CN103923998A - 一种应用于核酸扩增实时电化学pH检测的反应体系和检测方法 - Google Patents

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张芳
俞永华
吴坚
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    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Abstract

本发明提供了一种应用于核酸扩增实时电化学pH检测的反应体系及检测方法。所述反应体系为恒温扩增反应体系，含有引物、反应液、DNA聚合酶、和待检DNA；所述反应体系中的反应液含有TritonX-100、dNTP、甜菜碱、Mg2+、K+与NH4 +，反应体系的反应液中有额外添加的OH-。本发明具有以下特点，本发明是利用对pH敏感的电化学传感器对核酸扩增进行实时检测：对于阴性样本，扩增反应过程中由于不产生质子因此反应前后pH无变化，而对于阳性样本，随扩增反应进行，氢离子作为副产物不断产生，因此反应前后pH发生变化；该反应液能够替代普通核酸扩增的反应缓冲液，不仅能保证核酸扩增正常进行，且对扩增过程中氢离子的产生足够敏感，产生明显的pH变化。

Description

一种应用于核酸扩增实时电化学pH检测的反应体系和检测方法
技术领域
本发明属电化学分析、核酸分析领域，涉及应用于核酸扩增实时电化学pH检测的反应体系。
背景技术
核酸扩增技术被广泛应用在农业、医学及食品工业领域，特别是医疗诊断及食品安全检测方面。由于传统DNA扩增需要有单链模板的产生、引物与模板的结合以及引物的延伸等循环，需要有变性（95℃）、退火（55~60℃）、延伸（72℃）等步骤；而且DNA扩增的实时检测常常依赖于荧光染料，因此对仪器的温度控制精度有较高要求并且需要较庞大的光学检测设备，从而限制了实时核酸扩增技术的成本和应用范围。恒温扩增技术是近年发展起来的一类新型扩增技术，由于能够在恒定温度条件下实现核酸扩增，因此不需要使用昂贵的、精密控制温度的 PCR仪器、消耗大量电力，从而得到广泛关注。其中发展较快的有交叉引物恒温扩增技术（CPA）、环介导恒温扩增技术（LAMP）等等。尽管恒温扩增技术摆脱了精密的温控设备，但仍然需要复杂、庞大的光学设备对其扩增产物进行实时检测。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种应用于核酸扩增实时电化学pH检测的反应体系。为此，本发明采用以下技术方案：
一种应用于核酸扩增实时电化学pH检测的反应体系，其为恒温扩增反应体系，含有引物、反应液、DNA聚合酶、和待检DNA；所述反应体系中的反应液含有Triton X-100、dNTP、甜菜碱、Mg2+、K+与NH4 +，其特征在于所述反应体系的反应液中有额外添加的OH-。
在采用上述技术方案的基础上，本发明还可采用以下进一步的技术方案：
所述反应体系的反应液中K+的工作浓度在50mM。
所述反应体系的反应液中K+主要由KCl或K2SO4提供，KCl的工作浓度在22-48mM，K2SO4的工作浓度在11-24mM。
所述反应体系的反应液中OH-由KOH提供，所述反应液中KOH的工作浓度在2-8mM。
所述的反应液中NH4 +的工作浓度在10-60mM。
所述的反应液中NH4 + 由(NH4)2SO4或NH4Cl提供。
所述DNA聚合酶为具有链置换功能的DNA聚合酶，例如Bst DNA聚合酶，GspF DNA聚合酶。
本发明的第二个目的是提供一种基于核酸扩增中pH变化的电化学传感器实时监测恒温扩增的方法。为此，本发明采用以下技术方案：
一种基于核酸扩增中pH变化的电化学传感器实时监测恒温扩增的方法，其特征在于它包括以下步骤：
（1）、提取待检样品核酸；
（2）、在反应管中配置权利要求1所述的反应体系；
（3）、扩增反应：将配置好反应体系的反应管混匀后，油封，并插入电极，于60-65℃水浴或金属浴反应50min；
（4）、通过电极连接的数据窗口实时读取pH数据。
所述待检样品可以为DNA，也可以为RNA，如果待检样品为RNA，则需通过逆转录为DNA后进行检测。
所述油封是指在反应液表面滴加20-50ul油，所用油可以是矿物油或者石蜡油。
所述电极是对pH敏感的电极，例如8220 BNWP Thermo ROSS Ultra 复合电极，也可以是其他对pH敏感的电化学传感器。
本发明所提供的检测方法可用于交叉引物恒温扩增（CPA）的产物检测，其引物包含有：正向外围引物、反向外围引物、正向交叉引物、反向交叉引物、正向检测引物和反向检测引物。本发明所提供的检测方法同样适用于其他核酸恒温扩增产物检测。
电化学传感器具有检测灵敏度高、选择性好、响应快速等特点，目前已被广泛用于医药、临床、工业和食品化学等领域的分析与检测。pH计作为一种应用最为广泛的电化学传感器，因其价格低、易于微型化和集成化等特点，具有巨大的发展潜力。
在核酸扩增过程中，新的碱基替代磷酸骨架3’端羟基上的氢，并形成新的磷酸二酯键，从而实现链的延伸。因此，核酸扩增的过程实际上也是氢离子释放的过程。本发明提出一种优化的核酸等温扩增反应体系，并将之应用于基于核酸扩增中pH变化的电化学传感器实时监测。本发明的优势在于，对正常的核酸扩增体系而言，由于其稳定的缓冲环境，扩增过程中产生的氢离子难以对整个反应体系的pH变化做出贡献，因此无法通过检测核酸扩增过程中pH的变化实现对氢离子释放过程的实时检测，也就是说无法达到检测核酸扩增的目的。本发明所提供的反应体系不仅能够保证核酸扩增反应正常进行，而且能够使反应体系对扩增过程中氢离子的产生足够敏感，有明显的pH变化的响应。
