PT1317537E

PT1317537E - Composições e métodos de análogos de g-csf

Info

Publication number: PT1317537E
Application number: PT01970897T
Authority: PT
Inventors: A Casim Sarkar; A Douglas Lauffenburger; Bruce Tidor
Original assignee: Massachusetts Inst Technology
Priority date: 2000-09-08
Filing date: 2001-09-10
Publication date: 2007-02-28
Also published as: AU2001290846B2; EP1319182A2; WO2002020766A3; AU2006201824A1; WO2002020766A2; MXPA03002046A; US7371370B2; MXPA03002045A; AU9096001A; EP1317537B1; CY1107556T1; US20030166527A1; ES2276822T3; AU2001290960B2; AU9084601A; JP2004508044A; DK1317537T3; CA2421760A1; US6946548B2; WO2002020767A3

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES E MÉTODOS DE ANÁLOGOS DE G-CSF"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a composições de análogo do polipéptido do factor de estimulação de colónias de granulócitos ("G-CSF"), ácidos nucleicos relacionados, e vectores, células hospedeiras e processos para a produção de ADN recombinante dos presentes polipéptidos análogos de G-CSF. Adicionalmente, são proporcionadas composições farmacêuticas, e métodos de utilização. Alguns aspectos da invenção devem ser generalizáveis também para além das composições análogas de G-CSF.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Muitos ligandos terapêuticos eliciam respostas celulares através da ligação a receptores de superficie celular para eliciar respostas celulares. A concepção do fármaco centra-se tipicamente na capacidade de um ligando para se ligar firmemente e especificamente ao seu alvo pretendido. Todavia, se o fármaco é uma proteina e o alvo um receptor de superficie de célula, existem questões adicionais a considerar da análise do nivel de sistemas. Quando os ligandos terapêuticos se ligam a receptores na superficie de uma célula, inicia-se uma cascata de sinalização intracelular que, no final, resulta numa resposta celular apropriada. Adicionalmente, a modulação - geralmente atenuação - destes sinais começa quase imediatamente por tráfego 1 celular dos complexos ligando-receptor. Os complexos na superfície da célula são internalizados em vesículas que fundem com compartimentos endossómicos. A partir dos endossomas, as moléculas podem ser quer conduzidas para degradação em lisossomas ou ser recicladas intactas para a superfície da célula, onde o receptor livre e ligado ao ligando são reapresentados e o ligando livre é libertado para o meio extracelular. Evidência recente sugere que o resultado desta decisão de escolha para complexos que envolvem factores de crescimento ou citocinas está frequentemente relacionado com a constante de afinidade endossómica para a interacção ligando-receptor: os complexos que permanecem ligados são rapidamente degradados, enquanto que aqueles que se dissociam são reciclados [Lauffenburger et al., Chem. Biol. 5: R257-R263 (1998)]. Em geral, a dissociação de complexos em endossomas parece aumentar a reciclagem de receptor, porque resulta em interacções alteradas entre os receptores e componentes de retenção endossómica.

Adicionalmente, para um número baixo de complexos intracelulares, que é o caso para muitos sistemas de citocina-receptor clinicamente importantes, a modulação indica uma correlação positiva particularmente forte entre a afinidade endossómica inversa e a fracção do ligando reciclado [French e Lauffenburger, Ann. Biomed. Eng 25:690-707 (1997)]. Assim, se um ligando pode ser concebido para aumentar a dissociação endossómica após ligação a, e criação de sinais na sua célula alvo, o fármaco pode reduzir a regulação negativa do receptor, de modo a que as células tenham maior capacidade de resposta a outra estimulação de ligando. O tempo de vida e a eficiência do fármaco também podem ser aumentados se a reciclagem do ligando for aumentada por dissociação endossómica. Este contraste com a 2 abordagem convencional de tentar melhorar a potência do ligando através de afinidade aumentada. Se os aumentos de afinidade extracelular se estendem aos endossomas, essas tentativas podem, na verdade, ser contraprodutivas porque aumentam a regulação negativa do receptor e possivelmente a diminuição do ligando. Assim, o tráfego celular pode ser um estrangulamento no aumento da potência do ligando, particularmente nos casos em que a degradação, através de endocitose mediada pelo receptor é significativa.

Um sistema no qual a optimização das propriedades de tráfego celular pode ter um impacto profundo na potência é o do factor de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF) e do seu receptor (G-CSFR) . 0 G-CSF é uma citocina de 19-kDa, que é um dos factores de crescimento hematopoiéticos, também denominados factores de estimulação de colónias. 0 G-CSF é utilizado para aumentar as contagens de glóbulos brancos (neutrófilos) quando os niveis no sangue dessas células estão perigosamente baixos. Isto ocorre normalmente quando certos antibióticos, terapêuticas anti-HIV e/ou quimioterapêuticas suprimem a medula óssea. Um estudo recente documenta que o G-CSF, não apenas aumenta o número de neutrófilos no sangue, mas aumenta também as capacidades funcionais de matar dessas células [Vecchiarelli et al., J. Infect. Dis. 171: 1448-1454 (1995)]. 0 G-CSF estimula especificamente a proliferação e diferenciação de células precursoras neutrofilicas em neutrófilos maduros [Fukunaga et al., Cell 74: 1079-1087 (1993)], e é útil para tratamento em estados neutropénicos [Welte et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 1526-1530 (1985); Souza et al., Science 232: 61-65 (1986); Gabrilove, Sem. Hematol. 26(2): 1-14 (1989)]. O G-CSF aumenta o número de granulócitos em circulação e foi relatado por melhorar a infecção em modelos de sepsia. A administração de G-CSF também 3 inibe a libertação de factor de necrose tumoral (TNF), uma citocina importante para a lesão de tecido durante sepsia e rejeição [Wendel et al ., J. Immunol. 149: 918-924 (1992)]. 0 G-CSF é um membro da superfamília de citocinas do Grupo I, caracterizado por uma estrutura em feixe de 4 hélices anti-paralelas e incluindo outros fármacos terapeuticamente importantes, tais como eritropoietina e hormona do crescimento. 0 G-CSF liga-se especificamente e com afinidade elevada (kD aparente ~100 pM) [Morstyn, Dexter, & Foote (eds.) Filgrastim (r-metHuG-CSF) em: Clinicai Practice, Edição 2., Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque (1998)] para G-CSFR, resultando num complexo ligando:receptor com uma estequiometria de 2:2 [Horan et ai., Biochemistry 35: 4886-4896 (1996); Horan et al., J. Biochem. 121: 370-375 (1997)]. A região extracelular de G-CSFR contém o dominio de homologia com o receptor de citocina de ligação ao ligando (CRH) [Fukunaga et al., EMBO J. 10: 2855-2865 (1991)] e recentemente, a estrutura de cristal de G-CSF complexado com o dominio CRH de G-CSFR foi resolvida, apresentando a estequiometria esperada de ligando:receptor de 2:2 [Aritomi et al., Nature, 401: 713-717 (1999)].

