CN106497778B - 一种用于恒温核酸扩增快速可视化检测的装置 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于分子诊断技术领域的一种用于恒温核酸扩增快速可视化检测的装置。该装置采用恒温核酸扩增对靶核酸进行扩增，再应用侧流层析法进行可视化检测，并将整个体系封闭于一个9cm×3.4cm的透明小盒内。通过本装置特殊结构设计，实现密闭条件下核酸扩增、样品递送、显色反应和结果判定的一体化，免除了检测中的开盖需求，避免了核酸污染导致的假阳性问题，克服了核酸可视化检测应用中面临的最大阻碍；该装置能够在不产生核酸污染的前提下，实现高灵敏度核酸可视化检测，在疾病诊断、流行病学监测、产前筛查及食品安全检测等方面发挥重要作用。

Description

一种用于恒温核酸扩增快速可视化检测的装置
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种用于恒温核酸扩增快速可视化检测的装置。
背景技术
随着人们对健康、环境的重视程度越来越高，与生命健康相密切相关各项的病原体检测、产前诊断、遗传病诊断、食品安全检测变得越来越重要，而目前广泛应用的PCR等技术虽然可以实现高灵敏度检测，但是他们往往需要精密昂贵的仪器，复杂的操作以及特殊的实验室条件。这些限制使他们在现场、实时监测、社区应用方面受到限制，而核酸可视化诊断方法恰可以克服以上问题，一时成为分子诊断技术研究热点。恒温核酸扩增结合测流层析试纸条检测技术可以实现快速、灵敏、高效、可视化核酸检测，一度被视作替代PCR的极佳选择。但是，至今他们也未能被临床广泛接纳应用，其中最重要的原因就是他为非密闭体系，当对核酸进行数量级扩增后，会对空气造成非常严重的核酸污染，导致后续样本检验的假阳性问题。对此，研究者也提出了部分解决方案，例如向LAMP检测体系中加入钙黄绿素等封闭剂，但是经验证仍然无法彻底解决污染问题。因此建立一种更加有效的方法，实现恒温核酸扩增可视化诊断技术的应用，成为了亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于核酸扩增快速可视化检测的便携式装置。
一种用于恒温核酸快速可视化检测的装置，包括内部恒温核酸扩增-侧流层析检测体系1和外部密闭体系2；
所述恒温核酸扩增-侧流层析检测体系1包括两个样品容器3、载物胶塞4、侧流层析试纸条5和汇流斜面6；样品容器3为常规应用的加样枪尖，固定在载物胶塞4内，侧流层析试纸条5位于载物胶塞4下方，样品容器3内的扩增液滴于汇流斜面6后，在汇流斜面6的汇集作用下扩增液与侧流层析试纸条5接触显色；
所述外部密闭体系2包括透明外壳7、封闭胶塞8和封闭开关9，整个恒温核酸扩增-侧流层析检测体系1位于透明外壳7内，并由封闭胶塞8和封闭开关9进行装置的封闭，封闭开关9可按需要打开或关闭。
所述样品容器3内进行的样品扩增采用恒温核酸扩增技术，此技术可以在恒定温度下对核酸实现数量级扩增，因此它不需要依赖电源和昂贵的温度控制仪器，可以根据恒温核酸扩增技术需求，利用蓄电池加热装置、简易化学发热装置等维持反应，甚至能于常温下进行。
所述侧流层析试纸条5快速定性检测和鉴定核酸扩增产物，可检测不低于10ng的DNA，并且可以直接通过肉眼观察检测结果，如果质控线和检测线均出现则结果为阳性，如果只出现质控带则结果为阴性。
所述透明外壳7为PC2805材料，厚2.5cm，透明度好，强度高，重量轻，耐高温；载物胶塞4及封闭胶塞8为硅胶silicone材料。
