CN111548900A - 一种用于核酸扩增及检测的装置和检测方法 - Google Patents

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CN111548900A CN201910110662.7A CN201910110662A CN111548900A CN 111548900 A CN111548900 A CN 111548900A CN 201910110662 A CN201910110662 A CN 201910110662A CN 111548900 A CN111548900 A CN 111548900A
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吴坚
伍辉
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Abstract

本发明提供了一种用于核酸扩增及检测的装置及加盖式不开盖核酸扩增及检测检测方法能够在核酸扩增反应后引入CRISPR系统检测试剂，但不会产生扩增物气溶胶污染的，并且该装置可用于后续可视化检测。该装置包括管体、第一层过流密封元件、第二层密封元件、密封承载薄膜、穿刺物；管体的上端具有与第一层过流密封元件连接的接口；第一层过流密封元件具有和管体连接的下部接口和与第二层密封元件连接的上部接口，所述的密封承载薄膜与第一层过流密封元件连接或处在第一层过流密封元件和管体之间；第二层密封元件层设有与第一层过流密封元件的上部接口连接的连接部位；第二层密封元件设置穿刺物，所述穿刺物用于穿破所述密封承载薄膜。

Description

一种用于核酸扩增及检测的装置和检测方法
技术领域
本发明属于核酸扩增和检测的领域，其具体内容涉及到一种用于核酸扩增及检测的装置和检测方法。
背景技术
由于核酸分子具有较强的稳定性、特异性等优点，许多研究者将核酸作为目标物来对转基因作物及制品、肉类及制品、微生物、病毒等进行检测。在核酸检测过程中，往往需要对核酸先进行扩增，使其达到可检测的数量范围。核酸扩增技术根据扩增过程是否需要变温，分为变温扩增与恒温扩增两大类。变温扩增最常见的就是三温区PCR(聚合酶链式反应)反应技术。该技术是目前应用最为广泛的核酸扩增技术，其主要分为三部分：高温变性、低温退火和中温延伸。也有许多科研人员研究二温区的PCR反应，将退火与延伸安排在一个温度条件下进行，也可实现核酸扩增。但不管怎样，PCR反应技术都需要高温，对设备及装置要求较高。为此，以LAMP(环介导等温扩增)、RPA(重组酶聚合酶等温扩增)等为代表的核酸恒温扩增技术越来越受到人们的喜爱。由于核酸扩增技术将核酸分子实现了百万倍扩增，不可避免的会产生一定的气溶胶污染，对实验结果产生干扰。另外，这些核酸扩增技术的特异性并不是特别高，有时候在实验过程中会出现一些非特异性扩增，造成假阳性，干扰实验结果。
在核酸可视化检测过程中，常见的是利用荧光嵌入染料(Ethidium Bromide、SYBRGreen、SYTO 9、EvaGreen等)与核酸结合产生特定波长荧光，从而对核酸扩增产物进行检测。由于这些染料结合具有非特异性，因此当核酸扩增过程中产生非异性扩增产物时，这些荧光嵌入染料也能与非特异性扩增产物结合产生特定波长荧光，从而干扰实验结果。CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPRassociated)系统是一种广泛存在原核生物中的，由RNA介导的获得性免疫系统，主要用来抵抗外来遗传物质的入侵，比如噬菌体病毒、质粒等。由于CRISPR-Cas系统能够对核酸片段进行特异识别并进行切割，常被研究人员用来进行基因编辑。随着type V酶功能的发现，人们开始尝试将CRISPR-Cas系统用于核酸特异性检测。type V酶能够在guide RNA的辅助下识别目的核酸并进行切割，在切割目的核酸的过程中还能对非特异性单链DNA进行切割。
目前，已有一些研究人员将CRISPR-Cas系统与RPA核酸扩增技术结合进行核酸特异性检测。由于绝大多数CRISPR-Cas系统的酶工作温度在37℃，在高温下这些酶将或迅速失活，因此很难将其应用在PCR、LAMP等需要超过60℃才能进行的核酸扩增反应中。如果在反应后引入CRISPR-Cas系统，需要开盖，往往会产生扩增物气溶胶污染，干扰实验结果。针对这些问题，本发明提出了一种基于核酸扩增及检测的反应装置。
发明内容
本发明首先所要解决的技术问题是提供一种能够在核酸扩增反应后引入CRISPR系统检测试剂，但不会产生扩增物气溶胶污染的用于核酸扩增及检测的装置，并且该装置可用于后续可视化检测。为此，本发明采用以下技术方案：
一种用于核酸扩增及检测的装置，包括管体，其特征在于所述装置还包括第一层过流密封元件、第二层密封元件、密封承载薄膜、穿刺物；
管体的上端具有与第一层过流密封元件连接的接口；
第一层过流密封元件具有和管体连接的下部接口和与第二层密封元件连接的上部接口，所述的密封承载薄膜与第一层过流密封元件连接或处在第一层过流密封元件和管体之间；
第二层密封元件层设有与第一层过流密封元件的上部接口连接的连接部位；第二层密封元件设置穿刺物，所述穿刺物用于穿破所述密封承载薄膜。
所述反应容器的管体、第一层过流密封元件和第二层密封元件可以均为一体成型的或者由独立组件组装成型。管体的材质为玻璃或者塑料等高分子材料，其为透明材质，或其它适用于可视化检测的能辨认内部颜色的材质。第一层过流密封元件、第二层密封元件和尖锐状穿刺物的材质为玻璃、塑料或者金属等，可以为透明材质，也可以为不透明材质。
