CN105199940A - 一种防污染便携式基因检测方法及装置 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种防污染便携式基因检测方法和装置，操作流程为将含有扩增产物的PCR管放入装置内进行密封，然后通过一系列简易的人工操作得出肉眼可视的检测结果；可快速检测靶核酸扩增产物，并能防止核酸扩增产物污染，避免假阳性；可在临床传染病病原体检测、食品致病菌检测以及农业工业海关牧业等领域在基因水平上的种类鉴定等方面得到应用。

Description

一种防污染便携式基因检测方法及装置

技术领域

本发明涉及一种防污染便携式基因检测方法及装置，更具体的说，涉及利用核酸薄膜层析（试纸条）技术在防污染便携式基因检测装置中快速检测靶核酸序列扩增的方法，本发明还涉及了利用该防污染便携式基因检测装置快速检测靶核酸扩增产物的试剂盒及其在检测传染病病原体中的用途。

背景技术

核酸研究已有100多年的历史，20世纪60年代末、70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术，1983年美国科学家KaryMullis驱车在蜿蜒的州际高速公路上行驶，孕育出了PCR的雏形。经过两年的努力，在实验上证实了PCR的构想，并于1985年申请了有关PCR的第一个专利，在science杂志上发表了第一篇PCR学术论文。从此PCR技术得到了生命科学界的普遍认同。KaryMullis也因此获得了诺贝尔化学奖。

核酸扩增反应实现了对微量的核酸样本的扩增与检测，已经广泛应用于生物医药等领域中。目前，已经发展了包括聚合酶链式反应PCR、核酸环介导等温扩增反应LAMP、依赖核酸序列的扩增NASBA、滚环扩增反应RCA、连接扩增反应LCR、解旋酶依赖的核酸扩增反应HAD等多种核酸扩增方法。但是，这些基于目标序列的核酸扩增方法存在扩增产物易交叉污染的问题，由产物污染产生的假阳性信号会造成检测结果的错误判读。在靶核酸扩增操作过程中常可见样本间的交叉污染，污染可能来自阴性样本处理过程中引入的已知或未知的阳性物质，其通过空气污染或气溶胶造成假阳性反应；然而更为常见的一种情况是：上次靶核酸扩增的产物形成气溶胶，成为下次靶核酸反应的模板，即造成了PCR污染，其原因为实验操作人员在靶核酸扩增反应结束后，必须打开PCR反应管的管盖，吸出扩增产物，进行凝胶电泳或其它必须开盖式的传统检测方法检测，此过程中靶核酸扩增的产物极易形成气溶胶。极其微量的样品靶序列污染片段经扩增，在短时间内可放大上百万倍，从而影响检测结果判定。尽管已发展了一系列方法来防止扩增产物的交叉污染，如对PCR操作进行严格的分区控制、采用闭管扩增与检测的方法、利用酶解方法消除污染的方法等，但这些方法对实验条件以及操作人员要求较高，且人为因素影响较大。此外，基于扩增产物的检测方法，传统的实时荧光定量检测方法需要集成庞大、昂贵、精密的光学设备，不利于装置的小型化开发和应用于现场检测。目前新兴的非光学检测方法如电化学方法、HNB比色法、浊度法，对装置的要求大为简化，但这些方法有的需要开盖操作，极容易造成气溶胶污染；有的检测灵敏度不高，结果不易判断。虽然目前已有多种集扩增以及检测一体化的装置与设备，它们能够在一个封闭的体系中实现对待测核酸的扩增与检测，极大地避免了样本扩增及检测过程中的污染，有效的提高了核酸检测的准确性与可操作性。但这些装置构造复杂、均需使用荧光探针且设备价格昂贵。另外，在核酸扩增产物的检测中需要特殊的装置、熟练的检查技术。因此，开发密闭、小型化、便携式的核酸检测装置，将其与现有的检测方法相结合显得越来越重要。

发明内容

本发明提供一种防止靶核酸扩增物交叉污染，避免假阳性的快速检测靶核酸扩增物的方法。

本发明提供一种在全封闭环境中应用核酸检测试纸条检测经普通PCR、恒温扩增或其他方法扩增的产物的便携式基因检测装置。

本发明方法的技术要点在于，在扩增反应结束后，把反应管在不开盖的情况下放入本发明所述的密闭性装置内，在该密闭性装置内反应管被割破，随后反应管内扩增产物流到玻璃纤维纸上，然后按压溶液储藏室顶端使溶液储藏室内的尖锐体刺破封闭隔，使缓冲液也流入玻璃纤维纸上，并带动扩增反应物转移到另一边的检测试纸条上，判读结果。

上述方法中扩增反应结束后，不打开反应管的管盖，可以避免靶核酸扩增产物释放至空气中形成严重的气溶胶污染；在这个完全密闭的装置内可以对扩增产物进行试纸条检测；检测后不打开该密闭性装置，可将其全部废弃于安全处。整个过程在密闭环境中进行，能有效地防止靶核酸扩增物交叉污染，避免假阳性。

本发明的方法适用于检测所有的靶核酸序列，能迅速而可靠的确定特异性扩增靶核酸的存在与否。

本发明的防污染便携式基因检测装置与常规靶核酸检测技术相比，主要有以下优点：

(1)全密闭式检测。整个过程都是无须开盖的，且是密封的，很好的避免了因为开盖而造成的靶核酸扩增产物的污染：PCR反应管从核酸扩增结束到置入离心管，均是封闭的.

