CN117567599A - 一种针对人腺病毒的纳米抗体3a2及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种针对人腺病毒的纳米抗体3A2及其制备方法与应用。本发明属于生物技术领域,具体涉及一种针对人腺病毒的纳米抗体3A2及其制备方法与应用。本发明的靶向人腺病毒的纳米抗体或含有纳米抗体的抗原结合片段,具有3个互补决定簇CDR1、CDR2和CDR3;其中CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No.1,CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No.2,CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No.3。将纳米抗体3A2与人免疫球蛋白的Fc段(hFc)融合得到融合蛋白,并进行人源化得到的h3A2‑hFc可以有效抑制人55型腺病毒的感染,其IC50为0.62nM。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种针对人腺病毒的纳米抗体3A2及其制备方法与应用。
背景技术
全球多次报道由腺病毒引发的呼吸道疾病在新兵中暴发流行,流行的病毒株主要为B组55型、7型和14型腺病毒,其中55型是近几年新发现的病毒,由11型和14型重组而来,人群缺乏免疫力,普遍易感,且症状较重,引起各方重视。目前尚无明确针对腺病毒的特效治疗,临床上以对症支持、提高机体免疫力和针对并发症的治疗为主。研究发现人体感染腺病毒后可产生长时间的免疫保护,康复后一般不会再次感染同型病毒,且有研究显示:腺病毒感染所产生的起保护作用的中和抗体通常可持续10年。因此利用腺病毒中和抗体进行被动免疫治疗,作为一种有效而特异的抗腺病毒治疗手段,应该是未来腺病毒感染治疗的一个重要研究方向。
纳米抗体(nanobody)是一种小型、单链的抗体片段,来源于骆驼科动物(如骆驼、双峰驼和羊驼)和鲨鱼的重链抗体。与传统的抗体相比,纳米抗体具有尺寸小、稳定性高、易于生产和改造的特点。纳米抗体的起源可以追溯到上世纪90年代对骆驼科动物的抗体研究。与大多数哺乳动物(它们的抗体由两个重链和两个轻链组成)不同,骆驼科动物的抗体中有一部分只由两个重链组成。纳米抗体是这种重链抗体的可变区(VHH),不包含常数区。因其小型结构,纳米抗体的分子量大约为15kDa。由于其结构简单,纳米抗体容易进行遗传和化学改造,以增强其亲和力、特异性或增加功能性标签,尺寸小使得纳米抗体可以进入传统抗体无法到达的细胞部位或病原体上的结构。此外,纳米抗体对温度、酸碱性和其他化学物质具有高度稳定性,适合多种应用环境。纳米抗体可用于开发针对疾病标记物或病原体的治疗策略,目前已被用于癌症、炎症性疾病和传染病的治疗研究。
发明内容
本发明所要解决的主要问题是开发一种能够与人55型腺病毒特异性结合的纳米抗体,并能在针对人腺病毒的诊断或治疗中发挥作用。
为了解决上述问题,本发明提供了一种靶向人腺病毒的纳米抗体或含有所述纳米抗体的抗原结合片段。
本发明提供的靶向人腺病毒的纳米抗体或含有所述纳米抗体的抗原结合片段,具有3个互补决定簇CDR1、CDR2和CDR3;所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示,所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
上述CDR是根据IMGT编号系统定义的序列。
本文中所述的纳米抗体通常包括由4个构架区(FRs)和3个互补决定区(CDRs)组成的VHH,称为FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4,所述抗原结合片段包含该纳米抗体的至少一部分,该部分足以赋予该片段特异性结合人55型腺病毒的能力。
所述4个框架区可为FR1、FR2、FR3和FR4。
所述FR1的氨基酸序列为SEQ ID No.12或SEQ ID No.16;
所述FR2的氨基酸序列为SEQ ID No.13;
所述FR3的氨基酸序列为SEQ ID No.14或SEQ ID No.18;
所述FR4的氨基酸序列为SEQ ID No.15或SEQ ID No.19。
上文所述的纳米抗体或抗原结合片段中,所述纳米抗体可为下述任一种:
A1)氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的纳米抗体;
A2)氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的纳米抗体;
A3)在SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示氨基酸序列的N端和/或C端连接上蛋白标签后得到的纳米抗体融合蛋白。
所述蛋白标签(protein-tag)是指利用与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白,以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为His标签、Flag标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签、免疫球蛋白的Fc段等。
本发明中,所述蛋白标签可为人免疫球蛋白G的Fc段(hFc)。
上述纳米抗体中,所述纳米抗体由所述互补决定簇区和框架区组成。
本发明中术语“抗体”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白,其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连,而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH),其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL),另一端有恒定区;轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对,轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
本发明中术语“单域抗体(VHH)”、“纳米抗体”(nanobody)具有相同的含义,指克隆抗体重链的可变区,构建仅由一个重链可变区组成的单域抗体(VHH),它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。
上述抗原结合片段可为含有所述纳米抗体的完整抗体、融合抗体、抗体药物偶联物、Fab片段、Fv片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、单链抗体(ScFv)、或最小识别单位(MRU)。