进一步地，所述密封承载薄膜设置在第一层过流密封元件上，将所述上部接口和下部接口隔开，或设置在第一层过流密封元件的下部接口处。
进一步地，第一层过流密封元件的中部具有台阶，所述密封承载薄膜设置在台阶上。
进一步地，所述第二层密封元件为核酸扩增后的检测工作时的密封盖，所述穿刺物设置在所述盖的内侧顶面上。
进一步地，所述穿刺物的长度满足在第二层密封件和所述第一层过流密封元件基本密封连接时，穿刺物再穿破所述密封承载薄膜。
进一步地，所述反应容器的管体、第一层过流密封元件、第二层密封元件三者之间可通过螺纹但不限于螺纹进行连接。
所述反应容器的管体、第一层过流密封元件、第二层密封元件之间的连接需保证密封性。
本发明还提供一种加盖式不开盖核酸扩增及检测检测方法，能够在核酸扩增反应后引入CRISPR系统检测试剂，但不会产生扩增物气溶胶污染，可用于后续可视化检测。为此，本发明采用以下技术方案：
一种加盖式不开盖核酸扩增及检测检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)在管体中加入核酸扩增反应体系及模板；
(2)将密封承载薄膜及能够和盖连接的结构连接在管体上，并将管体封闭，
(3)待核酸扩增反应结束后，在密封承载薄膜上加CRISPR系统的检测试剂；然后盖上带有能穿破密封承载薄膜的穿刺物的盖，在所述盖与所述能和盖连接的结构连接时，穿刺物穿破密封承载薄膜，转由所述盖进行封闭；
(4)将检测试剂和管体中的核酸反应扩增子混合及反应，进行可视化检测。
本发明的上述装置能够应用上述检测方法，将核酸扩增反应液与模板置于管体中，将第一层过流密封元件连接在管体上，或者将密封承载薄膜放置在管体上，用第一层过流密封元件连接在管体上时将密封承载薄膜固定住，可将扩增反应液与外界环境完全隔离；然后将管体置于相应的核酸扩增条件下进行核酸扩增。扩增结束后，待管体的温度降至CRISPR系统的酶可工作的温度时，将CRISPR系统的检测试剂滴加到密封承载薄膜上，这时密封承载薄膜和第一层过流密封元件的组合起到两个作用，第一是隔绝核酸扩增液和外界环境，起到密闭作用；第二是作为一个容器，容纳CRISPR系统的检测试剂；之后，将第二层密封元件与第一层过流密封元件连接，在第二层密封元件已与第一层过流密封元件进行了一定的连接时，穿刺物刺破密封承载薄膜。最后将CRISPR系统的检测试剂引入到核酸扩增反应液中反应，进行后续检测。
本发明的上述装置和检测方法可以适用于各种CRISPR系统检测试剂进行核酸检测，操作简单，并能防止扩增物气溶胶污染。
在上述装置的基础上，本发明还提供了一种可用于特异可视化检测核酸扩增产物的CRISPR-Cas系统的检测试剂。所述的CRISPR-Cas系统的检测试剂包含Cas蛋白、缓冲液、引导RNA序列(gRNA)、单链DNA荧光探针、RNA酶抑制剂、无菌水等。所述检测试剂中，Cas蛋白的工作浓度范围为0.1μM至1.5μM；引导RNA序列(gRNA)的工作浓度不小于Cas蛋白的浓度；单链DNA荧光探针的工作浓度介于1μM至10μM。Cas蛋白可采用Cas12a或者有与Cas12a的旁路单链DNA切割活性类似的Cas蛋白。
进一步地，gRNA的工作浓度为1.5μM至10μM。
在本发明的一个方面，所述的反应装置与CRISPR-Cas系统的检测试剂结合应用于特异可视化检测核酸扩增产物，本发明提供了一种利用所述反应装置进行基于CRISPR-Cas系统的特异可视化检测核酸扩增产物的方法，其特征在于，所述反应装置可以在避免气溶胶污染的情况下，在核酸扩增反应结束后引入CRISPR-Cas系统的检测试剂。将核酸扩增反应液与模板加入到管体中，然后将第一层过流密封元件与管体进行连接，利用密封承载薄膜将核酸扩增反应液与外部环境相隔离开。此时还未加入CRISPR-Cas系统的检测试剂，在完成核酸扩增反应后，将CRISPR-Cas系统的检测试剂加在密封承载薄膜上，然后将第二层密封元件与第一层过流密封元件进行连接，在连接的过程中，第二层密封元件上的尖锐状穿刺物的长度可保证在其刺破密封承载薄膜之前，第二层密封元件已与第一层过流密封元件进行了一定的连接，可防止核酸扩增子在尖锐状穿刺物刺破密封承载薄膜之后扩散到环境中造成扩增物气溶胶污染。最后通过离心将CRISPR-Cas系统的检测试剂引入到核酸扩增反应液中，孵育一段时间后，利用特定波长的LED灯或紫外灯等简易光源照射进行结果的可视化观察与判断。孵育的反应温度为20℃至48℃，更优选地，反应温度为25℃至40℃，更优选地，反应温度为32℃至38℃；孵育的反应时长为1至20分钟，更优选地，反应时长为1至10分钟，更优选地为1至5分钟。
进一步地，核酸扩增反应液与CRISPR-Cas系统的体积比为1:30至1:1。
在本发明的另一个方面，所述核酸扩增反应可以是恒温核酸扩增反应(LAMP、RPA、CPA等)，也可以是变温核酸扩增反应(三温区PCR反应、二温区PCR反应等)。本发明提供了用于检测CaMV35S启动子的LAMP扩增反应与三温区PCR扩增(以下所述PCR扩增均为三温区PCR反应)反应的扩增体系和扩增程序。LAMP扩增体系主要考虑DNA聚合酶浓度、引物浓度、镁离子浓度，其扩增程序主要考虑反应温度；PCR扩增体系主要考虑DNA聚合酶浓度、引物浓度，其扩增程序主要三个温区各自设定的反应温度以及每个温区所需的反应时间。
