CN111153992A

CN111153992A - 结核分枝杆菌lam的单克隆抗体及其用途

Info

Publication number: CN111153992A
Application number: CN202010109148.4A
Authority: CN
Inventors: 张洪涛
Original assignee: Beijing Chest Hospital; Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute
Current assignee: Beijing Chest Hospital; Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute
Priority date: 2020-02-21
Filing date: 2020-02-21
Publication date: 2020-05-15

Abstract

本发明公开了一种结核分枝杆菌LAM的单克隆抗体及其用途，涉及抗体技术领域。本发明公开的结核分枝杆菌LAM的单克隆抗体，具有轻链可变区和重链可变区,单克隆抗体对LAM的亲和力较高，将其用于检测以LAM作为靶点的分枝杆菌时，具有较高的灵敏度和特异性，为分枝杆菌的LAM检测提供了一种新的抗体选择，也为结核病的诊断提供了一种新的诊断方案。

Description

结核分枝杆菌LAM的单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种结核分枝杆菌LAM的单克隆抗体及其用途。

背景技术

结核病居单一传染性微生物导致死亡的首位，世界范围内约23％的人群感染了结核分枝杆菌(Mtb)。结核病与其它疾病共存时，例如人免疫缺陷病毒感染，使得治疗更加困难。活动性结核病的早期诊断对于结核病的有效治疗是必需的，Mtb及其组分的发现为结核病快速诊断提供直接证据。虽然细菌培养仍然是结核病诊断的金标准，但检测周期往往较长，且需要专业人员进行操作，检测敏感性也较低。Xpert-MTB/RIF检测是一种高敏感性和高特异性的活动性结核病诊断方法，可在2小时内检出结核分枝杆菌复合群细菌，同时测定结核病常见利福平耐药相关基因突变情况。然而这种检测相对昂贵，且需要技术投资。Mtb特异性抗原检测成为辅助诊断活动性结核病具有吸引力的替代方案。

脂阿拉伯甘露聚糖(LAM)，一种17.5kDa的糖脂，是结核分枝杆菌细胞壁外表面的一种主要多糖抗原。LAM是一种异质性脂糖，由三部分组成：磷脂酰肌醇甘露糖苷锚定物、多糖主链和末端戴帽结构。依据LAM末端的帽状结构，将LAM分为磷脂酰肌醇LAM(phosphatidylinositol-capped LAM，PILAM)、甘露糖LAM(rnannose-capped LAM，ManLAM)和阿拉伯糖LAM(arabinose-capped LAM，AraLAM)。三种LAM分别存在于不同分枝杆菌中，在细菌的生长致病过程中发挥不同作用。致病性分枝杆菌中富含ManLAM，其可引起宿主强烈的免疫反应，是结核病重要的免疫靶标。

世界卫生组织(WHO)已推介一种商业化尿LAM检测试剂盒(LF-LAM；Determine TB-LAM；Alere,USA)用于艾滋病患者中疑似结核病的筛查，该试剂盒通过兔抗LAM多克隆抗体进行检测。研究者试图在非艾滋病的结核病患者中通过多种方法检测LAM抗原，然而现有的检测试剂其检测敏感性仍较差。

单克隆抗体是免疫诊断领域研发的热点，具有高特异性、高亲和力、抗体均一化和便于生产的优势，鼠抗LAM单克隆抗体(如CS35)是目前国际上公认的抗LAM单克隆抗体，相对于鼠单克隆抗体，兔单克隆抗体能够识别一些特殊抗原表位，增加抗体多样化程度，且兔源抗体往往具有更高的亲和力。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种结核分枝杆菌LAM的单克隆抗体及其用途。本发明提供的抗LAM单克隆抗体对LAM具有较高的亲和力，将其用于检测以LAM作为靶点的分枝杆菌时，具有更高的灵敏度和特异性，为分枝杆菌的检测提供了一种新的抗体选择，也为结核病的诊断提供了一种新的诊断方案。

本发明是这样实现的：

第一方面，本发明实施例提供一种抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段，其具有轻链可变区和重链可变区；

其中，轻链可变区各互补决定区的氨基酸序列如下：

LCDR1(轻链互补决定区1):QASHSVYGNNELS(SEQ ID NO.1)；

LCDR2:KASTLAS(SEQ ID NO.2)；

LCDR3:QGGYWGNRA(SEQ ID NO.3)；

重链可变区各互补决定区的氨基酸序列如下：

HCDR1(重链互补决定区1):NYDMG(SEQ ID NO.4)；

HCDR2:NIWSNGYTDYASWVNG(SEQ ID NO.5)；

HCDR3:GSSGYVGDI(SEQ ID NO.6)；

或者，轻链可变区各互补决定区的氨基酸序列如下：

LCDR1:QASQSVYGNNELS(SEQ ID NO.7)；

LCDR2:KASTLAS(SEQ ID NO.2)；

LCDR3:QGGYWGNRA(SEQ ID NO.3)；

重链可变区各互补决定区的氨基酸序列如下：

HCDR1:SYDMG(SEQ ID NO.8)；

HCDR2:SIWSNDFTDYASWVNG(SEQ ID NO.9)；

HCDR3:GSSGYVGDI(SEQ ID NO.6)。

本发明的研究显示，具有上述互补决定区的抗体或其抗原结合片段，对LAM抗原具有较高的亲和力，将其用于检测分枝杆菌时，表现出较高的敏感性和特异性，是一种检测分枝杆菌的新抗体，也是一种理想的抗体，其可以用于制备成分枝杆菌的检测试剂，用于LAM和分枝杆菌的检测领域，本发明为LAM和分枝杆菌的检测提供更多的抗体选择，同时也为结核病的诊断提供了一种新的诊断方案。

在可选的实施方式中，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

在可选的实施方式中，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

需要说明的是，在本发明揭示了可特异性识别LAM的互补决定区的序列基础上，本领域技术人员可以根据所公开的轻重链的CDR区序列，结合其实际需求，进行合适的改造，例如改变可变区中的CDR区序列等，无论是何种改造，只要其借鉴了本发明所公开的CDR序列，即属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，单克隆抗体的重链恒定区选自：IgG、IgA、IgD、IgE和IgM中任意一种抗体的重链恒定区。单克隆抗体的轻链恒定区为κ型或λ型轻链恒定区。没有属种限制。

