JP2632317B2 - ホップ矮化ウイロイド類の分別検出法 - Google Patents
ホップ矮化ウイロイド類の分別検出法Info
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- JP2632317B2 JP2632317B2 JP62194377A JP19437787A JP2632317B2 JP 2632317 B2 JP2632317 B2 JP 2632317B2 JP 62194377 A JP62194377 A JP 62194377A JP 19437787 A JP19437787 A JP 19437787A JP 2632317 B2 JP2632317 B2 JP 2632317B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は特定の塩基配列を有する合成DNAプローブを
用いたホップ矮化ウイロイド（以下HSVという）、同キ
ュウリ変株（以下HSV−ｃという）、同ブドウ変株（以
下HSV−ｇという）の分別検出法に関する。
用いたホップ矮化ウイロイド（以下HSVという）、同キ
ュウリ変株（以下HSV−ｃという）、同ブドウ変株（以
下HSV−ｇという）の分別検出法に関する。
［従来の技術］ ウイロイドは一本鎖の小さな環状のRNA分子であり、
植物に感染すると矮縮、成育阻害、奇形などの好ましく
ない症状をひき起こす病原体である。
植物に感染すると矮縮、成育阻害、奇形などの好ましく
ない症状をひき起こす病原体である。
HSVもその１つであり、1983年に大野らによってそのc
DNAの全塩基配列（297塩基）がすでに決定されている。
（日経バイオテクノロジー最新用語辞典380頁右欄、ウ
イロイドの項、昭60.7.25日経マグロウヒル社発行） その後、HSVにはHSV,HSV−c,HSV−ｇの三変株が存在
することが確認されている。
DNAの全塩基配列（297塩基）がすでに決定されている。
（日経バイオテクノロジー最新用語辞典380頁右欄、ウ
イロイドの項、昭60.7.25日経マグロウヒル社発行） その後、HSVにはHSV,HSV−c,HSV−ｇの三変株が存在
することが確認されている。
一方、近年急成長をとげている茎頂培養等による無菌
苗の生産にあっては、このようなウイロイドを除いたウ
イロイド・フリーの植物体を得ることが必須とされてい
る。したがって、HSVについてもその感染の有無ととも
にどの変株によるものかをいち速く検出して、感染経路
を深知し、対処等を講じなければならない。
苗の生産にあっては、このようなウイロイドを除いたウ
イロイド・フリーの植物体を得ることが必須とされてい
る。したがって、HSVについてもその感染の有無ととも
にどの変株によるものかをいち速く検出して、感染経路
を深知し、対処等を講じなければならない。
ところが、ウイロイドのように自己成分として蛋白質
を持たず、環状一本鎖RNAだけからできているものは、
抗体を用いた検出法、即ち免疫学的検出法が適用できな
いので、これにかわる適切な検出法の出現が望まれてい
た。
を持たず、環状一本鎖RNAだけからできているものは、
抗体を用いた検出法、即ち免疫学的検出法が適用できな
いので、これにかわる適切な検出法の出現が望まれてい
た。
すなわち、従来は多大の手間と時間を要する割に感度
が今一つの、植物に直接感染され、それを育成して検出
するという素朴な方法を用いたり、又RNAを一つずつ分
離後、順次分析していく方法及び病理学的方法等がとら
れてきたが、いづれも煩雑な上に時間と手間を要し実用
的な方法とはなり得ていない。
が今一つの、植物に直接感染され、それを育成して検出
するという素朴な方法を用いたり、又RNAを一つずつ分
離後、順次分析していく方法及び病理学的方法等がとら
れてきたが、いづれも煩雑な上に時間と手間を要し実用
的な方法とはなり得ていない。
［発明が解決しようとする問題点］ 本発明者は以上の状況に鑑み、より簡便で実用的な分
別検出法を提供すべく、最近の遺伝子工学の進歩を踏ま
えたプローブを用いるハイブリダイゼーション法の開発
に着手した。しかしHSV3変株はその塩基配列の相同性が
95〜99％と極めて高いため、従来の延長線上にある技術
では所期の目的を達成することができなかった。
別検出法を提供すべく、最近の遺伝子工学の進歩を踏ま
えたプローブを用いるハイブリダイゼーション法の開発
に着手した。しかしHSV3変株はその塩基配列の相同性が
95〜99％と極めて高いため、従来の延長線上にある技術
では所期の目的を達成することができなかった。
［問題点を解決するための手段］ そこでさらに研究を重ねた結果、特定の合成DNAプロ
ーブを用い、温度条件を適切に設定してハイブリダイゼ
ーションを行うと驚くべきことにHSV3変株が夫々識別で
きることを見出し、本発明に到達した。
ーブを用い、温度条件を適切に設定してハイブリダイゼ
ーションを行うと驚くべきことにHSV3変株が夫々識別で
きることを見出し、本発明に到達した。
すなわち本発明は、塩基配列５′ACCTC３′を含有
し、ホップ矮化ウイロイドブドウ変株のRNAと相補性を
有する合成DNAプローブを用いることを特徴とするホッ
プ矮化ウイロイド、ホップ矮化ウイロイドキュウリ変
