CN104450976B - 检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增反应引物 - Google Patents

检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增反应引物 Download PDF

Info

Publication number
CN104450976B
CN104450976B CN201510002842.5A CN201510002842A CN104450976B CN 104450976 B CN104450976 B CN 104450976B CN 201510002842 A CN201510002842 A CN 201510002842A CN 104450976 B CN104450976 B CN 104450976B
Authority
CN
China
Prior art keywords
primer
type
pig parvoviral
detection
loop
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CN201510002842.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104450976A (zh
Inventor
李家玉
张奇
杨晓燕
张榕容
胡晓努
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujian Agriculture and Forestry University
Original Assignee
Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fujian Agriculture and Forestry University filed Critical Fujian Agriculture and Forestry University
Priority to CN201510002842.5A priority Critical patent/CN104450976B/zh
Publication of CN104450976A publication Critical patent/CN104450976A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104450976B publication Critical patent/CN104450976B/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
    • C12Q1/701—Specific hybridization probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于病毒分子生物学检测领域，本发明公开了一种检测猪细小病毒5型（Porcine parvovirus 5，PPV5）的环介导等温扩增反应引物。该方法根据猪细小病毒2型非结构蛋白NS1基因前段保守序列设计引物两对引物：外引物F3和B3；内引物FIP和BIP。具体序列见SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4。根据所设计的引物建立一种检测猪细小病毒5型（PPV5）环介导等温扩增方法。该检测方法不与猪常见传染病病原发生交叉反应。本发明的检测方法现地实用性强，不需要昂贵仪器设备；准确性高，特异性强，灵敏度高。