Em humanos, o G-CSF endógeno é detectável no plasma sanguíneo [Jones et al., Bailliere's Clin. Hematol. 2(1):83-111 (1989)]. O G-CSF é produzido por fibroblastos, macrófagos, células T, trofoblastos, células endoteliais, e células epiteliais, e é o produto de expressão de um gene de cópia única compreendido por quatro exões e cinco intrões localizados no cromossoma dezassete. A transcrição deste locus produz uma espécie de ARNm que é processada diferencialmente, resultando em duas formas de ARNm de G-CSF, uma versão codificando para uma proteína de 177 aminoácidos, a outra codificando para uma proteína de 174 aminoácidos [Nagata et al., EMBO J. 5: 575-581 4 (1986)]. Verificou-se que a forma compreendida por 174 aminoácidos possui actividade biológica especifica in vivo. A SEQ ID N°: 1 apresenta um ADN codificando a espécie de 174 aminoácidos de G-CSF e a correspondente sequência de aminoácidos é apresentada na SEQ ID N°: 2. 0 G-CSF apresenta reacção cruzada entre espécies, de tal modo que quando o G-CSF humano é administrado a outro mamifero tal como um murganho, canideo, ou macaco, é promovida leucocitose sustentada por neutrófilos [Moore et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 7134-7138 (1987)]. O G-CSF humano pode ser obtido e purificado a partir de várias fontes. 0 G-CSF-humano natural pode ser isolado a partir dos sobrenadantes de linhas de células tumorais em cultura. O desenvolvimento das tecnologias de ADN recombinante possibilitou a produção de quantidades à escala comercial de G-CSF na forma glicosilada como um produto de expressão em células hospedeiras eucariotas, e de G-CSF na forma não glicosilada como um produto de expressão em células hospedeiras procariotas. Ver, por exemplo, Patente US N° 4810643 (Souza).

Verificou-se que o G-CSF era útil no tratamento de indicações em que o aumento de neutrófilos proporciona benefícios. Por exemplo, para doentes com cancro, o G-CSF é benéfico como um meio de estimular selectivamente produção de neutrófilos para compensar défices hematopoiéticos resultantes de quimioterapêutica ou terapêutica por radiação. Outras indicações incluem o tratamento de várias doenças infecciosas e estados relacionados, tais como sepsia, que é tipicamente causada por um metabolito de bactéria. O G-CSF é também útil isolado, ou em combinação com outros compostos, tais como outras citocinas, para crescimento ou expansão de células em cultura (por exemplo, para transplantes de medula óssea ou expansão ex 5 vivo) . 0 G-CSF foi administrado a doentes com transplante como um adjunto a tratamento de infecção ou para tratamento de neutropenia [Diflo et ai., Hepatology 16: PA278 (1992); Wright et al., Hepatology 14: PA48 (1991); Lachaux et al., J. Ped. 123: 1005-1008 (1993); Colquehoun et al., Transplantation 56: 755-758 (1993)]. Todavia, o G-CSF é rapidamente eliminado através de endocitose medida pelo receptor por neutrófilos periféricos e células precursoras em medula óssea que expressam G-CSFR [Morstyn, Dexter, & Foote (eds.) Filgrastim (r-metHuG-CSF) em: Clinicai Practice, Edn. 2., Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque (1998)]. Deste modo, a potência do fármaco é reduzida por este mecanismo de retroacção negativa. Uma vez que as células que expressam naturalmente G-CSFR em baixo número, diminuindo a afinidade endossómica do complexo pode não só reduzir a sub-regulação do receptor mas pode também estimular a reciclagem do ligando, como previsto por modelação [French e Lauffenburger, Ann. Biomed. Eng. 25: 690-707 (1997)]. Deste modo, G-CSF é um candidato de primeira para mutagénese para estimular as propriedades de tráfego, melhorando assim a potência do fármaco.

Foram descritos vários G-CSF's alterados. Geralmente, para a concepção de fármacos, sabe-se que certas alterações produzem certos efeitos estruturais. Por exemplo, a remoção de uma cisteina pode resultar no não enrolamento de uma molécula que, no seu estado alterado, está normalmente enrolada através de uma ponte persulfureto. Existem outros métodos para o especialista da técnica adicionar, remover ou substituir aminoácidos de modo a alterar a função de uma proteína.

Foram preparados mutantes de G-CSF-humano recombinante, mas o método de preparação não inclui informação da relação global estrutura/função. Por exemplo, foi descrita a mutação e a 6 modificação bioquímica de Cys 18 [Kuga et al, Biochem. Biophy. Res. Comm. 159: 103-111 (1989); Lu et al., Arch. Biochem. Biophys. 268: 81-92 (1989)].

Na Patente US N°. 4810643, intitulada, "Produção de Factor de Estimulação de Colónias de Granulócitos Pluripotente" (aqui incorporada como referência), são revelados de forma geral análogos de polipéptidos e fragmentos de péptidos de G-CSF. Os análogos de G-CSF específicos revelados incluem os que possuem cisteínas nas posições 17, 36, 42, 64, e 74 (das 174 espécies de aminoácidos ou os que possuem 175 aminoácidos, sendo o aminoácido adicional uma metionina N-terminal) substituída com outro aminoácido (tal como serina) , e G-CSF com uma alanina na primeira posição (N-terminal). O documento EP 0335423 intitulado "G-CSF humano Modificado" revela a modificação de, pelo menos, um grupo amino num polipéptido possuindo actividade de hG-CSF. O documento EP 0272703 intitulado "Novos Polipéptidos" revela derivados de G-CSF possuindo um aminoácido substituído ou removido em ou "na vizinhança" do terminal N. Também, Okabe et al. [Blood 75(9): 1788-1793 (1990)], revelaram modificações de cinco posições da região N-terminal de G-CSF humano. O documento EP 0459630, intitulado "Polipéptidos" revela derivados de G-CSF que ocorrem naturalmente possuindo, pelo menos, uma das propriedades biológicas de G-CSF que ocorre naturalmente e uma solução de estabilidade, pelo menos, 35% a 5 mg/mL, em que o derivado possui, pelo menos, Cys17 da sequência nativa substituído por um resíduo de Ser17 e Asp27 da sequência nativa substituído por um resíduo Ser27. 7 0 documento ΕΡ 0256843 intitulado "Expressão de G-CSF e Suas Muteinas e Suas utilizações" revela uma sequência de ADN modificada codificando G-CSF em que o terminal N é modificado para expressão melhorada da proteina em células hospedeiras recombinantes, sem alteração da sequência de aminoácidos da proteina. O documento EP 0243153 intitulado "Expressão da Proteina G-CSF humano" revelou G-CSF a ser modificado por inactivação de, pelo menos um sitio de processamento da protease KEX2 de levedura para aumentar o rendimento na produção recombinante utilizando leveduras.

