JP4128074B2 - 核酸の増幅方法 - Google Patents

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    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6853—Nucleic acid amplification reactions using modified primers or templates

Description

技術分野
本発明は、臨床分野において有用な標的核酸の検出方法及び遺伝子工学分野において有用なＤＮＡの合成方法に関し、鋳型となる核酸の増幅方法および該方法で増幅された標的核酸の検出方法に関する。
背景技術
遺伝子工学分野の研究においてＤＮＡの合成は種々の目的に使用される。このうちオリゴヌクレオチドのような短鎖のＤＮＡの合成を除けば、そのほとんどはＤＮＡポリメラーゼを利用した酵素的方法により実施されている。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）があるが、それは米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号および第４，８００，１５９号に詳細に記述されている。もう一つの例としては、トレンズ イン バイオテクノロジー（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）第１０巻、１４６〜１５２頁（１９９２）に記載の当該方法と逆転写酵素反応を組合わせた逆転写ＰＣＲ法（ＲＴ−ＰＣＲ法）が挙げられる。上記の方法の開発により、ＤＮＡから、若しくはＲＮＡから目的とする領域を増幅することが可能になった。
これらのＤＮＡ合成方法は、目的とするＤＮＡ領域を増幅させるために例えば、二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖への解離（変性）、一本鎖鋳型ＤＮＡへのプライマーのアニーリング、プライマーからの相補鎖合成（伸長）の３つのステップからなる反応により、もしくは、”シャトルＰＣＲ”（『ＰＣＲ法最前線』、「蛋白質核酸 酵素」別冊、第４１巻、第５号、４２５頁〜４２８頁（１９９６））と呼ばれる、前述の３ステップ反応のうちプライマーのアニーリングおよび伸長のステップを同一温度で行なう２ステップ反応により実施される。
さらに、別法としては、１９８９年６月１４日に公開された欧州特許出願第３２０，３０８号に記述されているリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ；ｌｉｇａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、あるいはＰＣＲプロトコールズ（ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．，１９９０）２４５〜２５２頁に記述されている転写増幅システム（ＴＡＳ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）法が挙げられる。上記４法は、次の増幅サイクルのための一本鎖標的分子を再生するために、高温から低温の反応を何回も繰り返す必要がある。このように温度によって反応が制約されるため、反応系は不連続な相またはサイクルで行なう必要がある。
従って、上記の方法には広い温度範囲で、かつ、厳密な温度調整を経時的に行なうことのできる高価なサーマルサイクラーを使用することが必要となる。また、該反応は、２種類〜３種類の温度条件で行なうため設定温度にするために要する時間が必要であり、そのロス時間はサイクル数に比例して増大していく。
そこで、上記問題点を解決すべく等温状態で実施可能な核酸増幅法が開発された。例えば、特公平７−１１４７１８号に記載の鎖置換型増幅（ＳＤＡ；ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、自立複製（３ＳＲ；ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）法、日本国特許番号第２６５０１５９号に記載の核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ；ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、日本国特許番号第２７１０１５９号に記載のＱβレプリカーゼ法、さらに米国特許番号第５，８２４，５１７号、国際公開第９９／０９２１１号パンフレット、国際公開第９５／２５１８０号パンフレットあるいは、国際公開第９９／４９０８１号パンフレット等に記載の種々の改良ＳＤＡ法が挙げられる。米国特許番号第５，９１６，７７７号には等温状態でのオリゴヌクレオチドの酵素的合成方法が記載されている。これらの等温核酸増幅法またはオリゴヌクレオチド合成法の反応においては、プライマーの伸長や、一本鎖伸長生成物（または元の標的配列）へのプライマーのアニーリングや、それに続くプライマーの伸長は、一定温度で保温された反応混合物中で同時に起こる。
これらの等温核酸増幅法のうち最終的にＤＮＡが増幅される系、例えば、ＳＤＡ法は、ＤＮＡポリメラーゼと制限エンドヌクレアーゼを介する二本鎖の置換による、試料中の標的核酸配列（およびその相補鎖）の増幅法であるが、該方法では、増幅に使用するプライマーは４種類必要であり、その内の２種類は、制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含むように構築する必要がある。また、該方法では、ＤＮＡ合成のための基質として、修飾されたデオキシリボヌクレオチド３リン酸、例えばα位のリン酸基の酸素原子が硫黄原子（Ｓ）に置換された（α−Ｓ）デオキシリボヌクレオチド３リン酸を大量に用いる必要があり、ルーチンワークで反応を行なう遺伝子検査等においては、そのランニングコストが深刻な問題となってくる。さらに該方法では、増幅されたＤＮＡ断片中に上記の修飾ヌクレオチド、たとえば（α−Ｓ）デオキシリボヌクレオチドが含まれるため、例えば、増幅後のＤＮＡ断片を制限酵素長多型（ＲＦＬＰ；ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｌｅｎｇｔｈ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）解析に供しようとする場合に、該断片が制限酵素で切断できないことがある。
また、米国特許番号第５，８２４，５１７号記載の改良ＳＤＡ法は、ＲＮＡとＤＮＡから構成され、少なくとも３’末端にＤＮＡが配置された構造を必須要件とするキメラプライマーを使用するＤＮＡ増幅方法である。また、国際公開第９９／０９２１１号パンフレットに記載の改良ＳＤＡ法は、３’突出末端を生じさせる制限酵素が必要である。また、国際公開第９５／２５１８０号パンフレットに記載の改良ＳＤＡ法は、少なくとも２組のプライマー対を必要とする。さらに、国際公開第９９／４９０８１号パンフレットに記載の改良ＳＤＡ法は、少なくとも２組のプライマーと少なくとも１種類の修飾デオキシリボヌクレオチド３リン酸を必要とする。一方、米国特許番号第５，９１６，７７７号は、オリゴヌクレオチドを合成するために、３’末端にリボヌクレオチドを有するプライマーを使用してＤＮＡを合成し、反応終了後にエンドヌクレアーゼによりプライマー伸長鎖中のプライマーと伸長鎖の間にニックをいれて分離させ、テンプレートを消化し、さらにプライマーを回収して再利用するというものである。該方法では、プライマーを再利用する際には反応系よりプライマーを単離したうえで鋳型を再度アニーリングさせる必要がある。また、国際公開第００／２８０８２号パンフレットに記載のＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法は増幅に４種類のプライマーを必要とし、また、増幅産物は増幅の標的とされた領域が繰り返された、サイズの一定しないＤＮＡである。
上記のように従来の等温核酸増幅法はまだまだ種々の問題をかかえており、低ランニングコストで、かつ結果的に得られたＤＮＡ断片をさらに遺伝子工学的な処理に使用することが可能な核酸の増幅方法が求められていた。
発明の目的
本発明の主な目的は、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＤＮＡ合成反応により試料中の標的核酸の高感度、特異的に増幅する標的核酸の増幅方法、該方法によって得られた増幅断片の検出方法、該増幅方法を用いた標的核酸の製造方法及びこれらの方法に用いるキメラオリゴヌクレオチドプライマーを提供することにある。
発明の概要
本発明者らは鋭意研究の結果、リボヌクレオチドが３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマー、エンドリボヌクレアーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼの存在下に目的とする領域のＤＮＡを増幅する方法を見出し、優れた遺伝子増幅反応系を構築し、本発明を完成するに至った。該方法は、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いる核酸増幅方法であり、本願明細書ではＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ ａｎｄ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｐｒｉｍｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）法と称する。
本発明の第１の発明は、標的核酸を増幅する方法において、
（ａ）鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびＲＮａｓｅＨを混合して反応混合物を調製する工程；ここで該プライマーは、鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーであり；および、
（ｂ）反応産物を生成するのに充分な時間、反応混合物をインキュベートする工程、
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法に関する。
本発明の第１の発明においては、さらに鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相同な配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する反応混合物を使用することができる。
本発明の第２の発明は、核酸を増幅する方法において、
（ａ）鋳型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的に相補的な少なくとも１種類のプライマーとＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖を合成し、二本鎖核酸を合成する工程；ここで該プライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され、
（ｂ）ＲＮａｓｅＨの存在下、前記工程で得られる二本鎖核酸を鋳型とし、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、置換鎖と二本鎖核酸を合成する工程；および、
（ｃ）（ｂ）工程で得られる二本鎖核酸が鋳型として（ｂ）工程に再利用される工程；
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法に関する。
本発明の第３の発明は、少なくとも２種類のプライマーを使用する、核酸を増幅する方法において、
（ａ）鋳型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的に相補的な少なくとも１種類のプライマーとＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖を合成する工程；ここで該プライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され；
（ｂ）ＲＮａｓｅＨの存在下、前記工程で得られる二本鎖核酸を鋳型とし、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、置換鎖と二本鎖核酸を合成する工程；
（ｃ）（ｂ）工程で得られる二本鎖核酸が鋳型として（ｂ）工程に再度利用される工程；
（ｄ）（ｂ）工程で得られる置換鎖を鋳型として（ａ）工程で使用されたプライマーとは異なる少なくとも１種のプライマーとＤＮＡポリメラーゼにより処理して、置換鎖に相補的なプライマー伸長鎖を合成する工程；ここで該（ａ）工程で使用されたプライマーとは異なるプライマーは置換鎖の塩基配列に実質的に相補的で、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され；
（ｅ）ＲＮａｓｅＨの存在下、前記工程で得られる二本鎖核酸を鋳型とし、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、置換鎖と二本鎖核酸を合成する工程；および、
（ｆ）（ｅ）工程で得られる二本鎖核酸が鋳型として（ｅ）工程に再度利用される工程；
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法に関する。
本発明の第２、３の発明においては、ＤＮＡポリメラーゼとして鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。
本発明の第４の発明は、核酸を増幅する方法において、
（ａ）鋳型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な２種類のプライマーと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖を合成し、合成されたプライマー伸長鎖がアニーリングして成る二本鎖核酸を得る工程；ここで該プライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され、
（ｂ）（ａ）工程で得られるプライマー伸長鎖より成る二本鎖核酸のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼで切断する工程；および、
（ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のそれぞれのプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、鋳型とプライマー伸長鎖より成る二本鎖核酸を得る工程；
を包含することを特徴とする標的核酸の増幅方法に関する。
本発明の第５の発明は、核酸を増幅する方法において、
（ａ）鋳型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な２種類のプライマーと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖を合成し、合成されたプライマー伸長鎖がアニーリングして成る二本鎖核酸を得る工程；ここで該プライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され、
（ｂ）（ａ）工程で得られるプライマー伸長鎖より成る二本鎖核酸のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼで切断する工程；および、
（ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のそれぞれのプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、プライマー伸長鎖がアニーリングした二本鎖核酸を得る工程；
を包含することを特徴とする標的核酸の増幅方法に関する。
本発明の第６の発明は、核酸を増幅する方法において、
（ａ）鋳型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な２種類のプライマーと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖を合成し、合成されたプライマー伸長鎖がアニーリングして成る二本鎖核酸を得る工程；ここで該プライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され、
（ｂ）（ａ）工程で得られるプライマー伸長鎖より成る二本鎖核酸のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼで切断する工程；
（ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のそれぞれのプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、プライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸、及び鋳型同士がアニーリングした二本鎖核酸に（ａ）工程の２種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸を得る工程；
（ｄ）（ｃ）工程で得られる２種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸のそれぞれのプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、プライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸、及び鋳型同士がアニーリングした二本鎖核酸に（ａ）工程の２種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸を得る工程；および、
（ｅ）（ｄ）工程で得られる２種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸が（ｄ）工程で再利用される工程；
を包含することを特徴とする標的核酸の増幅方法に関する。
本発明の第７の発明は、核酸を増幅する方法において、
（ａ）鋳型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な２種類のプライマーと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖を合成し、合成されたプライマー伸長鎖がアニーリングして成る二本鎖核酸を得る工程；ここで該プライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され、
（ｂ）（ａ）工程で得られるプライマー伸長鎖より成る二本鎖核酸のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼで切断する工程；
（ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のそれぞれのプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、プライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸、及び鋳型同士がアニーリングした二本鎖核酸に（ａ）工程の２種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸を得る工程；
（ｄ）（ｃ）工程で得られる２種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸のそれぞれのプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、鋳型とプライマー伸長鎖よりなる二本鎖核酸を得る工程；
（ｅ）（ｄ）工程で得られる鋳型とプライマー伸長鎖よりなる二本鎖核酸のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼで切断する工程；および、
（ｆ）（ｅ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して置換鎖を合成する工程；
を包含することを特徴とする標的核酸の増幅方法に関する。
第４〜７の発明に使用されるエンドヌクレアーゼとしては、エンドリボヌクレアーゼ、例えばＲＮａｓｅＨのようなエンドリボヌクレアーゼを使用することができる。
ＲＮａｓｅＨを使用する上記の第１〜７の発明においては、大腸菌、サーモトガ属、サーマス属、ピロコッカス属、アルカエオグロバス属、バチルス属等の細菌に由来するＲＮａｓｅＨが使用されることができる。
上記の第１〜第７の発明において、標的核酸の塩基配列中の特異的増幅に適した領域としては２００ｂｐ以下の鎖長の領域が例示される。
本発明の第１〜第７の発明には、下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる。
一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’
（ａ：１１以上の整数、ｂ：１以上の整数、ｃ：０または１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ、Ｎ：未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチド、なお、ｄＮａの部位の一部のｄＮはＮで置換されていてもよく、３’末端のヌクレオチドは当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい）
該キメラオリゴヌクレオチドプライマーとしては、ｃが０であるプライマー、ならびにヌクレオチドアナログがデオキシリボイノシンヌクレオチド、あるいはデオキシリボウラシルヌクレオチドであり、修飾リボヌクレオチドが（α−Ｓ）リボヌクレオチドであるプライマーが例示される。さらにこれらのキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する場合には、当該プライマーに適したＤＮＡ伸長反応温度でＤＮＡ伸長反応が実施される。
上記の第１〜第７の発明の増幅方法は、鋳型となる核酸と該核酸の塩基配列に実質的に相補的なキメラオリゴヌクレオチドプライマーを、当該核酸と当該プライマーのアニーリングを増強する物質を含有するアニーリング溶液中でアニーリングさせる工程を包含することができる。上記のアニーリング溶液としてはスペルミジン及び／又はプロピレンジアミンを含有するものが例示される。当該アニーリング処理は、鋳型となる核酸と該核酸の塩基配列に実質的に相補的なキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有するアニーリング溶液を９０℃以上で保温した後、増幅反応が実施される温度以下に冷却して行うことができる。
第１〜第７の発明の増幅反応は、ビシン、およびヘペスから選択される緩衝成分を含有する緩衝液中で実施することができる。
上記の第１〜第７の発明においては、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとして、例えば、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バチルスステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、およびバチルス カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｒｄｏｔｅｎａｘ）由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼを使用できる。
第１〜第７の発明の一態様として、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしてバチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼとして大腸菌由来、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来ＲＮａｓｅＨを使用する態様が挙げられる。該ＲＮａｓｅＨとしては大腸菌由来Ｉ型ＲＮａｓｅＨ、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来ＩＩ型ＲＮａｓｅＨが例示される。
第１〜第７の発明にはエンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。当該ＤＮＡポリメラーゼとしてはバチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼが使用でき、該ＤＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質の存在下に増幅反応を実施することができる。ＢｃａＤＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質としてはマンガンイオンが例示される。
第１〜第７の発明の標的核酸の増幅方法は、ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質の存在下で実施することができる。ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質としてはホスホノギ酸が例示される。
本発明の第１〜第７の発明は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡを鋳型として実施することができ、鋳型となる核酸が二本鎖ＤＮＡである場合には、これを一本鎖ＤＮＡにする工程の後に増幅反応を実施することができる。
上記の鋳型となる核酸はＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって得られたｃＤＮＡであってもよく、ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によってｃＤＮＡを合成する工程の後に増幅反応を実施する態様が例示される。当該逆転写反応には逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することができ、例えば、逆転写反応と鋳型に相補的な伸長鎖の合成とを、逆転写酵素活性と鎖置換活性とを有する１種のＤＮＡポリメラーゼにより実施することができる。このようなＤＮＡポリメラーゼとしては、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、もしくは、バチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼが例示される。
上記の第１〜第７の発明において、その増幅反応は等温条件下に行なうことができ、また、デオキシウリジン３リン酸またはその誘導体のようなデオキシヌクレオチド３リン酸のアナログの存在下に行うことができる。
本発明の第８の発明は、核酸増幅用組成物であって、
（ａ）鋳型となる核酸を該核酸の塩基配列に実質的に相補的な少なくとも１種類のプライマー；ここで該プライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されている、
（ｂ）エンドヌクレアーゼ；および、
（ｃ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ；
を含有することを特徴とする核酸増幅用組成物、に関する。
本発明の第９の発明は、核酸増幅用組成物であって、
（ａ）鋳型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な少なくとも２種類のプライマー；ここで該プライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され；
（ｂ）エンドヌクレアーゼ；および、
（ｃ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ；
を含有することを特徴とする核酸増幅用組成物に関する。
本発明の第１０の発明は、鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１種類のプライマー、およびエンドヌクレアーゼを混合して得られる核酸増幅用組成物であって、該プライマーが鋳型となる核酸の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーである組成物に関する。
本発明の第１１の発明は、鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種類のプライマー、およびエンドヌクレアーゼを混合して得られる核酸増幅用組成物であって、該プライマーが鋳型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーである組成物に関する。
上記の本発明の第８〜１１の発明の組成物に含有されるプライマーとしては、下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーが挙げられる。
一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’
（ａ：１１以上の整数、ｂ：１以上の整数、ｃ：０または１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ、Ｎ：未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチド、なお、ｄＮａの部位の一部のｄＮはＮで置換されていてもよく、３’末端のヌクレオチドは当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい）
該キメラオリゴヌクレオチドプライマーとしては、ｃが０であるプライマー、ならびにヌクレオチドアナログがデオキシリボイノシンヌクレオチド、デオキシウラシルヌクレオチドであり、修飾リボヌクレオチドが（α−Ｓ）リボヌクレオチドであるプライマーが例示される。
上記の第８〜第１１の発明の組成物は核酸の増幅反応に適した緩衝成分を含有することができ、例えば、ビシン、およびヘペスから選択される緩衝成分を含有することができる。
上記の第８〜１１の発明としては、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとして大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、およびバチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼを含有する組成物が挙げられる。また、エンドヌクレアーゼとしては、エンドリボヌクレアーゼ、例えばＲＮａｓｅＨのようなエンドリボヌクレアーゼを使用することができる。上記ＲＮａｓｅＨとしては大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属、サーマス（Ｔｈｅｒｍａｓ）属、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、アルカエオグロバス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属等の細菌に由来のものが例示される。
第８〜１１の発明の組成物の一態様としては、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしてバチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼとして大腸菌由来、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来ＲＮａｓｅＨを含有するするものが挙げられる。該ＲＮａｓｅＨとしては大腸菌由来Ｉ型ＲＮａｓｅＨ、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来ＩＩ型ＲＮａｓｅＨが例示される。
第８〜１１の発明の組成物はエンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含有するものであってもよい。当該ＤＮＡポリメラーゼとしてはバチルスカルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼが使用でき、該ＤＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質を共存させることができる。ＢｃａＤＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質としてはマンガンイオンが例示される。
第８〜１１の発明の組成物は、ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質を含有することができる。ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質としてはホスホノギ酸が例示される。さらに、当該組成物はデオキシウリジン３リン酸またはその誘導体のようなデオキシヌクレオチド３リン酸のアナログを含むことができる。
本発明の第１２の発明は、上記の第１〜３の発明の核酸の増幅方法に使用する核酸増幅用組成物であって、
（ａ）ＲＮａｓｅＨ；および、
（ｂ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ；
を含有することを特徴とする核酸増幅用組成物に関する。
また、本発明の第１３の発明は、上記の第４〜７の発明の核酸の増幅方法に使用する核酸増幅用組成物であって、
（ａ）エンドヌクレアーゼ；および、
（ｂ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ；
を含有することを特徴とする核酸増幅用組成物に関する。
第１３の発明の組成物に使用されるエンドヌクレアーゼはエンドリボヌクレアーゼであることができ、例えば、ＲＮａｓｅＨが例示される。
ＲＮａｓｅＨを含有する第１２、１３の発明の組成物には、ＲＮａｓｅＨとして大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ、サーモトガ属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、サーマス属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、ピロコッカス属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、アルカエオグロバス属由来ＲＮａｓｅＨ、及びバチルス属細菌由来ＲＮａｓｅＨから選択されるＲＮａｓｅＨを使用することができる。
第１２、１３の発明の組成物は、さらに核酸増幅反応に適した緩衝成分を含有することができ、例えば、ビシン、およびヘペスから選択される緩衝成分を含有するものが例示される。
上記の第１２、１３の発明としては、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとして大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、およびバチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼを含有する組成物が挙げられる。また、エンドヌクレアーゼとしては、エンドリボヌクレアーゼ、例えばＲＮａｓｅＨのようなエンドリボヌクレアーゼを使用することができる。上記ＲＮａｓｅＨとしては大腸菌、サーモトガ属、サーマス属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、ピロコッカス属、アルカエオグロバス属、バチルス属等の細菌に由来のものが例示される。
第１２、１３の発明の組成物の一態様としては、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしてバチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼとして大腸菌由来、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来ＲＮａｓｅＨを含有するするものが挙げられる。該ＲＮａｓｅＨとしては大腸菌由来Ｉ型ＲＮａｓｅＨ、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来ＩＩ型ＲＮａｓｅＨが例示される。
第１２、１３の発明の組成物はエンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含有するものであってもよい。当該ＤＮＡポリメラーゼとしてはバチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼが使用でき、該ＤＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質を共存させることができる。ＢｃａＤＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質としてはマンガンイオンが例示される。
第１２、１３の発明の組成物は、ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質を含有することができる。ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質としてはホスホノギ酸が例示される。さらに、当該組成物はデオキシウリジン３リン酸またはその誘導体のようなデオキシヌクレオチド３リン酸のアナログを含むことができる。
本発明の第１４の発明は、本発明の第１〜３の発明の核酸の増幅方法に使用する核酸増幅用キットであって、
（ａ）ＲＮａｓｅＨ；および、
（ｂ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ；
を含有することを特徴とする核酸増幅用キットに関する。
本発明の第１５の発明は、本発明の第４〜７の発明の核酸の増幅方法に使用する核酸増幅用キットであって、
（ａ）エンドヌクレアーゼ；および、
（ｂ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ；
を含有することを特徴とする核酸増幅用キットに関する。
第１５の発明のキットにおいては、エンドヌクレアーゼとしてエンドリボヌクレアーゼを使用することができ、例えばＲＮａｓｅＨが例示される。
ＲＮａｓｅＨを含有する上記の第１４、１５の発明のキットとしては、大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ、サーモトガ属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、サーマス属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、ピロコッカス属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、アルカエオグロバス属由来ＲＮａｓｅＨ、及びバチルス属細菌由来ＲＮａｓｅＨから選択されるＲＮａｓｅＨを含有するキットが例示される。
第１４、１５の発明のキットは、さらに核酸増幅反応に適した緩衝液を含有してもよく、例えばビシン、およびヘペスから選択される緩衝成分を含有することができる。また、鋳型となる核酸と該核酸の塩基配列に実質的に相補的なプライマーのアニーリングを増強する物質を含有するアニーリング溶液を含有する物であってもよく、当該アニーリング溶液としてはスペルミジン及び／又はプロピレンジアミンを含有するものが例示される。
本発明の第１４、１５の発明のキットに含有される鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、およびバチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼが例示される。
第１４、１５の発明のキットの一態様としては、バチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼと大腸菌由来、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来ＲＮａｓｅＨとを含有するキットが例示される。該ＲＮａｓｅＨとしては大腸菌由来Ｉ型ＲＮａｓｅＨ、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来ＩＩ型ＲＮａｓｅＨが挙げられる。
本発明の第１４、１５の発明のキットはエンドヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含有するものであってもよい。当該ＤＮＡポリメラーゼとしてはバチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼが使用でき、該ＤＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質を含有させることができる。ＢｃａＤＮＡポリメラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を発現させる物質としてはマンガンイオンが例示される。
第１４、１５の発明のキットは、ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質を含有することができる。ＤＮＡポリメラーゼの逆転写活性を阻害する物質としてはホスホノギ酸が例示される。さらに、当該キットはデオキシウリジン３リン酸またはその誘導体のようなデオキシヌクレオチド３リン酸のアナログを含むことができる。
本発明の第１６の発明は、本発明の第１〜３の発明の核酸の増幅方法に使用する核酸増幅用キットであって、パッケージされた形態において、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及びＲＮａｓｅＨの使用を指示した指示書を含むことを特徴とする核酸増幅用キットに関する。
本発明の第１７の発明は、本発明の第４〜７の発明の核酸の増幅方法に使用されるキットであって、パッケージされた形態において、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及びエンドヌクレアーゼの使用を指示した指示書を含むことを特徴とする核酸増幅用キットに関する。
本発明の第１８の発明は、包装材と該包装材に封入された核酸増幅用試薬からなる製造品であって、該核酸増幅用試薬が鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及び／又はＲＮａｓｅＨを含有し、該包装材に賦されたラベル又は該包装材に添付された指示書に前記核酸増幅用試薬が等温での核酸増幅に使用できることが表示してなる核酸増幅用試薬の製造品に関する。
本発明の第１９の発明は、包装材と該包装材に封入された核酸増幅用試薬からなる製造品であって、該核酸増幅用試薬が鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼを含有し、該包装材に賦されたラベル又は該包装材に添付された指示書に前記核酸増幅用試薬が等温での核酸増幅に使用できることが表示してなる、核酸増幅用試薬の製造品に関する。
本発明の第２０の発明は、試料中の標的核酸を検出するための方法であって、
（ａ）本発明の第１〜７の発明の核酸の増幅方法により核酸を増幅する工程；及び
（ｂ）（ａ）工程により増幅された標的核酸を検出する工程；
を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法に関する。
本発明の第２０の発明の検出方法においては、得られる増幅核酸を検出用プローブを用いて検出する工程を包含することができる。当該プローブはあらかじめ標識物質により標識されているプローブであってもよく、例えば、消光状態になるような距離で配置された２種類以上の蛍光物質で標識されたＲＮＡプローブを使用することができる。
本発明の第２１の発明は、上記の第２０の発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーに関する。当該キメラオリゴヌクレオチドプライマーとしては、例えば下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーが挙げられる。
一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’
（ａ：１１以上の整数、ｂ：１以上の整数、ｃ：０または１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ、Ｎ：未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチド、なお、ｄＮａの部位の一部のｄＮはＮで置換されていてもよく、３’末端のヌクレオチドは当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい）
該キメラオリゴヌクレオチドプライマーとしては、ｃが０であるプライマー、ならびにヌクレオチドアナログがデオキシリボイノシンヌクレオチド、あるいはデオキシリボウラシルヌクレオチドであり、修飾リボヌクレオチドが（α−Ｓ）リボヌクレオチドであるプライマーが例示される。
本発明の第２１の発明のプライマーとしては、病原微生物検出用、疾病関連遺伝子検出用のプライマーが挙げられ、腸管出血性大腸菌、ボツリヌス菌、黄色ブドウ球菌、結核菌、クラミジア、パピローマウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ウイロイド等の病原性微生物検出用のキメラオリゴヌクレオチドプライマーも本発明に包含される。
本発明の第２２の発明は、配列表の配列番号３１〜３４、４７、４８、５１〜５３、６４〜７２、８４、８５、１１３、１１４、１３０、１３１でそれぞれ表される核酸配列を有する腸管出血性大腸菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
本発明の第２３の発明は、配列表の配列番号５９、６０、１１９、１２０、１２２、１２３でそれぞれ表される核酸配列を有するウイロイド検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
本発明の第２４の発明は、配列表の配列番号１１６、１１７でそれぞれ表される核酸配列を有するボツリヌス菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
本発明の第２５の発明は、配列表の配列番号９６、９７でそれぞれ表される核酸配列を有するパピローマウイルス検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
本発明の第２６の発明は、配列表の配列番号１０１〜１０２、１３８〜１３９、２００〜２０１、２０５〜２０６でそれぞれ表される核酸配列を有するＣ型肝炎ウイルス検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
本発明の第２７の発明は、配列表の配列番号１３６、１３７でそれぞれ表される核酸配列を有する黄色ブドウ球菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
本発明の第２８の発明は、配列表の配列番号１５５〜１５６、１５９〜１６２、１９４〜１９５でそれぞれ表される核酸配列を有する結核菌検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
本発明の第２９の発明は、配列表の配列番号１５７〜１５８、２０３〜２０４でそれぞれ表される核酸配列を有するクラミジア検出用キメラオリゴヌクレオチドプライマーに関する。
本発明の第３０の発明は、上記の本発明の第１〜５の発明の核酸の増幅方法に使用されるキットであって、第２１〜２９の発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有することを特徴とする核酸増幅用キットに関する。
本発明の第３１の発明は、上記の本発明の第２０の発明の標的核酸の検出方法に使用されるキットであって、第２１〜２９の発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有することを特徴とする標的核酸の検出用キットに関する。
本発明の第３２の発明は、本発明の第２０の発明の標的核酸の検出方法に使用されるプローブに関する。
本発明の第３３の発明は、本発明の第１〜７の発明の核酸の増幅方法により増幅された核酸にハイブリダイズするプローブに関する。
本発明の第３４の発明は、本発明の第２１〜２９の発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーから選択されるプライマーで増幅される領域にハイブリダイズするプローブに関する。
第３２〜３４の発明のプローブはあらかじめ標識物質により標識されているプローブであってもよく、例えば、消光状態になるような距離で配置された２種類以上の蛍光物質で標識されたＲＮＡプローブであることができる。
本発明の第３５の発明は、本発明の第２０の発明の標的核酸の検出方法に使用されるキットであって、本発明の第３２〜３４の発明のプローブを含有することを特徴とする。
本発明の第３６の発明は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用し、鋳型交換反応を行う工程を包含する核酸の増幅方法に関する。
本発明の第３６の発明に使用される、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとしては、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、およびバチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼが例示される。
本発明の第３７の発明は、核酸を所定の領域に整列させた核酸固定物を作製するための方法であって、
（ａ）上記の本発明の第１〜７の発明の核酸の増幅方法によって固定化すべき核酸を増幅する工程；および、
（ｂ）（ａ）工程で増幅された核酸を所定の領域に整列させて固定化する工程；
を包含することを特徴とする核酸固定物の作製方法に関する。
本発明の第３８の発明は、上記の第３７の発明の方法で作製された、核酸を所定の領域に整列させた核酸固定物に関する。
本発明の第３９の発明は、核酸を大量に製造する方法であって、
（ａ）上記の本発明の第１〜７の発明の核酸の増幅方法によって核酸を増幅する工程；及び、
（ｂ）（ａ）工程で増幅された核酸を採取する工程；
を包含することを特徴とする核酸の大量製造方法に関する。
本発明の第４０の発明は、核酸を増幅するための方法であって、
（ａ）増幅しようとする配列を含むＤＮＡあるいはＲＮＡを複製し、鋳型となる核酸を調製する工程；及び、
（ｂ）（ａ）で得られた鋳型となる核酸を第１〜７の発明の核酸の増幅方法で増幅する工程；
を包含することを特徴とする核酸の増幅方法に関する。
本発明の第４１の発明は、核酸の塩基配列を決定するための方法であって、第１〜第７、３９、４０の発明の方法の、核酸を増幅する工程を包含することを特徴とする核酸の塩基配列の決定方法に関する。
発明の詳細な説明
本明細書においてデオキシリボヌクレオチド（本明細書中ではｄＮとも記載する）とは、糖部分がＤ−２−デオキシリボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、例えば、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、チミンを有するものが挙げられる。さらに、７−デアザグアノシン等の修飾塩基を有するデオキシリボヌクレオチドやデオキシイノシンヌクレオチドのようなデオキシリボヌクレオチドアナログも上記のデオキシリボヌクレオチドに包含される。