(1)在检测CaMV35S启动子的LAMP扩增体系中，DNA聚合酶采用具有链替换功能的聚合酶，其浓度范围为5U至30U，优选地，DNA聚合酶的浓度范围8U至25U，更优选地，DNA聚合酶的浓度范围为12U至18U。
(2)在检测CaMV35S启动子的LAMP扩增体系中，包含一对内部引物FIP与BIP、一对外部引物F3与B3和一对环引物LF与LB。内部引物的浓度范围为0.5μM至4μM，优选地，内部引物的浓度范围为1μM至3μM，更优选地，内部引物的浓度范围为1.5μM至2μM；外部引物的浓度范围为0.05μM至0.5μM，优选地，外部引物的浓度范围为0.1μM至0.5μM，更优选地，外部引物的浓度范围为0.2μM至0.3μM；环引物的浓度范围为0μM至1μM，优选地，环引物的浓度范围为0.2μM至0.8μM，更优选地，环引物的浓度范围为0.4μM至0.5μM；进一步地，内部引物、外部引物与环引物之间的浓度比为8:1:2。
(3)在检测CaMV35S启动子的LAMP扩增体系中，镁离子的浓度范围为2mM至8mM，优选地，镁离子的浓度范围为2mM至6mM，更优选地，镁离子的浓度范围为4mM至6mM。
(4)在检测CaMV35S启动子的LAMP扩增程序中，反应温度范围为62℃至67℃，优选地，反应温度范围为62℃至65℃，更优选地，反应温度范围为63℃至65℃。
(5)在检测CaMV35S启动子的PCR扩增体系中，DNA聚合酶的浓度范围为0.3U至2.5U，优选地，DNA聚合酶的浓度范围为0.5U至1.5U，更优选地，DNA聚合酶的浓度范围为0.5U至1.0U。
(6)在检测CaMV35S启动子的PCR扩增体系中，引物的浓度范围为0.2μM至0.8μM，优选地，引物的浓度范围为0.2μM至0.6μM，更优选地，引物的浓度范围为0.4μM至0.6μM。
(7)在检测CaMV35S启动子的PCR扩增程序中，PCR反应每个循环需要三个温度(变性温度、退火温度和延伸温度)，变性温度的范围为90℃至98℃，优选地，变性的温度范围为92℃至96℃，更优选地，变性温度范围为92℃至95℃；退火温度的范围为55℃至65℃，优选地，退火温度的范围为58℃至65℃，更优选地，退火温度的范围为60℃至64℃；延伸温度的范围为70℃至76℃，优选地，延伸温度的范围为72℃至76℃，更优选地，延伸温度的范围为72℃至74℃。
(8)在检测CaMV35S启动子的PCR扩增程序中，PCR反应中处于变性温度的反应时间范围为10s至60s，优选地，处于变性温度的反应时间范围为20s至60s，更优选地，处于变性温度的反应时间范围为30s至40s；PCR反应中处于退火温度的反应时间范围为20s至60s，优选地，处于退火温度的反应时间范围为20s至40s，更优选地，处于退火温度的反应时间范围为30s至40s；PCR反应中处于延伸温度的反应时间范围为30s至90s，优选地，处于延伸温度的反应时间范围为30s至60s，更优选地，处于延伸温度的反应时间范围为30s至40s。
本发明利用所述反应装置可以在核酸扩增反应结束后，在避免出现扩增物气溶胶污染的情况下，引入CRISPR系统的检测试剂，对核酸扩增产物进行特异可视化检测。另外，所述反应装置可以将核酸扩增反应与反应后检测试剂进行彻底分开，使得反应后检测试剂不受核酸扩增过程中温度的影响。因此，所述反应装置能适应于基于CRISPR系统检测的核酸恒温扩增反应或者核酸变温扩增反应。
附图说明：
图1-1、1-2、1-3分别为本发明反应装置的管体、第一层过流密封元件、第二层密封元件的示意图。
图2为本发明的反应装置结合CRISPR-Cas系统的检测试剂用于特异检测核酸扩增产物方法原理图。
图3为实施例1的结果图，其中“1”代表阴性样本，“2”代表阳性样本。
图4为实施例2的结果图，其中“1”代表阴性样本，“2”代表阳性样本。
图5为实施例3的结果图，其中“1”代表阴性样本，“2”代表阳性样本。
图6为实施例4的结果图，其中“1”代表阴性样本，“2”代表阳性样本。
具体实施方式：
参照附图和具体实施例对本发明作进一步详细地描述，但具体实施例并不对本发明作任何限定。
参照图1-1、1-2、1-3与图2，本发明的以下实施例中所采用的核酸扩增及检测装置包括管体1、第一层过流密封元件2、第二层密封元件3、密封承载薄膜2a和穿刺物3a，如针尖或类似能穿破密封承载薄膜2a的结构或元件。
管体1的上端具有与第一层过流密封元件2连接的接口11。
第一层过流密封元件2具有和管体1连接的下部接口21和与第二层密封元件3连接的上部接口22，第一层过流密封元件2可以采用管状等上下相通的主体结构，密封承载薄膜2a设置在第一层过流密封元件2上，将上部接口和下部接口隔开，在被密封承载薄膜2a隔开的上部具有一定的高度，而供CRISPR-Cas系统的检测试剂加入暂存。优选地，第一层过流密封元件2的中部具有台阶23，所述密封承载薄膜2a设置在台阶23上，既方便密封承载薄膜2a的安装和连接，同时连接更加可靠，定位更加准确，能够缩短穿刺物的长度及便于穿刺物穿破密封承载薄膜2a。所述密封承载薄膜2a也可设置在第一层过流密封元件2的上部、下部，当设置在下部时，所述密封承载薄膜2a可以是已处在所述容器1中，所述密封承载薄膜2a也可以直接粘结在第一层过流密封元件2上或者通过支架等结构采用粘结或卡接、套接等方式连接在第一层过流密封元件2上。当与第一密封元件2为分体的两个部件时，所述密封承载薄膜2a也可放置在管体上，并由第一层过流密封元件2将其固定连接。