本发明与现有技术相比，具有以下特点，首先，本发明是利用对pH敏感的电化学传感器对核酸扩增进行实时检测：对于阴性样本，扩增反应过程中由于不产生质子因此反应前后pH无变化，而对于阳性样本，随扩增反应进行，氢离子作为副产物不断产生，因此反应前后pH发生变化；其次，该反应液能够替代普通核酸扩增的反应缓冲液，不仅能保证核酸扩增正常进行，而且对扩增过程中氢离子的产生足够敏感，产生明显的pH变化。 
附图说明
图1是核酸交叉引物恒温扩增过程中pH值的变化。
图2 是使用不同反应液核酸交叉引物恒温扩增过程中pH值变化。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明作详细的介绍，但并不局限于此。
实例1：本发明用于检测转基因终止子T-Nos基因。
提取DNA: 称量0.5g转基因大米粉末（过200目筛），用CTAB法提取其基因组DNA，最终溶解于50ul 去离子水中，-20℃贮存备用。
配置相应的反应液（10×，浓度为10倍于实际工作浓度）: 1% Triton X-100, 30mM MgCl2， 4mM dNTP，0.075 M (NH4)2SO4，10 M Betaine, 30 mM KOH, 0.47 M KCl。
配置CPA恒温扩增液：对于50ul CPA反应体系，需添加上述10×反应液5ul、6U/ul 的GspF DNA聚合酶1ul、DNA模板1ul及引物，并最终用去离子水补足至50ul，添加50ul矿物油液封。引物来自杭州优思达生物技术公司转基因NOS序列恒温扩增试剂盒（货号：I016-01；引物设计方法参照优思达公司公开的专利CN101638685B、CN102363815B、CN102363816B）。
CPA恒温扩增与检测：将8220 BNWP Thermo ROSS Ultra 复合电极插入上述CPA反应液中，置于水浴锅63度加热，每分钟读数一次并记录，pH变化如图1所示。 阴性样本(不含模板)在整个CPA扩增过程中pH值不产生变化,而阳性样本(含有扩增模板,约1000拷贝转基因大米基因组DNA)的pH值在扩增过程中产生类似S型曲线的变化。具体来讲，阳性样品在反应初期变化缓慢，当反应的进行达到指数扩增期，产物迅速积累并同时释放出大量氢离子，呈现出急剧下降的趋势，随着反应进行， 扩增速率减慢，pH值的变化也趋于平缓。 因此，根据反应过程中pH值是否有S型曲线的变化即可判断该反应是否得到扩增。
实例2：一种应用于检测反应液pH变化的CPA扩增实时检测技术的弱缓冲体系，所述的反应液（1×，实际工作浓度）包含: 0.1% Triton X-100, 3 mM MgCl2，0.4mM dNTP，7.5mM (NH4)2SO4，1M Betaine, 6.5mM KOH, 43.5mM KCl，其他同实例1。
实例3：一种应用于检测反应液pH变化的CPA扩增实时检测技术的弱缓冲体系，所述的反应液（1×）包含: 0.1% Triton X-100, 3mM MgCl2，0.4mM dNTP，10mM (NH4)2SO4，1M Betaine, 8mM KOH, 42mM KCl，其他同实例1。
实例4：一种应用于检测反应液pH变化的CPA扩增实时检测技术的弱缓冲体系，所述的反应液（1×）包含: 0.1% Triton X-100, 3 mM MgCl2，0.4mM dNTP，10mM (NH4)2SO4，1M Betaine, 8mM KOH, 22mM KCl，其他同实例1。
实例5：一种应用于检测反应液pH变化的CPA扩增实时检测技术的弱缓冲体系，所述的反应液（1×）包含: 0.1% Triton X-100, 3 mM MgCl2，0.4mM dNTP，15mM NH4Cl，1M Betaine, 6.5mM KOH, 43.5mM KCl，其他同实例1。
实例6：一种应用于检测反应液pH变化的CPA扩增实时检测技术的弱缓冲体系，所述的反应液（1×）包含: 0.1% Triton X-100, 3 mM MgCl2，0.4mM dNTP，5mM (NH4)2SO4，1M Betaine, 5mM KOH, 22.5mM K2SO4，其他同实例1。
实例7：一种应用于检测反应液pH变化的CPA扩增实时检测技术的弱缓冲体系，所述的反应液（1×）包含: 0.1% Triton X-100, 3 mM MgCl2，0.4mM dNTP，30mM (NH4)2SO4，1M Betaine, 6.5mM KOH, 23.5mM KCl，其他同实例1。
实例8：一种应用于检测反应液pH变化的CPA扩增实时检测技术的弱缓冲体系，所述的反应液（1×）包含: 0.1% Triton X-100, 3 mM MgCl2，0.4mM dNTP，7.5mM (NH4)2SO4，1M Betaine, 2mM KOH, 48mM KCl，其他同实例1。
实例9：本发明用于检测金黄色葡萄球菌检测。
提取DNA：1ml菌液12000g离心15min，并将沉淀复溶于去离子水，然后用SDS法裂解细菌、酚氯仿法提纯，最终溶解于50ul去离子水中，-20℃贮存备用。
引物来自杭州优思达生物技术公司金黄色葡萄球菌恒温扩增核酸试剂盒（货号：I011-01），其他同实例1。
实例10：本发明用于沙门氏菌检测。
引物来自杭州优思达生物技术公司沙门氏菌恒温扩增核酸试剂盒（货号：I047-01），其他同实例9。
实例11：本发明用于志贺氏菌检测。
引物来自杭州优思达生物技术公司志贺氏菌恒温扩增核酸试剂盒（货号：I048-01），其他同实例9。