本明細書においてリボヌクレオチド（本明細書中ではＮとも記載する）とは、糖部分がＤ−リボースで構成されたヌクレオチドのことをいい、塩基部分にアデニン、シトシン、グアニン、ウラシルを有するものが挙げられる。さらに、当該リボヌクレオチドには修飾リボヌクレオチドが包含され、例えばα位のリン酸基の酸素原子を硫黄原子に置き換えた修飾リボヌクレオチド［（α−Ｓ）リボヌクレオチド、（α−Ｓ）Ｎとも記載する］やこの他の誘導体等も含まれる。
本明細書においてキメラオリゴヌクレオチドプライマーとは、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含有するプライマーのことを言う。該プライマーはヌクレオチドアナログおよび／または修飾ヌクレオチドを含有していてもよい。
本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、該プライマーの３’末端又は３’末端側にリボヌクレオチドを配置し、本発明の方法において核酸鎖が伸長でき、エンドヌクレアーゼで切断でき、鎖置換反応を行うことができるものであれば、いずれもが本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーに包含される。
本明細書において３’末端側とは、核酸、例えば、プライマーにおいてその中央より３’末端にかけての部分を指す。同様に５’末端側とは、核酸においてその中央より５’末端にかけての部分を指す。
本明細書においてエンドヌクレアーゼとは、鋳型核酸にアニーリングした上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーよりＤＮＡの伸長を行って生成した二本鎖ＤＮＡに作用して、該プライマーのリボヌクレオチド部分を特異的に切断するものであればよい。
本明細書においてＤＮＡポリメラーゼとは、ＤＮＡ鎖を鋳型として新たなＤＮＡ鎖を合成する酵素のことを言い、天然型のＤＮＡポリメラーゼの他、前記活性を有する変異体酵素も包含される。当該酵素としては、例えば鎖置換（Ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有していないＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素活性やエンドヌクレアーゼ活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
本明細書において「鎖置換活性」とは、鋳型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）することができる活性のことをいう。また、本明細書においては、鎖置換により鋳型となる核酸配列から遊離したＤＮＡ鎖のことを「置換鎖」と称する。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）本発明に使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマー
本発明の方法において使用されるプライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド及びヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーである。該プライマーには未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドを含有するオリゴリボヌクレオチドプライマーも含まれる。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型核酸の塩基配列の一部に実質的に相補的な塩基配列を有し、使用される条件において、ＤＮＡ鎖の伸長に寄与することができ、さらに、その３’末端又は３’末端側にリボヌクレオチドが配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーである。当該プライマーは通常、増幅しようとする領域の上流、すなわち鋳型核酸上の増幅しようとする領域に対応する塩基配列の３’側部分に相補的に設計される。なお、ここで「実質的に相補的な塩基配列」とは、使用される反応条件において鋳型となるＤＮＡにアニーリング可能な塩基配列を意味する。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは１以上の修飾リボヌクレオチドを含有するものであってもよい。即ち、本明細書においてリボヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端又は３’末端側に配置され、エンドヌクレアーゼにより認識あるいは切断されるものであれば、未修飾リボヌクレオチドおよび／または修飾リボヌクレオチドのいずれであってもよく、そのような未修飾あるいは修飾リボヌクレオチドのいずれもが包含される。すなわち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、当該プライマーの機能を失わない範囲で未修飾リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチドを使用することができ、さらにこれらを組合せて使用することができる。このような修飾リボヌクレオチドとしては、特に限定するものではないが、たとえば、リン酸基に結合する酸素原子が硫黄原子に置換された（α−Ｓ）リボヌクレオチドや、リボースの２位の水酸基がメトキシ基に置換されたリボヌクレオチドが挙げられる。このような修飾リボヌクレオチドを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、例えば、米国特許第５，００３，０９７号記載の硫化反応試薬（グレンリサーチ社製）を用いた方法で調製した（α−Ｓ）リボヌクレオチド３リン酸、あるいは２−ＯＭｅ−ＲＮＡ−ＣＥ ホスホアミダイド試薬（グレンリサーチ社製）を用いて作製することができる。
また、エンドヌクレアーゼによる切断に耐性を付与するような性質の修飾リボヌクレオチドを含有し、本発明の増幅方法に使用できるキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設計してもよく、この様なプライマーは、増幅反応工程におけるエンドヌクレアーゼの切断位置を制御し得る点において有用である。
本発明の方法で使用するキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、増幅後のＤＮＡ断片を一本鎖もしくは二本鎖のいずれの形態で得たいかによって１種類もしくは２種類を使い分けることができる。すなわち、一本鎖ＤＮＡが望まれる場合には１種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを、また、二本鎖が望まれる場合には２種類のプライマーが使用される。
本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、特に限定するものではないが、約１２ヌクレオチドから約１００ヌクレオチドの長さのものが好ましい。さらに好ましくは、約１５ヌクレオチドから約４０ヌクレオチドの長さのプライマーである。その塩基配列は使用される反応条件において鋳型核酸にアニーリングするように、実質的に鋳型核酸に相補的な配列であることが好ましい。該プライマーは、後に示す段階で使用されるエンドヌクレアーゼにより認識される配列を３’末端又は３’末端側に含む。
本発明を何ら限定するものではないが、例えば、下記一般式で表す構造をもつオリゴヌクレオチドを本発明のＤＮＡ合成方法にプライマーとして使用することができる。
一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’
（ａ：１１以上の整数、ｂ：１以上の整数、ｃ：０または１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド及び／又はヌクレオチドアナログ、Ｎ：未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチド、なお、ｄＮａの部位の一部のｄＮはＮで置換されていてもよく、３’末端のヌクレオチドは当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい）
例えば、上記一般式においてａ＝１１以上の任意の整数で、ｂ＝１、ｃ＝０のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、ｂ＝２、ｃ＝０のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、ｂ＝３〜５、ｃ＝０のキメラオリゴヌクレオチドプライマー、さらにｂ＝２、ｃ＝０〜５のキメラオリゴヌクレオチドプライマー等がいずれも本発明に好適に使用できる。即ち、本発明の方法に用いるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端又は３’末端側のリボヌクレオチドの長さは、好ましくは１ｍｅｒ〜１５ｍｅｒ、さらに好ましくは、１ｍｅｒ〜１０ｍｅｒ、特に好ましくは１ｍｅｒ〜５ｍｅｒである。また、上記一般式中のｃの数は、特に限定はなく、本発明の方法に使用できる数を選択すればよいが、通常５以下が好適であり、４、３、２、１、の順に反応結果が良く、特にｃ＝０の場合が最も反応効率がよい。
本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、該プライマーよりＤＮＡポリメラーゼで伸長されたＤＮＡ鎖（プライマー伸長鎖）に含まれるリボヌクレオチド含有部位がエンドヌクレアーゼで認識あるいは切断されるような構造を有しており、当該リボヌクレオチドはその３’末端又は３’末端側に配置されている。本発明を特に限定するものではないが、例えば、鋳型核酸にアニーリングした、上記の一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーよりＤＮＡの伸長を行って生成した二本鎖ＤＮＡにＲＮａｓｅＨを作用させた場合には、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーのリボヌクレオチド部分が切断され、上記オリゴヌクレオチドプライマーと伸長により合成されたＤＮＡ鎖の間にニックの入った二本鎖ＤＮＡが生じる。さらに、該ニックの入った部位からＤＮＡポリメラーゼにより鎖置換反応がおこる。従って、プライマーの３’末端から核酸鎖を伸長させることができ、エンドヌクレアーゼにより切断されることができ、そしてＤＮＡポリメラーゼにより鎖置換反応ができるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは全て本発明の方法に使用することができる。さらに、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、その３’末端がＤＮＡポリメラーゼによる伸長が不可能な形に修飾されており、エンドヌクレアーゼによる切断によって生じた３’末端からＤＮＡの伸長が行われるものが包含される。
また、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端側にはＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含んでいてもよい。該ＲＮＡポリメラーゼとしては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが例示される。
さらに本発明の方法において使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーはヌクレオチドアナログやその他の物質を含有するものであってもよい。即ち、本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーには、ＤＮＡポリメラーゼによってその３’末端からポリメラーゼ伸長反応せしめる、プライマーの機能を失わない範囲で１以上のヌクレオチドアナログを含有させることができ、さらに、当該ヌクレオチドアナログは複数の種類のものを組合せて使用することができる。該ヌクレオチドアナログとしては、特に限定はされないが、例えば、デオキシイノシンヌクレオチド、デオキシウラシルヌクレオチドあるいは７−デアザグアニンのような修飾塩基を有するヌクレオチドアナログ、リボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログ等を使用することができる。また、本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、上記の機能を保持する範囲内で種々の修飾、例えば標識化合物等の付加がなされたデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、ヌクレオチドアナログを含有してもよい。
ヌクレオチドアナログのプライマーへの導入は、プライマー自身の高次構造形成の抑制、鋳型とのアニーリング形成の安定化の観点からも有効である。さらに、同様の目的でリボヌクレオチドをプライマーに導入しても良い。特に限定するものではないが、非特異的なエンドヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）によるプライマーの分解を防ぐ観点からは、例えば、（α−Ｓ）リボヌクレオチドのような修飾リボヌクレオチドが好適に使用できる。
これらのキメラオリゴヌクレオチドプライマーは、任意の核酸配列を持つように、例えばアプライド バイオシステムズ社（ＡＢＩ社、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）のＤＮＡシンセサイザー３９４型を用いて、ホスホアミダイト法により合成できる。また、別法としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チオホスホネート法等があるが、いかなる方法で合成されたものであっても良い。
（２）本発明に使用されるエンドヌクレアーゼ
本発明に使用されるエンドヌクレアーゼとは、鋳型核酸にアニーリングした上記（１）に記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマーよりＤＮＡの伸長を行って生成した二本鎖ＤＮＡに作用して、鎖置換反応が起こるように伸長鎖を切断しうるものであればよい。即ち、上記の二本鎖ＤＮＡのうちのキメラオリゴヌクレオチドプライマー部分にニックを生成しうる酵素である。特に限定されるものではないが、例えば、本発明にはリボヌクレアーゼが使用でき、特にＤＮＡとＲＮＡとから形成された二本鎖核酸のＲＮＡ部分に作用するエンドリボヌクレアーゼＨ（ＲＮａｓｅＨ）が好適に使用できる。また、該リボヌクレアーゼには、上記作用を有するものであれば、常温性から耐熱性のリボヌクレアーゼのいずれもが好適に本発明に使用できる。例えば、下記実施例に示すように、約５０℃〜約７０℃での反応では大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来のＲＮａｓｅＨが本発明の方法に使用することができる。また、本発明の方法においては、耐熱性のリボヌクレアーゼも好適に使用できる。該耐熱性リボヌクレアーゼとしては、特に限定はされないが、例えば市販のＨｙｂｒｉｄａｓｅＴＭ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＲＮａｓｅＨ（エピセンターテクノロジーズ社製）の他、好熱性バチルス属細菌、サーマス属細菌、ピロコッカス属細菌、サーモトガ属細菌、アルカエオグロバス属細菌等由来のＲＮａｓｅＨ等も好適に使用できる。さらに、該リボヌクレアーゼは、天然体および変異体のいずれもが好適に使用できる。なお、本願明細書に記載されているＲＮａｓｅＨの酵素単位は、実施例中の参考例に示した酵素単位測定方法に基づいて表示された数値である。
また、上記ＲＮａｓｅＨは、本発明の方法に使用できるものであれば特に限定はなく、例えば、種々のウイルス、ファージ、原核、真核生物由来のいずれであってもよい。さらに、細胞性ＲＮａｓｅＨあるいはウイルス性ＲＮａｓｅＨのいずれであってもよい。例えば、上記細胞性ＲＮａｓｅＨとしては大腸菌ＲＮａｓｅＨＩが、ウイルス性ＲＮａｓｅＨとしてはＨＩＶ−１が例示される。本発明の方法においてＲＮａｓｅＨは、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型のいずれもが使用できる。特に限定はされないが、例えば大腸菌由来ＲＮａｓｅＨＩ、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来ＲＮａｓｅＨＩＩが好適である。
また、本発明の方法に使用するエンドヌクレアーゼ、例えば、ＲＮａｓｅＨの切断反応の効率は上記プライマーの３’末端近傍の塩基配列に左右され、所望のＤＮＡの増幅効率に影響することが考えられるので、使用するＲＮａｓｅＨに最適なプライマーをデザインすることは当然のことである。
本明細書において使用されている「ニックを入れる」もしくは「ニッキング」という語は、二本鎖核酸の一方の鎖の内部を切断することを意味する。たとえば、ＲＮａｓｅＨはＤＮＡとリボヌクレオチドを含むＤＮＡとのハイブリッド二本鎖核酸に作用し、二本鎖のうちのリボヌクレオチドを含む鎖のリボヌクレオチド部分を選択的に切断することにより、当該ハイブリッド二本鎖核酸にニックを入れる。
（３）本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼ
本発明には、ＤＮＡの鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することができる。また、実質的に５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有しないものが特に好適に使用することができる。
本発明において、「鎖置換活性」とは、鋳型となる核酸配列に従ってＤＮＡ複製を行う際、ＤＮＡ鎖を置き換えながら進行し、鋳型鎖にアニーリングしている相補鎖を遊離させる、即ち鎖置換（ｓｔｒａｎｄ ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）することができる活性のことをいう。また、本明細書においては、鎖置換により鋳型となる核酸配列から遊離したＤＮＡ鎖のこと「置換鎖」と称する。
本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、上記の鎖置換活性を有するものであれば特に限定はなく、例えば、バチルス カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ、以下、Ｂ．ｃａと称す）やバチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、以下Ｂ．ｓｔと称す）等の好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体や、大腸菌（以下、Ｅ．ｃｏｌｉと称す）由来のＤＮＡポリメラーゼＩのラージ フラグメント（クレノウ断片）等が挙げられる。また、本発明に使用できるＤＮＡポリメラーゼは、常温性から耐熱性のいずれのものも好適に使用できる。
Ｂ．ｃａは生育至適温度が約７０℃である好熱性細菌であり、この細菌由来のＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性（逆転写活性）、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を持つことが知られている。上記の酵素は、その本来の起源より精製して取得されたもの、あるいは遺伝子工学的に生産された組み換え蛋白質の何れであっても良い。また、該酵素は、遺伝子工学的あるいはその他の手法によって置換、欠失、付加、挿入等の改変を加えたものであっても良く、このような酵素の例として、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠損させたＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼであるＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）等が挙げられる。
なお、ＤＮＡポリメラーゼの中には、特定の条件でエンドヌクレアーゼ活性、例えば、ＲＮａｓｅＨ活性を有するものが知られている。このようなＤＮＡポリメラーゼを本発明の方法に用いることができる。すなわち、該ＤＮＡポリメラーゼをＲＮａｓｅＨ活性が発現されるような条件下、例えばＭｎ２＋の存在下で使用する態様が挙げられる。該態様においては、上記ＲＮａｓｅＨを添加することなく本発明の方法を実施することができる。本発明者らは、Ｍｎ２＋を含有する緩衝液中で上記のＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼがＲＮａｓｅＨ活性を示すことを初めて明らかにし、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼ以外の酵素を含有しない反応液中で本発明の核酸増幅法が実施できることを実証した。なお、上記の態様はＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼに限定されるものではなく、ＲＮａｓｅＨ活性を併せ持つことが知られている公知のＤＮＡポリメラーゼ、例えばサーマス サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼも本発明に使用することができる。
（４）本発明に使用される反応バッファーの組成
本発明に使用される反応バッファーには、緩衝成分、マグネシウム塩やその他の金属塩、ｄＮＴＰを含有するものが使用される。また、使用する酵素の金属要求性等に応じて塩の種類及び濃度を最適化するのは当然のことである。緩衝成分は、特に限定はないが、例えば、ビシン、トリシン、ヘペス、トリス、リン酸塩（リン酸ナトリウム、リン酸カリウム等）が好適に使用できる。特にビシン、トリシン、ヘペス、あるいはリン酸塩を緩衝成分として含有するバッファーが本発明に好適である。特に限定はされないが、例えば、反応温度が高い場合は、温度変化によるｐＨの変化が少ないビシン緩衝液が好ましく、また使用するＲＮａｓｅＨの種類によってはヘペス緩衝液が好ましい場合がある。従って、反応温度、使用するエンドヌクレアーゼあるいはＤＮＡポリメラーゼ等によって、最適な緩衝液を選択すればよい。該緩衝成分の最終濃度は５ｍＭ〜１００ｍＭの範囲、特に好ましくは２０ｍＭ〜５０ｍＭの範囲であり、またｐＨ６．０〜９．５、特に好ましくはｐＨ７．０〜９．２の範囲のものが使用される。例えば、２２ｍＭ〜４６ｍＭのトリシンを含有するｐＨ７．５〜９．２のバッファー、あるいは２５ｍＭ〜５０ｍＭのリン酸カリウムを含有するｐＨ７．０〜８．０のバッファーが好適に使用できる。また、マグネシウム塩としては、特に限定はないが、例えば、塩化マグネシウム、酢酸マグネシウムあるいは硫酸マグネシウムが好適に使用でき、その濃度は、最終濃度で１ｍＭ〜２０ｍＭ、特に好ましくは２ｍＭ〜１０ｍＭの範囲である。また、ＤＮＡ伸長反応の基質となるｄＮＴＰｓ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ混合物）は、最終濃度で、それぞれ０．１ｍＭ〜３．０ｍＭ、特に好ましくは０．２ｍＭ〜１．２ｍＭの範囲である。使用するプライマーの量は、反応液量５０μｌ当たり１ｐｍｏｌ〜１０００ｐｍｏｌの範囲であり、特に１０ｐｍｏｌ〜１５０ｐｍｏｌの範囲が好ましい。さらに、反応液中には増幅反応の安定化等を目的とした添加物を共存させることができ、それぞれ最終濃度として０．１％以下のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０％以下のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、４ｍＭ以下のプトレスシン２塩酸塩あるいは０．０１％以下のプロピレンジアミンを添加してもよい。この他、ＮＭＰ（１−メチル−２−ピロロリジノン）、グリセロール、ポリエチレングリコール、ジメチルスルホキシドおよび／またはホルムアミドを含んでもよく、これらの有機溶媒の添加により、オリゴヌクレオチドプライマーの非特異的なアニーリングが軽減されることが期待される。
さらに、ＤＮＡポリメラーゼが有している逆転写活性を阻害するような物質、例えばホスホノギ酸（ＰＦＡ、Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ）を添加して本発明の方法を実施してもよい。逆転写活性を阻害する物質を添加した場合には、標的核酸以外の非特異的な産物の増幅が低減される。
さらにオリゴヌクレオチドプライマーの非特異的なアニーリングを軽減させる別の態様としては、本発明の検出方法、増幅方法あるいは製造方法において、増幅反応に先立って、鋳型となる核酸と本発明で使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリング処理を行うことが効果的である。該処理はアニーリングを増強する物質、例えばスペルミン、スペルミジン等のポリアミン類やプロピレンジアミンを含有するアニーリング溶液を使用して実施することが好ましい。上記のポリアミン類を含有するアニーリング溶液としては塩を含有するものが好適に使用でき、特に限定するものではないが、例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、酢酸カリウム、酢酸ナトリウム等とポリアミン類とを含有するアニーリング溶液が挙げられる。
アニーリング処理は、通常、プライマー、鋳型となる核酸を含有する上記のアニーリング溶液を、２本鎖核酸が変性する温度、例えば、９０℃以上で保持した後、本発明の方法に使用される反応温度以下まで冷却して実施される。
アニーリング処理の工程の後、上記混合液にさらに必要な他の成分、例えばＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅＨ、ｄＮＴＰ等を添加して本発明の核酸増幅反応が開始される。
エンドヌクレアーゼは、例えば、大腸菌由来のＲＮａｓｅＨならば、反応液量５０μｌ当たり３〜２００Ｕの範囲が好ましく、特に１５Ｕ〜６０Ｕの範囲が好適である。同様に、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来ＲＮａｓｅＨならば、反応液量５０μｌあたり３〜２００Ｕの範囲、さらに好ましくは４〜４０Ｕの範囲である。また、ＤＮＡポリメラーゼは、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）ならば、反応液量５０μｌ当たり０．５Ｕ〜１００Ｕの範囲、特に１Ｕ〜２２Ｕの範囲が好ましい。
本発明の方法においてエンドヌクレアーゼとＤＮＡポリメラーゼを組み合わせる場合、特に限定はされないが、例えば大腸菌由来、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来のＲＮａｓｅＨ及びＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが好適である。さらに、上記エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼはいずれもその種類によって好適に使用できるユニット数が異なる場合が予想される。その際には、検出感度の向上あるいは増幅産物量を指標にして、使用されるバッファーの組成ならびに酵素の添加量を調整すればよい。いずれの場合においても、使用する酵素の種類にあわせて反応バッファーの組成等を至適化するのは当然のことである。
（５）本発明の核酸の増幅方法
本発明の方法は、上記（１）に示されたオリゴヌクレオチドプライマーを少なくとも１種類使用し、さらに上記（２）に示されたエンドヌクレアーゼおよび上記（３）に示されたＤＮＡポリメラーゼを組合わせて実施することができる。また、上記のようにＲＮａｓｅＨ活性を有するＤＮＡポリメラーゼをＲＮａｓｅＨ活性が発現するような条件で使用することができる。
当該方法では、伸長反応の基質となるヌクレオチド３リン酸としてＰＣＲ法等に使われるｄＮＴＰ、すなわちｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰの混合物が好適に使用できる。また、ｄＵＴＰを基質として用いてもよい。さらに、当該ｄＮＴＰは、使用されるＤＮＡポリメラーゼの基質となる限りにおいては、ｄＮＴＰ（デオキシリボヌクレオチド３リン酸）のアナログ、たとえば７−デアザ−ｄＧＴＰ、ｄＩＴＰの３リン酸等を含んでいてもよい。また、ｄＮＴＰあるいはｄＮＴＰアナログの誘導体を使用してもよく、官能基を有する誘導体、例えばアミノ基を有するｄＵＴＰを含んでいてもよい。当該方法では、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用するが、当該プライマーは、例えば、ＤＮＡ合成機等を用いて通常の合成方法と同様に調製することができる。さらに、本発明の方法においては、上記キメラオリゴヌクレオチドプライマーと通常のオリゴヌクレオチドプライマーを組み合わせて使用することもできる。
本発明の方法においては、使用される酵素の活性が反応中に低下するおそれのある場合には、反応の途中で当該酵素をさらに添加することができる。特に限定するものではないが、例えば、大腸菌由来のＲＮａｓｅＨを使用する反応の途中で該ＲＮａｓｅＨをさらに添加してもよい。添加する酵素は、反応開始時に反応液中に含まれる酵素と同じものでもよいし、同じ作用を示す異なる種類の酵素であってもよい。すなわち、反応途中で添加することにより、検出感度の向上あるいは増幅産物量の増大等の効果が得られるならば、添加する酵素の種類及び該酵素の性質には何ら限定はない。
本発明の方法において鋳型となる核酸、すなわちＤＮＡまたはＲＮＡは、当該核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から調製、あるいは単離したものでもよい。さらに、上記試料を直接、本発明の核酸増幅反応に使用してもよい。このような核酸を含む試料には特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料（食品、生物学的製剤等）、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料が挙げられる。また、前記試料等を公知の方法で処理することによって得られる核酸含有調製物であっても良い。該調製物としては、例えば細胞破砕物やそれを分画して得られる試料、該試料中の核酸、あるいは特定の核酸分子群、例えば、ｍＲＮＡを富化した試料等が本発明に使用できる。さらに上記試料中に含まれる核酸が公知方法で増幅されたＤＮＡあるいはＲＮＡ等の核酸等も好適に使用できる。
これら材料からの核酸含有調製物の調製には特に限定はなく、例えば、界面活性剤による溶解処理、超音波処理、ガラスビーズを用いた振盪撹拌、フレンチプレスの使用等により行うことができる。幾つかの例においては、さらに操作を加えて核酸を精製することが有利である（例えば、内在性ヌクレアーゼが存在するとき）。これらの例において、核酸の精製はフェノール抽出、クロマトグラフィー、イオン交換、ゲル電気泳動または密度勾配遠心分離等の公知方法により実施される。
ＲＮＡ由来の配列を有する核酸を増幅したい場合には、当該ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって合成されたｃＤＮＡを鋳型として本発明の方法を実施すればよい。本発明の方法に適用することができるＲＮＡには、逆転写反応に使用されるプライマーが作製可能なものであれば特に制限はなく、試料中の全ＲＮＡの他、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ等のＲＮＡ分子群、あるいは特定のＲＮＡ分子種が挙げられる。
上記の逆転写反応に使用されるプライマーは、使用される反応条件において鋳型ＲＮＡにアニールするものであれば特に限定されるものではない。該プライマーは、特定の鋳型ＲＮＡに相補的な塩基配列を有するプライマー（特異的プライマー）の他、オリゴｄＴ（デオキシチミン）プライマーやランダムな配列を有するプライマー（ランダムプライマー）であっても良い。逆転写用プライマーの長さは、特異的なアニーリングを行う観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは９ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。さらに、逆転写用プライマーとして、逆転写後のｃＤＮＡを鋳型とした本発明の核酸増幅法を行う際に鎖置換反応のためのプライマーとして使用可能なキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。このようなプライマーは、上記（１）に記載された性質を有し、かつＲＮＡからの逆転写反応に使用できるものであれば特に限定はない。
上記の逆転写反応に使用される酵素としては、ＲＮＡを鋳型としたｃＤＮＡ合成活性を有するものであれば特に限定はなく、例えばトリ骨髄芽球症ウイルス由来逆転写酵素（ＡＭＶ ＲＴａｓｅ）、モロニーネズミ白血病ウイルス由来逆転写酵素（ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅ）、ラウス関連ウイルス２逆転写酵素（ＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅ）等、種々の起源の逆転写酵素が挙げられる。このほか、逆転写活性を併せ持つＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。また、本発明の目的のためには、高温で逆転写活性を有する酵素が好適であり、例えばサーマス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ等）、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼ等を使用できる。特に限定はないが、例えば、好熱性バチルス属細菌由来ＤＮＡポリメラーゼが好ましく、Ｂ．ｓｔ由来ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ）、さらにＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼが好ましい。例えば、Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写反応にマンガンイオンを必要とせず、また、高温条件下で鋳型ＲＮＡの二次構造形成を抑制しながらｃＤＮＡを合成することができる。上記の逆転写酵素活性を有する酵素も、当該活性を有している範囲において天然体、変異体のいずれもが使用できる。
また、別の態様としては、増幅しようとする塩基配列を含むＤＮＡあるいはＲＮＡをあらかじめ複製した後、本発明の方法の鋳型となる核酸として用いてもよい。該複製の方法としては、特に限定はされないが、増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を挿入したベクターで適当な宿主を形質転換させた後、得られた形質転換体を培養して、上記増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を挿入したベクターを抽出して使用する方法が例示される。該ベクターは、宿主内で安定して複製されるものであれば特に限定はなく、例えば、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＧＥＭ系、コスミド系、ファージ系のいずれもが好適に使用できる。また、宿主は、使用されるベクターを保持することができるものであれば特に限定はなく、例えば、培養が容易な大腸菌等が例示される。
さらに、上記複製の方法の別の態様としては、増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を鋳型としてＲＮＡポリメラーゼで該塩基配列を有するＲＮＡを転写した後、該ＲＮＡをそのまま、あるいは逆転写反応によりｃＤＮＡとして本発明の方法の鋳型に用いてもよい。上記の増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片はＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有していれば特に限定はなく、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するベクターに挿入されたものでもよいし、末端にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するアダプターあるいはカセットをライゲーションさせたものでもよいし、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するプライマーと適切な鋳型を用いて酵素的に合成したものであってもよい。すなわち、上記の増幅しようとする塩基配列を含む核酸断片を、上記のように配置されたＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を用いて、ＲＮＡの形で複製、増幅することができる。上記ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有するものであれば特に限定はなく、例えば、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ系、ｐＧＥＭ系、コスミド系、ファージ系のいずれもが好適に使用できる。また、該ベクターは、環状のままあるいは直鎖状に処理したもののいずれもが好適に使用できる。さらに、上記の複製、増幅方法に用いられるＲＮＡポリメラーゼは特に限定はなく、例えば、ＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼあるいはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ等が好適に使用できる。
上記方法により単離したゲノムＤＮＡやＰＣＲフラグメントのような二本鎖ＤＮＡ、および全ＲＮＡ若しくはｍＲＮＡから逆転写反応で調製されたｃＤＮＡのような一本鎖ＤＮＡのいずれもが本発明において鋳型ＤＮＡとして好適に使用できる。上記二本鎖ＤＮＡの場合は、一本鎖ＤＮＡに変性する工程（デネーチャー）を施したもの及び一本鎖ＤＮＡに変性する工程を施さないもののいずれもが好適に使用できる。
また、鋳型がＰＣＲ増幅産物のような直鎖状２本鎖ＤＮＡにおいては、本発明の方法に用いるプライマーがアニーリングする位置を、該ＤＮＡの末端から約５０塩基程度内側に設定することにより、前述のデネーチャーの工程を行わなくても本発明の核酸の増幅方法を行うことができる場合がある。ＲＮＡ由来の配列を有する核酸の増幅を目的とする場合には、ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応によって得られたＲＮＡ−ｃＤＮＡ二本鎖核酸を、ＲＮａｓｅＨを含有する本発明の増幅用反応液に加えることにより、ＲＮＡ鎖を分解して一本鎖ｃＤＮＡとし増幅反応を開始することができる。さらに、本発明のＤＮＡの合成方法に逆転写酵素活性と鎖置換活性とを有するＤＮＡポリメラーゼを使用することにより、ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応と、当該反応によって生成したｃＤＮＡを鋳型にしたＤＮＡ増幅反応とを１種類のＤＮＡポリメラーゼで行なうことができる。
上記鋳型の長さは、標的配列がその断片中に完全に含まれるか、または標的配列の十分な部分が少なくとも断片中に存在することにより、プライマー配列の十分な結合を提供するようなものがよい。
本発明の方法では、特に限定するものではないが、鋳型ＤＮＡが二本鎖ＤＮＡの場合にはそれらを変性して一本鎖にすることにより鋳型ＤＮＡ鎖へのプライマーの結合を可能にさせることができる。二本鎖ＤＮＡが変性する温度、例えば約９５℃で保持することは好ましい変性法である。他の方法はｐＨの上昇を含むが、オリゴヌクレオチドプライマーを標的物に結合させるためには、増幅反応時にｐＨを低下させる必要がある。上記のような二本鎖を一本鎖ＤＮＡに変性する工程、もしくは、鋳型がＲＮＡの場合、逆転写反応によりｃＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）を調製する工程の後、等温条件下において、連続的に核酸が増幅される。
ここで、「連続的に」とは、反応温度、反応液組成の変更を伴わずに反応が進行していることを意味する。また、本明細書において「等温」とは、酵素および核酸鎖が上記各工程において機能する、実質的に一定の温度条件のことを意味する。
本発明の核酸増幅反応は、例えば、クレノウ断片のような常温性ＤＮＡポリメラーゼを使用することにより常温（例えば３７℃）でも実施できるが、耐熱性を有する酵素（エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ）を使用して高温、例えば５０℃以上で、さらに例えば６０℃以上で実施することができる。この場合、プライマーの非特異的なアニーリングが抑制され、ＤＮＡ増幅の特異性が向上し、また鋳型ＤＮＡの二次構造が解消されることによりＤＮＡポリメラーゼの伸長性も向上する。さらに該方法においては、逆転写反応および核酸の増幅を連続して行なう態様も可能であり、上記反応に逆転写酵素を組み合わせて、あるいは逆転写活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して、ＲＮＡ由来の配列を有するＤＮＡを増幅することができる。
本発明を特に限定するものではないが、本発明の各態様において、好ましくは、まず一本鎖の鋳型ＤＮＡに該ＤＮＡに相補的なキメラオリゴヌクレオチドプライマーをアニーリングさせる。次にＤＮＡポリメラーゼの作用により、当該プライマーの３’末端より鋳型ＤＮＡの残りの配列に沿って鋳型ＤＮＡに相補的なＤＮＡ（プライマー伸長鎖）を伸長させて二本鎖ＤＮＡを合成する。エンドヌクレアーゼは当該二本鎖ＤＮＡに作用してプライマー伸長鎖のプライマー部分からの新たなＤＮＡの伸長を開始させる。本発明の一つの態様においては、エンドヌクレアーゼは上記の二本鎖ＤＮＡにニックを入れるニッキング酵素として作用するか、あるいはキメラオリゴヌクレオチドプライマーと鋳型ＤＮＡの二本鎖ＤＮＡ構造を変化させるが、本願発明は理論によって限定はされない。さらに、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼがニックの入った二本鎖ＤＮＡのニックの３’末端からＤＮＡ鎖を再伸長して新たなプライマー伸長鎖を生成し、同時にニックの３’末端から下流のＤＮＡを遊離させる。こうして先に合成されたプライマー伸長鎖が新たなプライマー伸長鎖に置換される。
本発明の核酸増幅方法は、鋳型核酸に相補的なキメラオリゴヌクレオチドプライマーと、置換鎖に相補的なもう１種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーの２種のプライマーを使用して実施することができる。この場合、一方のプライマーは鋳型となるＤＮＡ鎖に結合して鎖置換反応を起し、そして他方のプライマーは上記の鎖置換反応によって遊離した置換鎖に結合し、新たな鎖置換反応を開始する。この態様を使用すると、各反応産物が他のプライマーのための鋳型として機能できることは明らかである。このように鋳型量が増加することにより、非直線的に増幅産物が増加していく。
二本鎖ＤＮＡを鋳型に用いて本発明の核酸増幅方法を実施する場合には、二本鎖のそれぞれにアニーリングするキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用することにより、両方の鎖を増幅反応の鋳型とすることができる。二本鎖ＤＮＡを変性した後に反応を開始する場合には、変性する前または後に、キメラオリゴヌクレオチドプライマー、４種のデオキシリボヌクレオチド３リン酸（ｄＮＴＰ）、ＤＮＡポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを反応液に添加する。熱処理により二本鎖ＤＮＡを変性し、かつ耐熱性の酵素を使用しない場合には、変性後に酵素を添加することが好ましい。
二本鎖の鋳型ＤＮＡと２種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する本発明の核酸増幅方法の態様においては、反応の条件等にもよるが、各プライマーから伸長反応中のそれぞれの鋳型−伸長鎖中間体の間で鋳型の交換が起こり、合成されたプライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸を生成することがある。この二本鎖核酸は両端にキメラオリゴヌクレオチドプライマーを有しており、次いでその両端から再び鎖置換による相補鎖伸長反応を開始することができる。この反応の結果、一端にプライマーの配列を有する増幅産物が生成される。さらに、この反応中に鋳型の交換が起こった場合には前妃と同様な二本鎖核酸が再度生成される。
本発明により、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用し、鋳型交換反応を行う工程を包含する核酸の増幅方法が提供される。当該鋳型交換反応においては、鋳型となる二本鎖核酸と、それぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な２種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーと、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼの存在下に、該鋳型に相補的な２種のプライマー伸長鎖が合成される。該プライマー伸長鎖の合成の途中において、プライマー伸長鎖のそれぞれの鋳型から他方のプライマー伸長鎖への鋳型の交換が起こる。
ここで、鋳型交換反応とは、２本鎖核酸の両側からの鎖置換反応による相補鎖の合成が行われる際に、ＤＮＡポリメラーゼがその鋳型を交換し、他方のＤＮＡポリメラーゼが新規に合成してきた相補鎖をそれぞれ鋳型として、以降の相補鎖合成を行うことを言う。言い換えれば、鋳型となる２本鎖核酸をそれぞれのプライマー及び鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼで処理し、該鋳型に相補的な伸長鎖を生成せしめる反応において、該伸長鎖を合成中に、ＤＮＡポリメラーゼがプライマー伸長鎖を、当初の鋳型から、他方のプライマー伸長鎖へと能動的に鋳型をスイッチングせしめる反応を言う。ＤＮＡポリメラーゼが鋳型交換反応を行う能力を有することは、特に限定するものではないが、例えば後述の実施例３２に記載の方法によって確認することができる。
本発明には、鎖置換反応中に上記の鋳型交換反応を行う能力を有するＤＮＡポリメラーゼが好適に使用でき、例えば、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を欠失したＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼの変異体酵素が特に好適に使用される。当該酵素はＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）として市販されており、また、該酵素の遺伝子を含有する大腸菌、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＨＢ１０１／ｐＵＩ２０５（ＦＥＲＭ ＢＰ−３７２０）（平成３年５月１０日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託）より日本特許第２９７８００１号に記載の方法によって調製することもできる。
本発明を特に限定するものではないが、本発明の核酸の増幅方法の反応様式は、例えば以下のように考察される。
本発明の核酸を増幅する方法においては、鋳型となる二本鎖核酸を、ＲＮａｓｅＨの存在下、それぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な２種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマーと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖が合成され、鋳型交換反応により、合成されたプライマー伸長鎖同士がアニーリングして成る二本鎖核酸、及び鋳型同士がアニーリングした二本鎖核酸に前記２種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸を得ることができ、後者の二本鎖核酸は鋳型として再利用される。
プライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸のリボヌクレオチド含有部位はＲＮａｓｅＨで切断され、当該二本鎖核酸のそれぞれのプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換が行われ、鋳型交換反応により、プライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸、及び鋳型同士がアニーリングした二本鎖核酸に前記２種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸を得ることができる。
また鋳型交換反応が起こらない場合は鋳型とプライマー伸長鎖から成る２種の二本鎖核酸を得ることができる。
上記の２種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸のそれぞれのプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換が行われ、鋳型交換反応により、プライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸、及び鋳型同士がアニーリングした二本鎖核酸に前記２種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸を得ることができ、２種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸は鋳型として再利用される。
また鋳型交換反応が起こらない場合は鋳型とプライマー伸長鎖から成る２種の二本鎖核酸を得ることができる。
この２種の二本鎖核酸のリボヌクレオチド含有部位はＲＮａｓｅＨで切断され、当該二本鎖核酸のそれぞれのプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列が伸長され鎖置換が行われる。
また本発明の核酸を増幅する方法においては、鋳型となる二本鎖核酸を、ＲＮａｓｅＨの存在下、それぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な２種類のキメラオリゴヌクレオチドプライマーと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖が合成され、鋳型交換反応が起こらない場合は、鋳型とプライマー伸長鎖よりなる２種の二本鎖核酸が得られる。
また、本発明の増幅方法において、キメラオリゴヌクレオチドプライマー伸長鎖のリボヌクレオチド含有部位が切断される際に、当該切断によって生じる５’側の断片（プライマー部分）がリボヌクレオチドを含有しないように切断される場合がある。こうして生じたプライマー部分から伸長されたプライマー伸長鎖はもはやエンドヌクレアーゼにより切断されず、この結果、末端にプライマーの配列を有する増幅産物が生成される。