在可选的实施方式中，单克隆抗体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示。

在可选的实施方式中，单克隆抗体的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。

在可选的实施方式中，抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或ScFv。

第二方面，本发明实施例提供前述实施方式任一项所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段在制备检测分枝杆菌的试剂或试剂盒中的应用。

在本发明公开的抗体基础上，本领域技术人员容易地将上述单克隆抗体或其抗原结合片段用于制备检测分枝杆菌的试剂或试剂盒，无论试剂或试剂盒是基于何种检测原理例如免疫沉淀、ELISA等，只要其利用了本发明的抗体或其抗原结合片段，即属于本发明的保护范围。

在可选的实施方式中，分枝杆菌为慢速生长型分枝杆菌。

本发明的研究发现，本发明提供的单克隆抗体或其抗原结合片段对慢速生长型分枝杆菌具有较好的结合反应和检测敏感性，据此，将本发明提供的单克隆抗体或其抗原结合片段应用于慢速生长型分枝杆菌的检测，具有更好的检测效果。

在可选的实施方式中，慢速生长型分枝杆菌选自结核分枝杆菌(M.tb.H37Rv)、牛分枝杆菌(M.bovis)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、海分枝杆菌(M.marinum)、鸟分枝杆菌(M.avium)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、胃分枝杆菌(M.gastri)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)和玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)中的任意一种。

第三方面，本发明实施例提供一种抗体偶联物，其包括前述实施方式任一项所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段。

需要说明的是，本领域技术人员可以根据实际需求，在本发明公开的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段上偶联合适的分子，无论偶联何种物质，均属于本发明的保护范围。

第四方面，本发明实施例提供一种检测组合物，其包括前述实施方式任一项所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段。

第五方面，本发明实施例提供一种检测分枝杆菌的试剂或试剂盒，其包括前述实施方式任一项所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段。

在可选的实施方式中，分枝杆菌为慢速生长型分枝杆菌。

第六方面，本发明实施例提供一种分离的核酸分子，其编码如前述实施方式任一项所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段。

基于本发明公开的氨基酸序列上，本领域技术人员容易获取编码这些抗体的核酸序列，无论其核酸分子序列如何变化，其只要是编码上述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段，即属于本发明的保护范围。

第七方面，本发明实施例提供一种载体，其含有前述实施方式的核酸分子。

第八方面，本发明实施例提供一种重组细胞，其含有前述实施方式的载体。

第九方面，本发明实施例提供一种制备如前述实施方式任一项的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其包括：培养前述实施方式的重组细胞，从培养物中分离纯化得到单克隆抗体或其抗原结合片段。

在本发明公开了上述LAM的单克隆抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列上，本领域技术人员容易利用本领域常规的技术例如基因工程技术获得上述LAM的单克隆抗体或其抗原结合片段，无论其以什么方式获得上述LAM的单克隆抗体或其抗原结合片段，其均属于本发明的保护范围。

为了本发明可以更容易的理解，术语解释如下。

非本文另外定义，否则与本发明联用的科技术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

术语“抗体”是指完整免疫球蛋白或其与完整抗体竞争特异性结合的抗原结合部分，除非另有说明。可通过重组DNA技术或者通过酶促切割或化学裂解完整抗体来产生抗原结合部分。抗原结合部分尤其包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、结构域抗体(dAb)和互补决定区(CDR)片段、可变区片段、单链抗体(scFv)、嵌合抗体、双链抗体、三链抗体、四链抗体和含有足以赋予多肽特异性抗原结合的免疫球蛋白的至少一部分的多肽。抗体的亚类可以选择IgG、IgA、IgM、IgE、IgD。

术语“抗原结合片段”是包含与抗原结合的部分和任选支架或框架部分的蛋白质，所述支架或框架部分允许抗原结合部分呈促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象。抗原结合蛋白的实例包括抗体、抗体片段、抗体衍生物和抗体类似物。抗原结合蛋白可包含例如具有移植CDR或CDR衍生物的备选蛋白质支架或人工支架。这类支架包括但不限于抗体衍生的支架，其包含引入例如稳定抗原结合蛋白的三维结构的突变以及包含例如生物相容性聚合物的完全合成支架。参见例如Korndorfer等，2003，Proteins:Structure,Function,andBioinformatics,第53卷，第1期:121-129；Roque等，2004,Biotechnol.Prog.20:639-654。

术语“抗体可变区”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可表示为“VH”。轻链可变结构域可表示为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(VL或VH)由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区和骨架区构成。骨架区和CDR的范围已被精确定义，例如在Kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，E.Kabat等，美国卫生与人类服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，(1983)和Chothia中。抗体的骨架区，即构成要件轻链和重链的组合的骨架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。

术语“核酸”与“多核苷酸”、“寡核苷酸”始终可互换使用，其包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)、RNA分子(例如mRNA)、使用核苷酸类似物(例如肽核酸和非天然存在的核苷酸类似物)产生的DNA或RNA类似物，及其杂合体。核酸分子可以是单链或双链的。在一个实施方案中，本发明的核酸分子包含编码本发明的抗体或其片段、衍生物、突变蛋白或变体的连续可读框。

术语“载体”是可用来将与之连接的另一种核酸导入细胞的核酸。载体的一种类型是“质粒”，它是指其中可连接其它核酸区段的线性或环状双链DNA分子。“表达载体”是可指导选定多核苷酸表达的载体类型。