术语“Fab片段”是由重链Fd和完整轻链通过二硫键结合而成的异二聚体,仅含一个抗原结合位点。上述重链Fd指Fab中约1/2的H链部分(约含225个氨基酸残基,包括VH、CH1和部分铰链区)。
术语“Fv片段”是指可分别构建含有VH和VL基因的载体,共转染细胞,使之分别表达,再组装成功能性Fv抗体;也可在载体中的VH和VL之间设置终止密码,分别表达两个小分子蛋白片段,再通过非共价键结合而形成Fv抗体(Fv片段)。
术语“Fab′片段”含有一条轻链和包含VH结构域和CH1结构域以及CH1和CH2结构域之间区域的一条重链的部分,由此可在两个Fab′片段的两条重链之间形成链间二硫键以形成F(ab′)2分子。
术语“F(ab′)2片段”含有两条轻链和两条包含CH1和CH2结构域之间的恒定区的部分的重链,由此在两条重链间形成链间二硫键。因此,F(ab′)2片段由通过两条重链间的二硫键保持在一起的两个Fab′片段组成。
本发明中术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同,它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区,它们大致上呈β-折叠构型,由形成连接环的三个CDR相连,在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I,647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
在一些实施方案中,本发明所述的纳米抗体可在N端或C端处截短以使其仅包含部分FR1和/或FR4,或缺少那些骨架区中的一个或两个,只要其实质上保持抗原结合和特异性即可。
本发明中,所述纳米抗体命名为纳米抗体3A2。
本发明还提供了与前文所述纳米抗体相关的生物材料,所述生物材料可为下述任一种:
B1)编码前文所述纳米抗体或抗原结合片段的核酸分子;
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒;
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体;
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体;
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物;
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物;
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物;
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。
上述生物材料中,所述核酸分子可以是DNA,如cDNA、基因组DNA或重组DNA;所述核酸分子也可以是RNA,如mRNA或hnRNA等。
上述生物材料中,B2)所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述纳米抗体的DNA,该DNA不但可包括启动所述纳米抗体编码基因转录的启动子,还可包括终止所述纳米抗体编码基因转录的终止子。进一步,所述表达盒还可包括增强子序列。
可用现有的表达载体构建含有所述表达盒的重组载体。
上述生物材料中,所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
上述生物材料中,所述重组载体可为将B1)所述核酸分子导入到pTSE-hFc载体中得到的重组载体。
上述生物材料中,所述微生物可为细菌(如大肠杆菌)、酵母、藻或真菌。
上述生物材料中,所述纳米抗体的CDR1的编码基因是SEQ ID No.6的第76-99位核苷酸,所述CDR2的编码基因如SEQ ID No.6的第151-174位核苷酸,所述CDR3的编码基因如SEQ ID No.6的第289-324位核苷酸。
上述生物材料中,B1)所述核酸分子可为如下任一:
C1)核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子;
C2)核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的DNA分子;
C3)在严格条件下与C1)或C2)限定的DNA分子杂交且编码所述纳米抗体的DNA分子;
C4)与C1)-C3)中任一限定的DNA序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同源性且编码所述纳米抗体的DNA分子。
其中,所述严格条件可为如下:50℃,在7%十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交,在50℃,2×SSC,0.1%SDS中漂洗;还可为:50℃,在7%SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交,在50℃,1×SSC,0.1%SDS中漂洗;还可为:50℃,在7%SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交,在50℃,0.5×SSC,0.1%SDS中漂洗;还可为:50℃,在7%SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交,在50℃,0.1×SSC,0.1%SDS中漂洗;还可为:50℃,在7%SDS、0.5M Na3PO4和1mM EDTA的混合溶液中杂交,在65℃,0.1×SSC,0.1%SDS中漂洗;也可为:在6×SSC,0.5%SDS的溶液中,在65℃下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法,例如定向进化和点突变的方法,对本发明的B1)所述纳米抗体3A2编码基因的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的,具有与本发明的B1)所述3A2的核苷酸序列75%或75%以上同一性的核苷酸,只要编码所述纳米抗体且具有纳米抗体3A2活性,均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
本发明还提供了上述纳米抗体的制备方法,可包括如下步骤:将编码前文所述纳米抗体的核酸分子导入受体细胞得到表达所述纳米抗体的转基因细胞,培养所述转基因细胞,得到所述纳米抗体。
进一步地,编码所述纳米抗体的核酸分子为前文所述的核酸分子。
上述方法中,编码前文所述纳米抗体的核酸分子的核苷酸序列具体可为如下任一:
C1)核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子;
C2)核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的DNA分子;