上記のように、本発明の核酸増幅方法においてはプライマーの配列を含まない増幅産物の他、一端、もしくは両端にプライマーの配列を有する産物が生成しうる。これらの産物も本発明にいう増幅産物に包含される。
本発明の核酸の増幅方法の一例を図３３〜３６に示す。すなわち図３３〜図３６は本発明の核酸の増幅方法における核酸の増幅の例を示す図である。
図３３〜図３６で示される核酸の増幅の例においては、二本鎖核酸である鋳型ＤＮＡ、当該鋳型ＤＮＡの塩基配列の情報に基づいて合成された一対のキメラオリゴヌクレオチドプライマー（図中キメラオリゴヌクレオチドプライマーは、その３’末端に３個のリボヌクレオチドを有している。図中リボヌクレオチドを白丸で示す）、鎖置換活性を有する鎖置換型ＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド部位を切断するリボヌクレアーゼであるＲＮａｓｅＨ、および伸長鎖に取り込まれる基質であるｄＮＴＰの存在下での核酸の増幅の例が示されている。
図３３に示すように、鋳型ＤＮＡの塩基配列の情報に基づいて合成された一対のキメラオリゴヌクレオチドプライマーは鋳型ＤＮＡの特定部分にアニーリングし、ステップ１に示すように、鎖置換反応により各キメラオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端からＤＮＡ鎖が伸長する。
次に、図３４に示すように、上流側と下流側から伸長してきたプライマー伸長鎖は、ステップ２に示す鋳型交換反応により、ある割合で元の鋳型から離れ、その３’部分でプライマー伸長鎖同士がアニーリングする。このアニーリングした伸長鎖同士がさらに互いの相補鎖を伸長し、プライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖ＤＮＡを形成する。また、置換鎖同士がアニーリングした二本鎖ＤＮＡに、前出一対のキメラオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングした二本鎖ＤＮＡが生成する。これは図３４の出発物質として利用される。
図３４に示した、プライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖ＤＮＡは、図３５のステップ３に示すように、ＲＮａｓｅＨの作用によって当該二本鎖ＤＮＡのＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド部分の、キメラオリゴヌクレオチドプライマーに由来するＲＮＡを含む片方の鎖のみが切断され、二本鎖ＤＮＡに切れ目（ニック）が導入される。
引き続き図３５のステップ４に示すように、二本鎖ＤＮＡの切れ目の部分から鎖置換反応が起こり、ＤＮＡが伸長する。次いで図３５のステップ５に示すように、ある割合で図３４のステップ２と同様に鋳型交換反応がおこり、増幅生成物であるプライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖ＤＮＡが生成する。
また、置換鎖同士がアニーリングした二本鎖ＤＮＡに前出一対のキメラオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングした二本鎖ＤＮＡが生成する。
次に、図３６に示すように、図３５に示した置換鎖同士がアニーリングした二本鎖ＤＮＡに、前出一対のキメラオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングした二本鎖ＤＮＡでは、鎖置換反応により各キメラオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端からＤＮＡ鎖が伸長する。ついでステップ２、およびステップ５と同様な鋳型交換反応がある割合で起こり、プライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖ＤＮＡが生成する。当該二本鎖ＤＮＡは図３５のステップ３に戻り、再度ステップ３以降の反応が開始される。また、置換鎖同士がアニーリングした二本鎖ＤＮＡに前出一対のキメラオリゴヌクレオチドプライマーがアニーリングした二本鎖ＤＮＡが生成し、図３６の出発物質として利用される。これらの結果、これらの二本鎖核酸の生成が繰り返される連鎖反応が生じ、一対のキメラオリゴヌクレオチドプライマーによって挟まれた領域が特異的に増幅産生される。
キメラオリゴヌクレオチドを使用する本発明の核酸増幅方法においては、増幅領域が連なった重合体を生成する場合がある。このような重合体は増幅領域が複数個、いずれも同じ向きに連なったものであり、電気泳動による増幅産物の解析ではラダー状のバンドとして確認される。当該重合体の生成は、増幅される領域、該領域のサイズ、その隣接領域、使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの塩基配列あるいは反応の条件等により影響を受けることが考えられている。
上記の重合体は、増幅領域を複数個含むものである。当該重合体は、例えば適切なプローブとのハイブリダイゼーションによって多数のプローブとハイブリダイズし、当該重合体が強いシグナルを発生することから、増幅領域を含む核酸の検出を目的とする場合に有用である。また、制限酵素消化等を組み合わせて、重合体より増幅領域、またはその一部をモノマーとして得ることもできる。
本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼは、プライマー部分の３’末端から下流への伸長鎖合成に伴い、先に伸長されたＤＮＡ鎖の置換を行う必要がある。そして重要なことは置換鎖を分解する可能性のある５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示さないことである。このようなＤＮＡポリメラーゼ、例えば大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのエキソヌクレアーゼ欠損変異体であるクレノウ断片、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ由来の同様の断片（ニューイングランドバイオラブス社製）、Ｂ．ｃａ由来のＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）が有用である。シークエネース１．０およびシークエネース２．０（米国バイオケミカル社）、ジーン（Ｇｅｎｅ）第９７巻、１３〜１９頁（１９９１）記載のＴ５ＤＮＡポリメラーゼおよびφ２９ ＤＮＡポリメラーゼも使用することができる。通常は５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼであっても、その活性が適当な阻害剤の添加により阻害することが可能な場合は、本発明のＤＮＡ合成方法に使用できる。
本発明の核酸の増幅方法は、変温で行ってもよく、又は等温で行ってもよい。ここで変温とは、各工程の反応を妨げない範囲で各工程の反応温度を変化させることを意味する。すなわち、例えば、プライマーのアニーリング、相補鎖の合成反応、相補鎖のニッキング、そして置換反応のそれぞれに適した温度に変化させる場合のことをいう。
次に等温とは、各工程の反応温度を変化させず、各工程が実質的に一定の温度で行われることを意味する。いずれの場合においても、最適の反応条件となるように温度を設定するのは当然である。
本発明の核酸の増幅方法の１つの特徴としては、核酸の合成方法において温度を上げ下げする必要がないことにある。即ち、本発明は等温での核酸の合成方法を提供する。従来の多くの核酸増幅法は、温度を上下することにより合成鎖から標的物を解離する必要があり、例えばサーマルサイクラーのような特別な反応装置を必要とするが、本発明の方法においては一定温度を保持できる装置のみでも実施することができる。このように、本発明の方法は、単一の温度で実施することができる。好ましくは、プライマーの非特異的なアニーリングが低減され、かつ鋳型となる核酸にプライマーが特異的にアニーリングするように反応温度、ストリンジェンシーのレベルを設定して実施される。特に限定するものではないが、上記のように耐熱性の酵素を用いて本発明の方法を高温条件下で行う事ができる。さらに、反応の効率を高く保つ観点から、本発明の方法は使用する酵素の活性が十分に保持される適当な温度で行うことが好ましい。従って、使用する酵素にもよるが、好ましい反応温度は、約２０℃〜約８０℃であり、さらに好ましくは約３０℃〜約７５℃であり、特に好ましくは、約５０℃〜約７０℃である。特に高温条件下で反応を行う場合には、常温で反応を行う場合よりも鎖長の長いプライマーを使用することが好ましい。各反応温度に適したプライマーの配列及び長さの設定については、例えば、そのＴｍ値を参考にしてもよく、あるいは市販のプライマー設計ソフト、例えば、ＯＬＩＧＯＴＭ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｏｆｔｗａｒｅ（宝酒造社製）を使用してもよい。例えば、本発明の方法において反応温度を５５℃から６０℃あるいは６５℃に設定した場合、該方法に使用するプライマーの長さとしては、特に限定するものではないが、例えば１２ヌクレオチド〜１００ヌクレオチドの長さ、好ましくは１４ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの長さ、さらに好ましくは１５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドの長さのプライマーが使用できる。このように反応温度を上げることの効果としては、鋳型ＤＮＡの二次構造を解消できることが挙げられ、ＧＣ含量の高い鋳型核酸を使用した場合にも所望の核酸が増幅される。また、長鎖長の領域を増幅する場合においても同様の効果がある。該効果は、約６０ｂｐ〜約２０ｋｂｐの範囲で、さらに約１１０ｂｐ〜約４．３ｋｂｐの範囲で、特に約１３０ｂｐ〜約１５００ｂｐの範囲で認められる。
さらに、鋳型となる核酸のＧＣ含量に応じて反応温度を調節し、増幅効率を向上させることができる。例えば、鋳型となる核酸としてＧＣ含量の低いものを使用する場合には、増幅する鎖長やプライマーのＴｍ値にもよるが、５０〜５５℃で本発明の増幅反応を行うことができる。
また、本発明の方法において、逆転写酵素活性を持つＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを使用した場合、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する工程（逆転写反応）を含むＲＮＡ由来の核酸の増幅を簡便に実施することができる。また、ＲＮＡからｃＤＮＡを調製する工程を独立させて行い、その生成物（ｃＤＮＡ）を本発明の方法に鋳型ＤＮＡとして使用することもできる。
いずれの場合においても、本発明の方法においては、適当な方法、例えば酵素を失活させたり反応温度を低下させて反応を停止させるか、または基質のうちのいずれか一つが使い尽くされるかのいずれかまで繰り返される。
本発明の核酸の増幅方法は、核酸の増幅を利用した種々の実験操作、例えば核酸の検出、標識、塩基配列の決定に使用することができる。
また、本発明の核酸の増幅方法は、ｉｎ ｓｉｔｕ核酸増幅方法、ＤＮＡチップのような固相担体上での核酸増幅方法あるいは多種類の領域を同時に増幅するマルチプレックス核酸増幅方法として使用することができる。
本発明の核酸の増幅方法の特徴の一つとして、一本鎖のＤＮＡを調製することが可能なことが挙げられる。この目的のためには、１種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する方法のみならず、２種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用する方法を使用することもできる。例えば、２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いる場合は、一方のオリゴヌクレオチドプライマー量を他方の量に対して過剰にして増幅反応を行なう、いわゆるアシンメトリック（非対称）−ＰＣＲ法において採用される方法と同様のプライマー比率によって行なうことができる。当該プライマー比率は、特に限定されるものではないが、１：１０〜１：５００の範囲で好適に使用でき、特に好ましくは１：１０〜１：１００の範囲である。この結果、一方の鎖を置換した産物の量が、他方の鎖を置換した産物の量に比べて過剰になる。
本発明の核酸の増幅方法によれば実質的にその相補鎖を含有しない一本鎖のＤＮＡを調製することができ、例えば、ＤＮＡチップのような核酸固定化物を作製するための一本鎖ＤＮＡ、標的核酸検出のための一本鎖ＤＮＡプローブ、または長鎖ＰＣＲ法のためのメガプライマーを容易にしかも短時間に作製することができる。また、本発明の方法を使用することにより、センス配列のみ、あるいはアンチセンス配列のみを選択して増幅させることが可能である。従って、本発明はセンス配列あるいはアンチセンス配列を有する核酸の製造方法としても有用である。
また、本発明の方法は、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝液中で行うことにより微量の鋳型となる核酸からでも所望の核酸配列領域を増幅することができる。
さらに、本発明の核酸の増幅方法には経時的な温度調節が可能な反応装置を使用する必要がないため、大容量の反応液を使用して増幅反応を実施することができる。したがって、例えば医薬用途等に使用される核酸の工業的大量製造が可能である。
本発明の核酸の増幅方法において使用するプライマーの利用効率は、ほぼ１００％であり、従来の方法、例えばＰＣＲ法の利用効率に比べて５倍〜１０倍高くすることができる。
また、本発明の核酸増幅方法は、鋳型となる核酸の塩基配列に忠実に増幅産物を生成することができる。本発明の方法におけるＤＮＡ合成の誤りの頻度を得られた増幅産物の塩基配列を解析することによって確認したところ、高い忠実度で核酸を増幅できることが知られているＬＡ−ＰＣＲ法と本発明の方法のそれぞれで得られた増幅産物中に見出された誤りの頻度は同程度であった。すなわち、本発明の方法はＬＡ−ＰＣＲ法に匹敵する忠実度を有している。
（６）本発明の標的核酸の検出方法および該方法のためのキット
本発明の核酸の増幅方法を使用することにより、試料中の標的核酸の検出を行うことができる。当該検出方法は、
（ａ）上記の本発明の核酸の増幅方法により、標的核酸を増幅する工程；および、
（ｂ）上記工程により増幅された標的核酸を検出する工程；
を包含する。
上記（ａ）行程において、ＲＮＡを鋳型とする場合は、逆転写反応と核酸増幅反応を１段階で行ってもよい。特に限定はされないが、逆転写酵素と鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせとして例えば、ＡＭＶ ＲＴａｓｅ、ＭＭＬＶ ＲＴａｓｅあるいはＲＡＶ−２ ＲＴａｓｅとＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが好適に使用できる。
上記方法は試料中に存在する特定の遺伝子の検出、定量に利用することができる。すなわちＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸を含む可能性のあるあらゆる試料から特定の遺伝子を検出、定量することができる。前述の試料としては、特に限定はないが、例えば、全血、血清、バフィーコート、尿、糞便、脳脊髄液、精液、唾液、組織（例えば、癌組織、リンパ節等）、細胞培養物（例えば、哺乳動物細胞培養物及び細菌培養物等）のような生体由来試料、ウイロイド、ウイルス、細菌、カビ、酵母、植物及び動物のような核酸含有試料、ウイルス又は細菌のような微生物が混入もしくは感染している可能性のある試料（食品、生物学的製剤等）、あるいは土壌、排水のような生物を含有する可能性のある試料から特定の遺伝子を検出、定量することができる。さらに例えば、ウイロイド、ウイルス、カビ、細菌あるいはその他の微生物等由来の特定の遺伝子をターゲットとすることにより、該遺伝子の存在の有無によって上記の微生物の存在を検出、定量等に利用することができる。特に、病原性の微生物の検出方法は衛生、環境分野で有用である。さらに、生物の遺伝子型の判別や遺伝子の発現状態を調べるために本発明の方法を使用することもできる。特に疾病関連遺伝子、例えば細胞の癌化に関連する遺伝子等の検出、発現状態の確認は医療分野において有用である。上記検出法のための鋳型として使用される核酸は、ＲＮＡあるいはＤＮＡのいずれもが好適に使用できる。
さらに、本発明の標的核酸の検出方法により、標的核酸上の塩基配列の違いを判別することができる。この態様においては、使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーの３’末端部分が、標的とされる塩基配列の判別しようとする特定の塩基付近に位置するように、たとえば、該塩基とプライマーの３’末端の塩基とが水素結合を形成するようにプライマーが設計される。このようなキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅反応を実施した場合、プライマーの３’末端部分の塩基配列と鋳型の塩基配列との間にミスマッチが存在する場合には標的核酸からの増幅が起こらず、増幅産物の生成が見られない。当該方法により、点突然変異、一塩基置換（Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｙｓｍ、ＳＮＰ）のような遺伝子上の特定の塩基についての情報を得ることが可能である。
本発明の標的核酸の検出方法は、核酸を含有する試料より直接、標的核酸を増幅することにより実施することができる。この場合、増幅される標的核酸の鎖長には、特に限定はないが、感度よく標的核酸を検出する観点からは、例えば２００ｂｐ以下、さらに好ましくは１５０ｂｐ以下の領域が有効である。該増幅鎖長となるように本発明のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを設定することにより、高感度に試料中の標的核酸を検出することができる。
さらに、本発明の検出方法では、前述の（４）で例示したような、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、及びスペルミジンやプロピレンジアミンを含有するアニーリング溶液の使用により、微量の核酸試料からもさらに高感度に標的核酸を検出することができる。この場合、使用するエンドヌクレアーゼとＤＮＡポリメラーゼは特に限定はされないが、例えば大腸菌由来、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来のＲＮａｓｅＨ及びＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが好ましい。特に、上記エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼはともにその種類によって好適に使用できるユニット数が異なる場合が予想されるが、その際には検出感度の向上あるいは増幅産物量の増加を指標にして、該バッファーの組成および酵素の添加量を調整すればよい。
本発明の検出方法においては、標的核酸の増幅の際に、ｄＵＴＰを基質として取り込ませることができる。したがって、ｄＵＴＰを基質に用いた場合には、ウラシル Ｎ−グリコシダーゼ（ｕｒａｃｉｌ Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅ：ＵＮＧ）を利用して増幅産物を分解し、増幅産物のキャリーオーバーを防止することができる。
上記（ｂ）工程には公知の核酸検出方法、例えば電気泳動により特定のサイズの反応産物を検出する方法や、プローブとのハイブリダイゼーションによる検出等を使用することができる。さらに、磁気ビーズ等を組み合わせた検出方法も好適に使用できる。上記電気泳動による検出には、通常、エチジウムブロマイド等の蛍光物質が使用されるが、プローブとのハイブリダイゼーションを組み合わせてもよい。また、プローブは放射性同位元素による標識の他、ビオチンや蛍光物質のような非放射性の標識を施したものが使用できる。この他、上記（ａ）工程において標識ヌクレオチドを使用することにより、増幅産物に標識ヌクレオチドを取り込ませて検出を容易にすることや該標識を利用した検出用シグナルの増強を行うことができ、さらに蛍光偏光法、蛍光エネルギー転移等を利用した検出を行うことも可能である。さらに、適切な検出系を構築することにより、標的核酸を自動的に検出することや、あるいは標的核酸の定量を行うことが可能である。また、ハイブリッドクロマト法による肉眼検出法も好適に使用できる。
消光状態になるような距離で配置された２種類以上の蛍光物質で標識されたリボヌクレオチド（ＲＮＡ）プローブを本発明の検出方法に使用することができる。当該プローブは蛍光を発することはないが、これに相補的な標的核酸由来の増幅ＤＮＡにアニーリングした場合、ＲＮａｓｅＨは該プローブを分解する。この結果、プローブ上の蛍光物質間の距離が増大して蛍光が発せられるようになり、標的核酸の存在を知ることができる。ＲＮａｓｅＨを使用して本発明の核酸の増幅方法が実施された場合には、その反応液中に上記のプローブを添加するだけで標的核酸を検出することができる。当該プローブの標識に使用される蛍光物質としては、例えば、６−ＦＡＭ（６−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）とＴＡＭＲＡ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌ−６−ｃａｒｂｏｘｙｒｈｏｄａｍｉｎｅ）との組み合わせが好適に使用できる。
さらに、本発明は前記の標的核酸の検出方法に使用されるプローブを提供する。本発明のプローブは、上記の本発明の核酸の増幅方法により増幅された核酸に通常のハイブリダイゼーションの条件において標的核酸にハイブリダイズし得るものであれば特に限定はないが、増幅産物を特異的に検出する観点からは、例えば厳密な条件として当業者に知られている条件でハイブリダイズするものが好ましい。前記、厳密なハイブリダイゼーション条件は、例えば１９８９年、コールドスプリング ハーバー ラボラトリー発行、Ｔ．マニアティス（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら編集、モレキュラー クローニング：ア ラボラトリー マニュアル第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．）に記載されている。具体的な厳密な条件としては、例えば以下の条件を挙げることができる。すなわち、０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ［Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００］及び１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、使用するプローブのＴｍ値より約２５℃低い温度で４時間〜一晩保温を行う条件を言う。前記プローブは、標的核酸の検出を容易にするために上記のような標識を付されたものを使用することができる。
本発明の核酸の増幅方法の等温下における増幅方法においては、サーマルサイクラーのような装置を必要としない。また本発明の増幅方法では、使用するプライマーを１種類もしくは２種類と従来法よりも少なくすることができる。ｄＮＴＰのような試薬もＰＣＲ等で用いられるものを流用できるため、ランニングコストを従来法よりも低くすることができる。そのため、ルーチンワークを行なっている遺伝子検査等の分野で好適に使用できる。さらに、本発明の方法はＰＣＲ法よりも短時間により多くの増幅産物を得られることから、簡便、迅速、高感度な遺伝子検出方法として利用することができる。
ゲノムレベルの遺伝子解析においては、大量の塩基配列を解析するために反応系を微量化し、さらに集積度を高める試みがなされている。その手段の一つとして、最先端の超微細加工技術を駆使して、ゲノム解析の基本プロセス、例えば、ＤＮＡの細胞からの抽出、ＤＮＡ増幅反応、電気泳動、ハイブリダイゼーション、目的ＤＮＡの検出等のプロセスを数ｃｍ角〜指先大のマイクロチップ上に集積化したものが開発されている。該システムはマイクロチップ、あるいはナノチップと呼ばれている。
このようなシステムにおける遺伝子増幅反応として現在はＰＣＲ法が考えられているが、該方法は経時的に温度の上昇、下降を繰り返す温度制御のための手段を必要とするため、システムが複雑なものとなる。これに対し、等温条件下で核酸を増幅できる本発明の方法はシステムの単純化が可能であり、上記のような集積化されたシステムでの利用に非常に好適である。さらに、本発明の技術を利用してさらに高い集積度のシステムの構築が可能となる。
（７）本発明のキット
本発明は、前述の本発明の核酸の増幅方法、または本発明の核酸の検出方法に使用されるキットを提供する。１つの実施態様において、該キットは、パッケージされた形態において、鎖置換反応におけるＤＮＡポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼの使用のための指示書を含むことを特徴とする。さらに、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼならびに鎖置換反応用緩衝液を含むキットは本発明の方法に好適に使用される。あるいは、市販の鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼを指示書に従って選択し、使用してもよい。さらに、ＲＮＡを鋳型とする場合の逆転写反応用試薬を含んでもよい。ＤＮＡポリメラーゼは、上記（３）記載の本発明に使用されるＤＮＡポリメラーゼから選択することができる。また、エンドヌクレアーゼは、上記（２）記載のエンドヌクレアーゼから選択することができる。さらに、該鎖置換反応用緩衝液は、上記（４）記載の反応バッファー組成を有するものが好適に使用できる。
上記「指示書」とは、当該キットの使用方法、例えば鎖置換反応用試薬液の調製方法、推奨される反応条件等を記載した印刷物であり、パンフレットまたはリーフレット形式の取り扱い説明書のほか、キットに添付されたラベル、キットが納められたパッケージ等に記載されたものを含む。さらに、インターネットのような電子媒体を通し、開示、提供された情報も含まれる。
さらに、本発明のキットにおいては、前述の（４）で例示したような、ビシン、トリシン、ヘペス、リン酸塩あるいはトリス緩衝成分を含有する反応バッファー、及びアニーリング溶液が含まれていてもよい。また、鎖置換能を有するＤＮＡポリメラーゼやＲＮａｓｅＨが含まれていてもよい。さらに、修飾されたデオキシリボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチド３リン酸のアナログを含有していてもよい。
さらに、標的核酸の検出方法に使用されるキットは、上記の指示書、増幅反応のための試薬類の他、標的核酸の増幅に適したキメラオリゴヌクレオチドプライマー、増幅された標的核酸を検出するための試薬、例えばプローブ等を含むものであってもよい。
また、本発明のキットは、上記の本発明に使用されるキメラオリゴヌクレオチドプライマー及び／又は本発明のプローブを含有するキットも包含する。
（８）本発明の組成物
本発明は、前述の本発明の核酸の増幅方法、または本発明の核酸の検出方法に使用される組成物を提供する。該組成物としては、例えば、上記（２）に記載のエンドヌクレアーゼならびに上記（３）に記載のＤＮＡポリメラーゼを含有するものが挙げられる。さらに、増幅反応を行うための成分として、緩衝成分やマグネシウム塩、ｄＮＴＰ等を含んでいてもよい。さらに、修飾されたデオキシリボヌクレオチドあるいはデオキシヌクレオチド３リン酸のアナログを含有していてもよい。緩衝成分やその他の添加物としては上記の（４）に記載されたものを使用することができる。
特に好適な態様としては、本発明の核酸増幅方法に適した組成で上記の各種成分が含有された組成物を挙げることができ、該組成物は適切な鋳型とキメラオリゴヌクレオチドプライマーを添加するのみで増幅反応を実施することができる。さらに、増幅対象があらかじめ明らかである場合には、当該増幅対象の増幅に適したキメラオリゴヌクレオチドプライマーを含有する組成物が好適である。
（９）本発明の核酸を所定の領域に整列させた核酸固定化物とその製造方法
ＤＮＡチップは、多数の異なる遺伝子あるいはＤＮＡの断片をスライドグラス等の固相担体上の所定の領域あるいは所定の位置に整列させて固定化した核酸固定化物であり、ＤＮＡマイクロアレイ（ＤＮＡアレイ）とも呼ばれる。ＤＮＡチップは、試料より調製した核酸試料、好ましくは標識された核酸試料と接触させてハイブリダイゼーションを行うことにより、核酸試料中に存在する、ＤＮＡチップ上の所定の領域に整列させて固定化されたＤＮＡと相補的な配列を有する核酸の存在を調べる目的で使用される。試料中の多数の核酸を一度の操作で検出、定量できることから、ＤＮＡチップは遺伝子の発現解析や変異あるいは多型解析を飛躍的に加速させる手段として非常に有用である。二本鎖核酸が所定の領域に整列させて固定化されたＤＮＡチップは適切な変性処理の後にハイブリダイゼーション工程に使用されるが、検出しようとする標的核酸に相補的な一本鎖ＤＮＡが所定の領域に整列させて固定化されたＤＮＡチップは、標的核酸の検出に特に好適である。
上記のように、本発明の方法により所望のＤＮＡを一本鎖の状態で増幅することができる。増幅物の精製方法に限定はないが、イソプロパノール沈殿による精製が好ましい。こうして得られたＤＮＡ、特に好ましくは実質的にその相補鎖を含有しない一本鎖のＤＮＡは、ＤＮＡチップ上に固定するＤＮＡ断片として好適に使用できる。即ち、本発明の方法は、ＤＮＡチップ作製において所定の領域に整列させて固定化するＤＮＡを調製する方法として好適に使用できる。こうして得られたＤＮＡを所定の領域に整列させて固定する担体は不溶性のものであれば特に限定はなく、ガラス、プラスチック等で作製された板状の担体の他、ニトロセルロースやナイロン製の膜状の担体が好適に使用される。また、その固定化にあたっては公知の核酸固定化方法が使用できる。上記のＤＮＡはそのまま担体に固定化を行う他、適当なリンカーを介して、または複数分子のＤＮＡをライゲーションさせたうえで固定化してもよい。さらに、本発明の製造方法においては、増幅された核酸に修飾されたデオキシリボヌクレオチドを取り込ませることができるため、該修飾基を用いて当該核酸固定化物を作製することができる。
本発明の方法により増幅されたＤＮＡを所定の領域に整列させて固定化した核酸固定化物、例えばＤＮＡチップを試料より調製された標的核酸を含む可能性のある核酸試料と接触させ、ハイブリダイゼーションを実施することにより、当該核酸固定化物上の核酸とハイブリダイズした標的核酸を検出、定量することができる。特に、本発明の方法により増幅された一本鎖のＤＮＡを所定の領域に整列させて固定化したＤＮＡチップは、従来よりも簡便な操作で、かつ、高感度、高再現性での標的核酸の検出を可能とする。
（１０）本発明の核酸の大量製造方法
上記のように、本発明の一態様により等温で実施可能な核酸の増幅方法が提供される。該方法は、増幅しようとする核酸の鋳型となる核酸の他、反応に必要な各種成分を混合して等温条件下で反応させることにより、所望の核酸を製造することができる。ＰＣＲ法では反応混合物の温度を経時的に変化させる必要があるため、反応のスケールは温度制御が可能な容量（通常、２００μｌ以下）に限られ、スケールアップは困難である。一方、当該方法にはこのような制約はなく、反応混合物の容量を増加させることにより大量の核酸を製造することが可能である。本発明の方法においては、特に限定はされないが、例えば２００μｌを越える量が好適であり、好ましくは３００μｌ以上、特に好ましくは５００μｌ以上である。当該方法は１分子の鋳型から多数の相補鎖分子が合成され、さらにこれらの相補鎖分子を鋳型とした核酸の合成も可能であることから、鋳型ならびにプライマーを適切に設定することにより、所望の核酸を効率よく、大量に製造することができる。さらにまた、当該方法がＰＣＲ法のような特殊な装置、頻繁な温度変化を必要としないことは設備、エネルギーのコスト面からも有利であり、工業的な核酸の大量製造方法としても優れている。
さらに、本発明の製造方法では、前述の（４）で例示したような反応バッファー及びアニーリング溶液の使用により、微量の鋳型核酸からも目的とする核酸配列を増幅し、製造することができる。この場合、使用するエンドヌクレアーゼとＤＮＡポリメラーゼは特に限定はされないが、例えば大腸菌由来のＲＮａｓｅＨ及びＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼの組み合わせが好ましい。さらに、上記エンドヌクレアーゼ及びＤＮＡポリメラーゼはともにその種類によって好適に使用できるユニット数が異なる場合が予想されるが、その際には増幅産物量の最大を指標にして、該バッファーの組成および酵素の添加量を調整すればよい。
また、本発明の方法は、上記のＤＮＡチップに固定化するためのＤＮＡ断片のような多種類、かつ大量のＤＮＡ断片を供給する方法として有用である。すなわち、１つの態様としては、単純な反応工程でＤＮＡ断片を大量に得ることができ、別の態様としては限られた種類のプライマーを使用して非常に多種類のＤＮＡ断片を得ることができる。後者は、本発明の方法の鋳型となる核酸を公知の核酸増幅方法、例えばＰＣＲ法等であらかじめ増幅する工程を組み合わせて実施することができる。例えば、ヌクレイック アシッズ リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）第２４巻、１９号、３７７８〜３７８３頁（１９９６）に記載のタグ配列を有するランダムプライマーを使用して核酸を増幅する方法あるいは、ジェノミックス（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）第１３巻、７１８〜７２５頁（１９９２）に記載の縮重プライマー（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｐｒｉｍｅｒ）を用いたＤＯＰ−ＰＣＲ（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−Ｐｒｉｍｅｄ ＰＣＲ）法に基づき、限られた種類のプライマーを使用してあらゆる種類の鋳型核酸を増幅することができる。さらに、前述のランダムプライマーや縮重プライマーに付加されたタグ配列にあわせて本発明の核酸の増幅方法に使用されるプライマーを設計すれば、上記の工程で作成されたあらゆる鋳型核酸について１もしくは数種類のプライマーで本発明の核酸増幅反応を実施することができる。このように、適切な鋳型核酸の調製工程と本発明の方法を組み合わせれば、多種類のＤＮＡ断片を従来よりも安価で、大量に供給することができる。
核酸を含有する医薬としては、細胞内において有用なポリペプチドを発現させるための二本鎖ＤＮＡ、目的の遺伝子の発現を抑制するための一本鎖アンチセンスＤＮＡ等があり、これらは適切な手段、例えばリポソーム等の遺伝子導入用担体を使用して生体に投与される。本発明の核酸の製造方法は、上記のような医薬用途等の一本鎖、もしくは二本鎖の核酸を大量に製造するための方法として好適である。さらに、本発明の方法では、例えば生体内での分解を抑制するようなｄＮＴＰのアナログを含有する核酸を製造することも容易である。
本発明において増幅されたＤＮＡ断片は通常のヌクレオチドにより構成されるため、例えば、増幅されたＤＮＡはその内部の制限酵素部位を用いて適当なベクターにサブクローニングすることができる。さらにＲＦＬＰのような制限酵素を用いた処理をすることも問題なくでき、遺伝子検査の分野においても広く利用できる。また、増幅断片中にＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を組込んでおけば、増幅断片を鋳型としてＲＮＡを合成し、例えば、合成されたＲＮＡをプローブとして使用可能である。当然ながら、通常のｄＮＴＰの代わりに蛍光標識されたｄＮＴＰを使用して本発明の核酸増幅方法を実施することにより、蛍光標識されたＤＮＡプローブを作製することができる。
本発明の核酸の増幅方法の特徴を以下に列挙する。
１．少ない鋳型量より、大量の核酸を増幅することができる。２種のプライマーを使用した場合には増幅産物は２次関数的に増加する。
２．等温でも実施でき、その場合サーマルサイクラーのような装置を必要としない。このため、容易に反応容量をスケールアップすることができる。
３．通常、増幅反応は１または２種のキメラオリゴヌクレオチドプライマーと２種の酵素（ＤＮＡポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼ）で実施される。
４．１分子のプライマーより多数のＤＮＡ鎖が合成されるため、プライマー量が増幅産物量を制限することがない。さらに、プライマー使用効率が約１００％とＰＣＲ法に比べて極めて高い。
５．一本鎖、二本鎖のＤＮＡを目的に応じ選択的に増幅することができる。
６．増幅反応に（α−Ｓ）ｄＮＴＰのようなｄＮＴＰアナログを必要としないため、試薬コストが安価である。また、ｄＮＴＰアナログを含有しない、天然型の核酸を取得することが可能である。
７．核酸複製方法と組み合わせることにより、安価で大量のＤＮＡ増幅断片を供給することができる。
８．本発明の検出方法は、従来法と比較して同等以上の検出感度を有する。さらに、同じ検出感度であれば、従来法よりも短時間で検出することができる。
９．マイクロチップ、ナノチップにおける核酸の増幅、検出の自動化、微量化、高集積化に適した方法である。
以上のように、本発明の方法は遺伝子の検出、工業的スケールでの核酸製造のいずれにも適した方法である。
実施例
本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によって限定されるものではない。
参考例１ 好熱菌バチルス カルドテナックス由来のＲＮａｓｅＨの調製
トリプトン（ディフコラボラトリーズ社製）０．２％、酵母エキス（ディフコラボラトリーズ社製）１．５％を含む培地（ｐＨ６．５）１００ｍｌにバチルスカルドテナックスＹＴ−Ｇ株（Ｂｕｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ ＹＴ−Ｇ、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメンより購入：ＤＳＭ４０６）を植菌し、６０℃で１４０分間振とう培養し、この培養液を前培養液とした。ついで、同組成の培地３リットルに前培養液３０ｍｌを接種し、通気量２．５リットル／分、攪拌数２５０回転／分、温度６０℃で５時間培養した。
培養液を遠心分離（５０００×ｇ、１５分）し、集菌した。湿菌重量４０２ｇの菌体を１０ｍＭ メルカプトエタノール、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０μＭ ＰＡＰＭＳＦを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７５）１０００ｍｌに懸濁し、ＭＩＮＩ−Ｌａｂ（ＡＰＶ ＧＡＵＬＩＮ／ＲＡＮＮＩＥ社製）にて菌体を破砕後、遠心分離で細胞残渣を除き、上清を回収した。
得られた上清液に終濃度が０．１％となるようにポリエチレンイミン溶液を加え、攪拌後、１時間放置し、遠心分離にて上清を回収した。この上清液に５０％飽和となるように硫酸アンモニウムを加え、遠心分離で得られた沈殿を１０ｍＭメルカプトエタノール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールを含む２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。同緩衝液で平衡化した２８０ｍｌのＤＥ５２カラム（ワットマン社製）に透析試料を負荷し、非吸着画分を集めた。
さらに平衡化に用いた緩衝液４２０ｍｌで洗浄し、洗浄画分を集めた。ＤＥ５２カラムクロマトグラフィーでの非吸着画分と洗浄画分を混合し、１０ｍＭ メルカプトエタノール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールを含む２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した２４０ｍｌのＰ−１１カラム（ワットマン社製）に負荷した。その後、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌを含む平衡化緩衝液で溶出させた。
得られた活性画分を透析チューブに入れ、固体のポリエチレングリコール２００００上に置き、４℃で脱水濃縮した。次に、５ｍＭ メルカプトエタノール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、５０％グリセロールを含む２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した３００ｍｌのＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ−２００カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に、この酵素濃縮液を負荷した。平衡化に用いた緩衝液で溶出させ、活性画分を得た。１０ｍＭ メルカプトエタノール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールを含む２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した１５ｍｌのＨｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に活性画分を負荷し、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌを含む平衡化緩衝液で溶出させた。
得られた活性画分を１０ｍＭ メルカプトエタノール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールを含む２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した５ｍｌのＨｉｔｒａｐ−ＳＰカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に負荷し、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌを含む平衡化緩衝液で溶出させた。得られた活性画分を、再度５ｍＭメルカプトエタノール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ、３０ｍＭ ＮａＣｌ、５０％グリセロールを含む２５ｍＭ トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した３００ｍｌのＳｕｐｅｒｄｅｘ Ｇ−２００カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に負荷し、得られた活性画分をＲＮａｓｅＨ標品（酵素液）とした。
耐熱性ＲＮａｓｅＨ活性は、次の方法により測定した。
ポリ（ｒＡ）及びポリ（ｄＴ）（ともにアマシャム ファルマシア バイオテク製）１ｍｇをそれぞれ１ｍＭ ＥＤＴＡを含む４０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）１ｍｌに溶解し、ポリ（ｒＡ）溶液及びポリ（ｄＴ）溶液を調製した。
次に、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、０．００３％ＢＳＡ、４％グリセロールを含む４０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）に、終濃度２０μｇ／ｍｌとなるポリ（ｒＡ）溶液、終濃度３０μｇ／ｍｌとなるポリ（ｄＴ）溶液を加え、３７℃で１０分間反応後、４℃に冷却し、ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液を調製した。
ポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）溶液１００μｌに酵素液１μｌを加え、４０℃で１０分間反応させ、０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μｌを加えて反応を停止させた後、２６０ｎｍの吸光度を測定した。対照として、上記反応液に０．５Ｍ ＥＤＴＡ１０μｌを加えた後、４０℃で１０分間反応させ、吸光度を測定した。その後、ＥＤＴＡ非存在下で反応させ求めた吸光度から対照の吸光度を引いた値（吸光度差）を求めた。すなわち、酵素反応によってポリ（ｒＡ）−ポリ（ｄＴ）ハイブリッドから遊離したヌクレオチドの濃度を吸光度差から求めた。ＲＮａｓｅＨの１単位は、１ｎｍｏｌのリボヌクレオチドが遊離したのに相当するＡ２６０を１０分間に増加させる酵素量とし、下記の式に従って算出した。なお、酵素液を希釈した場合は、下記式の値を希釈率で補正した。
単位（ｕｎｉｔ）＝〔吸光度差×反応液量（ｍｌ）〕／０．０１５２
参考例２ バチルス カルドテナックス ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）バチルス カルドテナックス ゲノムＤＮＡの調製
バチルス カルドテナックス ＹＴ−Ｇ株（ＤＳＭ４０６）を６０ｍｌのＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）に植菌し、６５℃、２０時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離し集菌した。得られた菌体を２ｍｌの２５％ショ糖、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、０．２ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に１２ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．１ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び１ｍｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。
次いで２．１ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌと２ｍｌのＣＴＡＢ−ＮａＣｌ溶液〔１０％セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ナカライテスク社製）、０．７Ｍ ＮａＣｌ〕を加えてよく混合し、６５℃で１０分間保温した。これに等量のクロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２４：１、ｖ／ｖ）を加えて１０分間緩やかに混合した後、１０分間遠心（１００００×ｇ）を行った。遠心終了後、得られた上清に等量の１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２５：２４：１、ｖ／ｖ）を加えて１０分間緩やかに混合した後、更に１０分間遠心（１００００×ｇ）を行った。遠心終了後、得られた上清に０．６容の２−プロパノールを加え、生じた糸状の沈殿をガラス棒で巻き取った。これを７０％エタノール水溶液で洗浄し、風乾した後に０．５ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解してゲノムＤＮＡ溶液を得た。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子中央部のクローニング
様々な生物由来のＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列間で保存されている部分のうち、モチーフＩとモチーフＩＩＩ〔バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、第３８巻、第６０５−６０８頁（１９９９）〕をもとにして配列表の配列番号１及び２記載のオリゴヌクレオチドＢｓｕＩＩ−３とオリゴヌクレオチドＢｓｕＩＩ−６を合成した。
上記参考例２−（１）で調製したバチルス カルドテナックス ゲノムＤＮＡ溶液１μｌを鋳型にして、１００ｐｍｏｌのＢｓｕＩＩ−３及び１００ｐｍｏｌのＢｓｕＩＩ−６をプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラ タック ポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして、５０サイクル行った。反応終了後、反応液にフェノール処理とエタノール沈殿を行ってＤＮＡを精製した。得られたＤＮＡをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いてＤＮＡの末端を平滑化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、増幅された約０．４ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから回収した。得られた約０．４ｋｂ ＤＮＡ断片を、ＳｍａＩ（宝酒造社製）で消化したｐＵＣ１１９（宝酒造社製）にＴ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換体を培養し、約０．４ｋｂのＤＮＡが挿入されたプラスミド２１−１２を得た。
（３）ＲＮａｓｅＩＩ遺伝子上流部分のクローニング
上記参考例２−（２）で得たプラスミド２１−１２の約０．４ｋｂの挿入断片の塩基配列を決定し、それをもとに配列表の配列番号３及び４記載のオリゴヌクレオチドＲＮＩＩ−Ｓ１とオリゴヌクレオチドＲＮＩＩ−Ｓ２を合成した。
参考例２−（１）で調製したバチルス カルドテナックス ゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩ（宝酒造社製）で消化し、得られたＢａｍＨＩ消化物とＳａｕ３ＡＩカセット（宝酒造社製）をＴ４ ＤＮＡリガーゼで連結し、これを鋳型、ＲＮＩＩ−Ｓ２を１次ＰＣＲのプライマー、ＲＮＩＩ−Ｓ１を２次ＰＣＲのプライマーとして、タカラ ＬＡ ＰＣＲ イン ビトロ クローニング キット（宝酒造社製）に添付のプロトコールに従って操作を行った。フェノール処理とエタノール沈殿によって２次ＰＣＲ液からＤＮＡを精製し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼを用いてこのＤＮＡの末端を平滑化し、その後、アガロースゲル電気泳動を行い、増幅した約１．５ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから回収した。得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片を、ＳｍａＩで消化したｐＵＣ１１９にＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
この形質転換体を培養し、約１．５ｋｂのＤＮＡが挿入されたプラスミドＢ２５Ｎ１６を得た。
（４）ＲＮａｓｅＩＩ遺伝子全域のクローニング
参考例２−（３）で決定したプラスミド２１−１２の約０．４ｋｂの挿入断片の塩基配列をもとに配列表の配列番号５及び６記載のオリゴヌクレオチドＲＮＩＩ−Ｓ５とオリゴヌクレオチドＲＮＩＩ−Ｓ６を合成した。
参考例２−（２）で調製したプラスミド２１−１２を鋳型に、ＲＮＩＩ−Ｓ５とＲＮＩＩ−Ｓ６をプライマーとしてＰＣＲを行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラ ＥＸタック ポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３０秒を１サイクルとして、２５サイクル行った。反応終了後、アガロースゲル電気泳動を行い、増幅した約０．３ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから回収した。得られた約０．３ｋｂのＤＮＡ断片をＤＩＧハイプライム（ロシュ ダイアグノスティックス社製）でジゴキシゲニン標識した。
