CN111424073B

CN111424073B - 一种闭管核酸扩增检测方法及装置

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Publication number: CN111424073B
Application number: CN202010366237.7A
Authority: CN
Inventors: 徐秦峰; 澹台玮; 李艳妮; 蔡露阳; 李敏康
Original assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Current assignee: Shaanxi University of Science and Technology
Priority date: 2020-04-30
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2022-11-22
Anticipated expiration: 2040-04-30
Also published as: CN111424073A

Abstract

本发明公开了一种闭管核酸扩增检测方法及装置。从样品中提取核酸，将提取的核酸作为模板与扩增试剂混合，得到反应体系，同时将反应体系及检测体系置入在反应管中，并利用反应管中的检测管分隔反应体系与检测体系，确保在扩增反应结束前反应体系与检测体系互不接触；扩增反应结束后通过颠倒摇晃，使反应产物与检测体系混匀，最后进行目视观察比色、分析，本发明核酸扩增和结果分析过程在闭管条件下完成，具有检测成本低、时间短以及操作容易、样品不易污染的优点。

Description

一种闭管核酸扩增检测方法及装置

技术领域

本发明涉及一种核酸检测方法及装置，具体涉及基于管内分隔反应体系与检测体系(例如，染料)的闭管核酸检测。

背景技术

核酸是广泛存在于动植物细胞和微生物中的生物大分子，已成为重要生物标志物。为了高效分析特定的核酸序列，利用一系列核酸扩增技术，如聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)、环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermalamplification，LAMP)、重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase PolymeraseAmplification，RPA)等，通过将目标序列数量放大数百万倍以实现对核酸的扩增，并成功应用于医学鉴定、食品安全保障等领域。作为核酸检测方法，PCR至今仍是分子检测方法的黄金标准，但其所需的热循环步骤，限制了其在野外检测和资源贫乏地区的应用。LAMP具有恒温扩增、快速放大等优势，使得核酸检测在基层单位得以快速实现。普通PCR及普通LAMP在扩增目标序列后，一般需要采用凝胶电泳分析扩增结果，使得检测方法耗时、费力，而且必须在对人体有害的紫外线(UV)下，通过凝胶图像实现对分析结果的显示。尽管也可以利用荧光定量PCR及荧光定量LAMP技术实时监测扩增子的产生和积累，但是检测成本高，且不适用于现场检测。而基于焦磷酸镁沉淀的浊度法、基于添加的SYBR Green I及钙黄绿素等荧光染料的显色反应，在分析扩增产物时需借助浊度仪及UV照射仪等装置。

基于目视比色的核酸检测方法中，SYBR Green I、[Ru(phen)₂dppz]²⁺等染料只有在高浓度下才针对扩增的双链DNA显示颜色，但是这些染料在反应体系中浓度较高时会抑制扩增反应。而金纳米粒子标记探针，只有与非对称PCR产生的单链DNA互补才会产生颜色变化，但金纳米粒子标记探针在反应温度下会发生沉淀，从而无法与扩增的单链DNA识别。由于这些原因，在运用基于目视比色的检测方法时，待反应完成后对带有核酸的检测液进行优化、调试及分析操作中，无法避免开管操作，导致产物弥漫在空气中引发气溶胶污染的风险，从而造成假阳性结果，影响检测结果的准确性，故核酸检测目前无法在野外和条件简陋的场所展开工作。

为了避免开管操作，中国专利“基于金属钌配合物的LAMP荧光目视比色检测方法及试剂盒”(公开号：CN109022545A)采用微晶蜡分隔反应体系与金属钌配合物，扩增反应后需要将微晶蜡融化，而融化的微晶蜡会附着在管壁上，导致目视观察结果时存在模糊障碍，尤其是在使用颜色本身区分不明显的常规染料时，对检测结果准确读取影响更大。对于CN109022545A中采用的微晶蜡，在LAMP反应完成后还需要额外的升温处理，使得核酸检测无法在同一个水浴温度下进行。此外，CN109022545A采用的微晶蜡本身耐受不了PCR所需的较高变性温度(例如，95℃)，因此，不适合用于PCR检测。

发明内容

针对核酸检测技术的高灵敏度及开管操作导致的扩增产物污染问题，本发明提供一种闭管核酸扩增检测方法及装置，从而避免假阳性结果的出现，提高核酸检测结果的准确性，适用于多种核酸恒温扩增(例如，LAMP)或者变温扩增(例如，PCR、LCR)检测方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种闭管核酸扩增检测方法，包括以下步骤：