C3)在严格条件下与C1)或C2)限定的DNA分子杂交且编码所述纳米抗体的DNA分子;
C4)与C1)-C3)中任一限定的DNA序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同源性且编码所述纳米抗体的DNA分子。
进一步地,所述受体细胞可为微生物细胞,如细菌(如大肠杆菌)、酵母、藻或真菌。
在本发明的具体实施方式中,所述受体细胞具体可为HEK293-F细胞。
本发明还提供了一种纳米抗体融合蛋白,所述纳米抗体融合蛋白为将前文所述的纳米抗体或抗原结合片段与另一分子融合,所述另一分子可包括免疫球蛋白的Fc结构域、荧光蛋白或具有不同特异性的VHH。
在本发明具体实施例中,所述另一分子为人免疫球蛋白的Fc结构域。
在本发明具体的实施例中,上文所述人免疫球蛋白的Fc结构域的氨基酸序列为SEQ ID No.8的第122至348位或氨基酸序列为SEQ ID No.9的第122至348位。
在本发明具体的实施例中,上文所述的纳米抗体融合蛋白可为下述任一种:
M1)氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的纳米抗体融合蛋白;
M2)氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的纳米抗体融合蛋白;
M3)在SEQ ID No.8或SEQ ID No.9所示氨基酸序列的N端和/或C端连接上蛋白标签后得到的纳米抗体融合蛋白。
上述纳米抗体融合蛋白中,编码所述融合蛋白的核酸分子可为如下任一:
D1)核苷酸序列如SEQ ID No.10所示的DNA分子;
D2)核苷酸序列如SEQ ID No.11所示的DNA分子;
D3)在严格条件下与D1)或D2)限定的DNA分子杂交且编码所述融合蛋白的DNA分子;
D4)与D1)-D3)中任一限定的DNA序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同源性且编码所述融合蛋白的DNA分子。
本发明还提供了上述纳米抗体融合蛋白的制备方法,可包括如下步骤:将编码前文所述纳米抗体融合蛋白的核酸分子导入受体细胞得到表达所述纳米抗体融合蛋白的转基因细胞,培养所述转基因细胞,得到所述纳米抗体融合蛋白。
本发明还提供了一种靶向人55型腺病毒的ELISA检测试剂盒,所述试剂盒包含前文所述的纳米抗体或含有所述纳米抗体的抗原结合片段、或所述生物材料、或所述的融合蛋白。
本发明还提供了下述任一种应用:
E1)前文所述纳米抗体或抗原结合片段在制备用于检测人腺病毒的产品中的应用;
E2)前文所述生物材料在制备用于检测人腺病毒的产品中的应用;
E3)前文所述制备方法在制备用于检测人腺病毒的产品中的应用;
E4)前文所述试剂盒在制备用于检测人腺病毒的产品中的应用;
E5)前文所述纳米抗体在制备与人腺病毒结合的产品中的应用;
E6)前文所述生物材料在制备与人腺病毒结合的产品中的应用;
E7)前文所述制备方法在制备与人腺病毒结合的产品中的应用;
E8)前文所述试剂盒在制备与人腺病毒结合的产品中的应用;
E9)前文所述纳米抗体或抗原结合片段在制备人腺病毒检测试剂中的应用;
E10)前文所述纳米抗体或抗原结合片段在制备人腺病毒诊断试剂中的应用;
E11)前文所述纳米抗体或抗原结合片段在制备预防和/或治疗人腺病毒药物中的应用。
上述产品可为药物。
本发明不仅包括具有免疫活性的所述纳米抗体的片段,还包括抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此,本发明还包括所述纳米抗体的片段、衍生物和类似物等保持与本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。所述多肽可为如下:D1)含有前文所述纳米抗体的单链抗体;D2)含有前文所述纳米抗体的Fab;D3)含有前文所述纳米抗体的完整抗体;D4)含有前文所述纳米抗体的融合抗体;D5)含有前文所述纳米抗体的抗体药物偶联物。
D4)所述纳米抗体的融合抗体可为:M1)氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的纳米抗体融合蛋白;M2)氨基酸序列如SEQ ID No9所示的纳米抗体融合蛋白。
如本领域技术人员所知,所述偶联物及融合抗体表达产物包括:药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述纳米抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物),只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90%同源性,较佳地至少95%同源性。
本发明所述的抗原为人55型腺病毒。
本发明从VHH为骨架的多肽及蛋白质文库中,以人55型腺病毒(HAdV55)为抗原,筛选得到靶向人55型腺病毒(HAdV55)的高亲和力纳米抗体。此抗体具有非常好的中和活性与特异性,为人腺病毒感染的防治提供有效的候选抗体分子和有力的技术支持。还可应用于人腺病毒检测试剂盒的开发,用于人腺病毒感染的早期诊断和疫情监测。
附图说明
图1为HAdV55在A549细胞上的CPE。其中A:正常的A549细胞;B:HAdV55接种A549细胞后出现的CPE。
图2为氯化铯密度梯度纯化HAdV55病毒颗粒。
图3为人55型腺病毒免疫前后骆驼血清中抗体滴度的检测。图中横坐标为血清的稀释度,纵坐标为抗体滴度。
图4为骆驼外周血淋巴细胞的分离。其中A:离心前的骆驼外周血;B:离心后外周血淋巴细胞的位置。
图5为VHH基因片段的扩增。其中A:第一轮PCR结果;B:第二轮PCR结果。
图6为Phage-ELISA鉴定二筛选后噬菌体克隆与目的抗原的结合(部分)。其中A:第一轮筛选Phage-ELISA结果;B:第二轮筛选的Phage-ELISA结果。奇数列包被目的抗原;偶数列包被无关抗原。
图7为SDS-PAGE电泳检测纯化后的抗人55型腺病毒纳米抗体融合蛋白。
图8为抗人55型腺病毒纳米抗体融合蛋白结合活性检测。
图9为抗人55型腺病毒纳米抗体融合蛋白中和活性检测。
图10为抗人55型腺病毒纳米抗体融合蛋白人源化后结合活性检测。
图11为抗人55型腺病毒纳米抗体融合蛋白人源化后中和活性检测。
图12为抗人55型腺病毒纳米抗体融合蛋白人源化后酸碱稳定性检测。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述,给出的实施例仅为了阐明本发明,而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南,并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法,按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量实验,如无特别说明,均设置三次重复实验。