术语“宿主细胞”是可用于表达核酸的细胞。宿主细胞可以是原核生物，如大肠杆菌(E.coli)，也可以是真核生物，包括单细胞真核生物(例如酵母或其它真菌)、植物细胞(例如烟草或番茄植物细胞)、动物细胞(例如人细胞、猴细胞、仓鼠细胞、大鼠细胞、小鼠细胞或昆虫细胞)或杂交瘤。宿主细胞的实例包括猴肾细胞COS-7系(ATCCCRL 1651)、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或其衍生物、人胚肾细胞(如293、293EBNA或MSR 293)等。宿主细胞通常是可用多肽编码核酸转化或转染的培养细胞，所述多肽编码核酸然后可在宿主细胞中表达。表述“重组宿主细胞”可用来表示已用待表达的核酸转化或转染的宿主细胞。宿主细胞不仅仅是指特定的受试者细胞，而且还是指这类细胞的子代或潜在子代。因为由于例如突变或环境影响，某些修饰可发生在后代中，这类子代实际上可能与亲本细胞不同，但是仍包括在本文使用的该术语的范围内。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1：纯化LAM抗体的SDS-PAGE纯度鉴定；图中，A：非还原条件；B：还原条件；M:Marker；1:BJRbL01；2:BJRbL03。

图2：通过ELISA检测LAM抗体对LAM的敏感性。

图3：LAM抗体ELISA检测LAM和结核分枝杆菌重组蛋白的特异性。

图4：LAM抗体Western blotting检测结核分枝杆菌各组分的特异性。图中，A：丽春红染色的代表性结果；B：Western blotting检测结果；M:Marker；1:纯化的LAM；2:提取的结核分枝杆菌H37Rv细胞壁；3：H37Rv细菌培养上清。

图5：LAM抗体结合LAM的亲和力；图中曲线从下往上依次是：0/31.3/62.5/125/250nM。

图6：基于LAM抗体的ELISA检测分枝杆菌培养上清中的LAM。

图7：基于LAM抗体的Dot blots检测分枝杆菌细胞灭活上清中的LAM。图中，A和C：丽春红染色结果；B和D：Dot blots检测结果；a1-b5：慢速生长型分枝杆菌灭活上清液；c1-d6：快速生长型分枝杆菌灭活上清液；e2-f6：倍比稀释的LAM(0.1ng-100ng)；b6和e1：空白对照。

图8：基于LAM抗体的流式细胞术检测分枝杆菌细胞。

图9：基于LAM抗体的ELISA鉴定分枝杆菌临床分离菌株。

图10：LAM抗体ROC曲线分析检测分枝杆菌临床分离菌株的性能。

具体实施方式

本发明详细的实施方法见实施例，实施例中所述方法、所用试剂或仪器，若无特殊说明，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下实施例仅是为了说明和解释本发明，而不是以任何方式限制本发明。

本发明实施例提供了一种特异性结合LAM的兔单克隆抗体，所述重链可变区包含SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.13中的任一种。

优选的，所述结合LAM单克隆抗体的重链可变区选自SEQ ID NO.11，所述轻链可变区选自SEQ ID NO.10；所述LAM单克隆抗体的重链可变区选自SEQ ID NO.13，轻链可变区选自SEQ ID NO.12。

本发明在用结核分枝杆菌H37Rv细菌提取细胞壁免疫兔的基础上，用scFv单链噬菌体抗体库获得特异性抗体，所述兔源的特异性抗体结合LAM，其步骤在于：

(1)培养扩增结核分枝杆菌H37Rv菌株，提取细菌细胞壁成分；

(2)兔免疫如步骤(1)所述的细胞壁3-4次，取脾脏和骨髓细胞构建scFv噬菌体抗体库；

(3)抗LAM单链抗体的淘筛，经过三轮抗体库的富集筛选，筛选到抗LAM抗体序列BJRbL01和BJRbL03，BJRbL01其重链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO.11，其轻链可变区具有氨基酸序列SEQ ID NO.10；BJRbL03其重链具有氨基酸序列SEQ ID NO.13，其轻链具有氨基酸序列SEQ ID NO.12；

(4)将(3)中所述重链可变区基因和轻链可变分别构建兔IgG重链和κ型轻链全长基因，克隆到真核表达载体，共转染宿主细胞，获得兔抗LAM单克隆抗体的全抗体。

(5)对(4)中抗LAM单克隆抗体的全抗体进行敏感性、特异性、亲和力和临床应用价值鉴定。

具体实施例

以下结合附图和实施例详述本发明。

实施例1兔抗LAM单克隆抗体制备

结核分枝杆菌H37Rv细胞壁的制备和鉴定。将结核分枝杆菌H37Rv培养在Middlebrook 7H9培养基中培养至对数生长期，离心收集菌体，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2遍，重悬于PBS中，约2g/L，80℃，2h灭活细菌。4℃条件下用细胞破碎仪破碎细菌，165W，超生破碎30min，未破碎细菌低速离心(3000×g，30min)去除，上清高速离心(15000×g，1h)收集细胞壁成分，沉淀PBS洗2遍，最后将沉淀悬于PBS溶液，紫外分光光度计测定浓度，分装为500μg/支。提取的细胞壁成分利用鼠抗LAM抗体CS35(BeiResource，NR-13811)通过ELISA和Western blotting方法进行鉴定，以纯化LAM(BeiResource，NR-14848)作为阳性检测对照。鉴定正确后用于免疫。

H37Rv细菌提取细胞壁免疫种兔。选用2.0-2.5kg(3-4月龄)普通级日本大耳白兔2只，饲养一周无异常后对动物进行编号，经耳缘静脉采血0.5ml，室温静置1小时后4℃过夜，经1500g离心后取上层血清，-20℃保存备检。基础免疫用200μg细胞壁成分与等体积弗式完全佐剂乳化混匀，经足底注射进行免疫。间隔2-3周进行加强免疫，应用等量细胞壁成分与弗式不完全佐剂乳化混匀，经腘窝淋巴结注射进行免疫，共免疫四次，分别于第三次和第四次免疫一周后耳缘静脉采血测定血清效价。末次免疫后第9天经耳缘静脉注射戊巴比妥钠麻醉动物后，经腹主动脉放血处死动物，采集脾脏和胫骨骨髓，迅速转移至液氮冻存备用；采血血液，室温静置1小时后4℃过夜，经1500g离心后取上层血清，-20℃冻存备用。

