CN106715673A - 用于疾病检测的即时检测聚合酶链反应设备 - Google Patents
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Abstract
提供了用于检测靶核酸的即时检测设备。该设备包括:适应于接收生物样品的提取室,其中所述提取室包含提取和裂解样品以释放核酸的装置;与提取室连通的第一扩增室,其中所述扩增室包含引发靶核酸序列的核酸扩增发生的装置;和与扩增室连通的检测室,其中所述检测室包含可检测地标记靶核酸的装置和检测与标记的靶核酸相关的信号的装置。
Description
技术领域
本发明涉及,例如,用于检测传染病的一线(point-of-need)(PON)或即时检测(point-of-care)(POC)诊断设备的领域。
背景技术
已经存在着从传染病的传统检验方法(如培养和抗原检测)向更灵敏的核酸扩增测试(本文中称为NAAT)的转移。聚合酶链反应(PCR)扩增为实验室提供了检测传染病的灵敏和特异性的工具,并已经被全世界的临床实验室采用。
当前的分子诊断工具受到大量的“芯片外(off-chip)”临床样品制备时间和对熟练技师的需要的限制。这限制了分子诊断在家庭或资源贫乏的环境中的应用。典型的诊断测试可以在3小时到5天的时间内完成。但是,这在某些情况下不能提供有用的诊断信息。
使用微流体装置使诊断分析小型化成“芯片实验室”形式在过去十年间获得了许多的关注。微流体装置通常是小的且需要非常低的样品量,这有利于分子诊断。这一技术可以用于构建用于例如床旁使用的POC诊断工具和提供快速诊断结果。但是,POC设备的成本是重要的且应当尽可能低,特别是用于资源贫乏的环境中。此时,复杂和昂贵的样品制备和DNA检测技术阻碍了便宜的完全一次性POC设备的构建。
已经开发了允许以自动的“芯片上”方式或无需人干预从临床样品(血液、尿液、鼻咽拭子、粪便材料)分离传染性颗粒(病毒、细菌或真菌)的装置。例如,WO110019A1公开了可以将病原体或核酸与磁珠结合并随后使它们移动到次级室进行检测的微流体平台。另外,WO122564A2公开了用于从病原体释放细胞内内容物和随后转运一部分内容物进行检测的装置。US 2008/0299648A1公开了一种自持的诊断试剂盒,其包括样品收集元件和免疫色谱测试条。US8,574,923B2公开了使用整块吸附剂或使用样品过滤器特异性地结合核酸以结合任何目标分析物和裂解细胞膜的样品制备装置。WO2012/013733A1公开了用于通用样品制备的装置以从多种液体基质分离核酸而用于诊断目的。最后,WO2013/158686A1公开了需要最小时间带且可以从各种细胞混合物纯化核酸的核酸样品制备装置。
在传染病的检测中,传染性颗粒首先被分离且然后必须裂解以释放细胞内内容物,包括DNA、RNA和蛋白质。尽管几种方法已经描述用于从细胞释放核酸和蛋白质,但将其集成到诊断POC平台中显著地提高了该设备的复杂性。对于机械裂解,需要可增加该设备的成本和复杂性的电动机元件。对于化学裂解,难以施用准确量的裂解试剂且随后在下游分析之前除去该试剂。NAAT技术对于化学污染特别敏感且所有裂解化学品必须在后续步骤(包括酶学扩增和检测)之前除去。
聚合酶链反应(PCR)是使用热稳定DNA聚合酶和热循环的组合将病原性DNA序列扩增到高浓度的常用技术。但是,PCR通常需要~50℃和95℃之间的热循环以使扩增发生,且将热循环集成到POC诊断平台中将增加开发POC分子诊断设备的复杂性和成本。
使用POC诊断的一次性系统对于家庭检验、不能接触中心实验室的资源贫乏环境或社区医院是有吸收力的,但读数所需的辅助系统通常是昂贵的和专用的,这限制了其可处置性。这也可导致对于单独单元或阅读器的高昂初始资本投入。
因此,希望的是开发便携的和一次性的即时检测诊断设备。
发明内容
现在已经开发了适应于接受原始临床样品(例如,血液、尿液、粪便物质、鼻咽拭子等)、释放病原体细胞内内容物并扩增和检测病原体核酸的即时检测设备。
因此,提供了即时检测设备,其包括:
适应于接受生物样品的提取室,其中所述提取室包含提取和裂解该样品以释放核酸的装置;
与提取室连通的第一扩增室,其中所述扩增室包含引发靶核酸序列的核酸扩增发生的装置;和
与扩增室连通的检测室,其中所述检测室包含可检测地标记靶核酸的装置和检测与标记的靶核酸相关的信号的装置。
在本发明的另一方面,提供了检测生物样品中的靶核酸的方法,包括:
在拭子上收集生物样品和将拭子插入适应于从拭子提取所述样品和裂解病原体以释放核酸的封闭提取室中;
转移一部分释放的核酸到与提取室连接的核酸扩增室并将所述核酸暴露于试剂以诱导核酸扩增;
在与扩增室连接的检测室中标记和检测靶核酸。
本发明的这些和其它方面参照以下附图和说明将变得明显。
附图说明
图1是本发明的实施方式的框图(A),和按照本发明的实施方式的POC设备的示意图(B)(包括各种视图);
图2图示说明自调节加热器可以通过施加电压以不同电阻(3.8欧姆、3.5欧姆和3.4欧姆)加热250μl水到95℃ 20分钟;
图3图示说明自调节加热器可以通过施加电压以8.6欧姆的电阻加热250μl水到62℃;
图4图示说明在扩增后使用荧光染料(SYBR绿)检测无乳链球菌(S.agalactiae);
图5说明使用Quant-iT PicoGreen DNA结合染料分析扩增之前和之后的颜色变化;
图6图示说明使用2个浓度的亚甲基蓝和测量阳极峰电流(peak anodic current)电化学检测扩增的无乳链球菌DNA;
图7是显示可用于实施本技术的方面的示例计算机系统的框图;和
图8是显示可用于实施本技术的方面的示例智能手机的框图。
具体实施方式
提供了用于检测靶核酸的即时检测设备。该设备包括适应于接收生物样品和裂解样品以释放核酸的提取室;与提取室连通的第一扩增室,其从提取室接收样品并包含扩增样品中的靶核酸的装置;和与扩增室连通的检测室,其包含标记靶核酸以用于检测的装置和检测该标记的装置。如本文中使用的,术语“提取室”是指其中发生样品提取和裂解两者的腔室。