Description

检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增反应引物
技术领域
本发明涉及一种用于检测猪细小病毒5型(PPV5)的环介导等温扩增反应引物，属于病毒分子生物学检测领域。
背景技术
随着病毒宏基因组学的研究的不断深入，新发病毒的发现的报道越来越多。近年来，猪群中DNA病毒的报道越来越多，除去经典的猪细小病毒（porcine parvovirus，PPV）和猪圆环病毒（porcine circovirus type ⅠandⅡ，PCV1和PCV2），还见有猪细小病毒2型（porcine parvovirus type 2，PPV2）、猪细小病毒3型（porcine parvovirus type 3，PPV3）、猪细小病毒4型（porcine parvovirus type 4，PPV4）以及多种亚型的猪博卡病毒（porcine bocavirus，PBoV）。【参考文献：Xiao CT, Giménez-Lirola LG, Jiang YH,Halbur PG, Opriessnig T. Characterization of a novel porcine parvovirustentatively designated PPV5. PLoS One, 2013, 8(6): e65312.】
猪细小病毒5型（porcine parvovirus type 5，PPV5）最早在美国报道。【参考文献：Xiao CT, Halbur PG, Opriessnig T. Complete genome sequence of a novelporcine parvovirus (PPV) provisionally designated PPV5. 2013, Genome Announc,1: e00021–00012.】。目前，关于PPV5的致病性的研究较小，致病机理还未见明确。所以，建立一种简单实用的检测方法对猪细小病毒5型的防控有着重要意义。
目前，在对新发病毒进行分子流行病学采用的方法有PCR方法和环介导等温扩增( loop-mediated isothermal amplification， LAMP)反应等方法。基于分子水平对猪细小病毒5型检测常根据病毒基因特征设计特异性引物进行PCR扩增，可及时准确的进行病原鉴别诊断，但是普通的PCR以及灵敏度更高的荧光定量PCR，均需要使用精密仪器，对实验人员有较高的技术要求等，无法在基层实验室广泛使用。环介导等温扩增方法可在等温条件下进行高效、快速、高特异性的扩增靶序列。该方法特异性强，灵敏度较PCR方法高，无需PCR仪器等贵重仪器，仅需要普通水浴锅调节温度（60℃—65℃）。大大降低了检测的费用，特别适合基层和现地使用。目前，还未见针对环介导等温扩增( loop-mediated isothermalamplification， LAMP)反应方法，但该属其他类型病毒如PPV1、PPV2和PPV4均已经有相应的LAMP检测方法。本发明的建立可填补国内外相关领域空白。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增反应引物。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
所述检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增方法的引物，是由一对外引物和一对内引物组成，其中所述的外引物由F3和B3，内引物由FIP和BIP组成。上述2对引物的序列如下：
F3：5’- GCCACACAAAAATAAACACG -3’，
B3： 5’- TTTGTACATGGGAGCAGAT -3’，
FIP：5’- TGCATAAAGACATTCTTTCAGTGGT-GAGCATGGAAAAGCACAG -3’，
BIP：5’- TGGAGGTACAATAGGTGAAGCCT-CAATAACTGCTGGATCTTGTC -3’。
本发明还提供了所述的环介导等温扩增反应引物在制备猪细小病毒5型快速诊断试剂中的用途。
本发明根据猪细小病毒5型基因组中NS1基因序列特征，设计特异性的LAMP引物，根据所设计的LAMP引物，建立一种检测猪细小病毒5型（PPV5）环介导等温扩增方法。该方法不与猪其他常见传染病发生非特异性反应，本方法适用性好，准确度高，特异性强，灵敏度高。
敏感性实验表明，本发明所建立的检测方法能在60分钟内检测出43拷贝数/μL的病毒核酸，比常规方法敏感100倍。同时，本发明中，加入一种绿色荧光染料SYBR Ⅰ，该染料在反应液配制是加入，反应结束后，无需开盖，直接根据颜色变化进行结果判定，这极大的降低了污染的可能性，提高该方法的现地使用性。
附图说明
图1为猪细小病毒5型LAMP特异性实验，其中1：猪细小病毒5型（PPV5）阳性DNA；2：猪细小病毒（porcine parvovirus）DNA；3：猪圆环病毒2型（Porcine circovurs type 2）DNA；4：猪伪狂犬病毒（Porcine Pseudorabies）DNA； 5：猪细小病毒5型（PPV5）阳性标准品PPV5-NS1。
图2为猪细小病毒5型LAMP方法琼脂糖电泳实验。其中M：DL2000分子量标准；1：构建的PPV5-NS1质粒；2：猪细小病毒（porcine parvovirus）DNA； 3：猪圆环病毒（Porcinecircovurs type 2）DNA；4：猪伪狂犬病毒（Porcine Pseudorabies）DNA。
具体实施方式
下面进一步描述本发明，本描述中介绍的实施案例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成限制。本专业技术人员应该理解的是，在不偏离本发明原理和方法的情况下，对本发明技术方案的细节和形式进行部分修改或替换，但基于此修改或替换均属于本发明的保护范围内。