免疫兔血清效价检测。采用间接ELISA法，将LAM用包被缓冲液稀释成0.1μg/ml及1μg/ml，包被96孔酶标板，100μl/孔，4℃过夜。洗涤液洗涤3次，PBST-5％脱脂奶粉37℃封闭2h。加入PBST-5％脱脂奶粉梯度稀释的样品及样品稀释剂，100μl/孔，37℃反应2h。洗涤液洗涤2次，加入1:5000稀释山羊抗兔-HRP抗体，100μl/孔，37℃反应1h。洗涤液洗涤3次，加入显色液100μl/孔，室温反应10min。显色完成加入终止液，50μl/孔。酶标仪波长450nm读数。选取免疫后血清1：25000倍稀释，OD450值减去空白对照OD450值大于0.3的兔子用于噬菌体抗体库构建和抗体筛选。

兔单克隆抗体scFv噬菌体抗体库构建和抗体筛选。取兔组织(脾或骨髓)进行RNA提取。通过RT-PCR对抗体可变区(V)基因进行扩增，之后将重链、轻链可变区(VH和VL)片段拼接，获得融合的scFv片段并插入到表达载体，电转感受态细胞，获得噬菌体抗体库，库容不低于10⁹。将待筛选噬菌体抗体与包被抗原共同孵育，经过多轮淘洗和洗脱，得到富集的特异性结合噬菌体并将其扩增培养，取上清ELISA检测，挑选不同带型的克隆进行ELISA复检，确定仍为阳性者进行抗体序列测定。

完整兔抗LAM-IgG抗体序列构建和表达。经测序获得抗体可变区序列，兔IgG抗体恒定区序列是已知的，储备有包含兔抗体恒定区的载体，通过重叠PCR技术，利用筛选克隆和包含抗体恒定区序列的载体为模板扩增重链和轻链全长序列，构建IgG抗体重链(pCMV3-H)和轻链(pCMV3-L)表达载体。表达载体共同瞬时转染HEK293细胞，转染后6-7天取上清通过蛋白A纯化，获得纯化抗体，对纯化抗体鉴定后进行后续研究。

实施例2兔抗LAM抗体氨基酸序列分析及完整抗体表达鉴定

通过scFv实施噬菌体抗体库筛选确证2个LAM单克隆抗体，命名为BJRbL01和BJRbL03。阳性克隆通过测序获得轻链和重链可变区序列。通过IGBLAST软件分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)，发现scFv抗体属于VH类别和Vκ型；ABodyBuilder软件(http://opig.stats.ox.ac.uk/webapps/newsabdab/sabpred/abodybuilder/)在Kabat模式下进一步分析每个抗体VH(重链可变区)和VL(轻链可变区)三个CDR区位置。

针对BJRbL01抗体，其轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)氨基酸序列信息如下(下划线处分别为CDR1、CDR2和CDR3)：

BJRbL01-VL氨基酸序列(SEQ ID NO.10)：

DPVLTQTPASVEVAVGGTVTMNCQASHSVYGNNELSWYQQKPGQPPKLLVYKASTLASGVPS RFKGSGSGTQFTLTISDLECDDAAIYYCQGGYWGNRAFGGGTEVVVK；

BJRbL01-VH氨基酸序列(SEQ ID NO.11)：

QSVEESGGRLVTPGTSLTLTCTVSGFSLSNYDMGWVRQAPGKGLEWIGNIWSNGYTDYASWV NGRFTISKTSSTTMDLKMTSLTTEDMATYFCARGSSGYVGDIWGPGTLVTVSS；

针对BJRbL03抗体，其轻链可变区和重链可变区氨基酸序列信息如下(下划线处分别为CDR1、CDR2和CDR3)：

BJRbL03-VL氨基酸序列(SEQ ID NO.12)：

DPMLTQTASSVSAAVGGTVTINCQASQSVYGNNELSWYQQKPGQPPKLLIYKASTLASGVPSR FKASGSGTQFTLTISDLECDDAAIYYCQGGYWGNRAFGGGTKLEIK；

BJRbL03-VH氨基酸序列(SEQ ID NO.13)：

QSLEESGGRLVTPGTSLTLTCTVSGFSLRSYDMGWVRQAPGKGLEWIGSIWSNDFTDYASWV NGRFTVSKTSSTTMDLKMTSLTSEDTATYFCVRGSSGYVGDIWGPGTLVTVSS；

上述BJRbL01和BJRbL03抗体轻链恒定区和重链恒定区均相同，如下：

轻链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO.14)：

GDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADC TYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC；

重链恒定区氨基酸序列(SEQ ID NO.15)：

GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHQDWLRGKEFKCK VHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK。

另外，编码抗体的核苷酸序列如下(斜体下划线处为信号肽编码序列)：

BJRbL01-VL核苷酸序列如下(SEQ ID NO.16)：

ATGGGCTGGTCCTGTATCATCCTGTTCCTGGTGGCTACAGCCACAGGAGTGCATAGTGACCCTGTGCTGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATGAATTGCCAGGCCAGTCACAGCGTTTATGGTAACAACGAATTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGGTCTACAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGCTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCATTTATTACTGTCAAGGCGGTTATTGGGGCAATAGGGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA。

BJRbL03-VL核苷酸序列如下(SEQ ID NO.17)：

ATGGGCTGGTCCTGTATCATCCTGTTCCTGGTGGCTACAGCCACAGGAGTGCATAGTGACCCTATGCTGACCCAGACTGCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAACTGCCAGGCCAGTCAGAGCGTTTATGGTAACAACGAATTATCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAAGGCATCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAGGCCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGACGATGCTGCCATTTATTACTGTCAAGGCGGTTATTGGGGCAATAGGGCTTTCGGCGGAGGAACCAAGCTGGAGATCAAA。

BJRbL01和BJRbL03抗体轻链恒定区的核苷酸序列相同(SEQ ID NO.18)：

GGGGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTGTTAA。

BJRbL01-VH核苷酸序列如下(SEQ ID NO.19)：

AAGCTTGCCGCCACCATGGGCTGGTCCCTGATTCTGCTGTTCCTGGTGGCTGTGGCTACCAGGGTGCT GAGTCAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACATCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTACGACATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAAACATTTGGAGTAATGGTTACACGGACTACGCGAGCTGGGTGAATGGTCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGTCGACCACGATGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAACCGAGGACATGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGTAGTTCTGGTTATGTCGGAGACATCTGGGGCCCAGGTACCCTGGTCACAGTGAGCTCT。