(2)核酸试纸条检测。整个检测过程只需五分钟左右的时间；

(3)整个过程操作简单、快速、只需较少人力成本，且无需其他任何仪器。

本发明的防污染便携式基因检测装置在会实际应中的优势表现在：

1）由于该装置可使靶核酸扩增产物的检测在完全密闭状态下完成，大大降低了传统核酸检测法中扩增结束后由于下游检测需开盖而造成的污染。

2）由于这一装置操作简单、快速、成本低及防止靶核酸扩增物污染的效果显著，对在生物学领域工作的技术人员来说，有着很大的帮助。

3）由于核酸扩增检测技术的广泛使用，所以本发明的这项装置可以应用于所有需要使用核酸扩增检测技术法来检测的领域。如临床传染病病原体检测、食品致病菌检测以及农业工业海关牧业等领域在基因水平上的种类鉴定和基因突变检测等方面的应用。

附图说明

图1是防污染便携式基因检测装置的结构图。

图2为防污染便携式基因检测装置的另外几种形态图。

图3是试纸条的结构图。

图4是操作流程图。

图5是实施例1的反应结果图。

图6是实施例2的反应结果图。

具体实施方式：

本实施方式所述的内容只是举例说明本发明，并非限制本发明。下面，利用附图对本发明的实施方式进行说明。

附图1说明了本发明的防污染便携式基因检测装置的结构。如图1所示，一种防污染便携式基因检测装置，其包括PCR固定盒（2）和底座（5）两部分。其中，固定盒（2）带有螺旋管盖（1），用于置放含有扩增产物（17）的PCR管（3），固定盒底端通过一刀片（4）与底座（5）相连；底座（5）包括含有缓冲液（6）和在顶端（8）固定的尖锐体（7）的溶液储藏室（11）、带有刀片（4）的容纳单元（9）、封闭隔（10）、带有试纸条（13）的透明窗（12）的试纸条密封部分（14）、放置在容纳单元（9）并相连于透明窗（12）和溶液储藏室（11）底部的玻璃纤维纸（15）和溶液储藏室套盖（16）。

根据本发明的更优选实施方案，在上述方法中，如果PCR管的管盖有突出部分，可以用剪刀钳剪切PCR管盖成圆形，但不破坏PCR管的密闭性，又能使PCR管顺利置入螺旋管内，起到对PCR管一个相对定位的作用。

在本发明的另一个优选的实施方案中，防污染便携式基因检测装置还包括一个外盒，对整体装置起到保护、美化外观和便于操作的作用。

附图2说明了防污染便携式基因检测装置的另外几种形态。其中，底座（5）上的透明窗（12）和/或者溶液储藏室（11）可以和底座（5）在一条直线上，也可以和底座（5）成一定的夹角。

附图3是试纸条的平面图，试纸条从左到右按顺序有样本垫、胶体金结合垫、NC硝酸纤维素膜和吸水材料（吸水滤纸垫），上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上还设有检测线T和质控线C。

附图4说明了本装置的操作流程。将含有扩增产物（17）的PCR管（3）利用剪刀钳剪切管盖成圆形并垂直放入固定盒（2），旋紧螺旋管盖（1），由于螺旋管盖（1）正向旋转产生的压力，PCR管（3）被刀片（4）割破，扩增产物流入穿过刀片的玻璃纤维纸（15），随后按压溶液储藏室（11）的顶端（8），使尖锐体（7）刺穿封闭隔（10），使得缓冲液（6）流到玻璃纤维纸（15）上并带动扩增产物（17）转移到另一边的检测试纸条上（13），五分钟后判读结果，检测后不打开密封的装置，将其整体弃于安全处。

优选的，PCR管被割破是在PCR管固定盒的螺旋管盖完全合上形成一个密闭空间时开始的，至螺旋管盖完全盖死时割破产生的破口最大。

优选的，此装置整体选用的材料是重量轻的，坚硬且结实的材料。

所述实施例说明了本发明。所述实施例并非以任何形式限制本发明，在本发明范围内可做各种修改。

实施例1

HPV18型病毒的恒温扩增检测

1）依赖重组酶恒温扩增反应试剂的具体成分如下：

2）分别按照实施例1的反应体系配制两管试剂，并在体系中添加HPV18型的正向引物、反向引物和荧光探针，两管体系分别编号为1号反应管和2号反应管，然后，在1号反应管中加入2ulhela细胞，在2号反应管中加入2ul人基因组DNA作为阴性对照，将体系用无菌水补足到20ul。