穿刺物3a设置在第二层密封元件3上，第二层密封元件3呈盖状，具有与第一层过流密封元件2的上部接口22连接的连接部位31，穿刺物3a可设置在所述盖状内侧顶面上。
管体1、第一层过流密封元件2、第二层密封元件3三者之间可通过螺纹但不限于螺纹进行连接(比如插接、卡接等)，同时需保证密封性。将核酸反应液加入管体1中，将第一层过流密封元件2与管体1连接，利用密封承载薄膜2a与第一层过流密封元件2将管体1内的核酸反应液与外界环境进行绝对隔离。将管体1置于相应的核酸反应条件下进行核酸扩增。待反应结束后，将CRISPR-Cas系统的检测试剂滴加到密封承载薄膜2a上，然后将第二层密封元件3与第一层过流密封元件2进行连接，利用尖锐状穿刺物3a将密封承载薄膜2a刺穿，穿刺物3a的长度最佳是当第二层密封元件3与第一层过流密封元件2已连接或基本连接密封时，其穿刺物3a刚好到达刺穿密封承载薄膜2a的位置，可保证在刺穿过程前后，不会出现扩增物气溶胶污染。最后通过简短离心，将CRISPR-Cas系统的检测试剂与核酸反应液进行混合，在特定波长的光源照射下，即可实现肉眼可视化检测。
实施例1核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
LAMP扩增体系：LAMP反应在12.5μL体系中进行，该体系包含有Bst DNA聚合酶(大片段)16U，10x ThermoPol Reaction，Betaine(甜菜碱)0.8M，MgCl22mM，dNTP各0.35mM，引物F3/B3浓度各为0.2μM，引物FIP/BIP浓度各为1.6μM，引物LF/LB浓度各为0.4μM(购买自生工生物工程(上海)股份有限公司)，2μL模板。
先将LAMP扩增体系将入管体1中，在管体上端的接口11上连接第一密封元件2。LAMP扩增程序：63℃恒温加热45分钟。
LAMP反应结束后，将CRISPR-Cas系统的检测试剂滴加到密封承载薄膜2a上，再将第二层密封元件3连接到第一层过流密封元件2的上部接口22，通过第二层密封元件3上的尖锐状穿刺物3a将密封承载薄膜2a刺破，然后简短离心，将CRISPR-Cas系统的检测试剂与LAMP反应液混匀。
使用的引物序列：
F3：5’CTCCTCGGATTCCATTGC 3’
B3：5’ACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTC 3’
FIP：5’GGCAGAGGCATCTTCAACGAGGAAGGTGGCTCCTACAA 3’
BIP：5’CACGAGGAGCATCGTGGAAACGTCAGTGGAGATATCACATC 3’
LF：5’TTTCCTTTATCGCAATGATGGC 3’
LB：5’AGAAGACGTTCCAACCACG 3’
扩增的模版序列：
5’CTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGT 3’(GeneBank：GU734659.1)
CRISPR-Cas系统的检测试剂：总体积为30μL，其中包含NaCl 50mM，Tris-HCl10mM，MgCl2 10mM，BSA 100μg/mL，Cas12a 0.15μM，gRNA 0.6μM，单链DNA荧光探针2.5μM，RNAinhibitor 125U和RNase-Free Water。(Cas12a购买自Mew England Biolabs inc.,货号M0653)。
CRISPR-Cas系统的检测试剂的反应程序：37℃反应20分钟，然后在紫外灯或特定波长的LED光源(主要发射波长为365nm)照射下，肉眼观察结果。
gRNA序列：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-GGACCACUGUCGGCAGAGGCA
单链DNA荧光探针序列：5’6-FAM-TTATT-3’IABKFQ
利用所述装置对转基因大豆的检测结果见图3；结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例2核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
LAMP扩增体系：LAMP反应在12.5μL体系中进行，该体系包含有Bst DNA聚合酶(大片段)16U，10x ThermoPol Reaction，Betaine(甜菜碱)0.8M，MgCl24mM，dNTP各0.35mM，引物F3/B3浓度各为0.2μM，引物FIP/BIP浓度各为1.6μM，引物LF/LB浓度各为0.4μM(购买自生工生物工程(上海)股份有限公司)，2μL模板。
先将LAMP扩增体系将入管体1中，在管体上端的接口11上连接第一密封元件2。LAMP扩增程序、引物序列及扩增的模板序列同实施例1。
LAMP反应结束后，将CRISPR-Cas系统的检测试剂滴加到密封承载薄膜2a上，再将第二层密封元件3连接到第一层过流密封元件2的上部接口22，通过第二层密封元件3上的尖锐状穿刺物3a将密封承载薄膜2a刺破，然后简短离心，将CRISPR-Cas系统的检测试剂与LAMP反应液混匀。
CRISPR-Cas系统的检测试剂：总体积为30μL，其中包含NaCl 50mM，Tris-HCl10mM，MgCl2 10mM，BSA 100μg/mL，Cas12a 0.5μM，gRNA 1.6μM，单链DNA荧光探针2.5μM，RNAinhibitor 125U和RNase-Free Water。(Cas12a购买自Mew England Biolabs inc.,货号M0653)。