Shaw, Patente US N°. 4904584, intitulado "Modificação Homogénea Especifica para Sítios de Polipéptidos" revelou proteínas alteradas com lisina. O documento WO/9012874 revelou variantes de proteínas alteradas com cisterna. O Documento de Pedido de Patente Australiana N° AU-A-10948/92, intitulado "Activação melhorada de Proteínas Recombinantes" revelou a adição de aminoácidos a qualquer dos terminais de uma molécula de G-CSF com o objectivo de auxiliar no enrolamento da molécula após expressão procariótica. O Documento de Pedido de Patente Australiana N° AU-A-76380/91, intitulado "Muteinas do Factor de Estimulação de Crescimento de Colónias de Granulócitos (G-CSF)" revelou muteinas de G-CSF na sequência Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile na posição 50-56 de G-CSF com 174 aminoácidos, e posição 53 a 59 do

G-CSF com 177 aminoácidos, e/ou, pelo menos, um dos quatro resíduos de histidina nas posições 43, 79, 156 e 170 do G-CSF maduro com 174 aminoácidos ou nas posições 46, 82, 159, ou 173 da G-CSF madura com 177 aminoácidos. O documento GB 2213821, intitulado "Gene do Factor de Estimulação de Crescimento de Colónias de Granulócitos Humano Sintético" revelou uma sequência de ácido nucleico codificando G-CSF incorporando sítios de restrição para facilitar a cassete de mutagénese das regiões seleccionadas, e sítios de restrição de flanqueamento para facilitar a incorporação do gene num sistema de expressão desejado. A Patente US N° 5214132 revelou a modificação de G-CSF-humano nas posições dos aminoácidos 1, 3, 4, 5, e 17 [ver, também, Kuga et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 103-111 (1989)] . A Patente US N° 5218092 revelou a modificação do G-CSF humano nas posições dos aminoácidos 1, 3, 4, 5, 17, 145, e 147. A Patente US N° 5581476 revela a estrutura tridimensional de G-CSF ao nivel atómico. A partir desta estrutura tridimensional, pode prever-se com uma certeza substancial o modo como alterações na composição de uma molécula de G-CSF podem resultar em alterações estruturais. Estas caracteristicas estruturais podem ser correlacionadas com actividade biológica para conceber e produzir análogos de G-CSF. A transdução de sinal, a forma como G-CSF afecta o metabolismo celular, não é normalmente muito compreendida. Em geral, G-CSF liga-se e activa o receptor de G-CSF à superfície 9 da célula através de alterações conformacionais. Esta ligação inicia então uma sinalização em cascata (e. g., recrutando cinases para o domínio citoplasmático) que aparentemente inicia as alterações com células progenitoras particulares, levando a respostas celulares tais como diferenciação, proliferação e migração. Pensa-se que o complexo G-CSF/G-CSFR sofre processos de tráfego endocítico de internalização e selecção para reciclagem ou degradação [Lauffenburger, e Linderman, Receptors: Models for Binding, Trafficking, and Signaling, Nova Iorque: Oxford University Press (1993)]. A incorporação endocítica de G-CSF potência a degradação proteolítica intracelular da citocina em compartimentos endossómicos e/ou lisossómicos. Os receptores internalizados de citocina, se não são reciclados podem ser destruídos. Deste modo, o tráfego endocítico pode causar o desaparecimento de G-CSF do meio extracelular, assim como a sub-regulação do receptor de G-CSF. De acordo com o exposto, seria benéfico alterar a estrutura de G-CSF de uma forma que retivesse a activação do própria do receptor para a transdução de sinal, mas que diminuísse a internalização endocítica e/ou aumentasse a selecção endossómica para a reciclagem em vez da degradação [Lauffenburger et al., Scratching The (Cell) Surface: Cytokine Engineering For Improved Ligand/Receptor Trafficking Dynamics, Chem & Biol 5: R257-R263 (1988)].

Deste modo, existe a necessidade de desenvolver melhores ligandos terapêuticos de G-CSF. Estes agentes deverão apresentar semi-vidas mais longas e induzir maior proliferação celular se o ligando não for tão propenso a endocitose e subsequente degradação lisossómica. De acordo com o exposto, é um objectivo 10 da presente invenção proporcionar estes ligandos e métodos para os produzir e testar.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Nesta invenção, descreve-se uma abordagem para melhorar a potência de G-CSF através de melhorias concebidas para o tráfego celular. Verificou-se que as substituições da presente invenção resultam em análogos de G-CSF possuindo um efeito no tráfego celular quando comparado com G-CSF de SEQ ID N°: 2 ou G-CSF recombinante, possuindo um residuo de metionina na posição-1 ("metG-CSF" ou "r-met-HuG-CSF"). A menos que seja aqui indicado, estas espécies são referidas colectivamente como "tipo selvagem". Os efeitos destas modificações demonstram vantagens na estabilidade e potência, que não são observadas em outras espécies de G-CSF. Em particular, estes análogos proporcionam uma resposta celular melhorada (actividade do tipo de agonista de G-CSF). Estas alterações na resposta celular ocorrem afectando a ligação ao receptor de G-CSF e/ou os processos de selecção, reciclagem e degradação através das vias de tráfego endocitico do ligando/receptor. A presente invenção refere-se a polipéptidos análogos a G-CSF humano que compreendem uma substituição de aminoácidos na sequência de SEQ ID N°: 2 seleccionada a partir do grupo consistindo em 1) uma substituição de ácido aspártico com histidina na posição número 109, [His109] G-CSF; 2) uma substituição de ácido aspártico com histidina na posição número 112, [His112] G-CSF; 3) uma substituição de glutamina com histidina na posição número 119; [His119] G-CSF; e 4) qualquer um dos referidos análogos de polipéptido incluindo, opcionalmente, 11 um resíduo metionilo N-terminal. Esses análogos podem ser derivados adicionalmente com um ou mais polímeros solúveis em água.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona polinucleótidos codificando polipéptidos análogos a G-CSF humano descritos acima. Polinucleótidos presentemente preferidos são apresentados nas sequências de ADN de SEQ ID NoS: 3, 5, ou 7 (e cadeias complementares) e incluem aquelas que codificam adicionalmente um resíduo metionilo N-terminal.

Ainda noutro aspecto, a invenção compreende uma construção de expressão contendo um polinucleótido como apresentado acima.

Além disso, a invenção proporciona uma célula hospedeira contendo um polinucleótido como apresentado acima. Células hospedeiras presentemente preferidas são seleccionadas a partir do grupo consistindo em bactérias, células de mamíferos, células tumorais, células de leveduras, e células de insectos.

Ainda noutro aspecto, a presente invenção proporciona um processo para produzir polipéptidos análogos a G-CSF [His109] G-CSF, [His112] G-CSF, [His119] G-CSF, e a espécie Met"1 deste, a partir de uma célula hospedeira contendo ácido nucleico codificando esses análogos, em que o referido processo compreende: cultivar a referida célula hospedeira contendo um polipéptido como apresentado acima em condições que facilitam a expressão desse polipéptido; e obter esse polipéptido análogo a G-CSF. A invenção também proporciona composições farmacêuticas compreendendo um polipéptido análogo de G-CSF, como apresentado 12 acima, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Estas composições podem ser empregues em métodos para tratar estados hematopoiéticos, neurológicos ou relacionados com reprodução compreendidos por administrar uma quantidade eficaz de uma composição como apresentado acima a um doente em necessidade deste. Essas condições incluem função hematopoiética reduzida, função imunitária reduzida, contagem de neutrófilos reduzida, mobilização de neutrófilo reduzida, mobilização de células progenitoras do sangue periférico, sepsia, neutropenia severa crónica, transplantes de medula óssea, doenças infecciosas, leucopenia, trombocitopenia, anemia, aumento de enxertia da medula óssea durante o transplante, aumento da recuperação da medula óssea no tratamento de aplasia da medula óssea induzida por radiação, produtos químicos ou quimioterapêutica, ou mielossupressão, e síndrome da deficiência imunitária adquirida.

