.