1)从样品中提取核酸(例如，DNA)作为模板，将模板与扩增试剂于反应管中混合，得到反应体系，所述扩增试剂包括针对样品基因组某段目标检测序列(例如，基因片段)设计的特异性扩增引物；同时在反应管中置入检测管，并将用于对扩增阳性结果与扩增阴性结果进行目视比色或荧光分析(例如，荧光强度差异)的核酸检测体系(例如，染料)加入检测管中，必要时，应保证检测管内盛放核酸检测体系的管段部分包裹或全部包裹于反应管中的反应体系液面以上的空气中；

或者，

从样品中提取核酸(例如，DNA)作为模板，将模板与扩增试剂于检测管中混合，得到反应体系，然后将检测管置入反应管中；同时，将用于对扩增阳性结果与扩增阴性结果进行目视比色或荧光分析(例如，荧光强度差异)的核酸检测体系(例如，染料)加入反应管中，使得核酸检测体系将检测管内盛放反应体系的管段包裹(但不与反应体系混合)；所述扩增试剂包括针对样品基因组某段目标检测序列(例如，基因片段)设计的特异性扩增引物；

2)经过步骤1)后，关闭反应管并进行扩增反应；

3)反应结束后使反应产物与核酸检测体系通过颠倒摇晃反应管而混匀，然后进行显色处理，然后对显色结果进行目视观察或分析；或者，反应结束后使反应产物与核酸检测体系通过颠倒摇晃反应管而混匀，然后直接目视观察反应管内的颜色变化(例如，直接在日光下目视比色)。

优选的，还包括以下步骤：通过在步骤1)中设置阴性对照并按照步骤2)使阴性对照进行扩增反应，获得用于与目标检测序列扩增结果进行目视比色的对照扩增结果，所述阴性对照的反应体系不含模板。

优选的，所述样品选自采集自体内或环境中的生物样本，例如，细菌等微生物、机体组织、体液、分泌物(例如，生牛乳)。

优选的，所述检测体系选自核酸染料，例如，SYBR Green I、金属钌配合物，或选自单链核酸检测试剂，例如，金纳米粒子等显色颗粒的标记探针。

优选的，所述扩增反应选自PCR(例如，普通PCR、不对称PCR)、LCR或LAMP。

优选的，所述显色处理采用光激发(例如，蓝光透射仪)。

一种闭管核酸扩增检测装置，该检测装置包括反应器(水浴锅或PCR仪)、可透光的反应管以及设置在该反应管内的检测管，检测管内或检测管外设置有上述核酸检测体系，核酸检测体系通过封闭反应管而与外界隔离。

优选的，所述反应管内设置有通过检测管与核酸检测体系分隔的上述扩增试剂。

优选的，位于检测管内的扩增试剂包裹于检测管外的核酸检测体系中。

优选的，位于检测管内的核酸检测体系部分包裹或全部包裹于检测管外的位于扩增试剂液面以上的空气中。

优选的，所述检测装置还包括核酸染料激发光源(例如，蓝光透射仪)。

本发明的有益效果体现在：

本发明在反应管内置入检测管，使得反应体系(引物等扩增试剂及模板)与核酸检测体系在扩增反应结束前互不接触，可以一步完成检测所需的核酸扩增和结果分析，检测过程在闭管条件下完成。相比于现有的目视比色核酸检测方法，具有检测成本低、时间短、适用范围广以及操作容易、样品不易污染的优点，且检测结果容易辨识，不易受到干扰。

附图说明

图1为管内分隔装置示意图。

图2为以SYBR Green I为染料的荧光PCR目视比色图。

图3为以金纳米粒子作为染料的PCR目视比色图。

图4为不同浓度Ru(II)配合物[Ru(phen)₂dppz]²⁺作为染料的琼脂糖凝胶电泳图(M：2000bp Marker；泳道1～8：[Ru(phen)₂dppz]²⁺浓度分别为0、0.5、1、1.5、2、3、4μM及空白对照)。

图5为可视化LAMP检测结果；其中：(A)染料直接混合反应的LAMP扩增阳性、阴性发射光谱及比色图；(B)染料分隔反应的LAMP扩增阳性、阴性发射光谱及比色图；1号为阳性结果；2号为阴性结果。