上記のジゴキシゲニン標識ＤＮＡをプローブとして、参考例２−（１）で調製したバチルス カルドテナックス ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ（宝酒造社製）、ＳａｃＩ（宝酒造社製）による消化、及びＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩの２重消化をそれぞれ行い、得られた消化物とサザンハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションと検出はＤＩＧルミネッセント デテクションキット（ロシュ ダイアグノスティックス社製）を添付のプロトコールに従って用いた。その結果、ＨｉｎｄＩＩＩ消化では約４．５ｋｂ断片、ＳａｃＩ消化では約５．８ｋｂ、ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩの２重消化では約１．３ｋｂのＤＮＡ断片がプローブとハイブリダイズした。
上記結果に基づき、バチルス カルドテナックス ゲノムＤＮＡをＨｉｎｄＩＩＩ消化してアガロースゲル電気泳動を行い、約４．５ｋｂ付近のＤＮＡをゲルから回収した。得られたＤＮＡ断片をＳａｃＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、１．３ｋｂ付近のＤＮＡをゲルから回収した。このＤＮＡを、ＨｉｎｄＩＩＩとＳａｃＩで消化したｐＵＣ１９（宝酒造社製）にＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。
得られた形質転換体をハイボンドＮＴＭ（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）にレプリカし、上記のジゴキシゲニン標識プローブを用いて、常法に従ってコロニーハイブリダイゼーションを行った。こうして得られた陽性クローンからプラスミドｐＲＨＢ１を調製した。
次に、ｐＲＨＢ１に挿入されたＤＮＡの塩基配列を決定し、それから予想されるアミノ酸配列を枯草菌のＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列と比較したところ、ｐＲＨＢ１中のＤＮＡは開始コドンから約４０ｂｐを欠いていることが予想された。そこで以下のようにして完全長のＲＮａｓｅＨ遺伝子を構築した。
参考例２−（３）で調製したＢ２５Ｎ１６をＨｉｎｄＩＩＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を行った後、約１６０ｂｐのＤＮＡ断片をゲルから回収した。得られた約１６０ｂｐのＤＮＡ断片を、上記で調製したｐＲＨＢ１のＨｉｎｄＩＩＩ消化物にＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、大腸菌ＨＢ１０１を形質転換した。得られた形質転換体からプラスミドを調製した。
次に、予想される開始コドン周辺の塩基配列をもとにして、配列表の配列番号７記載のオリゴヌクレオチドＲＮＩＩ−Ｎｄｅを合成し、上記で得られた形質転換体から調製したプラスミドを鋳型とし、ＲＮＩＩ−ＮｄｅとＲＮＩＩ−Ｓ６をプライマーとして、ＰＣＲを行った。この時に約０．７ｋｂのＤＮＡ断片が増幅するプラスミドを選択し、このプラスミドをｐＲＨＢ１１とした。
こうして得られたプラスミドｐＲＨＢ１１に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定した。その結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。この塩基配列を配列表の配列番号８に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号９に示す。
なお、プラスミドｐＲＨＢ１１で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１は、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＲＨＢ１１と命名、表示され、平成１２年９月５日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６５５として寄託されている。
（５）バチルス カルドテナックス ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子の発現
ｐＲＨＢ１１又はｐＲＨＢ１で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１晩振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を０．５ｍｌのＴＥ緩衝液に懸濁して超音波破砕し、遠心分離によって上清を得、これを菌体粗抽出液とした。
１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ジチオスレイトール（ナカライテスク社製）、０．００３％ウシ血清アルブミン（フラクションＶ、シグマ社製）、４％グリセロール、２０μｇ／ｍｌポリ（ｄＴ）（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）、３０μｇ／ｍｌポリ（ｒＡ）（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を混合し、３７℃で１０分間保温した。これをＲＮａｓｅＨ活性を測定するための基質液として使用した。
１００μｌの基質液に１μｌの１Ｍ ＭｎＣｌ２を加えて４０℃で保温し、これに１０μｌの１０倍希釈した菌体粗抽出液を加えて反応を開始した。４０℃で３０分間反応を行った後、１０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えて反応を停止し、２６０ｎｍにおける吸光度を測定した。その結果、ｐＲＨＢ１を保持する大腸菌ＨＢ１０１から調製した菌体粗抽出液で反応させたときに比べて、ｐＲＨＢ１１を保持する大腸菌ＨＢ１０１から調製した菌体粗抽出液で反応させたときに明らかに２６０ｎｍにおける吸光度の値が高かった。よって、ｐＲＨＢ１１はＲＮａｓｅＨ遺伝子を含んでおり、このｐＲＨＢ１１を保持する大腸菌でＲＮａｓｅＨ活性を発現することが明らかになった。
（６）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
参考例２−（４）で得られたｐＲＨＢ１１で形質転換された大腸菌ＨＢ１０１を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１リットルのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を５２．３ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、２ｍＭ フェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を６０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、上清を集め、５０．０ｍｌの熱処理上清液を得た。
この溶液をバッファーＣ〔５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラムを素通りした。素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分５１ｍｌをバッファーＣで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約２４０ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＩＩ画分を得た。このＲＮａｓｅＩＩ画分３．０ｍｌを２回に分けて５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＣで平衡化したＰＤ−１０カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、得られた溶出液７．０ｍｌを５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＣで平衡化したＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて５０〜５５０ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約３１０ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＩＩ画分を得た。このＲＮａｓｅＩＩ画分４．４ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、２８０μｌの濃縮液を１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、３５キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＢｃａＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
上記で得られたＢｃａＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて、以下の方法により酵素活性を測定した。
ＢｃａＲＮａｓｅＨＩＩ標品１μｌに４０℃であらかじめインキュベーションした反応液〔２０ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム（ｐＨ７．８）、０．０１％牛血清アルブミン（宝酒造社製）、１％ジメチルスルホキシド、１０ｍＭ 塩化マンガン、２０μｇ／ｍｌポリ（ｄＴ）（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）、３０μｇ／ｍｌポリ（ｒＡ）（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）〕１００μｌを添加し、４０℃で１０分間反応さた後、０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）１０μｌで反応を停止し、２６０ｎｍの吸収を測定した。
その結果、Ｂｃａ ＲＮａｓｅＨＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
参考例３ バチルス カルドテナックス ＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子のクローニング
（１）ＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子断片のクローニング
バチルス サブチリスのＲＮａｓｅＨＩＩＩのアミノ酸配列〔バイオケミストリー：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第３８巻、第６０５−６０８頁（１９９９）〕について、他の生物由来のＲＮａｓｅＩＩＩのアミノ酸配列とのホモロジーを調べ、これらの間でよく保存されている領域のアミノ酸配列からＲＮａｓｅＨＩＩＩをコードする遺伝子を探索するための配列表の配列番号１０〜１３記載のプライマーＢｓｕＩＩＩ−１、ＢｓｕＩＩＩ−３、ＢｓｕＩＩＩ−６、ＢｓｕＩＩＩ−８を合成した。
参考例２−（１）で調製したバチルス カルドテナックス ゲノムＤＮＡ ２００ｎｇを鋳型にし、１００ｐｍｏｌのＢｓｕＩＩＩ−１及び１００ｐｍｏｌのＢｓｕＩＩＩ−８をプライマーにして、５０μｌの容量で１回目のＰＣＲを行った。更にその反応液１μｌを鋳型として１００ｐｍｏｌのＢｓｕＩＩＩ−３及び１００ｐｍｏｌのＢｓｕＩＩＩ−６をプライマーに用いて１００μｌの容量で２回目のＰＣＲを行った。この２回のＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼには、タカラタック ポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、１回目のＰＣＲは９４℃で３０秒、４５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとして、２５サイクル行い、２回目は３０サイクル行なった。
増幅して得られた約４５０ｂｐのＤＮＡ断片をＴ４ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いて末端を平滑化した後、アガロースゲル電気泳動を行い、増幅された約４５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。得られた約４５０ｂｐのＤＮＡ断片を、ＳｍａＩ（宝酒造社製）で消化したｐＵＣ１１９（宝酒造社製）にＴ４ ＤＮＡリガーゼ（宝酒造社製）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。該形質転換体を培養し、約４５０ｂｐのＤＮＡ断片が挿入されたプラスミドｐＢＣＡ３２０４を得た。
（２）サザンハイブリダイゼーション法によるＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子のクローニング
参考例３−（１）で得られたｐＢＣＡ３２０４に挿入されたＤＮＡ断片の塩基配列を決定し、得られた配列もとに、配列表の配列番号１４及び１５記載のプライマーＲＮＩＩＩ−Ｓ３及びＢｃａＲＮＩＩＩ−３を合成した。このプライマーＲＮＩＩＩ−Ｓ３及びＢｃａＲＮＩＩＩ−３を用いて、ｐＢＣＡ３２０４を鋳型にし、１００μｌの容量でＰＣＲを行なった。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＺタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９８℃で０秒、５５℃で０秒、７２℃で２０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行った。そして、アガロースゲル電気泳動を行い、約０．４ｋｂのＤＮＡ断片をゲルから回収した。得られた約０．４ｋｂのＤＮＡ断片をＤＩＧ ＤＮＡ標識キット（ベーリンガー マンハイム社製）で標識し、プローブを調製した。
参考例２−（１）で調製したバチルス カルドテナックス ゲノムＤＮＡ ２０μｇをＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｓｔＩ、ＸｂａＩ（すべて宝酒造社製）で、それぞれ完全消化した後、その半分量をアガロース電気泳動した。アガロースゲルからＤＮＡを０．４Ｎ 水酸化ナトリウムをもちいてナイロンメンブレンにトランスファーした後、１２０℃で３０分間固定した。次に、メンブレンを３０ｍｌハイブリダイゼーションバッファー〔４３．４ｇ／リットル塩化ナトリウム、１７．６ｇ／リットル クエン酸ナトリウム、１％ブロッキング剤（ベーリンガー マンハイム社製）、０．１％Ｎ−ラウロイルサルコシン、０．０２％ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）〕の入ったシールドバック中で、６０℃、４時間プレインキュベーションした後、プローブを含むハイブリダイゼーションバッファー５ｍｌの入ったシールドバック中で、６０℃、１６時間インキュベーションした。
次に、メンブランを５０ｍｌの０．１％ＳＤＳをふくむ２×ＳＳＣ（１７．５ｇ／リットル ＮａＣｌ、８．８ｇ／リットル クエン酸ナトリウム）中、室温で２回、５０ｍｌの０．１％ＳＤＳを含む０．５×ＳＳＣ（４．３ｇ／リットル 塩化ナトリウム、１．９ｇ／リットル クエン酸ナトリウム）中、４５℃で２回洗浄した後、ＤＩＧ核酸検出キット（ベーリンガーマンハイム社製）を用いて、プローブと相補的な配列を持った約８ｋｂのＥｃｏＲＩ断片、約４．５ｋｂのＰｓｔＩ断片、約１ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ断片を検出した。
ＰｓｔＩで完全消化したバチルス カルドテナックス ゲノムＤＮＡの残り半分量をアガロース電気泳動し、約４．５ｋｂのＰｓｔＩ断片をゲルから回収した。次に、このＤＮＡ断片と、ＰｓｔＩ消化した後アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を用いて脱リン酸化したプラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎとをライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
プライマーＲＮＩＩＩ−Ｓ３及びＢｃａＲＮＩＩＩ−３を用いて、コロニーを鋳型にし、５０μｌの容量でＰＣＲを行ない、ＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子を持つと考えられるコロニーを選択した。 このＰＣＲには、タカラＺタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９８℃で０秒、５５℃で０秒、７２℃で２０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った。この結果、Ｎｏ．８８のコロニーに目的の遺伝子が含まれていることがわかった。
次に、このＮｏ．８８のコロニーからプラスミドを調製し、これを鋳型にプライマーＲＮ−Ｎ（宝酒造社製）およびＢｃａＲＮＩＩＩ−３又はプライマーＭ４（宝酒造社製）及びＲＮＩＩＩ−Ｓ３を用いてＰＣＲを行い、ＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子の全長が含まれているかどうかを調べた。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩＩの全長が含まれていることが分かり、このプラスミドをｐＢＣＡ３Ｐ８８とした。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
参考例３−（２）で得られたプラスミドｐＢＣＡ３Ｐ８８の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩＩのＮ末端アミノ酸配列を有するオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号１６に、また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号１７にそれぞれ示す。
（４）ＲＮａｓｅＨＩＩＩを発現させるためのプラスミドの構築
参考例３−（２）に記載のプラスミドｐＢＣＡ３Ｐ８８を鋳型にし、上記得られたＲＮａｓｅＨＩＩＩのオープンリーディングフレームの周辺の配列を参考として設定した配列表の配列番号１８記載のＢｃａＲＮＩＩＩＮｄｅ及びＭ１３プライマーＭ４（宝酒造社製）を用いて、１００μｌの容量でＰＣＲを行なった。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはパイロベストＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で３分を１サイクルとして、３０サイクル行った。この結果増幅した約４ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ（宝酒造社製）で消化し、アガロース電気泳動を行い、約１．４ｋｂのＮｄｅＩ断片をゲルから回収した。得られた約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を、ＮｄｅＩ消化した後アルカリフォスファターゼ（宝酒造社製）を用いて脱リン酸化したｐＴＶ１１９Ｎｄ（ｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変換したもの）とライゲーションを行い、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。
次に、ＮｄｅＩ断片中のＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子がｐＴＶ１１９Ｎｄベクターのｌａｃプロモーター下流につながったプラスミドをスクリーニングするためコロニーを鋳型にし、プライマーＲＮ−Ｎ（宝酒造社製）およびＢｃａＲＮＩＩＩ−３を用いて、５０μｌの容量でＰＣＲを行ない、ＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子を持つと考えられるコロニーを選択した。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＺタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９８℃で０秒、５５℃で０秒、７２℃で２０秒を１サイクルとして、３０サイクル行った。この結果、Ｎｏ．２のコロニーがＮｄｅＩ断片中のＲＮａｓｅＨＩＩＩ遺伝子がｐＴＶ１１９Ｎｄベクターのｌａｃプロモーター下流につながったプラスミドであることが分かり、このプラスミドをｐＢＣＡ３Ｎｄ２とした。
さらに該プラスミド中の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法で確認したところ、開始コドンをＧＴＧからＡＴＧに変換したこと以外、ＰＣＲに起因する変異のないことを確認した。
なお、プラスミドｐＢＣＡ３Ｎｄ２で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＢＣＡ３Ｎｄ２と命名、表示され、平成１２年９月５日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７６５３として寄託されている。
（５）精製ＲＮａｓｅＨＩＩＩ標品の調製
参考例３−（４）で得られたｐＢＣＡ３Ｎｄ２で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２リットルのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を３９．６ｍリットルのソニケーションバッファー〔５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ フェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を６０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、上清を集め、３９．８ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩＩ画分４５ｍｌをバッファーＢ〔５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕２リットルを外液として、２時間の透析を３回行なった。透析後の酵素液５５．８ｍｌをバッファーＢで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓカラム（ファルマシア ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約１０５ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩＩ画分を得た。
この画分７．０ｍｌにＮａＣｌ濃度が１５０ｍＭになるように１Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーＢを添加し、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＢで平衡化したＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供した。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩＩはＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩＩ画分７．５ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、１９０μｌの濃縮液を１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩＩは、３３キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩＩが１量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩＩをＢｃａ ＲＮａｓｅＨＩＩＩ標品とした。
上記で得られたＢｃａ ＲＮａｓｅＨＩＩＩ標品を用いて、以下の方法により酵素活性を測定した。
Ｂｃａ ＲＮａｓｅＨＩＩＩ標品１μｌに４０℃であらかじめインキュベーションした反応液〔２０ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム（ｐＨ７．８）、０．０１％牛血清アルブミン（宝酒造社製）、１％ジメチルスルホキシド、４ｍＭ酢酸マグネシウム、２０μｇ／ｍｌポリ（ｄＴ）（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）、３０μｇ／ｍｌポリ（ｒＡ）（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）〕１００μｌを添加し、４０℃で１０分間反応さた後、１０μ１０．５Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で反応を停止し、２６０ｎｍの吸収を測定した。その結果、Ｂｃａ ＲＮａｓｅＨＩＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
参考例４ ピロコッカス フリオサスのＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）ピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡの調製
トリプトン（ディフコラボラトリーズ社製）１％、酵母エキス（ディフコラボラトリーズ社製）０．５％、可溶性でんぷん（ナカライテスク社製）１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジャマリンラボラトリー社製）３．５％、ジャマリンＳ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）０．５％、ＭｇＳＯ４ ０．００３％、ＮａＣｌ ０．００１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０００１％、ＣｏＳＯ４ ０．０００１％、ＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ ０．０００１％、ＺｎＳＯ４ ０．０００１％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ４）２ ０．１ｐｐｍ、Ｈ３ＢＯ４ ０．１ｐｐｍ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２５ｐｐｍの組成の培地２リットルを２リットル容のメジュウムボトルにいれ、１２０℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにピロコッカス フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆｕｒｉｏｓｕｓ、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメンより購入：ＤＳＭ３６３８）を接種して、９５℃、１６時間静置培養した後、遠心分離によって菌体を得た。
次に、得られた菌体を４ｍｌの２５％ショ糖、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、０．４ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に２４ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び２ｍｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、約１ｍｇのゲノムＤＮＡを調製した。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
ピロコッカス ホリコシ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）の全ゲノム配列が公開されており〔ＤＮＡ リサーチ（ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｉｃｈ），第５巻、第５５−７６頁（１９９８）〕、ＲＮａｓｅＨＩＩのホモログをコードする遺伝子（ＰＨ１６５０）が１つ存在することが明らかになっている（配列表の配列番号１９、独立行政法人 製品評価技術基盤機構 ホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／）。
そこで、このＰＨ１６５０遺伝子と一部公開されているピロコッカス フリオサスのゲノム配列（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ，Ｕｔａｈ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｅｒホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｕｔａｈ，ｅｄｕ／ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｈｔｍｌ）でホモロジー検索をおこなった。その結果、非常にホモロジーの高い配列が見つかった。得られた配列をもとにプライマー１６５０Ｎｄｅ（配列番号２０）及び１６５０Ｂａｍ（配列番号２１）を合成した。
参考例４−（１）で得たピロコッカス フリオサス ゲノムＤＮＡ ２００ｎｇを鋳型にして、２０ｐｍｏｌの１６５０Ｎｄｅ及び２０ｐｍｏｌの１６５０Ｂａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＥｘタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、３０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込んだプラスミドｐＰＦＵ２２０を作製した。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
参考例４−（２）で得られたｐＰＦＵ２２０の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号２２に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号２３に示す。
なお、プラスミドｐＰＦＵ２２０で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＰＦＵ２２０と命名、表示され、平成１２年９月５日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７６５４として寄託されている。
（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
参考例４−（２）で得られたｐＰＦＵ２２０で大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換し、得られたｐＰＦＵ２２０を含む大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２ＬのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を６６．０ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ フェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を６０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、６１．５ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分６０．０ｍｌをバッファーＡで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約１５０ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。このＲＮａｓｅＨＩＩ画分２．０ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、２５０μｌの濃縮液を１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ２００ゲルろ過カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、１７キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＰｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
上記で得られたＰｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて、参考例３−（５）に記載の方法により酵素活性を測定した結果、Ｐｆｕ ＲＮａｓｅＨＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
参考例５ サーモトガ マリティマ ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング（１）サーモトガ マリティマ ゲノムＤＮＡの調製
トリプトン１％、酵母エキス０．５％、可溶性でんぷん １％、ジャマリンＳ・ソリッド ３．５％、ジャマリンＳ・リキッド ０．５％、ＭｇＳＯ４ ０．００３％、ＮａＣｌ ０．００１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０００１％、ＣｏＳＯ４ ０．０００１％、ＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ ０．０００１％、ＺｎＳＯ４ ０．０００１％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ４）２ ０．１ｐｐｍ、Ｈ３ＢＯ３ ０．１ｐｐｍ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２５ｐｐｍの組成の培地２リットルを２リットル容のメディウムボトルにいれ、１２０℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにサーモトガ マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンＧｍｂＨより購入：ＤＳＭ３１０９）を接種して、８５℃、１６時間静置培養した。
次に、遠心分離によって培地３００ｍｌ相当分の菌体を集め、３ｍｌのＴＥ緩衝液〔１０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕に懸濁し、１５０μｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム（ナカライテスク社製）水溶液及び１５μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）を加えて３７℃で１時間保温した。反応終了後、０．５ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを加えてよく混合した後、０．４ｍｌのＣＴＡＢ−ＮａＣｌ溶液〔１０％セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ナカライテスク社製）、０．７Ｍ ＮａＣｌ〕を加えてよく混合し、６５℃で１０分間保温した。これに１．５ｍｌのクロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２４：１、ｖ／ｖ）を加えて１０分間緩やかに混合した後、５分間遠心（２００００×ｇ）を行った。遠心終了後、得られた上清に等量の１００ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）飽和フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール混合液（２５：２４：１、ｖ／ｖ）を加えて１０分間緩やかに混合した後、更に５分間遠心（２００００×ｇ）を行った。遠心終了後、得られた上清に０．６容の２−プロパノールを加え、で５分間遠心（１００００×ｇ）して得られた沈殿を、７０％エタノール水溶液で洗浄し、風乾した後に２００μｌのＴＥに溶解してゲノムＤＮＡ溶液を得た。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
サーモトガ マリティマ ゲノムＤＮＡを鋳型としたＰＣＲを行うことによりＲＮａｓｅＨ遺伝子を含む増幅ＤＮＡ断片を得るため、サーモトガ マリティマ ゲノムＤＮＡの塩基配列
（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ＣＭＲ／ｂｔｍ／ｈｔｍｌｓ／ＳｐｌａｓｈＰａｇｅ．ｈｔｍｌ）のうちＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子と同定されている部分の塩基配列をもとにして、配列表の配列番号２４〜２７記載のオリゴヌクレオチド９１５−Ｆ１、９１５−Ｆ２、９１５−Ｒ１及び９１５−Ｒ２を合成した。
上記参考例５−（１）で調製したサーモトガ マリティマ ゲノムＤＮＡを鋳型として、９１５−Ｆ１と９１５−Ｒ１、９１５−Ｆ１と９１５−Ｒ２、９１５−Ｆ２と９１５−Ｒ１又は９１５−Ｆ２と９１５−Ｒ２をプライマー対とし、それぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＥｘタックを添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９５℃で０．５分、５５℃で０．５分、７２℃で１．５分を１サイクルとして、２５サイクル行った。反応終了後、各ＰＣＲ反応物をアガロースゲル電気泳動に供し、約０．７ｋｂの増幅されたＤＮＡ断片を抽出精製した。９１５−Ｆ１と９１５−Ｒ１及び９１５−Ｆ１と９１５−Ｒ２のプライマー対で増幅したＤＮＡは、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、ＨｉｎｄＩＩＩとＸｂａＩで消化したｐＵＣ１９にＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換体を培養し、約０．７ｋｂのＤＮＡが挿入されたプラスミドＤＮＡを調製した。その結果、９１５−Ｆ１と９１５−Ｒ１から増幅したＤＮＡが挿入されたプラスミドＮｏ．１とＮｏ．２、９１５−Ｆ１と９１５−Ｒ２から増幅したＤＮＡが挿入されたプラスミドＮｏ．３とＮｏ．４を得た。
また、９１５−Ｆ２と９１５−Ｒ１及び９１５−Ｆ２と９１５−Ｒ２のプライマー対で増幅したＤＮＡをＮｃｏＩ（宝酒造社製）とＸｂａＩで２重消化し、ＮｃｏＩとＸｂａＩで２重消化したｐＴＶ１１９Ｎ（宝酒造社製）にＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９に形質転換した。
この形質転換体を培養し、約０．７ｋｂのＤＮＡが挿入されたプラスミドＤＮＡを調製した。その結果、９１５−Ｆ２と９１５−Ｒ１から増幅したＤＮＡが挿入されたプラスミドＮｏ．５とＮｏ．６、９１５−Ｆ２と９１５−Ｒ２から増幅したＤＮＡが挿入されたプラスミドＮｏ．７を得た。
なお、プラスミドＮｏ．７で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＴＭ−ＲＮＨと命名、表示され、平成１２年９月５日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７６５２として寄託されている。
（３） サーモトガ マリティマ ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子の発現
プラスミドＮｏ．１〜７又はｐＵＣ１９で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む５ｍｌのＬＢ培地（トリプトン１０ｇ／リットル、酵母エキス５ｇ／リットル、ＮａＣｌ ５ｇ／リットル、ｐＨ７．２）に植菌し、３７℃で振盪培養した。６６０ｎｍにおける吸光度が０．５になったときに終濃度が１ｍＭになるようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを加え、更に１晩振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって菌体を集め、１ｍｌのＴＥ緩衝液に懸濁し、超音波破砕した。これを８０℃で１０分間熱処理し、遠心によって得た上清を菌体粗抽出液とした。得られた菌体粗抽出液を用いて、参考例２−（５）に記載の方法で、吸光度を測定した。その結果、ｐＵＣ１９を保持する大腸菌ＪＭ１０９から調製した粗抽出液で反応させたときに比べて、プラスミドＮｏ．３、５、６及び７を保持する大腸菌ＪＭ１０９から調製した菌体粗抽出液は、ＭｎＣｌ２存在下で反応させたとき、明らかに２６０ｎｍにおける吸光度の値が高かった。よって、プラスミドＮｏ．３、５、６及び７はＲＮａｓｅＨ遺伝子を含んでおり、これらのプラスミドを保持する大腸菌でＲＮａｓｅＨ活性を発現することが明らかになった。
こうして大腸菌内でＲＮａｓｅ活性の発現していることが明らかとなったプラスミドに挿入されたＤＮＡ断片の一部の塩基配列を決定した。得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号１４３に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号１４４に示す。このプラスミドＮｏ．７に挿入されたＤＮＡ断片の一部の塩基配列にＰＣＲ時に生じたと思われる塩基置換が１箇所認められ、その箇所のアミノ酸残基が変化していることが分かった。
（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
参考例５−（２）で得られたｐＴＭ−ＲＮＨを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換し、得られたｐＴＭ−ＲＮＨを含む大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１リットルのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を３１．０ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール、２ｍＭ フェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を７０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離を行い、上清を集め、３２．０ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＣ〔５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ ２−メルカプトエタノール、１０％グリセロール〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラムを素通りした。素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分３２．５ｍｌをバッファーＣで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約２４０ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＩＩ画分を得た。このＲＮａｓｅＩＩ画分２．０ｍｌを５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＣで平衡化したＰＤ−１０カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、得られた溶出液３．５ｍｌを５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＣで平衡化したＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて５０〜５５０ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約２９５ｍＭＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＩＩ画分を得た。このようにして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＴｍａ ＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
上記で得られたＴｍａ ＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて、参考例２−（６）に記載の方法で酵素活性を測定した結果、Ｔｍａ ＲＮａｓｅＨＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
参考例６ ピロコッカス ホリコシイのＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）ピロコッカス ホリコシイ ゲノムＤＮＡの調製
トリプトン（ディフコラボラトリーズ社製）１％、酵母エキス（ディフコラボラトリーズ社製）０．５％、可溶性でんぷん（ナカライテスク社製）１％、ジャマリンＳ・ソリッド（ジャマリンラボラトリー社製）３．５％、ジャマリンＳ・リキッド（ジャマリンラボラトリー社製）０．５％、ＭｇＳＯ４ ０．００３％、ＮａＣｌ ０．００１％、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．０００１％、ＣｏＳＯ４ ０．０００１％、ＣａＣｌ２・７Ｈ２Ｏ ０．０００１％、ＺｎＳＯ４ ０．０００１％、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＫＡｌ（ＳＯ４）２ ０．１ｐｐｍ、Ｈ３ＢＯ４ ０．１ｐｐｍ、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ ０．１ｐｐｍ、ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ ０．２５ｐｐｍの組成の培地２リットルを２リットル容のメジュウムボトルにいれ、１２０℃、２０分間殺菌した後、窒素ガスを吹き込み、溶存酸素を除去し、これにピロコッカス ホリコシイ ＯＴ３（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ、理化学研究所より購入：ＪＣＭ９９７４）を接種して、９５℃、１６時間静置培養した後、遠心分離によって菌体を得た。
次に、得られた菌体を４ｍｌの２５％ショ糖、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、０．４ｍｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に２４ｍｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、０．２ｍｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び２ｍｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。
反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、続いてエタノール沈殿を行い、約１ｍｇのゲノムＤＮＡを調製した。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
ピロコッカス ホリコシイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ）は全ゲノム配列が公開されており〔ＤＮＡ リサーチ（ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第５巻、第５５−７６頁（１９９８）〕、ＲＮａｓｅＨＩＩのホモログをコードする遺伝子（ＰＨ１６５０）が１つ存在することが明らかになっている（配列番号１４５、独立行政法人製品評価センター ホームページ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｔｅ．ｇｏ．ｊｐ／）。
そこで、このＰＨ１６５０遺伝子（配列番号１４５）の配列をもとにプライマーＰｈｏＮｄｅ（配列番号１４６）及びＰｈｏＢａｍ（配列番号１４７）を合成した。
参考例６−（１）で得たピロコッカス ホリコシイ ゲノムＤＮＡ １００ｎｇを鋳型にして、２０ｐｍｏｌのＰｈｏＮｄｅＮｄｅ及び２０ｐｍｏｌのＰｈｏＢａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲ行った。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはタカラＥｘタック（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、４０サイクル行った。増幅した約０．７ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＥＴ３ａ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込んだプラスミドｐＰＨＯ２３８を作製した。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
参考例６−（２）で得られたｐＰＨＯ２３８の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号１４８に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号１４９に示す。
なお、プラスミドｐＰＨＯ２３８で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＰＨＯ２３８と命名、表示され、平成１３年２月２２日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６９２として寄託されている。
（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
