CN116669707A - 体液样品中结核的检测方法 - Google Patents

体液样品中结核的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN116669707A
CN116669707A CN202180056639.XA CN202180056639A CN116669707A CN 116669707 A CN116669707 A CN 116669707A CN 202180056639 A CN202180056639 A CN 202180056639A CN 116669707 A CN116669707 A CN 116669707A
Authority
CN
China
Prior art keywords
mtb
antibody
evs
lam
nanoparticle
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180056639.XA
Other languages
English (en)
Inventor
胡晔
郑问枢
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Durham Education Fund Management Committee
Original Assignee
Durham Education Fund Management Committee
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Durham Education Fund Management Committee filed Critical Durham Education Fund Management Committee
Publication of CN116669707A publication Critical patent/CN116669707A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/5695—Mycobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1267—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria
    • C07K16/1289—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-positive bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

描述了用于检测体液样品中TB的方法和系统。通过从体液样品中提取细胞外囊泡(EVs)并使用抗体缀合纳米颗粒来捕获Mtb相关的生物标志物，结果表明该测试可以在数小时内而不是数周内完成，并且可以以高精度显著降低检测限。此外，本发明的方法和系统可以区分活动性的和潜伏性的TB感染。

Description

体液样品中结核的检测方法
在先相关申请
本申请要求2020年8月5日提交的美国临时申请号63/061,674的优先权，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
联邦赞助的研究声明
不适用。
本发明领域
本发明总体上涉及一种用于诊断体液样品中结核的方法，并且更具体地涉及一种通过使用暗视野显微术的纳米等离子体增强测定法来检测体液样品中循环细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)上结核衍生抗原的方法。
本发明背景
全球结核病成为比早期估计更严重的负担，因为每年有潜在的数百万人既没有确诊又没有报告。结核病的及时诊断对于患者的积极预后仍然是迫切的。然而，诸如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)培养和痰涂片等传统技术耗时且灵敏度低。Xpert MTB/RIF试验能够在2小时内快速诊断结核并评估利福平耐药性，然而该试验的灵敏度依赖于痰液样品的高细菌负载。尽管在探索结核病原体衍生抗原标记物方面付出了巨大努力，世界卫生组织仅审核了脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan,LAM)，一种经鉴定可在活动性结核病期间流入尿液的结核抗原，可用于快速早期筛查HIV阳性的结核病患者。然而，未能在HIV阴性患者的尿液中检测到LAM限制了这些试验的适用性，因为85％的结核病患者为HIV阴性。此外，该试验仅适用于尿液样品。
理想的侵入性检测应同时测量体液中的致病靶标和宿主靶标，以在不同阶段(包括潜伏感染)实现对结核病检测的最高准确度。与致病过程密切相关的细胞外囊泡(EVs)可包含用于标记物发现的许多宿主和成分。作为一种被广泛研究和公认的结核病特异性标记物，在HIV阴性患者中检测LAM的失败可能是由于LAM被免疫复合物的形成所掩盖。LAM已被充分证实可介导EVs从巨噬细胞释放。
因此，需要开发一种能够快速、定量、超灵敏、非基于痰液的生物标志物的检测活动性结核病的检测方法。
本发明概述
在本发明的一个方面，描述了一种检测体液样品中结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis,MTB)特异性蛋白的方法。所述方法包括以下步骤：(a)提取体液样品中的细胞外囊泡(EVs)；(b)将抗体缀合纳米颗粒与步骤(a)中的EVs混合，其中所述抗体缀合纳米颗粒与抗MTB特异性蛋白的第一抗体缀合；和(c)使用暗视野显微术检测所述MTB特异性蛋白的存在。
在本发明的另一方面，描述了一种用于检测体液样品中MTB特异性蛋白的系统。所述系统包括：(a)暗视野显微镜；(b)样品基质；和(c)抗体缀合纳米颗粒，其中所述抗体缀合纳米颗粒与靶向MTB特异性蛋白的第一抗体缀合；其中所述样品基片包被有抗细胞外囊泡特异性(EV特异性)蛋白的第二抗体。
在本发明的另一方面，描述了一种通过检测体液样品中第一和第二结核分枝杆菌(MTB)特异性蛋白的存在来检测和确定结核感染状态的方法。所述方法包括以下步骤：a)提取体液样品中的细胞外囊泡(EVs)；b)将抗体缀合纳米颗粒与步骤(a)中提取的EVs混合，其中所述抗体缀合纳米颗粒与抗第一MTB特异性蛋白的第一抗体和抗第二MTB特异性蛋白的第二抗体缀合；c)使用暗视野显微术检测所述第一和/或第二MTB特异性蛋白的存在；和d)基于所述第一和第二MTB特异性蛋白的存在来确定结核感染状态。
在本发明的另一方面，描述了一种筛选抗MTB特异性蛋白的抗体的方法。所述方法包括以下步骤：(a)将MTB特异性蛋白固定在基片上；(b)将多个第一抗体引入所述基片上；(c)将纳米颗粒与步骤(b)中的混合物混合，其中所述纳米颗粒与第二抗体和信号发射基团缀合，其中所述第二抗体靶向第一抗体的重链恒定区；和(d)通过检测由所述纳米颗粒上的信号发射基团发射的信号来检测抗MTB特异性蛋白的抗体的存在。
在本发明的另一方面，描述了一种检测体液样品中细菌特异性蛋白的存在的方法。所述方法包括：(a)提取体液样品中的细胞外囊泡(EVs)；(b)将抗体缀合纳米颗粒与所述EVs混合，其中所述抗体缀合纳米颗粒与所述细菌特异性蛋白的特异性第一抗体缀合；和(c)使用暗视野显微术检测所述细菌特异性蛋白的存在。
在一个实施例中，所述体液样品可从患者获取。例如，所述体液可以是血液、血清、痰液、尿液或其他可用的体液。
在一个实施例中，所述第一抗体的抗原选自Mtb特异性抗原组，并且所述Mtb特异性抗原组由脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、抗原85B、LAM载体蛋白LprG和LpqH、α-晶体蛋白(HspX)、DnaK、GroEL2、KatG、SodA和GlnA组成。在一个实施例中，所述第二抗体的抗原选自同一组但不同于所述第一抗体。
在一个实施例中，使用捕获抗体，例如抗CD81或抗MTB抗体来提取所述EVs。还可以使用识别外泌体或MTB衍生EVs上的表面标记物的检测抗体，并且非限制性实例包括CD9、CD91、CD63、PDCD6IP、HSPA8、ACTB、ANXA2、PKM、HSP90AA1、ENO1、ANXA5、HSP90AB1、YWHAZ、YWHAE、LprG、LpqH、α-晶体蛋白(HspX)、DnaK、GroEL2、KatG、SodA和GlnA等。在一个实施例中，使用抗CD81抗体提取所述EVs。
在一个实施例中，所述纳米颗粒是当被光源激发时能够产生表面等离子体共振效应以显著增加无机荧光颗粒发射的荧光的那些颗粒。金纳米颗粒由于其稳定性和易于修饰的表面而最常用。为了与抗体缀合，金纳米颗粒的表面可被修饰，例如使用羧基。因此，带负电的金纳米颗粒可以与带正电的氨基形成共价键。然而，也可以使用其他纳米颗粒，并且非限制性实例包括由银(Ag)、氧化铋(Bi2O3)、铂(Pt)、氧化钆(Gd2O3)、氧化铁(Fe3O4)等制成的纳米颗粒，只要这些颗粒能够显示增强的散射光。
在本发明的另一方面，描述了一种用于筛选抗MTB特异性蛋白的抗体的系统。所述系统包括：基片，其中所述基片具有与所述MTB特异性蛋白形成共价键的包被层；MTB特异性蛋白；和纳米颗粒，所述纳米颗粒与抗IgG重链恒定区的抗体缀合。
如本文所用，“结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)”或“MTB”是指结核分枝杆菌科中的一种致病菌和结核病的病原体。MTB的增长速率很慢，大约每天翻一倍。
如本文所用，“样品”是指从受检者身上采集的少量生物物质。
如本文所用，“样品基片”是指一种样品可以放置在其上并通过显微术进行检查的基片。在一个实施例中，所述样品基片是载玻片，例如可在其上沉积多个样品的图案化载玻片。然而，也可以使用其他样品基片，例如由其他材料制成的载玻片或透明板。
如本文所用，“细胞外囊泡”或“EV”是指由脂质双层界定的颗粒，它们是从细胞、细菌中自然释放出来的，不能自我复制。EVs的直径范围为从约20-30nm至约10μm或更大。EVs能够在细胞之间转移核酸，如RNA。EVs通常通过超离心或密度梯度超离心、尺寸排阻色谱法、超滤，和亲和/免疫亲和捕获法从体液样品中分离。某些EV富集标记物可用于更好地分离EVs。EV富集标记物的实例包括但不限于CD81、PDCD6IP、HSPA8、ACTB、ANXA2、CD9、PKM、HSP90AA1、ENO1、ANXA5、HSP90AB1、CD63、YWHAZ、YWHAE等，以及针对LprG、LpqH、α-晶体蛋白(HspX)、DnaK、GroEL2、KatG、SodA和GlnA的抗体。
如本文所用，“暗视野显微术”是指从图像中排除未散射光束的显微术方法，从而使样本周围的背景变暗。在光学显微术中，暗视野描述了一种用于增强未染色样品中对比度的照明技术，其通过使用不会被物镜收集并因此不会形成图像的一部分的光来照射样品而实现。当与高光谱成像相结合时，暗视野显微术可用于表征嵌入细胞中的纳米材料，例如具有特定标记物的靶向细胞的金纳米颗粒。
如本文所用，“抗体缀合纳米颗粒”是指与抗靶抗原的特异性抗体缀合的纳米颗粒。所述抗体和纳米颗粒之间的缀合可以是静电相互作用(物理吸附)或在金属表面上抗体定向的共价缀合作为偶联方法。据报道，纳米颗粒与抗体的静态离子吸附具有较差的再现性、抗体的随机定向，以及在不同pH条件下的低稳定性。通过用活性基团(如羧基和氨基)修饰纳米颗粒表面的共价偶联促进了与抗体的氨基酸侧链的生物偶联。
如本文所用，抗原85B是指被发现在MTB培养液中产生的抗原85(Ag85)复合物(Ag85A、Ag85B、Ag85C)的一种亚单位。所述85A、85B和85C蛋白由位于分枝杆菌基因组不同位置的三个基因编码，并在氨基酸和基因水平上显示出广泛的交叉反应性和同源性。