图6为闭管分隔核酸检测原理示意图。

图7为基于金属钌配合物[Ru(phen)₂dppz]²⁺闭管LAMP反应阳性、阴性比色图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例仅用于解释本发明，而不是对本发明保护范围的限制。

(一)基于SYBR Green I的荧光可视化PCR扩增检测的可行性

1、PCR扩增引物

以金黄色葡萄球菌(环凯微生物科技有限公司)DNA为模型，根据金黄色葡萄球菌fem基因保守序列设计物种特异性引物，由生工生物(上海)有限公司合成，经HPLC纯化，引物序列如下：

上游引物F3(5'-3')：TTTAACAGCTAAAGAGTTTGGT；

下游引物B3(5'-3')：TTTTCATAATCRATCACTGGAC。

2、金黄色葡萄球菌DNA提取

无菌操作下，利用LB培养基进行增菌处理，用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)进行菌体DNA的提取，得到模板DNA。

3、PCR扩增

PCR反应体系(10μL)：2×Taq PCR Master Mix 5μL、引物F3、B3各1μL(4μM)、7ng/μL模板DNA 1μL，剩余用超纯水补齐。

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性15s，57℃退火15s，68℃延伸30s，30个循环；68℃再延伸5min。

4、比色闭管PCR荧光检测的步骤

(4.1)检测管的制作如图1示，在实验操作时，在无菌环境下从移液器吸头上裁取一段空管体，确保该段空管体可以放入反应管中，旋转该段空管体底部将其人为封死(或者通过加热封死)，得到前端(尖端)封堵的空管体，即检测管。

(4.2)当按照反应体系添加反应液时，将各反应液及检测管(检测管内加入有2μL100×SYBR Green I)放置于反应管中，即在反应管内将反应体系与染料(具体指SYBRGreen I)利用检测管相互分隔(分区)。添加反应液及染料的操作完成后，按照同样添加方式设置阴性对照(模板替换为超纯水)，并在相同的PCR反应程序下进行闭管反应。

(4.3)在反应结束后，颠倒摇晃反应管，使检测管内的染料与检测管外的反应产物混合均匀。然后在蓝光透射仪下对反应管内的混合液体进行目视比色鉴定(立即观察)。结果显示扩增反应的阳性和阴性结果可依据混合液体的颜色区分，如图2示，阳性结果为绿色，阴性结果为黄色，即通过清晰的颜色区分可以在闭管下一步实现对金黄色葡萄球菌中特异基因片段的扩增和结果分析。

(二)基于金纳米粒子的目视比色非对称PCR扩增检测的可行性

1、引物及探针

以金黄色葡萄球菌DNA为模型，根据金黄色葡萄球菌fem基因保守序列设计物种特异性引物，由生工生物(上海)有限公司合成，经HPLC纯化，引物序列如下(*表示硫代修饰)：

上游引物F3(5'-3')：CTGTCATTAGGTACTACCGAGGTTTAACAGCTAAAGAGTTTGGT；

下游引物B3(5'-3')：TTTTCATAATCRATCACTGGAC；

金纳米粒子探针probe1(Au)：TACTACCGAGGA*A*A*A*A*A*A*A*A*A；

金纳米粒子探针Probe2(Au)：A*A*A*A*A*A*A*A*A*ACTGTCATTAGG。

2、金纳米粒子修饰

无菌操作下，利用快速法(ACS Appl Mater Interfaces,2017,9:8014-8020)将probe1(Au)和Probe2(Au)修饰到金纳米粒子表面，得到金纳米粒子标记探针。

3、金黄色葡萄球菌DNA提取同(一)中步骤2，在此不再赘述。

4、非对称PCR扩增

PCR反应体系(10μL)：2×Taq PCR Master Mix 5μL、引物F3 2.4μL(10μM)、引物R30.4μL(1μM)、7ng/μL模板DNA 1μL，剩余用超纯水补齐。