生物样品可以使用用于将样品转移到设备的提取室中的任何适宜媒介获得。在本发明的一个实施方式中,拭子用于收集包含核酸的生物或临床样品(例如,血液、尿液、鼻咽拭子、粪便样品、阴道拭子、眼泪、在伤口部位或炎症部位排出的流体或者包含核酸的任何其它临床物质)。如本领域技术人员理解的,生物样品可以通过拭子以外的装置获得,例如通过注射器或通过收集容器(拭子可以浸入其中)。包含样品的拭子置于该设备的提取室的拭子-接收开口中。所使用的拭子可以是标准拭子或特别设计用于该设备的拭子。例如,拭子可以调整大小以配合在提取室内从而允许提取室开口用帽或盖密封。当使用标准拭子时,拭子杆可以在提取室开口处折断以允许提取室开口用盖密封。拭子可以具有适于收集特定样品如阴道和鼻咽样品的较小头部。或者,拭子可以包括沿其杆的塞,其起到密封提取室的开口和防止从设备的泄漏的作用。一旦提取室封闭,其在设备内形成封闭的包含环境。用于样品转移的其它适宜媒介包括小棍、泡沫粘杆或能够吸附用于转移到设备的生物样品的其它媒介。
提取室包含使得能够实现样品提取(按照需要)和裂解以从样品释放核酸的装置。因此,提取室含有适合从递送媒介提取样品和样品裂解的裂解液(例如,磷酸盐缓冲盐水溶液、水、0.1%Triton-X100溶液、0.1%SDS溶液、用于提取和裂解的其它合适清洁剂或这些中任何的组合)或可利用该裂解液。在一个实施方式中,提取室包含适合提取和裂解的量的裂解液,例如,约0.2-0.5mL的体积的裂解液,以浸没含样品媒介和促进其样品提取/裂解。在这种情况中,提取室具有单向进入点(在设备的开口处或附近),例如,膜,其允许样品经由媒介(例如,拭子等)输入到提取室中,但防止裂解液从提取室泄漏。在另一个实施方式中,提取室与在样品进入提取室中时起到释放提取和裂解液到提取室中的作用的缓冲释放装置连通。例如,裂解液可以包含在小袋、泡罩包装或其它储器中(在提取室内或邻近提取室),其在样品进入时被激活以将溶液释放到提取室中。就此而言,小袋或泡罩包装可以在进入时通过含样品媒介(例如,拭子)刺穿、在腔室密封或盖封闭时通过腔室内的装置刺穿或者在腔室密封时通过腔室内的压力爆破。邻近的储器可以通过相似地将连接储器与提取室的膜刺穿或爆破而导致裂解液释放到提取室中。如本领域技术人员理解的,也可以采用从小袋或储器释放裂解液的其它装置。
在提取室密封时,例如,通过盖封闭提取室的开口,设备通过如所述地完成一个或多个回路来激活。因此,加热器、泵和其它电子部件(如所述的)通过连接于内置的(on-board)或外加的(off-board)(通过连接于外部电源)控制单元(包括电池)、经由任何适宜的适配器(DC适配器)和/或转换器(D/A转换器)适当地供电。该连接可以是至电源(例如,电池)的标准电连接(DC适配器),或该连接可以经由至外部电源如处理装置(例如计算机、手机、平板电脑或其它外部装置)的端口(例如,USB)。因此,该设备可以具有连接至电源的装置。
提取室包含促进样品提取和裂解以从其释放核酸的装置。在一个实施方式中,加热装置,例如,自调节加热器,用于加热提取室至适合促进样品提取和裂解的温度(例如,约88℃-100℃之间的温度)足够的时间段(例如,至少约2-3分钟)。自调节加热器可以包括,但不限于,PTC(正温度系数)陶瓷加热器、蒸发温度控制加热器或散热温度控制加热器。加热器在提取室的盖封闭时激活,由此完成将加热器连接于电源(例如,电池)的回路。
或者,提取室可以包含产生机械力的装置(例如,小电动机)以促进样品从拭子释放和任何存在的病原体的裂解。电动机可以与放置于提取室内的玻璃或陶瓷珠的使用相结合以加速裂解。电动机可以位于提取室的基部,且以对于加热器所描述的方式供电。这一实施方式可以另外地包括或不包括加热器以促进裂解。
在某些样品(例如鼻咽样品)中,病原体可以用热裂解且核酸可以在没有核酸纯化的情况下直接扩增。
在其它样品,例如包含核酸扩增抑制剂(如胆汁盐、亚铁血红素、蛋白酶、尿素或血红蛋白)的血液或尿液中,提取室内的核酸纯化可能是需要的。在这种情况中,提取室可以涂布有固定的寡核苷酸捕获探针(其与靶核酸同源)(例如,以约104-105拷贝的量),或涂布有对于靶病原体序列(例如,表1中示例的那些)的靶核酸特异性的寡核苷酸探针。该设备可以任选地在提取室(其在设备的盖封闭时供电或激活)内包括带正电的电极,以促进核酸结合到捕获探针上。一旦核酸结合于探针,例如在如约2分钟的短时间内,未结合的污染物可以从提取室除去。污染物移除可以通过吸引或泵送到与提取室连接的废物室中来完成,或者污染物可以用从第二缓冲室释放的缓冲液洗涤到废物室中。这一步骤除去潜在的扩增抑制剂并浓缩核酸(例如,DNA或RNA)用于扩增。这一核酸结合步骤在室温和35℃之间进行而不需要加热器。在结合后,用于从提取室除去污染物的装置(例如,微泵和/或缓冲液释放装置)如前所述激活,且可以利用定时器以使得废物移除在捕获所有或足够量的核酸后发生。然后,核酸可以随后如前所述地洗脱。
在裂解和核酸释放后,测定体积(例如,约5-10μl)的这一经裂解物质经由通道如微流体通道转移(例如通过微泵)到扩增室。如所述的,微泵可以通过内置电源如电池或通过与外部电源的连接供电。泵可以在适当的时间(例如,一旦样品提取和裂解完成)激活以转移经裂解的物质到扩增室。在一个实施方式中,泵的激活通过连接于电源的定时器延迟以确保样品发生提取和裂解,且由此防止未裂解的物质转移到扩增室。关于测定体积的经裂解物质的转移,这可以通过微控制器控制。或者,转移到扩增室中的经裂解物质的体积可以通过扩增室的尺寸进行控制(例如,调整大小以包含足够量的扩增混合物和所需量的经裂解物质)。在这种情况中,扩增室的入口可以通过允许在扩增室填充时气体从扩增室内输出和液体输入到扩增室中直到扩增室被填充的疏水膜覆盖。