BJRbL03-VH核苷酸序列如下(SEQ ID NO.20)：

ATGGGCTGGTCCCTGATTCTGCTGTTCCTGGTGGCTGTGGCTACCAGGGTGCTGAGTCAGTCGTTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACATCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGGAGCTACGATATGGGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGATCGGAAGCATTTGGAGTAATGATTTTACGGACTACGCGAGCTGGGTGAATGGTCGATTCACCGTCTCCAAAACCTCGTCGACCACGATGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAAGCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGTCAGAGGTAGTTCTGGTTATGTCGGAGACATCTGGGGCCCAGGTACCCTGGTCACAGTGAGCTCT。

BJRbL01和BJRbL03抗体重链恒定区核苷酸序列相同(SEQ ID NO.21)：

GGTCAACCTAAGGCTCCGTCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCCTGGGCTGCCTGGTCAAAGGCTACCTCCCGGAGCCAGTGACCGTGACCTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGCGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACCAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAGTGGCAGCGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAATAA。

BJRbL01和BJRbL03抗体的轻链预测分子量约为23kDa；重链预测分子量约为48kDa；完整IgG抗体预测分子量约为140ka。表达纯化的完整抗LAM抗体通过SDS-PAGE胶在非还原(图1中A)和还原条件(图1中B)下进行鉴定，抗体纯度大于90％，可用于后续检测。图中1表示BJRbL01，2表示BJRbL03。

实施例3LAM抗体的敏感性、特异性和亲和力鉴定

纯化LAM抗体结合LAM敏感性的ELISA鉴定。将纯化LAM抗原10倍梯度稀释包被酶标板(1000-0.001ng/ml)，100μl/孔加入到ELISA-96孔酶标板中；盖上盖子或者保护膜，4℃过夜。用Wash Buffer工作液洗3次，加入200μl/孔5％脱脂奶粉以封闭非特异性结合位点，37℃反应2小时。洗涤3次后加入5％脱脂奶粉稀释的BJRbL01或BJRbL03抗体1μg/ml，100μl/孔，于37℃反应2h。洗涤5次后，加入1:5000稀释辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(H+L)37℃反应1h。洗涤5次后，加入TMB底物溶液，100μl/孔，37℃反应30min。加入终止液，100μl/孔。利用酶标仪测定OD450值。Graphpad软件分析检测结果。

敏感性检测结果(图2)：BJRbL01和BJRbL03抗体结合LAM的检测敏感性为100pg/ml，可见，两个抗体具有较高的敏感性。

ELISA实验主要试剂来源和配制：

包被液(BD OptEIA Coating Buffer，51-2713KC)：pH9.5的0.1M碳酸钠

洗液(BD OptEIA Wash Buffer，51-9003739)：20×浓缩洗液，用去离子水或者蒸馏水稀释成1×工作液。

5％脱脂奶粉封闭液：5克脱脂奶粉加入100ml的1×PBS溶液中。

显色液A(BD OptEIA Substrate Reagent A，51-2606KZ)：含有过氧化氢的缓冲液；显色液B(BD OptEIA Substrate Reagent B，51-2607KZ)：含有3,3'，5,5'四甲基联苯胺(TMB)的有机溶剂。显色液A与显色液B按照1：1比例混匀后作为工作液。

终止液(BD OptEIA Stop Solution，51-2608KZ)：1M硫酸。

LAM抗体特异性鉴定。

ELISA法检LAM抗体与结核分枝杆菌组分LAM和多种重组蛋白反应性。包被用的纯化LAM抗原为1μg/ml，结核分枝杆菌特异性重组蛋白38KD、MPT32、MPT64、Mtb81、CFP10和EspC稀释成5μg/ml，100μl/孔，分别加入到96孔酶标板中，盖上盖子或者保护膜，4℃过夜。其余步骤参同所述ELISA操作流程。

基于LAM抗体的ELISA特异性检测结果(图3)：抗LAM抗体仅与LAM结合，而不与结核分枝杆菌重组蛋白38KD、MPT32、MPT64、Mtb81、CFP10和EspC结合。

Western blotting鉴定LAM抗体特异性。纯化LAM、提取的细胞壁和H37Rv细菌培养上清分别与上样缓冲液混匀，煮沸5min。利用10％SDS-PAGE胶进行电泳分离，150V，电泳1h。将目的片段从PAGE胶电转移至硝酸纤维素膜上，300mA，1h。膜用丽春红染液染10min，拍照记录染色结果(见图4中A)。去离子水洗涤后用5％脱脂奶粉封闭2h。加入0.3μg/ml的BJRbL01和或BJRbL03抗体，4℃过夜；对照加入1:20稀释的鼠抗LAM单克隆抗体CS35杂交瘤培养上清。PBST洗3遍，每次5min。加入1:5000稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG室温反应1h。洗膜后加入化学发光底物，利用凝胶成像仪记录结果。

Western blotting鉴定结果(图4)：通过Western blotting法，BJRbL01和/或BJRbL03抗体可与纯化LAM、结核分枝杆菌H37Rv细胞壁成分和H37Rv细菌培养上清结合，以国际上认可的鼠抗LAM特异性抗体CS35作为对照，结果显示仅有一个条带，与LAM标准品大小一致(35-45kDa范围内)，无非特异性结合条带。以上结果均提示BJRbL01和BJRbL03抗体可特异性识别结核分枝杆菌特异性LAM。图中，A：丽春红染色的代表性结果；B：Westernblotting检测结果；M:Marker；1:纯化的LAM；2:提取的结核分枝杆菌H37Rv细胞壁：3：H37Rv细菌培养上清。

LAM抗体亲和力的鉴定。

亲和力检测流程：aminopropylsilane传感器(美国PALL公司)在平衡液中(0.1％BSA+0.02％Tween20的PBS溶液)预湿10分钟，将LAM用平衡液稀释为5μg/mL，加到避光96孔板第二列中，200μl/孔将BJRbL01或BJRbL03抗体从250nM起始倍比稀释至31.3nM，加入避光96孔板的第四列中，200μl/孔，孔H4为空白对照，加入200μl平衡液。将平衡液加入第一列与第三列中，200μl/孔。ForteBio Octet分子相互作用仪检测，将传感器在第一列中平衡60s获得基础平衡曲线，然后在第二列中进行抗体固化300s。在第三列中进行封闭10min，在第四列中结合抗体180s获得结合曲线，回到第一列中解离300s，获得解离曲线。ForteBioOctet分析软件对曲线进行拟合分析，获得亲和力数值。