CRISPR-Cas系统的检测试剂的反应程序：37℃反应20分钟，然后在紫外灯或特定波长的LED光源(主要发射波长为365nm)照射下，肉眼观察结果。
gRNA序列与单链DNA荧光探针序列同实施例1。
利用所述装置对转基因大豆的检测结果见图4；结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例3核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
PCR扩增体系：PCR反应在12.5μL体系中进行，该体系包含有TaKaRa Taq HS聚合酶0.625U，10x PCR Buffer(Mg2+Plus)，dNTP各0.2mM(购买自宝日医生物技术(北京)有限公司)，引物浓度为0.4μM(购买自生工生物工程(上海)股份有限公司)，2μL模板。
先将PCR扩增体系将入管体1中，在管体上端的接口11上连接第一密封元件2。PCR扩增程序：94℃热启动5min，40个循环，每个循环包括94℃反应30s，60℃反应30s，72℃反应30s。
PCR反应结束后，将CRISPR-Cas系统的检测试剂滴加到密封承载薄膜2a上，再将第二层密封元件3连接到第一层过流密封元件2的上部接口22，通过第二层密封元件3上的尖锐状穿刺物3a将密封承载薄膜2a刺破，然后简短离心，将CRISPR-Cas系统的检测试剂与PCR反应液混匀。
使用的引物序列：
F：5’CTCCTCGGATTCCATTGC 3’
R：5’ACTTCCTTATATAGAGGAAGGGTC 3’
扩增的模版序列：
5’CTCCTCGGATTCCATTGCCCAGCTATCTGTCACTTTATTGTGAAGATAGTGGAAAAGGAAGGTGGCTCCTACAAATGCCATCATTGCGATAAAGGAAAGGCCATCGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGATGGACCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCAAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCACAATCCCACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTCTATATAAGGAAGT 3’(GeneBank：GU734659.1)
CRISPR-Cas系统的检测试剂：总体积为30μL，其中包含NaCl 50mM，Tris-HCl10mM，MgCl2 10mM，BSA 100μg/mL，Cas12a 0.3μM，gRNA 0.6μM，单链DNA荧光探针2.5μM，RNAinhibitor 125U和RNase-Free Water。(Cas12a购买自New England Biolabs inc.,货号M0653)。
CRISPR-Cas系统的检测试剂的反应程序：37℃反应20分钟，然后在紫外灯或特定波长的LED光源(主要发射波长为365nm)照射下，肉眼观察结果。
gRNA序列：UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-GGACCACUGUCGGCAGAGGCA
单链DNA荧光探针序列：5’6-FAM-TTATT-3’IABKFQ
利用所述装置对转基因大豆的检测结果见图5；结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例4核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
PCR扩增体系：PCR反应在12.5μL体系中进行，该体系包含有TaKaRa Taq HS聚合酶0.625U，10x PCR Buffer(Mg2+Plus)，dNTP各0.2mM(购买自宝日医生物技术(北京)有限公司)，引物浓度为0.6μM(购买自生工生物工程(上海)股份有限公司)，2μL模板。
先将PCR扩增体系将入管体1中，在管体上端的接口11上连接第一密封元件2。PCR扩增程序、引物序列及扩增的模板序列同实施例3。
PCR反应结束后，将CRISPR-Cas系统的检测试剂滴加到密封承载薄膜2a上，再将第二层密封元件3连接到第一层过流密封元件2的上部接口22，通过第二层密封元件3上的尖锐状穿刺物3a将密封承载薄膜2a刺破，然后简短离心，将CRISPR-Cas系统的检测试剂与PCR反应液混匀。
CRISPR-Cas系统的检测试剂：总体积为30μL，其中包含NaCl 50mM，Tris-HCl10mM，MgCl2 10mM，BSA 100μg/mL，Cas12a 0.5μM，gRNA 1.6μM，单链DNA荧光探针2.5μM，RNAinhibitor 125U和RNase-Free Water。(Cas12a购买自Mew England Biolabs inc.,货号M0653)。
CRISPR-Cas系统的检测试剂的反应程序：37℃反应20分钟，然后在紫外灯或特定波长的LED光源(主要发射波长为365nm)照射下，肉眼观察结果。
gRNA序列与单链DNA荧光探针序列同实施例3。
