CN104195040A

CN104195040A - 可视化检测核酸恒温扩增的反应装置及方法

Info

Publication number: CN104195040A
Application number: CN201410431991.9A
Authority: CN
Inventors: 吴坚; 张芳
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2014-08-28
Filing date: 2014-08-28
Publication date: 2014-12-10
Anticipated expiration: 2034-08-28
Also published as: CN104195040B

Abstract

本发明公开了一种可视化检测核酸恒温扩增的方法和反应装置，包括：在特定的密闭反应装置中事先将能够将焦磷酸分解为磷酸的试剂添加在核酸扩增反应液当中。待反应结束后。在不开盖的情况下。通过将核酸扩增反应液与已预先另存于装置其他选定显色试剂混合反应。观测混合物进一步反应后的颜色。实现对样品是否发生核酸扩增反应作出判断。其中选定显色试剂为能与磷酸(根)发生颜色反应的试剂组合。本发明方法操作简单，快速灵敏，测试结果通过肉眼即可检测，成本低廉，弥补了现有检测核酸扩增技术的不足。

Description

可视化检测核酸恒温扩增的反应装置及方法

技术领域

本发明属化学分析、核酸分析领域，尤其涉及一种可视化检测核酸等温扩增产物的反应装置和方法。

背景技术

随着生物技术的发展，核酸恒温扩增技术作为新型的核酸扩增技术被广泛应用在农业、医学及食品工业领域。目前常用的恒温扩增技术有交叉引物恒温扩增技术（CPA）、环介导恒温扩增技术（LAMP）、链置换扩增（SDA）、依赖解旋酶的扩增（HDA）。由于该类新型扩增技术能够在较低的恒定温度条件下实现核酸扩增（大部分恒温扩增技术所需反应温度在60℃或者37℃左右），因此摆脱了传统PCR所需要的精密的温控设备，大大缩小成本，受到广泛关注。

用于核酸恒温扩增产物检测的方法，目前主要有电泳、荧光染料、浊度、免疫试纸条等。其中，凝胶电泳法需要有开盖的操作，因此容易造成气溶胶污染，并且需要用到高致癌性的荧光染料危害人体健康；荧光法检测需要特殊、庞大、昂贵的光学仪器；而浊度法虽然能能够使用肉眼观测，但是对核酸扩增效率要求较高，要求核酸扩增产量达到最低肉眼可见浊度并且容易受到主观因素的影响，并不适用于所有的恒温扩增检测。因此，该领域需要开发新的核酸扩增产物检测方法。可视化检测具有简单、直接、便于大通量筛查的特点，可以摆脱复杂的仪器设施，对检测结果做出判断。目前有钙黄绿素荧光目视法，HNB法。这两种方法是利用金属指示剂间接或是直接地检测反应体系中的金属离子浓度，从而发生颜色变化，具体来讲，分别是从橘色变为绿色或是从紫色变为天蓝色。因此，目前可视化检测核酸扩增的方法具有不可避免的缺点：1.金属指示剂容易受到样品中其他金属离子的影响，造成误差；2.阳性反应结果是从一种颜色到另外一种颜色，不利于肉眼观察；3.检测对象是反应液中初始浓度较高的金属离子，因此会具有较高的背景信号降低检测灵敏度。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种可视化检测核酸恒温扩增的反应装置，可实现在不打开盖的情况下，使得核酸恒温扩增反应能够不受干扰地进行，之后进行的检测反应能够按序正常进行。为此，本发明采用以下技术方案：

一种用于可视化核酸恒温扩增检测的反应装置，包括反应容器，其特征在于所述反应容器具备多个相互独立但是连通的储液区域，其中一个区域用于进行核酸恒温扩增反应，盛放核酸恒温扩增反应试剂，其它区域的全部或部分用于盛放用于核酸恒温扩增反应产物可视化检测的试剂（以下简称为产物检测试剂），所述反应装置具有所述反应容器的盖，以保持密封性。本发明反应装置的独立、分隔但连通的储液区域保证核酸恒温扩增反应液和产物检测试剂在反应前相互独立、互不干扰地盛放在装置的不同区域；在不开盖的情况下，通过剧烈摇晃或是震动、颠倒等操作下，不同区域预存储的液体才混合均匀用于可视化检测。