扩增室包含使得核酸扩增能够发生的扩增混合物。扩增室中存在的扩增混合物可以冻干(任选地用pullanin或海藻糖稳定),在该情况中约25-50μl的裂解溶液添加到孔中。扩增也可以是在液体形式中,在该情况中约5-10μl的裂解溶液添加到孔中。扩增混合物包含用于靶核酸序列的扩增的寡核苷酸引物(例如,约0.2-1.8μM)、链置换DNA聚合酶如Taq聚合酶(例如,约8单位)、脱氧核苷三磷酸或dNTP(例如,各约15-30mM)、缓冲液(例如,约1X终浓度)、阳离子如镁(例如,约2.0-8.0mM)。当靶核酸是RNA时,扩增混合物另外地包含逆转录酶。如本领域技术人员理解的,寡核苷酸引物选择为扩增来自目标微生物的特定靶DNA序列。因此,为扩增靶序列,利用与目标微生物内的DNA序列互补的引物(例如,包含约10至约100个碱基)。如本领域技术人员理解的,扩增混合物中寡核苷酸引物的数量随使用的扩增技术变化,且可以使用5’-3’定向以及3’-5’定向的引物。在一个实施方式中,目标微生物是病原生物体,例如但不限于,大肠杆菌(Escherichia coli)、单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)、沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophilia)、淋病奈瑟氏菌(Neisseriagonorrhea)、链球菌属(Streptococcus sp.)(包括B组链球菌感染)、疱疹病毒、乳头状瘤病毒、葡萄球菌属(Staphylococcus sp.)(包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA))、流感病毒、呼吸道合胞体病毒、诺瓦克病毒、西尼罗病毒、登革热病毒、SARS Co-V、埃博拉病毒、拉沙热病毒、结核病毒、HIV、中东呼吸综合症冠状病毒和基孔肯亚病毒。用于扩增这些病原体中的一些的引物的实例可以在表1中发现。
在一个实施方式中,扩增通过等温扩增技术完成,包括但不限于,环介导等温扩增(LAMP)、交叉引物扩增(CPA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、滚环扩增(RCA)、赖解旋酶扩增(HDA)、信号介导的RNA扩增技术(signal-mediated amplification of RNA technology)(SMART)、切刻酶介导的扩增(NEMA)、等温链扩增(ICA)、Smart扩增(Smart-AMP)、指数扩增反应(EXPAR)或网状分枝扩增(RAM)。在扩增过程中,腔室使用加热器如自调节加热器加热到适合于扩增的温度(例如约58℃-66℃的温度)足够的时间(例如,约15-20分钟)。加热器在适宜的时间激活,例如,在将经裂解的材料转移到扩增室中时或略微提前。在一个实施方式中,加热器的激活通过连接于电源的定时器延迟以防止扩增室内的过早加热。
在另一个实施方式中,扩增可以通过pH循环依赖性扩增完成。在这种情况中,溶液的pH例如从约pH 3至约pH 8循环以使核酸变性和复性,由此允许聚合酶访问和随后扩增。例如,扩增室可以包含氢加载的板而将扩增室分成两个区段。通过板任一侧上的两个电极产生的电场反复地牵引氢离子,从而循环pH。这通过电子或机械定时器控制以激活板的任一侧上的电极。
电场扩增(EFA)也可以用于核酸扩增,从而电场施加以使DNA变性和由此允许聚合酶访问而无需热循环。在这种情况中,约0.01-0.1mV范围内的电场通过使用电源在位于扩增室相对侧的电极上施加电压来产生。电压使用机械或电子定时器以10-20秒的特定时间间隔激活和关闭(以导致变性接着复性和扩增)。
在另一个实施方式中,设备适应用于在扩增室中进行热循环PCR扩增。对于这一途径,扩增室内的自调节加热器使用机械或电子定时器以特定时间间隔(例如,20-40s)激活和关闭以导致加热到变性温度(例如,94-96℃)和冷却到退火/扩增温度(例如,约70℃)。温度用连接于微处理器的热敏电阻监测。如本领域技术人员理解的,使用的温度及其时间间隔可以随所使用的聚合酶、反应中的二价离子和dNTP的浓度及引物的解链温度而变化。
设备可任选地包括第二(并行)扩增室以扩增样品内的核酸序列而用作扩增对照。因此,第二扩增室包含扩增混合物以及针对对照核酸序列的寡核苷酸引物,以使得当设备激活时,发生对照序列的扩增。尽管可以使用任何合适的对照序列,但如本领域技术人员理解的,对照序列的实例包括人基因如人β-肌动蛋白,以及来自共生细菌如咽峡炎链球菌(Streptococcus anginosus)或表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的核酸序列。因此,对照序列的扩增将确认样品适当地获得、提取和裂解及扩增在设备内适当地发生,且缺乏来自目标微生物的信号是由于样品内缺乏靶序列,而不是由于设备的故障。
在扩增后,靶核酸的存在可以使用多种方法检测,包括但不限于:电化学检测、侧流检测、荧光检测或比色检测。这一步骤在扩增室内或在单独的检测室中完成,由此一部分流体使用如前所述供电的微泵输送到检测室并使用定时器延迟流体到检测室中的输送直到扩增完成。DNA扩增的检测可以在扩增室中在检测传感器如电化学检测器(例如,稳压器)、光检测器(例如,光电二极管、荧光计)、比色检测器(例如,照度计)等等的存在下直接进行。或者,检测可以在包括检测传感器的单独检测室中进行。对于比色检测,检测传感器可以是允许观看检测室内的颜色改变的窗口。
为实现靶核酸的检测,其用DNA-结合的可检测标记如荧光、化学发光和生色标记及电化学检测标记进行标记。合适的DNA-结合可检测标记的实例包括亚甲基蓝染料、隐色结晶紫、Quant-iT PicoGreen或花色素苷DNA结合染料。