亲和力检测结果(图5)：通过ForteBio Octet系统对抗体亲和力进行测定，以不添加LAM的缓冲盐溶液作为对照。数据分析后，BJRbL01和BJRbL03抗体的亲和力K_D值分别为1.61×10^-9M、1.63×10^-9M，可见，BJRbL01和BJRbL03抗体的亲和力较好。

实施例4抗LAM抗体与多种分枝杆菌结合特性的鉴定

ELISA法鉴定LAM抗体与多种分枝杆菌培养上清结合特性。使用23种分枝杆菌鉴定LAM抗体对不同菌种LAM结合的特异性，包括11种慢速生长型分枝杆菌和12种快速生长型分枝杆菌。收集细菌培养上清，1:50稀释培养上清包被酶标板，间接ELISA法检测LAM抗体对培养上清中LAM的识别。其他操作流程参见上述ELISA流程。

检测结果(图6)：以2.1倍空白对照OD450均值作为临界值，BJRbL01和BJRbL03抗体检测阳性的均为慢速生长型分枝杆菌(n＝11)培养上清，检测阴性的均为快速生长型分枝杆菌(n＝12)培养上清。

其中，11种慢速生长型分枝杆菌包括：结核分枝杆菌(M.tb.H37Rv)、牛分枝杆菌(M.bovis)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、戈登分枝杆菌(M.gordonae)、海分枝杆菌(M.marinum)、鸟分枝杆菌(M.avium)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、胃分枝杆菌(M.gastri)、蟾蜍分枝杆菌(M.xenopi)和玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)。

其中，12种快速生长型分枝杆菌包括：脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、金色分枝杆菌(M.aurum)、新金色分枝杆菌(M.neoaurum)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、副偶发分枝杆菌(M.parafortuitum)、嗜鲑鱼分枝杆菌(M.salmoniphilum)、无色分枝杆菌(M.nonchromogenicum)、母牛分枝杆菌(M.vaccae)、草分枝杆菌(M.phlei)、汇合分枝杆菌(M.confluentis)和微黄分枝杆菌(M.gilvum)。

Dot blots法鉴定LAM抗体与分枝杆菌灭活上清液结合特征。Dot blots法用23种分枝杆菌细菌菌体灭活上清液鉴定BJRbL01和BJRbL03抗体结合不同分枝杆菌菌株的特异性。同时设置倍比稀释的H37Rv-LAM(100ng-0.1ng；f6-e2)作为对照。样本点到硝酸纤维素膜，室温干燥后利用丽春红进行染色，拍照记录结果(图7中A和C)，洗膜后进行封闭、抗体反应和化学发光等检测，参见Western blotting流程。

检测结果(图7)：BJRbL01和BJRbL03抗体均可与11种慢速生长型分枝杆菌灭活上清液结合(a1-b5)，而不与12种快速生长型分枝杆菌灭活上清液结合(c1-d6)。BJRbL01和BJRbL03均可检测到0.1ng的LAM(e2)。图中，A和C：丽春红染色结果；B和D：Dot blots检测结果；a1-b5：慢速生长型分枝杆菌灭活上清液；c1-d6：快速生长型分枝杆菌灭活上清液；e2-f6：倍比稀释的LAM(0.1ng-100ng)；b6和e1：空白对照。

实施例5流式细胞术鉴定LAM抗体与分枝杆菌的结合特性

流式细胞术检测：取50μl灭活细菌悬液转移至1.5ml的Eppendorf管中。PBS缓冲液(0.01M，pH7.4)洗涤2遍，12,000rpm，2min离心沉淀细菌，弃去上清，沉淀重选于100μl的PBS中。每管加入0.5μg兔抗LAM抗体混匀，室温反应30min。PBS溶液洗涤2遍，加入2μg/mlAF488标记的山羊抗兔IgG(H+L)superclonal^TM重组二抗，室温避光反应30min。PBS洗涤2遍，重悬于200μl的PBS溶液。利用BDLSRFortessa^TM流式细胞仪进行检测，通过BDFACSDiva软件分析结果。

检测结果(图8)：抗LAM抗体BJRbL01和BJRbL03可通过流式细胞术与慢速生长型分枝杆菌细胞表面的LAM结合，与快速生长型分枝杆菌对照不结合。ELISA和Dot blots检测结果一致，BJRbL01和BJRbL03均可与11株慢速生长型分枝杆菌结合。

实施例6LAM抗体对临床分离分枝杆菌菌株的识别特性

ELISA法鉴定LAM抗体检测临床分离菌株的敏感性和特异性。

分枝杆菌临床分离株：分枝杆菌临床株从固体培养基上用无菌小勺刮下后悬于500μl的PBS中，80℃灭活后用于后续检测。检测中应用了90个分枝杆菌临床分离株，包括50个结核分枝杆菌分离株(Mtb isolates，MTB组)、20个鸟-胞内分枝杆菌分离株(M.avium-intracellulare isolates，MAI组；10个鸟分枝杆菌分离株和10个胞内分枝杆菌分离株)和20个脓肿-偶发分枝杆菌分离株(M.abscessus-M.fortuitum isolates，MA-MF组；10个脓肿分枝杆菌分离株和10个偶发分枝杆菌分离株)。

ELISA检测：1:100稀释结核分枝杆菌分离株灭活悬液包被酶标板，间接ELISA法检测抗LAM抗体与分支杆菌临床分离株的结合特性。其余步骤同所述ELISA操作流程。

检测结果(图9)：在MTB组，BJRbL01和BJRbL03可检测到96％(48/50)的结核分枝杆菌分离株；在MAI组，BJRbL01和BJRbL03可检测到90％(18/20)的鸟-胞内分枝杆菌分离株；在MA-MF组(快速生长型分枝杆菌对照组)，BJRbL01和BJRbL03可检测到5％(1/20)的脓肿-偶发分枝杆菌分离株。该结果分析以MA-MF组检测OD450均值加两倍标准差值作为ELISA检测临界值。

