CN101712924A - 一种用于环介导等温扩增技术的反应管及其使用方法 - Google Patents

一种用于环介导等温扩增技术的反应管及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种用于环介导等温扩增技术的反应管，该反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板，A、B两个空腔中分别装有环介导等温扩增反应工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由石蜡封存。本发明的反应管通过隔板和石蜡的设计，有效地将显色液和工作液分隔开来，不仅能保证在储运过程中相对保持完整封闭性，而且无需打开管盖，就可以实现显色反应，大大降低气溶胶的污染。本发明的反应管保证了环介导等温扩增的检测快速、高效性，成本低廉，有利于大规模推广。

Description

一种用于环介导等温扩增技术的反应管及其使用方法
技术领域
本发明涉及环介导等温扩增技术，具体涉及一种可用于环介导等温扩增技术的反应管及其使用方法。
背景技术
PCR技术的出现使核酸水平的医学检测进入了一个全新的阶段，然而随着PCR技术的越来越广泛应用，它也面临着严峻的考验，由于核酸扩增技术的高灵敏度，使PCR出现了严重的气溶胶污染问题，从而使得PCR检测结果假阳性率增高，经过多年的努力，科研工作者发明了荧光定量PCR，彻底解决了PCR气溶胶污染的问题。然而荧光定量PCR的仪器成本太高，不适合现场快速检测，因此这项技术无法进行大规模的推广。
环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)技术将核酸检测技术推向了一个新的高度。LAMP是一种快速、灵敏、准确的核酸检测方式，其检测设备要求简单，只需有水浴锅即可，大大降低了设备成本的投入。此外，LAMP的扩增效率超强，表现在两个方面：(1)灵敏度比PCR高出的是数量级的差异；(2)扩增产物的DNA数量，也比PCR产物高出太多，能够达到几个ug，因此LAMP产物可以用荧光染料进行终点检测。虽然LAMP因为检测快速、简便、准确、不依赖仪器设备等优点越来越被推广使用，但是太过于灵敏和产物量的巨大，使得LAMP极易容易污染，尤其是在LAMP扩增反应后需要反应管开盖加入显色剂，就很容易出现气溶胶污染，而气溶胶污染会使得检测结果假阳性率高，并且污染其他样品，污染检测区域，同时还难以去除，因此如何解决LAMP所面临的气溶胶污染，是本领域技术人员当前急需解决的一个技术难题。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种成本增加量不到3％，且能解决LAMP反应气溶胶污染问题，保证LAMP检测准确性、快速性的，用于环介导等温扩增技术的反应管。
本发明的另一个目的在于提供上述反应管的使用方法。
本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的：
一种用于环介导等温扩增技术的反应管，该反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。
上述用于环介导等温扩增技术的反应管，其管体和隔板为一体成型。
上述用于环介导等温扩增技术的反应管，其隔板的高度为管体高度的1/4～1/3。
上述用于环介导等温扩增技术的反应管，其A、B两个空腔中分别装有环介导等温扩增反应工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由石蜡封存，所述环介导等温扩增反应工作液为环介导等温扩增反应液和Bst DNA聚合酶的混合。
上述用于环介导等温扩增技术的反应管，石蜡选择熔点小于10℃的石蜡品种，如广州市德隆化工贸易有限公司生产的巴拿芬蜡，可以在10℃以下将两个空腔内的液体有效封存，使两个空腔内的液体在受到机械震荡时不会泄露，又能使移液器的枪头轻易刺破而不影响样品的加入。
上述反应管的制备方法，包括如下步骤：
(1)取加工成型的反应管，该反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板；
(2)将环介导等温扩增反应工作液(LAMP反应液)和Bst DNA聚合酶，放入空腔A(或者B)中，LAMP反应液和Bst DNA聚合酶的合称环介导等温扩增反应工作液，工作液上层用石蜡密封；将LAMP显色液放入空腔B(或者A)中，显色液上层用石蜡密封。
本发明的反应管主要是针对需要做大批量LAMP反应时，可简化操作步骤，解决气溶胶污染等问题，按照实际反应需要，确定LAMP反应液配方，以及Bst DNA聚合酶的用量，然后制备大量相应的反应管，使用的时候只需将适量的样品加入管底空腔A的工作液中，进行LAMP反应即可。
上述反应管的使用方法，具体包括如下步骤：
(1)先打开反应管的管盖，选择装有LAMP工作液的那个空腔，将待测样品加入LAMP工作液中；因为加样通常是采用微量进样器加样，进样器的枪头在通过液封的石蜡时并不会对其造成太大的影响，当加样结束，取出枪头的时候，石蜡会自动愈合，从而实现对反应体系的有效封存；
(2)加样结束后，将反应管水浴中进行LAMP反应，LAMP反应的常用反应温度为63～65℃。在反应过程中，由于空腔A和空腔B均分别被石蜡密封又有隔板分隔，因此是两个相对独立的小室，工作液和显色液之间不会发生任何形式的相互渗漏；
(3)LAMP反应结束后，将反应管倒置甩动两次，再正放甩动两次，使显色液与工作液能够充分混合，室温放置，观察LAMP反应产物与管底显色液的显色结果。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明的反应管通过隔板和石蜡的设计，有效地将显色液和工作液分隔开来，不仅能保证在储运过程中相对保持完整封闭性，而且无需打开管盖，就可以实现显色反应，大大降低气溶胶的污染；