下述实施例中的载体pADSCFV-S制备方法具体参见:发明专利CN105315371B中“实施例1、高质量噬菌体呈现抗体库的构建”。该生物材料只为重复本发明的实验所用,不可作为其它用途使用。
下述实施例中的表达载体pTSE-hFc由本实验室将人免疫球蛋白的Fc结构域的基因连接在pCMV载体上改造得到。pTSE-hFc已记载于:谢青,李志颖,张卫等.抗鼠疫菌保护性抗原V抗体的筛选与鉴定[J].中国病原生物学杂志,2022,17(03):266-271。公众可从申请人处获得该生物材料,该生物材料只为重复本发明的实验所用,不可作为其它用途使用。
下述实施例中HAdV55病毒(简称55型腺病毒)已记载于:博士论文基于多组学的人55型腺病毒与宿主相互作用研究,王凯英。公众可从申请人处获得该生物材料,该生物材料只为重复本发明的实验所用,不可作为其它用途使用。
下述实施例中A549细胞购买于北京协和细胞资源中心,货号为25。
下述实施例采用SPSS11.5统计软件对数据进行处理,实验结果以平均值±标准偏差表示,采用One-way ANOVA检验,P<0.05(*)表示具有显著性差异,P<0.01(**)表示具有极显著性差异,P<0.001(***)表示具有极显著性差异。
实施例1、针对人55型腺病毒单域抗体文库的构建
一、人55型腺病毒病毒原液、浓缩液与灭活病毒的制备
1、人55型腺病毒毒液制备
人55型腺病毒培养:HAdV55病毒为人55型腺病毒(简称HAdV55)。采用常规DMEM+10%(体积百分含量)FBS(GIBCO、10099141)培养基培养A549细胞。
接种人55型腺病毒前一天,将A549细胞胰酶消化后传代于75cm2细胞瓶中,使第二天接种病毒时细胞密度达到80%-90%;接种当天,缓慢吸出培养瓶内的细胞培养基,加入5mL DMEM轻轻冲洗细胞后弃去,另加入3mL DMEM+2%(体积百分含量)FBS;用微量移液器吸取HAdV55病毒于细胞瓶中,按MOI≈0.001进行感染,均匀晃动瓶子数次使病毒分散均匀,置于37℃,5%CO2的培养箱中吸附2h,期间每隔30min左右晃动培养瓶一次;吸附完成后,弃掉病毒培养液,重新加入15mL新的DMEM+2%(体积百分含量)FBS,然后将细胞瓶放置在37℃,5%CO2的培养箱中继续培养;每日观察细胞病变情况。
结果如图1中A和B所示:接种后约96小时,细胞病变达到80%~90%,细胞病变表现为细胞皱缩、脱落等特征;收获腺病毒培养物,-80℃冻融2-3次,4,000rpm离心5min,收集上清分装后保存于-80℃,即为人55型腺病毒原液。
2、腺病毒滴度测定
实验前一天取生长状态良好的A549细胞,胰酶消化后用DMEM+10%(体积百分含量)FBS调细胞密度至1.3×105/mL,接种于96孔细胞培养板,每孔100μL,37℃、5%CO2培养;实验当天取出96孔板,弃培养基,无血清培养基洗一遍,加入DMEM+2%(体积百分含量)FBS,100μL/孔;然后用无血清培养基10倍梯度稀释待测的HAdV55病毒液,10-1-10-8共8个梯度,稀释好的病毒按照10μL/孔加入备好的96孔板中,每个稀释梯度8孔,同时设置空白对照组,操作完成细胞置于37℃、5%CO2的培养箱中培养观察,7天后计数各孔细胞死亡情况,根据下面公式计算病毒原液的TCID50。
距离比例=(高于50%病变率的百分数-50%)/(高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数)
LgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数。
经检测和计算,本实施例中所用HAdV55病毒原液的病毒滴度为3.16×108TCID50/mL。
3、腺病毒的灭活与纯化
取步骤1中获得的HAdV55病毒原液转移至500mL样品瓶,用碳酸氢钠调pH至7.6,然后按照1:2000的比例加入β-丙内酯(MACKLIN、P816096),边加边搅拌,充分混匀后,4℃继续搅拌灭活,24小时后再次调pH至7.6,按照1:2000的比例补加β-丙内酯,4℃继续搅拌灭活24小时,取不少于1‰体积的样品37℃水浴水解4小时(中间观察到样品颜色变黄时用碳酸氢钠调整pH至7.0左右),水解结束,取前一天传至25cm2细胞瓶的A549细胞,按照1mL样品接种1瓶25cm2 A549细胞的比例接种(不足1mL按1mL计算),同时设置接种未灭活病毒的细胞及未接种病毒的细胞(简称空白细胞)作为对照,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养观察,7天后盲传至新的A549细胞,继续观察,如此盲传3代,以接种未灭活病毒的细胞样品产生细胞病变,而灭活实验组细胞与空白细胞均不病变者,判定为灭活检测结果可信,灭活完全,否则为灭活不完全,需要重新灭活、检测。
经灭活检测证实灭活完全的病毒原液,4,000rpm离心10分钟去除细胞碎片,用PBS缓冲液平衡Sepharose 4Fast Flow凝胶柱并上样,随后用PBS洗脱,第一个洗脱峰即为目的病毒峰,收集该洗脱峰,然后在Amicon-Ultra-15超滤管(50kDa)中加入12.5mL重密度氯化铯溶液(42.23g氯化铯+57.77mL 10mM Tris-HCL(pH7.9-8)),再缓慢加入12.5mL轻密度氯化铯溶液(22.39g氯化铯+77.61mL 10mM Tris-HCL(pH 7.9-8)),再加入15mL病毒悬浮液,配平,放于超速离心机(Beckman L100-XP)中,25,000rpm,4℃离心2小时。
结果如图2所示:经过氯化铯密度梯度离心后,可观察到在轻密度和重密度氯化铯溶液之间有1条主要的蛋白条带。收集条带用PBS透析,得到HAdV55灭活病毒。
4、腺病毒浓缩液的制备
将步骤3获得的HAdV55灭活病毒转入截留分子量为50kD的超滤管(MILIPORE,货号UFC805008),4,000rpm离心至体积减少至初始体积的1/30,收集截留液,分装后保存于-80℃,即为HAdV55病毒浓缩液。
二、人55型腺病毒单域抗体文库的构建
1、骆驼免疫及血清中抗体滴度测定
将纯化的HAdV55病毒浓缩液与等体积弗氏完全佐剂(Sigma,F5881)混合,振荡乳化,在健康成年双峰驼皮下多点接种,免疫周期间隔为14d,除第一次用弗氏完全佐剂,其余免疫时都使用弗氏不完全佐剂(Sigma,F5506)。皮下多点注射抗原乳化液(约3.5mL/只),每只骆驼抗原用量为0.75mg。经4次免疫后,采集双峰驼血清,用免疫前的血清作为阴性对照,以人55型腺病毒为包被抗原、HRP标记的兔抗骆驼IgG抗体(Solarbio,SE268)为二抗,采用ELISA法检测骆驼血清中的抗体滴度。
结果如图3所示:与免疫前的骆驼血清样品相比,免疫后的血清对人55型腺病毒结合显示出有效且特异性的结合活性,证实骆驼血清中产生特异性抗体,抗体滴度为51200。
2、骆驼血液外周血淋巴细胞的分离