如本文所用，“LAM载体蛋白LprG”是指脂阿拉伯甘露聚糖载体蛋白LprG。
如本文所用，“LpqH”是指MTBs中发现的脂蛋白LpqH。19kDa结核分枝杆菌脂蛋白(LpqH)通过外部和内部途径诱导巨噬细胞凋亡：线粒体凋亡诱导因子的作用。
如本文所用，“α-晶体蛋白(HspX)”是指小噬细胞中分枝杆菌持续存在所需的16kDa热休克蛋白HspX。
如本文所用，“DnaK”是指细菌分子伴侣蛋白DnaK。分子伴侣是与其他蛋白质结合的蛋白质，从而以ATP依赖的方式稳定它们。DnaK是一种酶，它将N-末端ATP水解结构域所致的ATP结合、水解和ADP释放的循环与C-末端底物结合结构域所致的未折叠蛋白的螯合和释放的循环相结合。
如本文所用，“GroEL2”是指与位于结核分枝杆菌细胞壁外层的Cpn60.1分子伴侣密切相关的60kDa伴侣蛋白2(又名Cpn60.2)。已发现结核脑膜炎患者的脑脊液中存在GroEL2。
如本文所用，“KatG”是指结核分枝杆菌中由katG基因编码的过氧化氢酶-过氧化物酶，它激活前药INH。结核分枝杆菌katG基因突变是一种主要的INH耐药机制。
如本文所用，“SodA”是指超氧化物歧化酶[Fe]。对于MTB检测，除非另有规定，否则SodA特指MTB SodA。
如本文所用，“GlnA”是指谷氨酰胺合成酶。对于MTB检测，GlnA特指MTB GlnA。
如本文所用，“PDCD6IP”是指程序性细胞死亡6-互作蛋白，其编码被认为参与程序性细胞凋亡的蛋白。
如本文所用，“HSPA8”是指人热休克70kDa蛋白8，也称为热休克同源71kDa蛋白或Hsc70或Hsp73。作为热休克蛋白70家族的成员和伴侣蛋白，它有助于新翻译的和错误折叠的蛋白的正确折叠，以及稳定或降解突变蛋白。
如本文所用，“ACTB”是指人β-肌动蛋白，它是已在人类中被鉴定的六种不同的肌动蛋白亚型之一。
如本文所用，“ANXA2”是指膜联蛋白A2，其参与多种细胞过程，如细胞运动、膜相关蛋白复合物与肌动蛋白细胞骨架的连接、内吞作用、纤维蛋白溶解、离子通道形成和细胞基质相互作用。
如本文所用，“PKM”是指丙酮酸激酶M1/2，其催化磷酰基从磷酸烯醇式丙酮酸向ADP转移，生成ATP和丙酮酸。
如本文所用，“HSP90AA1”是指人热休克蛋白HSP90α(胞浆)，成员A1。Hsp90A在细胞经历蛋白毒性应激时开始表达，以具有超过85％的氨基酸序列同一性的组成性表达的同源Hsp90B作为补充。一旦表达，Hsp90A二聚体作为分子伴侣发挥作用，与其他蛋白质结合并将其折叠成它们的功能性三维结构。
如本文所用，“ENO1”是指α-烯醇化酶，它是一种在大多数组织中表达的糖酵解酶。每个同工酶都是由2个α、2个γ或2个β亚基组成的同型二聚体，作为糖酵解酶发挥作用。此外，α-烯醇化酶还作为单体形式的结构晶状体蛋白(tau-晶体蛋白)发挥作用。
如本文所用，“ANXA5”是指膜联蛋白A5，它是膜联蛋白组中的一种细胞蛋白。ANXA5能够与磷脂酰丝氨酸结合，磷脂酰丝氨酸是细胞凋亡的标志物，位于质膜的外叶上。
如本文所用，“HSP90AB1”是指热休克蛋白HSP90-β，一种分子伴侣。
如本文所用，“YWHAZ”是指14-3-3蛋白ζ/δ，它是14-3-3蛋白家族的成员，也是许多信号转导途径的中枢蛋白。它是对细胞生存至关重要的凋亡途径的主要调节因子，在许多癌症和神经退行性疾病中起着关键作用。
如本文所用，“YWHAE”是指14-3-3蛋白ε，14-3-3家族的成员，其通过与含磷酸丝氨酸的蛋白结合而介导信号转导。
除非上下文另有规定，否则当与权利要求或说明书中的术语“包括”一起使用时，“一”或“一个”一词的使用是指一个或多个。
如未指明测量方法，术语“约”是指所述值加上或减去测量误差裕度，或加上或减去10％。
除非明确表示仅指替代方案或者如果替代方案相互排斥，否则权利要求中术语“或”的使用是指“和/或”。
术语“包括”、“具有”、“包含”和“含有”(及其变体)是开放式连接动词，允许在权利要求中添加其他元素。
短语“由……组成”是封闭的，不包括所有其他元素。
短语“基本上由……组成”不包括额外的材料元素，但允许包括不会实质上改变本发明性质的非材料元素。
本文使用以下缩写：
缩写 术语
Ag85b 抗原85B
AuNRs 金纳米棒
EVs 细胞外囊泡或外泌体
LAM 脂阿拉伯甘露聚糖
LC 液相色谱法
MS 质谱法
MTB 结核分枝杆菌
nPES 纳米等离子体增强散射
TB 结核
附图简要说明
图1.用于标记物发现的TB感染的巨噬细胞中EVs的纯化和表征，包括蛋白质鉴定和脂质聚糖确认。(a)用于标记物发现的体外TB感染模型方案。(b)使用LC-MS蛋白质组学从TB感染的巨噬细胞中分离的EVs中鉴定的不同类型的蛋白质数量。(c)热图显示了培养基和使用LC-MS蛋白质组学从TB感染的巨噬细胞中纯化的EVs之间的几种蛋白质的折叠变化。(d)蛋白免疫印迹用于确认来自不同TB菌株、EVs和来自TB感染的巨噬细胞的细胞质的培养过滤蛋白(culture filter protein,CFP)中的LAM(37kDa)。
图2.纳米等离子体增强免疫测定法对TB感染的巨噬细胞衍生EVs上的TB抗原进行高灵敏度检测。(a)使用基于AuNRs的纳米等离子体增强免疫测定法在EVs上检测TB抗原的方案。(b)AuNRs的UV-vis光谱。(c)AuNRs的TEM图像。(d-g)不同浓度AuNRs的暗视野图像。(h)来自不同浓度AuNRs的暗视野图像的信号的量化。(i)从含有不同浓度LAM的样品的暗视野图像中量化的强度。平均值±SD；n＝6。(j)使用捕获抗体和检测抗体的不同组合，将包含10μg/mL TB感染的巨噬细胞衍生EVs的样品的暗视野图像的强度与不存在EVs时的强度进行比较。(k)使用抗CD81抗体作为捕获抗体和抗LAM抗体(A194-01)作为检测抗体，从含有不同浓度TB感染的巨噬细胞衍生EVs的样品的暗视野图像中量化的强度，平均值±SD；n＝6。
图3.采用纳米等离子体增强免疫测定法诊断儿童HIV阴性患者的结核病的性能应用。(a)来自血清、纯化EVs或来自4个TB患者血清样品、2个对照血清样品的EVs纯化后的上清液的强度。(b)使用抗LAM作为检测抗体，对15个TB患者血清样品和5个对照血清样品进行纳米等离子体增强免疫测定法检验的强度和用ELISA检验的OD450。(c)当使用抗LAM抗体作为使用传统ELISA的检测抗体时，来自TB患者样品和对照样品的强度。(d-f)当使用(d)抗LAM、(e)抗LprG、(f)抗LpqH作为检测抗体时，来自TB患者样品和对照样品的强度。t检验，**，p<0.01，***，p<0.001。(g)使用具有不同检测抗体的纳米等离子体增强免疫测定法和使用抗LAM抗体的ELISA，对20个越南样品进行诊断的ROC曲线。
图4A显示了原理图和分析示意图。OMVs：Mtb外膜囊泡。
图4B.未感染和Mtb H37Rv感染的巨噬细胞分泌的EVs的大小分布。
图4C显示了患有肺结核(pulmonary TB,PTB)、潜伏性TB感染(latent TBinfection,LTBI)的非人灵长类动物或其健康对照(Ctrl)的血清EVs上的LAM和LprG(三次技术重复的平均值±SD)。
图4D显示了EV-ELISA检测患有TB(N＝10)和无TB证据的儿童的血清EVs上的LAM、LprG以及综合LAM和LprG(LAM+LprG)的表达(对照；N＝5；通过非参数Kruskal-Wallis单因素ANOVA和Dunn's后测，平均值±SE，*p<0.05和**p<0.01)。
图5A是NEI图像捕获工作流程和信号的示意图。
图5B.EV LAM和LprG NEI信号与使用来自Mtb感染的巨噬细胞的EVs生成的Mtb EV浓度曲线呈线性。
图5C.对单个和综合的EV LAM和LprG NEI信号的区分患有和不患有TB的儿童的能力进行受试者工作特征(Receiver operating characteristic,ROC)分析，显示ROC曲线下的区域。
图5D-F.在患有TB(N＝10)和无TB证据(N＝5)的儿童的血清EVs上的(D)LAM、(E)LprG和(F)综合LAM和LprG表达的NEI信号。实线表示平均值±SE；虚线表示在相应ROC分析中确定的阳性信号阈值(C)
图6.结核高风险的HIV感染儿童的Mtb EV NEI诊断表现。根据以下确定的确诊TB、待确认TB和不太可能患有TB的儿童的NEI信号：呼吸培养物/Xpert或粪便Xpert阳性结果、符合NIH标准的TB相关症状持续时间、胸部X光检查(chest X-ray,CXR)结果、密切接触TB或TST阳性、ATT应答阳性和/或TB相关死亡。
图7A是用于NEI分析读数的基于便携式智能手机的DFM设备的示意图。
图7B显示了图7A中使用的暗视野聚光掩模。
发明详述
本发明提供了检测体液样品和提取的EVs中MTB的存在的新方法和系统，其与需要痰液样品的传统TB检测方法不同。体液样品，如血液、唾液或尿液，更容易从患者身上提取，而痰液样品则很难获得。
此外，本发明的方法和系统可用于在数小时内快速确定MTB的存在，即使体液样品仅含有少量MTB蛋白。传统的TB检测方法需要痰液培养，这需要1-8周的时间。快速的运转时间有助于医生做出治疗决定，并防止结核病的传播。
此外，本发明的方法能够通过提取EVs而无需浓缩来高精度地检测TB。在其他实践中，一旦提取EVs，通常进一步进行离心步骤以浓缩EVs。然而，在本发明中，高灵敏度的纳米颗粒和暗视野显微镜使得即使在体液样品中也更容易检测TB，而无需进一步提高样品中EVs的浓度。
此外，本发明的方法和系统可用于检测非HIV患者和潜伏患者中的TB。传统的TB检测只对HIV阳性患者敏感，也不能区分潜伏TB患者和TB阴性患者。本发明的方法和系统被显示可检测HIV阴性患者中MTB的存在，并且还能够检测潜伏的、无症状的TB患者中MTB的存在。本发明的方法、系统的高灵敏度和特异性允许通过使用体液样品而不是痰液进行检测，因为体液样品更容易获得。
也许更重要的是，本发明的方法和系统提供了可用于区分活动性TB患者和潜伏性TB患者的生物标志物的组合。
为了实现这些结果，本发明描述了一种用于检测体液样品中MTB特异性蛋白的存在的方法，包括以下步骤：a)提取体液样品中的细胞外囊泡(EVs)；b)将纳米颗粒与所述EVs混合，其中所述纳米颗粒与MTB特异性蛋白的特异性第一抗体缀合；和d)使用暗视野显微术检测MTB的存在。
或者，本发明描述了一种筛选针对MTB特异性蛋白的抗体的方法，包括以下步骤：a)将MTB特异性蛋白固定在基片上；b)将多个第一抗体引入所述基片上；c)将纳米颗粒与步骤(b)中的混合物混合，其中所述纳米颗粒与第二抗体和信号发射基团缀合，其中所述第二抗体靶向第一抗体的重链恒定区；和d)通过检测由信号发射颗粒发射的信号来检测抗MTB特异性蛋白的抗体的存在。这种筛选方法可有效地筛选大量抗体，以获得靶向所述MTB特异性蛋白的抗体。
本发明还描述了一种用于检测体液样品中MTB蛋白的系统，包括：a)暗视野显微镜；b)样品基片；和c)抗体缀合纳米颗粒，其中所述抗体缀合纳米颗粒包括靶向所述MTB蛋白的抗MTB抗体，其中所述样品基片包被有抗细胞外囊泡特异性蛋白的第二抗体。
或者，本发明描述了一种通过检测体液样品中第一和第二结核分枝杆菌(MTB)特异性蛋白的存在来检测和确定结核感染状态的方法。所述方法包括以下步骤：a)提取体液样品中的细胞外囊泡(EVs)；b)将抗体缀合纳米颗粒与步骤(a)中提取的EVs混合，其中所述抗体缀合纳米颗粒与抗第一MTB特异性蛋白的第一抗体和抗第二MTB特异性蛋白的第二抗体缀合；c)使用暗视野显微术检测所述第一和/或第二MTB特异性蛋白的存在；和d)基于所述第一和第二MTB特异性蛋白的存在来确定所述结核感染状态。
本发明的方法和系统着重于受试者中具有至少一种MTB蛋白的细胞外囊泡。EVs具有可被抗体靶向的特异性表面标记，而至少一种MTB蛋白也具有被抗体靶向的表位。因此，人们可以在含有EVs的体液中同时检测致病靶标和宿主靶标。