进一步地，所述反应容器为多个试管并列连为一体的试管组，试管组中试管的上部连通；试管在连通部位以下的区域为所述储液区域。

所述用于进行核酸恒温扩增反应的储液区域的容积小于等于80ul大于等于10ul。

所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂中的不同试剂在检测反应前放在不同的储液区域中，所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂总体积优选地在90~450ul之间，更优选地在，90~270ul之间。

所述多个能区分但是连通的储液区域的数量，优选为2-5个，更优选地为2-4个。

本发明另一个目的是提供一种可视化检测核酸恒温扩增的方法。为此，本发明采用以下技术方案：

其采用上述的反应装置作为核酸恒温扩增反应及用于可视化检测恒温扩增结果的反应的反应器；

所述方法利用所述反应装置提供的封闭的反应器中用于核酸恒温扩增反应的储液空间进行核酸恒温扩增反应，并将进行核酸恒温扩增反应产物可视化检测的试剂一一预先储放在所述反应器中的其它储液区域中，进行核酸恒温扩增反应的反应液中含有将焦磷酸根分解为磷酸根的试剂，所述进行核酸恒温扩增反应产物可视化检测的试剂是指能与磷酸根进行反应的显色试剂；

在核酸恒温扩增反应过程中，核酸扩增副产物焦磷酸根被分解为磷酸根，核酸恒温扩增反应结束后，在依旧封闭反应器的情况下，将反应器内的所有液体混匀，观察反应器内是否发生颜色变化，根据反应器内的液体颜色是否符合显色试剂与磷酸根发生反应后应当体现的颜色来对核酸恒温扩增进行可视化检测。

所述核酸恒温扩增反应试剂包含核酸恒温扩增反应混合液和无机焦磷酸酶；其中核酸恒温扩增反应混合液可以来自于商业化核酸恒温扩增试剂盒，例如广州迪澳PA101 Nos基因核酸检测试剂盒；无机焦磷酸酶是可以将焦磷酸水解生成磷酸根的酶，优选为耐热型的无机焦磷酸酶。

所述核酸恒温扩增反应可以为扩增温度低于90°C的扩增反应，可以为交叉引物恒温扩增（CPA），也可以是环介导恒温扩增（LAMP）。所述恒温扩增反应可以在水浴、金属浴或其他加热条件下进行。

所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂中的不同试剂在反应前放在不同的储液区域中，总体积优选地在90~450ul之间，更优选地在，90~270ul之间。所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂可以是还原剂溶液和钼酸盐-酒石酸锑钾酸性溶液组合（组合一），或者钼酸盐酸性溶液和孔雀石绿溶液组合（组合二），总的体积在上述体积范围之内，有需要可以用水或是Tris-HCl缓冲液补充。

所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂组合中，钼酸盐溶液的配置可使用钼酸铵或钼酸钠，优选钼酸铵。

所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂组合中，酸为纯硫酸、硝酸，优选地为浓硫酸。

所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂组合中，还原剂溶液是由抗坏血酸或氯化亚锡配置，优选为抗坏血酸。

所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂组合中，抗坏血酸溶液中抗坏血酸的含量为0.2~1mg，优选地0.2~0.8mg，更优地0.2~0.6mg。

所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂组合中，钼酸盐-酒石酸锑钾溶液中钼酸铵的含量为0.1~0.5mg，优选地0.1~0.4mg，更优地0.1~0.3mg；酒石酸钾锑的含量为2.67~13.35ng，优选地2.67~10.68ng、更优地2.67~8.01ng；硫酸的含量为1.96g~9.8g，优选地1.96g~7.84g、更优地1.96g~5.88g。

所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂组合中，钼酸盐酸溶液中钼酸铵的含量为0.58mg~2.9mg，优选地0.58mg~2.32mg，更优地0.58mg~1.74mg；硫酸的含量为8.82mg~44.1mg，优选地8.82mg~35.28mg，更优地8.82mg~26.46mg。所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂组合中，孔雀石绿溶液中孔雀石绿的含量为4.635ng~23.175ng，优选地4.635ng~18.54ng，更优地4.635ng~13.905ng。由上述技术方案可知，本发明还可形成一种专用于可视化检测核酸恒温扩增的试剂装置，其包括上述反应装置，反应装置中的用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂的总体积在90~450ul之间，用于进行核酸恒温扩增反应的储液区域的容积小于等于80ul大于等于10ul，其各项试剂的组合及含量如前所述。