正向引物（biotin标记）：20pmol

反向引物：20pmol

FITC标记的探针15pmol

3)混匀后将1号反应管和2号反应管放入37℃恒温水浴锅中进行反应，20min后取出反应管，95℃，10min变性。将两管反应管分别放入两个本发明的密闭装置内，盖好螺旋盖，随后挤压溶液储藏室外壁，结果可见检测1号反应管的试纸条上有C线（质控线）和T线（测试线）两条带，即为阳性；检测2号反应管的试纸条上只有C线（质控线）一条带，即为阴性。（结果见附图5）。

实施例2

HPV18型病毒的一般PCR扩增检测

1）具体成分如下：

2）分别按照实施例2的反应体系配制两管试剂，两管体系分别编号为1号反应管和2号反应管，然后，在1号反应管中加入2ulhela细胞，在2号反应管中加入2ul人基因组DNA作为阴性对照，将体系用无菌水补足到20ul。

正向引物（biotin标记）：4pmol

反向引物：4pmol

3）在RCR扩增仪上设置扩增条件如下：

95℃---——15min94℃——30s；55℃——30s；72℃——45s72℃——10min

（40个循环）

4）检测：

将两管反应管分别放入两个本发明的密闭装置内，盖好螺旋盖，随后挤压溶液储藏室外壁，结果可见检测1号反应管的试纸条上有C线（质控线）和T线（测试线）两条带，即为阳性；检测2号反应管的试纸条上只有C线（质控线）一条带，即为阴性。（结果见附图6）

Claims (8)

1.一种防污染便携式基因检测方法及装置，是在扩增反应结束后，将反应管在不开盖的情况下放入密闭性的装置内，在该密闭性装置内反应管被破壁，反应管中的靶核酸扩增产物流出并转移至试纸条上发生反应，随后以肉眼可见的形式判读结果，检测后不打开装置，将其整体废弃于安全处。

2.根据权利要求1所述的装置，其组成包括PCR固定盒（2）和底座（5）两部分，其中，固定盒（2）密封且一端具有螺旋管盖（1），用于置放含有扩增产物（17）的PCR管（3），固定盒底端通过一刀片（4）与底座（5）相连；底座（5）包括含有缓冲液（6）和在顶端（8）固定尖锐体（7）的溶液储藏室（11）、带有刀片（4）的容纳单元（9）、封闭隔（10）、带有试纸条（13）的透明窗（12）的试纸条密封部分（14）、放置在容纳单元（9）并相连于透明窗（12）和溶液储藏室（11）底部的玻璃纤维纸（15）和溶液储藏室套盖（16）。

3.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，

所述PCR固定盒（2）和底座（5）两部分是密封相连，不可拆分的；

所述PCR管（3）是刚好能够正向垂直放入PCR固定盒（2）的，且PCR管（3）放入PCR固定盒（2）后，其突出PCR固定盒（2）3-10mm；

所述螺旋管盖（1）的高度大于PCR管（3）突出PCR固定盒（2）的部分，且其直径也稍大于PCR管（3）的直径，这样螺旋管盖（1）能固定并且覆盖PCR管（3）突出PCR固定盒（2）的部分；

所述刀片（4）突出PCR固定盒（2）的部分大于等于PCR管（3）突出PCR固定盒（2）的部分；

所述刀片（4）突出PCR固定盒（2）的部分大于等于PCR管（3）突出PCR固定盒（2）的部分；

所述螺旋管盖（1）盖上后正向旋转两或者三圈时，螺旋管盖（1）对PCR管（3）没有产生任何压力，并在此时，整个装置处于密闭状态，在随后的3-5圈的旋转中，螺旋管盖（1）对PCR管（3）产生压力，使其被刀片（4）割破；

所述底座（5）上的溶液储藏室（11），其顶端（8）的材质是坚固而又富有一定弹性的，其可向内压缩，在顶端（8）固定有尖锐体（7），尖锐体（7）可轻易戳破封闭隔（10）；

所述的溶液储藏室（11），由于其外壁富有一定的弹性，为了避免尖锐体（7）意外刺穿封闭隔（10），在溶液储藏室（11）设计了一个类似于笔筒与笔盖关系的溶液储藏室套盖（16）；

所述试纸条（13）被固定于透明窗（12）内，并且通过玻璃纤维纸（15）与容纳单元（9）和溶液储藏室（11）相连。

4.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，

一旦螺旋管盖扭紧，则无需再打开，从而防止盒内的扩增物外泄而造成污染。

5.根据权利要求2所述的防污染便携式基因检测装置，其管盖不一定非要是螺旋状的，也可以设计成橡胶塞或者其他可用的材质，其管盖密封方式也不一定非要是螺旋，也可以是直接塞入式或者其他可行方式。

6.根据权利要求2所述的装置，其特征在于，

构成整个装置的材料坚固扎实，材料可以为透明或者不透明的（透明窗必须使用透明材料）。

7.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，

底座（5）上的透明窗（12）和溶液储藏室（11）可以和底座（5）在一条直线上，也可以和底座（5）成一定的夹角。

8.根据权利要求2所述的装置，其外还可以含有一个外壳，将装置整体或者部分容纳其中。