上述用于恒温核酸快速可视化检测的装置的使用方法，将样品扩增液及检测稀释液分别加入两个样品容器3内，塞紧封闭胶塞8，关闭封闭开关9，使装置保持密闭，然后放入相应恒温环境内孵育，使样品扩增液进行反应，扩增结束后下压封闭胶塞，使装置内部气压增加，在空气压力下样品扩增液及检测稀释液同时从样品容器3流出，落于下方的汇流斜面6，样品扩增液及检测稀释液混合汇聚于汇流斜面6底端，并与侧流层析试纸条5接触反应。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明用于恒温核酸快速可视化检测的装置，能够在不产生核酸污染的前提下，实现高灵敏度恒温核酸扩增可视化检测，核酸的快速、准确、高效、可视化检测，将在疾病诊断、流行病学监测、产前筛查及食品安全检测等方面发挥重要作用；该检测装备先应用恒温核酸扩增技术用对靶核酸进行数量级扩增，再应用侧流层析试纸条进行检测，目前恒温核酸扩增技术已有多种方法，他们中凡是可以与侧流层析试纸检测结合应用的均可以用于此检测设备，例如LAMP、重组酶聚合酶扩增(RPA)及解旋酶依赖性扩增(HDA)等；该检测装备将整个检测体系封闭于一个9cm×3.4cm的透明小盒内，不需要依赖电源和昂贵的温度控制仪器，可以根据恒温核酸扩增技术需求，利用蓄电池加热装置、简易化学发热装置等维持反应，甚至能于常温下进行，因此任何规模的实验室、社区门诊、野外环境均可应用；该装备可以实现核酸扩增与试纸条检测的一体化、密闭操作，我们只需在前期加样时打开设备，之后全程密闭，避免了核酸污染导致的假阳性问题，克服了目前核酸可视化检测应用中面临的最大阻碍；该装备将恒温核酸扩增与试纸条检测过程结合为一体，使操作简化快速，结果识别简单，只需对操作人员进行简单的培训即可，而无需经验丰富的工作人员；由于恒温扩增与侧流层析试纸条检测都具有快速、高效、准确的特点，因此整个操作过程耗时短；这样一种检测体系，对于社区应用、疫情筛查及军队外训等都将有重要的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例的装置整体示意图；
图2为本发明实施例的装置内部恒温核酸扩增-侧流层析检测体系示意图；
图3为本发明实施例的装置外部密闭体系示意图；
图4为用本发明结合重组酶聚合酶恒温核酸扩增技术检测结核杆菌的结果示意图；
图中，1-恒温核酸扩增-侧流层析检测体系，2-外部密闭体系，3-样品容器，4-载物胶塞，5-侧流层析试纸条，6-汇流斜面，7-透明外壳，8-封闭胶塞，9-封闭开关。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
本实施例提供了一种用于恒温核酸扩增快速可视化检测的便携式装置，如图1所示，包括内部恒温核酸扩增-侧流层析检测体系1和外部密闭体系2。
外部密闭体系2如图3所示，整个恒温核酸扩增-侧流层析检测体系1位于透明外壳7内，并由封闭胶塞8和封闭开关9进行装置的封闭，封闭开关9可按需要打开或关闭。
恒温核酸扩增-侧流层析检测体系1如图2所示，样品容器3固定在载物胶塞4内，侧流层析试纸条5位于载物胶塞4下方，将恒温核酸扩增体系(酶、引物、探针、样本等)及侧流层析检测稀释液分别加入两个样品容器3中。下压封闭胶塞8使装置内气压升高，样品容器3中的两种液体滴于汇流斜面6后，在斜面的作用下进行汇集混合，并与侧流层析试纸条5接触检测。
样品容器3中加入相应液体试剂后，在内部气压不变的情况下能够保持液体稳定不滴漏。在样品容器3、载物胶塞4及反应试剂的封闭作用下，使设备的上下两端空气隔离。然后塞紧封闭胶塞8，关闭封闭开关9，使装置整体保持密闭。将密闭好的装置放入相应温度环境内，维持恒温核酸扩增反应，适当时间后取出。下压封闭胶塞8，使装置上端气压快速增加，在空气压力作用下，样品扩增液及检测稀释液同时从样品容器3流出，落于下方的汇流斜面6，并与侧流层析试纸条5接触反应。
目前恒温核酸扩增技术已有多种方法，凡是可以与侧流层析试纸检测结合应用的恒温核酸扩增技术均可以应用于此检测设备，例如LAMP、重组酶聚合酶扩增(RPA)及解旋酶依赖性扩增(HDA)等。此处，我们采用重组酶聚合酶扩增技术(RPA)结合此发明装置对结核杆菌进行检测：