特异性抗体达到目标效价后,以不加佐剂的人55型腺病毒作为免疫原进行冲击免疫。冲击免疫一周内采集100-150mL骆驼外周血,加入到抗凝采血袋中,用于分离外周血淋巴细胞。用淋巴细胞分离液(stemcell,07851)对骆驼血液中的外周血淋巴细胞进行分离。
结果如图4中A和B所示:全血和淋巴细胞分离液的混合物离心后分为四层,最上层为血清,第二层为淋巴细胞,第三层为淋巴细胞分离液中的葡聚糖,最下层为红细胞。
3、巢式PCR扩增VHH基因片段
利用OMEGA E.Z.N.A Total RNA kit I试剂盒(OMEGA,R6834)将分离的外周血单核细胞PBMCs进行总RNA的提取,然后使用Invitrogen SuperscriptⅢFirst-strandsynthesis system for RT-PCR反转录试剂盒(Invitrogen,18080-051)将其反转录合成cDNA。
巢式PCR扩增VHH基因片段:1)第一轮PCR扩增,利用IgG特异性上游引物CALL001和下游引物CALL002扩增骆驼抗体基因的前导序列和CH2区,上下游引物分别识别抗体的前导序列和CH2序列;2)以第一轮纯化的DNA产物为模板,引物VHH-F和VHH-R进行第二轮PCR扩增获取VHH基因。
表1两轮PCR所使用的引物序列
引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
CALL001 | GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG |
CALL002 | GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC |
VHH-F | cggCCATGGcGGTCCTGGCTGCTCTTCTACA |
VHH-R | tcccGCGGCCGCTGAGGAGAYGGTGACCWGGGT |
两轮扩增的PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果见图5中A和B:第一轮PCR扩增得到了1000bp和700bp左右的两个特异性的条带,其中1000bp左右的条带是来自骆驼体内的传统抗体对应的条带,700bp左右的条带则是来自于骆驼体内的重链抗体。
利用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit胶回收试剂盒(TaKaRa,9762)将700bp左右的条带切胶回收。以第一轮纯化的DNA产物为模板,引物VHH-F和VHH-R进行二轮PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳后回收450bp的条带,该条带即为所需要的VHH基因。
4、电转连接产物
将第二轮PCR扩增得到的VHH基因经限制性内切酶NcoⅠ和NotⅠ双酶切后与pADSCFV-S载体(pADSCFV-S载体:VHH基因片段摩尔数之比为1:3)进行连接,获得重组载体pADSCFV-VHH。
将重组载体pADSCFV-VHH转化至E.coli TG1感受态(Solarbio、C1170)细胞中,电转后的菌液涂布平板进行放大培养,次日将平板上的菌落刮下,即获得初始人55型腺病毒特异性噬菌体纳米抗体库。同时取50μL电转后的菌液10倍等比稀释,将103~107五个稀释度的菌液分别取200μL涂板,次日计数菌落数,根据稀释倍数计算人55型腺病毒特异性噬菌体纳米抗体库库容量:库容量=(菌落数×稀释倍数)/涂板体积×总体积。经计算,此人55型腺病毒特异性噬菌体纳米抗体库的库容量为5.2×108cfu。
三、人55型腺病毒特异性噬菌体纳米抗体库的筛选
取上述步骤二中构建好的人55型腺病毒特异性噬菌体纳米抗体库菌液,利用辅助噬菌体M13K07(NEB、N0315S)进行呈现。然后用20%PEG/2.5M NaCl溶液(1L溶液里含有200gPEG6000,146.25g NaCl)沉淀噬菌体得到人55型腺病毒特异性噬菌体纳米抗体库。
以纯化的人55型腺病毒为抗原,利用固相筛选策略(实验方案参考噬菌体展示:通用实验指南/(美)克拉克森(Clackson,T),(美)洛曼(Lowman,H.B.)编;马岚等译。化学工业出版社,2008.5)筛选上述人55型腺病毒噬菌体纳米抗体库。具体步骤如下:
向每个免疫孔中加入1mL用0.1M NaHCO3包被液稀释好的抗原,4℃包被过夜,每轮淘选的包被浓度分别为20、10μg/mL;次日用PBS洗涤免疫管2遍,3min/次,之后用2%牛血清白蛋白37℃封闭2h;封闭结束后,用PBST(1×PBS+0.1%Tween-20)洗涤3次,再用PBS洗涤3次;用封闭液将人55型腺病毒特异性噬菌体纳米抗体库滴度调整到适当浓度,加入免疫管,室温下放置2h,再以200rpm低速摇动,结合20min;用PBST洗涤10次,再用PBS洗涤5次,洗涤完成后,各孔加入1mL洗脱液(甘氨酸-盐酸,pH 2.2),400rpm,室温震荡洗脱20min,将目的抗原孔中的洗脱液取出,加入50-60uL中和液(1M Tris-HCl,pH 8.0)进行中和,混匀,于冰箱4℃放置;感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1细胞,37℃培养1h,产生并纯化次级人55型腺病毒特异性噬菌体纳米抗体库用于下一轮的筛选,相同筛选过程重复2轮,其富集结果如表2所示:
表2人55型腺病毒噬菌体纳米抗体库筛选富集程度分析
筛选次数 | 投入量 | 产出量 | 产出/投入 | 富集倍数 |
1 | 5×1011 | 7.8×107 | 1.56×10-4 | --- |
2 | 1×1011 | 2.67×108 | 2.67×10-3 | 17.12 |
从上述2轮筛选后含有噬菌体的培养皿中分隔良好的单个菌落,接种至含有2YT-GA培养基(1升2YT培养基中含有16g胰蛋白胨,10g酵母提取物,5g氯化钠,100μg/mL氨苄青霉素,20%葡萄糖)的96孔板(600μL/孔)中,留2个阴性对照孔(不接克隆或接种其它抗原的克隆),37℃培养5-6小时;按MOI≈50的比例加入M13KO7辅助噬菌体,按100μL/孔加入培养单个噬菌体克隆的深孔板中,室温静置感染30min,再用低速150rpm,37℃培养1小时;将深孔板于室温离心(2000rpm,10min)后弃上清,用加终浓度1mM的阿拉伯糖进行诱导表达,得到展示抗体可变区的噬菌体颗粒。
四、用噬菌体的酶联免疫方法(Phage-ELISA)鉴定特异性单个阳性克隆