本发明描述了一种检测样品中MTB的存在的新方法，首先提取样品中的细胞外囊泡(EVs)，然后从所述EVs中检测MTB特异性标记物。要做到这一点，第一步要识别EVs中存在的MTB特异性标记物，因而可以捕获这些标记物。
1.TB特异性标记物的识别
为了探索EVs的TB特异性标记物，使用TB感染巨噬细胞，以便通过以下步骤体外分离EVs供蛋白质组学研究。如图1a所示，标记物发现是用体外TB感染模型进行的。用TB感染巨噬细胞后，将巨噬细胞分泌的细胞外囊泡(EVs)纯化。此外，还进行了用于蛋白标记物的鉴定基于液相色谱-质谱的蛋白质组学(liquid chromatography mass spectrometry-based proteomics，LC-MS蛋白质组学)研究和用于糖脂确认的免疫测定。
活性MTB感染后巨噬细胞培养基的收集
为了提供更准确和实际的结果，以TB感染的巨噬细胞为基础进行实验很重要。使用了以下材料：
所需总样品：T175培养瓶的培养基(4X 10X 35-52.5ml＝1400-2100mL)，每个培养瓶含有MTB感染的(MOI＝10:1)激活的THP-1(2.5x 107)[4小时感染]
细胞、细菌和试剂：THP-1TIB202TM,M.tb H37Rv(理想情况下一些具有不同毒力的其他菌株)、RPMI 1640无PS培养基、RPMI 1640(无FBS、无PS)培养基。
THP-1细胞培养(TIB202TM)在37℃水浴中解冻冷冻细胞。解冻应迅速(约2分钟)。
1.将小瓶内容物转移到含有9.0mL完整培养基的离心管中。然后以约125x g的速度旋转5分钟。
2.计数细胞数和存活率(不低于95％)。用终浓度为3x 105活细胞/ml的完整培养基重悬细胞颗粒。
3.在37℃条件下，在含有5％CO2的合适培养箱中孵育所述培养物。
4.当细胞浓度达到8x105细胞/ml时进行传代培养。细胞浓度不得超过1x 106个细胞/ml。将所述培养基离心并以与上述相同的方式重悬细胞颗粒。
5.当总数量达到2.5x 108个细胞时，将细胞平均分配到10个T175培养瓶(35-52.5ml)(2.5x 107个细胞/培养瓶)中，并添加500ng/ml PMA 24小时以将THP-1细胞分化为巨噬细胞。
6.检查细胞的形态，如果细胞已经充分伸展，则轻轻移去培养基，用37℃PBS清洗细胞三次。
然后细胞就可以接受感染了。
活性MTB感染THP-1
i).MOI＝10，THP-1感染需要的非成团结核分枝杆菌总数(M.tb H37Rv原液)＝2.5x 109。
ii).在少量(5-10mL)含有10％FBS的RPMI 1640培养基中重悬Mtb颗粒，通过短暂的水浴超声去除团块，并使所述Mtb颗粒通过装有27号针头的注射器至少10次。
iii).加入更多的RPMI 1640无PS培养基(PS＝青霉素和链霉素)和10％FBS，并将其充分混合。然后将混合物等分到10个巨噬细胞培养瓶中(每个培养瓶20mL RPMI无PS培养基)。
iv).在培养条件下感染4h。
v).感染后，去除混合物，用37℃PBS(10ml/次，3次或更多次)轻轻清洗细胞(在显微镜下检查)。
vi).向培养瓶中加入RPMI 1640(无FBS，无PS)，孵育48小时。
vii).收集培养基。使用0.45μm滤器过滤培养基以去除细菌。将培养基保存在-80℃冰箱中，接种少量培养基3-4周(Mtb)，以确保不存在活菌。
收集上述培养基中的上清液用于EVs分离，然后使用标准程序进行LC-MS蛋白质组学研究。EVs的分离在本领域是众所周知的，因此在此不再赘述。
如图1(b)所示，发现可以从TB感染的巨噬细胞衍生EVs中检测到78种TB衍生的蛋白质，其中36种是膜蛋白，可以呈现在EV膜的表面上，用于进一步检测而不破坏EVs。36种蛋白质中的17种显示出高丰度，并显示出作为TB诊断进一步检测的标记物的前景。
本文鉴定的TB衍生EV特异性标记物包括脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、抗原85B(Ag85B)、LAM载体蛋白LprG和LpqH、α-晶体蛋白(HspX)、DnaK、GroEL2、KatG、SodA和GlnA。
如图1(c)所示，与TB感染的巨噬细胞培养基相比，TB感染的巨噬细胞衍生EVs中的几种蛋白质(包括Ag85B、DnaK、EsxA、EsxO、EsxN、LprO和PepA)显著过表达。在这些蛋白质中，与来自TB感染的巨噬细胞衍生EVs的培养基相比，Ag85b在EVs中显示出最高的倍数变化。由于LC-MS对LAM(一种众所周知的糖脂(37KDa)，在TB感染期间起着关键作用)不敏感，因此使用两种不同的抗LAM抗体(克隆号：CS-35、CS-40)作为检测抗体进行了蛋白免疫印迹，以确认LAM也存在于从TB感染的巨噬细胞的不同菌株中分离的EVs中。图1(d)中的结果证实了LAM的存在。
2.标记物的验证
随后通过蛋白免疫印迹验证筛选实验中发现的标记物(数据未显示)。
3.检测EVs中Mtb的存在情况
我们开发并优化了纳米等离子体增强免疫测定法，以实现对TB感染的巨噬细胞衍生EVs上TB抗原的高灵敏度检测。将1μl小鼠抗CD81抗体(5μg/mL)包被在图案化载玻片上。洗涤和封闭后，加入1μL血清，在37℃孵育1小时，然后用PBS再洗涤2轮。然后使用1μL生物素官能化的人抗LAM抗体(1μg/mL,A194-01)捕获EVs上的LAM。之后，固定化的抗体可以使亲和素官能化的金纳米颗粒缀合，以产生可以用暗视野显微术观察到的散射信号。
本发明中使用的人抗LAM抗体(A194-01)是针对脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)和磷脂酰肌醇甘露糖苷6(phosphatidyl-myo-inositol mannoside 6,PIM6)中发现的表位的单克隆抗体，用于MTB感染的诊断和治疗。人单克隆抗LAM抗体A194-01分离自从TB感染患者TB-194获得的经培养记忆B细胞。
请参考图2a。用捕获抗体将EVs捕获在载玻片上，并使用检测抗体将TB抗原结合在EV膜上。本文中所述检测抗体进一步与金纳米棒(AuNRs)缀合，以供信号读数。AuNRs的信号读数如图2b所示。
如图2c所示，AuNRs在TEM下在650nm处显示出具有均匀尺寸分布的吸收峰，并且如图2d-g所示，在暗视野显微术下显示出随着AuNRs浓度的增加而逐渐增加的红色散射光。如图2h所示，通过计算散射物体的数量和形成这些图像的像素的平均强度来量化信号，平均强度显示出与AuNRs浓度的更好的线性响应。
如图2(i)所示，LAM被用作该方法的示例性靶标，测试了几种抗LAM抗体(CS-35、CS-40和A194-01)。CS-35显示了具有相对较高背景的最强信号，而A194-01显示了对LAM的最佳线性响应。进一步测试捕获抗体和检测抗体的不同组合，以检测10μg/mL TB感染的巨噬细胞衍生EVs。如图2j所示，使用抗CD81抗体作为捕获抗体和抗LAM抗体(A194-01)作为检测抗体，在纳米等离子体增强免疫测定法下产生了相对于空白对照(在没有EVs的情况下)的强信号比率，并且获得了0-15μg/mL的动态范围以便在这种抗体组合下检测TB感染的巨噬细胞衍生EVs(图2k)。该范围为TB特异性EVs提供了实际检测限。该CD-81/A194-01组合进一步用于检测血清样本中的EVs，用于TB诊断。
本发明的方法也用于从患者血清样品中检测EVs上的TB抗原，结果如图3所示。在图3a中，使用抗CD81抗体作为捕获抗体和抗LAM抗体(A194-01)作为检测抗体，来自TB患者的这些样品的全血清和纯化EVs均显示阳性结果。
15名未经治疗的TB患者的血清和5份对照血清进行了进一步测试，结果如图3b所示。与对照相比，这些样品中的大多数可以产生更高的信号。相反，传统的ELISA无法区分TB和对照组。
抗LprG、抗LpqH(两种LAM载体蛋白)和抗Ag85B也用作纳米等离子体增强免疫测定法中的检测抗体，结果如图3c-e所示。当使用抗LAM(图3c)、抗LprG(图3d)和抗LpqH(图3e)作为检测抗体时，在TB和对照组之间观察到显著性差异。TB患者和对照样品之间的明显区别表明，本发明的方法可以有效地检测样品中TB的存在。
曲线下面积(AUC)是测试方法灵敏度/特异性的量度，AUC越大表示测试结果越好。如图3f所示，对于传统的ELISA，AUC仅为0.68，而对于传统的基于Ag85B的纳米等离子体增强免疫测定法，AUC为0.627。相反，根据本发明，使用抗LAM、抗LprG和抗LpqH分别作为检测抗体，同时使用A194-01作为捕获抗体，纳米等离子体增强免疫测定法实现了0.91、0.90和0.83的AUC。结果表明，使用本发明的测定可以实现有效TB诊断的更高灵敏度和选择性。
从15名TB患者中收集了额外的样品并进行了检测。分析了来自15名TB患者(TB1-14和16)、5个对照血清样品(C1-5)和两个外泌体对照样品(THP1和THP1+CFP)的暗视野图像结果以及标准化测试强度结果(未展示)。
这些结果清楚地表明，本发明的方法和系统可以检测体液样品(如血液样品)中MTB的存在，并区分TB阴性和TB阳性样品。本发明的方法和系统还可以检测HIV阴性患者中MTB的存在，这在本领域中尚未得到证实。此外，快速检测过程确保了快速和准确的诊断，与常规培养测试相比，减少了等待时间。
此外，图像识别软件也可优化免疫测定的信号读数，以降低检测限。另据报道，不同类型的EVs可能会提高检测的准确性，因此，进一步的重点是从患者尿液或血清样品中定量不同类型EVs中的LAM和其他标志物。最后，将LAM和宿主标记物的浓度与TB患者的临床信息相关联，也可以为选择合适的治疗方案提供见解。
4.EVs中Mtb的自动检测
自动化纳米颗粒-增强EV免疫测定法(NEI)使用机器学习来检测Mtb感染细胞分泌的EVs(Mtb-EVs)，基于其在Mtb外膜上大量表达的因子的表面表达。脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)是本实施例的靶标之一，因为它占Mtb生物量的15％，并调节Mtb的毒力。另一个靶标是LprG，它是将LAM分布到外层细胞被膜所需的。据推测，Mtb感染的巨噬细胞分泌的EVs将表现出可作为TB疾病生物标志物的LAM和LprG的表面表达，并且这些Mtb EVs将积聚在外周血液循环以及其他体液(如尿液、唾液等)中，因此允许肺部和肺外TB的检测(图4A)。
通过NEI方法，发现当整合了LAM和LprG的EV表面表达的组合Mtb-EVs生物标志物标记可以在非人灵长类疾病模型中区分活动性TB和潜伏性TB感染(LTBI)时，可将肺外和肺部TB儿童与TB阴性儿童对照区分开来，并可在具有诊断挑战性的群体——住院的、严重免疫抑制的HIV感染儿童中诊断TB，这些儿童是TB高风险人群。
Mtb感染的巨噬细胞分泌的EVs表达LAM和LprG。为了评估EV LAM和LprG表达作为Mtb感染或TB疾病的生物标志物的潜在能力，我们首先检测了这些因子在Mtb感染的巨噬细胞分泌的EVs上的表达。从感染或未感染Mtb H37Rv参考菌株的巨噬细胞培养物中分离的EVs显示出相似的形态和大小分布(未展示)，尽管Mtb感染的巨噬细胞分泌的EVs明显更多(图4B，2.3×109vs.1.1×109EVs/mL，通过Kruskal-Wallis检验，p<0.01)。基于对显示出不同的生长速率和免疫原性的Mtb菌株感染的巨噬细胞的等量胞浆、细胞膜和EV蛋白提取物的分析，LAM和LprG显示出显著的EV富集，表明其作为Mtb感染的菌株独立性生物标记物的潜在效用(未展示)。
EV-ELISAs是检测EV表面标志物25的金标准方法，通过用Mtb培养滤液蛋白(CFP)提取物孵育的巨噬细胞产生的EVs的连续稀释，还检测到了LAM和LprG信号中的剂量依赖性增加(未显示)，验证了两种标志物的表面表达。