参考例６−（２）で得られたｐＰＨＯ２３８で大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）（ノバジェン社製）を形質転換し、得られたｐＰＨＯ２３８を含む大腸菌ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１リットルのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を３４．３ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を８０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、３３．５ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分３５．０ｍｌををバッファーＢ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕２Ｌを外液として、２時間の透析を３回行なった。透析後の酵素液３４．５ｍｌをバッファーＢで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓカラム（ファルマシア ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて０〜５００ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出し、約１５５ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
この画分４．０ｍｌにＮａＣｌ濃度が５０ｍＭになるようにバッファーＢを添加し、５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＢで平衡化したＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて５０〜５５０ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約１６０ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分６．９ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、２５０μｌの濃縮液を２回に分けて１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ゲルろ過カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、２４．５キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＰｈｏＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
上記で得られたＰｈｏＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて、参考例３−（５）に記載の方法により酵素活性を測定した結果、ＰｈｏＲＮａｓｅＨＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
参考例７ アルカエオグロバス フルギダスのＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
（１）アルカエオグロバス フルギダス ゲノムＤＮＡの調製
アルカエオグロバス フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ、ドイッチェ ザムルンク フォン ミクロオルガニスメン ウント ツェルクルツレンＧｍｂＨより購入：ＤＳＭ４１３９）８ｍｌ相当分の菌体を集め、１００μｌの２５％ショ糖、５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に懸濁し、２０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ、１０μｌの１０ｍｇ／ｍｌ塩化リゾチーム（ナカライテスク社製）水溶液を加えて、２０℃で１時間反応させた。反応終了後、この反応液に８００μｌの１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１０μｌの２０ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（宝酒造社製）及び５０μｌの１０％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液を加え、３７℃で１時間保温した。反応終了後、フェノール−クロロホルム抽出、エタノール沈殿、風乾した後に５０μｌのＴＥに溶解してゲノムＤＮＡ溶液を得た。
（２）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子のクローニング
アルカエオグロバス フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）は全ゲノム配列が公開されており〔ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、第３９０巻、第３６４−３７０頁（１９９７）〕、ＲＮａｓｅＨＩＩのホモログをコードする遺伝子（ＡＦ０６２１）が１つ存在することが明らかになっている（配列番号１５０、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ＣＭＲ／ｂｔｍ／ｈｔｍｌｓ／ＳｐｌａｓｈＰａｇｅ．ｈｔｍｌ）。
そこで、このＡＦ０６２１遺伝子（配列番号１５０）の配列をもとにプライマーＡｆｕＮｄｅ（配列番号１５１）及びＡｆｕＢａｍ（配列番号１５２）を合成した。
参考例７−（１）で得たアルカエオグロバス フルギダス ゲノムＤＮＡ３０ｎｇを鋳型にして、２０ｐｍｏｌのＡｆｕＮｄｅ及び２０ｐｍｏｌのＡｆｕＢａｍをプライマーに用い、１００μｌの容量でＰＣＲを行なった。ＰＣＲでのＤＮＡポリメラーゼはパイロベストＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を添付のプロトコールに従って用い、ＰＣＲは９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１サイクルとし、４０サイクル行った。増幅した約０．６ｋｂのＤＮＡ断片をＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ（ともに宝酒造社製）で消化し、得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクターｐＴＶ１１９Ｎｄ（ｐＴＶ１１９ＮのＮｃｏＩサイトをＮｄｅＩサイトに変換したもの）のＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩ間に組込んだプラスミドｐＡＦＵ２０４を作製した。
（３）ＲＮａｓｅＨＩＩ遺伝子を含むＤＮＡ断片の塩基配列の決定
参考例７−（２）で得られたｐＡＦＵ２０４の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列をジデオキシ法によって決定した。
得られた塩基配列の結果を解析したところ、ＲＮａｓｅＨＩＩをコードすると考えられるオープンリーディングフレームが見出された。このオープンリーディングフレームの塩基配列を配列表の配列番号１５３に示す。また、該塩基配列から推定されるＲＮａｓｅＨＩＩのアミノ酸配列を配列表の配列番号１５４に示す。
なお、プラスミドｐＡＦＵ２０４で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＪＭ１０９／ｐＡＦＵ２０４と命名、表示され、平成１３年２月２２日（原寄託日）より日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−７６９１として寄託されている。
（４）精製ＲＮａｓｅＨＩＩ標品の調製
参考例７−（２）で得られたｐＡＦＵ２０４で大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、得られたｐＡＦＵ２０４を含む大腸菌ＪＭ１０９を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む２リットルのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間振盪培養した。培養終了後、遠心分離によって集めた菌体を３７．１ｍｌのソニケーションバッファー〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭフェニルメタンスルフォニルフルオライド〕に懸濁し、超音波破砕機にかけた。この破砕液を１２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を行い、得られた上清を７０℃、１５分間の熱処理にかけた。その後、再度１２０００ｒｐｍで１０分の遠心分離を行い、上清を集め、４０．３ｍｌの熱処理上清液を得た。
この熱処理上清液をバッファーＡ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕で平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｑカラムを素通りした。
バッファーＡで平衡化したＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）を用いてクロマトグラフィーを行なった。その結果、ＲＮａｓｅＨＩＩはＲＥＳＯＵＲＳＥ Ｓカラムを素通りした。
素通りしたＲＮａｓｅＨＩＩ画分４０．０ｍｌを５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＢ〔５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍＭ ＥＤＴＡ〕２Ｌを外液として、２時間の透析を３回行なった。透析後の酵素液４０．２ｍｌを５０ｍＭ ＮａＣｌを含むバッファーＢで平衡化したＨｉＴｒａｐ−ｈｅｐａｒｉｎカラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、ＦＰＬＣシステムを用いて５０〜５５０ｍＭ ＮａＣｌ直線濃度勾配により溶出した。その結果、約２４０ｍＭ ＮａＣｌのところに溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩ画分を得た。
このＲＮａｓｅＨＩＩ画分７．８ｍｌをセントリコン−１０（アミコン社製）を用いた限外ろ過により濃縮し、約６００μｌの濃縮液を４回に分けて１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡを含む５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ６ゲルろ過カラム（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）に供し、同じバッファーで溶出を行った結果、ＲＮａｓｅＨＩＩは、３０．０キロダルトンの分子量に相当する位置に溶出された。この分子量は、ＲＮａｓｅＨＩＩが１量体として存在する場合に相当する。
こうして溶出されたＲＮａｓｅＨＩＩをＡｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品とした。
上記で得られたＡｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品を用いて、参考例３−（５）に記載の方法により酵素活性を測定した結果、ＡｆｕＲＮａｓｅＨＩＩ標品にＲＮａｓｅＨ活性が認められた。
参考例８
本発明の方法に使用される大腸菌由来ＲＮａｓｅＨのユニット数は、以下の方法で測定した。
（１）使用する試薬液の調製
力価測定用反応液：最終濃度がそれぞれ４０ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．７、３７℃）、４ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ＤＴＴ、０．００３％ ＢＳＡ、４％グリセロール、２４μＭ ポリ（ｄＴ）になるように滅菌水で調製した。
ポリ［８−３Ｈ］アデニル酸溶液：３７０ｋＢｑのポリ［８−３Ｈ］アデニル酸溶液を２００μｌの滅菌水に溶解した。
ポリアデニル酸溶液：ポリアデニル酸を３ｍＭになるように滅菌超純水で希釈した。
酵素希釈液：最終濃度がそれぞれ２５ｍＭ トリス−塩酸（ｐＨ７．５、３７℃）、５ｍＭ ２−メルカプトエタノール、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５、３７℃）、３０ｍＭ 塩化ナトリウム、５０％グリセロールになるように滅菌水で調製した。
熱変性子牛胸腺ＤＮＡの調製：子牛胸腺ＤＮＡ２００ｍｇをＴＥバッファー１００ｍｌに懸濁し、膨潤させた。該溶液のＵＶ２６０ｎｍの吸光度を測定し、１ｍｇ／ｍｌの濃度に滅菌超純水で希釈した。次に、該溶液を１００℃で１０分間加熱後、氷浴中で急冷した。
（２）活性測定方法
上記（１）で調製した力価測定用反応液９８５μｌにポリ［８−３Ｈ］アデニル酸溶液７μｌを加え３７℃で１０分間保持した。次にポリアデニル酸を最終濃度が２４μＭになるように８μｌ加え、さらに３７℃で５分間保持した。このようにしてポリ［８−３Ｈ］ｒＡ−ポリｄＴ反応液１０００μｌを調製した。次に、該反応液２００μｌを分取し、３０℃で５分間保持した後、任意の希釈系列で希釈した酵素液１μｌを加え、これらの反応液を経時的に５０μｌずつサンプリングして、後の測定に用いた。酵素添加からサンプリングまでの間の時間をＹ分とした。また、全ＣＰＭ用反応液５０μｌおよびブランク用反応液５０μｌは、酵素液の代わりに酵素希釈液を１μｌ加えて調製した。該サンプリング溶液に１００ｍＭピロリン酸ナトリウム１００μｌ、熱変性子牛胸腺ＤＮＡ溶液５０μｌおよび１０％トリクロロ酢酸３００μｌ（全ＣＰＭ測定の場合は、超純水３００μｌ）を加え、０℃で５分間保持後、１００００ｒｐｍで１０分間遠心した。遠心後、得られた上清２５０μｌをバイアルに入れ、アクアゾルー２（ＮＥＮライフサイエンスプロダクツ社製）１０ｍｌを加え、液体シンチレーションカウンターでＣＰＭを測定した。
（３）ユニット計算
各酵素のユニット（ｕｎｉｔ）数は、以下の計算式で算出した。
Ｕｎｉｔ／ｍｌ＝｛（測定したＣＰＭ−ブランクＣＰＭ）×１．２＊×２０×１０００×希釈率｝×２００（μｌ）／（全ＣＰＭ×Ｙ分×５０（μｌ）×９＊＊）
１．２＊：全ＣＰＭ中に含まれるポリ［８−３Ｈ］ｒＡ−ポリｄＴの５０μｌ当たりのｎｍｏｌ数
９＊＊：補正係数
実施例１
本発明の方法を用いて腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７の検出を行った。
本実施例において使用するプライマーを配列表の配列番号３１〜３４に示した。また、配列番号３１と３２の組み合わせは、Ｏ−１５７のベロ毒素（ＶＴ、ｖｅｒｏ−ｔｏｘｉｎ）１をコードする配列を、配列番号３３と３４の組み合わせは、ベロ毒素２をコードする配列を検出するように構築した。鋳型は、ＡＴＣＣ登録番号４３８９５の腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７を培養したものを集菌し、適当な細胞数に滅菌水で懸濁した後、９８℃で１０分間処理した熱抽出物を使用した。以下に反応液組成を示す。
２７ｍＭ リン酸バッファー（ｐＨ７．３）、０．０１％ＢＳＡ（牛血清アルブミン）、５％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、各１ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、８ｍＭ 酢酸マグネシウム、それぞれ６０ｐｍｏｌの上記のプライマー対、１０４〜１０６細胞数に相当する鋳型ＤＮＡ（熱水抽出物）、および滅菌蒸留水で反応液容量を４８μｌにした。上記反応液を９８℃、１分間熱変性処理後、５５℃に冷却した。次に、５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、６０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨを添加し、５５℃、６０分間保持した。その後、９０℃、２分間加熱して酵素を失活させた。各反応液３μｌを４％ヌシーブ３：１アガロース（宝酒造社製）ゲルにて電気泳動を行なった。その結果、いずれのプライマー対でも１０４細胞数相当のＤＮＡを鋳型として、Ｏ−１５７ベロ毒素１および２を検出することができ、本発明の方法が、病毒性細菌の検出方法として利用できることを確認した。
実施例２
（１）本発明の方法においてバッファーの種類を変えて検討した。本実施例において使用するプライマーは、配列表の配列番号３９及び４０記載の配列を有するλＤＮＡ増幅用のプライマーを用いた。反応は、以下のように行った。すなわち、各１２０ｐｍｏｌの上記プライマー、０．０１％プロピレンジアミン水溶液、１０ｎｇまたは１ｎｇの鋳型ＤＮＡの混合液１０μｌを９８℃で２分間、熱変性させた後、氷中で冷却し、プライマーを鋳型ＤＮＡにアニールさせた。なお、該鋳型は、λＤＮＡ（宝酒造社製）を鋳型とし、配列表の配列番号４１及び４２記載のプライマーを使用したＰＣＲによって得られた増幅産物（１００５ｂｐ）をＳｕｐｒｅｃ０２（宝酒造社製）で精製したものを用いた。
アニーリング処理後、上記混合液に各０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、５．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、１．２５％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ及び１１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む３種類の反応用緩衝液（４２．５ｍＭ トリシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）、４２．５ｍＭ ビシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．３）及び４２．５ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．８））４０μｌを添加し、最終容量を５０μｌにした。該反応液は、６０℃で１時間保持した。反応終了後、反応液３μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動で確認したところ、いずれの鋳型量においても目的の増幅断片が確認できた。特に、ビシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）を用いた反応系でより多くの増幅産物が得られた。
（２）さらに、ヘペス−水酸化カリウムバッファーによる反応性の向上について検討した。鋳型は、ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡのマルチクローニングサイトに約１５０ｂｐのＤＮＡ断片を挿入したものを用いた。該鋳型は、以下のようにして調製した。
配列表の配列番号１３４および１３５記載の配列を有するｐＵＣ１９ｕｐｐｅｒ １５０ ＰＣＲプライマー、ｐＵＣ１９ ｌｏｗｅｒ ＰＣＲプライマーを使用し、ｐＵＣ１９プラスミドＤＮＡ１００ｐｇを鋳型としてＰＣＲ反応を行った。得られた増幅断片は、マイクロコン−１００で精製後、ＤＮＡ ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いて平滑末端化し、ｐＵＣ１９プラスミドのＨｉｎｃＩＩサイトにサブクローニングした。上記増幅断片の挿入されたプラスミドを用いて、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。該形質転換体を培養し、その菌体よりＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄｍｉｎｉ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてＤＮＡ挿入プラスミドを精製した。このＤＮＡ挿入プラスミドを鋳型として使用した。
上記の方法で調製したｐＵＣ１９−１５０プラスミドＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号３５及び３６記載の塩基配列を有するＭＣＳ−ＦおよびＭＣＳ−ＲプライマーによりＰＣＲ増幅したＤＮＡ断片を鋳型とした。また、キメラオリゴヌクレオチドプライマーとしては、配列表の配列番号３７及び３８記載の塩基配列を有するＭＦ２Ｎ３（２４）プライマーおよびＭＲ１Ｎ３（２４）プライマーを使用した。該プライマーの組合せにより約３５０ｂｐの増幅断片が得られた。
検討するバッファーは、ヘペス−水酸化カリウムバッファー系を選択し、対照としてリン酸カリウムバッファー系、トリシンバッファー系を使用した。以下に反応液組成を示す。
反応液Ａ；上記ＰＣＲ増幅断片１０ｎｇ、各５０ｐｍｏｌずつのＭＦ２Ｎ３（２４）プライマーおよびＭＲ１Ｎ３（２４）プライマー、０．０１％プロピレンジアミン水溶液、および滅菌蒸留水で反応液量を１０μｌとした。
反応液Ｂ；以下の３種類を調製した。
リン酸カリウムバッファー系：最終濃度３５ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）、１．２５％ＤＭＳＯ、０．０１２５％ＢＳＡ、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、各０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、６０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨおよび５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含有する反応液４０μｌを調製した。
トリシンバッファー系：最終濃度４２．５ｍＭ トリシンバッファー（ｐＨ８．７）、１２．５ｍＭ 塩化カリウム、１２．５ｍＭ 硫酸アンモニウム、１．２５％ＤＭＳＯ、０．０１２５％ＢＳＡ、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、各０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨおよび５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含有する反応液４０μｌを調製した。
ヘペス−水酸化カリウムバッファー系：最終濃度２５ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１２５ｍＭ 酢酸カリウム、１．２５％ＤＭＳＯ、０．０１２５％ＢＳＡ、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、各０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨおよび５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含有する反応液４０μｌを調製した。
上記反応液Ａを９８℃、２分間熱変性処理した後、６０℃または６５℃に冷却したのち氷上に静置した。氷上に置いておいた反応液Ａに上記各反応液Ｂを加えて混合し、反応液を５０μｌとした。該反応液を６０℃または６５℃で１時間インキュベートした。反応終了後４℃に冷却し、１／１０容量の０．５Ｍ ＥＤＴＡを加えて反応を停止させた。この反応液３μｌを３％ヌシーブ３：１アガロースゲル電気泳動に供した。その結果、反応温度に関わらず、３種類のバッファー系で目的の増幅断片が確認できた。特に本実施例においては、ヘペス−水酸化カリウムバッファー系が最も増幅産物量が多く、反応性が高いことが確認できた。
実施例３
（１）本発明の方法について、プライマーと鋳型のアニーリング条件について検討した。国際公開第９７／３２０１０号パンフレット記載のフラボバクテリウム属細菌、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＡ−００８２（日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに平成７年（１９９５年）３月２９日よりＦＥＲＭ Ｐ−１４８７２として寄託され、また前記日本国〒３０５−８５６６茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターにＦＥＲＭＢＰ−５４０２［国際寄託への移管請求日：平成８年（１９９６年）２月１５日］として寄託されている。）の部分塩基配列に従って、配列表の配列番号４３及び４４記載の塩基配列を有するプライマーを使用した。また、本実施例においては、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＡ−００８２由来のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号４５及び４６記載のプライマーの組み合わせによるＰＣＲ増幅産物（５７３ｂｐ）をＳｕｐｒｅｃ０２（宝酒造社製）で精製したものを鋳型ＤＮＡとして用いた。反応は以下のように行った。すなわち、各１２０ｐｍｏｌの上記プライマーに２種類のアニーリング溶液（５００ｍＭ塩化カリウム及び８μＭスペルミジン、あるいは０．０５％プロピレンジアミン）をそれぞれ２μｌ添加し、さらに１０ｎｇまたは１ｎｇの上記ＰＣＲ増幅断片を含む最終液量１０μｌの混合液を９８℃で２分間、熱変性させた。変性後、氷中で急冷することによりプライマーを鋳型にアニールさせた。
上記アニーリング処理後、該混合液に各０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、５．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、１．２５％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ及び１１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む３種類の緩衝液（４２．５ｍＭ トリシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）緩衝液、４２．５ｍＭ ビシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．３）、及び４２．５ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．８））のそれぞれを４０μｌ添加し、最終容量を５０μｌにした。該反応液は、５２℃で１時間保持した。反応終了後、反応液３μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図１に示す。図１は、アニーリング溶液と緩衝液のそれぞれの組み合わせについての反応後の電気泳動の結果を示し、レーン１は分子量マーカー（１００ｂｐラダー、宝酒造社製）、レーン２はプロピレンジアミン／トリシン（鋳型１０ｎｇ）、レーン３はプロピレンジアミン／ヘペス（鋳型１０ｎｇ）、レーン４はプロピレンジアミン／ヘペス（鋳型１ｎｇ）、レーン５はプロピレンジアミン／ビシン（鋳型１０ｎｇ）、レーン６は、プロピレンジアミン／ビシン（鋳型１ｎｇ）、レーン７は５００ｍＭ塩化カリウム及び８μＭスペルミジン／ビシン（鋳型１０ｎｇ）、レーン８は５００ｍＭ塩化カリウム及び８μＭスペルミジン／ビシン（鋳型１ｎｇ）、レーン９は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン１０はプロピレンジアミン／トリシン（鋳型１ｎｇ）、レーン１１は５００ｍＭ塩化カリウム及び８μＭスペルミジン／トリシン（鋳型１ｎｇ）、レーン１２はプロピレンジアミン／ヘペス（鋳型１ｎｇ）、レーン１３は５００ｍＭ塩化カリウム及び８μＭスペルミジン／ヘペス（鋳型１ｎｇ）、レーン１４はプロピレンジアミン／ビシン（鋳型１ｎｇ）、レーン１５は５００ｍＭ塩化カリウム及び８μＭスペルミジン／ビシン（鋳型１ｎｇ）である。
図１に示したように、鋳型ＤＮＡ量に関わらず、上記３種類のいずれの緩衝液においてもプライマーと鋳型ＤＮＡのアニーリングに５００ｍＭ 塩化カリウム＋８μＭ スペルミジンを含むアニーリング溶液を使用したものがより多くの目的と増幅産物が得られた。特に本実施例においては、５００ｍＭ 塩化カリウム＋８μＭ スペルミジンを含むアニーリング溶液とビシン−水酸化カリウム緩衝液との組み合わせが良好であった。
（２）λＤＮＡのＰＣＲ増幅断片を鋳型とした場合のアニーリング溶液の効果について検討した。本実施例において、実施例２（１）記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。鋳型ＤＮＡは、実施例２（１）で調製したＰＣＲ増幅断片及びλＤＮＡを用いた。反応は、以下のように行った。すなわち、各１２０ｐｍｏｌの上記プライマーに３種類のアニーリング溶液溶液（５００ｍＭ 塩化カリウム及び８μＭ スペルミジン、０．０５％プロピレンジアミンまたは滅菌水）をそれぞれ２μｌ加え、さらに１０ｎｇまたは１ｎｇのＰＣＲ増幅断片を含む全液量１０μｌの混合液を調製した。該混合液を９８℃で２分間、熱変性させた後、氷中で急冷することによりプライマーを鋳型にアニールさせた。
アニーリング処理後に各０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、５．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ、１．２５％ＤＭＳＯ、３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ及び１１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む３種類の緩衝液（４２．５ｍＭ トリシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）、４２．５ｍＭ ビシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．３）、及び４２．５ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．８））をそれぞれ４０μｌ添加し、最終容量を５０μｌにした。該反応液を６０℃で１時間保持した。反応終了後、該反応液３μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図２に示す。図２は、鋳型量と反応緩衝液とアニーリング溶液の組み合わせについて検討した電気泳動の結果を示し、レーン１はマーカー（１００ｂｐラダー）、レーン２は鋳型１０ｎｇでトリシン／５００ｍＭ 塩化カリウム及び８μＭスペルミジンの組み合わせ、レーン３は鋳型１ｎｇでトリシン／５００ｍＭ 塩化カリウム及び８μＭ スペルミジンの組み合わせ、レーン４は鋳型１０ｎｇでビシン／５００ｍＭ塩化カリウム及び８μＭスペルミジンの組み合わせ、レーン５は鋳型１ｎｇでビシン／５００ｍＭ 塩化カリウム及び８μＭ スペルミジンの組み合わせ、レーン６は鋳型１０ｎｇでヘペス／５００ｍＭ 塩化カリウム及び８μＭスペルミジンの組み合わせ、レーン７は鋳型１ｎｇでヘペス／５００ｍＭ 塩化カリウム及び８μＭ スペルミジンの組み合わせ、レーン８は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン９は、鋳型１０ｎｇでトリシン／プロピレンジアミンの組み合わせ、レーン１０は鋳型１ｎｇでトリシン／プロピレンジアミンの組み合わせ、レーン１１は鋳型１０ｎｇでビシン／プロピレンジアミンの組み合わせ、レーン１２は鋳型１ｎｇでビシン／プロピレンジアミンの組み合わせ、レーン１３は鋳型１０ｎｇでヘペス／プロピレンジアミンの組み合わせ、レーン１４は鋳型１ｎｇでヘペス／プロピレンジアミンの組み合わせ、レーン１５は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン１６は鋳型１０ｎｇでトリシン／水の組み合わせ、レーン１７は鋳型１ｎｇでトリシン／水の組み合わせ、レーン１８は鋳型１０ｎｇでビシン／水の組み合わせ、レーン１９は鋳型１ｎｇでビシン／水の組み合わせ、レーン２０は鋳型１０ｎｇでヘペス／水の組み合わせ、レーン２１は鋳型１ｎｇでヘペス／水の組み合わせである。
図２に示したように、鋳型ＤＮＡ量に関わらず、上記３種類の緩衝液と上記３種類のアニーリング溶液の組み合わせのいずれにおいても目的の増幅断片が得られることが確認できた。特に、ビシン緩衝液と５００ｍＭ 塩化カリウム及び８μＭ スペルミジンを含むアニーリング溶液との組み合わせにおいて、より多くの増幅断片が得られることが確認できた。
実施例４
逆転写酵素（ＲＴａｓｅ）阻害剤存在下での本発明の方法について検討した。上記ＲＴａｓｅ阻害剤としてホスホノギ酸（ＰＦＡ：Ｐｈｏｓｐｈｏｎｏｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ）を用いた。本実施例においてプライマーは、配列表の配列番号４７及び４８記載のものを使用した。また、鋳型ＤＮＡとしては、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７のゲノムＤＮＡを鋳型とし、配列表の配列番号４９及び５０記載のプライマーによるＰＣＲ増幅産物（５７６ｂｐ）をＳｕｐｒｅｃ０２（宝酒造社製）で精製したものを用いた。反応は以下のように行った。すなわち、各１２０ｐｍｏｌの上記プライマーと２μｌの５００ｍＭ 塩化カリウム及び８μＭ スペルミジンを含むアニーリング溶液に１ｎｇのＰＣＲ増幅断片を添加した全液量１０μｌの混合液を、９８℃で２分間、熱変性させた後、氷中で急冷することによりプライマーを鋳型にアニールさせた。
上記アニーリング処理後、該処理液に各０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、４２．５ｍＭ トリシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）、５．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、１．２５％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ、１１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む４０μｌを添加し、さらに５００μｇ／ｍｌあるいは５０μｇ／ｍｌの濃度になるようにＰＦＡを加え、最終容量を５０μｌにした。該反応液は、５５℃で１時間保持した。対照として、ＰＦＡを添加しない系も同様に調製した。反応終了後の反応液９μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図３に示す。図３は、逆転写酵素活性阻害剤の効果を示す電気泳動の結果を示し、レーン１は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン２はＰＦＡ無添加、レーン３は５００μｇ／ｍｌのＰＦＡ添加、レーン４は５０μｇ／ｍｌのＰＦＡ添加結果である。
図３に示したように、ＰＦＡを添加することにより非特異的な増幅が抑制され、さらに目的の増幅断片が確認できた。特に５００μｇ／ｍｌになるように添加した系では、添加していない系で見られる非特異的な増幅産物が見られず、目的の増幅断片が明瞭に増幅されていることが確認できた。
実施例５
本発明の方法について増幅断片長と検出感度の関係について検討した。
（１）配列表の配列番号５１〜５３記載の大腸菌Ｏ−１５７ベロ毒素増幅用プライマーを合成した。さらに、実施例４で使用したキメラオリゴヌクレオチドプライマーも使用した。上記プライマーの組み合わせと増幅断片長は、配列表の配列番号５１及び４８の組み合わせで２４７ｂｐ、５２及び５３の組み合わせで１６８ｂｐ、５２及び４８の組み合わせで２０６ｂｐ、４７及び５３の組み合わせで１３５ｂｐ、４７及び４８の組み合わせで１７３ｂｐである。本実施例において鋳型ＤＮＡは、実施例４で調製した５７６ｂｐのＰＣＲ増幅断片精製物を用いた。反応は、以下のように行った。すなわち、上記各６０ｐｍｏｌのプライマーと２μｌの０．０５％プロピレンジアミン水溶液、１０ｆｇ〜１０ｎｇの上記ＰＣＲ増幅断片を含む全液量１０μｌの混合液をサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造社製）で９８℃で２分間熱変性後、５５℃に冷却し、鋳型にプライマーをアニーリングさせた。
上記アニーリング処理した混合液に０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、４２．５ｍＭ トリシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）、５．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、１．２５％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ、５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、及び滅菌水を含む全液量４０μｌの反応液を添加し、最終容量を５０μｌにした。該反応液は、５５℃で１時間保持した。反応終了後、該反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。対照として、配列表の配列番号５４及び５５記載のプライマーを用いて、上記ＰＣＲ増幅断片１ｐｇ〜１０ｆｇの検出を行った。上記プライマーの組み合わせにより、１３５ｂｐの増幅断片が得られる。すなわち、各６０ｐｍｏｌのプライマー、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー（宝酒造社製）５μｌ、１．２５Ｕのタカラ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ混合物を含む全量５０μｌのＰＣＲ溶液を調製した。ＰＣＲ条件は、９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒を１サイクル（所要時間は、２分３８秒）とした２５または３０サイクルで行った。反応終了後、ＩＣＡＮ法の場合は１μｌ、ＰＣＲ法の場合は、５μｌの反応液を３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図４及び表１に示す。
Figure 0004128074
図４は、ＩＣＡＮ法（反応液の１／５０量を泳動）及びＰＣＲ法（反応液の１／１０量を泳動）での増幅鎖長１３５ｂｐの場合の検出限界を示す電気泳動の結果を示し、レーン１は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン２はＩＣＡＮ法で鋳型１ｐｇの場合、レーン３はＩＣＡＮ法で鋳型１００ｆｇの場合、レーン４はＩＣＡＮ法で鋳型１０ｆｇの場合、レーン５は２５サイクルのＰＣＲ法で鋳型１ｐｇの場合、レーン６は２５サイクルのＰＣＲ法で鋳型１００ｆｇの場合、レーン７は２５サイクルのＰＣＲ法で鋳型１０ｆｇの場合、レーン８は３０サイクルのＰＣＲ法で鋳型１ｐｇの場合、レーン９は３０サイクルのＰＣＲ法で鋳型１００ｆｇの場合、レーン１０は３０サイクルのＰＣＲ法で鋳型１０ｆｇの場合である。
表１に示したようにＰＣＲ法とほぼ同等の検出感度が得られることを確認した。さらに、同じ検出感度の場合、ＰＣＲ法の反応所要時間約８０分に比べ、本発明の方法の反応所要時間は７０分となり、所要時間の短縮ができることを確認した。
（２）配列表の配列番号３９、４０及び５６記載の塩基配列を有するλＤＮＡ増幅用のプライマーを合成した。該プライマーの組み合わせと増幅断片長は、配列表の配列番号３９及び４０の場合は１５１ｂｐ、５６及び４０の場合は１２５ｂｐである。また、本実施例において鋳型ＤＮＡは、実施例２（１）で調製したものを使用した。反応は以下のように行った。すなわち、各１２０ｐｍｏｌの上記プライマーに２μｌのアニーリング溶液（５００ｍＭ 塩化カリウム及び８μＭスペルミジン）と、１ｆｇ〜１ｎｇの鋳型を加え、滅菌水で全液量を１０μｌにした。該液を９８℃で２分間、熱変性させた後、氷中で急冷することによりプライマーを鋳型にアニーリングさせた。
アニーリング処理後、上記混合液に各０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、４２．５ｍＭ トリシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）、５．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ、１．２５％ＤＭＳＯ、３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ、１１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む４０μｌを添加し、滅菌水で最終容量を５０μｌにした。該反応液は、６０℃で１時間保持した。反応終了後、該反応液３μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を表２に示した。
Figure 0004128074
表２に示したようにλＤＮＡを鋳型にした場合においても、最適な領域を検討することにより、検出感度を１０ｆｇまで下げることができることを確認した。
（３）配列表の配列番号５７及び５８記載の塩基配列を有する菊ウイロイド遺伝子増幅用プライマーを合成し、ウイロイド感染菊由来ＲＮＡを鋳型として特願平９−１４０３８３公報記載の方法で調製した増幅断片（全長３４０ｂｐ）をプラスミドＴ７ブルーＴベクター（宝酒造製）に挿入して調製した。これで大腸菌ＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換し、ＬＢ培地５ｍｌにて３７℃１６時間培養した。菌体を回収し、ＱＩＡＧＥＮ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてマニュアルに従い、プラスミドの精製をおこなった。ベックマンＤＵ−６００（ベックマン製）にて濃度測定を行い、滅菌水にて１μｌあたリプラスミド濃度０、１ｆｇ、１０ｆｇ、１００ｆｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇ、１ｎｇに調製した。ＩＣＡＮ反応系５０μｌにおいて上記調製プラスミド溶液１μｌを鋳型として用いた。本実施例においてプライマーは、配列表の配列番号５９及び６０記載の塩基配列を有するＣＳＶＤ−Ｆ２プライマー及びＣＳＶＤ−Ｒ６プライマーを使用した。反応は、以下のように行った。すなわち、上記プライマー各５０ｐｍｏｌ、各調製プラスミド溶液１μｌ及び最終濃度０．０１％プロピレンジアミンを含む全液量１０μｌの混合液を調製した。該混合液をサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造製）にて９８℃、２分間熱処理後、６０℃まで冷却し、１分間保持後、氷上に保存した。
アニーリング処理後、上記混合液に最終濃度２０ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、各５００μＭ ｄＮＴＰ混合物、３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ、５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを添加し、滅菌水で最終容量を５０μｌにした。該反応液をあらかじめ、６０℃に設定したサーマルサイクラーパーソナルにセットし６０分間反応させた。反応終了後、各反応液３μｌを３％ヌシーブ３：１アガロース電気泳動に供した。その結果、目的とする増幅産物（約９０ｂｐ、約７０ｂｐ、約５０ｂｐ）について、１０ｆｇの鋳型濃度の場合まで確認できた。
実施例６
本発明の方法で使用するプライマーについて検討した。
（１）プライマーのＴｍ値と反応温度について検討した。配列表の配列番号４３及び６１〜６３記載の塩基配列を有する、フラボバクテリウム属（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＡ−００８２）増幅用プライマーを合成した。さらに該プライマーは、１６０ｂｐ以下でＧＣ含量が約２０％の領域を増幅するように構築した。該プライマーの組み合わせと増幅断片長は、配列表の配列番号４３及び６２の場合は１２６ｂｐ、４３及び６３の場合は１５８ｂｐ、６１及び６２の場合は９１ｂｐ、６１及び６３の場合は１２３ｂｐである。なお、本実施例において鋳型となるＤＮＡは、実施例３（１）で調製したＰＣＲ増幅産物を用いた。反応は以下のように行った。すなわち、各１２０ｐｍｏｌの上記プライマー、２μｌの３種類のアニーリング溶液（５００ｍＭ 塩化カリウム及び８μＭ スペルミジン、０．０５％プロピレンジアミン、または水）及び、１ｆｇ〜１０ｎｇの鋳型を含む全液量１０μｌの混合液を調製した。該混合液を９８℃で２分間、熱変性させた後、氷中で冷却することによりプライマーを鋳型にアニーリングさせた。
アニーリング処理後、上記混合液に各０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、５．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）、１．２５％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ及び１１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む３種類の緩衝液（１７ｍＭ トリシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）、１７ｍＭ ビシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．３）、及び２０ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．８））を４０μｌを添加し、最終容量を５０μｌにした。該反応液を５２℃、５５℃または６０℃で１時間保持した。反応終了後、反応液３μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果、反応温度が５２℃の場合に目的の増幅断片が確認できた。特に、５００ｍＭ塩化カリウム及び８μＭスペルミジンを含むアニーリング溶液とトリシン、あるいはビシン緩衝液の組み合わせにおいてより多くの目的とする増幅断片が得られた。反応温度が５２℃におけるプライマー対、増幅断片長及び検出感度について図５及び表３に示す。
Figure 0004128074
図５は、ＡＴリッチな領域を増幅する場合の増幅断片長と鋳型ＤＮＡ量の関係を示した電気泳動の結果を示し、レーン１は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン２は増幅断片長９１ｂｐで鋳型１ｐｇの場合、レーン３は増幅断片長９１ｂｐで鋳型１００ｆｇの場合、レーン４は増幅断片長９１ｂｐで鋳型１０ｆｇの場合、レーン５は増幅断片長９１ｂｐで鋳型１ｆｇの場合、レーン６は増幅断片長１２３ｂｐで鋳型１ｐｇの場合、レーン７は増幅断片長１２３ｂｐで鋳型１００ｆｇの場合、レーン８は増幅断片長１２３ｂｐで鋳型１０ｆｇの場合、レーン９は増幅断片長１２６ｂｐで鋳型１ｐｇの場合、レーン１０は増幅断片長１２６ｂｐで鋳型１００ｆｇの場合、レーン１１は増幅断片長１２６ｂｐで鋳型１０ｆｇの場合、レーン１２は増幅断片長１５８ｂｐで鋳型１ｐｇの場合、レーン１３は増幅断片長１５８ｂｐで鋳型１００ｆｇの場合、レーン１４は増幅断片長１５８ｂｐで鋳型１０ｆｇの場合である。
図５及び表３に示したように、ＡＴリッチな鋳型に対し、ＡＴリッチなプライマーセットで本発明の方法を行う場合は、プライマーのＴｍ値にあわせて、反応温度を下げると良いことが明らかになった。
（２）本発明の方法においてプライマーの高次構造が反応性に影響を与えることが考えられた。従って、プライマーの高次構造を回避し、プライマーが本来の鋳型にアニーリングしやすくするためのプライマーの修飾を検討した。プライマーは、配列表の配列番号４７〜４８及び６４〜６９記載のそれぞれのプライマーを使用した。すなわち、配列表の配列番号４７記載の塩基配列を有するプライマー、配列番号６４〜６６記載の塩基配列を有するプライマーで、さらに３’末端より４塩基目、５塩基目、６塩基目の塩基がそれぞれイノシンデオキシヌクレオチドである１２０Ｉ４、１２１Ｉ５及び１２２Ｉ６プライマー、配列表の配列番号１０４記載の塩基配列を有するプライマー、配列番号６７〜６９記載の塩基配列を有するプライマーで、さらに３’末端より４塩基目、５塩基目、６塩基目の塩基がそれぞれイノシンデオキシヌクレオチドである１２３Ｉ４、１２４Ｉ５及び１２５Ｉ６プライマーを使用した。本実施例において鋳型ＤＮＡは、実施例４で調製したものを使用した。反応は、以下のように行った。すなわち、前記各５０ｐｍｏｌのプライマー、２μｌの０．０５％ プロピレンジアミン水溶液、１ｎｇ〜１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ及び滅菌蒸留水を含む全液量１０μｌの混合液をサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９６００、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、９８℃で２分間、続いて５５℃まで冷却し、１分間保持した。
アニーリング処理後、該混合液に０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、４２．５ｍＭ トリシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）、５．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ、１．２５％ＤＭＳＯ、３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨあるいは５Ｕのサーマス サーモフィラス（Ｔｔｈ）由来耐熱性ＲＮａｓｅＨ（東洋紡社製、以下Ｔｔｈ ＲＮａｓｅＨと記載する。）及び５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを添加し、滅菌水で最終容量を５０μｌにした。該反応液は、５５℃で１時間保持した。反応終了後、反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図６に示す。
図６は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ及びＴｔｈ ＲＮａｓｅＨを使用した場合のイノシンデオキシヌクレオチド含有キメラオリゴヌクレオチドプライマーの効果について示した電気泳動の結果を示し、レーン２〜レーン９までは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ、レーン１０〜１７は、Ｔｔｈ ＲＮａｓｅＨを使用した場合である。レーン１は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン２は配列番号４７及び４８記載のプライマー対で鋳型１ｎｇの場合、レーン３は、１２０Ｉ４及び１２３Ｉ４プライマー対で鋳型１ｎｇの場合、レーン４は、１２１Ｉ５及び１２４Ｉ５プライマー対で鋳型１ｎｇの場合、レーン５は、１２２Ｉ６及び１２５Ｉ６プライマー対で鋳型１ｎｇの場合、レーン６は配列表の配列番号４７及び４８記載のプライマー対で鋳型１０ｎｇの場合、レーン７は、１２０Ｉ４及び１２３Ｉ４プライマー対で鋳型１０ｎｇの場合、レーン８は、１２１Ｉ５及び１２４Ｉ５プライマー対で鋳型１０ｎｇの場合、レーン９は、１２２Ｉ６及び１２５Ｉ６プライマー対で鋳型１ｎｇの場合、レーン１０は、配列表の配列番号４７及び４８記載のプライマー対で鋳型１ｎｇの場合、レーン１１は、１２０Ｉ４及び１２３Ｉ４プライマー対で鋳型１ｎｇの場合、レーン１２は、１２１Ｉ５及び１２４Ｉ５プライマー対で鋳型１ｎｇの場合、レーン１３は、１２２Ｉ６及び１２５Ｉ６プライマー対で鋳型１ｎｇの場合、レーン１４は配列表の配列番号４７及び４８記載のプライマー対で鋳型１０ｎｇの場合、レーン１５は、１２０Ｉ４及び１２３Ｉ４プライマー対で鋳型１０ｎｇの場合、レーン１６は、１２１Ｉ５及び１２４Ｉ５プライマー対で鋳型１０ｎｇの場合、レーン１７は、１２２Ｉ６及び１２５Ｉ６プライマー対で鋳型１０ｎｇの場合である。