株、ホップ矮化ウイロイドブドウ変株の分別検出法（上
記塩基配列において、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃ
はシトシン、Ｔはチミンを示す。）を提供するものであ
る。
し、ホップ矮化ウイロイドブドウ変株のRNAと相補性を
有する合成DNAプローブを用いることを特徴とするホッ
プ矮化ウイロイド、ホップ矮化ウイロイドキュウリ変
株、ホップ矮化ウイロイドブドウ変株の分別検出法（上
記塩基配列において、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃ
はシトシン、Ｔはチミンを示す。）を提供するものであ
る。
以下本発明を詳細に説明する。
本発明で分別検出の対象としているHSV,HSV−c,HCV−
ｇの３変株の夫々の塩基配列は公知の遺伝子工学的手法
によって下記の配列になることを確認した。
ｇの３変株の夫々の塩基配列は公知の遺伝子工学的手法
によって下記の配列になることを確認した。
上記塩基配列にみる通り、HSVおよびHSV−ｇはいずれ
も297塩基、HSV−ｃは303塩基の大きさの環状１本鎖RNA
である。
も297塩基、HSV−ｃは303塩基の大きさの環状１本鎖RNA
である。
本発明者はこれらHSV系３変株全塩基配列中に数％存
在する非相同性の塩基配列に着目し、この非相同性塩基
配列を含むRNAと相補的な塩基配列を有する15〜25merの
合成DNAプローブを選択したものである。
在する非相同性の塩基配列に着目し、この非相同性塩基
配列を含むRNAと相補的な塩基配列を有する15〜25merの
合成DNAプローブを選択したものである。
相補性の高い塩基配列を持った２本のDNA（または２
本のRNAまたはDNA−RNA）は重なり合って２重鎖を形成
する。これは塩基間に特異的な水素結合の組合せが形成
される〔アデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）ただしRNAはＴ
の代わりにウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）−シトシン
（Ｃ）〕ためで、２本鎖間の親和力の強さは相補性の高
さに依存する。本発明はこの原理に基づいてなされたも
のである。
本のRNAまたはDNA−RNA）は重なり合って２重鎖を形成
する。これは塩基間に特異的な水素結合の組合せが形成
される〔アデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）ただしRNAはＴ
の代わりにウラシル（Ｕ）、グアニン（Ｇ）−シトシン
（Ｃ）〕ためで、２本鎖間の親和力の強さは相補性の高
さに依存する。本発明はこの原理に基づいてなされたも
のである。
本発明により識別されるHSV系３変株のうち、HSV−ｇ
・RNAの53番目〜59番目の塩基配列とこれに相当するHSV
・RNAおよびHSV−ｃ・RNAの塩基配列は であることが確認された。そこでHSV−ｇと相補的な塩
基配列が５′ TACCTCC３′ であるヌクレオチドをDNAプローブとして用いると、○
印のところでHSVでは１塩基、HSV−ｃでは２塩基の非相
補配列を含むため、合成DNAプローブとHSV系３変株との
ハイブリダイゼーションの温度条件を変えると、HSV,HS
V−g,HSV−ｃというきわめて近縁のウイロイドの識別が
可能となった。
・RNAの53番目〜59番目の塩基配列とこれに相当するHSV
・RNAおよびHSV−ｃ・RNAの塩基配列は であることが確認された。そこでHSV−ｇと相補的な塩
基配列が５′ TACCTCC３′ であるヌクレオチドをDNAプローブとして用いると、○
印のところでHSVでは１塩基、HSV−ｃでは２塩基の非相
補配列を含むため、合成DNAプローブとHSV系３変株との
ハイブリダイゼーションの温度条件を変えると、HSV,HS
V−g,HSV−ｃというきわめて近縁のウイロイドの識別が
可能となった。
本発明で用いる合成DNAプローブはHSV−ｇ・RNAの54
番目〜58番目の塩基配列と相補的な塩基配列５′ACCTC
３′を必須の構成成分とするものであるが、標識物質の
組込みや条件設定の容易さなどから、通常は前記の必須
塩基配列を含む15〜25merが用いられる。
番目〜58番目の塩基配列と相補的な塩基配列５′ACCTC
３′を必須の構成成分とするものであるが、標識物質の
組込みや条件設定の容易さなどから、通常は前記の必須
塩基配列を含む15〜25merが用いられる。
たとえば、HSV−ｇ・RNAの51番目〜65番目の塩基配列
と相補性をもつ15merの合成DNAプローブ（塩基配列は
５′GGTAAGTACCTCCT３′）による識別は、このプローブ
のハイブリッド融解温度（Tm）が46℃であることを考慮
し、ハイブリダイゼーションの温度条件を41℃および31
℃で行った結果、41℃ではHSV−ｇとのみ反応し、31℃
ではHSV−ｇおよびHSVと強く、HSV−ｃとは弱く反応す
ることが確認できた。なお、この温度条件の設定は用い
る合成DNAプローブによって変更することが好ましい。
と相補性をもつ15merの合成DNAプローブ（塩基配列は
５′GGTAAGTACCTCCT３′）による識別は、このプローブ