接下来，通过分析从未感染Mtb的或在接触Mtb后发展为LTBI或肺结核(PTB)的非人灵长类动物分离的血清EVs，评估血清EV LAM和LprG区分活动性TB、潜伏性TB感染(LTBI)和健康对照的能力。本分析中采用了NHP模型，以便在活动性TB和LTBI之间进行可靠的区分，因为很难将LTBI与人类患者群体中的初发或亚临床TB区分开来。当用LAM和LprG EVELISAs分析时，从未感染Mtb的NHPs分离的血清EVs具有低的非特异性背景信号(图4C)，而LTBI组的血清EVs显示LAM或LprG的表达升高，但不是两者都升高，大多数具有LTBI的NHPs显示LprG信号升高。然而，来自PTB组的血清EVs表现出LAM和LprG的表达升高，这表明了线性关系，这两个因子可以作为特异性TB诊断的复合生物标志物。图4D是EV-ELISA检测患有TB(N＝10)和无TB证据的儿童的血清EVs上的LAM、LprG以及整合LAM和LprG(LAM+LprG)的表达。结果表明，与TB阴性对照组相比，TB患者的LAM和LprG表达均显著升高。这进一步表明LAM和LprG是TB的阳性生物标志物。
作为一项基于人群的大型结核病监测研究的一部分，对从一个小规模、良好表征的病例-对照儿童群体(登记于越南国立肺科医院(National Lung Hospital,NLH))的存档血清中分离的EVs进行了类似分析(未展示)，发现TB和非TB对照组的平均EV LAM与综合EVLAM和LprG信号不同，但EV LprG信号无区别。其他Mtb衍生的膜相关因子在这两组的血清EVs中没有差异(未展示)，除了LpqH，其在TB和非TB组之间比LAM或LprG具有更多的信号重叠。
5.NEI以高灵敏度检测Mtb EVS上LAM和LprG的表达
鉴于靶标EVs不能通过EV ELISA直接从血清中捕获和分析，我们研究了基于暗视野显微镜(DFM)的NEI方法改进靶标EV检测的可行性。这样的测定可以从复杂的生物样品中捕获EVs，而无需耗时的分离步骤，并通过检测从金纳米棒(AuNR)探针散射的光来识别特异性的EV群体，其中所述金纳米棒探针结合到所述EV群体外膜上的靶标生物标记物。通过分析样品孔的高倍或低倍DFM图像来读取NEI信号。高倍分析允许超灵敏检测，但需要手动聚焦以检测来自相互作用纳米颗粒的等离子体信号，这可能会由于采样分析孔的有限区域而引入选择偏差。低倍DFM分析可以自动化，因此更适合临床应用，但会受到可能增加背景和降低灵敏度的伪影的影响。
然后建立了NEI工作流程(图5A)，该工作流程允许自动捕获低倍DFM图像，该图像使用自定义降噪算法进行处理以减少测定过程中引入的来自血清聚集物、微粒和表面划痕的伪影。该算法检测并裁剪感兴趣区域(ROI)；将每个图像转换成HSB(色调、饱和度、亮度)颜色空间；并且将阈值归一化并应用于每个HSB信道以识别AuNR衍生的信号(未展示)。该方法显著减少了信号伪影，表现为在处理图像及其像素强度图中AuNR信号的增强(未展示)。对于信号检测，通过量化正像素和平均像素强度对AuNR稀释曲线进行分析发现，后一种方法具有更大的线性度和更小的变化(未展示)。
为了确定在低浓度下(接近EV-ELISA的检测限)最大程度提高靶标EVs的信噪比所需的探针浓度，通过非特异性结合捕获从Mtb感染的巨噬细胞中分离的EVs，并将其与抗LAM抗体缀合的AuNRs的稀释液杂交(未展示)。捕获和检测抗体对的评估确定了抗CD81捕获抗体和两种抗LAM(A194-01，科瑞佰莱生物科技有限公司(Creative Biolabs))和抗LprG(克隆B)检测抗体产生了最佳的信噪比(分别为10.21和7.25)，并且在广泛的EV浓度范围内(0-150ng EV蛋白/mL；图5B)使用时都具有良好的线性和可变性。
对NHL发现群体的血清作NEI分析发现，血清EV LprG和LAM信号在区分TB组和非TB组方面表现出相似的能力，但通过逻辑模型(参见方法)整合的EV LAM和LprG信号具有优异的差异表现(图5C)，如使用这些分析中每个的阈值来区分TB和非TB组时所示(图5D-F)。该分析表明，在EV LAM或LprG信号的阈值附近，TB和非TB组之间存在大量信号重叠，导致三个假阴性和一个假阳性分类，而整合LAM和LprG信号只产生一个假阴性识别。LAM和LprG的NEI信号在EV富集而非EV耗竭的血清组分中检测到，证实NEI信号是EV特异性的(未展示)。与EV富集样品的结果不同，当EV-ELISA用于直接分析这些组的血清时，EV LAM和LprG信号没有区分出TB和非TB病例，这表明EV-ELISA缺乏血清应用所需的敏感性。当儿童TB病例按年龄、性别或TB表现(肺部或肺外)分层时，NEI信号没有差异，这表明NEI信号是TB疾病的一般标志物。
6.TB症状HIV感染儿童群体中Mtb EV生物标志物的验证
接下来，我们在具有诊断挑战性的HIV感染儿童群体中评估了NEI检测性能，这些儿童是TB相关发病率和死亡率的高风险人群，而呼吸采样往往会遗漏这些风险。这项分析采用了在肯尼亚进行的多地点儿科急诊与稳定后高效抗逆转录病毒疗法(activeantiretroviral therapy,ART)启动145试验(PUSH)中从HIV感染儿童收集的血清，这些儿童住院治疗但在登记入院时尚未开始ART治疗。这项研究中的大多数儿童表现出严重的免疫抑制以及一些与TB一致的症状。根据2015年NIH儿科临床TB病例的定义，对儿童进行回顾性分类：如果他们有TB的微生物学证据(Mtb培养阳性或呼吸道或粪便样品Xpert结果阳性)，则定义为已确诊TB；待确认TB(基于以下两项或多项标准：TB症状、异常CXR、密切接触TB或Mtb感染证据(即TST阳性)，或对TB治疗的阳性应答)；或者如果他们缺乏待确认TB诊断所需的两项标准，则定义为不太可能患有TB。确诊TB和待确认TB的儿童，其症状(72.7％与85.5％)和胸部影像学检查结果(90.9％与80.6％)与TB一致的几率很高，大多数儿童在两种TB标准中都表现出阳性结果(63.6％与81.1％；图6)，尽管根据专家评审小组确定的抗TB治疗(ATT)应答或与TB相关的死亡，有一个儿童亚组从不太可能患有TB重新分类为待确认TB(图6，亚组A)。不太可能患有TB的儿童经常出现与TB一致的症状或胸部影像学检查结果(65.7％与31.8％)，但两项标准均为阳性结果的儿童亚组被归类为不太可能患有TB，因为在未开始ATT的情况下开始ART后，其TB相关症状有所改善(图6，亚组B)。
NEI分析使用先前在NLH发现群体中确定的阳性信号阈值，由对临床信息不知情的操作员进行，检测到确诊TB和待确认TB，诊断敏感性分别为90.9％和72.5％(表2)。NEI结果对有或无临床TB诊断的待确认TB病例表现出相似的敏感性(图6)，并检测到了除一例确诊TB病例外的所有病例(未展示)。NEI结果还检测到大多数(52.7％)不太可能患有TB的儿童，他们至少具有一项待确认TB诊断所需的标准(表2)。由于年龄匹配的低风险群体不适用，NEI诊断的特异性在一个不太可能患有TB的儿童亚组中进行了评估，这些儿童不具有任何符合NIH病例定义特征阈值的临床结果。该组的中位Mtb EV信号显著低于所有其他组。确诊TB和待确认TB儿童的ATT成功应答率较高(87.2％与66.7％；表1)。ATT启动后，确诊TB儿童的死亡率高于待确认TB儿童(33.3％与8.5％；表2)，但研究期间未诊断和未治疗的待确认TB儿童(31.9％22/69)的死亡率更高(45.5％)，而不太可能患有TB儿童的死亡率更低(18.2％)，尽管死亡的不太可能患有TB儿童经常缺少微生物学或CXR结果(图6，亚组B)。尿液LAM结果显示，确诊TB(42.8％；7例中的3例)的诊断敏感性较差，待确认TB(5.6％；53例中的3例)的检测结果有效，不太可能患有TB的病例(88.7％；53例中的47例)的特异性中等，其中所述不太可能患有TB的病例包括不符合TB标准的儿童(88.3％；12例中的10例)。
7.血清Mtb EV信号与TB重新分类和治疗的对应关系
使用在登记入院就诊时收集的症状或胸部影像学数据对大多数待确认TB儿童作出诊断，但根据随后的结果(包括专家小组判断为与TB相关的死亡或对ATT的阳性应答)(未展示)，有一个儿童亚组从不太可能患有TB重新分类为待确认TB(17.9％；12/67)。重新分类决定是在不了解EV结果的情况下做出的，大多数从不太可能患有TB重新分类为待确认TB的儿童(83.3％；10/12)在基线具有可检测到的Mtb EV NEI信号，并且这些值在TB重新分类后可获得血清的儿童中仍保持阳性(未展示)。相反，被重新分类为不太可能患有TB(由于症状改善而未开始ATT)的大多数待确认TB病例在基线具有阳性Mtb EV NEI信号(75％；9/12)，该信号在重新分类时显著下降(88.9％；8/9；数据未展示)。总之，这些结果表明，反映MtbEV降低的血清NEI信号的纵向降低与具有ATT应答的TB疾病的解决相关，还可能与免疫重建的清除或抑制相关。
8.用于Mtb EV测定信号读数的便携式DFM装置的设计和验证
为了使该测定平台适应TB流行的资源有限的环境，我们使用3D打印机制造了一种廉价且便携式的基于智能手机的DFM设备，该设备可以在5分钟内扫描144孔测定载玻片(图7A)。该设备采用了一个铝制滑动支架以在自动扫描过程中增加稳定性并保持焦点，以及一个照明掩模以阻挡杂散光并提高DFM信号强度(图7B)。为该设备开发的智能手机应用程序允许对第一个载玻片孔进行手动居中和对焦，然后应用程序自动对剩余孔的图像进行居中、对焦和拍摄，将所有图像保存到单独的文件中以供下载和分析。当用于从发现群体中读取NEI数据时，该设备产生了与基准DFM结果类似的结果，准确识别了73％(11/15；与80％；12/15)的TB病例和87％(13/15；与93％；14/15)的非TB病例。综合和单一生物标志物信号的归一化NEI信号强度在这两个装置上也很相似(数据未展示)。
新的NEI方法可用于检测体液中的Mtb EV生物标志物，以通过改进标准NEI方法来实现TB的快速诊断，从而实现靶标信号的自动图像捕获和超灵敏检测。本发明的方法和系统可进一步适用于可在EVs中发现的其他细菌病原体。该方法采用了一种适用于临床环境的工作流程，以检测具有高TB风险的儿童人群中的TB，在这些人群中，使用呼吸道样品的检测往往会漏检TB。该测定法直接从血清或其他体液中捕获EVs，消除了对纯化EV样品的常见EV免疫测定要求，这些样品通常通过在时间、劳动力、费用和EV产量、纯度和完整性之间进行权衡的方法进行分离，这限制了其临床可行性。由于目前还没有广泛接受的TB的EV生物标志物，本研究评估了测量EVs血清水平的潜在诊断价值，其中所述EVs表达与TB毒力相关的两种Mtb衍生因子LAM和LprG，研究发现这些标志物的EV表达在TB病例中增强，并且这两个因子的多重检测可以在NHP模型中区分LTBI和TB。LAM和LprG都在结核分枝杆菌中高度表达，这可能有助于它们的诊断性能。然而，通过文献检索确定为潜在靶点的其他丰富的Mtb衍生因子在区分TB和非TB病例方面并没有表现出类似的能力，包括膜蛋白Ag85b，这是一种有效生物合成Mtb细胞壁所需的分枝酰转移酶。在该分析中，只有Mtb膜蛋白LpqH在这两组之间表现出显著差异，尽管尚不清楚本研究中分析的分泌型Mtb蛋白(CFP10、ESAT6、MPT51和MPT64)是否形成稳定的膜相互作用，从而允许在血清EVs上检测它们。