用Phage-ELISA测定与纯化的人55型腺病毒灭活病毒特异性结合的噬菌体颗粒。抗原为灭活的人55型腺病毒,同时每一列抗原组的邻列用于平行包被无关抗原做为阴性对照,4℃包被过夜;取包被过夜的ELISA板,弃包被液,用PBST洗涤6次,加封闭液(100mL的PBS中加入2g脱脂奶粉)进行封闭,200μL/孔,置37℃封闭2h;弃ELISA板中封闭液,然后按100μL/孔将诱导表达好的噬菌体上清加入相应包被有目的抗原和对照抗原的孔中,37℃孵育1.5小时;用PBST震荡洗涤6次,新鲜配置0.2μg/ml HRP标记的M13鼠单克隆抗体(SinoBioligical,1973-MM05T-H),按照100μL/孔加入ELISA板中,37℃孵育45min;用PBST震荡洗涤6次,配置显色液(每个ELISA板约10mL,即9mL显色液加1mL的10×OPD,10μL的30%的双氧水),按照100μL/孔加入ELISA板中,避光显色15-20分钟;加入2M的硫酸终止液(50μL/孔),双波长492/630nm下读值;对于抗原组:阴性对照组的ELISA信号值>3倍的克隆孔,判为阳性克隆孔。
部分Phage-ELISA实验结果见图6,图6中A为第一轮筛选Phage-ELISA结果,图6中B为第二轮筛选的Phage-ELISA结果。奇数列包被目的抗原;偶数列包被无关抗原。将Phage-ELISA阳性克隆送生物技术服务公司进行序列测定,得到插入片段的DNA序列,最终获得可特异性结合人55型腺病毒的骆驼源纳米抗体3A2。纳米抗体3A2的部分序列信息见表3。
纳米抗体3A2的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示:包括抗体基因互补决定区(CDR)和框架区(FR);所述互补决定区分为三部分,依次可定义为CDR1、CDR2、CDR3,依次记为SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3;其中框架区分为四部分,依次定义FR1、FR2、FR3、FR4,依次记为SEQ ID No.12、SEQ ID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15;编码上述抗人55型腺病毒纳米抗体3A2的基因,其核苷酸序列如SEQ ID No.6所示。其中纳米抗体3A2的CDR1的编码基因是SEQ ID No.6的第76-99位核苷酸,所述CDR2的编码基因如SEQ ID No.6的第151-174位核苷酸,所述CDR3的编码基因如SEQ ID No.6的第289-324位核苷酸。
表3纳米抗体3A2序列信息
区域 | 氨基酸序列 | 序列表中位置 |
CDR1 | GATTRTRC | SEQ ID No.1 |
CDR2 | INLPYGSK | SEQ ID No.2 |
CDR3 | ALSQPCTGQYNY | SEQ ID No.3 |
实施例2、抗人55型腺病毒纳米抗体的制备
1、抗人55型腺病毒纳米抗体融合蛋白真核表达质粒的构建
根据人55型腺病毒纳米抗体基因序列(SEQ ID No.5),将其C末端与人的免疫球蛋白G的Fc段(hFc)进行融合,得到3A2-hFc融合蛋白的编码基因,其融合蛋白的编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.10,可表达氨基酸序列为SEQ ID No.8的抗人55型腺病毒纳米抗体融合蛋白3A2-hFc。
利用常规的分子生物学技术将获得的3A2的编码基因序列克隆至真核表达载体pTSE-hFc上,插入至Sal I和Nhe I两个酶切位点之间,挑取克隆进行测序验证。采用引物3A2-F:5’-cgggtcgaccggtCAGGTGCAATTAGTAGAGTCTGG-3’和3A2-R:5’-GTCGCTAGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTCC-3’扩增3A2基因,将扩增得到的3A2基因插入pTSE-hFc载体后成功构建重组真核表达载体,将其命名为pTSE-hFc-3A2-VHH。
重组载体pTSE-hFc-3A2-VHH的结构描述如下:将核苷酸序列为SEQ ID No.6的DNA分子替换载体pTSE-hFc限制性内切酶Sal I和Nhe I两个酶切位点之间的片段,保持载体pTSE-hFc其他序列不变得到的重组真核表达载体。
2、抗人55型腺病毒纳米抗体融合蛋白的表达纯化
将步骤1中构建的重组真核表达质粒pTSE-hFc-3A2-VHH,利用转染试剂FectoPRODNA Transfection Reagent(Polyplus,116-001)转染FreeStyleTM HEK293-F细胞(Invitrogen,R79007)。转染后48小时开始监测细胞活度,在细胞活度降到80-85%时8,000rpm离心10min收集培养上清液进行纯化,将上清用0.45μm滤膜过滤以去除杂质,加入10×PBS调节离子浓度与结合缓冲液相近;用AKTA纯化系统(GE,AKTA EXPLORER)进行抗体纯化,在AKTA纯化仪器中安装HiTrap MabSelect Xtra纯化柱,设定相应系统参数,用结合缓冲液平衡纯化柱并上样,随后继续平衡,然后用柠檬酸溶液(pH3.0)冲洗预装柱以洗脱抗体蛋白,UV280达到100时开始收集,UV280降至100时结束收集,并将缓冲液置换为柠檬酸盐溶液(pH6.0),得到纳米抗体融合蛋白融合蛋白3A2-hFc。
用NanoDrop紫外分光光度计(ThermoScientific)测定纳米抗体融合蛋白3A2-hFc浓度,经检测蛋白浓度为2.66mg/mL-3.8mg/mL。聚丙烯酰胺凝胶电泳检测纯化的抗体溶液,结果如图7所示:抗体分子量大小与预期一致,纯化后的纳米抗体融合蛋白3A2-hFc在还原条件下的条带大小约为40kDa,非还原条件下的条带大小约为80kDa。
实施例3、纳米抗体融合蛋白3A2-hFc与人55型腺病毒结合活性分析
通过ELISA试验对获得的纳米抗体融合蛋白3A2-hFc的结合活性进行测定,实验方法具体如下:
用碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)稀释的HAdV55灭活病毒(2μg/mL),按每孔100μL加入到酶标板中,4℃包被过夜;次日PBST洗板6次,加入含有2%BSA的封闭液,37℃孵育2小时;弃去封闭液,按照100μL/孔加入2倍等比稀释纳米抗体融合蛋白3A2-hFc稀释液(起始浓度10μg/mL,用PBS进行稀释),一共设置24个梯度,每个梯度设2孔,37℃孵育90min;然后PBST洗板6次,每孔加入100μL的1:4000倍稀释HRP标记的抗人IgG抗体,37℃孵育45min;PBST洗板6次,每孔加入50μL OPD底物显色液,室温下孵育10min;每孔加入50μL 1M硫酸溶液终止酶联反应,酶标仪492nm/630nm双波长测定光密度值。
结果如图8所示:3A2-hFc与人55型腺病毒的结合半数有效浓度(EC50)为0.0141nM。
实施例4、纳米抗体融合蛋白3A2-hFc抗人55型腺病毒感染的药效
以人55型腺病毒作为纳米抗体融合蛋白中和的病毒目标,检测纳米抗体融合蛋白3A2-hFc能否抑制人55型腺病毒对A549细胞的感染。实验方法如下:
实验前一天取生长状态良好的A549的细胞,胰酶消化,细胞密度调整至3×105/mL,接种于96孔细胞培养板(100μL/孔),放置在37℃、5%CO2培养箱培养24h;实验当天取出96孔板,弃培养基,无血清培养基洗一遍,加入DMEM+2%(体积百分含量)FBS,每孔100μL;然后分组进行如下操作:
阳性抗体对照组:将抗人55型腺病毒小鼠血清(实施例1制备)用无血清培养基稀释,进行2倍的倍比稀释,共20个稀释度(具体浓度为:1250、625、312.5、156.25、78.13、39.06、19.53、9.77、4.88、2.44、1.22、0.61、0.30、0.15、0.08、0.04、0.0191、0.0095、0.0048、0.0024nM),将待测抗体溶液与与实施例1步骤一中制备的HAdV55病毒原液(用无血清培养基稀释至病毒浓度为2×103TCID50/mL)按照体积比1∶1混合,37℃孵育1.5h后加至孔内,100μL/孔,继续置于37℃,5%CO2的培养箱中孵育1h。
实验组(纳米抗体融合蛋白):将实施例2制备的纳米抗体融合蛋白用无血清培养基稀释,得到含有不同浓度(起始浓度为1250nM,按照2倍等比稀释,一共设置20个稀释度,具体浓度为:1250、625、312.5、156.25、78.13、39.06、19.53、9.77、4.88、2.44、1.22、0.61、0.30、0.15、0.08、0.04、0.0191、0.0095、0.0048、0.0024nM)纳米抗体融合蛋白的待测抗体溶液,每个梯度设2孔;将待测抗体溶液与实施例1步骤一中制备的HAdV55病毒原液(用无血清培养基稀释至病毒浓度为2×103TCID50/mL)按照体积比1∶1混合,37℃孵育1.5h后加至孔内,100μL/孔,继续置于37℃,5%CO2的培养箱中孵育1h。
病毒组(VIRUS):将无血清培养基与实施例1步骤一中制备的HAdV55病毒原液(用无血清培养基稀释至病毒浓度为2×103TCID50/mL)按照体积比1∶1混合,37℃孵育1.5h后加至孔内,100μL/孔,继续置于37℃,5%CO2的培养箱中孵育1h。
无关抗体对照组:将抗人表皮生长因子受体抗体(Anti-EGFR)(记载于发明专利CN102993305B)用无血清培养基稀释,得到含有不同浓度(起始浓度为1250nM,按照2倍等比稀释,一共设置20个稀释度,具体浓度为:1250、625、312.5、156.25、78.13、39.06、19.53、9.77、4.88、2.44、1.22、0.61、0.30、0.15、0.08、0.04、0.0191、0.0095、0.0048、0.0024nM)Anti-EGFR抗体的待测抗体溶液;将待测抗体溶液与实施例1步骤一中制备的HAdV55病毒原液(用无血清培养基稀释至病毒浓度为2×103CID50/mL)按照体积比1∶1混合,37℃孵育1.5h后加至孔内,100μL/孔,继续置于37℃,5%CO2的培养箱中孵育1h。
空细胞对照组(CELL):无血清培养基,37℃孵育1.5h后加至孔内,100μL/孔,继续置于37℃,5%CO2的培养箱中孵育1h。
取出96孔板,弃上清,加入DMEM+2%(体积百分含量)FBS培养基(100μL/孔),37℃,5%CO2继续培养1周,直至细胞出现明显病变;37℃培养箱里孵育(至少1小时)后换为2%FBS-DMEM放回孵箱继续培养,每日观察细胞变化。在出现典型CPE后用无菌PBS洗涤前述96孔细胞培养板两次后,按100μL/孔加入DMEM培养基(含10%FBS,10%CCK8试剂),37℃细胞孵箱培养1-2h,酶标仪测定450nm波长吸光值,计算各组抗体对于细胞病变的抑制率(%)=(抗体与病毒混合孵育实验组的450nm波长吸光值-病毒组的450nm波长吸光值)/(空细胞对照组的450nm波长吸光值-病毒组的450nm波长吸光值)×100%。利用检测到的OD450 nm数据计算抑制率,然后再以浓度取10的对数为横坐标,以抑制率对应的几率值作为纵坐标,以抑制率为50%时对应的几率值求出IC50值。
结果如图9所示,3A2-hFc对人55型腺病毒的半数最大抑制浓度(IC50)为3.984nM。
实施例5、抗人55型腺病毒纳米抗体融合蛋白3A2-hFc的人源化改造及活性评价
1、抗人55型腺病毒纳米抗体融合蛋白3A2-hFc的人源化改造
利用纳米抗体人源化通用模板框架NbBcII10FGLA对纳米抗体3A2-hFc融合蛋白进行人源化改造。NbBcII 10FGLA氨基酸序列如SEQ ID No.20所示:包括框架区(FR)和抗体基因互补决定区(CDR),其中框架区分为4部分,依次定义FR1、FR2、FR3和FR4,依次记为SEQ IDNo.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.18和SEQ ID No.19;互补决定区分为3部分,依次可定义为CDR1、CDR2和CDR3,依次记为SEQ ID No.20中的第26-37位,SEQ ID No.20中的第54-63位,SEQ ID No.20中的第100-117位。
3A2-hFc的人源化改造方法如下:使用CDR区移植法(ComplementarityDetermining Region Grafting)将目的抗体3A2的CDR区替换模版抗体相对应的CDR区CDR1、CDR2和CDR3,同时将3A2的FR2区替换模版抗体相对应的FR2区,保留模版抗体相对应的FR1、FR3和FR4区,从而完成抗人55型腺病毒纳米抗体3A2进行人源化改造,得到人源化纳米抗体h3A2,其氨基酸序列为SEQ ID No.5,编码人源化纳米抗体h3A2蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示。
2、抗人55型腺病毒人源化纳米抗体真核表达载体pTSE-hFc-h3A2-VHH的构建
根据抗人55型腺病毒人源化纳米抗体基因序列(SEQ ID No.7),将其C末端与人免疫球蛋白G的Fc段(hFc)进行连接,得到h3A2-hFc融合蛋白的编码基因,其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID No.11,表达氨基酸序列为SEQ ID No.9的抗人55型腺病毒纳米抗体融合蛋白h3A2-hFc。委托华大基因优化并合成人源化抗体的可变区基因。采用常规的分子生物学方法,将合成的人源化化纳米抗体可变区基因克隆至pTSE-hFc载体上,构建重组真核表达质粒pTSE-hFc-h3A2-VHH。
重组载体pTSE-hFc-h3A2-VHH的结构描述如下:将核苷酸序列为SEQ ID No.7的DNA分子替换载体pTSE-hFc限制性内切酶Sal I和Nhe I两个酶切位点之间的片段,保持载体pTSE-hFc其他序列不变得到的重组载体pTSE-hFc-h3A2-VHH。
3、人源化纳米抗体融合蛋白与人55型腺病毒结合活性分析
参照实施例2的步骤2的方法制备得到人源化纳米抗体融合蛋白h3A2-hFc,参照实施例3对人源化纳米抗体融合蛋白h3A2-hFc与人55型腺病毒的结合活性进行检测。
结果如图10所示:h3A2-hFc与人55型腺病毒的结合半数有效浓度(EC50)为0.0034nM。