Ainda noutro aspecto, a invenção proporciona um método de sensibilizar células à quimioterapêutica e radioterapêutica de administrar uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica, como apresentado acima, a um doente em necessidade desta. A invenção também proporciona um método para cultivar células hematopoiéticas in vitro compreendendo: colocar as referidas células num meio de cultura adequado, contendo o referido meio de cultura adequado um polipéptido análogo de G-CSF como apresentado acima; e proporcionando condições adequadas para o crescimento das referidas células hematopoiéticas. A invenção também proporciona um método como apresentado acima, em que o referido tratamento, sensibilização, ou cultivo 13 inclui a utilização de, pelo menos, um factor adicional seleccionado de entre EPO, G-CSF, SCF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, interleucinas, IGF-1, LIF, interferão, um factor neurotrófico, ligando flt-3/flk-2, e um factor de crescimento de fibroblasto. A invenção proporciona um kit correspondente contendo componentes para cultivar células hematopoiéticas compreendidas por: qualquer um dos análogos de polipéptido como apresentado acima; componentes adequados para preparar meio para cultivar células hematopoiéticas; e, opcionalmente, pelo menos, um factor adicional como apresentado acima.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Verificou-se que o G-CSF é útil no tratamento de vários estados em que um aumento nos neutrófilos irá proporcionar benefícios. Por exemplo, para doentes com cancro, o G-CSF é benéfico como um meio de estimular selectivamente a produção de neutrófilos para compensar défices hematopoiéticos resultantes de quimioterapêutica ou terapêutica por radiação. Outras indicações incluem o tratamento de várias doenças infecciosas e estados relacionados, tais como sepsia, que é tipicamente provocada por um metabolito de bactérias. 0 G-CSF é também útil isoladamente, ou em combinação com outros compostos, tais como outras citocinas, para crescimento ou expansão de células em cultura (por exemplo, para transplantes de medula óssea ou expansão ex vivo). 0 G-CSF foi administrado a doentes com transplante, como um adjunto a tratamento de infecção ou para tratamento de neutropenia. Todavia, é rapidamente eliminado através de endocitose mediada por receptor por neutrófilos 14 periféricos e células precursoras na medula óssea que expressam G-CSFR, e deste modo, a potência do fármaco é reduzida por este mecanismo de retroacção negativa. Porque as células naturalmente expressam G-CSFR em números baixos, a diminuição da afinidade endossómica do complexo pode não apenas reduzir a regulação negativa do receptor mas pode também aumentar a reciclagem do ligando, como previsto pela modulação. Deste modo, a potência fármaco G-CSF seria melhorada por mutações em G-CSF que iria aumentar as propriedades de tráfego. A presente invenção debruça-se sobre novos análogos de polipéptidos de G-CSF que apresentam vantagens na estabilidade que não se observam noutras espécies de G-CSF. Em particular, estes análogos proporcionam resposta celular aumentada (superagonista ou actividade de tipo agonista de G-CSF) em comparação com G-CSF de tipo selvagem. Essas alterações na resposta celular ocorrem afectando a ligação ao receptor de G-CSF e/ou os processos de escolha, reciclagem e degradação através das vias de tráfego endocitico do ligando/receptor.

Todas as alterações análogas da presente invenção são baseadas na sequência de 174 aminoácidos para G-CSF na SEQ ID N°: 2. Um especialista na técnica entenderá que os análogos da presente invenção também pode ser construídos com um resíduo de metionina N-terminal.

Os títulos das secções são aqui utilizados apenas para efeitos organizacionais, e não devem ser encarados de qualquer forma limitantes do objecto da matéria descrita. 15 A. Papel de G-CSF no Tratamento de Neutropenia

Verificou-se que o G-CSF é útil no tratamento de estados em que o aumento em neutrófilos irá proporcionar benefícios. Por exemplo, para doentes com cancro, o G-CSF é benéfico como um meio de estimular selectivamente a produção de neutrófilos para compensar défices hematopoiéticos resultantes de quimioterapêutica ou terapêutica por radiação. Outras indicações incluem o tratamento de várias doenças infecciosas e estados relacionados, tais como sepsia, que é tipicamente provocada por um metabolito de bactérias. 0 G-CSF é também útil isoladamente, ou em combinação com outros compostos, tais como outras citocinas, para crescimento ou expansão de células em cultura (por exemplo, para transplantes de medula óssea ou expansão ex vivo) . Foi administrado G-CSF a doentes com transplante como um adjunto para tratamento de infecção ou para tratamento de neutropenia [Diflo et al., Hepatology 16: PA278 (1992); Wright et al., Hepatology 14: PA48 (1991); Lachaux et al., J. Ped. 123: 1005-1008 (1993); Colquehoun et al., Transplantation 56: 755-758 (1993)] . O termo "neutropenia" refere-se a um estado com um número de neutrófilos anormalmente baixo na circulação periférica. O neutrófilo tem origem óssea e está totalmente maduro quando é libertado para a circulação. É então completamente preparado para funcionar no seu papel como a primeira linha de defesa celular. Torna-se activado, i. e., capaz de realizar muitas das suas funções, expondo-o a certos mediadores pró-inflamatórios e a factores quimiotácticos que o atraem para o local de um estímulo de incitação. A neutropenia severa pode ameaçar a vida, porque pode conduzir a infecções graves. 16

Alternativamente, o termo "neutrofilia" refere-se a um estado com um número de neutrófilos anormalmente elevado na circulação periférica. A neutrofilia, ou uma contagem de glóbulos brancos aumentada, tem muitas causas, incluindo exposição a frio extremo, calor, cirurgia recente, traumatismo físico, infecção de qualquer tipo, queimaduras, choques, tumores, inflamação não infecciosa, tais como gota, artrite, problemas da tiróide, e drogas. B. Análogos de G-CSF da Presente Invenção A presente invenção contempla a produção de análogos de polipéptidos de G-CSF de tipo selvagem e os seus polipéptidos codificados em que: 1) a histidina é substituída por ácido aspártico na posição 109, [His109] G-CSF; 2) a histidina é substituída por ácido aspártico na posição 112, [His112] G-CSF; e 3) a histidina é substituída por glutamina na posição 119, [His119] G-CSF, e a espécie Met-1 deste. As substituições acima estão de acordo com a numeração da SEQ ID N°: 2. As sequências de aminoácidos para estes três análogos podem ser encontradas nas SEQ ID Nos: 4, 6, e 8, respectivamente. A presente invenção contempla a produção de polipéptidos análogos de G-CSF humano que têm uma potência aumentada em relação ao G-CSF de tipo selvagem para estimular a proliferação celular, e semi-vidas aumentadas. Essas alterações na resposta celular ocorrem afectando ligação ao receptor de G-CSF e/ou os processos de escolha, reciclagem, e degradação através de vias de tráfego endocítico de ligando/receptor.

Estes análogos foram desenvolvidos por meio de um esquema geral, computacional para a concepção de ligandos, utilizando 17 que actuam como substituições únicas para a histidina, interruptores activados por pH para melhorar as suas propriedades de tráfego celular. A estratégia aqui descrita explora as diferenças de pH entre o meio extracelular e os compartimentos endossómicos como um interruptor para a protonação da histidina para reduzir a afinidade endossómica do complexo ligando-receptor, e isto é previsto aumentar a reciclagem de ligando intacto de volta para o meio extracelular. A selecção de residuos para a mutação para histidina foi guiada por considerações electrostáticas. A intenção foi de criar análogos de G-CSF que se iriam ligar a G-CSFR com afinidade próxima da (ou, se possivel, superior à) do tipo selvagem, para a histidina neutra, mas que se iriam ligar fracamente à histidina carregada positivamente. A pH acidico, a afinidade de ligação diminuiria desse até pH neutro à custa de desprotonação da histidina em G-CSF não ligado [Yang e Honig, J. Mol. Biol. 231:459-474 (1993)]. Se o pKa da histidina na proteína não ligada foi 6,5 [Tanokura, Biochim. Biophys. Acta. 742: 576-585 (1982)], isto resultaria em afinidade 10 vezes mais baixa a pH 5,5.