図６に示したように、鋳型量に関わらず、また、大腸菌由来ＲＮａｓｅＨあるいはサーマス サーモフィラス由来耐熱性ＲＮａｓｅＨのいずれを用いた場合においてもプライマーの３’末端より４塩基目あるいは５塩基目にイノシンを導入したプライマーにおいて目的の増幅産物の増加が確認できた。このことより、イノシンを適当な位置に入れることにより、ＩＣＡＮの反応性が向上することが明らかになった。
（３）上記（２）と同様の目的でプライマーの検討を行った。プライマーは、配列表の配列番号８４及び８５記載の塩基配列の塩基配列を有するプライマーで、さらに３’末端の３塩基が（α−Ｓ、あるいはａｌｐｈａ−ｔｈｉｏ）リボヌクレオチドであるもの、すなわち、ＲＮＡ部分が５’−ホスホチオエート結合を持つオリゴヌクレオチドプライマー１Ｓおよび４Ｓを合成した。また、配列表の配列番号７０及び７１記載の塩基配列を有するプライマーで、さらに３’末端の３塩基と該プライマーのデオキシリボヌクレオチド部分の配列の一部がリボヌクレオチドである、すなわち、該プライマーの３’末端より１１塩基目から１３塩基目までがリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドプライマー１Ｎ３Ｎ３および４Ｎ３Ｎ３を合成した。鋳型となるＤＮＡは、実施例４で調製したものを使用した。反応は、以下のように行った。すなわち、前記各５０ｐｍｏｌのプライマー、２μｌの０．０５％プロピレンジアミン水溶液、１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ及び滅菌水を含む全液量１０μｌの混合液をサーマルサイクラーを用いて、９８℃で２分間加熱処理を行ったのち、氷中に移し冷却した。
アニーリング処理後、上記混合液に０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、４２．５ｍＭ トリシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）、５．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ、１．２５％ＤＭＳＯ、３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨあるいは５ＵのＴｔｈ ＲＮａｓｅＨ及び５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む全液量４０μｌを加え、滅菌水で最終容量を５０μｌにした。該反応液を、サーマルサイクラーで５５℃で１時間保持した。
反応終了後、反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果、いずれのＲＮａｓｅＨを用いた場合においても、１Ｓと４Ｓのプライマーの組み合わせおよび１Ｎ３Ｎ３と４Ｎ３Ｎ３のプライマーの組み合わせにおいて目的の位置に明らかな増幅産物が確認できた。このことから、プライマーの３’末端部分の５’−ホスホチオエート化は、本発明の方法において有効であることを確認した。さらに、プライマーの３’末端に加え、内部の適当な位置をリボヌクレオチドに置き換えた場合でも本発明の方法の反応性の向上に有効であることを確認した。
実施例７
特定の金属イオン存在下でＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いた本発明の方法について検討した。実施例２（１）で使用したキメラオリゴヌクレオチドプライマーを各１２０ｐｍｏｌ、２μｌの５００ｍＭ 塩化カリウム及び８μＭスペルミジンを含むアニーリング溶液、実施例２（１）で用いた１ｎｇの鋳型ＤＮＡ及び滅菌水含む全液量１０μｌの混合液を９８℃で２分間、熱変性させた後、氷中で急冷することによりプライマーを鋳型にアニーリングさせた。アニーリング処理後、該混合液に各０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、４２．５ｍＭ トリシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）、５．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ、１．０％ＤＭＳＯ、１１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む４０μｌを添加し、さらに塩化マンガン（ナカライテスク社製）を０．５ｍＭ、２．５ｍＭ、５．０ｍＭ、１０ｍＭの濃度になるように加え、滅菌水で最終容量を５０μｌにした。該反応液は、６０℃で１時間保持した。さらに、対照として塩化マンガンを添加しないもの、及び３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨを添加し、塩化マンガンを添加しないものも調製した。反応終了後、反応液３μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図７に示す。
図７は、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼのＲＮａｓｅＨ活性を利用した場合のＩＣＡＮ法の結果を示す電気泳動を示し、レーン１は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン２は塩化マンガン無添加／Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ添加の場合、レーン３は塩化マンガン無添加／Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ無添加の場合、レーン４は０．５ｍＭ塩化マンガン添加／Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ無添加の場合、レーン５は２．５ｍＭ塩化マンガン添加／Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ無添加の場合、レーン６は５．０ｍＭ塩化マンガン添加／Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ無添加の場合、レーン７は１０．０ｍＭ塩化マンガン添加／Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ無添加の場合を示す。
図７に示したようにＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ非存在下において、塩化マンガンを２．５ｍＭになるように添加した反応系で、目的の増幅産物が確認された。
実施例８
本発明の方法について、実際の生体試料で検討した。
（１）ＡＴＣＣ登録番号４３８９５の腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７を培養後、熱水抽出した物を鋳型として検出を行った。腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７をノボビオシン加ｍＥＣ培地にて４２℃、１８時間培養後、９５℃、１０分間熱処理を行った。これを滅菌水にて０、１、１０、１０２、１０３、１０４、１０５セルに相当するＯ−１５７熱水抽出物を調製した。このＯ−１５７熱水抽出物を用い、実施例５（１）と同様の条件で、ベロ毒素２型（ＶＴ２）遺伝子の増幅を行った。また、対照として、同じ鋳型を用いて実施例５（１）記載の条件でＰＣＲ増幅も行った。反応終了後、ＩＣＡＮ法では反応液１μｌ、ＰＣＲ法では、反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を表４及び図８に示す。
Figure 0004128074
図８は、ＩＣＡＮ法及びＰＣＲ法を用いた大腸菌Ｏ１５７の検出を示す電気泳動の結果を示し、増幅鎖長は１３５ｂｐである。レーン１は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン２はＩＣＡＮ法で細胞１０４個、レーン３はＩＣＡＮ法で細胞１０３個、レーン４はＩＣＡＮ法で細胞１０２個、レーン５は２５サイクルのＰＣＲで細胞１０４個、レーン６は２５サイクルのＰＣＲ法で細胞１０３個、レーン７は２５サイクルのＰＣＲで細胞１０２個、レーン８は３０サイクルのＰＣＲで細胞１０４個、レーン９は３０サイクルのＰＣＲ法で細胞１０３個、レーン１０は３０サイクルのＰＣＲで細胞１０２個の場合である。
表４及び図８に示したように、本発明の検出方法は、ＰＣＲ法と同等の検出感度を有し、さらにＰＣＲ法よりも短時間で検出できることを確認した。
（２）実施例２及び４で用いた配列表の配列番号４０及び５６のプライマーを用いて、λＤＮＡを検出した。反応は、以下のように行った。すなわち、前記各１２０ｐｍｏｌのプライマー、２μｌの５００ｍＭ 塩化カリウム及び８μＭ スペルミジンを含むアニーリング溶液、１０ｆｇ〜１ｎｇのλＤＮＡ（宝酒造社製）及び滅菌水を含む全液量１０μｌの混合液を調製し、９８℃で２分間、熱変性させた後、氷中で急冷することによりプライマーを鋳型にアニーリングさせた。
アニーリング処理後、該混合液に各０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、４２．５ｍＭ トリシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）、５．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ、１．２５％ＤＭＳＯ、３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ及び１１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む４０μｌを添加し、滅菌水で最終容量を５０μｌにした。該反応液は、６０℃で１時間保持した。反応終了後、反応液３μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を表５に示す。
Figure 0004128074
表５に示したように、λＤＮＡの検出において本発明の方法は有効であることを確認した。
（３）フラボバクテリウム細菌（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．ＳＡ−００８２）のゲノムＤＮＡを鋳型とし、実施例６（１）で用いた配列表の配列番号６１及び６２記載のプライマーを用いて検出を行った。鋳型として、国際公開第９７／３２０１０号パンフレット記載の方法で培養したフラボバクテリウム細菌からゲノムＤＮＡを常法により調製した。反応は、以下のように行った。すなわち、前記各１２０ｐｍｏｌのプライマー、２μｌの５００ｍＭ 塩化カリウム及び８μＭ スペルミジンを含むアニーリング溶液、１０ｆｇ〜１ｎｇのゲノムＤＮＡ及び滅菌水で全液量１０μｌの混合液を調製し、９８℃で２分間、熱変性させた後、氷中で急冷することによりプライマーを鋳型にアニーリングさせた。
アニーリング処理後、上記混合液に各０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、４２．５ｍＭ トリシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）、５．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ、１．２５％ＤＭＳＯ、３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ及び１１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む４０μｌを添加し、滅菌水で最終容量を５０μｌにした。該反応液は、５２℃で１時間保持した。反応終了後、反応液３μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を表６及び図９に示す。
Figure 0004128074
図９は、フラボバクテリウム属細菌の検出を示す電気泳動の結果を示し、レーン１は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン２は鋳型１ｎｇ、レーン３は鋳型１０ｐｇ、レーン４は鋳型１ｐｇ、レーン５は鋳型１００ｆｇ、レーン６は鋳型１０ｆｇの場合である。
表６及び図９に示したように細菌の検出において、本発明の方法は有効であることを確認した。
実施例９
本発明の増幅方法とハイブリダイゼーション法との組み合わせによる標的核酸の検出方法を検討した。ターゲットとして、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７を選択した。鋳型ＤＮＡは、実施例８（１）記載の方法で調製した。増幅断片長は、ＧＣ含量約４０％で約１００ｂｐの領域を選び，プライマーとして配列表の配列番号５１及び７２記載の塩基配列で示されるＶＴ２−ＩＦ２０及びＶＴ２−ＩＲ２０−２プライマーを使用した。反応は、以下のように行った。すなわち、各５０ｐｍｏｌのＶＴ２−ＩＦ２０及びＶＴ２−ＩＲ２０−２プライマー、最終濃度０．０１％プロピレンジアミンを含むアニーリング溶液、０〜１０４セル相当の各細胞数熱抽出液及び滅菌水で全液量１０μｌの混合液を調製した。該混合液をサーマルサイクラーパーソナル（宝酒造製）にて９８℃ ２分間、熱変性後、５５℃まで冷却し、１分間保持後、さらに氷上に置き、アニーリング処理を行った。
アニーリング処理後、上記混合液に最終濃度２０ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、各５００μＭ ｄＮＴＰ混合物、３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ及び５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡ ポリメラーゼを添加し、滅菌水で最終容量を５０μｌにした。該反応液は、あらかじめ５５℃に設定したサーマルサイクラーパーソナルにセットし、６０分間保持した。対照としてＯ−１５７ Ｔｙｐｉｎｇ Ｓｅｔ（宝酒造製）を用い、マニュアル通りにサーマルサイクラーパーソナルにてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃ １分、５５℃ １分、７２℃ １分を１サイクルとする３５サイクルで行った。該反応での所要時間は、１サイクルが約４分で、全所要時間は、約１４５分になる。この際、予想される増幅産物は、４０４ｂｐである。反応終了後、各反応液３μｌを３％ヌシーブ３：１アガロース電気泳動に供した。その結果を図２８Ａに示す。図２８Ａは、ＩＣＡＮ法とＰＣＲ法での腸管出血性大腸菌Ｏ１５７ベロ毒素ＩＩ型遺伝子検出の電気泳動結果であり、レーンＭ１は分子量マーカー（５０−２０００ｂｐ）、レーンＭ２は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーンＮはネガティブコントロール、レーン１は１セル相当、レーン２は１０セル相当、レーン３は１０２セル相当、レーン４は１０３セル相当、レーン５は１０４セル相当の鋳型の場合である。さらに、１，１０セルにおけるＩＣＡＮ法とＰＣＲ法の増幅量の比較結果を表７に示す。
Figure 0004128074
図２８Ａ及び表７に示したように、本発明の検出方法もＰＣＲ法も予想される増幅産物を１細胞相当量の熱水抽出液を用いた反応系まで得ることができた。さらに、ＩＣＡＮ法で得られた増幅産物については、配列表の配列番号７３記載の塩基配列で示される５’末端にビオチン標識されたＶＴ２ オリゴヌクレオチドプローブを用いてドットハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイズは以下の条件で行った。すなわち、９８℃、５分間変性後、氷上にて急冷させた反応液１μｌをＨｙｂｏｎｄ−ＮＴＭ（アマシャム ファルマシア バイオテク社製）にスポットし、ＵＶ照射後、ハイブリバックに入れ、０．５Ｍ リン酸水素二ナトリウム（ｐＨ７．２）、１ｍＭ エチレンジアミン四酢酸、７％ラウリル硫酸ナトリウムのハイブリ溶液１０ｍｌを添加し、４２℃でプレハイブリダイゼーションを３０分間行なった。次に１０μｌの上記ＶＴ２ プローブ １００ｎｇ／μｌ溶液を熱変性後、プレハイブリダイゼーション反応系に添加した。４２℃、６０分間ハイブリダイゼーション後、６６．６ｍＭ 塩化ナトリウム、６６．６ｍＭ クエン酸三ナトリウム水和物、０．１％ラウリル硫酸ナトリウムの溶液で室温にて５分間２回洗浄し、洗浄バッファー（０．３Ｍ塩化ナトリウム、１７．３ｍＭ リン酸二水素ナトリウム二水和物，２．５ｍＭ ＥＤＴＡ溶液、０．１％ラウリル硫酸ナトリウム）６ｍｌに５ｍｇ／ｍｌのＨｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＰＩＥＲＣＥ製）を２μｌ添加し、４２℃、１２分間インキュベート後、洗浄バッファーで、室温で２回洗浄した。その後、０．１Ｍ クエン酸バッファー（ｐＨ５．０）１０ｍｌ室温で洗浄し、０．１Ｍ クエン酸バッファー５ｍｌ、３％過酸化水素５μｌ、２ｍｇ／ｍｌテトラメチルベンジジンエタノール溶液（ＴＭＢ、ナカライ社製）２５０μｌの混合溶液で暗室にて約１０分間反応させた。発色後、脱イオン水にて反応停止させた。その結果を図２８Ｂに示す。図２８Ｂは、ＩＣＡＮ法での腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７ベロ毒素ＩＩ型遺伝子検出のドットハイブリ結果であり、上記電気泳動結果と同一であった。すなわち、本発明の方法の検出感度もＰＣＲの検出感度も同等であることから、増幅反応の全所要時間を比較するとＰＣＲに対し本発明のＩＣＡＮ法は、１／２以下の時間で行えることができ、病原菌等の検出方法として有効であることを確認した。
実施例１０
（１）培養細胞由来ＲＮＡを鋳型として、逆転写反応と本発明の方法の組み合わせを検討した。反応は、以下のように行った。すなわち、１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）含有、ダルベッコ改良イーグル培地（バイオウィタカー社製、１２−６０４Ｆ）にＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ ７１）を１．５×１０５／ｍｌになるように懸濁し、６穴マイクロタイタープレートのウェルに５ｍｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で一晩培養した。各ウェルに５０μｌの１００μｇ／ｍｌのリポポリサッカライド（ＬＰＳ、シグマ社製）水溶液および５０μｌの１０００Ｕ／μｌ インターフェロン−γ水溶液（ＩＦＮ−γ、ジェンザイムテクネ社製）を添加して４時間培養後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてキットの説明書に従いＲＮＡを調製した。なお、陰性対照としてＬＰＳおよびＩＦＮ−γを添加しない区分を設定した。
上記により調製したＲＮＡ ３μｇと１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、１５０ｐｍｏｌのランダム６ｍｅｒｓプライマー、６０Ｕのリボヌクレアーゼ インヒビター（宝酒造社製）、１５ＵのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）（宝酒造社製、２６２０Ａ）を含む全液量６０μｌをサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、３０℃で１０分間、続いて４２℃で１時間保温した後、酵素を失活させるために９９℃で５分間加熱してｃＤＮＡを調製した。
マウス誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）のｍＲＮＡの塩基配列（ＧｅｎｅＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＭ−０１０９２７）に従って、配列表の配列番号７４及び７５記載の塩基配列を有するプライマーを合成した。また、対照としてＰＣＲのために配列表の配列番号７６及び７７記載のプライマーも合成した。
各５０ｐｍｏｌの上記プライマーと２μｌの０．０５％プロピレンジアミン水溶液、鋳型として上記ｃＤＮＡ １μｌ（ＲＮＡとして５０ｎｇ相当）及び滅菌水で全液量１０μｌの混合液を調製した。該混合液は、サーマルサイクラーで９８℃で２分間、熱変性後、５５℃に冷却し、１分間保持して鋳型にプライマーをアニーリングさせた。
アニーリング処理後、上記混合液に０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合物、４２．５ｍＭ トリシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．５）、５．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ、１．２５％ＤＭＳＯ、１５ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ、１１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む全液量４０μｌを加え、滅菌水で最終容量を５０μｌにした。該反応液は、サーマルサイクラーで５５℃、１時間保持した。反応後のサンプルは分析するまで−２０℃で凍結して保存した。対照のＰＣＲは以下のように行った。すなわち、各５０ｐｍｏｌのプライマーとｃＤＮＡ １μｌ（ＲＮＡとして５０ｎｇ相当）を含む１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー（宝酒造社製）５μｌ、１．２５Ｕ タカラ Ｅｘタック ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ混合物を含む全液量５０μｌの反応液をサーマルサイクラーを用い、９４℃ ２分間を１サイクル、次に９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒を１サイクルとする３０サイクル、さらに７２℃ ５分間の１サイクルのプログラムで反応を行った。反応後のサンプルは分析するまで−２０℃で凍結して保存した。反応終了後、各反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図１０に示す。
図１０は、ＲＴ−ＩＣＡＮ法（Ａ）及びＲＴ−ＰＣＲ法（Ｂ）の比較を示した電気泳動の結果を示し、レーン１は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン２は陰性対照区分、レーン３はＬＰＳ、ＩＦＮ−γ処理区分である。
図１０に示したように、本発明の方法およびＰＣＲのいずれの反応においても、ＬＰＳおよびＩＦＮ−γで処理した細胞より調製したｃＤＮＡを鋳型にした場合のみ増幅産物が確認された。従って、ＰＣＲ法より反応所要時間が短い本発明の方法が、逆転写反応後のＤＮＡ増幅方法として有効であることを確認した。
実施例１１
Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨの至適温度は、３７℃であることから、本発明の増幅反応中に失活していくことが考えられた。そこで、増幅反応の途中でＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨをさらに添加することによる増幅反応への影響を検討した。鋳型ＤＮＡは、カリフラワーモザイクウイルス ３５Ｓプロモーター及びＥＰＳＰＳ遺伝子の挿入された組み換えダイズより抽出したゲノムＤＮＡから配列表の配列番号７８及び７９記載のＧＭＯ−ＰＣＲ−Ｆ及びＧＭＯ−ＰＣＲ−Ｒプライマーを用いたＰＣＲにより得られた増幅断片（１０７１ｂｐ）を使用した。また、配列表の配列番号８０〜８３記載の塩基配列を有するプライマー、ＧＭＯ−Ｓ１、Ｓ２、Ａ１、Ａ２を使用した。反応は、以下のように行った。すなわち、各５０ｐｍｏｌの上記プライマー、最終濃度０．０１％プロピレンジアミン、１ｐｇ〜１０ｎｇの鋳型ＤＮＡ及び滅菌水で全液量１０μｌの混合液を調製した。該混合液は、９８℃、２分間熱変性し、５５℃まで冷却し、アニーリング処理を行った。
アニーリング処理後、上記混合溶液に最終濃度各５００μＭ ｄＮＴＰ混合物、３４ｍＭ トリシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．７）、４．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、１％ＤＭＳＯ、３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨ、５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを添加し、滅菌水で最終容量を５０μｌにした。該反応液は、サーマルサイクラーで５５℃で２５分間保持した。反応開始から２５分後に、さらに３０ＵのＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨを添加し、５５℃で３０分間保持した。対照として、５５℃で５５分間保持したものも調製した。反応終了後、反応液３μｌを３％アガロース電気泳動に供した。その結果、いずれの鋳型ＤＮＡ濃度でも、いずれのプライマーの組み合わせ、Ｓ１／Ａ１、Ｓ１／Ａ２、Ｓ２／Ａ１、Ｓ２／Ａ２においてもＥ．ｃｏｌｉ ＲＮａｓｅＨを反応途中で加えることにより増幅効率が改善されることを確認した。
実施例１２
本発明で使用する鋳型となる核酸を増幅あるいは複製する方法と、本発明の方法の組み合わせについて検討した。反応は以下のように行った。すなわち、実施例５（３）で調製した菊ウイロイド遺伝子を含み、大腸菌で複製したプラスミドを鋳型とし、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いてインビトロトランスクリプション（ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）を行い、ＲＮＡ複製断片を得た。配列表の配列番号５７及び５８記載の塩基配列を有するプライマー及びｃＤＮＡ シンセシスキット（宝酒造社製）を用いてｃＤＮＡを合成した。該ｃＤＮＡ断片及び上記複製プラスミドを鋳型として実施例５（３）記載の方法で増幅反応を行った。その結果、鋳型となる核酸をプラスミドの形で複製した場合及びＲＮＡポリメラーゼでＲＮＡを複製し、ｃＤＮＡにした場合のいずれにおいても本発明の方法で使用できることを確認した。
実施例１３
（１）プライマーの合成
マウス誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）のｍＲＮＡの塩基配列に従って、配列表の配列番号８６〜８７記載のオリゴヌクレオチドプライマーＮＳ１、ＮＳ２をそれぞれ合成した。
（２）ＰＣＲ産物を鋳型にしたＩＣＡＮ法によるＤＮＡ断片の増幅
前記各５０ｐｍｏｌの合成オリゴヌクレオチドプライマーと２μｌの０．０５％プロピレンジアミン水溶液、１０ｆｇ〜１０ｐｇの鋳型を含む全液量１０μｌをサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９６００、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、９８℃で２分間、続いて６０℃で２分間の加熱処理を行い鋳型にプライマーをアニーリングさせた。なお、この際の鋳型は、ｉＮＯＳ ｃＤＮＡを配列表の配列番号１３２及び１３３記載のプライマーＮＳ−ＰＣＲ１とプライマーＮＳ−ＰＣＲ２により増幅し（７４１ｂｐ）、Ｓｕｐｒｅｃ０２（宝酒造社製）で精製したものを用いた。上記熱処理をした各溶液に０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、４０ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１２５ｍＭ 酢酸カリウム、５．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ、１．２５％ＤＭＳＯ、０．０１５６μｇのＰｆｕ由来ＲＮａｓｅＨ、０．６６ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む全液量４０μｌの反応液を添加し、サーマルサイクラーで６０℃、１時間保温した。この反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図１１に示す。図１１は、Ｐｆｕ ＲＮａｓｅＨを用いたＩＣＡＮ法の結果を示すものであり、レーン１は分子量マーカー（１００ｂｐ）、レーン２は鋳型１０ｆｇ、レーン３は鋳型１００ｆｇ、レーン４は鋳型１ｐｇ、レーン５は鋳型１０ｐｇの場合である。
図１１に示したように、１００ｆｇの鋳型量まで目的の増幅産物が確認できた。
実施例１４
（１）ＲＮＡの調製
１０％ウシ胎児血清（ギブコ社製）含有、ダルベッコ改良イーグル培地（バイオウィタカー社製）にＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ ７１）を１．５×１０５／ｍｌになるように懸濁し、６穴マイクロタイタープレートのウェルに５ｍｌずつ加えて５％炭酸ガス存在下、３７℃で一晩培養した。各ウェルに５０μｌの１００μｇ／ｍｌリポポリサッカライド（ＬＰＳ、シグマ社製）水溶液および５０μｌの１０００Ｕ／ｍｌ インターフェロン−γ水溶液（ＩＦＮ−γ、ジェンザイムテクネ社製）を添加して４時間培養後、ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製、７４１０４）を用いてキットの説明書に従いＲＮＡを調製した。なお、陰性対照としてＬＰＳおよびＩＦＮ−γを添加しない区分を設定した。
上記により調製したＲＮＡ ３μｇと１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、１５０ｐｍｏｌのＲａｎｄｏｍ ６ｍｅｒｓ、６０ＵのＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造社製）、１５ＵのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）（宝酒造社製）を含む全液量６０μｌをサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９６００、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、３０℃で１０分間、続いて４２℃で１時間保温した後、酵素を失活させるために９９℃で５分間加熱してｃＤＮＡを調製した。
マウス誘導型ＮＯ合成酵素（ｉＮＯＳ）のｍＲＮＡの塩基配列に従って、配列表の配列番号９２〜９３に記載の塩基配列を有するプライマーＮＳ５、ＮＳ６をそれぞれ合成した。また、ＰＣＲ反応のために配列表の配列番号８８〜８９記載のプライマーＮＳ３、ＮＳ４を合成した。
各５０ｐｍｏｌの上記プライマーＮＳ５、ＮＳ６、鋳型として上記により合成したｃＤＮＡ溶液１μｌ（ＲＮＡとして５０ｎｇ分）あるいは水により１０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍希釈したもの１μｌ、および０．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、１％ＤＭＳＯ、０．０１５６μｇのＰｆｕ ＲＮａｓｅＨ、０．６６ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む全液量５０μｌをサーマルサイクラーで６０℃、１時間保温した。反応後のサンプルは分析するまで−２０℃で凍結して保存した。
一方、対照としてＰＣＲ法を行った。各５０ｐｍｏｌのプライマーＮＳ３、ＮＳ４とｃＤＮＡ溶液１μｌ（ＲＮＡとして５０ｎｇ分）あるいは水により１０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍希釈したもの１μｌと１０×Ｅｘ タックバッファー（宝酒造社製）５μｌ、１．２５Ｕ タカラ Ｅｘタック ポリメラーゼ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ混合液を含む全液量５０μｌの反応系でサーマルサイクラーを用い、９４℃ ２分間を１サイクル、９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒のサイクルを３５サイクル、７２℃ ５分間を１サイクルのプログラムで反応を行った。反応後のサンプルは分析するまで−２０℃で凍結して保存した。
上記ＩＣＡＮ反応液およびＰＣＲ反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図１２に示す。すなわち、図１２はＰｆｕ ＲＮａｓｅＨを用いたＩＣＡＮ法及びＰＣＲ法でのｉＮＯＳ遺伝子検出結果であり、レーン１は１００ｂｐ ＤＮＡラダーマーカー、レーン２は陰性対照ｃＤＮＡの１００００倍希釈サンプル、レーン３は陰性対照ｃＤＮＡの１０００倍希釈サンプル、レーン４は陰性対照ｃＤＮＡの１００倍希釈サンプル、レーン５は陰性対照ｃＤＮＡの１０倍希釈サンプル、レーン６は陰性対照ｃＤＮＡの原液サンプル、レーン７はＬＰＳとＩＦＮ−γ区分ｃＤＮＡの１００００倍希釈サンプル、レーン８はＬＰＳとＩＦＮ−γ区分ｃＤＮＡの１０００倍希釈サンプル、レーン９はＬＰＳとＩＦＮ−γ区分ｃＤＮＡの１００倍希釈サンプル、レーン１０はＬＰＳとＩＦＮ−γ区分ｃＤＮＡの１０倍希釈サンプル、レーン１１はＬＰＳとＩＦＮ−γ区分ｃＤＮＡの原液サンプルの場合である。
図１２に示したように、ＩＣＡＮおよびＰＣＲのいずれの反応においても、ＬＰＳおよびＩＦＮ−γで処理した細胞より調製したｃＤＮＡを鋳型にした場合のみ増幅産物が確認された。ＩＣＡＮ反応においては１０００倍希釈したｃＤＮＡまで増幅産物の増加が確認された。ＰＣＲ反応においては１００倍希釈したｃＤＮＡまで増幅産物の増加が確認された。
実施例１５
（１）λＤＮＡの塩基配列に従って、配列表の配列番号９０〜９１記載のオリゴヌクレオチドプライマー４とオリゴヌクレオチドプライマー５を合成した。オリゴヌクレオチドプライマー４はＧＣ含量７５％のセンス方向のプライマーであり、オリゴヌクレオチドプライマー５はＧＣ含量８０％のアンチセンス方向のプライマーである。
各１２０ｐｍｏｌの上記プライマー４と５に２μｌの０．０５％プロピレンジアミン溶液と、１０ｎｇの鋳型を含む全液量１０μｌの反応系で９８℃で２分間、熱変性させた後、氷中で急冷することによりプライマーを鋳型にアニールさせた。なお、この際の鋳型は、実施例２記載のＰＣＲ反応物（１００５ｂｐ）をＳｕｐｒｅｃ０２で精製したものを用いた。
（２）アニール後に各０．６２５ｍＭのｄＮＴＰ混合液、４２．５ｍＭ ビシン−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ８．３）、５．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ、１．２５％ＤＭＳＯ、０．５μｌのＴｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＲＮａｓｅＨＩＩ（０．５８μｇ／ｍｌ）及びＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを２．２Ｕ含む４０μｌを添加し、ＩＣＡＮ反応を６０℃、６５℃、７０℃で１時間行なった。このＩＣＡＮ反応後の反応液３μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動で確認した。その結果を図１３に示す。図１３は、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ ＲＮａｓｅＨＩＩを用いたＩＣＡＮ法の結果を示すものであり、レーン１は分子量マーカー（１００ｂｐ）、レーン２は反応温度６０℃、レーン３は反応温度６５℃、レーン４は反応温度７０℃の場合である。
図１３に示した様に、いずれの反応温度においても目的の増幅産物が確認できた。
実施例１６
（１）ＰＣＲ産物を鋳型にしたＩＣＡＮ法によるＤＮＡ断片の増幅（アルカリ変性）について検討した。１０ｆｇ〜１０ｐｇの鋳型１μｌと０．４Ｎ ＮａＯＨ １μｌを混合し、３７℃で５分間保温し鋳型の変性を行った。なお、この際の鋳型は、ｉＮＯＳ ｃＤＮＡを実施例１３記載のＰＣＲ増幅断片（７４１ｂｐ）をＳｕｐｒｅｃ０２（宝酒造社製）で精製したものを用いた。上記変性した各鋳型を０．４Ｎ ＨＣｌ １μｌにより中和し、続いてこれに前記各５０ｐｍｏｌのＮＳ１及びＮＳ２プライマーと、０．５ｍＭのｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、１．０％ＤＭＳＯ、０．０１５６μｇのＰｆｕ ＲＮａｓｅＨ、０．６６ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む全液量４７μｌの反応液を添加し、サーマルサイクラーで６０℃、１時間保温した。この反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図１４に示す。図１４は、アルカリ変性した鋳型を用いたＩＣＡＮ法の結果を示すものであり、レーン１は分子量マーカー（１００ｂｐ）、レーン２は鋳型１０ｆｇ、レーン３は鋳型１００ｆｇ、レーン４は鋳型１ｐｇ、レーン５は鋳型１０ｐｇの場合である。
図１４に示した様に、１ｐｇの鋳型量まで明らかな増幅産物の増加が確認できた。
実施例１７
（１）鋳型の変性を伴わないＩＣＡＮ法によるＤＮＡ断片の増幅について検討した。プライマーは、配列表の配列番号９２〜９３に示すＮＳ５及びＮＳ６プライマーを使用した。鋳型ＤＮＡは、実施例１３で調製したものを使用した。
鋳型１０ｆｇ〜１００ｐｇあるいは陰性対照の水、各５０ｐｍｏｌのＮＳ５およびＮＳ６プライマー、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、１．０％ＤＭＳＯ、０．０１５６μｇのＰｆｕ ＲＮａｓｅＨ、１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）を含む全液量５０μｌの反応液をサーマルサイクラーで６０℃、１時間保温した。反応終了後、この反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動により分析した。その電気泳動の結果を図１５に示す。図１５は、鋳型ＤＮＡ変性工程のない場合の本発明の増幅方法についての電気泳動の結果を示し、レーン１は１００ｂｐ ＤＮＡラダーマーカー、レーン２は陰性対照（水）の場合、レーン３は鋳型１０ｆｇの場合、レーン４は鋳型１００ｆｇの場合、レーン５は鋳型１ｐｇの場合、レーン６は鋳型１０ｐｇの場合、レーン７は鋳型１００ｐｇの場合である。
図１５に示したように、１ｐｇの鋳型量まで、目的の増幅産物が確認できた。
実施例１８
（１）ベクタープラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ ＤＮＡ（宝酒造社製）のパッケージング領域の塩基配列に従って、配列表の配列番号９４及び９５記載のｐＤＯＮ−ＡＩ−１、ｐＤＯＮ−ＡＩ−２プライマーをそれぞれ合成した。
（２）鋳型の変性を伴わないＩＣＡＮ法によるＤＮＡ断片の増幅
１０ｆｇ〜１ｎｇのＰＤＯＮ−ＡＩ ＤＮＡ １μｌあるいは陰性対照の水１μｌ、前記各５０ｐｍｏｌのプライマー、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、１．０％ＤＭＳＯ、参考例４で調製した０．０１５６μｇのＰｆｕ ＲＮａｓｅＨ、１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む全液量５０μｌの反応液をサーマルサイクラーで６０℃、１時間保温した。この反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図１６に示す。図１６は、環状２本鎖ＤＮＡを変性処理なしで鋳型とした場合の本発明の方法についての電気泳動の結果を示し、レーン１は１００ｂｐ ＤＮＡラダーマーカー、レーン２は陰性対照（水）、レーン３は鋳型１０ｆｇ、レーン４は鋳型１００ｆｇ、レーン５は鋳型１ｐｇ、レーン６は鋳型１０ｐｇ、レーン７は鋳型１００ｐｇ、レーン８は鋳型１ｎｇの場合である。
図１６に示すように、１０ｆｇの鋳型量まで目的とする増幅断片が得られることを確認した。
実施例１９
本発明の方法を利用したヒトパピローマウィルス１６型遺伝子の検出について検討した。鋳型として、ヒトパピローマウィルス１６型の感染している細胞であるＣａＳｋｉ ｃｅｌｌ（大日本製薬社製、ｃｅｌｌあたり５００コピーのヒトパピローマウィルス１６型を保有している）のＤＮＡを用いた。ＨＰＶ１６検出用プライマーとして、配列表の配列番号９６〜９７記載の塩基配列を有するＨＰＶ１６ Ｓ３プライマー及びＨＰＶ１６ Ａ２プライマーを使用した。該プライマー対で得られる増幅産物は、約１２０ｂｐである。反応は、以下のように行った。
上記鋳型ＤＮＡを１ｐｇ、３ｐｇ、３０ｐｇ、１００ｐｇ、３００ｐｇ、１ｎｇ、３ｎｇあるいは１０ｎｇ、各５０ｐｍｏｌのＨＰＶ１６ Ｓ３プライマー及びＨＰＶ１６ Ａ２プライマー、最終濃度０．０１％プロピレンジアミンを含む混合液１０μｌを調製した。この混合液をサーマルサイクラーパーソナルにて９８℃ ２分間、５５℃ １分間保温後、氷上に置いた。該混合液に、最終濃度２０ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、各５００μＭ ｄＮＴＰ混合液、３０Ｕ大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ、５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを添加し最終容量を５０μｌとした。この反応液を、あらかじめ５５℃に設定したサーマルサイクラーにセットし、６０分間反応させた。対照として、Ｈｕｍａｎ Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ Ｐｒｉｍｅｒｓ ＨＰＶｐ１６（ｆｏｒｗａｒｄ、ｒｅｖｅｒｓｅ）（宝酒造社製）を用い、マニュアルに記載の方法に従い、サーマルサイクラーパーソナルにてＰＣＲを行った。この際、予想される増幅産物は、１４０ｂｐである。
反応終了後、各反応液３μｌを４％ヌシーブ３：１アガロース電気泳動に供した。その結果を図１７Ａに示す。すなわち、図１７ＡはＩＣＡＮ法とＰＣＲ法を利用したＨＰＶ１６遺伝子の検出結果であり、レーンＭ１は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーンＭ２は分子量マーカー（５０−２０００ｂｐ）、レーン１は鋳型無し、レーン２は鋳型１ｐｇ、レーン３は鋳型３ｐｇ、レーン４は鋳型３０ｐｇ、レーン５は鋳型１００ｐｇ、レーン６は鋳型３００ｐｇ、レーン７は鋳型１ｎｇ，レーン８は鋳型３ｎｇ、レーン８は鋳型３ｎｇ、レーン９は鋳型１０ｎｇの場合である。
図１７Ａに示したように、ＩＣＡＮ反応では鋳型ＤＮＡ ３ｐｇを用いた反応まで、ＰＣＲ反応では鋳型ＤＮＡ１ｐｇの場合まで予想される増幅産物が得られることが確認できた。
さらに、これらの反応産物について、配列表の配列番号９８に記載の塩基配列で示されるオリゴヌクレオチドＨＰＶ１６プローブを用いてドットハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーションは、実施例９記載の条件で行った。その結果を図１７Ｂに示す。すなわち、図１７ＢはＰＣＲ法とＩＣＡＮ法でのＨＰＶ１６遺伝子のドットハイブリ検出の結果であり、レーン１は鋳型無し、レーン２は鋳型１ｐｇ、レーン３は鋳型３ｐｇ、レーン４は鋳型３０ｐｇ、レーン５は鋳型１００ｐｇ、レーン６は鋳型３００ｐｇ、レーン７は鋳型１ｎｇ，レーン８は鋳型３ｎｇ、レーン８は鋳型３ｎｇ、レーン９は鋳型１０ｎｇの場合である。
図１７Ｂに示したようにＩＣＡＮ法及びＰＣＲ法のいずれにおいても検出感度はほぼ同等であることから、ウィルス等の検出方法として有効であることが確認できた。
実施例２０
臨床検体ＤＮＡサンプルからのヒトパピローマウィルス１６型遺伝子検出について検討した。鋳型として、インフォームドコンセントの得られた臨床検体６検体から常法で調製されたＤＮＡを用いた。この臨床検体から調製されたサンプルは、ＰＣＲにより感染ＨＰＶのタイプが判明しているものである。検出用プライマーは、実施例１９記載のＨＰＶ１６ Ｓ３プライマー及びＨＰＶ１６ Ａ２プライマーを用いた。鋳型となる臨床検体からのＤＮＡサンプルはＴＥバッファーにより１μｌあたり１００ｎｇとなるように調製して使用した。鋳型量以外は、実施例１９記載の反応液組成及び反応条件で行った。さらに、ネガティブコントロールとして鋳型ＤＮＡを加えないもの、ポジティブコントロールとしてＨＰＶ１６の感染している細胞であるＣａＳｋｉ ｃｅｌｌ ＤＮＡ ５００ｐｇを用い、同様の反応を行った。反応終了後、各反応液３μｌを４％ヌシーブ３：１アガロース電気泳動に供した。その結果を図１８Ａに示す。すなわち、図１８Ａは臨床検体からのＨＰＶ１６遺伝子検出の結果であり、レーンＭは分子量マーカー、レーン１〜６は臨床検体、レーン７はネガティブコントロール、レーン８はポジティブコントロールの場合である。
図１８Ａに示したように、従来法のＰＣＲ法によりＨＰＶ１６型感染と判明しているサンプルにおいて、ＩＣＡＮ法でも約１２０ｂｐの増幅産物が認められ、その他の型のＨＰＶが感染しているサンプルおよび非感染サンプルでは増幅は認められなかった。
さらに、これらの増幅産物について、実施例９記載のドットハイブリを行った。その結果を図１８Ｂ及び表８に示す。すなわち、図１８Ｂは、臨床検体からのＨＰＶ１６遺伝子のドットハイブリ検出結果であり、レーン１〜６は臨床検体、レーン７はネガティブコントロール、レーン８はポジティブコントロールの場合である。
図１８に示したように電気泳動で得られた結果と同じ結果が得られ、電気泳動的にもドットハイブリ的にＰＣＲ法と同様の結果が得られることを確認した。すなわち、本発明の方法により、実際の臨床検体からＨＰＶ１６型を検出でき、ウィルス等の検出方法として有効であることを確認した。
Figure 0004128074
実施例２１
臨床検体からのＨＣＶの検出について検討した。検体試料は、インフォームドコンセントの得られたＨＣＶ患者の血清５検体各々３００μｌからトライゾール試薬（ライフテック社製）を使用して該試薬添付の説明書に従い調製し、最終的に注射用水（大塚製薬製）６μｌに溶かしＲＮＡサンプルとした。陰性コントロールとして健常者の血清３００μｌから同様に抽出したＲＮＡをおいた。先ず、ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（ＡＭＶ）ｖｅｒ２．１（宝酒造製）を用いて、逆転写反応液として１×ＲＮＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、１Ｕ ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＸＬ、配列表の配列番号９９〜１００に記載のＨＣＶ−Ｆプライマー及びＨＣＶ−Ｒプライマーを各１０ｐｍｏｌ及び各ＲＮＡサンプル２μｌを含む４μｌの反応液を調製し、３０℃、１０分間加温後、５０℃で３０分間反応させた。逆転写反応終了後、ＩＣＡＮ反応を行った。ＩＣＡＮ反応では、配列表の配列番号１０１〜１０２記載の塩基配列を有するＨＣＶ−Ｆ２プライマー及びＨＣＶ−Ｒ１プライマーを使用した。反応は以下のようにして行った。
上記プライマー各５０ｐｍｏｌ、各逆転写反応液３μｌ、最終濃度０．０１％プロピレンジアミンを含む全液量１０μｌの混合液を調製した。また、ブランクとして滅菌水３μｌを用いた。該混合液をサーマルサイクラーパーソナルで９８℃、２分間熱処理後、６０℃まで急冷し１分間保持後、氷上に保存した。
アニーリング処理後、上記混合液に最終濃度が２０ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、各５００μＭ ｄＮＴＰｓ、３０Ｕの大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ及び５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを添加し滅菌水で最終容量を５０μｌにした。該反応液をあらかじめ、６０℃に設定したサーマルサイクラーＭＰにセットし６０分間反応させた。反応終了後、各反応液３μｌを３％ヌシーブ３：１アガロース電気泳動に供した。その結果を図１９Ａに示す。すなわち、図１９Ａは、臨床検体からのＨＣＶ検出の結果を示すものであり、レーンＢは滅菌水を鋳型にした場合、レーン１は健常人試料、レーン２〜６はＨＣＶ患者試料、レーンＭは分子量マーカー（５０〜２０００ｂｐ）である。
図１９Ａに示したように、ＨＣＶ患者由来のＲＮＡサンプルのみ、ＨＣＶゲノムの塩基配列から予想される約１０７ｂｐの増幅産物が得られ、健常人由来の血清及びブランクは、上記増幅産物は得られなかった。さらに実施例９記載の条件で、配列表の配列番号１０３記載の５’末端をビオチン化したＨＣＶプローブを使用して、ＩＣＡＮ増幅産物についてドットハイブリダイゼーションを行った。その結果を図１９Ｂに示す。図１９Ｂにおいて、各レーンのサンプルは、電気泳動の場合と同じである。
図１９に示したように、電気泳動結果とドットハイブリ結果とは一致することが確認できた。このことから、本発明の方法により実際の臨床検体からＨＣＶを検出することができ、ウイルス等の検出方法として有効であることが確認できた。
実施例２２
アデノウイルスの検出方法について検討した。
ジーンバンク登録番号（ＡＣＣ Ｎｏ．ＪＯ１９１７）記載のアデノウイルスの塩基配列に従って、配列表の配列番号１０４〜１０６記載のＥ１Ａ（腫瘍遺伝子）増幅用プライマーＥ１Ａ−１（センス方向）、Ｅ１Ａ−２（アンチセンス方向）、Ｅ１Ａ−３（アンチセンス方向）を構築した。アデノウイルスは、ＡＴＣＣ登録番号ＶＲ−５を使用した。鋳型は、以下のように調製した。８．７３×１０１０ＰＦＵ／ｍｌのアデノウイルス溶液１００μｌを終濃度０．１％ＳＤＳ−０．２ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ溶液で３７℃、１時間インキュベートし、その後シリカゲルによりＤＮＡを吸着させ、精製した。これを滅菌水にて希釈し、１０３、１０４、１０５、１０６ＰＦＵに相当するアデノウイルスＤＮＡを調製したものを使用した。反応は、以下のようにして行った。すなわち、各６０ｐｍｏｌのＥ１Ａ−１プライマー及びＥ１Ａ−２プライマー（増幅鎖長１１２ｂｐ）あるいはＥ１Ａ−１プライマー及びＥ１Ａ−３プライマー（増幅鎖長９１ｂｐ）の組み合わせに、２μｌの０．０５％プロピレンジアミンと鋳型を含む全液量１０μｌの反応系で９８℃で２分間、熱変性させた後、氷中で急冷することによりプライマーを鋳型にアニールさせた。