在一个实施方式中,DNA-结合可检测标记存在于扩增混合物中并随着DNA浓度提高通过嵌入DNA的双重螺旋中结合于DNA。添加到扩增室的DNA-结合可检测标记的量是在约5-10μl的范围内的量。标记的DNA(例如,DNA/亚甲基蓝复合物)在电场的存在下与未结合标记(例如,单独的亚甲基蓝)差异地迁移,这用作DNA浓度的量度。电场通过存在于扩增室内并浸没于样品中的电极提供。电极连接于提供电压的稳压器,之后测量阳极峰电流并传送至内置或外部微处理器。
DNA扩增可以使用DNA结合荧光染料监测。合适的DNA-结合荧光染料的实例包括SYBR绿、CYTO9、羟基萘酚蓝(hydroxynapthol blue)或Quant-iT PicoGreen,其在扩增室中或在单独的检测室中。用于检测的DNA-结合荧光染料的量是约5-10μl范围中的量。该设备可以配备与扩增或检测室连接的荧光检测器,及处理单元以提供经处理的输出。或者,来自检测器的信号可以传送到外部处理单元以提供处理的输出。
DNA的扩增可以使用金纳米颗粒、脱氧核酶(DNAzymes)或如上所述的DNA结合染料比色检测,其在DNA存在的情况下引发颜色变化。这种颜色变化可以通过允许观看到检测室内部的窗口人工(通过眼睛)检测、使用连接于检测或扩增室的内置比色检测器检测或者使用检测室如所述地与其连接的外加检测装置检测,例如,以通过颜色变化的分析(如RGB分析)来分析在与比色标记反应后溶液的彩色图像。这也可以通过使匹配色光照射到最终扩增反应混合物上并用光度计监测作为输出的颜色强度来完成。
扩增的DNA可以在扩增室或检测室中使用侧流分析检测。使用侧流分析进行检测的多种配置是可能的。在一个实施方式中,扩增的DNA用配体(例如,生物素或另一配体)和对于靶核酸的标记的寡核苷酸引物进行标记(例如,用荧光素标记如6-羧基荧光素或异硫氰酸荧光素(FITC)或者另一标记进行标记),随后使用该配体的结合剂(例如,抗生物素蛋白或链霉亲和素)复合并通过固定的抗体(例如,抗-FITC抗体)捕获。如上所述,捕获的扩增DNA然后基于所使用的标记进行检测,例如,通过荧光或比色信号,如上所述。
在该设备的另一实施方式中,检测在含有DNA结合染料(其不可能在扩增过程中存在)(例如,Hersch染料)的单独检测室中进行。用于检测的DNA-结合染料的量是约5-10μl范围内的量。DNA结合如对于亚甲基蓝DNA结合所述的在电场的存在下通过电化学检测进行监测。
检测室可以任选地是可移除地连接于设备外部的适合于后续分析的小瓶。
在另一个实施方式中,该设备可以适应以使得在单一室中进行裂解、扩增和检测。为此,含有临床样品的媒介浸入包含扩增混合物(例如,热稳定DNA聚合酶和/或用于RNA靶的逆转录酶、镁、核苷酸、用于特定靶标的核酸引物和DNA结合染料)的单一室中。包括自调节加热器的腔室通过定时器激活以加热到约95℃的温度而裂解病原体。或者,游离DNA/RNA被扩增而无需加热到95℃。在这种情况中,加热步骤可以省略。加热器然后关闭以允许冷却整个样品到约50-70℃的温度用于DNA扩增。在DNA扩增后,DNA结合染料与任何扩增的DNA反应并导致单一室内的颜色变化,其可以如前所述进行检测。
在进一步的实施方式中,该设备可以适应以使得裂解和扩增在单一室中发生,而检测在单独的检测室中发生。在这种情况中,裂解-扩增室包含自调节加热器,其使用机械或电子定时器以特定时间间隔激活和关闭以允许加热到变性温度(例如,95℃)和冷却到扩增温度(例如,约70℃)。扩增的DNA然后可以例如通过泵转运到单独的检测室中用于如前所述的检测。
在另一个实施方式中,该设备可以适应以检测两种或更多种微生物,例如两种或更多种病原体。在这一实施方式中,该设备可以包括两个或更多个扩增室,各适应于扩增不同目标生物体的核酸。因此,设备的这一实施方式的各扩增室将包含靶向于不同微生物的扩增混合物,包含用于所靶向的微生物的寡核苷酸引物。例如,第一扩增室可以包含用于大肠杆菌的寡核苷酸引物,而第二扩增室包含用于单核细胞增生李斯特氏菌的寡核苷酸引物,和第三扩增室包含用于金黄色葡萄球菌(S.aureus)的寡核苷酸引物。在另一实例中,该设备可以包括靶向于各种皮肤感染的扩增室如疱疹、乳头状瘤病毒和金黄色葡萄球菌。该设备可以适应以用于第三世界国家,并包括各适应于鉴别相关目标生物体(如,但不限于登革热病毒、SARS Co-V、埃博拉病毒、拉沙热病毒、结核病毒和/或HIV)的扩增室。
该设备的检测传感器可以适应于与可操作以接收由检测传感器提供的信号和将该信号翻译成所需输出的信号处理单元连接。因此,如果需要,信号处理单元可操作以将由检测传感器提供的输出数字化成可以呈现于例如显示器(例如,监视器等)上的可记录输出。例如,在一个实施方式中,诊断分析的结果可以传输到内置智能阅读器供用户察看结果。信号处理单元可以以包括用于翻译来自检测传感器的输出的任何所需转换器(模-数转换器)的微处理器(例如,数字信号处理器)的形式或用于数字化来自检测传感器的信号的数据采集卡的形式包括在设备内。或者,信号处理单元可以是外部处理系统。在这样的实施方式中,该设备配备有用于与外部处理系统通讯的端口。该端口可以是可起到将电力从外部处理系统传输到该设备和将来自检测传感器的输出传输到外部处理系统用于信号处理的作用的物理端口(例如,USB端口)。或者,端口可以是无线通讯端口,例如使用WiFi或蓝牙协议,其起到将来自检测传感器的输出传输到外部处理系统用于信号处理的作用。外部处理系统的实例包括个人计算机、个人数字助理、网络化移动无线远程通信计算装置如智能手机和内容播放器。
用于实施信号处理单元的本技术的方面可以在系统、方法、计算机程序产品或其任何组合内实现。计算机程序产品可以包括在其上具有计算机可读程序指令的一种或多种计算机可读存储介质,该计算机可读程序指令导致处理器完成本技术的方面。计算机可读存储介质可以是可保持和存储由指令执行装置使用的指令的有形装置。计算机可读存储介质可以是,例如,但不限于电子存储装置、磁存储装置、光存储装置、电磁存储装置、半导体存储装置或前述的任意合适的组合。