利用所述装置对转基因大豆的检测结果见图5；结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例5核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统的检测试剂中的Cas12a浓度调整为0.8μM，gRNA的工作浓度调整为1.0μM，其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例6核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统的检测试剂中的Cas12a浓度调整为1.2μM，gRNA的工作浓度调整为2.0μM，其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例7核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统的检测试剂中的Cas12a浓度调整为1.5μM，gRNA的工作浓度调整为3.0μM，其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例8核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统检测试剂的孵育温度调整为20℃，其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例9核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统检测试剂的孵育温度调整为25℃，其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例10核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统检测试剂的孵育温度调整为40℃，其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例11核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统检测试剂的孵育温度调整为45℃，其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例12核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统检测试剂的孵育时间调整为10分钟，其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例13核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统检测试剂的孵育时间调整为5分钟，其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例14核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将LAMP反应体系中的Bst聚合酶的浓度调整为5U，其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例15核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将LAMP反应体系中的Bst聚合酶的浓度调整为8U，其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例16核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将LAMP反应体系中的Bst聚合酶的浓度调整为30U，其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例17核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将LAMP反应体系中的镁离子浓度4mM，其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例18核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将LAMP反应体系中的镁离子浓度8mM，其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例19核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将LAMP反应体系中的内部引物FIP/BIP的浓度调整为3μM，内部引物、外部引物与环引物之间的浓度比为8:1:2。其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例20核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将LAMP反应体系中的内部引物FIP/BIP的浓度调整为4μM，内部引物、外部引物与环引物之间的浓度比为8:1:2。其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例21核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将LAMP反应程序中的反应温度调整为62℃，其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例22核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将LAMP反应程序中的反应温度调整为65℃，其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例23核酸扩增及检测装置结合LAMP检测转基因大豆