アニーリング処理後に各０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、４２．５ｍＭ トリシン−水酸化カリウム（ｐＨ８．５）緩衝液、５．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ、１．２５％ＤＭＳＯ、３０Ｕの大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ及び５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む４０μｌを添加し、最終容量を５０μｌにした。該反応液を６０℃で１時間保持した。また対照として、上記と同じ鋳型と配列表の配列番号１０７〜１０８及び１４２記載の塩基配列を有するＥ１Ａ（腫瘍遺伝子）ＰＣＲ増幅用プライマーＥ１Ａ−１Ｐ（センス方向）、Ｅ１Ａ−２Ｐ（アンチセンス方向）、Ｅ１Ａ−３Ｐ（アンチセンス方向）を構築した。プライマーを用いて、ＰＣＲによる検出を行なった。ＰＣＲは以下のようにして行った。すなわち、各６０ｐｍｏｌのＥ１Ａ−１Ｐプライマー及びＥ１Ａ−２Ｐプライマー（増幅鎖長１１２ｂｐ）あるいはＥ１Ａ−１Ｐプライマー及びＥ１Ａ−３Ｐプライマー（増幅鎖長９１ｂｐ）の組み合わせに、１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー（宝酒造社製）５μｌ、１．２５ＵのタカラＥｘ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓを含む全量５０μｌのＰＣＲ溶液を調製した。ＰＣＲ条件は９４℃、３０秒、５５℃、３０秒、７２℃、３０秒を１サイクルとした３０サイクルで行なった。
反応終了後、ＩＣＡＮ法、ＰＣＲ法の両反応液３μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図２０及び表９に示す。すなわち、図２０は、アデノウイルス粒子からのウイルスＥ１Ａ遺伝子の検出結果を示すものであり、レーン１〜レーン１０までがプライマーＥ１Ａ−１及びＥ１Ａ−２の組み合わせに関する結果であり、レーン１１〜２０までがプライマーＥ１Ａ−１及びＥ１Ａ−３の組み合わせに関する結果である。レーン１は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン２はＩＣＡＮ法で１０６（ＰＦＵ相当ＤＮＡ）、レーン３はＩＣＡＮ法で１０５、レーン４はＩＣＡＮ法で１０４、レーン５はＩＣＡＮ法で１０３、レーン６は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン７はＰＣＲ法で１０６（ＰＦＵ相当ＤＮＡ）、レーン８はＰＣＲ法で１０５、レーン９はＰＣＲ法で１０４、レーン１０はＰＣＲ法で１０３の場合である。さらに、レーン１１は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン１２はＩＣＡＮ法で１０６（ＰＦＵ相当ＤＮＡ）、レーン１３はＩＣＡＮ法で１０５、レーン１４はＩＣＡＮ法で１０４、レーン１５はＩＣＡＮ法で１０３、レーン１６は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン１７はＰＣＲ法で１０６（ＰＦＵ相当ＤＮＡ）、レーン１８はＰＣＲ法で１０５、レーン１９はＰＣＲ法で１０４、レーン２０はＰＣＲ法で１０３の場合である。
Figure 0004128074
図２０及び表９に示すようにアデノウイルスＥ１Ａ遺伝子の検出においてＩＣＡＮ法はＰＣＲ法と同等の検出感度であることを確認した。
実施例２３
レトロウイルスベクター感染細胞からの組み込みウイルス遺伝子の検出について検討した。レトロウイルス感染細胞の調製およびゲノムＤＮＡ調製法は以下のようにして行った。すなわち、ベクタープラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ（宝酒造社）をパッケージング細胞ＧＰＥ＋８６にリン酸カルシウム法にて導入し、導入細胞の培養上清からエコトロピックベクターを調製した。ＮＩＨ／３Ｔ３細胞に、エコトロピックベクターを感染させ、Ｇ４１８を含む培地で１４日間培養することによりウイルスベクター感染細胞を調製した。調製したレトロウイルス感染細胞４×１０４個より常法によりレトロウイルス感染細胞のゲノムＤＮＡ ２７μｇを得た。また、プライマーは、実施例１８（１）記載のプライマーｐＤＯＮ−ＡＩ−１及びｐＤＯＮ−ＡＩ−２を用いた。反応は以下のようにして行った。すなわち、前記各６０ｐｍｏｌのプライマー、２μｌの０．２５％プロピレンジアミン水溶液、上記鋳型ゲノムＤＮＡ１０００ｎｇ〜０．１ｎｇを含む全液量１０μｌの反応系でサーマルサイクラー（宝酒造社製）で９８℃で２分間の後、６０℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。
上記アニーリング処理後の各溶液に０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、４０ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１２５ｍＭ 酢酸カリウム、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ、１．２５％ＤＭＳＯ、３０Ｕの大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ及び、５．５ＵのＢｃａＢｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを含む全液量４０μｌの反応液を添加し、最終容量を５０μｌにした。該反応液をサーマルサイクラーで６０℃で１時間保持した。反応終了後、該反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。さらにＩＣＡＮ法とＰＣＲ法によるＤＮＡの検出感度を比較するために、配列表の配列番号１１１〜１１２記載のｐＤＯＮ−ＡＩ−３及びｐＤＯＮ−ＡＩ−４プライマーを使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲは、上記鋳型１００ｎｇ〜０．１ｎｇ、上記各プライマー６０ｐｍｏｌ、１０×ＥｘＴａｑバッファー５μｌ、１．２５ＵのタカラＥｘタックポリメラーゼ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓを含む全量５０μｌの反応液を調製し、サーマルサイクラーパーソナルを用い、９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒を１サイクルとした反応を３５サイクル行った。反応終了後、該反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図２１に示す。すなわち、図２１は、ＩＣＡＮ法及びＰＣＲ法でのレトロウイルスベクター感染細胞からの組み込みウイルス遺伝子の検出結果を示すものであり、レーン１は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン２は鋳型１０００ｎｇ、レーン３は鋳型１００ｎｇ、レーン４は鋳型１０ｎｇ、レーン５は鋳型１ｎｇ、レーン６は鋳型０．１ｎｇの場合である。
図２１に示したようにＩＣＡＮ法では、鋳型ＤＮＡが１ｎｇまで、ＰＣＲ法では３５サイクルで鋳型１ｎｇまで目的の増幅産物を確認できた。
実施例２４
大腸菌Ｏ−１５７ ベロ毒素Ｉ型遺伝子の検出について、本発明の増幅方法とハイブリダイゼーション法との組み合わせによる標的核酸の検出方法を検討した。ターゲットとして、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７ ベロ毒素Ｉ型遺伝子を選択した。鋳型ＤＮＡは、実施例８（１）記載の方法で調製した。増幅領域は、ＧＣ含量約４０％で約８０ｂｐの領域を選び、プライマーとして配列表の配列番号１１３及び１１４記載の塩基配列で示されるＶＴ１−ＩＦ４及びＶＴ１−ＩＲ１プライマーを使用した。反応は、以下のように行った。すなわち、各６０ｐｍｏｌのＶＴ１−ＩＦ４及びＶＴ１−ＩＲ１プライマー、最終濃度０．０１％プロピレンジアミン、０〜１０５セル相当の各細胞数熱抽出液及び滅菌水で全液量５μｌの混合液を調製した。該混合液をサーマルサイクラーパーソナルにて９８℃２分間、熱変性後、５５℃まで急冷し、１分間保持後、さらに氷上に置き、アニーリング処理を行った。
アニーリング処理後、上記混合液に最終濃度２０ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、各５００μＭ ｄＮＴＰｓ、１５Ｕの大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ及び２．７５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡ ポリメラーゼを添加し、滅菌水で最終容量を２５μｌにした。該反応液は、あらかじめ５５℃に設定したサーマルサイクラーパーソナルにセットし６０分間保持した。対照として上記熱抽出液についてＯ−１５７ Ｔｙｐｉｎｇ Ｓｅｔ（宝酒造製）を用い、マニュアル通りにサーマルサイクラーパーソナルにてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９４℃ １分、５５℃ １分、７２℃ １分を１サイクルとする３５サイクルで行った。該反応での所要時間は、約１４５分になる。この際、予想される増幅産物は、３４９ｂｐである。反応終了後、各反応液３μｌを３％ヌシーブ３：１アガロース電気泳動に供した。ＩＣＡＮ法の結果を図２２に示した。図２２は、Ｏ−１５７ベロ毒素Ｉ型遺伝子の検出結果であり、レーンＭは分子量マーカー（５０−２０００ｂｐ）、レーンＮは、滅菌水を鋳型にした場合、レーン１は１セル相当の鋳型、レーン２は１０セル相当の鋳型、レーン３は１０２セル相当の鋳型、レーン４は１０３セル相当の鋳型の場合である。さらに、ＩＣＡＮ法とＰＣＲ法の検出結果について表１０に示す。
Figure 0004128074
表１０に示したように、ＩＣＡＮ法もＰＣＲ法も予想される増幅産物を１細胞相当量の熱抽出液を用いた反応系まで得ることができた。さらに、増幅産物については、配列表の配列番号１１５に記載の塩基配列で示される５’末端がビオチン標識されたＶＴ１ オリゴヌクレオチドプローブを用いてドットハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイズは実施例１９記載の条件で行った。その結果は、上記電気泳動結果と同一であった。すなわち、ＩＣＡＮ法とＰＣＲ法の検出感度は同等であることが確認できた。さらに増幅反応の全所要時間を比較するとＰＣＲに対し本発明のＩＣＡＮ法は１／２以下の時間で行うことができ、病原菌などの検出方法として有効であることを確認した。
実施例２５
ボツリヌスＡ型毒素遺伝子の検出方法について検討した。鋳型は、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、食中毒事例株、ｔｙｐｅＡ−１９０）より調製したＤＮＡを用いた。該菌株は女子栄養大学・衛生学教室保存菌株である。検出用プライマーとして、配列表の配列番号１１６〜１１７記載の塩基配列で示されるＢｏｔＡ Ｓ２プライマー）及びＢｏｔＡ Ａ２プライマーを合成した。該プライマー対で約１５０ｂｐの増幅産物が得られる。鋳型となる上記Ａ型毒素産生ボツリヌス菌ＤＮＡは、滅菌水にて１μｌあたり１００ｆｇ、１ｐｇ、１０ｐｇ、１００ｐｇとなるように調製した。反応は以下のようにして行った。
各５０ｐｍｏｌの上記プライマー、最終濃度０．０１％プロピレンジアミン、上記鋳型ＤＮＡ溶液各１μｌを添加し、容量１０μｌの混合液を調製した。該混合液を実施例１９記載の反応液組成及び反応条件でＩＣＡＮ反応を行った。対照として、ボツリヌスＡ型毒素遺伝子検出用プライマーセット ＢＡＳ−１ ａｎｄ ＢＡＳ−２（宝酒造社製）を用い、マニュアルに記載の方法に従い、サーマルサイクラーパーソナルにてＰＣＲを行った。この際、予想される増幅産物は、２８４ｂｐである。
反応終了後、各反応液３μｌを４％ヌシーブ３：１アガロース電気泳動に供した。その結果を図２３Ａに示す。すなわち、図２３Ａは、ＩＣＡＮ法及びＰＣＲ法でのボツリヌスＡ型毒素遺伝子の検出結果を示すものであり、レーンＭ１は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーンＭ２は分子量マーカー（５０〜２０００ｂｐマーカー）、レーン１は鋳型なし、レーン２は鋳型１００ｆｇ、レーン３は鋳型１０ｐｇ、レーン４は鋳型１００ｐｇの場合である。
図２３Ａに示すように、ＩＣＡＮ法では鋳型ＤＮＡ １００ｆｇを用いた反応まで、予想される増幅産物が得られたが、ＰＣＲ法では鋳型ＤＮＡ １００ｆｇを用いた反応では予想される増幅産物が得られなかった。さらに、これらの反応産物について、配列表の配列番号１１８に記載の塩基配列で示されるＢｏｔＡプローブを用いてドットハイブリダイゼーションを行った。ドットハイブリは、実施例９記載の条件と同様にして行った。その結果を図２３Ｂに示す。図２３Ｂに示したように、ＩＣＡＮ反応では鋳型１００ｆｇまで、ＰＣＲ反応では鋳型１０ｐｇまでシグナルが確認でき、上記電気泳動結果と一致することが確認できた。
実施例２６
菊ウイロイドの検出について検討した。特開平９−１４０３８３号公報 実施例１に記載の、キクわい化ウイロイド（ＣＳＶｄ）感染キクからの低分子ＲＮＡの抽出法に従って得た低分子ＲＮＡの１０倍希釈系列を調製した。逆転写反応は、ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（ＡＭＶ）ｖｅｒ２．１（宝酒造社製）を用いて行った。すなわち、逆転写反応液として、１×ＲＮＡ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２０ＵのＲＮａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，５Ｕ ＡＭＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅＸＬ、５０ｐｍｏｌ Ｒａｎｄｏｍ ９ｍｅｒｓ、各希釈系列ＲＮＡ溶液１μｌを用いて２０μｌの反応液を調製し、３０℃ １０分間加温後、５５℃ ３０分間反応させた。反応終了後、９９℃ ５分間熱処理により逆転写酵素を失活させ、冷却後、ＩＣＡＮ反応を行った。ＩＣＡＮ反応液５０μｌの反応系に対して上記逆転写反応液１μｌを鋳型として用いた。本実施例においてプライマーは、配列表の配列番号１１９及び１２０記載の塩基配列を有するＣＳＶＤ−Ｆ４プライマーとＣＳＶＤ−Ｒ３プライマーを使用した。反応は、反応温度を６０℃、サーマルサイクラーＭＰを使用する以外は、実施例１９記載の反応条件と同じにした。反応終了後、各反応液３μｌを３％ヌシーブ３：１アガロース電気泳動に供した。
一方、同じ逆転写反応液１μｌを鋳型として用いて５０μｌの反応系でＰＣＲ増幅を行った。このとき使用したプライマーは配列表の配列番号１０９及び１１０記載のＦ９４とＲ２６４プライマーを使用した。反応は以下のように行った。すなわち、ＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔを使用し、プロトコールに従い、反応液を調製し、上記プライマー各１０ｐｍｏｌ用いて、各逆転写反応液１μｌを添加して全量５０μｌにし、サーマルサイクラーＭＰにより増幅反応をおこなった。反応条件は、９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒を１サイクルとし３０サイクルをおこなった。反応終了後、各反応液５μｌを３％ヌシーブ３：１アガロース電気泳動に供した。その結果を表１１に示す。
Figure 0004128074
表１１に示したように、ＩＣＡＮ法では１０３倍に希釈したＲＮＡサンプルを鋳型に用いた反応まで、ＰＣＲ法では１０２倍に希釈したＲＮＡサンプルを鋳型に用いた反応まで増幅産物が得られた。
さらにＩＣＡＮ増幅産物とＰＣＲ増幅産物についてドットハイブリダイゼーションにより目的の産物であることを確認した。配列表の配列番号１２１記載の塩基配列で示される５’末端にビオチン標識されたＣＳＶｄプローブを用いてドットハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイズの方法は実施例９に記載の条件に従った。その結果は、上記電気泳動結果と一致しており、ＩＣＡＮでは１０３倍希釈のＲＮＡサンプルまでシグナルが得られ、ＰＣＲでは１０２倍希釈のＲＮＡサンプルまでシグナルが得られた。ＰＣＲに比べてＩＣＡＮの方が感度がよいことが示された。
実施例２７
Ｐｆｕ ＲＮａｓｅＨを用いたキクわい化ウイロイド（ＣＳＶｄ）感染キクからのウイロイド遺伝子の検出について検討した。実施例２６で調製したＲＮＡの１０倍希釈液３μｌと１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ塩化カリウム、５ｍＭ 塩化マグネシウム、１ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、１５０ｐｍｏｌのＲａｎｄｏｍ ６ｍｅｒｓ、６０ＵのＲｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（宝酒造社製）、１５ＵのＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（ＡＭＶ）（宝酒造社製）を含む全液量６０μｌをサーマルサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ９６００，アプライドバイオシステムズ社製）を用いて、３０℃で１０分間、続いて４２℃で１時間保温した後、酵素を失活させるために９９℃で５分間加熱してｃＤＮＡを調製した。次に、ウイロイドのｍＲＮＡの塩基配列に従って、配列表の配列番号１２２〜１２５記載のプライマーＶｄ１、Ｖｄ２、Ｖｄ３、Ｖｄ４を合成した。
各５０ｐｍｏｌの上記プライマーＶｄ１、Ｖｄ２と鋳型として上記により合成したｃＤＮＡ溶液１μｌあるいは水により１０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍希釈したもの１μｌ、または陰性対照として水１μｌと０．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、１％ＤＭＳＯ、０．０１５６μｇのＰｆｕ ＲＮａｓｅＨ、１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む全液量５０μｌをサーマルサイクラーで５７℃、１時間保温した。反応後のサンプルは分析するまで−２０℃で凍結して保存した。
対照としてＰＣＲを行った。すなわち、各５０ｐｍｏｌのプライマーＶｄ３、Ｖｄ４と上記ｃＤＮＡ 溶液１μｌあるいは水により１０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍希釈したもの１μｌまたは陰性対照として水１μｌと１０×Ｅｘ Ｔａｑバッファー ５μｌ、１．２５Ｕのタカラ Ｅｘタック ポリメラーゼ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰ混合液を含む全液量５０μｌの反応系でサーマルサイクラーを用い、９４℃ ２分間を１サイクル、９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒を１サイクルとする３５サイクル、７２℃ ５分間を１サイクルのプログラムで反応を行った。反応後のサンプルは分析するまで−２０℃で凍結して保存した。
上記ＩＣＡＮ反応液およびＰＣＲ反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図２４に示す。すなわち、図２４はＰｆｕ ＲＮａｓｅＨを使用したＩＣＡＮ法及びＰＣＲ法でのウイロイドの検出結果を示すものであり、レーン１は１００ｂｐ ＤＮＡラダーマーカー、レーン２は陰性対照、レーン３はｃＤＮＡの１００００倍希釈サンプル、レーン４はｃＤＮＡの１０００倍希釈サンプル、レーン５はｃＤＮＡの１００倍希釈サンプル、レーン６はｃＤＮＡの１０倍希釈サンプル、レーン７はｃＤＮＡの原液サンプルの場合である。
図２４に示したようにＩＣＡＮおよびＰＣＲのいずれの反応においても、１００倍希釈したｃＤＮＡまで目的の増幅産物を確認することができた。
実施例２８
Ｋ−ｒａｓ遺伝子の検出について検討した。
（１）ゲノムＤＮＡからの検出
ヒトｃ−Ｋｉ−ｒａｓの塩基配列に従って、配列表の配列番号１２６及び１２７記載のｃ−Ｋｉ−ｒａｓ−１及びｃ−Ｋｉ−ｒａｓ−２プライマーを構築した。
前記各６０ｐｍｏｌのプライマー、２μｌの０．２５％プロピレンジアミン水溶液、ヒトゲノムＤＮＡ（クロンテック社製）１００ｎｇ〜１ｎｇの鋳型を含む全液量１０μｌの混合液を調製した。該混合液をサーマルサイクラーパーソナルで９８℃で２分間処理後、５３℃の加熱処理により鋳型にプライマーをアニーリングさせた。
上記アニーリング処理をした各溶液に０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、４０ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、１２５ｍＭ 酢酸カリウム、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１２５％ＢＳＡ、１．２５％ＤＭＳＯ、３０Ｕの大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ及び５．５ＵのＢｃａＢｅｓｔ ＤＮＡポリメラーゼを含む全液量４０μｌの反応液を添加し、最終容量を５０μｌにした。該反応液を５３℃で１時間保持した。反応終了後、該反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。
一方、対照としてＰＣＲを行った。プライマーは、配列表の配列番号１２８及び１２９記載のｃ−Ｋｉ−ｒａｓ−３、ｃ−Ｋｉ−ｒａｓ−４プライマーを使用した。上記プライマー６０ｐｍｏｌ、上記鋳型１００ｎｇ〜０．１ｎｇ、１０×Ｅｘタックバッファー５μｌ、１．２５Ｕのタカラ Ｅｘタック ポリメラーゼ、０．２ｍＭ ｄＮＴＰを含む全量５０μｌの溶液を調製し、サーマルサイクラーパーソナルを用い、９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ ３０秒を１サイクルとする３０または３５サイクルの反応を行った。反応終了後、該反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図２５に示す。すなわち、図２５はＩＣＡＮ法及びＰＣＲ法でのヒトゲノムＤＮＡからのｃ−Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子の検出結果を示すものであり、ＩＣＡＮ法では、レーン１は分子量マーカー、レーン２は鋳型１００ｎｇ、レーン３は鋳型１０ｎｇ、レーン４は鋳型１ｎｇ、レーン５は鋳型なしの場合である。ＰＣＲ法では、レーン１は鋳型１００ｎｇ、レーン２は鋳型１０ｎｇ、レーン３は鋳型１ｎｇ、レーン４は鋳型なしの場合である。
図２５に示したようにＩＣＡＮ法では、鋳型１ｎｇまで、ＰＣＲ法では、３０サイクルで鋳型１０ｎｇまで、目的の増幅産物が確認できた。さらに、鋳型が１ｎｇから１００ｎｇの場合のＩＣＡＮ法とＰＣＲ法での増幅産物量の比較結果を図３０に示す。図中、斜線を付した棒は３０サイクルのＰＣＲ法の、点を付した棒は３５サイクルのＰＣＲ法の、黒棒はＩＣＡＮ法の結果をそれぞれ示す。図３０に示したように、ＩＣＡＮ法がＰＣＲ法に比較して、増幅産物量が多いことが確認できた。
（２）血液サンプルからの検出
抗凝固剤として、クエン酸ナトリウムおよびヘパリンを用いて健常人から採血した血液サンプルそれぞれ１００μｌよりＧｅｎとるくんＴＭ（血液用）（宝酒造社製）を用いてゲノムＤＮＡを調製してきた。調製した血液換算で５μｌ〜０．０４μｌのＤＮＡよりＩＣＡＮ反応により上記（１）と同様の条件でｃ−Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子の検出を行った。さらに、ＩＣＡＮ反応とＰＣＲ反応によるＤＮＡの検出感度を比較するために、上記（１）と同様の条件で上記血液サンプル由来ＤＮＡ ５μｌ〜０．０４μｌからの検出を行った。その結果を図２６に示す。すなわち、図２６は、ＩＣＡＮ法及びＰＣＲ法での血液サンプルからのｃ−Ｋｉ−ｒａｓ遺伝子の検出結果であり、ＩＣＡＮ法では、レーン１は分子量マーカー、レーン２はクエン酸血５μｌ、レーン３はクエン酸血１μｌ、レーン４はクエン酸血０．２μｌ、レーン５はクエン酸血０．０４μｌ、レーン６はヘパリン血５μｌ、レーン７はヘパリン血１μｌ、レーン８はヘパリン血０．２μｌ、レーン９はヘパリン血０．０４μｌの場合である。また、ＰＣＲ法では、レーン１は分子量マーカー、レーン２はクエン酸血５μｌで３０サイクル、レーン３はクエン酸血１μｌで３０サイクル、レーン４はクエン酸血０．２μｌで３０サイクル、レーン５はクエン酸血０．０４μｌで３０サイクル、レーン６はクエン酸血５μｌで３５サイクル、レーン７はクエン酸血１μｌで３５サイクル、レーン８はクエン酸血０．２μｌで３５サイクル、レーン９はクエン酸血０．０４μｌで３５サイクル、レーン１０はヘパリン血５μｌで３０サイクル、レーン１１はヘパリン血１μｌで３０サイクル、レーン１２はヘパリン０．２μｌで３０サイクル、レーン１３はヘパリン０．０４μｌで３０サイクル、レーン１４はヘパリン血５μｌで３５サイクル、レーン１５はヘパリン血１μｌで３５サイクル、レーン１６はヘパリン０．２μｌで３５サイクル、レーン１７はヘパリン０．０４μｌで３５サイクルの場合である。
図２６に示したように、ＩＣＡＮ法では、いずれの血液サンプルからも血液換算で０．２μｌ相当のゲノムＤＮＡまで、ＰＣＲ法では、クエン酸血については、３０サイクルで０．２μｌ、ヘパリン血についても３０サイクルで０．２μｌ相当まで目的の増幅産物が確認できた。
実施例２９
Ｂｃａ ＲＮａｓｅＨＩＩＩを用いた大腸菌Ｏ−１５７ベロ毒素２型（ＶＴ−２）遺伝子の検出について検討した。腸管出血性大腸菌であるＯ−１５７をノボビオシン加ｍＥＣ培地において４２℃、１８時間培養後、９５℃、１０分間熱処理を行った。これを滅菌水にて０、１、１０、１０２、１０３相当細胞数液に調製し、鋳型として使用した。検出用プライマーとして、配列表の配列番号１３０〜１３１記載の塩基配列で示されるＶＴ−２ ＩＦ４プライマー及びＶＴ−２ ＩＲ３プライマ）を合成した。該プライマー対で得られる増幅産物は約１４６ｂｐである。反応は以下のようにして行った。すなわち、各５０ｐｍｏｌの上記プライマー、最終濃度０．０１％プロピレンジアミン、上記各細胞数熱抽出液を添加し、１０μｌに調製した。この混合液をサーマルサイクラーパーソナルにて９８℃ ２分間熱処理、５５℃ １分間保温後、氷上に置いた。該混合液に、最終濃度３４ｍＭ トリシンバッファー（ｐＨ８．７）、１０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ 硫酸アンモニウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、各５００μＭ ｄＮＴＰｓ、参考例３（５）にて調製したＢｃａ ＲＮａｓｅＨＩＩＩ ３２Ｕ、５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを添加し最終容量を５０μｌにした。この反応液を、あらかじめ５５℃に設定したサーマルサイクラーにセットし、６０分間反応させた。反応終了後、各反応液３μｌを４％ヌシーブ３：１アガロース電気泳動に供した。その結果を図２７に示す。すなわち、図２７は、Ｂｃａ ＲＮａｓｅＨＩＩＩを用いた大腸菌Ｏ−１５７ベロ毒素ＩＩ型（ＶＴ２）遺伝子の検出結果を示すものであり、レーンＭは分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーンＮは滅菌水を鋳型とした場合、レーン１は１セル相当、レーン２は１０セル相当、レーン３は１０２セル相当、レーン４は１０３相当の鋳型の場合である。
図２７に示すように、ＩＣＡＮ法で１セル相当の熱抽出物からもＶＴ２遺伝子を検出することができた。この結果は、実施例９で示される大腸菌ＲＮａｓｅＨを使用した場合のＩＣＡＮ法およびＰＣＲによる検出反応と同等の結果であり、耐熱性のＲＮａｓｅＨであるＢｃａ ＲＮａｓｅＨＩＩＩを使用したＩＣＡＮ法もまた、ウィルス、細菌等の検出方法として有効であることが確認できた。
実施例３０
黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＡ遺伝子の検出について検討した。まず、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＡ遺伝子領域の塩基配列に従って、配列表の配列番号１３６及び１３７のプライマーＳＥＡ−１、ＳＥＡ−２をそれぞれ合成した。次に１１５ｐｇ、１．１５ｎｇのＡＴＣＣ登録番号１３５６５の黄色ブドウ球菌由来ゲノムＤＮＡ１μｌあるいは陰性対照の水１μｌと、これに前記各５０ｐｍｏｌの上記プライマー、０．５ｍＭ ｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、１．０％ＤＭＳＯ、０．０１５６μｇのＰｆｕ ＲＮａｓｅＨ、１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む全液量５０μｌの反応液をサーマルサイクラーで５８℃、１時間保温した。反応終了後、該反応液５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動により分析した。その結果を図２９に示す。図２９は、黄色ブドウ球菌エンテロトキシンＡ遺伝子検出の電気泳動結果であり、レーン１は分子量マーカー（１００ｂｐラダー）、レーン２は陰性対照（滅菌水）、レーン３は鋳型１１５ｐｇ、レーン４は鋳型１．１５ｎｇの場合である。
図２９に示したように、鋳型が約１．１５ｎｇの場合まで目的の増幅産物の増加が確認できた。
実施例３１
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ：Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ）の検出について検討した。まずＨＣＶの塩基配列に従って、配列表の配列番号１３８及び１３９記載の塩基配列を有するプライマーＨＣＶ−Ｆ３、ＨＣＶ−Ｒ１をそれぞれ合成した。次に鋳型ＤＮＡは以下のように調製した。すなわち、健常人およびＨＣＶ患者の血清１００μｌより実施例２１と同様の方法で調製したＲＮＡ、１０ｍＭ トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．３）、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ｄＮＴＰ、１０ｐｍｏｌのランダム６ｍｅｒｓプライマー、１０ＵのＲｅｖｅｒｓ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＸＬ（宝酒造社製）を含む全量４μｌをサーマルサイクラー（Ｇｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９６００、アプライドバイオシステムズ社製）を用いて３０℃で１０分間、続いて４２℃で１時間保温した後、酵素を失活させるために９９℃で５分間加熱してｃＤＮＡを調製した。
上記ｃＤＮＡ反応溶液１μｌと上記各１００ｐｍｏｌのＨＣＶ−Ｆ３及びＨＣＶ−Ｒ１プライマーを用いる以外は、実施例１３と同様の条件下でＩＣＡＮ反応を５５℃、１時間行った。反応終了後、該反応液２．５μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図３１に示す。図３１は、Ｃ型肝炎ウイルス検出の電気泳動結果であり、レーン１は分子量マーカー（１００ｂｐ）、レーン２は健常人、レーン３〜レーン６はＨＣＶ感染患者のそれぞれの血清より調製した鋳型を用いた場合である。
図３１に示したようにＨＣＶ感染患者の血清サンプルから特異的にＨＣＶを検出できることが確認できた。
実施例３２
本発明の増幅方法について検討した。
（１）実施例２（２）で調製したｐＵＣ１９−１５０プラスミドＤＮＡを鋳型にし、配列表の配列番号３５及び３６記載のＭＣＳ−Ｆ、ＭＣＳ−Ｒプライマーを用いてＰＣＲを行った後、マイクロコン−１００（ミリポア社製）で精製し、５３４ｂｐのＰＣＲ増幅断片を得た。上記ＰＣＲ断片１５ｎｇに３０ｐｍｏｌの５’末端を［γ−３２Ｐ］ＡＴＰでリン酸化ラベルした配列表の配列番号１４０記載の塩基配列を有するＭＦ２プライマー及び滅菌蒸留水で５μｌとした反応液、さらに配列表の配列番号１４１記載の塩基配列を有するＭＲ１プライマー３０ｐｍｏｌを加えた反応液を用意した。これらの反応液を９８℃、２分間熱変性後、５５℃まで冷却した後、１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液（４２．５ｍＭ トリシン緩衝液（ｐＨ８．７）、１２．５ｍＭ 塩化カリウム、１２．５ｍＭ 硫酸アンモニウム、０．０１２５％ＢＳＡ、１．２５％ＤＭＳＯ、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、各０．６２５ｍＭｄＮＴＰ）２０μｌを添加し５５℃で１５分間反応した。反応終了後、５μｌの反応液に２．５μｌの反応停止液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノルブルー、０．５％キシレンシアノール）を加えて、９４℃、３分間の熱変性を行った。この反応液１．６μｌを８Ｍ 尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した後、ＢＡＳ２０００（フジックス）でシグナルを読みとり、ＭＲ１プライマーからの伸長産物を検出した。その結果を図３２Ａに示す。図３２Ａ中のシークエンスラダーは［γ−３２Ｐ］ＡＴＰでリン酸化ラベルしたＭＦ２プライマーを用いてＭ１３ｍｐ１８ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡ（宝酒造社製）を配列決定したものであり、伸長産物の長さを決定するのに使用した。さらに、レーン１はＭＦ２及びＭＲ１プライマーの組み合わせ、レーン２はＭＲ１を用いた場合である。
図３２Ａに示したように上記鋳型にＭＲ１プライマーのみを加えて伸長反応した場合はＭＲ１プライマーより鋳型の末端まで伸長した４４８ｂｐのバンドが検出されたが、さらにＭＦ２プライマーを加えることにより、上記のバンドに加えて、ＭＲ１プライマーとＭＦ２プライマーに挟まれた３７３ｂｐのバンドが検出された。従って、最初、ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼにより、ＰＣＲ増幅断片を鋳型にしてＭＲ１プライマーより伸長していたものが、途中、鋳型交換により、ＭＦ２プライマーからの伸長鎖を鋳型として伸長したことが確認できた。さらに、鎖置換活性を有する常温菌由来のＤＮＡポリメラーゼとしてクレノウ ＤＮＡポリメラーゼを用いた場合について、上記と同様の条件で検討を行ったところ、鋳型交換が起こっていることが確認できた。一方、鎖置換活性を有さないタカラ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）やＰｙｒｏＢＥＳＴ ＤＮＡ ポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いた場合には鋳型交換は確認できなかった。
（２）上記鋳型交換反応に、プライマーがアニーリングしている鋳型ＤＮＡ鎖について検討した。最初にＭＦ２プライマー及びＭＲ１プライマーがアニーリングできるＤＮＡ断片を以下のように調製した。ｐＵＣ１９プラスミドを鋳型にＭＣＳＦプライマーとＲＶプライマー（宝酒造社製）およびＭ４プライマー（宝酒造社製）とＭＣＳＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、マイクロコン−１００で精製し、２３６ｂｐと２７１ｂｐのＰＣＲ増幅断片、ＭＳＣＦ−ＲＶ断片及びＭ４−ＭＣＳＲ断片を得た。この２つのＰＣＲ増幅断片の中でＭ４プライマーとＲＶプライマーにはさまれた領域は共通配列である。
次に、プライマーがアニーリングしている鋳型ＤＮＡ鎖同士がアニーリングしていない形態の鋳型−プライマー（１）とプライマーがアニーリングしている鋳型ＤＮＡ鎖同士がアニーリングしている形態の鋳型−プライマー（２）を以下のように作製した。
（１）ＭＣＳＦ−ＲＶ断片、３０ｎｇに４０ｐｍｏｌの５’末端を［γ−３２Ｐ］ＡＴＰでリン酸化ラベルしたＭＦ２プライマーとプロピレンジアミンを最終濃度０．０１％になるよう添加し滅菌蒸留水で５μｌとした反応液およびＭ４−ＭＣＳＲ断片、３０ｎｇに４０ｐｍｏｌのＭＲ１プライマーとプロピレンジアミンを最終濃度０．０１％になるよう添加し、滅菌蒸留水で５μｌとした反応液を別々に９８℃、２分間熱変性後、５５℃まで冷却した後、それぞれの反応液２．５μｌずつ混合して鋳型−プライマーを調製した。
（２）１５ｎｇのＭＣＳＦ−ＲＶ断片、１５ｎｇのＭ４−ＭＣＳＲ断片、２０ｐｍｏｌの５’末端を［γ−３２Ｐ］ＡＴＰでリン酸化ラベルしたＭＦ２プライマー、２０ｐｍｏｌのＭＲ１プライマー、及びプロピレンジアミンを最終濃度０．０１％になるよう添加し、滅菌蒸留水で５μｌとした反応液を９８℃、２分間熱変性後、５５℃まで冷却して鋳型−プライマーを調製した。
上記、鋳型−プライマー反応液５μｌに１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液（４２．５ｍＭトリシン緩衝液（ｐＨ８．７）、１２．５ｍＭ 塩化カリウム、１２．５ｍＭ 硫酸アンモニウム、０．０１２５％ＢＳＡ、１．２５％ＤＭＳＯ、５ｍＭ 酢酸マグネシウム、各０．６２５ｍＭ ｄＮＴＰ）２０μｌを添加し５５℃で１５分間反応した。反応終了後、５μｌの反応液に２．５μｌの反応停止液（９５％ホルムアミド、２０ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ブロモフェノルブルー、０．５％キシレンシアノール）を加えて、９４℃３分間の熱変性を行った。この反応液１．６μｌを８Ｍ尿素を含む６％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した後、ＢＡＳ２０００（フジックス）でシグナルを読みとりＭＦ２プライマーからの伸長産物を検出した。その結果を図３２Ｂに示す。図３２Ｂ中のシークエンスラダーは［γ−３２Ｐ］ＡＴＰでリン酸化ラベルしたＭＲ１プライマーを用いてＭ１３ｍｐ１８ｓｉｎｇｌｅ ｓｔｒａｎｄ ＤＮＡを配列決定したものであり、伸長産物の長さを決定するのに使用した。さらに、レーン１は鋳型ＤＮＡ鎖がアニーリングしていない場合、レーン２は鋳型ＤＮＡ鎖がアニーリングしている場合である。
図３２Ｂに示したようにプライマーがアニーリングしている鋳型ＤＮＡ鎖同士がアニーリングしていない形態の鋳型−プライマーの場合にはＭＦ２プライマーより鋳型の末端まで伸長した１６１ｂｐのバンドのみが検出されたが、プライマーがアニーリングしている鋳型ＤＮＡ鎖同士がアニーリングしている形態の鋳型−プライマーの場合には、上記のバンドに加えて、ＭＦ２プライマーとＭＲ１プライマーに挟まれた２２３ｂｐのバンドが検出された。従って、プライマーがアニーリングしている鋳型ＤＮＡ鎖同士がアニーリングしている場合は、鋳型交換反応が起こることが確認できた。
実施例３３
（１）前記参考例７記載のアルカエオグロバス フルギタス（Ａｆｕ：Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ）由来ＲＮａｓｅＨを用いた結核菌の検出について検討をした。まず、ジーンバンク登録番号ＡＬ１２３４５６記載の結核菌ゲノムの塩基配列に従って配列表の配列番号１５５及び１５６記載の塩基配列を有するプライマーＭＴＩＳ２Ｆプライマー、ＭＴＩＳ２Ｒプライマーをそれぞれ合成した。該プライマー対で挟まれる領域は、プライマー部を含めて１０３ｂｐである。次に、鋳型として乾燥ＢＣＧワクチン（日本ビーシージー製造社製）より結核菌ゲノムを常法により抽出した。該ゲノムを滅菌水にて１μｌあたり１００ｐｇ、１０ｐｇ、１ｐｇ、１００ｆｇ、１０ｆｇ、１ｆｇとなるように調製した。反応は以下のようにして行った。即ち、最終濃度３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、各５００μＭ ｄＮＴＰｓ、各５０ｐｍｏｌのＭＴＩＳ ２Ｆ及びＭＴＩＳ ２Ｒプライマー、８．７５ＵのＡｆｕ由来ＲＮａｓｅＨ、８ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、各鋳型量１μｌを添加し滅菌水で最終容量を５０μｌにした。該反応液はあらかじめ６０℃に設定したサーマルサイクラーパーソナルにセットし、６０分間保持した。反応終了後、該反応液３μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。
一方、対照としてＰＣＲをおこなった。使用するプライマーは、臨床病理、第４３巻、第９号、第９４１頁〜９４７頁（１９９５）記載のＭＴＩＳ ＰＣＲ−Ｆプライマー、ＭＴＩＳ ＰＣＲ−Ｒプライマーを使用した。該プライマー対で２７６ｂｐの増幅産物が得られる。各プライマー１０ｐｍｏｌを用いてＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）の使用マニュアルに従い容量５０μｌの反応液を調製した。サーマルサイクラーにセットし、反応温度条件９４℃ ３０秒、５０℃ ３０秒、７２℃ ３０秒を１サイクルとする４０サイクル反応を行った。反応終了後、該反応液３μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。
その結果、いずれの場合においても１００ｆｇの鋳型量の場合まで目的の増幅産物を確認できた。
（２）上記Ａｆｕ由来ＲＮａｓｅＨ及びピロコッカス ホリコシイ（Ｐｈｏ：Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ）由来ＲＮａｓｅＨを用いてクラミジア トラコーマ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）の検出について検討した。まず、ジーンバンク登録番号Ｘ０６７０７記載のクラミジア トラコーマ プラスミドの塩基配列に従って配列表の配列番号１５７、１５８記載の塩基配列を有するプライマーＣＴ２Ｆプライマー、ＣＴ２Ｒプライマーをそれぞれ合成した。該プライマー対で挟まれる領域は、プライマー部分を含めて１０９ｂｐである。また、鋳型ＤＮＡとしてインフォームド コンセントの得られた患者より提供された臨床検体よりフェノール・クロロホルム処理後、エタ沈回収したものをサンプルとして用いた。反応は、以下のようにして行った。即ち、最終濃度３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、各５００μＭ ｄＮＴＰｓ、各５０ｐｍｏｌのＣＴ２Ｆ及びＣＴ２Ｒプライマー、４６．４ＵのＰｈｏ由来ＲＮａｓｅＨあるいは８．７５ＵのＡｆｕ由来ＲＮａｓｅＨ、８Ｕ ＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、サンプル１μｌを添加し滅菌水で最終容量を５０μｌにした。該反応液は、あらかじめ５５℃に設定したサーマルサイクラーパーソナルにセットし、６０分間保持した。反応終了後、該反応液３μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果、目的の増幅産物を確認できた。このことから、Ａｆｕ由来あるいはＰｈｏ由来ＲＮａｓｅＨを用いた本発明の方法においてクラミジア トラコーマの検出ができることが確認できた。
（３）さらに、市販の検出装置を用いた磁気ビーズ検出について検討した。即ち、プライマーとして上記（１）で使用したＭＴＩＳ ２Ｒプライマーの５’末端にビオチン標識を導入したものを用い、鋳型として１００ｎｇの結核菌ゲノムを用いて上記（１）記載の増幅反応を行った。得られた増幅断片を３０倍、３００倍、３０００倍に希釈し、自動検出装置、ルミパルス（富士レビオ社製）にセットし、ストレプトアビジンコートされた磁気ビーズ（ピアス社製）による検出を行った。
ビオチン結合能１００ｐｍｏｌ相当のストレプトアビジン固層化磁気ビーズをキュベット第１層でビオチン化増幅断片と５分間反応させ、次いで０．１Ｎ ＮａＯＨを加えてＦＩＴＣ標識プローブＭＴＩＳＢＦと５分間ハイブリダイズさせ、洗浄後ＰＯＤ標識抗ＦＩＴＣ抗体を加え、５分間反応後洗浄し発光基質を加えた。この結果、既存の自動化検出装置において磁気ビーズを用いて２０分という短時間で半定量が可能であることが示された。検出は、発光量をフォトカウンティングすることで測定した。その結果を表１２に示す。
Figure 0004128074
表１２に示した結果から、従来のプレート発光法と同等の感度で検出できることを確認した。
（４）上記増幅断片の検出方法として、ハイブリッド・クロマト法を検討した。即ち、ニトロセルロース膜にストレプトアビジン（ナカライテスク社製）を固定化し、吸水パッドを連結し、ハイブリ・クロマト・ストリップを作製した。これを用いて、上記（３）で用いた増幅断片のハイブリ・クロマト法による検出を行った。検出は、１−ｓｔｅｐ ＴＭＢ−Ｂｌｏｔｔｉｎｇ（ピアス社製）を用いた発色で行った。すなわち、ニトロセルロース膜上に増幅断片を含有する反応液を展開し、その後順に０．１Ｎ ＮａＯＨ溶液、ＦＩＴＣ標識プローブ、洗浄液、発色液を展開した。その結果、結核菌陽性の増幅断片では、ブルーのバンドが検出された。また、この方法を用いる事により、本発明の方法実施後、５〜１０分で結果が肉眼で判明することから、迅速な遺伝子検査方法として有用であることが確認できた。
実施例３４
（１）ラダーバンドを含む増幅産物のサザンハイブリダイゼーション解析
本発明の増幅方法において、目的とする３本のバンド以外に高分子側に複数のラダー状バンドが存在する場合があり、このラダーバンドについて検討した。ターゲットとして、腸管出血性大腸菌Ｏ−１５７を選択した。鋳型ＤＮＡ、使用するキメラプライマー、ＩＣＡＮ法の反応条件については、実施例９記載の方法で調製した。反応終了後、該反応液５μｌを３％ＮｕＳｉｅｖｅ ３：１アガロースにて電気泳動した。その結果を図３７に示す。図３７において、レーンＭは１００ｂｐＤＮＡラダーマーカー、レーン１はネガティブコントロール、レーン２は菌体熱抽出液１セル相当、レーン３は１０セル相当、レーン４は１０２セル相当、レーン５は１０３セル相当、レーン６は１０４セル相当、レーン７は１０５セル相当の場合を示す。図３７に示したようにラダー状バンドが確認できた。
（２）ラダー増幅断片の解析
上記（１）で得られたラダーバンドについて、その塩基配列を解析した。すなわち、（１）で調製した反応液５０μｌを３％アガロース電気泳動に供し、電気泳動後、ラダーバンドをゲルから切り出した。次に、ＥＡＳＹＴＲＡＰ Ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて、ゲルからＤＮＡ増幅断片を回収した。回収後、該増幅断片をＤＮＡ Ｂｌｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造社製）にて、末端平滑化処理を行った。
制限酵素ＨｉｎｃＩＩ（宝酒造社製）で処理したｐＧＥＭ−３Ｚベクター（プロメガ社製）と上記平滑末端化処理したＤＮＡ断片をＤＮＡ ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（宝酒造社製）を用いてライゲーションした。この反応液を用いてコンピテントセルＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換した。形質転換後、上記セルを０．１ｍＭ アンピシリン及び１ｍＭ ＩＰＴＧ／０．０２％Ｘ−Ｇａｌを含むＬＢ培地で３７℃で一晩培養した。
培養後のプレートから、ホワイトコロニーを数個選択し、Ｍ１３−Ｍ４及びＭ１３−ＲＶプライマー（いずれも宝酒造社製）にてコロニーＰＣＲを行い、インサートの有無を確認した。インサートの確認されたコロニーを０．１ｍＭ アンピシリンを含むＬＢ液体培地で３７℃、一晩振とう培養した。培養後の菌体より、ＱＩＡＧＥＮ ｐｌａｓｍｉｄ ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社製）をもちいてプラスミドを精製した。該プラスミド中のＨｉｎｃＩＩサイトにクローニングされた断片をＭ１３−Ｍ４及びＭ１３−ＲＶプライマーを用いて両方向から常法によりシークエンス解析を行った。
その結果、本発明の方法で得られるラダー断片は、目的の増幅領域の繰り返し構造であることが確認できた。また、この繰り返しは、５’から３’方向に同じ向きに並列になっていることが確認できた。
（３）本発明の方法における結核菌、ＨＣＶ、クラミジア トラコーマの検出方法において形成される目的の３本の増幅断片以外のラダー増幅断片について検討した。ＨＣＶ検出は、実施例３１記載の反応条件、結核菌及びクラミジアトラコーマ検出は、実施例３３記載の反応条件で行った。得られたラダー増幅断片は、上記（２）記載の方法でサブクローニングを行いシークエンス解析を行った。その結果、本発明の方法で得られるラダー断片は、目的の増幅領域の繰り返し構造であることが確認できた。また、この繰り返しは、５’から３’方向に同じ向きに直列になっていることが確認できた。
実施例３５
（１）結核菌を対象とした本発明の検出方法について検討した。まず、結核菌ゲノムのうち、比較的ＧＣ含量が低い領域を目的の増幅領域として、配列表の配列番号１５９〜１６０記載の塩基配列を有するＫ−Ｆ−１０３３（６０）及びＫ−Ｆ−１１３３（６２）プライマーをそれぞれ合成した。鋳型となる結核菌ゲノムは、実施例３３（１）記載のものを使用し、１００ｆｇ〜１０ｐｇの範囲で段階希釈した。反応は、以下のようにして行った。即ち、最終濃度３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、各５００μＭ ｄＮＴＰｓ、各５０ｐｍｏｌのＫ−Ｆ−１０３３（６０）及びＫ−Ｆ−１１３３（６２）プライマーの組み合わせ、９．３７５ＵのＰｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩあるいは４．３７５ＵのＡｆｕ由来ＲＮａｓｅＨ、２．７５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、各鋳型量１μｌを添加し滅菌水で最終容量を２５μｌにした。該反応液はあらかじめ６２℃に設定したサーマルサイクラーパーソナルにセットし、６０分間保持した。反応終了後、該反応液３μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果、いずれのＲＮａｓｅＨにおいてもゲノムＤＮＡを鋳型とした場合において、１００ｆｇ〜１０ｐｇのいずれの濃度においても検出できることを確認した。
（２）上記（１）の方法について、更にＴｍ値が高いプライマーについて検討した。まず、配列表の配列番号１６１〜１６２記載の塩基配列を有するＫ−Ｆ−１０３３（６８）及びＫ−Ｆ−１１３３（６８）プライマーをそれぞれ合成した。増幅反応は、反応温度を６３℃にする以外は、上記（１）と同じ条件で行った。反応終了後、該反応液３μｌを３．０％アガロースゲル電気泳動に供した。その結果を図３８に示す。図３８は、Ｐｆｕ由来ＲＮａｓｅＨ及びＡｆｕ由来ＲＮａｓｅＨを用いた場合の結核菌ゲノムの電気泳動結果を示すものであり、レーン１〜４は、Ｐｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩを用いた場合であり、レーン１は鋳型ＤＮＡが１０ｐｇ、レーン２は１ｐｇ、レーン３は１００ｆｇ、レーン４はネガティブコントロールの場合である。さらに、レーン５〜８は、Ａｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩを用いた場合であり、レーン５は鋳型ＤＮＡが１０ｐｇ、レーン６は１ｐｇ、レーン７は１００ｆｇ、レーン８はネガティブコントロール、レーンＭは１００ｂｐＤＮＡラダーマーカーを示す。
図３８に示したように、いずれのＲＮａｓｅＨを用いた場合でも１００ｆｇの鋳型ＤＮＡを用いた場合まで、目的の増幅断片を検出することができた。また、Ａｆｕ由来ＲＮａｓｅＨを用いた方が、増幅産物量が多くなることが確認できた。さらに、Ａｆｕ由来ＲＮａｓｅＨを用いた方が、安定した検出感度が得られることを確認した。