对LTBI和TB的NHP模型作NEI分析表明，LAM和LprG的血清EV表达是区分TB和LTBI的必要条件。LAM是一种在Mtb外细胞壁上表达的毒力因子，在那里它可以与巨噬细胞甘露糖受体结合，促进结核分枝杆菌进入宿主吞噬细胞，并抑制吞噬体-溶酶体融合，调节免疫反应，以促进TB发展所需的Mtb的持续细胞内生存。LprG在LAM定位于结核分枝杆菌的外细胞被膜中起着重要作用，LprG缺失的Mtb突变体表现出降低的LAM表面表达和毒力，Mtb进入宿主巨噬细胞的减少，Mtb细胞被膜的生物发生和/或完整性降低，不能抑制吞噬体-溶酶体融合，并且细胞内复制率降低。因此，LprG对LAM活性至关重要，因为LprG缺乏会在不改变LAM表达的情况下减弱Mtb毒力。因此，LprG表达可能在患有LTBI的NHPs中被下调；然而，我们的结果表明了相反的情况：来自诊断为LTBI的NHPs的血清EVs上LAM下调和LprG表达上调，而来自诊断为TB的NHPs的血清EVs上两种标记物均升高。有几种机制可以解释这一发现，包括下调LAM表达或抑制LPRG活性的LprG以限制LAM转运，这两种机制都有望限制Mtb外膜上的LAM表达，并且可能限制LTBI期间Mtb感染细胞分泌的EVs的LAM表达。然而，导致这种差异表达的机制及其功能意义尚不清楚，值得进一步研究，包括在具有定义明确的LTBI和TB群体的人类研究中的重复。
对Mtb EVs作NEI分析显示，在具有诊断挑战性的HIV感染儿童群体中(包括尽管进行了广泛的TB检查，但在母研究期间未经临床诊断的儿童)，无论是确诊的还是待确认的TB，都具有良好的诊断敏感性。该组的NEI诊断敏感性尤其重要，因为在临床评估期间未被诊断为TB的未治疗儿童的死亡率比在评估时被诊断和治疗的儿童高5倍以上，这与报告的因漏诊而未接受ATT的儿童的高死亡率一致。值得注意的是，几名儿童的血清在其根据临床结果的TB诊断之前显示出阳性的Mtb EV信号，这表明血清Mtb EV信号具有作为早期TB诊断手段的潜力，这在该人群中尤为重要，因为以这种方式识别的儿童中有三分之一在其根据常规手段诊断时或诊断后不久死亡。
确诊TB和待确认TB患者在ATT启动后的NEI Mtb EV信号显著降低，与TB症状改善一致，这表明Mtb EV水平可作为ATT应答的替代。在一个儿童亚组中也观察到了类似的降低，这些儿童在基线数据评估时符合待确认TB的标准，但由于在未开始ATT的情况下开始ART后，其TB提示症状有所改善，因此被重新分类为不太可能患有TB。在所有这些病例中观察到的NEI Mtb EV信号降低表明，儿童可能患有新生TB，ART启动后改善的免疫功能至少部分抑制了这种情况。
如上所述，通过首先从体液样品中提取EVs，通过使用具有抗LAM和LprG抗体的NEI，可以显著提高测试的灵敏度和特异性。该方法可以准确地检测体液样品中Mtb的存在，并且基于检测到的LAM和LprG的表达，还可以确定感染是潜伏的还是活跃的。NEI和暗视野显微术的结合允许高灵敏度的Mtb检测，而无需进一步富集样品中的EV浓度。自动化的NEI检测在高精度的情况下进一步提高了检测效率。
本发明使用以下方法和材料。
方法
Mtb培养。Mtb菌株H37Rv、CDC1551和HN878从休斯顿卫理公会医院获得，并在37℃条件的转瓶中，在pH值7.0的无蛋白基本培养基(含有0.1％(v/v)甘油、1g/L KH2PO4、2.5g/LNa2HPO4、0.5g/L天冬酰胺、50mg/L柠檬酸铁铵、0.5g/L MgSO4×7H2O、0.5mg/L CaCl2和0.1mg/L ZnSO4，含有或不含有0.05％泰洛沙泊(v/v))中，培养至对数中期(OD600＝0.5-0.6)。
THP-1细胞培养和分化。THP-1单核细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC；马纳萨斯，弗吉尼亚州)，并在37℃下在添加10％ FBS的RPMI 1640中于5％ CO2培养箱中培养。通过用nM PMA(西格玛(Sigma Aldrich)，389美国)孵育10个T175培养瓶(每个培养瓶含有约2.5x 107个活的THP-1单核细胞(5～7x 105个细胞/mL；≥95％生存能力)24小时，进行巨噬细胞分化，之后用37℃ PBS洗涤3次以去除PMA和非粘附细胞，然后在补充有10％ FBS的RPMI 1640中培养粘附、分化的THP-1巨噬细胞。
对于使用Mtb感染的巨噬细胞的实验，通过在4℃下以3000g离心10分钟，将对数中期的Mtb H37Rv、CDC1551和HN878培养物(10mL)成团，并将所得细菌团悬浮在10mL不含青霉素和链霉素的RPMI 1640/10％ FBS中，使用简短的超声处理步骤去团块，并使其通过装有27号针头(VWR，Norm-Ject，美国)的注射器10次。然后将Mtb悬浮液与另外10mL无抗生素RPMI 1640/10％FBS混合，并将0.1mL等分悬浮液添加到T175培养瓶中，该培养瓶含有在20mL无抗生素的RPMI 1640/10％ FBS中培养的约2.5x 107分化的THP-1巨噬细胞，以获得数值为10的感染复数(MOI)。培养4小时后，将细胞培养物用37℃PBS洗涤3次以去除细胞外结核分枝杆菌，并在不含FBS的RPMI 1640中培养48小时，然后使培养上清液通过0.22μm滤器以去除结核分枝杆菌并生成用于EV和可溶性蛋白分析的样品。将培养滤液储存在-80℃，同时将等分样品接种到分枝杆菌生长指示管中，并在培养3-4周后评估Mtb生长情况，以确认这些样品中不存在存活的结核分枝杆菌。通过胰蛋白酶消化回收培养的巨噬细胞，并将其分成用于分析活力的样品，并用于产生细胞裂解物以供靶蛋白的蛋白免疫印迹分析。
对于使用培养滤液蛋白(CFP)的实验，将含有100μg CFP的等分样品添加到T175培养瓶中，该培养瓶含有在20mL RPMI 1640/10％ FBS中培养的约2.5x 107分化的THP-1巨噬细胞。培养4小时后，用37℃ PBS洗涤细胞培养物3次以去除细胞外CFP，并在不含FBS的RPMI1640中培养48小时，然后收集培养上清液以生成用于EV和可溶性蛋白分析的样品。通过胰蛋白酶消化回收培养的巨噬细胞，并将其分成样品，用于分析其活力，并用于产生用于靶蛋白的蛋白免疫印迹分析的细胞裂解物。
EV分离和表征。被处理用于EV分离的冷冻保存血清等分样品(1mL)在37℃水浴中快速解冻，涡旋3s，然后将300μL等分样品转移到2mL离心管中，与1.2mL PBS混合，然后在4℃下以1200rpm离心15分钟，以沉淀大颗粒和碎片。将上清液在4℃下以2,000g离心30分钟，通过0.45μm滤器，并在10,000rpm和4℃离心45分钟2次，然后在110,000g和4℃离心90分钟。将所得EV团粒悬浮在1mL PBS中，在110,000g和4℃下离心3小时，然后悬浮在50μL PBS中并通过二辛可宁酸(BCA)测定和NanoSight纳米颗粒追踪分析(马尔文帕纳科(MalvernPanalytics)，美国；5μg/mL，5个重复)进行表征，以确定蛋白质含量、EV浓度和尺寸分布。用于EV分离的细胞培养上清液通过在4℃和3000rpm条件下在50mL 10kDa共聚物苯乙烯超滤管(密理博西格玛(Millipore Sigma)，美国)上离心15分钟，从而将200mL起始材料浓缩至100μL，之后将这些浓缩的样品处理用于EV分离，并如上所述进行表征。对于透射电子显微镜分析，在室温下用含有1mg/mL蛋白质的5μL EV等分样品孵育碳涂层铜网格(400目)30秒，用滤纸吸干以去除多余的液体，用2μL的1％四氧化锇在室温下孵育2分钟以对膜染色，吸干以除去该溶液，并使用Tecani F30显微镜(FEI公司，美国)以200kV的加速电压用指示的放大倍数成像。
EV ELISA分析。向96孔微量滴定板的每个孔中添加100μL的人CD81特异性小鼠抗体等分样品(百进生物科技公司(BioLegend)，美国)(5μg抗体/mL溶于PBS中)，并在室温下孵育这些板16小时，从而产生用于EV-ELISA的标准EV捕获板。然后将孔用260μL PBST(每次洗涤30秒)洗涤3次，之后用250μL封闭缓冲液(1％wgt/vol BSA溶于PBST中)在37℃下孵育2小时来封闭孔，随后再次用PBST洗涤3次。为了分析NEI的最佳EV捕获条件，将孔与100μL的针对EV表面标记物(包括CD9、CD63、CD81和抗LAM/LprG抗体的不同克隆)的特异性小鼠抗体等分样品交替孵育。
对于EV ELISA，每个孔在4℃下与100μL分离的EVs或血清孵育过夜，用PBST洗涤3次，然后在37℃下与含有1μg/mL所示检测抗体的100μL PBST孵育1小时，用PBST洗涤3次，之后与含有0.5μg/mL HRP标记的羊抗鼠/人IgG(杰克逊免疫实验室(Jackson Immune lab)，美国)的100μL PBST在37℃孵育30分钟，并用PBST洗涤3次。在最后的洗涤步骤之后，在室温下用50μLTMB(西格玛(Sigma)，美国)孵育孔10分钟，然后与50μL的2M H2SO4混合以终止反应，之后使用酶标仪(Tecan，Ultra，瑞士)在减去OD 650信号后测量OD 450值来读取每个孔的靶标EV。
非人类灵长类动物(NHP)Mtb注射和样品采集。本研究中分析的低温保存NHP血浆是从先前报道的35个研究中感染Mtb的NHPs中获得的存档材料。简而言之，将无特定病原体、无逆转录病毒、从未感染分枝杆菌的成年恒河猴分为三个实验组，接受不同的Mtb接触(无、低和高)。阴性对照(从未感染Mtb)群体的样品取自四只在研究期间未接触Mtb的未感染恒河猴。潜伏性TB感染(LTBI)群体的样品取自四只恒河猴，它们经历了低剂量Mtb气溶胶接触事件(约10CFU的Mtb CDC1551)，接触后一个月内结核菌素皮肤试验(TST)结果呈阳性，但没有表现出任何TB迹象，而是在整个研究期间(约22周)保持无症状的LTBI样感染。TB群体的样品取自五只恒河猴，它们经历了高剂量Mtb气溶胶事件(约200CFU的Mtb CDC1551)，它们发展为活动性TB疾病，其特征为在研究终点时体重减轻、发热、血清C-反应蛋白水平升高、与TB一致的胸片评分升高、支气管肺泡灌洗液中可检测到的Mtb CFU水平、更高的肺部细菌负荷，和相关的肺部病理。如前所述，在研究终点收集的肺组织由对动物治疗不知情的病理学家使用网格随机取样。
NEI分析。向固定在显微镜载玻片上的144孔掩模的每个位置添加1μL对人CD81 EV捕获具有特异性的小鼠抗体或指示抗体的等分样品(5μg/mL)，并将这些载玻片在4℃孵育16小时，从而产生用于NEI分析的EV捕获载玻片。本分析中的所有孵育步骤均在加湿室中进行，以减少蒸发效应。捕获抗体结合后，用PBST清洗载玻片3次，并用1μL/孔SuperBlockTM(PBS)封闭缓冲液(思拓凡(Cytiva)，美国)在4℃下封闭1小时，然后用PBST洗涤3次，之后与1μL血清或分离的EV样品孵育。将血清样品以10000g离心20分钟以去除大碎片。将血清或EV样品在EV捕获载玻片上以4℃孵育16小时，然后用PBS洗涤3次，在37℃下与1μl特定生物素化检测抗体(1μg/mL)杂交1小时，用PBS洗3次，并在37℃下用中性亲和素官能化AuNR(Nanopartz，美国)以指定浓度孵育1小时。在AuNR孵育步骤之后，先用PBST和蒸馏水洗涤载玻片一次以去除未结合的颗粒，再对载玻片进行DFM拍照和图像分析。
DFM降噪算法。使用定制设计的算法分析NEI信号，该算法识别待分析的每个分析的第一个识别区域，然后减去DFM伪影和背景信号。该算法检测每个孔的高强度边界，计算由其高强度边界形成的圆形区域的中心位置，然后选择该区域的中心区域，以避免在最终洗涤步骤后，这些区域的边缘处残留AuNRs的累积导致的潜在“咖啡环效应”。为了去除DFM伪影和背景，将图像转换为HSB(色调、饱和度、亮度)颜色空间，并将16位图像中每个通道的值归一化为0到1范围，因为色调是以度(0°到360°)为单位测量的。使用色调和饱和度通道来识别AuNR信号，并使用一组来自包被有纯AuNRs和AuNRs与人血清混合物的载玻片的训练图像来去除伪影。色调用于识别与AuNR散射范围匹配的像素，饱和度用于评估与AuNR范围匹配的颜色强度(纯度)。色调通道值在AuNR信号的红色散射范围之外的像素(色调色轮上≥0.8且≤0.05)被排除，饱和度值极低的像素也被排除(≤0.05)。使用这些参数，使用MATLAB(软件版本2020a)测量处理图像中的476个AuNR信号。