本发明与现有技术相比，本发明提供了一种既能符合核酸等温扩增反应条件又能符合生产磷酸根反应和磷酸根检测反应条件的反应装置可以实现在不打开反应容器的条件下，通过对不同溶液混合，检测核酸扩增反应过程中磷酸根的产生，间接可视化检测核酸恒温扩增：对于阴性样本，整个检测过程中不产生磷酸根，因此反应液呈无色，而对于阳性样本，随着扩增反应的进行，焦磷酸根作为副产物不断产生，并在无机焦磷酸酶的作用下被分解为磷酸根，从而与显色试剂反应产生颜色变化，反应液呈蓝色。因此该发明具有以下特点，首先，核酸扩增的检测不存在开盖操作，不会造成交叉污染；其次，核酸扩增检测的可视化使得该方法不需要特殊的仪器，并且该发明的颜色是由无色变化为蓝色，因此很容易用肉眼分辨；再次，该发明是通过检测核酸扩增过程中磷酸根的生成判断核酸扩增反应的进行，具有较低的背景干扰，有利于对结果的准确判定。

附图说明

图1a为用于可视化核酸恒温扩增检测的反应装置实施例1的示意图

图1b为用于可视化核酸恒温扩增检测的反应装置实施例1的立体图。

图2a为用于可视化核酸恒温扩增检测的反应装置实施例2的示意图。

图2b为用于可视化核酸恒温扩增检测的反应装置实施例2的立体图。

图3a为用于可视化核酸恒温扩增检测的反应装置实施例3的示意图。

图3b为用于可视化核酸恒温扩增检测的反应装置实施例3的立体图。

图4a为实例1的CPA恒温扩增体系阳性样品和阴性样品可视化检测结果对照图。

图4b为实例5的LAMP恒温扩增体系阳性样品和阴性样品可视化检测结果对照图。

具体实施方式

如图1a、1b、2a、2b、3a和3b所示，本发明所提供的用于可视化核酸恒温扩增检测的反应装置包括反应容器1，所述反应容器1具备多个相互独立但是连通的储液区域，图1a和1b所显示的实施例1中具有三个储液区域分别为a、b、c，图2a和2b所显示的实施例2中具有四个储液区域分别为a、b、c、d，图3a和3b所显示的实施例3中具有五个储液区域分别为a、b、c、d、e，其中一个区域（比如区域a）用于进行核酸恒温扩增反应，盛放核酸恒温扩增反应试剂，其它区域的全部或部分用于盛放用于核酸恒温扩增反应产物可视化检测的试剂，所述反应装置具有所述反应容器的盖10，以保持密封性。

在实施中，所述反应容器1为多个试管并列连为一体的试管组，试管组中试管的上部连通；试管在连通部位20以下的区域为所述储液区域。

下面将结合上述反应装置实施例对本发明作详细的介绍，但并不局限于此。

实例1：本发明用于可视化交叉引物恒温扩增（CPA）检测转基因终止子T-Nos基因。

反应前试剂准备：在实施例1反应器的a区域，添加9ul反应扩增液（包含有引物、dNTP、Tris-HCl缓冲液、Mg²⁺、NH₄ ⁺、模板，来自杭州优思达生物技术公司转基因NOS序列恒温扩增试剂盒，货号I016-01），和1ul 0.1U/ul的耐热无机焦磷酸酶（来自New England Biolabs，货号M0296s）；b区域添加2ul 10%的抗坏血酸溶液和8ul水；c区域添加4ul 钼酸铵-酒石酸钾锑溶液（包含21mM钼酸铵，2mM酒石酸钾锑，5M硫酸）和76ul水。

核酸恒温扩增反应进行：将上述装置置于63°C水浴加热1h。

可视化检测恒温扩增：反应完成后，颠倒装置一，使得3个区域的液体充分混合，10min后判断结果：阳性为蓝色（图4a，4），阴性为无色（图4a，3）。

实例2：本发明用于可视化交叉引物恒温扩增（CPA）检测转基因终止子T-Nos基因。

核酸恒温扩增反应进行：将上述装置置于63°C金属浴加热1h。其他同实施例1。

实例3：本发明用于可视化交叉引物恒温扩增（CPA）检测金黄色葡萄球菌。

反应扩增液（包含有引物、dNTP、Tris-HCl缓冲液、Mg²⁺、NH₄ ⁺、模板，来自杭州优思达生物技术有限公司金黄色葡萄球菌恒温扩增核酸试剂盒，货号I011-01）。其他同实施例1。