As mutações de histidina candidatas foram identificadas por um processo de três partes in silico. Primeiro, a natureza das interacções de ligação electrostática foi quantificada utilizando um método [Kangas e Tidor, J. Chem. Phys. 109: 7522-7545 (1998)] que explicitamente explica a desolvatação e interacção do ligando e localiza regiões na interface que são um pouco demasiado negativas ou demasiado positivas para a ligação óptima. Segundo, análogos de G-CSF de histidina de ensaio (quer neutras como carregadas positivamente) foram 18 construídos e a energia minimizada. Terceiro, a energia livre de ligação electrostática de cada foi computacionada. 0 conceito aqui detalhado envolve novos mutantes de G-CSF que foram escolhidos racionalmente. A estrutura cristalina do complexo entre G-CSF e o seu receptor, G-CSFR, foi utilizada para calcular o potencial electrostático líquido na interface de ligação principal entre ligando e receptor. Os resíduos de aminoácido no G-CSF que contribuíram para o potencial electrostático residual líquido foram seleccionados como candidatos pata mutagénese. A predominância de regiões excessivamente negativas indica densidade de carga negativa excessiva, incluindo localizações correspondendo aos resíduos carregados Glu19, Asp109, e Asp112, bem como os resíduos polares Gin20, Thr116, e Gin119, indicando que existe densidade de carga positiva insuficiente do receptor. As contribuições electrostáticas para a ligação podem ser aumentadas com carga negativa diminuída no ligando nestes seis sítios; a histidina neutra pode ser tolerada no complexo, mas a histidina carregada positivamente pode repelir a densidade de carga positiva do receptor. Para testar estes sítios, foram construídos mutantes de histidina individuais computacionalmente nos resíduos identificados.

Utilizando a estrutura cristalográfica tridimensional do complexo entre G-CSF e o seu receptor (G-CSFR) pode ser calculado o potencial electrostático líquido na interface de ligação principal entre ligando e receptor. Ver Patente US N° 5581476 (aqui incorporada por referência); Aritomi et al., Nature 401(6754): 713-718 (1999). Os resíduos de aminoácidos em G-CSF que contribuíram com potencial electrostático líquido residual foram seleccionados como candidatos para mutagénese. 19

Foram identificados seis desses resíduos em G-CSF: Asp112, Asp109, Gin119, Gin20, Thr116 e Glu19. Em particular, três das substituições de histidina únicas propostas foram realizadas e testadas: Asp109His ( [His109] G-CSF) , Asp112His ( [His112] G-CSF) , e Gln119His ( [His119] G-CSF) (utilizando a numeração de SEQ ID N°: 2 com a metionina em -1). A fundamentação para a mutagénese da histidina do G-CSF foi afectar o tráfego celular de G-CSF e/ou G-CSFR. Após ligação a G-CSFR na superfície de uma célula, o G-CSF é internalizado numa célula e é realizada uma decisão de escolha em vesículas endossómicas. Os componentes do complexo podem ser degradados nos lisossomas ou reciclados de volta para a superfície intactos. É conhecido em muitos outros sistemas ligando/receptor que quando o ligando e receptor permanecem em complexo, eles são, de um modo preferido, degradados; todavia, se o complexo se dissocia nos endossomas, há reciclagem aumentada do ligando e/ou do receptor. Na superfície celular, o pH do ambiente é aproximadamente 7,0; nos endossomas, o pH é de cerca de 5,0-6,0. Uma vez que o aminoácido histidina é o único resíduo que se espera que titule neste intervalo de pH, espera-se que a substituição de histidina afecte as propriedades do tráfego celular. Mais especificamente, mutantes de histidina únicos alteram as propriedades de tráfego com base nas diferenças na energia livre de ligação electrostática a pH 7,0 versus pH 5,0, devido unicamente à protonação da histidina mutada a pH 5,0.

Especificamente contemplada pela presente invenção é a mutagénese dirigida de sequências de ADN genómico, ADNc, e sequências de ADN sintético de pol ipéptido G-CSF de tipo selvagem. Presentemente, sequências de polinucleótido preferidas da invenção incluem as sequências de ADN de SEQ ID N°: 3 20 [His109] G-CSF; SEQ ID N°: 5 [His112] G-CSF; SEQ ID N°: 7 [His119]G-CSF; e a espécie Met-1 destes. Estas sequências de ADN também podem ser modificadas para codificar outra versão de G-CSF possuindo, pelo menos, uma das propriedades biológicas hematopoiéticas de G-CSF humano que ocorre naturalmente. De um modo preferido, a propriedade biológica é a propriedade de ligação a um receptor de G-CSF, mas outra propriedade biológica é a capacidade de estimular a proliferação de células hematopoiéticas. Outras propriedades biológicas serão óbvias para os especialistas na técnica (Ver, também, Souza, supra).

Estas sequências de ADN podem incorporar codões que facilitam a transcrição e tradução de ARNm em hospedeiros microbianos. Essas sequências fabricadas podem ser construídas rapidamente de acordo com os métodos bem conhecidos na técnica. Ver, também, Alton et al., Pedido de PCT publicado WO 83/04053. Os ADNs acima também podem codificar opcionalmente um resíduo metionilo N-terminal.

As sequências de ADN proporcionadas pela invenção são úteis na criação de novos e úteis vectores de ADN virai e plasmídico, novas e úteis células hospedeiras procariotas e eucariotas transformadas e transfectadas (incluindo células bacterianas, de levedura, e de mamífero crescidas em cultura), e novos e úteis métodos novos e úteis para o crescimento em cultura dessas células hospedeiras capazes de expressão dos presentes análogos de G-CSF. As sequências de ADN codificando análogos de G-CSF aqui biologicamente activos (ou ARNs correspondentes) podem ser úteis para terapia génica nos casos em que a subproduçao de G-CSF deve ser aliviada, ou de necessidade de níveis incrementados de G-CSF. 21 A presente invenção também proporciona processos para a produção de ADN recombinante dos presentes análogos de G-CSF. É proporcionado um processo para produzir os análogos de G-CSF de uma célula hospedeira contendo ácido nucleico codificando esses análogos compreendidos por a) cultura da referida célula hospedeira contendo ácido nucleico codificando esses análogos de G-CSF em condições que facilitam a expressão dessa molécula de ADN; e b) obter esses análogos de G-CSF.

Pode, opcionalmente purificar-se e isolar-se esses análogos de G-CSF a partir de outros componentes obtidos no processo. Métodos para purificar podem ser encontrados na Patente US N° 5849883. São conhecidos outros métodos bem conhecidos na técnica (Ver, também, Souza, supra).