临床群体评估
NLH群体。样本和相关临床数据是从越南国立肺科医院(National LungHospital,NLH)的20名儿童收集的，他们连续来到越南河内NLH的儿科门诊进行临床评价和医学评估。NLH群体包括≤17岁的儿童，这些儿童由NLH儿科门诊的临床医生接诊，并获得父母或法定监护人的书面知情同意。如果儿童≤17岁，患有实验室记录的贫血(血红蛋白＜9mg/dL)，或未获得所有研究程序的知情同意，则将其排除在外。如果儿童目前感染艾滋病毒或接受过抗逆转录病毒治疗(ART)，则不排除他们。对照组为患有支气管肺疾病而非TB的儿童，他们的QuantiFERON TB Gold Plus(QFT；Hilden，德国)、Xpert GeneXpert MTB/RIF(Xpert；Cepheid，美国)和Mtb培养结果均为阴性，并且有经验的儿科TB专家给出了排除TB的临床评估。TB病例由Mtb培养阳性和/或GeneXpert MTB/RIF(Xpert；Cepheid，美国)肺部或肺外样本结果确定。NLH机构审查委员会批准了该方案。
PUSH群体。儿科急诊与稳定后高效抗逆转录病毒疗法(HAART)启动试验(PUSH)研究是一项在肯尼亚进行的随机对照试验(NCT02063880)，评估了急诊(<48小时)与稳定后抗逆转录病毒疗法(7-14天)是否能提高12岁以下住院HIV感染儿童的生存率。在登记入院时，对儿童进行了系统的TB症状和TB接触筛查，并进行了密集的TB评估，包括胸片、痰液或胃液(gastric aspirates,GA)的Xpert与培养、尿液中脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)抗原检测和粪便中的Xpert，而不考虑TB症状。在入院时以及入院后2、4、12和24周收集血清并冷冻保存。CXRs由南非结核病疫苗倡议组织的放射科医生使用标准化报告形式读取，以确定提示TB的结果。结核菌素皮肤试验(TST)阳性结果定义为硬结>5mm。诊断结果可供临床医生研究，并根据肯尼亚指南自行决定开始TB治疗。
基于NIH国际共识儿科TB临床病例的定义，儿童被事后分类为确诊TB(呼吸道或粪便样品的Mtb阳性培养物或Xpert结果)、待确认TB(符合以下标准>2或更多：TB症状、与结核病一致的异常CXR、TST阳性或已知的结核病接触，和/或TB治疗应答)，或不太可能患有TB(不符合其他标准)(未展示)。TB症状定义为咳嗽持续2周以上、体重减轻/发育不良、发烧持续1周以上和/或嗜睡持续1周以上。对于在研究期间死亡的儿童，一个专家小组审查了病例，并就死亡是否被认为可能、或许，或不太可能与TB有关达成共识。被认为可能或或许与TB有关的死亡被用作待确认TB分类的附加标准(表S6)。为了进行测定评估，待确认TB的儿童根据他们是否接受了临床TB诊断和ATT，或是否没有临床TB诊断并且没有开始ATT而进行进一步分层。被归类为不太可能患有TB的儿童则根据待确认TB诊断所采用的特征的存在或不存在进行进一步分级。
对TB诊断后2周内(包括ATT开始后2周)可获得冷冻保存血清的儿童进行评估，以评估Mtb EV NEI结果的TB诊断性能。已开始TB治疗的并且具有TB治疗开始后2周内的样品和至少一个额外的后续样品的儿童有资格进行治疗应答分析。
通过分类变量的频率和比例以及连续变量的中位数和四分位范围(IQR)总结参与者特征(表1)。假设NIH儿科TB临床病例定义为二项分布，我们使用95％置信区间(confidence intervals,CI)通过灵敏度和特异性估计NEI EV检测TB的性能(表2)。值得注意的是，许多不太可能患有TB类别中的儿童具有提示TB或TB症状的CXR(但不符合待确认TB标准)，因此，我们进一步根据是否存在异常的CXR和TB症状对不太可能患有TB类别进行分层，以确定可能更合适的阴性对照组。通过Wilcoxon秩和检验评估了中位Mtb NEI EV水平，并与无TB症状和CXR阴性的不太可能患有TB的参考值进行了比较。对于治疗反应，通过配对Wilcoxon符号秩检验评估TB治疗开始时和最新可获得样品的平均Mtb NEI EV水平(TB治疗开始和最新可获得样品之间的中位数时间为5.5个月(IQR 3.1-5.7))。
24名儿童未进行CXR研究(4名确诊，2名待确认，18名不太可能)。从医院病历中提取其他CXR结果，以告知TB分类。该方法确定了24名缺失CXR研究数据的儿童中14名的医院CXR数据。如果医院CXR的结果显示出与TB(SATVI标准)相配的特征，我们纳入此信息以确定TB分类(3名儿童使用此信息从不太可能患有TB变为待确认TB)。另外XX名缺失CXR和临床肺炎的儿童被假设具有与TB一致的暗示CXR结果(即，如果有CXR结果，则可能有TB提示的CXR结果)。如果医院CXR仅显示“异常”，而未定义特定的TB CXR特征，我们认为这不足以进行TB分类。
便携式DFM设备。移动DFM滑动扫描系统(270x 190x 106mm)的滑动扫描范围为82mm x 38mm，包括一个带两个步进电机的机械扫描系统、一个暗视野光源、一个带小型物镜的可互换智能手机、一个IOIO-OTG板(DEV-13613，熠趣电子有限公司(SparkFunElectronics)，科罗拉多州)和两个电机驱动板(ROB-12779，熠趣电子有限公司(SparkFunElectronics)，科罗拉多州)，用于控制步进电机并通过蓝牙与智能手机组件通信。该系统采用两个锂电池：7.6V3500mAh锂电池(3.35x1.97x0.55英寸，高能(GAONENG)，中国)为电子设备供电，和11.1V 3200mAh锂电池(5.16x1.73x0.67英寸，HOOVO，中国)为电机供电。大多数附加零件是用商用3D打印机(Objet 30prime，Stratasys，以色列)打印的，但用于确保扫描过程中载玻片稳定性的载玻片支架是使用计算机数控铣床由铝板制成的。暗视野光源由一个集成的暗视野聚光镜组成，该聚光镜包含一个范围从0.7到0.9的照明数值孔径(NA)和一个视角为30度的3mm白色LEDs阵列，并使用放置在聚光镜前面的掩模来阻挡杂散光并提高暗视野图像的对比度。所述物镜由三个相同的双镜组成；它的焦距为3.4mm，NA为0.25，工作距离为1mm，视野为1.6x 1.6mm。该设备的手机组件的相机是Moto G6，焦距为3.95mm，工作F值为1.8，传感器分辨率为1200万像素(3072×4096像素，像素大小为1.4μm)。
统计分析。使用GraphPad Prism(版本7.0)生成图像、热图并进行统计分析。通过参数或非参数(Kruskal-Wallis)单因素方差分析(ANOVA)，以及多重比较检验、Wilcoxon符号秩检验、学生t检验或Mann-Whitney U检验(视情况而定)分析各组之间的潜在差异。进行Logistic回归以评估LAM和LprG信号的组合，该组合能够最好地区分阳性和阴性对照组以建立诊断方程，并以双侧α0 05作为显著性水平进行假设检验。这两个特征都被输入到这个logistic回归模型中，没有其他协变量。所有分析均使用OnDemand 9.4版学术版进行(https://welcome.oda.sas.com/login)。除非另有说明，否则数据以平均值±SD表示。
出于所有目的，以下参考文献通过引用全部并入。
Zumla,Alimuddin等人，“世界卫生组织2013年全球结核病报告：成功、威胁和机遇”，《柳叶刀》382.9907(2013):1765-1767。
Zumla,Alimuddin等人，“世界卫生组织2014年全球结核病报告——进一步发展”，《柳叶刀全球健康》3.1(2015):e10-e12。
Bass Jr,J.B.等人，“结核病的诊断标准和分类”，《美国呼吸与危重症医学杂志》142.3(1990):725-735。
Boehme,Catharina C.等人，“结核病和利福平耐药性的快速分子检测”，《新英格兰医学杂志》363.11(2010):1005-1015。
Yerlikaya,Seda等人，“结核病生物标志物数据库：新结核病诊断的关键”，《国际传染病杂志》56(2017):253-257。
Paris,Luisa等人，“HIV阴性肺结核患者尿液脂阿拉伯甘露聚糖与疾病严重程度的相关性”，《科学转化医学》9.420(2017):eaal2807。
Raviglione,Mario和GiorgiaSulis，“2015年结核病：控制和消除的负担、挑战和战略”，《传染病报告》8.2(2016)。
C.M.Denkinger,S.V.Kik,D.M.Cirillo,M.Casenghi,T.Shinnick,K.Weyer,C.Gilpin,C.C.Boehme,M.Schito,M.Kimerling,M.Pai，“确定下一代结核病检测的需求”，J.Infect.Dis.211,S29-S38(2015)。
Raposo,和Willem Stoorvogel，“细胞外囊泡：外泌体、微泡和朋友”，JCell Biol 200.4(2013):373-383。
Liang,Kai等人，“用于诊断和治疗监测的血浆微样品中肿瘤衍生细胞外囊泡的纳米等离子体定量”，《自然生物医学工程》1.4(2017):0021。
Sun,Dali和Tony Y.Hu。“用于基于纳米颗粒的定量研究的低成本手机暗视野显微镜”，《生物传感器和生物电子学》99(2018):513-518。
Russell,David G，“谁把结核放在肺结核中？”，《自然综述微生物学》5.1(2007):39。
Athman,Jaffre J.等人，“细菌膜囊泡介导结核分枝杆菌脂聚糖和脂蛋白从感染巨噬细胞中释放”，《免疫学杂志》195.3(2015):1044-1053。
N：有结果的参与者人数；n：具有阳性结果的588名参与者
a根据世界卫生组织，严重免疫抑制的年龄特异性CD4％临界值，或在缺乏CD4％数据的情况下的CD4计数(<12个月：<25％/<1500个细胞/μl；12-35个月：<20％/<750个细胞/μl；>36个月：<15％/<350个细胞/μl)
b5岁及以下儿童：WHZ<-2或MUAC<12.5cm
c持续咳嗽(≥14天)、发烧(≥7天)、发育不良或嗜睡(≥7天)。发育不良＝入院时消瘦(WHZ<-2或MUAC<12.5)或体重不足(WHZ<-2)(入院前生长轨迹不可用)
d痰液或胃液
e包括2名粪便Xpert结果不确定的待确认TB的儿童
f包括1名待确认TB的儿童和2名不太可能患有TB的儿童，其尿液LAM结果无效。研究时，与制造商参考卡等级≥1对应的颜色变化被视为阳性。
g两名确诊TB的儿童在开始TB治疗前死亡
h研究期内6个月
N＝147；137名儿童在基线时进行了血清分析；待确认TB诊断时为7例(6例在入院后2周600，1例在入院后4周)；以及3例在入院后2周进行血清分析的基线血清缺失的不太可能患有TB的病例
ATT：抗TB治疗
a基于国际共识儿科TB临床病例的定义(Graham等人，2015年)；研究期间有TB诊断和ATT——由临床工作人员在研究期间对其进行前瞻性诊断并在研究期间接受ATT的儿童；研究期间无TB诊断或ATT——在研究期间未经临床诊断且未接受ATT的儿童；NIH TB标准——至少具有NIH算法诊断TB所需的两种诊断标准中的一种的儿童
b补充表4中描述的NIH标准
cWilcoxon秩和检验与无TB症状的不太可能患有TB和CXR610的比较
dTB诊断时或TB治疗后<14天
e最新可获得样品。TB治疗开始与TB治疗开始后之间的中位数5.5个月(IQR 3.1-5.7)
f配对Wilcoxon符号秩检验
权利要求为。