实例4：本发明用于可视化交叉引物恒温扩增（CPA）检测沙门氏菌。

反应扩增液（包含有引物、dNTP、Tris-HCl缓冲液、Mg²⁺、NH₄ ⁺、模板，来自杭州优思达生物技术有限公司沙门氏菌恒温扩增核酸试剂盒，货号I047-01）。其他同实施例1。

实例5：本发明用于可视化环介导恒温扩增（LAMP）检测转基因终止子T-Nos基因。

在实施例1反应器的a区域，添加9ul反应扩增液（包含有引物、dNTP、Tris-HCl缓冲液、Mg²⁺、NH₄ ⁺、模板，来自广州迪澳NOS基因核酸检测试剂盒（恒温荧光法），货号PA101S），和1ul 0.1U/ul的耐热无机焦磷酸酶（来自New England Biolabs，货号M0296s）；b区域添加2ul 10%的抗坏血酸溶液和8ul水；c区域添加4ul 钼酸铵-酒石酸钾锑溶液（包含21mM钼酸铵，2mM酒石酸钾锑，5M硫酸）和76ul水。其他同实施例1。

可视化检测恒温扩增：反应完成后，颠倒实施例1反应器，使得3个区域的液体充分混合，10min后判断结果：阳性为蓝色（图4b，4），阴性为无色（图4b，3）。

实例6：本发明用于可视化环介导恒温扩增（LAMP）检测沙门氏菌。

在实施例1反应器的a区域，添加19ul反应扩增液（包含有引物、dNTP、Tris-HCl缓冲液、Mg²⁺、NH₄ ⁺、模板，来自广州迪澳沙门氏菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法），货号FA105S），和1ul 0.1U/ul的耐热无机焦磷酸酶（来自New England Biolabs，货号M0296s）；b区域添加4ul 10%的抗坏血酸溶液和16ul水；c区域添加8ul 钼酸铵-酒石酸钾锑溶液（包含21mM钼酸铵，2mM酒石酸钾锑，5M硫酸）和152ul水。其他同实施例1。

实例7：本发明用于可视化环介导恒温扩增（LAMP）检测金黄色葡萄球菌。

在实施例2反应器的a区域，添加29ul反应扩增液（包含有引物、dNTP、Tris-HCl缓冲液、Mg²⁺、NH₄ ⁺、模板，来自广州迪澳金黄色葡萄球菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法），货号FA109S），和1ul 0.1U/ul的耐热无机焦磷酸酶（来自New England Biolabs，货号M0296s）；b区域添加6ul 10%的抗坏血酸溶液和24ul水；c区域添加12ul 钼酸铵-酒石酸钾锑溶液（包含21mM钼酸铵，2mM酒石酸钾锑，5M硫酸）和108ul水；d区域添加120ul水。其他同实施例1。

实例8：本发明用于可视化环介导恒温扩增（LAMP）检测铜绿假单胞菌。

在实施例2反应器的a区域，添加39ul反应扩增液（包含有引物、dNTP、Tris-HCl缓冲液、Mg²⁺、NH₄ ⁺、模板，来自广州迪澳铜绿假单细胞菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法），货号FA112S），和1ul 0.1U/ul的耐热无机焦磷酸酶（来自New England Biolabs，货号M0296s）；b区域添加8ul 10%的抗坏血酸溶液和32ul水；c区域添加16ul 钼酸铵-酒石酸钾锑溶液（包含21mM钼酸铵，2mM酒石酸钾锑，5M硫酸）和144ul水；d区域添加160ul水。其他同实施例1。

实例9：本发明用于可视化环介导恒温扩增（LAMP）检测铜绿假单胞菌。

在实施例3反应器的a区域，添加49ul反应扩增液（包含有引物、dNTP、Tris-HCl缓冲液、Mg²⁺、NH₄ ⁺、模板，来自广州迪澳铜绿假单细胞菌核酸检测试剂盒（恒温荧光法），货号FA112S），和1ul 0.1U/ul的耐热无机焦磷酸酶（来自New England Biolabs，货号M0296s）；b区域添加10ul 10%的抗坏血酸溶液和40ul水；c区域添加16ul 钼酸铵-酒石酸钾锑溶液（包含21mM钼酸铵，2mM酒石酸钾锑，5M硫酸）和144ul水；d区域添加120ul水；e区域添加120ul水。其他同实施例1。