（３）Ｋ−Ｆ−１０３３（６８）及びＫ−Ｆ−１１３３（６８）プライマーの組み合わせの場合について目的の増幅領域を含むプラスミドを鋳型とした場合について検討した。目的の増幅領域を含むプラスミドを調製するためにまず、配列表の配列番号１６３〜１６４記載の塩基配列を有するＦ２６プライマーとＲ１３１０プライマーを合成した。これらのプライマーとＢＣＧワクチン株を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物をｐＴ７−Ｂｌｕｅ−Ｔベクター（宝酒造社製）に導入することにより調製した。また、反応条件は、４ＵのＢｃａ ＤＮＡポリメラーゼ用いる以外は、上記（２）と同様の反応液組成にした。その結果、１ｆｇまで検出できることを確認した。
（４）目的の３本の増幅断片を含むラダー増幅断片を形成するＭＴＩＳ２Ｆ及びＭＴＩＳ２Ｒプライマーの組み合わせの場合と、目的の３本の増幅断片が得られるＫ−Ｆ−１０３３（６８）及びＫ−Ｆ−１１３３（６８）プライマーの組み合わせの場合について検出感度を比較した。対象としては、結核菌を選択した。反応は、ＭＴＩＳ２Ｆ及びＭＴＩＳ２Ｒプライマーの組み合わせの場合は実施例３３（２）の条件で、Ｋ−Ｆ−１０３３（６８）及びＫ−Ｆ−１１３３（６８）プライマーの組み合わせについては、上記（２）記載の条件と同様にして行った。その結果、いずれの場合においても同じ検出感度が得られることが確認できた。
実施例３６
鋳型ゲノムＤＮＡの変性を伴わない本発明の増幅方法について検討した。
（１）プラスミドｐＤＯＮ−ＡＩ（宝酒造社製）のパッケージング領域の塩基配列に従って、配列表の配列番号１６５、１６６記載の塩基配列を有する、ｐＤＯＮ−ＡＩ−６８−１及びｐＤＯＮ−ＡＩ−６８−２プライマーをそれぞれ合成した。
（２）それぞれ１０ｆｇ、１ｐｇのｐＤＯＮ−ＡＩを含む１μｌの溶液、あるいは実施例２３で調製したｐＤＯＮ−ＡＩを組み込まれたＮＩＨ／３Ｔ３細胞由来のゲノムＤＮＡそれぞれ１ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇを含む１μｌの溶液、あるいは陰性対照である１μｌの水に、上記（１）のプライマー各５０ｐｍｏｌ、０．５ｍＭのｄＮＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウム緩衝液（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．０１％ＢＳＡ、１％ＤＭＳＯ、１８．５ＵのＰｆｕ由来ＲＮａｓｅＨＩＩ、４ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む全量５０μｌの反応液を調製した。この反応液をサーマルサイクラーにセットし、６４℃で１時間保温した。反応終了後、反応液５μｌを３％アガロースゲル電気泳動に供し、増幅産物を確認した。この結果を図３９に示す。図３９において、レーンＭは１００ｂｐＤＮＡラダーマーカー、レーン１はネガティブコントロール、レーン２はｐＤＯＮ−ＡＩを組み込んだゲノムＤＮＡ １ｎｇの場合、レーン３はｐＤＯＮ−ＡＩを組み込んだゲノムＤＮＡ １０ｎｇの場合、レーン４はｐＤＯＮ−ＡＩを組み込んだゲノムＤＮＡ １００ｎｇの場合、レーン５はｐＤＯＮ−ＡＩ ＤＮＡ １０ｆｇの場合、レーン６はｐＤＯＮ−ＡＩ ＤＮＡ １ｐｇの場合を示す。
図３９に示されるように、ｐＤＯＮ−ＡＩ、ｐＤＯＮ−ＡＩを組み込まれたゲノムＤＮＡのいずれにおいても特異的なＤＮＡ断片の増幅が確認された。すなわち、鋳型としてゲノムＤＮＡを用いる場合も、反応に先立って鋳型ＤＮＡを変性することなく目的のＤＮＡ断片を増幅することが可能であることが確認できた。
実施例３７
本発明の忠実度（正確性）をＬＡテクノロジーを用いたタカラ ＥｘＴａｑ ポリメラーゼ（宝酒造社製）によるＰＣＲと比較した。まず、鋳型プラスミドは以下のようにして行った。
即ち、ジーンバンク登録番号Ｌ２０８６１記載のヒトプロトオンコジーン Ｗｎｔ−５ａ遺伝子、ジーンバンク登録番号ＸＭ＿００９３７１記載のリボゾーマルプロテインＳ５遺伝子、ジーンバンク登録番号ＮＭ＿０００９０３記載のヒトＮＡＤＨ遺伝子、ジーンバンク登録番号ＡＵ０７７３４７記載のヒトプロトカドヘリン４３遺伝子について、配列表の配列番号１６７〜１７０記載の各々３００ｂｐの領域をＰＣＲで増幅した。この際、プライマーの５’末端にＳｆｉＩ制限酵素サイトを付加した特異的プライマーを用いてＰＣＲ増幅した。反応終了後、該増幅断片をＳｆｉＩ制限酵素（宝酒造社製）で処理した。次にｐＵＣ１９（宝酒造社製）をＡｆｌＩＩＩ制限酵素（ＮＥＢ製）とＮｄｅＩ制限酵素（宝製）で処理後、アガロースゲル電気泳動に供し、約２ｋｂｐのサイズのフラグメントを抜き出しイージートラップ（宝酒造社製）で回収した。ＤＮＡ合成機で配列表の配列番号１７１に記載のＤＮＡを合成した。この配列に相補的なＤＮＡも合成しこれらのＤＮＡを熱変性後、アニールさせ２本鎖ＤＮＡにした。その２本鎖ＤＮＡの末端にはＡｆｌＩＩＩとＮｄｅＩ制限酵素付着部位を有している。前述のｐＵＣ１９制限酵素処理フラグメントに２本鎖合成ＤＮＡをＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ ｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いて挿入した。このプラスミドをｐＩＣ６２とした。このｐＩＣ６２にはＩＣＡＮ２プライマー（配列番号１７２）とＩＣＡＮ６プライマー（配列番号１７３）がアニールする配列を有し、さらにＳｆｉＩ制限酵素サイトも有している。このｐＩＣ６２プラスミドをＳｆｉＩ制限酵素処理したものを調製した。次に上記ＰＣＲ増幅／ＳｆｉＩ制限酵素消化断片をライゲーションキットｖｅｒ．２（宝酒造社製）を用いてライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９（宝酒造社製）を形質転換した。この形質転換体を培養し、約３００ｂｐのＤＮＡが挿入されたプラスミドを取得し、シークエンスの確認をおこなった後、本実施例の鋳型とした。
（２）ＩＣＡＮ増幅産物の調製は、以下のようにして行った。即ち、上記鋳型プラスミド１０ｎｇ、各５０ｐｍｏｌ配列表の配列番号１７２、１７３記載のＩＣＡＮ２及びＩＣＡＮ６ キメラプライマー、プロピレンジアミン ０．０１％を含む１０μｌの溶液を調製し、サーマルサイクラーパーソナルにて９８℃、２分間変性後、６０℃１分間保持してから、氷上に移した。次に、最終濃度２０ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、各５００μＭ ｄＮＴＰｓ、３０Ｕの大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ及び５．５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを添加し、滅菌水で最終容量を５０μｌにした。該反応液は、あらかじめ６０℃に設定したサーマルサイクラーパーソナルにセットし、６０分間保持した。反応終了後、該反応液を２％ＳｅａＫｅｍ ＧＴＧアガロース（宝酒造社製）電気泳動に供した。電気泳動後、アガロースゲルより目的の増幅産物のバンドを切り出し、ＳＵＰＲＥＣ−０１（宝酒造社製）にて回収後、フェノール／クロロホルム処理してエタ沈回収した。
（３）タカラ Ｅｘタック ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲ増幅産物の調製は、以下のようにして行った。即ち、上記鋳型プラスミド１０ｎｇ、配列表の配列番号１７４、１７５記載の塩基配列を有するＩＣＡＮ２ ＤＮＡプライマー及びＩＣＡＮ６ ＤＮＡプライマーを各１０ｐｍｏｌ用いてタカラ ＥｘＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（宝酒造社製）の使用マニュアルに従い反応液を調製した。該反応液をサーマルサイクラーにセットし、反応温度条件９４℃ ３０秒、５５℃３０秒、７２℃ ３０秒を１サイクルとする３０サイクル反応を行った。反応終了後、該反応液を上記（２）と同様にアガロース電気泳動に供し、目的の増幅産物をＭｉｃｒｏｃｏｎ−１００（宝酒造製）で回収し、フェノール／クロロホルム処理してエタ沈回収した。
（４）上記（２）及び（３）で得られた増幅産物は、以下の方法でサブクローニングした。即ち、Ｐｅｒｆｅｃｔｌｙ Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（宝酒造製）を用いてマニュアルに従い、ＩＣＡＮ増幅産物とＰＣＲ増幅産物をｐＴ７ Ｂｌｕｅベクター（宝酒造社製）に導入し、ＮｏｖａＢｌｕｅ Ｓｉｎｇｌｅｓ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｃｅｌｌ（宝酒造社製）を形質転換した。その形質転換体を各クローンについて１０コロニーずつ選択後、培養し、約０．４ｋｂのＤＮＡが挿入されたプラスミドを取得し、該プラスミド中の挿入断片のシークエンスをＴ７ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）とＭ３ｐｒｉｍｅｒ（宝酒造社製）を用いて行った。
上記シークエンシングで約１６０００塩基を解析した結果、本発明の方法で増幅したフラグメントとタカラ Ｅｘタック ＤＮＡポリメラーゼによるＰＣＲで増幅したフラグメントについて比較したところ、いずれの方法においても約２５００塩基に一個の変異が認められた。すなわち、本発明の方法は、忠実度（正確性）の高いＬＡ−ＰＣＲと同等の忠実度を有することが確認できた。
実施例３８
（１）ＰＣＲによるＩＣＡＮ反応用テンプレートの作製
マウス脳由来ポリＡ＋ＲＮＡ（ＯｒｉＧｅｎｅ社製）を用いて、ｃＤＮＡ合成キット（宝酒造社製）により二本鎖ｃＤＮＡを作製した。この二本鎖ｃＤＮＡを鋳型として配列表の配列番号１７６〜１８９記載の塩基配列を有するプライマーの組合せで増幅した各々のＰＣＲ断片を、ｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔ−ｖｅｃｔｏｒ（宝酒造社製）にＴＡクローニングしてプラスミドクローンを得た。作製した各プラスミドクローン（１ｎｇ）１μｌと各１０ｐｍｏｌの配列表の配列番号１９０〜１９１記載の塩基配列を有するＭＣＳ−Ｆ及びＭＣＳ−Ｒプライマー、１．２５ＵのＥｘ Ｔａｑ（宝酒造社製）、５μｌの１０×Ｅｘタック ｂｕｆｆｅｒ（宝酒造社製）および０．２ｍＭのｄＮＴＰ 合物を含む全量５０μｌをＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌ（宝酒造社製）を用いて、９４℃で２分間、続いて９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分間を１サイクルとする反応を３０サイクル行い、得られたＤＮＡ増幅断片をＩＣＡＮ反応の鋳型とした。
（２）ＰＣＲ産物を鋳型にしたＩＣＡＮ法によるＤＮＡ断片の増幅
ＩＣＡＮ増幅産物にアミノ基をいれるため、Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ ｄＵＴＰ（シグマ社製）を用いてＩＣＡＮ反応を行った。その際、ｄＴＴＰ量とＡｍｉｎｏａｌｌｙｌ ｄＵＴＰ量の割合を１０：０、９：１、８：２、７：３、６：４とかえてＩＣＡＮ反応を行い、ＩＣＡＮ増幅産物にいれるアミノ基の割合を検討した。反応は、以下のようにして行った。
まず、上記（１）で調製したＰＣＲ反応液１μｌと各５０ｐｍｏｌの配列表の配列番号１９２、１９３記載の塩基配列を有するプライマーＭＦ２Ｎ３（２４）とＭＲ１Ｎ３（２４）と２μｌの０．０５％プロピレンジアミン水溶液を含む全液量１０μｌをＴａＫａＲａ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ Ｐｅｒｓｏｎａｌを用いて、９８℃で２分間の加熱処理、続いて６５℃で３０秒、氷上で急冷の処理を行い鋳型にプライマーをアニーリングさせた。次に、熱処理をした各溶液に各０．６２５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ混合液、０．６２５ｍＭのｄＴＴＰ＋Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ ｄＵＴＰ混合液、３２ｍＭ ヘペス（Ｈｅｐｅｓ）−水酸化カリウム緩衝溶液（ｐＨ７．８）、５．０ｍＭ 酢酸マグネシウム、０．６Ｕの大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ（宝酒造社製）、２．７５ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼを含む全液量４０μｌの反応液を添加し、サーマルサイクラーで６５℃、１時間保温した。
この反応液５０μｌに５０μｌのイソプロパノール、５μｌの３Ｍ 酢酸ナトリウム溶液（ｐＨ５．２）を添加して−８０℃で２０分放置後、遠心して上清除いた。続いて７０％エタノール溶液 ２００μｌを添加後、遠心により上清を除去して風乾した。得られたＤＮＡを水で再溶解してＯＤ２６０／２８０を測定し産物量を求めた。
（３）ＩＣＡＮ増幅産物へのＡｍｉｎｏａｌｌｙｌ ｄＵＴＰ導入の確認
ＩＣＡＮ産物にアミノ基が入っていることの確認は、５−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｉｌ ｅｓｔｅｒ（モレキュラープローブ社製）を用いてＩＣＡＮ産物のアミノ基を蛍光ラベルすることにより行った。前記ＤＮＡ溶液の一部を２μｇ／５０μｌになる様に希釈し、２０μｌの１Ｍ 炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．０）を加えた後、濃度が１０ｍＭになるようにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに溶解したＦＩＴＣ（ナカライテスク社製）を４μｌ添加し、２０℃で１６時間反応させた。市販のスピンカラムで過剰なＦＩＴＣを除去後、２．０％アガロースゲルに１０μｌアプライして電気泳動を行った。電気泳動後、ＦＭ−ＢＩＯで蛍光色素を確認、さらにＥｔＢｒ染色を行いＩＣＡＮ増幅断片の確認を行った。その結果、Ａｍｉｎｏａｌｌｙｌ ｄＵＴＰを用いてＩＣＡＮを行うことで、ＩＣＡＮ増幅産物にアミノ基を入れることができる事が確認できた。また、増幅産物に官能基を有する修飾ヌクレオチドと蛍光標識を組み合わせることにより、さらに検出感度を向上させることができることを確認した。
（４）デオキシＵＴＰを用いた本発明の増幅方法について検討した。対象として結核菌を選択した。まず、ジーンバンク登録番号ＡＬ１２３４５６記載の結核菌ゲノムの塩基配列に従って配列表の配列番号１９４、１９５記載の塩基配列を有するＭＴＩＳ２Ｆ−１６プライマー、ＭＴＩＳ２Ｒ−ＡＣＣプライマーをそれぞれ合成した。該プライマー対で増幅される領域は、プライマー部を含めて９８ｂｐである。鋳型は、以下のようにして行った。すなわち、結核菌ゲノムを配列表の配列番号１９６、１９７記載の塩基配列を有するＭＴＩＳ−ＰＣＲ−Ｆ−２プライマーとＭＴＩＳ−ＰＣＲ−Ｒ−２プライマーでＰＣＲ増幅した産物をｐＴ７Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｏｒ（宝酒造社製）にＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ Ｖｅｒ．２をもちいて挿入し、該プラスミドを用いて大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。この形質転換体を培養し、約４００ｂｐのＤＮＡが導入されたプラスミドを取得し、ＯＤ２６０で計算上、１μｌ中に１０３コピー含まれる溶液を調製した。
最終濃度３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、５００μＭ ｄＡＴＰ、５００μＭ ｄＣＴＰ、５００μＭ ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ／ｄＵＴＰ混合物（５００μＭ：０または４００μＭ：１００μＭまたは３００μＭ：２００μＭまたは２００μＭ：３００μＭまたは１００μＭ：４００μＭまたは０：５００μＭ）、各５０ｐｍｏｌのＭＴＩＳ ２Ｆ−１６及びＭＴＩＳ ２Ｒ−ＡＡＣプライマー、８．７５ＵのＡｆｕ由来ＲＮａｓｅＨ、８ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、鋳型１０３コピー１μｌを添加し滅菌水で最終容量を５０μｌにした。該反応液はあらかじめ６０℃に設定したサーマルサイクラーパーソナルにセットし、６０分間保持した。反応終了後、該反応液３μｌを３％アガロースゲル電気泳動に供した。
その結果、どのｄＴＴＰ／ｄＵＴＰ混合物の比率においても目的の増幅産物が確認できた。以上のことから、修飾ヌクレオチドも本発明の方法の基質として用いることができることを確認した。
実施例３９
本発明の方法において、ＯＮＥ−ＳＴＥＰ増幅方法への応用について検討した。対象としては、ＨＣＶを選択した。
（１）トランスクリプトＲＮＡの調製
まず、鋳型となるトランスクリプトＲＮＡの調製を行った。インフォームドコンセントの得られたＣ型肝炎患者の血清３００μｌからトライゾール試薬（ライフテック社製）を使用して該試薬添付の説明書に従い調製し、最終的に注射用水（大塚製薬製）２０μｌに溶かした。このＲＮＡサンプルを鋳型にＲＴ−ＰＣＲを行なった。反応は以下のようにして行った。上記ＲＮＡサンプル２μｌと配列表の配列番号１９８、１９９に記載のＳＰ６−ＨＣＶ−Ｆプライマー及びＴ７−ＨＣＶ−Ｒプライマーのそれぞれ２０ｐｍｏｌを用いてＯｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＮＡ ＰＣＲ ｋｉｔ（宝酒造製）でマニュアル通りに反応液量５０μｌを調製した。サーマルサイクラーパーソナルにセットし、５０℃ １５分、９４℃ ２分反応後、９４℃ ３０秒、６０℃ ３０秒、７２℃ ３０秒を１サイクルとして４０サイクル反応を行った。反応終了後、該反応液を２％ＳｅａＰｌａｑｕｅ ＧＴＧ アガロースゲルによる電気泳動に供し、目的増幅産物３５０ｂｐを切り出した。その後、ＥＡＳＹＴＲＡＰ Ｖｅｒ．２を用いて該キット添付の説明書に従いＤＮＡを回収した。これを鋳型にＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ キット（宝酒造社製）を用いて該キット添付の説明書に従いトランスクリプトＲＮＡを合成した。これをＯｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＩＣＡＮの検討用鋳型とした。
（２）Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＩＣＡＮの検討
上記（１）で調製したトランスクリプトＲＮＡをＯＤ２６０値より計算し、１μｌあたり１０４，１０５，１０６，１０７コピーに調製した。次に最終濃度３２ｍＭ ヘペス−水酸化カリウムバッファー（ｐＨ７．８）、１００ｍＭ 酢酸カリウム、１％ＤＭＳＯ、０．０１％ＢＳＡ、４ｍＭ 酢酸マグネシウム、５００μＭ ｄＮＴＰｓ、配列表の配列番号２００と２０１に記載のＨＣＶ−Ａ ＳプライマーとＨＣＶ−Ａ Ａプライマー各５０ｐｍｏｌ、３０ＵのＰｆｕ由来ＲＮａｓｅＨ、８ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、２０ＵのＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ＡＭＶ ＲＴａｓｅＸＬ（宝酒造製）（０、１、２．５、３又は５Ｕ）、各コピー数のトランスクリプトＲＮＡ １μｌを添加した５０μｌ反応液量を調製した。該反応液は、あらかじめ６０℃に設定したサーマルサイクラーパーソナルにセットし、６０分間保持した。反応終了後、該反応液２μｌを３％アガロースゲル電気泳動に供した。
その結果、ＡＭＶ ＲＴａｓｅ（−）の場合、どの鋳型量の時も目的の増幅産物は確認できなかった。一方、ＡＭＶ ＲＴａｓｅＸＬを１Ｕ添加時は１０７コピーまで、２．５Ｕ添加時は１０６コピー、３Ｕ添加時は１０６コピー、５Ｕ添加時は１０６コピーまで目的増幅産物が得られた。また、反応温度を５７℃にしたとき、ＡＭＶ ＲＴａｓｅＸＬを２．５Ｕ添加時に１０５コピーまで目的の増幅産物を確認できた。また、１ＵのＢｃａＢＥＳＴ ＤＮＡポリメラーゼ、１０ＵのＰｆｕ由来ＲＮａｓｅＨを用いたときは、ＡＭＶ ＲＴａｓｅを無添加でも１０６コピーまで目的の増幅産物が確認できた。
産業上の利用の可能性
本発明により、キメラオリゴヌクレオチドプライマーを使用するＤＮＡ合成反応により標的核酸の塩基配列中の特異的増幅に適した領域を増幅することを特徴とする標的核酸の増幅方法が提供される。また、該標的核酸の増幅方法で得られた標的核酸の増幅断片を検出する工程を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法が提供される。また、本発明の増幅方法は、他の核酸増幅方法あるいは核酸複製方法と組み合わせて使用することにより、効率的な核酸配列の製造方法として利用できる。また、本発明によりウイルス、細菌、カビ、酵母などの微生物、特に病原性微生物等の高感度、特異的検出、定量のための標的核酸の検出方法及び該方法のためのキメラオリゴヌクレオチドプライマーが提供される。さらに、本発明により自動化、微量化、高集積化された核酸の増幅、検出システムが提供される。
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【配列表】
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【図面の簡単な説明】
図１：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図２：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図３：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図４：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図５：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図６：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図７：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図８：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図９：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図１０：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。Ａ：ＩＣＡＮ法；Ｂ：ＰＣＲ法。
図１１：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図１２：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図１３：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図１４：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図１５：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図１６：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図１７：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図１８：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図１９：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図２０：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図２１：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図２２：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図２３：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図２４：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図２５：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図２６：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図２７：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図２８：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動及びドットハイブリパターンを示す。
図２９：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図３０：本発明の方法及びＰＣＲ法により増幅された増幅産物量の比較グラフである。
図３１：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図３２本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のポリアクリルアミド電気泳動パターンを示す。
図３３：本発明の核酸の増幅方法の一態様を示した図である。
図３４：本発明の核酸の増幅方法の一態様を示した図である。
図３５：本発明の核酸の増幅方法の一態様を示した図である。
図３６：本発明の核酸の増幅方法の一態様を示した図である。
図３７：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図３８：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。
図３９：本発明の方法により増幅された増幅ＤＮＡ断片のアガロース電気泳動パターンを示す。

Claims (56)

  1. 核酸を増幅する方法において、
    （ａ）鋳型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な２種類のプライマーと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖を合成し、合成されたプライマー伸長鎖がアニーリングして成る二本鎖核酸を得る工程；ここで該プライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド、７−デアザグアニン、デオキシリボイノシンヌクレオチド、デオキシリボウラシルヌクレオチド、及びリボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され、
    （ｂ）（ａ）工程で得られるプライマー伸長鎖より成る二本鎖核酸のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼで切断する工程；および、
    （ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のそれぞれのプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、鋳型とプライマー伸長鎖より成る二本鎖核酸を得る工程；
    を包含することを特徴とする核酸の増幅方法。
  2. 核酸を増幅する方法において、
    （ａ）鋳型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な２種類のプライマーと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖を合成し、合成されたプライマー伸長鎖がアニーリングして成る二本鎖核酸を得る工程；ここで該プライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド、７−デアザグアニン、デオキシリボイノシンヌクレオチド、デオキシリボウラシルヌクレオチド、及びリボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され、
    （ｂ）（ａ）工程で得られるプライマー伸長鎖より成る二本鎖核酸のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼで切断する工程；および、
    （ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のそれぞれのプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、プライマー伸長鎖がアニーリングした二本鎖核酸を得る工程；
    を包含することを特徴とする核酸の増幅方法。
  3. 核酸を増幅する方法において、
    （ａ）鋳型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な２種類のプライマーと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖を合成し、合成されたプライマー伸長鎖がアニーリングして成る二本鎖核酸を得る工程；ここで該プライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド、７−デアザグアニン、デオキシリボイノシンヌクレオチド、デオキシリボウラシルヌクレオチド、及びリボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され、
    （ｂ）（ａ）工程で得られるプライマー伸長鎖より成る二本鎖核酸のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼで切断する工程；
    （ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のそれぞれのプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、プライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖 核酸、および鋳型同士がアニーリングした二本鎖核酸に（ａ）工程の２種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸を得る工程；
    （ｄ）（ｃ）工程で得られる２種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸のそれぞれのプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、プライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸、および鋳型同士がアニーリングした二本鎖核酸に（ａ）工程の２種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸を得る工程；および、
    （ｅ）（ｄ）工程で得られる２種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸が（ｄ）工程で再利用される工程；
    を包含することを特徴とする核酸の増幅方法。
  4. 核酸を増幅する方法において、
    （ａ）鋳型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な２種類のプライマーと鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼにより処理して該鋳型に相補的なプライマー伸長鎖を合成し、合成されたプライマー伸長鎖がアニーリングして成る二本鎖核酸を得る工程；ここで該プライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド、７−デアザグアニン、デオキシリボイノシンヌクレオチド、デオキシリボウラシルヌクレオチド、及びリボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され、
    （ｂ）（ａ）工程で得られるプライマー伸長鎖より成る二本鎖核酸のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼで切断する工程；
    （ｃ）（ｂ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のそれぞれのプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、プライマー伸長鎖同士がアニーリングした二本鎖核酸、および鋳型同士がアニーリングした二本鎖核酸に（ａ）工程の２種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸を得る工程；
    （ｄ）（ｃ）工程で得られる２種のプライマーがアニーリングした二本鎖核酸のそれぞれのプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して鎖置換を行い、鋳型とプライマー伸長鎖よりなる二本鎖核酸を得る工程；
    （ｅ）（ｄ）工程で得られる鋳型とプライマー伸長鎖よりなる二本鎖核酸のリボヌクレオチド含有部位をエンドヌクレアーゼで切断する工程；および、
    （ｆ）（ｅ）工程で得られるプライマー伸長鎖が切断された二本鎖核酸のプライマー部分の３’末端より、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって鋳型に相補的な核酸配列を伸長して置換鎖を合成する工程；
    を包含することを特徴とする核酸の増幅方法。
  5. エンドヌクレアーゼがエンドリボヌクレアーゼである請求項１〜４いずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  6. エンドリボヌクレアーゼがＲＮａｓｅＨである請求項５に記載の核酸の増幅方法。
  7. ＲＮａｓｅＨが大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）由来ＲＮａｓｅＨ、サーモトガ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、サーマス（Ｔｈｅｒｍａｓ）属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、ピロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、アルカエオグロバス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、及びバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属細菌由来ＲＮａｓｅＨから選択されるＲＮａｓｅＨである請求項６記載の核酸の増幅方法。
  8. 核酸の増幅領域が２００ｂｐ以下であることを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  9. 下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーを用いることを特徴とする請求項１〜８いずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
    一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’
    （ａ：１１以上の整数、ｂ：１以上の整数、ｃ：０または１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド、７−デアザグアニン、デオキシリボイノシンヌクレオチド、デオキシリボウラシルヌクレオチド及び／又はリボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログ、Ｎ：未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチド、なお、ｄＮａの部位の一部のｄＮはＮで置換されていてもよく、３’末端のヌクレオチドは当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい）
  10. ｃが０である請求項９に記載の核酸の増幅方法。
  11. 請求項９又は１０記載のキメラオリゴヌクレオチドプライマーに適したＤＮＡ伸長反応温度でＤＮＡ伸長反応を行うことを特徴とする請求項９又は１０記載の核酸の増幅方法。
  12. 鋳型となる核酸と該核酸の塩基配列に実質的に相補的なキメラオリゴヌクレオチドプライマーを、当該核酸並びにスペルミジン及び／又はプロピレンジアミンを含有するアニーリング溶液中で９０℃以上に保温した後、増幅反応が実施される温度以下に冷却してアニーリングさせる工程を包含することを特徴とする請求項１〜１１いずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  13. ビシン、およびヘペスから選択される緩衝成分を含有する緩衝液中で増幅反応が実施されることを特徴とする請求項１〜１２いずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  14. 鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとして、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バチルス ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、およびバチルス カルドテナックス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｒｄｏｔｅｎａｘ）由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼが使用される請求項１〜１３いずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  15. 鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとＲＮａｓｅＨがバチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼと大腸菌由来、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来からなる群から選択されるＲＮａｓｅＨの組み合わせであることを特徴とする請求項６〜１４いずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  16. ＲＮａｓｅＨが大腸菌由来Ｉ型ＲＮａｓｅＨ、ピロコッカス属細菌由来又はアルカエオグロバス属細菌由来ＩＩ型ＲＮａｓｅＨである請求項１５に記載の核酸の増幅方法。
  17. ＤＮＡポリメラーゼがバチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼであり、マンガンイオンの存在下に当該ＢｃａＤＮＡポリメラーゼが使用される請求項１〜１６いずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  18. ホスホノギ酸の存在下で増幅反応が実施される請求項１〜１７のいずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  19. 鋳型となる核酸が一本鎖または二本鎖のＤＮＡである請求項１〜１８のいずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  20. 鋳型となる二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡにする工程の後に実施されることを特徴とする請求項１９に記載の核酸の増幅方法。
  21. 鋳型となる核酸がＲＮＡを鋳型とする逆転写反応によって得られたｃＤＮＡである請求項１９又は２０に記載の核酸の増幅方法。
  22. ＲＮＡを鋳型とする逆転写反応によってｃＤＮＡを合成する工程の後に実施されることを特徴とする請求項２１に記載の核酸の増幅方法。
  23. 逆転写酵素として逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用することを特徴とする請求項２１又は２２に記載の核酸の増幅方法。
  24. 逆転写反応と鋳型に相補的な伸長鎖の合成とが、逆転写酵素活性と鎖置換活性とを有する１種のＤＮＡポリメラーゼにより実施されることを特徴とする請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  25. ＤＮＡポリメラーゼが、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、もしくは、バチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損Ｂｃａ ＤＮＡポリメラーゼであることを特徴とする請求項２４記載の核酸の増幅方法。
  26. 核酸の増幅反応が等温で行われることを特徴とする請求項１〜２５のいずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  27. デオキシリボヌクレオチド３リン酸のアナログの存在下に実施されることを特徴とする請求項１〜２６のいずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  28. デオキシリボヌクレオチド３リン酸のアナログとして、デオキシウリジン３リン酸またはその誘導体が使用される請求項２７記載の核酸の増幅方法。
  29. 核酸増幅用組成物であって、
    （ａ）鋳型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的な少なくとも２種類のプライマー；ここで該プライマーは、少なくともデオキシリボヌクレオチド、７−デアザグアニン、デオキシリボイノシンヌクレオチド、デオキシリボウラシルヌクレオチド、及びリボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーであって、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置され；
    （ｂ）エンドヌクレアーゼ；
    （ｃ）鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ；
    を含有することを特徴とする核酸増幅用組成物。
  30. 鋳型となる核酸、デオキシリボヌクレオチド３リン酸、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも２種類のプライマー、およびエンドヌクレアーゼを混合して得られる核酸増幅用組成物；ここで該プライマーは、鋳型となる二本鎖核酸のそれぞれの鎖の塩基配列に実質的に相補的であり、少なくともデオキシリボヌクレオチド、７−デアザグアニン、デオキシリボイノシンヌクレオチド、デオキシリボウラシルヌクレオチド、及びリ ボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログから選択されるものとリボヌクレオチドとを含有し、該リボヌクレオチドは該プライマーの３’末端又は３’末端側に配置されたキメラオリゴヌクレオチドプライマーである。
  31. プライマーが下記一般式で表されるキメラオリゴヌクレオチドプライマーであることを特徴とする請求項２９又は３０記載の核酸増幅用組成物。
    一般式：５’−ｄＮａ−Ｎｂ−ｄＮｃ−３’
    （ａ：１１以上の整数、ｂ：１以上の整数、ｃ：０または１以上の整数、ｄＮ：デオキシリボヌクレオチド、７−デアザグアニン、デオキシリボイノシンヌクレオチド、デオキシリボウラシルヌクレオチド及び／又はリボースの誘導体を有するヌクレオチドアナログ、Ｎ：未修飾リボヌクレオチド及び／又は修飾リボヌクレオチド、なお、ｄＮａの部位の一部のｄＮはＮで置換されていてもよく、３’末端のヌクレオチドは当該末端からのＤＮＡポリメラーゼによる伸長が起こらないような修飾を有していてもよい）
  32. ｃが０である請求項３１に記載の核酸増幅用組成物。
  33. 核酸の増幅反応に適した緩衝成分を含有する請求項２９〜３２いずれか１項に記載の核酸増幅用組成物。
  34. ビシン、およびヘペスから選択される緩衝成分を含有する請求項３３に記載の核酸増幅用組成物。
  35. 鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとして、大腸菌由来のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、バチルス ステアロサーモフィラス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、およびバチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択されるＤＮＡポリメラーゼが使用される請求項２９〜３４いずれか１項に記載の核酸増幅用組成物。
  36. エンドヌクレアーゼがエンドリボヌクレアーゼである請求項２９〜３５いずれか１項に記載の核酸増幅用組成物。
  37. エンドリボヌクレアーゼがＲＮａｓｅＨである請求項３６に記載の核酸増幅用組成物。
  38. ＲＮａｓｅＨが大腸菌由来ＲＮａｓｅＨ、サーモトガ属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、サーマス属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、ピロコッカス属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、アルカエオグロバス属細菌由来ＲＮａｓｅＨ、及びバチルス属細菌由来ＲＮａｓｅＨから選択されるＲＮａｓｅＨである請求項３７記載の核酸増幅用組成物。
  39. 鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼとエンドヌクレアーゼがバチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼと大腸菌由来、ピロコッカス属細菌由来あるいはアルカエオグロバス属細菌由来からなる群から選択されるＲＮａｓｅＨの組み合わせであることを特徴とする請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の核酸増幅用組成物。
  40. ＲＮａｓｅＨが大腸菌由来Ｉ型ＲＮａｓｅＨ、ピロコッカス属細菌由来又はアルカエオグロバス属細菌由来ＩＩ型ＲＮａｓｅＨである請求項３９に記載の核酸増幅用組成物。
  41. ＤＮＡポリメラーゼがバチルス カルドテナックス由来の５’→３’エキソヌクレアーゼ欠損ＢｃａＤＮＡポリメラーゼであり、マンガンイオンを含有する請求項２９〜４０いずれか１項に記載の核酸増幅用組成物。
  42. ホスホノギ酸を含有する請求項２９〜４１のいずれか１項に記載の核酸増幅用組成物。
  43. デオキシリボヌクレオチド３リン酸のアナログを含有する請求項２９〜４２のいずれか１項に記載の核酸増幅用組成物。
  44. デオキシリボヌクレオチド３リン酸のアナログがデオキシウリジン３リン酸またはその誘導体である請求項４３記載の核酸増幅用組成物。
  45. 試料中の標的核酸を検出するための方法であって、
    （ａ）請求項１〜２８いずれか１項に記載の核酸の増幅方法により核酸を増幅する工程；および
    （ｂ）（ａ）工程により増幅された標的核酸を検出する工程；
    を包含することを特徴とする標的核酸の検出方法。
  46. 得られる増幅核酸を検出用プローブを用いて検出する工程を包含する請求項４５に記載の標的核酸の検出方法。
  47. 検出用プローブがあらかじめ標識物質により標識されているプローブであることを特徴とする請求項４６記載の標的核酸の検出方法。
  48. プローブが、消光状態になるような距離で配置された２種類以上の蛍光物質で標識されたＲＮＡプローブであることを特徴とする請求項４７記載の標的核酸の検出方法。
  49. プライマーが、配列表の配列番号３１〜３４、４７、４８、５１〜５３、６４〜７２、８４、８５、１１３、１１４、１３０、１３１でそれぞれ表される核酸配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーである、請求項１〜２８いずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  50. プライマーが、配列表の配列番号５９、６０、１１９、１２０、１２２、１２３でそれぞれ表される核酸配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーである、請求項１〜２８いずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  51. プライマーが、配列表の配列番号１１６、１１７でそれぞれ表される核酸配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーである、請求項１〜２８いずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  52. プライマーが、配列表の配列番号９６、９７でそれぞれ表される核酸配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーである、請求項１〜２８いずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  53. プライマーが、配列表の配列番号１０１〜１０２、１３８〜１３９、２００〜２０１でそれぞれ表される核酸配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーである、請求項１〜２８いずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  54. プライマーが、配列表の配列番号１３６、１３７でそれぞれ表される核酸配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーである、請求項１〜２８いずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  55. プライマーが、配列表の配列番号１５５〜１５６、１５９〜１６２、１９４〜１９５で それぞれ表される核酸配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーである、請求項１〜２８いずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
  56. プライマーが、配列表の配列番号１５７〜１５８でそれぞれ表される核酸配列を有するキメラオリゴヌクレオチドプライマーである、請求項１〜２８いずれか１項に記載の核酸の増幅方法。
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