Claims (22)

1.一种检测体液样品中结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)特异性蛋白的存在的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a)提取体液样品中的细胞外囊泡(EVs)；
b)将抗体缀合纳米颗粒与步骤(a)中的EVs混合，其中所述抗体缀合纳米颗粒与抗MTB特异性蛋白的第一抗体缀合；和
c)使用暗视野显微术检测所述MTB特异性蛋白的存在。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，其中所述MTB特异性蛋白选自下组：脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、LAM载体蛋白LprG和LpqH、α-晶体蛋白(HspX)、DnaK、GroEL2、KatG、SodA和GlnA。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗体选自下组：CS-35、CS-40和A194-01。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一抗体和所述纳米颗粒之间的缀合是亲和素-生物素或链霉亲和素-生物素缀合。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一抗体是生物素官能化的，并且所述纳米颗粒是亲和素或链霉亲和素官能化的。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过使用第二抗体提取所述EVs，其中所述第二抗体对CD9、CD81、CD91、CD63 CD81、PDCD6IP、HSPA8、ACTB、ANXA2、PKM、HSP90AA1、ENO1、ANXA5、HSP90AB1、YWHAZ、YWHAE、LprG、LpgH、HspX、DnaK、GroEL2、KatG、SodA或GlnA具有特异性。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纳米颗粒是金纳米棒(AuNRs)、银(Ag)、氧化铋(Bi2O3)、铂(Pt)、氧化钆(Gd2O3)，或氧化铁(Fe3O4)纳米颗粒。
8.一种用于检测体液样品中MTB特异性蛋白的系统，其特征在于，所述系统包括：
a)暗视野显微镜；
b)样品基片；和
c)抗体缀合纳米颗粒，其中所述抗体缀合纳米颗粒与靶向所述MTB特异性蛋白的第一抗体缀合；
其中所述样品基片包被有抗细胞外囊泡特异性(EV-特异性)蛋白的第二抗体。
9.如权利要求8所述的系统，其特征在于，所述抗体缀合纳米颗粒是金、银(Ag)、氧化铋(Bi2O3)、铂(Pt)、氧化钆(Gd2O3)，或氧化铁(Fe3O4)纳米颗粒。
10.如权利要求8所述的系统，其特征在于，所述MTB特异性蛋白选自下组：脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、LAM载体蛋白LprG、LpqH、α-晶体蛋白(HspX)、DnaK、GroEL2、KatG、SodA和GlnA。
11.如权利要求8所述的系统，其特征在于，所述第一抗体是CS-35、CS-45或A194-01。
12.如权利要求8所述的系统，其特征在于，所述第二抗体对CD9、CD81、CD91、CD63CD81、PDCD6IP、HSPA8、ACTB、ANXA2、PKM、HSP90AA1、ENO1、ANXA5、HSP90AB1、YWHAZ、YWHAE、LprG、LpgH、HspX、DnaK、GroEL2、KatG、SodA或GlnA是特异性的。
13.如权利要求8所述的系统，其特征在于，所述纳米颗粒与所述第一抗体之间的缀合是生物素-亲和素或生物素-链霉亲和素缀合。
14.如权利要求8所述的系统，其特征在于，所述纳米颗粒是金纳米颗粒。
15.一种通过检测体液样品中第一和第二结核分枝杆菌(MTB)特异性蛋白的存在来检测和确定结核感染状态的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a)提取体液样品中的细胞外囊泡(EVs)；
b)将抗体缀合纳米颗粒与步骤(a)中提取的EVs混合，其中所述抗体缀合纳米颗粒与抗第一MTB特异性蛋白的第一抗体和抗第二MTB特异性蛋白的第二抗体缀合；
c)使用暗视野显微术检测所述第一和/或第二MTB特异性蛋白的存在；和
d)基于所述第一和第二MTB特异性蛋白的存在来确定所述结核感染状态。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述第一MTB特异性蛋白是脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)，并且所述第二MTB特异蛋白是脂阿拉伯甘露聚糖载体蛋白(LprG)。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，如果所述第一和第二MTB特异性蛋白都存在，则确定活动性TB感染。
18.一种筛选抗MTB特异性蛋白的抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a)将MTB特异性蛋白固定在基片上；
b)将多个第一抗体引入所述基片上；
c)将纳米颗粒与步骤(b)中的混合物混合，其中所述纳米颗粒与第二抗体和信号发射基团缀合，其中所述第二抗体靶向第一抗体的重链恒定区；和
d)通过检测由所述纳米颗粒上的信号发射颗粒发射的信号来检测抗MTB特异性蛋白的抗体的存在。
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述MTB特异性蛋白选自下组：脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)、LAM载体蛋白LprG和LpqH，和α-晶体蛋白(HspX)。
20.如权利要求15的方法，其特征在于，所述MTB特异性蛋白是LAM或LprG。
21.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述基质包被有刀豆蛋白A(ConA)。
22.一种检测体液样品中细菌特异性蛋白的存在的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a)提取体液样品中的细胞外囊泡(EVs)；
b)将抗体缀合纳米颗粒与所述EVs混合，其中所述抗体缀合纳米颗粒与所述细菌特异性蛋白的特异性第一抗体缀合；和
c)使用暗视野显微术检测所述细菌特异性蛋白的存在。
CN202180056639.XA 2020-08-05 2021-08-06 体液样品中结核的检测方法 Pending CN116669707A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063061674P 2020-08-05 2020-08-05
PCT/US2021/045086 WO2022032184A1 (en) 2020-08-05 2021-08-06 Method of detecting tb in bodily fluid samples