のハイブリッド融解温度（Tm）が46℃であることを考慮
し、ハイブリダイゼーションの温度条件を41℃および31
℃で行った結果、41℃ではHSV−ｇとのみ反応し、31℃
ではHSV−ｇおよびHSVと強く、HSV−ｃとは弱く反応す
ることが確認できた。なお、この温度条件の設定は用い
る合成DNAプローブによって変更することが好ましい。
上記した本発明で用いられる合成DNAプローブはDNAの
化学合成法として知られている方法によって合成するこ
とができる。例えばリン酸の解離基の１部を保護してト
リエステルにし、縮合ユニットの末端を活性化するいわ
ゆるホスホトリエステル法（詳しくはOligonucleotide
Synthesis,1984年IRL Press Limited発行参照のこと）
によって合成される。
化学合成法として知られている方法によって合成するこ
とができる。例えばリン酸の解離基の１部を保護してト
リエステルにし、縮合ユニットの末端を活性化するいわ
ゆるホスホトリエステル法（詳しくはOligonucleotide
Synthesis,1984年IRL Press Limited発行参照のこと）
によって合成される。
本発明におけるハイブリダイゼーションは、ドットブ
ロットハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイ
ゼーション、In situハイブリダイゼーションなどの公
知の手法が用いられる。
ロットハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイ
ゼーション、In situハイブリダイゼーションなどの公
知の手法が用いられる。
また、ハイブリダイズした合成DNAプローブの検出
は、放射性同位元素（32P）標識、酵素標識、蛍光標識
などいずれの標識法を用いてもよく、これら標識物質の
合成DNAプローブへの組み込み位置は通常５′−末端で
あるが、特に限定されるものではない。
は、放射性同位元素（32P）標識、酵素標識、蛍光標識
などいずれの標識法を用いてもよく、これら標識物質の
合成DNAプローブへの組み込み位置は通常５′−末端で
あるが、特に限定されるものではない。
なお、本発明で分別検出を行う場合の試材の調製に関
しては植物からそのRNAを抽出する方法として通常用い
られる方法、例えば日本植物病理学会報vol.50 p331〜3
38（1984）の方法によって行えばよい。
しては植物からそのRNAを抽出する方法として通常用い
られる方法、例えば日本植物病理学会報vol.50 p331〜3
38（1984）の方法によって行えばよい。
［実 施 例］ 以下、実施例で本発明を具体的に説明する。
実施例 １ HSV,HSV−g,HSV−ｃにそれぞれ感染したキュウリか
ら、各ウイロイドを含む低分子RNA分画を抽出し、４×S
SC−7.5％ホルムアミド中で60℃、15分間加熱変性処理
を行い、ニトロセルロース紙にスポットした。スポット
量は２μとし、原液は２μ中に10μｇの低分子RNA
を含むように調製した。
ら、各ウイロイドを含む低分子RNA分画を抽出し、４×S
SC−7.5％ホルムアミド中で60℃、15分間加熱変性処理
を行い、ニトロセルロース紙にスポットした。スポット
量は２μとし、原液は２μ中に10μｇの低分子RNA
を含むように調製した。
６×SSC−0.1％SDS−５×Denhardt's試薬中で50℃、
１時間、プレハイブリダイゼーションを行った後、６×
SSC−0.1％SDS−５×Denhardt's試薬中でハイブリダイ
ゼーションを行った。〔注:1×SSC＝0.15M NaCl,0.015
Mクエン酸三ナトリウム;SDS＝ドデシル硫酸ナトリウム;
1×Denhardt's試薬＝0.02％（w/v）ポリビニルピロリド
ン、0.02％（w/v）ウシ血清アルブミン、0.02％（w/v）
フィコールよりなる〕 プローブは、HSV−ｇ・RNAの51〜65番目に相補的な合
成DNA（塩基配列は５′GGTAAGTACCTCCCT３′）の５′末
端を32Pで標識したものを用いた。比活性は約108dpm/μ
gDNAであった。プローブのハイブリッド融解温度（Tm）
が46℃であることを考慮し、温度条件を31℃,36℃,41℃
と変えて行った結果、41℃ではHSV−ｇとのみ反応し、3
6℃ではHSV−ｇと強く、HSVと弱く反応した。また31℃
ではHSV−ｇおよびHSVと強く、HSV−ｃと弱く反応し
た。
１時間、プレハイブリダイゼーションを行った後、６×
SSC−0.1％SDS−５×Denhardt's試薬中でハイブリダイ
ゼーションを行った。〔注:1×SSC＝0.15M NaCl,0.015
Mクエン酸三ナトリウム;SDS＝ドデシル硫酸ナトリウム;
1×Denhardt's試薬＝0.02％（w/v）ポリビニルピロリド
ン、0.02％（w/v）ウシ血清アルブミン、0.02％（w/v）
フィコールよりなる〕 プローブは、HSV−ｇ・RNAの51〜65番目に相補的な合
成DNA（塩基配列は５′GGTAAGTACCTCCCT３′）の５′末
端を32Pで標識したものを用いた。比活性は約108dpm/μ
gDNAであった。プローブのハイブリッド融解温度（Tm）