计算机可读存储介质的更具体实例的非穷尽列表包括以下:便携计算机磁盘、硬盘、随机存取存储器(RAM)、只读存储器(ROM)、可擦除可编程只读存储器(EPROM或闪存)、静态随机存取存储器(SRAM)、便携只读光盘存储器(CD-ROM)、数字通用光盘(DVD)、记忆棒、软盘、具有记录于其上的指令的机械编码装置如穿孔卡片或槽中凸起结构(raisedstructures in a groove)及前述的任意合适组合。如本文中使用的,计算机可读存储介质不理解为是瞬时信号本身,如无线电波或其它自由传播电磁波、通过波导或其它传输介质传播的电磁波(例如,通过光纤电缆的光脉冲)或通过电线传输的电信号。
本文描述的计算机可读程序指令可以从计算机可读存储介质下载到相应的计算/处理装置或者经由网络(例如,互联网、局域网、广域网和/或无线网络)下载到外部计算机或外部存储装置。网络可以包括铜传输电缆、光传输纤维、无线传输、路由器、防火墙、交换器、网关计算机和/或边缘服务器。各计算/处理装置中的网络适配卡或网络接口从网络接收计算机可读程序指令并转发计算机可读程序指令用于存储到相应计算/处理装置内的计算机可读存储介质中。
用于进行本技术的操作的计算机可读程序指令可以是汇编指令、指令集架构(ISA)指令、机器指令、机器相关指令(machine dependent instructions)、微码、固件指令、状态设置数据(state-setting data)或者以一种或多种编程语言(包括面向对象的编程语言或常规过程式编程语言)的任何组合编写的源代码或目标代码。计算机可读程序指令可以完全地在用户的计算机上、部分地在用户的计算机上、作为独立的软件包、部分地在用户的计算机上和部分地在远程计算机上执行或者完全地在远程计算机或服务器上执行。在后一情形中,远程计算机可以通过任何类型的网络(包括局域网(LAN)或广域网(WAN))连接于用户的计算机,或者可以进行到外部计算机的连接(例如,利用互联网服务提供商(Internet Service Provider)通过互联网连接)。在一些实施方式中,包括例如可编程逻辑电路、现场可编程门阵列(FPGA)或可编程序逻辑阵列(PLA)的电子电路可以通过利用计算机可读程序指令的状态信息使电子电路个性化来执行计算机可读程序指令,从而实施本技术的方面。
这些计算机程序指令也可以存储在可指导计算机、其它可编程数据处理设备或其它装置的计算机可读介质中而以特定的方式发挥功能,以使得存储在计算机可读介质中的指令产生包括指令的制品,该指令实施在一个或多个流程和/或框图模块中指定的功能/活动。计算机程序指令也可以加载到计算机、其它可编程数据处理设备或其它装置上以导致一系列的操作步骤在计算机、其它可编程数据处理设备或其它装置上执行而产生计算机执行的过程,以使得在计算机或其它可编程设备上执行的指令提供用于实施在一个或多个流程和/或框图模块中指定的功能/活动的过程。
关于本文描述的技术的方面可以用于实施(例如,其可以作为信号处理单元发挥功能)的说明性计算机系统在图7中作为框图呈现。说明性计算机系统总体上通过附图标记800表示且包括显示器802、键盘804A和点击装置804B形式的输入装置、计算机806和外部设备808。尽管点击装置804B描绘为鼠标,但应理解也可以使用其它类型的点击装置。
计算机806可以包含一个或多个处理器或微处理器,如中央处理单元(CPU)810。CPU 810执行算术计算和控制函数以执行在内部存储器812,优选随机存取存储器(RAM)和/或只读存储器(ROM),及可能的附加存储器814中的软件。附加存储器814可以包括,例如,大容量存储装置、硬盘驱动器、光盘驱动器(包括CD和DVD驱动器)、磁盘驱动器、磁带驱动器(包括LTO、DLT、DAT和DCC)、闪存盘、程序盒和盒式接口如视频游戏装置中存在的那些、可移除存储芯片如EPROM或PROM、新兴存储介质如全息存储或如本领域中已知的类似存储介质。这种附加存储器814对于计算机806可以是物理内部的,或如图7中所示是外部的,或者两者。
计算机系统800还可以包括用于允许计算机程序或其它指令被加载的其它类似装置。这类装置可包括,例如,允许软件和数据在计算机系统800与外部系统和网络之间传输的通讯接口816。通讯接口816的实例可以包括调制解调器、网络接口如以太网卡、无线通讯接口或者串联或并联通讯端口。经由通讯接口816传输的软件和数据是能够被通讯接口816接收的可以作为电子、声、电磁、光或其它信号的信号形式。当然,可以在单一计算机系统800上提供多个接口。
计算机806的输入和输出通过输入/输出(I/O)接口818执行。这一I/O接口818实施显示器802、键盘804A、外部设备808和计算机系统800的其它这类部件的控制。计算机806也包括图形处理单元(GPU)820。后者也可以作为用于数学计算的(CPU)810的附加或替代(CPU)810用于计算目的。
计算机系统800的各种部件直接地或通过与合适的总线耦合而彼此偶联。
在另一个实施方式中,结果可以使用网络化的移动无线远程通讯计算装置(如装有用于解释结果的特定应用的智能手机)来解释。图9显示智能手机900形式的示例性网络化移动无线远程通讯计算装置;该智能手机900可以作为信号处理单元发挥功能。智能手机900包括显示器902、键盘904形式的输入装置和内置计算机系统906。显示器902可以是触屏显示器且由此用作附加的输入装置,或作为键盘904的替代。内置计算机系统906包括具有一个或多个用于执行算术计算和控制函数的处理器或微处理器的中央处理器(CPU)910,以执行在内部存储器912,优选随机存取存储器(RAM)和/或只读存储器(ROM),中的软件,其与通常包括闪存的附加存储器914耦合,该附加存储器可以集成到智能手机900中或可以包含可移除的闪存卡或两者。智能手机900也包括通讯接口916,其允许软件和数据在智能手机900与外部系统和网络之间传输。通讯接口916与一个或多个无线通讯模块924耦合,其通常包括用于连接于蜂窝网络、无线数字网络或Wi-Fi网络的一个或多个的无线电波。通讯接口916通常也能够实现智能手机900与外部计算机系统的有线连接。麦克风926和扬声器928与内置计算机系统906耦合以支持由内置计算机系统906管理的电话功能,且GPS接收器硬件922也可以与通讯接口916耦合以支持内置计算机系统906的导航操作。内置计算机系统906的输入和输出通过输入/输出(I/O)接口918执行,其实施显示器902、键盘904、麦克风926和扬声器928的控制。内置计算机系统906还可以包括单独的图形处理单元(GPU)920。各种部件直接地或通过与合适的总线耦合彼此偶联。