As células hospedeiras podem ser procariotas ou eucariotas e incluir bactérias, células de mamiferos (tais como células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), células de macacos, células de rim de hamster bebé, células de cancro ou outras células), células de leveduras, e células de insectos. Para maior facilidade na produção comercial é preferido utilizar uma célula hospedeira bacteriana. C. Produção de Proteina

Dada a descrição acima de polipéptidos análogos a G-CSF humano, será possível, para um especialista na técnica, produzir polipéptidos análogos a G-CSF humano através de síntese automatizada de péptidos, por técnicas recombinantes ou ambas. 22

Os análogos de G-CSF-humano da invenção podem ser sintetizados em solução ou num suporte sólido, de acordo com técnicas convencionais. Vários sintetizadores automáticos estão comercialmente disponíveis e podem ser utilizados de acordo com protocolos conhecidos. Ver, por exemplo, Stewart e Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2a. ed., Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 6442 (1983); Merrifield, Science 232: 341-347 (1986); e Barany e Merrifield, The Peptides, Gross e Meienhofer (eds.), Academic Press, Nova Iorque, 1-284 (1979). A proteína activa pode ser rapidamente sintetizada e depois rastreada em ensaios de rastreio concebidos para identificar péptidos reactivos.

Alternativamente, podem ser utilizados uma variedade de sistemas de vector de expressão/hospedeiro para conter e expressar uma sequência codificando o análogo de G-CSF humano. Estes incluem, mas não estão limitados a microrganismos, tais como bactérias transformadas com vectores de expressão de ADN de bacteriófago, plasmídeo ou cosmídeo recombinantes; leveduras transformadas com vectores de expressão de levedura; sistemas de células de insecto infectadas com vectores de expressão de vírus (e. g., baculovírus); sistemas de células vegetais transfectadas com vectores de expressão de vírus (e. g. , vírus do mosaico da couve flor, CaMV; vírus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vectores de expressão bacterianos (e. g·, plasmídeo Ti ou pBR322); ou sistemas de células animais. Células de mamíferos que são úteis em produções de proteína recombinante incluem, mas não estão limitados a células VERO, células HeLa, linhas de células de ovário de hamster Chinês (CHO), células COS (tais como COS-7), células W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 e 293. Protocolos exemplificativos para a expressão recombinante da proteína são aqui descritos abaixo. 23

Pode ser empregue um sistema de leveduras para gerar os análogos de G-CSF-humano da presente invenção. A região codificante do ADNc do análogo de G-CSF humano é amplificado por PCR. Um ADN codificando a sequência lider pré-pro-alfa de levedura é amplificada a partir de ADN genómico de levedura numa reacção de PCR utilizando um iniciador contendo os nucleótidos 1-20 do gene do factor de cruzamento alfa e outro iniciador complementar aos nucleótidos 255-235 deste gene [Kurjan e Herskowitz, Cell 30: 933-943 (1982)]. A sequência codificante lider pré-pro-alfa e os fragmentos da sequência codificante do análogo de G-CSF humano estão ligados ao plasmideo contendo o promotor da álcool desidrogenase de levedura (ADH2), de modo a que o promotor dirige a expressão de uma proteina de fusão consistindo no factor pré-pro-alfa fundido com o polipéptido do análogo de G-CSF humano madura. Como ensinado por Rose e Broach [Meth. Enz. 185: 234-279, Goeddel (ed.), Academic Press, Inc.,

San Diego, CA (1990)], o vector inclui ainda um terminador de transcrição de ADH2 a jusante do sitio de clonagem, uma origem de replicaçao "2-micron" de levedura, o gene leu-2d de levedura, os genes REP1 e REP2 de levedura, o gene da beta-lactamase de E. coli, e uma origem de replicação de E. coli. Os genes da beta-lactamase e de leu-2d proporcionam a selecção em bactérias e leveduras, respectivamente. O gene de leu-2d também facilita o aumento do número de cópias do plasmideo em leveduras para induzir níveis de expressão elevados. Os genes REP1 e REP2 codificam proteínas envolvidas na regulação do número de cópias do plasmideo. A construção de ADN descrita no parágrafo anterior é transformada em células de leveduras utilizando um método conhecido, e. g., tratamento com acetato de lítio [Stearns et 24 al., Meth. Enz. 185:280-297 (1990)]. O promotor de ADH2 é induzido após exaustão da glucose no meio de crescimento [Price et al., Gene 55:287 (1987)]. A sequência pré-pro-alfa realiza a secreção da proteína de fusão das células. Concomitantemente, a proteína KEX2 de levedura cliva a sequência pré-pro dos análogos de G-CSF humano maduro [Bitter et. al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 5330-5334 (1984)].

Alternativamente, os análogos de G-CSF humano podem ser expressos recombinantemente em leveduras, utilizando um sistema de expressão disponível comercialmente, e. g., o Pichia

Expression System (Invitrogen, San Diego, CA), seguindo as instruções do fabricante. Este sistema também se baseia na sequência pré-pro-alfa para secreção directa, mas a transcrição da inserção é dirigida pelo promotor da álcool oxidase (AOX1) após indução por metanol. O análogo de G-CSF humano secretado é purificado do meio de cultura das leveduras através de, e. g., os métodos utilizados para purificar o análogo de G-CSF humano dos sobrenadantes de células bacterianas e de mamífero.

Alternativamente, o ADNc codificando análogos de G-CSF humano pode ser clonado no vector de expressão de baculovírus pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA). Este vector contendo análogo de G-CSF humano é então utilizado de acordo com as instruções do fabricante (PharMingen) para infectar células de Spodoptera frugíperda em meio sem proteína sF9 e para produzir proteína recombinante. A proteína é purificada e concentrada no meio utilizando uma coluna de heparina-Sepharose (Pharmacia, Piscataway, NJ) e colunas de exclusão de tamanho molecular sequencial (Amicon, Beverly, MA), e ressuspensa em PBS. A 25 análise por SDS-PAGE apresenta uma banda única e confirma o tamanho da proteina, e a sequenciação de Edman num Sequenciador de Péptidos Proton 2090 confirma a sua sequência N-terminal.

Alternativamente, os análogos de G-CSF humano podem ser expressos num sistema de insecto. Os sistemas de insecto para expressão de proteina são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Num desses sistemas, é utilizado o vírus da poliedrose nuclear Autographa californica (AcNPV) como um vector para expressar genes estranhos em células de Spodoptera frugiperda ou em larvas de Trichoplusia. A sequência codificante do análogo de G-CSF humano é clonada numa região não essencial do virus, tal como o gene da poliedrina, e colocada sob controlo do promotor da poliedrina. A inserção bem sucedida do análogo de G-CSF humano irá tornar o gene da poliedrina inactivo e produzir virus recombinante sem revestimento de proteina da capa. Os virus recombinante também são utilizados para infectar células de S. frugiperda ou larvas de Trichoplusia, nas quais o análogo de G-CSF humano é expresso [Smith et al., J. Virol. 46: 584 (1983);

Engelhard EK et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 3224-7 (1994)] .

Noutro exemplo, a sequência de ADN codificando a forma madura da proteina é amplificada por PCR e clonada num vector apropriado, por exemplo, pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, NJ) . O vector pGEX é concebido para produzir uma proteina de fusão compreendendo glutationa-S-transferase (GST), codificada pelo vector, e uma proteina codificada por um fragmento de ADN inserido no sitio de clonagem do vector. Os iniciadores para a PCR podem ser criados de modo a incluir, por exemplo, um sitio de clivagem apropriado. 26 A proteína de fusão recombinante pode ser então clivada da porção GST da proteína de fusão. A construção pGEX-3X/análogo de G-CSF humano é transformada em células de E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla CA) , e os transformantes individuais são isolados e cultivados. 0 ADN plasmídico de transformantes individuais é purificado e parcialmente sequenciado utilizando um sequenciador automatizado para confirmar a presença da inserção do gene codificando o análogo de G-CSF humano desejado, na orientação apropriada.