实施例1
1.LAMP实验引物的设计
根据GenBank中登录的所有猪细小病毒5型基因序列和本研究室从我省现地猪场中检测到的猪细小病毒5型基因序列，进行分析比较，选择NS1基因前段保守区域片段（GENBANK登录号JX896318），利用LAMP引物设计的在线网站(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计引物，包括外引物1对和内引物1对，具体序列见SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4。
2、毒株
猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒均购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。猪细小病毒5型阳性DNA由我省（福建省）现地猪场现地检测并保存。
3、病毒核酸的提取
用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.4.0（宝生物工程（大连）有限公司）按照说明书方法进行操作提取猪细小病毒5型阳性病料的DNA，并按照试剂盒的方法同时提取猪细小病毒、猪圆环病毒2型和猪伪狂犬病毒基因组DNA，均放置－20℃保存备用。
4、阳性标准品的制备
以提取的PPV5病毒DNA为模板，用所设计的特异性引物（F：5′-AGAACTTAGAAAATCCTGTAGA-3′和R：5′- TAGCAGGACCGTAAAACCATACA-3′，扩增片段长度为818bp，扩增体系为50μL，其中Primix TaqTM（Ex TaqTM Version）25μL、上下游引物（20μM）各1μL、DNA模板1μL，补充灭菌去离子水至终体积50 μL。反应条件：反应条件为94℃ 5 min预变性后进入循环，循环参数为94℃ 50s、55℃ 35s、72℃ 50s，35个循环后，72℃延伸10min。取PCR产物5μL，在1.0 %琼脂糖凝胶上电泳。经胶回收试剂盒切胶回收纯化后与T载体连接，转化DH5α感受态细胞，应用PCR和双酶切方法鉴定重组质粒，并将阳性重组质粒送由宝生物工程（大连）有限公司进行序列测定。测序结果在NCBI上进行BLAST分析表明，该阳性重组质粒符合实验预期，即作为猪细小病毒5型LAMP阳性标准品(PPV5-NS1)。将获得的阳性标准品用超微量核酸蛋白测定仪测定阳性质粒浓度，测定后计算拷贝数，置于－20℃备用，使用前进行10倍连续稀释。
5、LAMP实验条件优化
使用Loopamp DNA扩增反应试剂盒（北京蓝谱生物科技有限公司）进行LAMP反应。每25μL反应体系中含有：2×反应液12.5μL、Bst DNA大片段聚合酶1μL、F3和B3各5 pmol、FIP和BIP各40 pmol、以猪细小病毒5型阳性标准品为模板2μL、荧光染料1μL，补充灭菌去离子水至终体积25μL。实验不同温度（60℃、62℃、64℃、66℃）、不同时间（30min、45min、60min）检测引物反应性能。优化后的反应条件为64℃反应45min。
6、特异性实验
取猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒提取的DNA进行LAMP反应，并重复实验操作一次。
7、敏感性实验
将制备的阳性质粒标准品进行10倍连续稀释，取拷贝数为4.3×101拷贝数/μL至4.3×106拷贝数/μL共6个梯度的样品进行LAMP反应，确定检测敏感度。并重复实验操作3次。
8、临床样品的检测
对本研究室收集的15份猪组织病料按照步骤3中的方法提取DNA后，进行LAMP和PCR检测。
实验结果
1、LAMP方法的特异性实验
1.1 肉眼判定
猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒均为阴性，而对猪细小病毒5型阳性DNA和有很好的扩增，本方法具有很好的特异性。此外，本结果在自然光条件下可以见到的通过明显的颜色区别进行判定（见图1）。
1.2琼脂糖凝胶电泳判定
反应结束后，利用2%普通琼脂糖凝胶电泳检测，结果可见加入PPV5阳性质粒大的反应管电泳后有不连续梯状电泳条带，加入猪细小病毒DNA、猪圆环病毒DNA和猪伪狂犬病毒DNA均无明显梯状电泳条带。
2、LAMP方法敏感性结果
将制备的阳性质粒标准品进行10倍连续稀释，确定猪细小病毒5型（PPV5）环介导等温扩增方法检测敏感度为43拷贝数/μL，其敏感性为普通PCR的100倍。
3、临床样品的检测
对本研究室收集的15份猪组织病料进行猪细小病毒5型LAMP检测，共有2份阳性样品，PCR检测仅有1份阳性样品，且PCR检测为阳性样品经LAMP检测方法检测也为阳性。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
<120> 检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增反应引物
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gccacacaaa aataaacacg 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tttgtacatg ggagcagat 19
<210> 3
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgcataaaga cattctttca gtggtgagca tggaaaagca cag 43
<210> 4
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tggaggtaca ataggtgaag cctcaataac tgctggatct tgtc 44