如本文中使用的,术语“计算机系统”及相关术语不限于任何特定类型的计算机系统,且包括服务器、台式计算机、手提电脑、网络化移动无线远程通讯计算装置如智能手机、平板电脑以及其它类型的计算机系统。
因此,用于实施本文描述的技术的方面的计算机可读程序代码可以包含或存储在智能手机900的内置计算机系统906的存储器912中或计算机806的存储器812中,或者在智能手机900的内置计算机系统906或计算机906外部的计算机可用或计算机可读介质上,或其任何组合上。
因此,在该设备的一个实施方式中,诊断结果使用有线或无线连接发送到智能手机、手提电脑或任何合适的计算装置。计算装置包括可以对用户解释和呈现诊断信息的软件。另外,PON诊断平台可以使用内置电池电源通过DC电源适配器供电,或者通过智能手机、计算机或其它装置经USB或其它合适的连接供电。
在该设备的另一实施方式中,可提供直接对用户分析/解释/显示即时检测(POCT)结果的内置阅读器。
在一个实施方式中,各设备包括射频身份识别(RFID)标签以允许追踪和数据分析。
潜在应用
提供了一次性的经济的POC设备,其具有在宽范围的行业和部门内的应用。起始,该设备有利地制造为一次性的而保持制造成本为可控的,避免在使用后清洁该设备的必要和避免由进一步操作已使用的设备导致可能的病原体感染的扩散。在使用后,该设备可利用建立为避免感染扩散的方案来处置。
这种POC设备的一种用途是快速检测病原体微生物。例如,POC设备可以用于检测病原体微生物,例如但不限于,大肠杆菌、单核细胞增多李斯特氏菌、艰难梭菌、肺炎支原体、肺炎衣原体、沙眼衣原体、嗜肺军团菌、淋病奈瑟氏菌、链球菌、葡萄球菌、流感病毒、呼吸道合胞体病毒、诺瓦克病毒、西尼罗病毒、登革热病毒、SARS Co-V、埃博拉病毒、拉沙热病毒、结核病毒、HIV或中东呼吸综合征冠状病毒。
因此,本POC设备特别可用于在不能利用中心实验室进行分子检验的资源贫乏的情况中检测传染病。例如,这一设备可用于在非洲检测传染病(例如,使用直肠拭子检测腹泻病)或HIV。POC设备可用于在食品加工厂中检验表面的李斯特氏菌或大肠杆菌污染。POC设备可用于在食品加工厂中的实时污染监测和确保清洁过程中的灭菌及防止食品相关的胃肠疾病的爆发。POC设备的另一应用是检测动物中的疾病,如由兽医检测猪中的猪呼吸道病毒,其严重地影响养猪业。这一设备也可以用于在护理和老年疗养院中或者在病人入院时监测医源性(医院获得性)感染。这一设备的另一应用是性传播感染如衣原体的家庭检验。女人可以获取阴道拭子(其对于衣原体检测是高度灵敏的),且使用POC设备进行分析。这一设备也可以用于在大的群体中的实时监视和爆发控制。另外,其可以用于对登机或下机的乘客进行呼吸道病毒检验。
本发明的实施方式在以下具体实施例中描述,该实施例不认为是限制性的。
实施例1–用于病原体检测的PON设备
设备设计
提供了手持的一次性设备10(图1B)。该设备10包括具有最大约250μl的容积的第一提取室12。提取室12包含具有0.1%Triton X-100的PBS的裂解试剂。提取室12包含用于接受含样品拭子的头部的开口11且提取室12大小调节为接受拭子。盖13提供为密封提取室12的开口11。盖13的封闭通过导致缓冲液从泡罩包装释放到提取室12中而激活设备10。提取室12配备有在封闭盖13时激活的第一自调节加热器14,其加热提取室12到约95℃的温度并维持这一温度至少2分钟,例如,通过使用定时器。加热器14连接于控制单元30并通过电池34供电。
提取室12通过微流体通道16连接于扩增室20。泵装置18,例如,微泵或注射器,位于微流体通道16内并起到将经裂解物质从提取室12移动到扩增室20的作用。泵18连接于控制单元30并通过电池34供电。控制单元也包括D/A转换器15用于温度和/或电位控制,及包括A/D转换器25以将模拟检测信号转换为数字信号。定时器在适当时间激活泵18。扩增室20包含通过如所述的定时器激活的第二自调节加热器22,其维持扩增室20内的温度在62℃下20分钟以允许等温扩增,包括环介导等温扩增(LAMP)、交叉引物扩增(CPA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)、滚环扩增(RCA)、赖解旋酶扩增(HDA)、信号介导的RNA扩增技术(SMART)、切刻酶介导的扩增(NEMA)、等温链扩增(ICA)、Smart扩增(Smart-AMP)、指数扩增反应(EXPAR)、网状分枝扩增(RAM)或缺口末端扩增反应(nicking end amplification reaction)(NEAR)。
一旦经裂解材料随时间冷却到约62℃的目标温度,5-10μl的经裂解材料通过泵18转移到扩增室20。经裂解材料在扩增室内用第二自调节加热器24维持在约62℃。第二加热器24连接于控制单元30并通过电池34供电。扩增室包含盐缓冲剂、DNA聚合酶、5mM MgSO4和靶特异性引物的扩增主混合物,例如,15μl的盐缓冲剂溶液、1μl的聚合酶和4μl的特异性引物,以及5-10μl的DNA结合染料(Quant-iT PicoGreen、羟基萘酚蓝和隐色三苯基甲烷(leuco triphenylmethane)染料)。
扩增室20包含检测传感器26,其可以是用于RGB分析的色度计、用荧光染料检测扩增后的荧光变化的荧光计、用亚甲基蓝进行样品的电化学分析的电位计或分析视觉颜色变化的透明观察端口。