2.本发明不但保证了LAMP的检测快速、高效性，而且成本低廉、可在不开盖的情况下完成整个LAMP检测。
附图说明
图1为本发明反应管开盖时的工作状态示意图；
其中，1为管体，2为管盖，3为空腔B，4为空腔A，5为隔板；
图2为本发明反应管合盖时的工作状态示意图；
其中，1为管体，2为管盖，3为空腔B，4为空腔A，5为隔板；
图3为本发明反应管制作过程示意图；
其中，1为空腔A，2为空腔B，3为石蜡，4为LAMP反应工作液，5为LAMP反应显色液，6为待测样品。
图4为本发明反应管的LAMP反应使用过程示意图；
其中，1为空腔A，2为空腔B，3为石蜡，4为LAMP反应工作液，5为LAMP反应显色液，6为待测样品；
图5为实施例3中特异性检测试验的结果图；
其中，1为阳性对照，2为阴性对照，3～8是李斯特氏菌、大肠杆菌O157、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌和变形杆菌，9为沙门氏菌；
图6为实施例3中灵敏度检测试验的结果图；
其中，1为阳性对照，2为阴性对照；3～10分别为10-1～10-8浓度级的沙门氏菌。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步地描述，但具体实施例并不对本发明做任何限定。
本发明的反应管，如图1和图2所示，由管体1和管盖2两部分组成，管体1内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板5。
实施例1
如图3所示，本实施例的反应管，由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板，其中：空腔A内装有22.0微升的LAMP反应液和0.5微升的Bst DNA聚合酶，液体上层由石蜡封存；空腔B内装有2.0微升的LAMP反应显色液，液体上层也由石蜡封存，将该反应管-20℃保存。
实施例2结核分歧杆菌的检测
本实施例采用实施例1制备所得反应管(反应液中的引物选择已知的结核分歧杆菌检测用引物组)，对结核分歧杆菌进行LAMP检测，同时设有阳性对照组和阴性对照组，其过程如图4所示，具体包括如下步骤：
取实施例1制备的反应管三支，分别加入阴性对照样品、阳性对照样品和待检测样品各2.5μL，加样时枪头穿透保护液层，样品加至华峰管大腔内，盖紧管盖并做好标记，移至反应区。
将上述反应管均于65℃恒温反应1h。
反应结束，将反应管倒置甩动1次，再正置甩动1次，使工作液与显色液充分混合均匀后观察。
若反应管与阳性对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现橙色则为阴性。
观察反应结果，检测准确率高，而且LAMP反应过程中，显色液与工作液密封状态好，没有发生互相泄露的情况，后期显色反应时，倒置甩动操作使得显色液和工作液混合，显色结果清晰。
实施例3沙门氏菌的检测
本实施例采用实施例1制备所得反应管(反应液中的引物选择已知的沙门氏菌检测用引物组)，对沙门氏菌进行LAMP检测，同时设有阳性对照组和阴性对照组，其过程如图4所示，具体包括如下步骤：
取实施例1制备的反应管三支，分别加入阴性对照样品、阳性对照样品和待检测样品各2.5μL，加样时枪头穿透保护液层，样品加至华峰管大腔内，盖紧管盖并做好标记，移至反应区。
将上述反应管均于65℃恒温反应1h。
反应结束，将反应管倒置甩动1次，再正置甩动1次，使工作液与显色液充分混合均匀后观察。
若反应管与阳性对照管一样显现绿色则为阳性，若反应管与阴性对照管一样显现橙色则为阴性。
观察反应结果，检测准确率高，而且LAMP反应过程中，显色液与工作液密封状态好，没有发生互相泄露的情况，后期显色反应时，倒置甩动操作使得显色液和工作液混合，显色结果清晰。
本实施例还进行了特异度试验，采用实施例1制备所得反应管对1株沙门氏菌和6株非沙门氏菌进行检测，结果发现沙门氏菌的检测结果为阳性，6株非沙门氏菌的检测结果均为阴性，说明本发明的反应管能够保证LAMP所需的高特异性，检测结果如图5所示。
本实施例还进行了灵敏度试验，制备沙门氏菌10-1～10-8共7个浓度的样品，采用实施例1制备所得反应管进行检测，结果发现7个浓度的沙门氏菌均能被检测出来，由此说明本发明的反应管能够保证LAMP反应所需的灵敏度，检测结果如图6所示。

Claims (6)

1.一种用于环介导等温扩增技术的反应管，其特征在于该反应管由管体和管盖两部分组成，管体内腔的下部设有将其分隔成A、B两个空腔的纵向延伸的隔板。
2.根据权利要求1所述反应管，其特征在于所述管体和隔板为一体成型。
3.根据权利要求1所述反应管，其特征在于所述隔板的高度为管体高度的1/4～1/3。
4.根据权利要求1所述的反应管，其特征在于所述A、B两个空腔中分别装有环介导等温扩增反应工作液或显色液，两个空腔中的液体上层均由石蜡封存，所述环介导等温扩增反应工作液为环介导等温扩增反应液和Bst DNA聚合酶的混合。
5.根据权利要求4所述的反应管，其特征在于所述石蜡为熔点低于10℃的石蜡。
6.权利要求4所述反应管的使用方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
(1)打开反应管管盖，选择装有环介导等温扩增反应工作液的空腔，将待测样品加入到环介导等温扩增反应工作液中；
(2)加样结束后，将反应管进行环介导等温扩增反应；
(3)环介导等温扩增反应结束后，将反应管倒置甩动使显色液与工作液充分混合，室温放置，观察显色结果。
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