Claims (2)

1.一种用于检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增反应引物，其特征在于：所述的引物由1对外引物和1对内引物组成，其中所述的外引物由F3和B3，内引物由FIP和BIP组成；上述两对引物的序列如下：
F3：5’- GCCACACAAAAATAAACACG -3’，
B3： 5’- TTTGTACATGGGAGCAGAT -3’，
FIP：5’- TGCATAAAGACATTCTTTCAGTGGT-GAGCATGGAAAAGCACAG -3’，
BIP：5’- TGGAGGTACAATAGGTGAAGCCT-CAATAACTGCTGGATCTTGTC -3’。
2.权利要求1所述的环介导等温扩增反应引物在制备猪细小病毒5型快速诊断试剂中的用途。
CN201510002842.5A 2015-01-06 2015-01-06 检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增反应引物 Expired - Fee Related CN104450976B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510002842.5A CN104450976B (zh) 2015-01-06 2015-01-06 检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增反应引物

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510002842.5A CN104450976B (zh) 2015-01-06 2015-01-06 检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增反应引物

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104450976A CN104450976A (zh) 2015-03-25
CN104450976B true CN104450976B (zh) 2016-08-24

Family

ID=52897721

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510002842.5A Expired - Fee Related CN104450976B (zh) 2015-01-06 2015-01-06 检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增反应引物

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104450976B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107034316A (zh) * 2017-06-19 2017-08-11 北京博奥晶典生物技术有限公司 同时检测6种猪病毒的系统及其专用lamp引物

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110438259B (zh) * 2019-07-26 2022-08-09 北京市动物疫病预防控制中心 一种能区分猪细小病毒1-7型的分型检测的lamp的引物组合、检测方法及试剂盒

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107034316A (zh) * 2017-06-19 2017-08-11 北京博奥晶典生物技术有限公司 同时检测6种猪病毒的系统及其专用lamp引物

Also Published As

Publication number Publication date
CN104450976A (zh) 2015-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN101712973B (zh) 常温核酸扩增链替换反应试剂及常温核酸扩增方法
CN102634602B (zh) 绵羊肺炎支原体环介导等温扩增检测试剂盒及制备、使用方法
CN103131798A (zh) 一种诺如病毒实时荧光rt-pcr检测试剂盒及其应用
CN102776295A (zh) 一种检测番茄幼苗携带番茄黄化曲叶病毒试剂盒及方法
CN102140543A (zh) 鉴定发热伴出疹症候群传染病相关病毒病原体的多重实时定量pcr的引物、探针及检测方法
CN110229932A (zh) 非洲猪瘟病毒核酸免提取荧光等温扩增检测试剂盒
Hjulsager et al. Inter-laboratory and inter-assay comparison on two real-time PCR techniques for quantification of PCV2 nucleic acid extracted from field samples
CN103725798A (zh) 用于以rt-lamp法检测肾综合征出血热病毒的引物、试剂盒、检测方法
CN107312875A (zh) 检测猪圆环病毒3型的环介导等温扩增方法的引物组
CN104450976B (zh) 检测猪细小病毒5型的环介导等温扩增反应引物
Gou et al. The colorimetric isothermal multiple-self-matching-initiated amplification using cresol red for rapid and sensitive detection of porcine circovirus 3
CN104263841B (zh) 马铃薯中黑胫病菌的实时荧光lamp检测方法及试剂盒
CN105734158A (zh) 一种马驽巴贝斯虫病荧光pcr检测试剂盒
CN102888471A (zh) SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测类猪圆环病毒P1的引物
CN103937884A (zh) 一种用于结核分枝杆菌检测的环介导等温扩增试剂盒及其使用方法
CN103103259A (zh) 确定核酸样本的两个预定位点是否具有已知突变的方法、试剂盒以及引物
CN112063763A (zh) 检测猪圆环病毒4型的环介导等温扩增引物组、试剂盒及应用
CN102634597B (zh) 检测绵羊无浆体的试剂盒
CN103993089A (zh) 一种耐万古霉素肠球菌的多重荧光定量pcr检测试剂盒及其检测方法
CN103088164B (zh) 检测猪细小病毒2型的环介导等温扩增反应引物
CN105603091A (zh) 一种霍乱弧菌多重荧光pcr检测试剂盒及其制备与应用
CN104962623A (zh) 转基因成分的数字pcr检测方法
CN101818212B (zh) 一种快速检测猪细小病毒的环介导等温扩增试剂盒
CN104388593A (zh) 一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒
CN104450968B (zh) 用于猪细小病毒5型实时荧光定量pcr方法的引物及探针

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20160824

Termination date: 20190106