在图1A中显示的替代实施方式中,扩增室20通过微流体通道28连接于单独的检测室50,且检测室50包含检测传感器26。
裂解验证
为确认提取室可以使用自调节加热器达到目标温度(93℃)并维持该温度两分钟,使用热电偶监测温度20分钟。测试不同电阻(3.8欧姆、3.5欧姆和3.4欧姆)。所有测量在用热胶粘附于耦合的PTC加热器的锡箔室中进行。为进一步确认这些条件足以裂解各种临床样品,包含呼吸道合胞体病毒A(RSV-A)、无乳链球菌和流感病毒H1的拭子各自置于含有250μl具有0.1%Triton-X100的PBS的提取室中并裂解3分钟,接着在荧光计,Genie II仪上使用扩增混合物,Optigene Lamp主混合物扩增。在各种情况中扩增时间与未裂解的对照比较。在各种情况中使用的来自表1的寡核苷酸引物如下:用于RSV-A的具有SEQ ID NO:20、21、22、23和24的引物,用于无乳链球菌的具有SEQ ID NO:32、33、34、35和36的引物,和用于流感病毒H1的具有SEQ ID NO:7、8、9、10和11的序列的引物。
扩增验证
为确认扩增室20达到所需温度(62℃)并维持这一温度20分钟,热敏电阻用于随时间监测室20温度。使用8.6欧姆的固定电阻,温度监测20分钟。为进一步确认样品在这些条件下成功地扩增,RSV-A、无乳链球菌和流感病毒H1在95℃下在加热块上热裂解10分钟并在含有15μl的Optigene主混合物和5μl的如上所述的特异性引物的扩增室20中扩增15分钟。样品然后从扩增室移除,与10μl的SYBR绿DNA结合染料混合,并与未扩增的阴性对照相比在Genie II仪上测定500-520nm之间的终点荧光。
检测
为评估扩增的DNA是否可以目视或使用电化学检测方式进行检测,使用了多种DNA结合染料(包括Quant-iT PicoGreen(Life Technologies)、羟基萘酚蓝、隐色三苯基甲烷染料和亚甲基蓝)。大约100拷贝的RSV-A、无乳链球菌或流感病毒H1使用包括如上所述的引物的扩增混合物,Optigene LAMP主混合物进行扩增,之后扩增的物质在室温下与10μl的单个DNA结合染料混合3分钟。对于Quant-iT PicoGreen、羟基萘酚蓝和隐色三苯基甲烷染料,由至少10个个体观察染料颜色的视觉变化。对于亚甲基蓝,检测使用利用PalmSens稳压器的循环伏安法基于样品中阳极峰电流的变化实现并与扩增前的基线读数比较。
样品分析
大约500个无乳链球菌细胞、RSV-A颗粒或流感病毒H1颗粒应用于相应的鼻咽拭子以模拟来自感染患者的临床拭子样品。拭子置于提取或设备10的提取室12中。提取室12包含250μl的磷酸盐缓冲盐水和0.1%Triton X-100,其随后使用自调节加热装置加热到95℃。这一温度维持3分钟,之后25μl的裂解溶液使用移液管转移到设备10的扩增室22。25μl的裂解溶液与含有来自Geobacillus的链置换DNA聚合酶、靶向特定无乳链球菌、RSV-A或流感病毒H1基因的引物(如上所述)(总共5μl)、5μl的dNTP、1μl的MgSO4和15μl的盐缓冲剂(pH9.2)的LAMP扩增缓冲液混合。扩增室22使用自调节加热器维持在63℃ 20分钟以允许扩增发生。扩增使用荧光染料(10μl的SYBR绿)监测,且扩增在14分钟内可检测。从临床拭子检测表皮葡萄球菌的总时间是19分钟,其包括5分钟样品释放和裂解步骤。
也使用DNA扩增的电化学检测。在扩增室22中63℃下温育20分钟后,样品使用亚甲基蓝检测和利用PalmSens稳压器的循环伏安法进行分析,并与在扩增前获取的基线读数比较。阳极峰电流的降低指示扩增。两个不同浓度的亚甲基蓝(MB)用于检测500ng的扩增DNA。单独的亚甲基蓝用作对照。
结果
自调节加热的分析
精确温度控制在设备10中对于传染性材料裂解和DNA扩增进行确认。使用了维持提取室中的温度在93℃和扩增室中的温度在62℃的自调节加热器。对于裂解温度,测试各种不同电阻以调查自调节加热器是否可以在室温下的各种条件下适当地发挥功能。据发现93℃的温度在所有测试的电阻下维持超过20分钟(图2)。对于扩增温度,62℃的温度可以在8.6欧姆下维持20分钟(图3)。基于这些结果,自调节加热器确定为足以维持用于裂解和扩增的温度。
样品裂解的评估
为确认设备10在93℃下3分钟内足以裂解临床材料和使临床样本灭菌,呼吸道合胞体病毒(RSV)、流感病毒、大肠杆菌和肺炎链球菌单独地引入设备10的提取室12中用于后续分析。首先确定病毒和细菌在提取室12中杀死以确保该设备在使用后不具有生物危害性。为做到这一点,10,000个细菌或病毒颗粒引入提取室中,进行裂解和随后基于平板接种试验(对于细菌)或通过感染和细胞培养(对于病毒)进行分析。在暴露于提取室12后没有传染性颗粒保留,表明暴露于93℃ 3分钟杀死100%的病毒或细菌。然后确定这些条件释放可以用于DNA扩增的细胞内DNA和RNA。在各样品裂解后,所得的DNA或RNA与阳性裂解对照(珠裂解)相比在Genie II仪器上使用LAMP进行分析。据发现LAMP可以检测来自所有四个样本的释放核酸,表明提取室可用于释放核酸以进行后续分析。
原位等温DNA扩增的评估
为确认等温扩增可以在设备10中进行,RSV、流感病毒、大肠杆菌和肺炎链球菌样品进行珠裂解并在扩增室22内扩增。样品随后基于使用Sybr绿DNA结合染料的终点荧光进行分析。所有样本在10分钟内在扩增室中扩增(图4)。
原位DNA检测
DNA的检测通过使用Quant-It PicoGreen DNA结合染料的视觉颜色和通过使用亚甲基蓝的电位测定法两者进行。为做到这一点,