ROC曲线检测LAM抗体检测分枝杆菌的性能。应用ROC曲线评估LAM抗体对结核分枝杆菌分离株和鸟-胞内分枝杆菌分离株的检测性能(MTB vs MA-MF和MAI vs MA-MF)，以MA-MF组作为识别对照组。

检测结果(图10)：以MA-MF组作为对照进行分析，BJRbL01和BJRbL03对MTB检测的曲线下面积(AUC)分别为0.9670和0.9615。BJRbL01和BJRbL03对MAI检测的曲线下面积(AUC)分别为0.9825和0.9775。

总的来说，我们成功制备了新型兔抗LAM单克隆抗体即BJRbL01和BJRbL03，其具有高敏感性、高特异性和较高亲和力。其与慢速生长型分枝杆菌结合，而不与快速生长型分枝杆菌结合，并可识别结核分枝杆菌和常见致病性分枝杆菌临床分离株，体现了它们在临床应用中的巨大潜力。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 首都医科大学附属北京胸科医院

北京市结核病胸部肿瘤研究所

<120> 结核分枝杆菌LAM的单克隆抗体及其用途

<160> 21

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gln Ala Ser His Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Leu Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Gln Gly Gly Tyr Trp Gly Asn Arg Ala

1 5

<210> 4

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 4

Asn Tyr Asp Met Gly

1 5

<210> 5

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 5

Asn Ile Trp Ser Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly

1 5 10 15

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 6

Gly Ser Ser Gly Tyr Val Gly Asp Ile

1 5

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 7

Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn Asn Glu Leu Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 8

Ser Tyr Asp Met Gly

1 5

<210> 9

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 9

Ser Ile Trp Ser Asn Asp Phe Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly

1 5 10 15

<210> 10

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 10

Asp Pro Val Leu Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Met Asn Cys Gln Ala Ser His Ser Val Tyr Gly Asn

20 25 30

Asn Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Val Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Lys Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu

65 70 75 80

Glu Cys Asp Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Tyr Trp Gly

85 90 95

Asn Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Glu Val Val Val Lys

100 105

<210> 11

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 11

Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Ser

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Asn Tyr Asp

20 25 30

Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Asn Ile Trp Ser Asn Gly Tyr Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Met Asp Leu Lys Met

65 70 75 80

Thr Ser Leu Thr Thr Glu Asp Met Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly

85 90 95

Ser Ser Gly Tyr Val Gly Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 12

<211> 109

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 12

Asp Pro Met Leu Thr Gln Thr Ala Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly

1 5 10 15

Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Tyr Gly Asn

20 25 30

Asn Glu Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Lys Ala Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu

65 70 75 80

Glu Cys Asp Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gly Gly Tyr Trp Gly

85 90 95

Asn Arg Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 13

<211> 115

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 13

Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Ser

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Arg Ser Tyr Asp

20 25 30

Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Ser Ile Trp Ser Asn Asp Phe Thr Asp Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Val Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Met Asp Leu Lys Met

65 70 75 80

Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Val Arg Gly

85 90 95

Ser Ser Gly Tyr Val Gly Asp Ile Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 104

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 14

Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe Pro Pro Ala Ala Asp

1 5 10 15

Gln Val Ala Thr Gly Thr Val Thr Ile Val Cys Val Ala Asn Lys Tyr

20 25 30

Phe Pro Asp Val Thr Val Thr Trp Glu Val Asp Gly Thr Thr Gln Thr

35 40 45

Thr Gly Ile Glu Asn Ser Lys Thr Pro Gln Asn Ser Ala Asp Cys Thr

50 55 60

Tyr Asn Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Ser Thr Gln Tyr Asn Ser

65 70 75 80

His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly Thr Thr Ser Val Val

85 90 95

Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys

100

<210> 15

<211> 323

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 15

Gly Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Thr Leu Thr Asn

35 40 45

Gly Val Arg Thr Phe Pro Ser Val Arg Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser Ser Gln Pro Val Thr Cys

65 70 75 80

Asn Val Ala His Pro Ala Thr Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Ala

85 90 95

Pro Ser Thr Cys Ser Lys Pro Thr Cys Pro Pro Pro Glu Leu Leu Gly

100 105 110

Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

115 120 125

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

130 135 140

Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val

145 150 155 160

Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln Gln Phe Asn Ser Thr Ile

165 170 175

Arg Val Val Ser Thr Leu Pro Ile Ala His Gln Asp Trp Leu Arg Gly

180 185 190

Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

195 200 205

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val

210 215 220

Tyr Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser

225 230 235 240

Leu Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu

245 250 255

Trp Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala

260 265 270

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val

275 280 285

Pro Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met

290 295 300

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser

305 310 315 320

Pro Gly Lys

<210> 16

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagtgac 60

cctgtgctga cccagactcc agcctctgtg gaggtagctg tgggaggcac agtcaccatg 120

aattgccagg ccagtcacag cgtttatggt aacaacgaat tatcctggta tcagcagaaa 180

ccagggcagc ctcccaagct cctggtctac aaggcatcca ctctggcatc tggggtccca 240

tcgcgcttca aaggcagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag cgacctggag 300

tgtgacgatg ctgccattta ttactgtcaa ggcggttatt ggggcaatag ggctttcggc 360

ggagggaccg aggtggtggt caaa 384

<210> 17

<211> 384

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagtgac 60

cctatgctga cccagactgc atcctccgtg tctgcagctg tgggaggcac agtcaccatc 120

aactgccagg ccagtcagag cgtttatggt aacaacgaat tatcctggta tcagcagaaa 180

ccagggcagc ctcccaagct cctgatctac aaggcatcca ctctggcatc tggggtccca 240

tcgcggttca aggccagtgg atctgggaca cagttcactc tcaccatcag cgacctggag 300

tgtgacgatg ctgccattta ttactgtcaa ggcggttatt ggggcaatag ggctttcggc 360

ggaggaacca agctggagat caaa 384

<210> 18

<211> 315

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ggggatccag ttgcacctac tgtcctcatc ttcccaccag ctgctgatca ggtggcaact 60