5、一步比色闭管PCR检测步骤

(5.1)检测管的制作参照(一)中步骤4.1。

(5.2)当按照反应体系添加反应液时，将各反应液及检测管(检测管内加入有2μL13nM的金纳米粒子标记探针)放置于反应管中，即在反应管内将反应体系与染料(具体指金纳米粒子标记探针)利用检测管相互分隔(分区)。添加反应液及染料的操作完成后，按照同样添加方式设置阴性对照(模板替换为超纯水)，并在相同的PCR反应程序下进行闭管反应(由于反应体系体积较小，检测管内的染料主要被反应管内位于反应体系液面以上的空气包裹，具有一定的隔热保护作用，解决了金纳米粒子在反应高温条件下沉淀而无法发挥染色作用的问题)。

(5.3)在反应结束后，颠倒摇晃反应管，使检测管内的染料与检测管外的反应产物混合均匀。然后直接对反应管内的混合液体进行目视比色鉴定(立即观察)。结果显示扩增反应的阳性和阴性结果可依据混合液体的颜色区分，如图3示，阳性结果为紫红色，阴性结果为无色，证明基于金纳米粒子的闭管裸眼非对称PCR检测方法适用性良好。

(三)基于[Ru(phen)₂dppz]²⁺的可视化LAMP检测的可行性

1、LAMP引物

以生牛乳(取自奶牛)为模型，根据生牛乳的细胞色素b基因保守序列设计物种特异性引物，由生工生物(上海)有限公司合成，经HPLC纯化，引物序列如下：

上游外引物F3(5'-3')：GACAACTAGCATCTGTCCTA；

下游外引物B3(5'-3')：CAGCTTTGGGGGTTGATG；

上游内引物FIP(5'-3')：GATGTACTACAAAGACCTGTCTTCATTTCTCCTCATCCTAGTGC；

下游内引物BIP(5'-3')：CTGGTCTTGTAAACCAGAGAAGGTGCAGTTTCTTCCTTGAGTC。

2、生牛乳DNA提取

无菌操作下，利用磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技有限公司)，提取新鲜生牛乳中的DNA，得到模板DNA。

3、LAMP扩增

LAMP反应体系(10μL)：10×Thermol Pol buffer 1μL、外引物F3和B3各0.2μL(10μM)、内引物FIP和BIP各0.2μL(40μM)、1.4μL dNTPs(10mmol/L)、甜菜碱(0.8M)1.6μL、BstDNA聚合酶(8U/μL)0.4μL、7ng/μL模板DNA 1.2μL，剩余用超纯水补齐。

LAMP反应程序：63℃、40min。

4、Ru(II)配合物[Ru(phen)₂dppz]²⁺作为LAMP反应的荧光染料的验证

对含有不同浓度(与反应体系混合后的终浓度)的Ru(II)配合物[Ru(phen)₂dppz]²⁺(0、0.5、1、1.5、2、3、4μM)的反应体系及空白对照(超纯水)进行LAMP扩增。根据扩增结果(图4)，直接在LAMP反应体系中加入Ru(II)配合物[Ru(phen)₂dppz]²⁺，扩增反应对[Ru(phen)₂dppz]²⁺的最大耐受浓度为1μM，而浓度大于1μM时扩增反应就会被抑制；但根据可视化反应体系的优化结果，[Ru(phen)₂dppz]²⁺浓度大于10μM时才能作为染料，使得阳性结果和阴性结果达到较明显的颜色区别，该浓度(10μM)远高于扩增反应耐受浓度(1μM)，故不能直接将钌染料([Ru(phen)₂dppz]²⁺)在反应前加入到体系中。

5、一步比色闭管LAMP检测步骤(参见图6)

(5.1)检测管的制作参照(一)中步骤4.1。

(5.2)当按照反应体系添加反应液时，将100μL Ru(II)配合物染料[Ru(phen)₂dppz]²⁺(与反应体系混合后的终浓度约为10μM)及检测管(检测管内为反应体系)放置于反应管中，即在反应管内将反应体系与染料(具体指[Ru(phen)₂dppz]²⁺)利用检测管相互分隔(分区)。添加反应液及染料的操作完成后，按照同样添加方式设置阴性对照(模板替换为超纯水)，并在相同的LAMP反应程序下进行闭管反应(由于染料体积较大，故将其放置于反应管中，并包裹检测管内的反应体系，以便良好传热，保证扩增反应顺利进行)。

(5.3)在反应结束后，颠倒摇晃反应管，使检测管内的反应产物与检测管外的染料混合均匀。然后在蓝光透射仪下对反应管内的混合液体进行目视比色鉴定(立即观察)。结果显示扩增反应的阳性和阴性结果可依据混合液体的颜色区分，如图7示，阳性结果为红色，阴性结果无色。即通过清晰的颜色区分可以在闭管下一步实现对生牛乳中特异基因片段的扩增和结果分析。