4、人源化纳米抗体融合蛋白抗人55型腺病毒感染的药效
参照实施例4的方法进行检测人源化纳米抗体融合蛋白h3A2-hFc对人55型腺病毒的半数最大抑制浓度(IC50)。
结果如图11所示:本发明制备的h3A2-hFc可以有效抑制人55型腺病毒的感染,其IC50为0.62nM。
5、人源化纳米抗体融合蛋白酸碱稳定性检测
抗体稳定性是抗体成药性的重要评价指标,通过加速放置实验对人源化纳米抗体融合蛋白h3A2-hFc的酸碱稳定性进行了初步评价。将抗体稀释至200nM,放入调节至不同pH值(5.5、7.4和8.0)的PBS缓冲液中,然后在37℃下培养7、14、21和28天。原始样品(pH值为7.4)作为对照保存在4℃下。用酶联免疫吸附试验(ELISA)分析经处理的h3A2-hFc样品与HAdV55的结合活性。
结果如图12所示,在酸性(pH5.5)和碱性(pH8.0)条件下将抗体在37℃放置4周后它们对HAdV55的结合活性仍未见明显下降,说明人源化纳米抗体融合蛋白h3A2-hFc酸碱稳定良好,有利于后期研发。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说,在不脱离本发明的宗旨和范围,以及无需进行不必要的实验情况下,可在等同参数、浓度和条件下,在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例,应该理解为,可以对本发明作进一步的改进。总之,按本发明的原理,本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进,包括脱离了本申请中已公开范围,而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.靶向人腺病毒的纳米抗体或含有所述纳米抗体的抗原结合片段,其特征在于,所述纳米抗体具有3个互补决定簇CDR1、CDR2和CDR3;所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示,所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示,所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.根据权利要求1所述的纳米抗体或抗原结合片段,其特征在于,所述纳米抗体为下述A1)或A2):
A1)氨基酸序列如SEQ ID No.4所示的纳米抗体;
A2)氨基酸序列如SEQ ID No.5所示的纳米抗体;
A3)在SEQ ID No.4或SEQ ID No.5所示氨基酸序列的N端和/或C端连接上蛋白标签后得到的纳米抗体。
3.与权利要求1或2所述纳米抗体相关的生物材料,所述生物材料为下述任一种:
B1)编码权利要求1或2所述纳米抗体或抗原结合片段的核酸分子;
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒;
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体;
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体;
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物;
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物;
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物;
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。
4.根据权利要求3所述的生物材料,其特征在于,B1)所述核酸分子为编码权利要求1或2所述纳米抗体的核酸分子,所述核酸分子中,所述CDR1的编码基因是SEQ ID No.6的第76-99位核苷酸,所述CDR2的编码基因如SEQ ID No.6的第151-174位核苷酸,所述CDR3的编码基因如SEQ ID No.6的第289-324位核苷酸。
5.权利要求1或2所述纳米抗体的制备方法,包括以下步骤:将编码权利要求1或2所述纳米抗体的核酸分子导入受体细胞得到表达所述纳米抗体的转基因细胞,培养所述转基因细胞,得到所述纳米抗体。
6.根据权利要求3或4所述的生物材料或权利要求5所述的制备方法,其特征在于,B1)所述核酸分子为如下任一:
C1)核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的DNA分子;
C2)核苷酸序列如SEQ ID No.7所示的DNA分子;
C3)在严格条件下与C1)或C2)限定的DNA分子杂交且编码所述纳米抗体的DNA分子;
C4)与C1)-C3)中任一限定的DNA序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同源性且编码所述纳米抗体的DNA分子。
7.纳米抗体融合蛋白,其特征在于,所述纳米抗体融合蛋白为将权利要求1或2所述的纳米抗体或抗原结合片段与另一分子融合,所述另一分子包括免疫球蛋白的Fc结构域、荧光蛋白或具有不同特异性的VHH。
8.根据权利要求7所述的纳米抗体融合蛋白,其特征在于,所述融合蛋白为下述任一种:
M1)氨基酸序列如SEQ ID No.8所示的融合蛋白;
M2)氨基酸序列如SEQ ID No.9所示的融合蛋白;
M3)在SEQ ID No.8或SEQ ID No.9所示氨基酸序列的N端和/或C端连接上蛋白标签后得到的蛋白。
9.一种靶向人腺病毒的ELISA检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含权利要求1或2所述的纳米抗体、权利要求3-5中任一所述生物材料或权利要求7或8所述的融合蛋白。
10.下述任一种应用:
E1)权利要求1或2所述纳米抗体或抗原结合片段在制备用于检测人腺病毒的产品中的应用;
E2)权利要求3或4任一所述生物材料在制备用于检测人腺病毒的产品中的应用;
E3)权利要求5或6所述制备方法在制备用于检测人腺病毒的产品中的应用;
E4)权利要求9所述试剂盒在制备用于检测人腺病毒的产品中的应用;
E5)权利要求1或2所述纳米抗体在制备与人腺病毒结合的产品中的应用;
E6)权利要求3或4任一所述生物材料在制备与人腺病毒结合的产品中的应用;
E7)权利要求5或6所述制备方法在制备与人腺病毒结合的产品中的应用;
E8)权利要求9所述试剂盒在制备与人腺病毒结合的产品中的应用;
E9)权利要求1或2所述纳米抗体或抗原结合片段在制备人腺病毒检测试剂中的应用;
E10)权利要求1或2所述纳米抗体或抗原结合片段在制备人腺病毒诊断试剂中的应用;
E11)权利要求1或2所述纳米抗体或抗原结合片段在制备预防和/或治疗人腺病毒药物中的应用。
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