此实施例中，将LAMP反应程序中的反应温度调整为67℃，其它工作条件同实施例1。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例24核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统的检测试剂中的Cas12a浓度调整为0.8μM，gRNA的工作浓度调整为1.0μM，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例25核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统的检测试剂中的Cas12a浓度调整为1.2μM，gRNA的工作浓度调整为2.0μM，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例26核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统的检测试剂中的Cas12a浓度调整为1.5μM，gRNA的工作浓度调整为3.0μM，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例27核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统检测试剂的孵育温度调整为20℃，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例28核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统检测试剂的孵育温度调整为25℃，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例29核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统检测试剂的孵育温度调整为40℃，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例30核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统检测试剂的孵育温度调整为45℃，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例31核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统检测试剂的孵育时间调整为10分钟，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例32核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统检测试剂的孵育时间调整为5分钟，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例33核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将CRISPR-Cas系统检测试剂的孵育时间调整为3分钟，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例34核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将PCR反应体系中聚合酶的浓度调整为0.5U，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例35核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将PCR反应体系中聚合酶的浓度调整为1.0U，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例36核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将PCR反应体系中聚合酶的浓度调整为2.5U，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例37核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将PCR反应体系中引物的浓度调整为0.2μM，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例38核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将PCR反应体系中引物的浓度调整为0.6μM，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例39核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将PCR反应体系中引物的浓度调整为0.8μM，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例40核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将PCR反应程序中变性温度调整为90℃，孵育时间为40s，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例41核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将PCR反应程序中变性温度调整为96℃，孵育时间为20s，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例42核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将PCR反应程序中变性温度调整为98℃，孵育时间为10s，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例43核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将PCR反应程序中退火温度调整为55℃，孵育时间为20s，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例44核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将PCR反应程序中退火温度调整为58℃，孵育时间为40s，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例45核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将PCR反应程序中退火温度调整为64℃，孵育时间为50s，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例46核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将PCR反应程序中延伸温度调整为70℃，孵育时间为60s，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例47核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将PCR反应程序中延伸温度调整为74℃，孵育时间为40s，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。
实施例48核酸扩增及检测装置结合PCR检测转基因大豆
此实施例中，将PCR反应程序中延伸温度调整为76℃，孵育时间为20s，其它工作条件同实施例3。结果显示：转基因大豆阳性样本产生绿色荧光，呈阳性结果；非转基因大豆阴性样本无绿色荧光，呈现阴性结果。

Claims (6)

1.一种用于核酸扩增及检测的装置，包括管体(1)，其特征在于所述装置还包括第一层过流密封元件(2)、第二层密封元件(3)、密封承载薄膜(2a)、穿刺物(3a)；
管体的上端具有与第一层过流密封元件连接的接口；
第一层过流密封元件具有和管体连接的下部接口和与第二层密封元件连接的上部接口，所述的密封承载薄膜与第一层过流密封元件连接或处在第一层过流密封元件和管体之间；
第二层密封元件层设有与第一层过流密封元件的上部接口连接的连接部位；第二层密封元件设置穿刺物，所述穿刺物用于穿破所述密封承载薄膜。
2.如权利要求1所述的一种用于核酸扩增及检测的装置，其特征在于所述密封承载薄膜设置在第一层过流密封元件上，将所述上部接口和下部接口隔开，或设置在第一层过流密封元件的下部接口处。
3.如权利要求1所述的一种用于核酸扩增及检测的装置，其特征在于第一层过流密封元件的中部具有台阶，所述密封承载薄膜设置在台阶上。
4.如权利要求1所述的一种用于核酸扩增及检测的装置，其特征在于所述第二层密封元件为核酸扩增后的检测工作时的密封盖，所述穿刺物设置在所述盖的内侧顶面上。
5.如权利要求1所述的一种用于核酸扩增及检测的装置，其特征在于所述穿刺物的长度在满足第二层密封件和所述第一层过流密封元件已进行基本密封连接之后，穿刺物再穿破所述密封承载薄膜。
6.一种加盖式不开盖核酸扩增及检测检测方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)在管体中加入核酸扩增反应体系及模板；
(2)将密封承载薄膜及能够和盖连接的结构连接在管体上，并将管体封闭，
(3)待核酸扩增反应结束后，在密封承载薄膜上加CRISPR系统的检测试剂；然后盖上带有能穿破密封承载薄膜的穿刺物的盖，在所述盖与所述能够和盖连接的结构连接时，穿刺物穿破密封承载薄膜，转由所述盖进行封闭；
(4)将检测试剂和管体中的核酸反应扩增子混合及反应，进行可视化检测。
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