Embora certas formas de realização da presente invenção contemplem a produção da proteína do análogo de G-CSF humano utilizando sintetizadores de péptidos sintéticos e subsequente análise por FPLC e redobragem apropriada das ligações duplas de cisteína, está contemplado que a produção de proteína recombinante também pode ser utilizada para produzir as composições de péptido análogo de G-CSF humano. Por exemplo, a indução da proteína de fusão GST/análogo de G-CSF humano é alcançada cultivando a cultura de XL-1 Blue transformada a 37 °C em meio LB (suplementado com carbenicilina) até uma densidade óptica a um comprimento de onda de 600 nm de 0,4, seguido por outra incubação durante 4 horas na presença de Isopropil β-D-Tiogalactopiranósido a 0,5 mM (Sigma Chemical Co., St. Louis MO) . A proteína de fusão que, se espera que seja produzida como um corpo de inclusão insolúvel na bactéria, pode ser purificada como se segue. As células são recolhidas por centrifugação; lavadas em NaCl a 0,15 M, Tris a 10 mM, pH 8, EDTA a 1 mM; e tratadas com lisozima a 0,1 mg/mL (Sigma Chemical Co.) durante 15 min. à temperatura ambiente. O lisado é clarificado por sonicação, e os resíduos celulares são sedimentados por 27 centrifugação durante 10 min. a 12000 X g. O sedimento contendo a proteina de fusão é ressuspenso em Tris a 50 mM, pH 8, e EDTA a 10 mM, coberto por uma camada de glicerol a 50%, e centrifugado durante 30 min. a 6000 X g. O sedimento é ressuspenso em solução salina tamponada com fosfato (PBS) sem Mg++ e Ca++. A proteina de fusão é ainda purificada friccionando o sedimento ressuspenso num gel desnaturante de poliacrilamida com SDS (Sambrook et al.r supra) . O gel é embebido em KC1 a 0,4 M para visualizar a proteina, que é excisada e electroeluida em tampão que corre pelo gel sem SDS. Se a proteina de fusão GST/análogo de G-CSF humano é produzida em bactérias como uma proteina solúvel, pode ser purificada utilizando o GST Purificação Module (Pharmacia Biotech). A proteina de fusão pode ser sujeita a digestão para clivar o GST da proteina do análogo de G-CSF humano maduro. A reacção de digestão (20-40 pg proteina de fusão, 20-30 unidades de trombina humana [4000 U/mg (Sigma) em 0,5 mL de PBS] é incubada 16-48 h à temperatura ambiente e aplicada num gel desnaturante de SDS-PAGE para fraccionar os produtos de reacção. O gel é embebido em KC1 a 0,4 M para visualizar as bandas de proteina. A identidade da banda de proteina correspondente ao peso molecular esperado do análogo de G-CSF humano pode ser confirmado por análise da sequência de aminoácidos parcial utilizando um sequenciador automatizado (Applied Biosystems Model 473A, Foster City, CA).

Alternativamente, a sequência de ADN codificando a proteina madura do análogo de G-CSF humano prevista pode ser clonada num plasmideo contendo um promotor desejado e, opcionalmente, uma sequência lider [ver, e. g., Better et al., Science 240: 1041-43 (1988)]. A sequência desta construção pode ser confirmada por 28 sequenciação automatizada. 0 plasmídeo é então transformado em E. coli, estirpe MC1061, utilizando processos convencionais empregando incubação com CaCÍ2 e tratamento das bactérias com choque térmico (Sambrook et al., supra). As bactérias transformadas são cultivadas em meio LB suplementado com carbenicilina, e a produção da proteina expressa é induzida através de crescimento num meio adequado. Se presente, a sequência lider irá afectar a secreção do análogo maduro da proteina G-CSF humano e será clivado durante a secreção. A proteina recombinante secretada é purificada do meio de cultura bacteriano pelo método aqui descrito abaixo.

Também são bem conhecidos dos especialistas na técnica, sistemas de hospedeiro de mamífero para uma expressão da proteína recombinante. As estirpes da célula hospedeira podem ser seleccionadas para uma capacidade particular para processar a proteína expressa ou produzir certas modificações de pós-tradução que serão úteis em proporcionar a actividade da proteína. Essas modificações do polipéptido incluem, mas não estão limitadas a, acetilação, carboxilação, glicosilação, fosforilação, lipidação e acilação. 0 processamento pós-tradução, que cliva uma forma "prepro" da proteína, também pode ser importante para inserção correcta, dobragem e/ou função. Células hospedeiras diferentes, tais como CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, e semelhantes, possuem maquinaria celular específica e mecanismos característicos para essas actividades de pós-tradução, e pode ser escolhido para assegurar a modificação correcta e o processamento da proteína estranha introduzida.

Num método particularmente preferido de expressão recombinante das proteínas do análogo de G-CSF humano da 29 presente invenção, células 293 são co-transfectadas com plasmideos contendo o ADNc do análogo de G-CSF humano no vector pCMV (promotor de CMV a 5' , sequência poli A de HGH a 3' ) e pSV2neo (contendo o gene de resistência a neo) pelo método do fosfato de cálcio. De um modo preferido, os vectores devem ser linearizados com Seal antes da transfecçao. De forma semelhante, pode ser utilizada uma construção alternativa utilizando um vector pCMV semelhante com o gene neo incorporado. Linhas celulares estáveis são seleccionadas de clones de células isoladas por diluição limitante em meio de cultura contendo G418 a 0,5 mg/mL (antibiótico do tipo neomicina) durante 10-14 dias. As linhas celulares são rastreadas para expressão do análogo de G-CSF humano através de ELISA ou transferência de Western, e as linhas celulares de expressão elevada são expandidas para cultura em larga escala. É preferido que as células transformadas sejam utilizadas para produção de proteina em rendimento elevado a longo termo e, como tal, a expressão estável é desejável. Uma vez que essas células são transformadas com vectores que contêm marcadores seleccionáveis juntamente com a cassete de expressão desejada, as células podem ser deixadas a crescer durante 1-2 dias num meio enriquecido antes de serem transferidos para meio selectivo. O marcador seleccionável é concebido para conferir resistência à selecção, e a sua presença permite o cultivo e a recuperação de células que expressam com sucesso as sequências introduzidas. Os grupos resistentes de células transformadas de forma estável podem ser proliferados utilizando técnicas de cultura de tecidos apropriadas para a célula.

Pode ser utilizado um número de sistemas de selecção para recuperar as células que foram transformadas para produção de 30 proteína recombinante. Esses sistemas de selecção incluem, mas não estão limitados a, genes de cinase da timidina de HSV, fosforribosiltransferase de hipoxantina-guanina e fosforribosiltransferase de adenina, em células tk-, hgprt- ou aprt-, respectivamente. Também, a resistência anti-metabolito pode ser utilizada como a base de selecção para dhfr, que confere resistência a metotrexato; gpt, que confere resistência a ácido micofenólico; neo, que confere resistência ao aminoglicósido, G418; também, que confere resistência a clorossulfurona; e hygro, que confere resistência a higromicina. Genes seleccionáveis adicionais que podem ser úteis incluem trpB, que permitem que as células utilizem indole em vez de triptofano, ou hisD, que permite que as células utilizem histinol em vez de histidina. Os marcadores que dão uma indicação visual para identificação de transformantes incluem antocianinas, β-glucuronidase e o seu substrato, GUS, e luciferase e o seu substrato, luciferina. D. Purificação de Proteína

Será desejável purificar as proteínas do análogo de G-CSF humano criadas pela presente invenção. Técnicas de purificação de proteína são bem conhecidas dos especialistas na técnica. Estas técnicas envolvem, a um nível, o fraccionamento bruto do meio celular para as fracções de polipéptido e não polipéptido. polipéptido de interesse pode ser ainda purificado utilizando técnicas cromatográficas e electroforéticas para alcançar purificação parcial ou completa (ou purificação até à homogeneidade). Métodos analíticos particularmente adequados para a preparação de um péptido puro são cromatografia de permuta iónica, cromatografia de exclusão, electroforese em gel 31

Um método de poliacrilamida, e focagem isoeléctrica. particularmente eficiente de purificar péptidos é cromatografia liquida rápida de proteína, ou mesmo HPLC.