6、检测结果的荧光光谱分析

利用以上建立的一步比色闭管LAMP检测步骤，在反应结束后利用蓝光透射仪进行比色检测的同时，进行光谱图扫描检测。扫描检测条件为：针对Ru(II)配合物染料[Ru(phen)₂dppz]²⁺，W(Ex)＝450nm，Excitation bandwith＝12nm。

如图5A所示，当直接将染料加入反应体系时，因高浓度染料对扩增反应的抑制作用阳性反应管没有出现颜色变化，阴性对照也无颜色显示；而在图5B中，通过在反应管内分区，在扩增结束后，通过颠倒混匀操作，使扩增产物与染料接触，阳性结果呈现明显的红色，阴性结果为无色，形成直观的颜色对比。对两组样品进行对应的光谱图扫描，分区操作的阳性结果也出现较大的荧光强度，与阴性对照的荧光强度具有较大的差值，与呈现的颜色对比相互对应。

本发明的特点如下：

(1)核酸扩增和结果分析过程始终在封闭体系中进行，减少污染，提高检测结果的准确性。

(2)针对不同的扩增反应，通过添加不同的染料，实现闭管可视化检测，结果清晰可辨，不易受到干扰，检测灵活性、适应性强。

(3)对反应结果进行分析时，不仅适用于双链DNA、单链DNA，而且还适用于RNA(可利用逆转录酶将单链RNA逆转录为DNA，将该DNA作为模板，扩增双链核酸，就能够间接地检测RNA)。

(4)通过置入反应管的检测管，完成核酸扩增与分析的管内分隔，染料与模板、扩增试剂在反应前互不接触，可以在短时内实现基于核酸水平的检测。

Claims

1.一种闭管核酸扩增检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

1)从样品中提取核酸作为模板，将模板与扩增试剂于反应管中混合，得到反应体系，所述扩增试剂包括针对样品基因组某段目标检测序列设计的特异性扩增引物；同时在反应管中置入检测管，并将检测体系加入检测管中；位于检测管内的检测体系部分包裹或全部包裹于检测管外的位于反应体系液面以上的空气中；

或者，

从样品中提取核酸作为模板，将模板与扩增试剂于检测管中混合，得到反应体系，然后将检测管置入反应管中；同时，将检测体系加入反应管中；所述扩增试剂包括针对样品基因组某段目标检测序列设计的特异性扩增引物；位于检测管内的反应体系包裹于检测管外的检测体系中；

2)经过步骤1)后，关闭反应管并进行扩增反应；

3)反应结束后使反应产物与检测体系通过颠倒摇晃反应管而混匀，然后进行显色处理，然后对显色结果进行目视观察或分析；或者，反应结束后使反应产物与检测体系通过颠倒摇晃反应管而混匀，然后直接目视观察反应管内的颜色变化。

2.根据权利要求1所述一种闭管核酸扩增检测方法，其特征在于：通过在步骤1)中设置阴性对照并按照步骤2)使阴性对照进行扩增反应，获得用于与目标检测序列扩增结果进行目视比色的对照扩增结果，所述阴性对照的反应体系不含模板。

3.根据权利要求1所述一种闭管核酸扩增检测方法，其特征在于：所述样品选自采集自体内或环境中的生物样本。

4.根据权利要求1所述一种闭管核酸扩增检测方法，其特征在于：所述检测体系选自核酸染料或金纳米粒子标记探针。

5.根据权利要求1所述一种闭管核酸扩增检测方法，其特征在于：所述扩增反应选自PCR、LCR或LAMP。

6.根据权利要求1所述一种闭管核酸扩增检测方法，其特征在于：所述显色处理采用蓝光激发。

7.一种闭管核酸扩增检测装置，其特征在于：包括可透光的反应管以及设置在该反应管内的检测管，检测管内或检测管外设置有检测体系，检测体系通过封闭反应管而与外界隔离；

所述反应管内设置有通过检测管与检测体系分隔的扩增试剂；

位于检测管内的扩增试剂包裹于检测管外的检测体系中；或者，位于检测管内的检测体系部分包裹或全部包裹于检测管外的位于扩增试剂液面以上的空气中。