が46℃であることを考慮し、温度条件を31℃,36℃,41℃
と変えて行った結果、41℃ではHSV−ｇとのみ反応し、3
6℃ではHSV−ｇと強く、HSVと弱く反応した。また31℃
ではHSV−ｇおよびHSVと強く、HSV−ｃと弱く反応し
た。
以上の結果から、本実施例のような合成DNAプローブ
を用いることにより、HSV系３変株の分別検出が可能で
あることが確認された。
を用いることにより、HSV系３変株の分別検出が可能で
あることが確認された。
［発明の効果］ 以上説明してきたとおり、特定の塩基配列を有する合
成DNAプローブを用いてハイブリダイゼーションを行う
という本発明の方法により、従来困難であったきわめて
近似した塩基配列よりなるHSV,HSV−c,HSV−ｇの分別検
出が可能となった。したがって、本発明によるホップ矮
化ウイロイド類が原因となる植物の病気の診断及びそれ
に基づく諸対策への道が拓かれたのであり、無菌苗生産
等の分野におよぼす効果は大なるものがあるといえる。
成DNAプローブを用いてハイブリダイゼーションを行う
という本発明の方法により、従来困難であったきわめて
近似した塩基配列よりなるHSV,HSV−c,HSV−ｇの分別検
出が可能となった。したがって、本発明によるホップ矮
化ウイロイド類が原因となる植物の病気の診断及びそれ
に基づく諸対策への道が拓かれたのであり、無菌苗生産
等の分野におよぼす効果は大なるものがあるといえる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 学術月報，Ｖｏｌ．40，Ｎｏ．１ （1987．Ｊａｎ）Ｐ．29−33 Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏ ｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ. 10（1985）Ｐ．69−73
Claims (1)
- 【請求項１】ウイロイドのRNAと相補性を有する合成DNA
プローブを用いるハイブリダイゼーションによるウイロ
イドの検出法において、ホップ矮化ウイロイドブドウ変
株のRNAと相補性を有する塩基配列が５′GGTAAGTACCTCC
CT３′である合成DNAプローブを用い、かつハイブリダ
イゼーションの温度条件が41℃および31℃であることを
特徴とするホップ矮化ウイロイド、ホップ矮化ウイロイ
ドキュウリ変株、ホップ矮化ウイロイドブドウ変株の分
別検出法。（上記塩基配列において、Ａはアデニン、Ｇ
はグアニン、Ｃはシトシン、Ｔはチミンを示す。）
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62194377A JP2632317B2 (ja) | 1987-08-05 | 1987-08-05 | ホップ矮化ウイロイド類の分別検出法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62194377A JP2632317B2 (ja) | 1987-08-05 | 1987-08-05 | ホップ矮化ウイロイド類の分別検出法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6440000A JPS6440000A (en) | 1989-02-10 |
| JP2632317B2 true JP2632317B2 (ja) | 1997-07-23 |
Family
ID=16323581
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62194377A Expired - Lifetime JP2632317B2 (ja) | 1987-08-05 | 1987-08-05 | ホップ矮化ウイロイド類の分別検出法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2632317B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3723839B2 (ja) * | 2001-06-07 | 2005-12-07 | 国立大学法人広島大学 | ニワトリの白血病阻止因子（ｌｉｆ）、及びそれをコードする遺伝子 |
| CN101683975B (zh) | 2008-09-16 | 2013-09-25 | 三菱麻铁里亚尔株式会社 | 多晶硅制备用碳部件的净化方法 |
-
1987
- 1987-08-05 JP JP62194377A patent/JP2632317B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．１０（１９８５）Ｐ．６９−７３ |
| 学術月報，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１（１９８７．Ｊａｎ）Ｐ．２９−３３ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6440000A (en) | 1989-02-10 |
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