扩增的DNA与Quant-It PicoGreen或亚甲基蓝染料混合并分别目视地或使用电位测定法进行分析。对于目视检测,DNA存在下的颜色变化且不存在DNA的情况下缺乏颜色变化可通过裸眼检测(图5)。对于亚甲基蓝(MB)DNA检测,测定在DNA存在和不存在的情况下的阳极峰电流。阳极峰电流的20-25%的显著降低在DNA存在的情况下观察到,这指示DNA扩增(图6)。在较低MB浓度(0.1μM)下,与DNA存在的情况下的较高MB浓度(1μM)相比存在阳极峰电流的更高降低。
临床分析
设备10使用临床流感鼻咽拭子、RSV鼻咽拭子和链球菌喉拭子进行测试。拭子从基于培养方法已知阳性的感染患者获得。拭子然后插入到设备10的提取室12中。提取室填充250μl的PBS并在93℃下加热3分钟。随后,裂解的材料泵送到扩增室22中,其在此处与LAMP主混合物混合。扩增室22然后激活15分钟(加热到62℃)且DNA在与Quant-It PicoGreenDNA结合染料混合后在观察小瓶中目视检测。传染物质使用该设备在20分钟内检测。
表1.用于等温扩增和各种病毒和细胞病原体的检测的寡核苷酸引物
表1中示例的引物按照通过引入并入本文的以下参考文献使用:
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本文中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的且不意图是限制的。如本文中使用的,单数形式“一(a和an)”和“该”意图也包括复数形式,除非上下文明确表明其它情况。应进一步理解,术语“包含”和/或“包括”在用于本说明书中时指定所陈述的特征、整体、步骤、操作、元件和/或组分的存在,但不排除一个或多个其它特征、整体、步骤、操作、元件、组分和/或其组合的存在或添加。
以下权利要求中所有手段或步骤加功能元件的对应结构、材料、活动和等同物意图包括用于与具体要求保护的其它要求元件结合以执行功能的任何结构、材料或活动。说明书用于说明和描述的目的提供,而不意图是穷尽的或限制于所公开的形式。许多改进和变化对于本领域技术人员是明显的而不脱离权利要求的范围。选择和描述实施方式以最好地解释该技术的原理和实际应用,并使得本领域技术其他人员能够理解用于具有适合于预想的特定应用的各种改进的各种实施方式的本技术。
一个或多个当前优选的实施方式通过举例方式描述。本领域技术人员清楚,可以进行多种变化和改进而不脱离权利要求的范围。
Claims (26)
1.一种用于检测靶核酸的即时检测设备,包括:
适应于接收生物样品的提取室,其中所述提取室包含提取和裂解所述样品以释放核酸的装置;
与所述提取室连通的第一扩增室,其中所述扩增室包含引发靶核酸序列的核酸扩增发生的装置;和
与所述扩增室连通的检测室,其中所述检测室包含可检测地标记所述靶核酸的装置和检测与标记的靶核酸相关的信号的装置。
2.权利要求1的设备,其另外包括适应于接收所述与标记的靶核酸相关的信号并提供表明标记的靶核酸存在或不存在的输出的处理装置,或者与适应于接收所述与标记的靶核酸相关的信号并提供表明标记的靶核酸存在或不存在的输出的处理装置连接的装置。
3.权利要求1的设备,其中所述提取室包含裂解液和加热器以提取和裂解所述样品。
4.权利要求1的设备,其中所述扩增室包含含有用于靶核酸序列扩增的寡核苷酸引物、DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸、缓冲剂和镁的扩增混合物及加热器以引发核酸扩增。
5.权利要求1的设备,其中所述检测室包含用于标记所述靶核酸的可检测标记和适合于检测标记的靶核酸的检测传感器。
6.权利要求5的设备,其中所述可检测标记选自荧光标记、化学发光标记、显色标记和可电化学检测的标记。
7.权利要求1的设备,其中所述提取室、扩增室和检测室是同一室。
8.权利要求1的设备,其中所述检测室在所述扩增室内。
9.权利要求1的设备,其中所述设备包括适应于扩增阳性对照核酸序列的与所述提取室连通的第二扩增室,其中所述第二扩增室包含含有与对照核酸序列互补的寡核苷酸引物的扩增混合物。
10.权利要求1的设备,其中所述设备包括与所述提取室连通的2个或更多个扩增室,其中各扩增室适应于扩增来自不同目标微生物的靶核酸序列。
11.权利要求10的设备,其中各扩增室包含含有与来自不同目标微生物的靶核酸序列互补的寡核苷酸引物的扩增混合物。
12.权利要求1的设备,包括转移释放的核酸到所述扩增室的泵送装置。
13.权利要求1的设备,其是一次性的。
14.权利要求1的设备,其是手持的。
15.一种所提供的检测生物样品中的靶核酸的方法,包括:
在拭子上收集生物样品和将所述拭子插入适应于从所述拭子提取所述样品和裂解病原体以释放核酸的封闭提取室中;
转移一部分释放的核酸到与所述提取室连接的核酸扩增室并将所述核酸暴露于试剂以诱导核酸扩增;
在与所述扩增室连接的检测室中标记和检测靶核酸;和
获得所述检测室的输出,其表明所述靶核酸的存在或不存在。
16.权利要求15的方法,其中所述提取室被加热用于病原体裂解和核酸的释放。
17.权利要求15的方法,其中所述提取室内衬固定在室壁上的靶标捕获DNA探针。
18.权利要求15的方法,其中在所述提取室内利用正电电场以加速核酸与所述靶标捕获探针的结合。
19.权利要求15的方法,其中电动机用于促进所述提取室中病原体的机械裂解和释放。
20.权利要求15的方法,其中加热器用于维持所述核酸扩增室中58℃-66℃的温度。
21.权利要求15的方法,其中等温DNA扩增用于扩增特定病原体序列。
22.权利要求15的方法,其中DNA的电化学检测使用亚甲基蓝DNA结合染料完成。
23.权利要求15的方法,其中DNA使用侧向流分析进行检测。
24.权利要求15的方法,其中诊断信息传输到内置阅读器。
25.权利要求15的方法,其中诊断信息通过USB连接或通过直接捕获图形图像传输到手机、手提电脑或平板电脑。
26.权利要求15的方法,其中所述诊断平台通过USB连接从手机或手提电脑供电。
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