ggaacagtca ccatcgtgtg tgtggcgaat aaatactttc ccgatgtcac cgtcacctgg 120

gaggtggatg gcaccaccca aacaactggc atcgagaaca gtaaaacacc gcagaattct 180

gcagattgta cctacaacct cagcagcact ctgacactga ccagcacaca gtacaacagc 240

cacaaagagt acacctgcaa ggtgacccag ggcacgacct cagtcgtcca gagcttcaat 300

aggggtgact gttaa 315

<210> 19

<211> 417

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

aagcttgccg ccaccatggg ctggtccctg attctgctgt tcctggtggc tgtggctacc 60

agggtgctga gtcagtcggt ggaggagtcc gggggtcgcc tggtcacgcc tgggacatcc 120

ctgacactca cctgcacagt ctctggattc tccctcagta actacgacat gggctgggtc 180

cgccaggctc cagggaaggg gctggagtgg atcggaaaca tttggagtaa tggttacacg 240

gactacgcga gctgggtgaa tggtcgattc accatctcca aaacctcgtc gaccacgatg 300

gatctgaaaa tgaccagtct gacaaccgag gacatggcca cctatttctg tgccagaggt 360

agttctggtt atgtcggaga catctggggc ccaggtaccc tggtcacagt gagctct 417

<210> 20

<211> 402

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgagtcag 60

tcgttggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggga catccctgac actcacctgc 120

acagtctctg gattctccct caggagctac gatatgggct gggtccgcca ggctccaggg 180

aaggggctgg agtggatcgg aagcatttgg agtaatgatt ttacggacta cgcgagctgg 240

gtgaatggtc gattcaccgt ctccaaaacc tcgtcgacca cgatggatct gaaaatgacc 300

agtctgacaa gcgaggacac ggccacctat ttctgtgtca gaggtagttc tggttatgtc 360

ggagacatct ggggcccagg taccctggtc acagtgagct ct 402

<210> 21

<211> 972

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ggtcaaccta aggctccgtc agtcttccca ctggccccct gctgcgggga cacacccagc 60

tccacggtga ccctgggctg cctggtcaaa ggctacctcc cggagccagt gaccgtgacc 120

tggaactcgg gcaccctcac caatggggta cgcaccttcc cgtccgtccg gcagtcctca 180

ggcctctact cgctgagcag cgtggtgagc gtgacctcaa gcagccagcc cgtcacctgc 240

aacgtggccc acccagccac caacaccaaa gtggacaaga ccgttgcgcc ctcgacatgc 300

agcaagccca cgtgcccacc ccctgaactc ctggggggac cgtctgtctt catcttcccc 360

ccaaaaccca aggacaccct catgatctca cgcacccccg aggtcacatg cgtggtggtg 420

gacgtgagcc aggatgaccc cgaggtgcag ttcacatggt acataaacaa cgagcaggtg 480

cgcaccgccc ggccgccgct acgggagcag cagttcaaca gcacgatccg cgtggtcagc 540

accctcccca tcgcgcacca ggactggctg aggggcaagg agttcaagtg caaagtccac 600

aacaaggcac tcccggcccc catcgagaaa accatctcca aagccagagg gcagcccctg 660

gagccgaagg tctacaccat gggccctccc cgggaggagc tgagcagcag gtcggtcagc 720

ctgacctgca tgatcaacgg cttctaccct tccgacatct cggtggagtg ggagaagaac 780

gggaaggcag aggacaacta caagaccacg ccggccgtgc tggacagcga cggctcctac 840

ttcctctaca gcaagctctc agtgcccacg agtgagtggc agcggggcga cgtcttcacc 900

tgctccgtga tgcacgaggc cttgcacaac cactacacgc agaagtccat ctcccgctct 960

ccgggtaaat aa 972

Claims

1.一种抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，具有轻链可变区和重链可变区；

其中，所述轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列如下：

LCDR1:QASHSVYGNNELS；

LCDR2:KASTLAS；

LCDR3:QGGYWGNRA；

所述重链可变区的各互补决定区的氨基酸序列如下：

HCDR1:NYDMG；

HCDR2:NIWSNGYTDYASWVNG；

HCDR3:GSSGYVGDI；

或者，所述轻链可变区的各互补决定区的氨基酸序列如下：

LCDR1:QASQSVYGNNELS；

LCDR2:KASTLAS；

LCDR3:QGGYWGNRA；

所述重链可变区的各互补决定区的氨基酸序列如下：

HCDR1:SYDMG；

HCDR2:SIWSNDFTDYASWVNG；

HCDR3:GSSGYVGDI。

2.根据权利要求1所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

3.根据权利要求1所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。

4.根据权利要求2或3所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述单克隆抗体的重链恒定区选自：IgG、IgD、IgA、IgE和IgM中任意一种抗体的重链恒定区；所述单克隆抗体的轻链恒定区为κ型或λ型轻链恒定区；

优选地，所述单克隆抗体的轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；

优选地，所述单克隆抗体的重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；

优选地，所述抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或ScFv。

5.权利要求1-4任一项所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段在制备检测分枝杆菌的试剂或试剂盒中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述分枝杆菌为慢速生长型分枝杆菌；

优选地，所述慢速生长型分枝杆菌选自结核分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、牛分枝杆菌、胞内分枝杆菌、戈登分枝杆菌、海分枝杆菌、鸟分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、胃分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌中的任意一种。

7.一种抗体偶联物，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段。

8.一种检测组合物，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段。

9.一种检测分枝杆菌的试剂或试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-4任一项所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段，权利要求7所述的抗体偶联物，或者权利要求8所述的检测组合物；

优选地，所述分枝杆菌为慢速生长型分枝杆菌；

10.一种分离的核酸分子，其特征在于，其编码如权利要求1-4任一项所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段。

11.一种载体，其特征在于，其含有权利要求10所述的核酸分子。

12.一种重组细胞，其特征在于，其含有权利要求11所述的载体。

13.一种制备如权利要求1-4任一项所述的抗LAM单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求12所述的重组细胞，从培养物中分离纯化得到所述单克隆抗体或其抗原结合片段。