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116669707A true CN116669707A (zh) 2023-08-29

Family

ID=80117702

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180056639.XA Pending CN116669707A (zh) 2020-08-05 2021-08-06 体液样品中结核的检测方法

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230184761A1 (zh)
EP (1) EP4192429A4 (zh)
CN (1) CN116669707A (zh)
WO (1) WO2022032184A1 (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023225019A1 (en) * 2022-05-17 2023-11-23 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Cu growth enhanced plasmonic assay for isolation-free exosome analysis
WO2024000018A1 (en) * 2022-06-30 2024-01-04 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation "on-site and confirmatory testing"

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1844073A1 (en) * 2005-01-31 2007-10-17 Ablynx N.V. Method for generating variable domain sequences of heavy chain antibodies
US8093018B2 (en) * 2008-05-20 2012-01-10 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Antibody identifying an antigen-bound antibody and an antigen-unbound antibody, and method for preparing the same
KR20120129927A (ko) * 2010-01-27 2012-11-28 글락소 그룹 리미티드 변형된 투베르쿨로시스 항원
US9841424B2 (en) * 2012-10-12 2017-12-12 Albert Einstein College Of Medicine, Inc. Serologic test for the rapid diagnosis of active tuberculosis
CN106029898B (zh) * 2014-01-21 2020-02-28 莫尔豪斯医学院 外来体介导的感染和疾病的检测
CN109791148A (zh) * 2016-09-30 2019-05-21 普洛米生科有限公司 用于去除抑制性组分的方法
WO2018151938A2 (en) * 2017-02-17 2018-08-23 The Methodist Hospital Compositions and methods of determining a level of infection in a subject
JP2021521462A (ja) * 2018-03-29 2021-08-26 ファウンデーション オブ イノベーティブ ニュー ダイアグノスティクス 抗体または抗体の組み合わせおよび対象の尿試料中のマイコバクテリウム関連抗原の検出のためのその使用
JP2022530351A (ja) * 2019-04-15 2022-06-29 マイコメッド テクノロジーズ リミティド ライアビリティ カンパニー 疾患および障害の検出のために細胞外小胞を使用する方法および組成物
US20230087018A1 (en) * 2020-02-06 2023-03-23 The Administrators Of The Tulane Educational Fund Crispr-based assay for detecting tb in bodily fluids

Also Published As

Publication number Publication date
EP4192429A4 (en) 2024-10-09
EP4192429A1 (en) 2023-06-14
WO2022032184A1 (en) 2022-02-10
US20230184761A1 (en) 2023-06-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230184761A1 (en) Method of detecting tb in blood sample
Hamasur et al. A sensitive urinary lipoarabinomannan test for tuberculosis
Wang et al. Screening and identification of a six-cytokine biosignature for detecting TB infection and discriminating active from latent TB
Zheng et al. Diagnosis of paediatric tuberculosis by optically detecting two virulence factors on extracellular vesicles in blood samples
Wang et al. Development of spike protein-based fluorescence lateral flow assay for the simultaneous detection of SARS-CoV-2 specific IgM and IgG
US20150192593A1 (en) Biomarkers for diagnosing and/or monitoring tuberculosis
Goyal et al. Utility of B-cell epitopes based peptides of RD1 and RD2 antigens for immunodiagnosis of pulmonary tuberculosis
Tamarozzi et al. Evaluation of microscopy, serology, circulating anodic antigen (CAA), and eosinophil counts for the follow-up of migrants with chronic schistosomiasis: a prospective cohort study
Herrmann et al. Temporal dynamics of interferon gamma responses in children evaluated for tuberculosis
US20170131291A1 (en) Methods and devices for diagnosing ocular surface inflammation and dry eye disease
Azghay et al. Utility of QuantiFERON-TB Gold In-Tube assay in adult, pulmonary and extrapulmonary, active tuberculosis diagnosis
Zhu et al. Performance evaluation of IGRA-ELISA and T-SPOT. TB for diagnosing tuberculosis infection.
Huang et al. New detection method in experimental mice for schistosomiasis: ClinProTool and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry
WO2016130638A1 (en) Methods of detecting analytes and diagnosing tuberculosis
Li et al. A novel chemokine biomarker to distinguish active tuberculosis from latent tuberculosis: a cohort study
Essone et al. Creatine kinase-(Mb) and hepcidin as candidate biomarkers for early diagnosis of pulmonary tuberculosis: A proof-of-Concept study in lambarene, Gabon
Dass et al. MPT51 and MPT64-based antigen detection assay for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis from urine samples
Agha et al. Utility of quantitative analysis of urine lipoarabinomannan in the diagnosis of tuberculosis
EP3911955A1 (en) Biomarkers
Soysal et al. Comparison of positive tuberculin skin test with an interferon-γ-based assay in unexposed children
Amewu et al. Evaluation of the fluorescent-thin layer chromatography (f-TLC) for the diagnosis of Buruli ulcer disease in Ghana
Le et al. Fluorescent nanodiamond immunosensors for clinical diagnostics of tuberculosis
ZA200905156B (en) Marker for the rapid differentiation of active TB disease from latent tuberculosis infection
Katte et al. Procalcitonin levels in children affected by severe malaria compared to those with uncomplicated malaria in the absence of bacterial infection: a cross-sectional study
US20230024715A1 (en) Methods and compositions for diagnosis of tuberculosis

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract

Application publication date: 20230829

Assignee: QINGDAO RUISIKEER BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Assignor: Durham Education Fund Management Committee

Contract record no.: X2023990000935

Denomination of invention: Detection method for tuberculosis in body fluid samples

License type: Exclusive License

Record date: 20231201

EE01 Entry into force of recordation of patent licensing contract