Claims (9)

1.一种应用于核酸扩增实时电化学pH检测的反应体系，其为恒温扩增反应体系，含有引物、反应液、DNA聚合酶、和待检DNA；所述反应体系中的反应液含有Triton X-100、dNTP、甜菜碱、Mg2+、K+与NH4 +，其特征在于所述反应体系的反应液中有额外添加的OH-。
2.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于所述反应体系的反应液中K+的工作浓度在50mM。
3.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于所述反应体系的反应液中K+主要由KCl或K2SO4提供，KCl的工作浓度在22-48mM，K2SO4的工作浓度在11-24mM。
4.如权利要求1或3所述的反应体系，其特征在于所述反应体系的反应液中OH-由KOH提供，所述反应液中KOH的工作浓度在2-8mM。
5.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于所述的反应液中NH4 +的工作浓度在10-60mM。
6.如权利要求1所述的反应体系，其特征在于所述的反应液中NH4 + 由(NH4)2SO4或NH4Cl提供。
7.一种基于核酸扩增中pH变化的电化学传感器实时检测恒温扩增的方法，其特征在于它包括以下步骤：
（1）、提取待检样品核酸；
（2）、在反应管中配置权利要求1所述的反应体系；
（3）、扩增反应：将配置好反应体系的反应管混匀后，油封，并插入电极，于60-65℃水浴或金属浴反应50min；
（4）、通过电极连接的数据窗口实时读取pH数据。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述油封是指在反应液表面滴加20-50ul油，所用油可以是矿物油或者石蜡油。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于所述电极是对pH敏感的电极。
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