实例10：本发明用于可视化环介导恒温扩增（LAMP）检测转基因终止子T-Nos基因。

在实施例1反应器的a区域，添加9ul反应扩增液（包含有引物、dNTP、Tris-HCl缓冲液、Mg²⁺、NH₄ ⁺、模板，来自广州迪澳NOS基因核酸检测试剂盒（恒温荧光法），货号PA101S），和1ul 0.1U/ul的耐热无机焦磷酸酶（来自New England Biolabs，货号M0296s）；b区域添加5.875ul 80mM钼酸铵水溶液、2.5ul浓硫酸、2ul 5mM孔雀石绿溶液以及29.625ul水；c区域添加50ul水。其他同实施例1。

实例11：本发明用于可视化环介导恒温扩增（LAMP）检测转基因终止子T-Nos基因。

在实施例1反应器的a区域，添加19ul反应扩增液（包含有引物、dNTP、Tris-HCl缓冲液、Mg²⁺、NH₄ ⁺、模板，来自广州迪澳NOS基因核酸检测试剂盒（恒温荧光法），货号PA101S），和1ul 0.1U/ul的耐热无机焦磷酸酶（来自New England Biolabs，货号M0296s）；b区域添加11.75ul 80mM钼酸铵水溶液、5ul浓硫酸、4ul 5mM孔雀石绿溶液以及19.25ul水；c区域添加140ul水。其他同实施例1。

实例12：本发明用于可视化环介导恒温扩增（LAMP）检测转基因终止子T-Nos基因。

在实施例2反应器的a区域，添加29ul反应扩增液（包含有引物、dNTP、Tris-HCl缓冲液、Mg²⁺、NH₄ ⁺、模板，来自广州迪澳NOS基因核酸检测试剂盒（恒温荧光法），货号PA101S），和1ul 0.1U/ul的耐热无机焦磷酸酶（来自New England Biolabs，货号M0296s）；b区域添加35.25ul 80mM钼酸铵水溶液、7.5ul浓硫酸、6ul 5mM孔雀石绿溶液以及1.25ul水；c区域添加110ul水；d区域添加110ul水。其他同实施例1。

Claims

1.一种用于可视化核酸恒温扩增检测的反应装置，包括反应容器，其特征在于所述反应容器具备多个相互独立但是连通的储液区域，其中一个区域用于进行核酸恒温扩增反应，盛放核酸恒温扩增反应试剂，其它区域的全部或部分用于盛放用于核酸恒温扩增反应产物可视化检测的试剂，所述反应装置具有所述反应容器的盖，以保持密封性。

2.如权利要求1所述的反应装置，其特征在于所述反应容器为多个试管并列连为一体的试管组，试管组中试管的上部连通；试管在连通部位以下的区域为所述储液区域。

3.如权利要求1所述的反应装置，其特征在于所述用于进行核酸恒温扩增反应的储液区域的容积小于等于80ul大于等于10ul。

4.如权利要求1所述的反应装置，其特征在于所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂的储液区域的总体适配90~450ul的储液量。

5.一种可视化检测核酸恒温扩增的方法。其特征在于：

其采用权利要求1所述的反应装置作为核酸恒温扩增反应及用于可视化检测恒温扩增结果的反应的反应器；

6.如权利要求5所述的一种可视化检测核酸恒温扩增的方法。其特征在于：所述核酸恒温扩增反应试剂包含核酸恒温扩增反应混合液和耐热无机焦磷酸酶。

7.如权利要求5所述的一种可视化检测核酸恒温扩增的方法。其特征在于：所述核酸恒温扩增反应为扩增温度低于90°C的扩增反应，包括交叉引物恒温扩增（CPA），包括环介导恒温扩增（LAMP）。

8.如权利要求5所述的一种可视化检测核酸恒温扩增的方法。其特征在于：所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂中的不同试剂在反应前放在不同的储液区域中，所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂是还原剂溶液和钼酸盐-酒石酸锑钾酸性溶液组合，或者钼酸盐酸性溶液和孔雀石绿溶液组合。

9.如权利要求8所述的一种可视化检测核酸恒温扩增的方法。其特征在于：所述用于可视化核酸恒温扩增检测的试剂组合中，还原剂溶液是由抗坏血酸或氯化亚锡配置，优选为抗坏血酸。