1.引物及探针设计：
Primer A:GTAAAACGAACTCTGGAATTGATCGACGGC；
Primer B:5’-/biotion/-CTATACGTGTTCCCCATCGAGCAAATTTTA；
Probe:5’-/FAM/-CATTCCCATGCTGCTGTGGATCAACGGGGT/THF/TACGACACGGTCCGC/C3-spacer/-3’
2.加样：将50ulRPA反应体系(酶、引物、探针、样本等)加入一个样品容器3中，另一容器中加入侧流层析检测稀释液50ul,塞紧封闭胶塞8，关闭封闭开关9，使装置整体保持密闭，并放入39℃水浴箱中，孵育10-15分钟后取出。下压封闭胶塞8，在空气压力作用下，RPA扩增液与侧流层析分析稀释液同时从两个样品容器3中流出，落于下方的汇流斜面6，并与侧流层析试纸条5接触反应、显色。五分钟后，观察试纸条条带，判断检测结果。
3.结果判读：结果为阳性，试纸条可见两条线；结果为阴性，试纸条上只可见一条质控线。
4.从图4的结果分析中可得出，运用重组酶聚合酶扩增技术(RPA)结合此发明装置方法对含结核杆菌核酸样本及阴性对照样本进行检测，3个阳性标本均显示阳性结果(同时出现质控线和检测线)，而阴性对照标本为阴性结果(仅出现质控线)。
以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种用于恒温核酸扩增快速可视化检测的装置，其特征在于，包括内部恒温核酸扩增-侧流层析检测体系(1)和外部密闭体系(2)；
所述恒温核酸扩增-侧流层析检测体系(1)包括两个样品容器(3)、载物胶塞(4)、侧流层析试纸条(5)和汇流斜面(6)；样品容器(3)，固定在载物胶塞(4)内，侧流层析试纸条(5)位于载物胶塞(4)下方，当样品容器(3)内的扩增液滴于汇流斜面(6)后，在汇流斜面(6)的汇集作用下扩增液与侧流层析试纸条(5)接触显色；
所述外部密闭体系(2)包括透明外壳(7)、封闭胶塞(8)和封闭开关(9)，整个恒温核酸扩增-侧流层析检测体系(1)位于透明外壳(7)内，并由封闭胶塞(8)和封闭开关(9)进行装置的封闭，封闭开关(9)可按需要打开或关闭。
2.根据权利要求1所述的用于恒温核酸扩增快速可视化检测的装置，其特征在于，所述样品容器(3)外设有加热装置。
3.根据权利要求1所述的用于恒温核酸扩增快速可视化检测的装置，其特征在于，所述样品容器(3)为加样枪尖。
4.根据权利要求1所述的用于恒温核酸扩增快速可视化检测的装置，其特征在于，所述侧流层析试纸条(5)快速定性检测和鉴定核酸扩增产物，可检测不低于10ng的DNA，并且可以直接通过肉眼观察检测结果，如果质控线和检测线均出现则结果为阳性，如果只出现质控带则结果为阴性。
5.根据权利要求1所述的用于恒温核酸扩增快速可视化检测的装置，其特征在于，所述透明外壳(7)为PC2805材料，厚2.5cm；载物胶塞(4)及封闭胶塞(8)为硅胶silicone材料。
6.权利要求1所述用于恒温核酸扩增快速可视化检测的装置的非疾病诊断和治疗目的的使用方法，其特征在于，将样品扩增液及检测稀释液分别加入两个样品容器(3)内，塞紧封闭胶塞(8)，关闭封闭开关(9)，使装置保持密闭，然后放入相应恒温环境内孵育，使样品扩增液进行反应，扩增结束后下压封闭胶塞，使装置内部气压增加，在空气压力下样品扩增液及检测稀释液同时从样品容器(3)底部流出，落于下方的汇流斜面(6)，样品扩增液及检测稀释液混合汇聚于汇流斜面(6)底端，并与侧流层析试纸条(5)接触反应。
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