Certos aspectos da presente invenção referem-se a purificação e, em formas de realização particulares, a purificação substancial, de uma proteina ou péptido codificado. 0 termo "proteina ou péptido purificado", como aqui utilizado, pretende referir-se a uma composição, isolável de outros componentes, em que a proteina ou péptido é purificado até qualquer grau em relação ao seu estado que se obtém naturalmente. A proteina ou péptido purificado consequentemente também se refere a uma proteina ou péptido, livre do ambiente em que pode ocorrer naturalmente.

Geralmente, "purificado" refere-se a uma composição de proteina ou péptido que foi sujeito a fraccionamento para remover vários outros componentes, e cuja composição retém substancialmente a sua actividade biológica expressa. Quando o termo "substancialmente purificado" é utilizado, esta designação refere-se a uma composição em que a proteina ou péptido forma o componente principal da composição, tal como constituindo cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 95% ou mais das proteínas na composição. Vários métodos para quantificar o grau de purificação da proteína ou péptido serão conhecidos dos especialistas na técnica à luz da presente revelação. Estes incluem, por exemplo, determinar a actividade específica de uma fracção activa, ou avaliar a quantidade de polipéptido na fracção por análise de SDS/PAGE. Um método preferido para avaliar a pureza de uma fracção é calcular a actividade específica da fracção, para a 32 comparar com a actividade específica do extracto inicial, e para calcular assim o grau de pureza, aqui avaliados por um "número de vezes de purificação". As unidades actuais utilizadas para representar a quantidade de actividade irá, obviamente, depender da técnica de ensaio particular seleccionada para seguir a purificação, e se a proteína ou péptido expresso exibe ou não uma actividade detectável. Várias técnicas adequadas para utilização na purificação de proteína serão bem conhecidas dos especialistas na técnica. Estas incluem, por exemplo, precipitação com sulfato de amónia, PEG, anticorpos, e semelhantes; desnaturação por calor, seguido por centrifugação; passos de cromatografia, tais como cromatografia de permuta iónica, filtração por gel, fase reversa, hidroxilapatite e de afinidade; focagem isoeléctrica; electroforese em gel; e combinações dessas e de outras técnicas. Como é geralmente conhecido na técnica, crê-se que a ordem de conduzir os vários passos de purificação pode ser alterada, ou que certos passos podem ser omitidos, e ainda assim resultar num método adequado para a preparação de uma proteína ou péptido substancialmente purificado. Não existe um requisito geral de que a proteína ou péptido seja sempre fornecida no seu estado purificado. Na verdade, está contemplado que produtos substancialmente menos purificados tenham utilidade em certas formas de realização. A purificação parcial pode ser conseguida utilizando menos passos de purificação em combinação, ou utilizando diferentes formas do mesmo esquema de purificação geral. Por exemplo, é apreciado que uma cromatografia de permuta catiónica em coluna realizada, utilizando um dispositivo de HPLC, resultará geralmente numa purificação maior em "vezes" do que a mesma técnica utilizando 33 um sistema de cromatografia de baixa pressão. Métodos apresentando um grau de purificação relativa mais baixo podem ter vantagens na recuperação total do produto de proteina, ou na manutenção da actividade de uma proteina expressa. É conhecido que a migração de um polipéptido pode variar, por vezes significativamente, com diferentes condições de SDS/PAGE [Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 76: 425 (1977) ] . Será por isso apreciado que, em condições de electroforese diferentes, os pesos moleculares aparentes dos produtos de expressão purificados ou parcialmente purificados podem variar.

Pode purificar-se opcionalmente e isolar os análogos de G-CSF de outros componentes obtidos no processo. Métodos para purificar podem ser encontrados na Patente US N° 5849883. Outros métodos são bem conhecidos na técnica (Ver, também, Souza, supra, cada um aqui incorporado por referência).

Estes documentos descrevem métodos exemplificativos específicos para o isolamento e purificação de composições de G-CSF que podem ser úteis no isolamento e purificação dos análogos de G-CSF da presente invenção. Dada a revelação destas patentes, é evidente que um especialista na técnica estaria bem ciente das numerosas técnicas de purificação que podem ser utilizadas para purificar G-CSF a partir de uma dada fonte.

Também está contemplado que pode ser empregue uma combinação de cromatografia de permuta aniónica e imunoafinidade para produzir composições de análogo de G-CSF purificada da presente invenção. 34 E. Vectores para Clonagem, Transferência e Expressão de

Genes

Como discutido na secção anterior, são empregues vectores de expressão para expressar o análogo do produto polipéptido de G-CSF humano, que pode ser então purificado e utilizado para o tratamento de neutropenia. Noutras formas de realização, podem ser utilizados vectores de expressão em aplicações de terapia génica para introduzir os ácidos nucleicos que codificam análogos de G-CSF-humano em células em necessidade deste e/ou para induzir a expressão do análogo de G-CSF humano nessas células. A presente secção está dirigida a uma descrição da produção desses vectores de expressão. A expressão requer que sejam proporcionados sinais apropriados nos vectores, que incluem vários elementos de regulação, tais como intensificadores/promotores tanto de fontes virais como de mamífero que conduzem a expressão dos genes de interesse em células hospedeiras. Elementos destinados a optimizar a estabilidade e capacidade de tradução do ARN mensageiro mas células hospedeiras também são descritos. Também são fornecidas as condições para a utilização de um número de marcadores de selecção de fármaco dominantes para estabelecer clones de células estáveis permanentes, que expressam os produtos, como é um elemento que liga a expressão dos marcadores de selecção do fármaco à expressão do polipéptido. 35 a. Elementos Reguladores

Promotores e Intensificadores. Ao longo desta aplicação, o termo "construção de expressão" ou "vector de expressão" pretende incluir qualquer tipo de construção genética contendo um ácido nucleico codificando para produtos de genes em que parte ou todo a sequência do ácido nucleico codificante é capaz de ser transcrita. 0 transcrito pode ser traduzido numa proteína, mas não precisa de o ser. Em certas formas de realização, a expressão inclui quer a transcrição de um gene como a tradução do ARNm num produto de gene. 0 ácido nucleico codificando um produto de gene está sob controlo de transcrição de um promotor. Um "promotor" refere-se a uma sequência de ADN reconhecida pela maquinaria sintética da célula, ou maquinaria sintética introduzida, necessária para iniciar a transcrição específica de um gene. A frase "sob controlo de transcrição" significa que o promotor está na localização e orientação correctas em relação ao ácido nucleico para controlar a iniciação da polimerase de ARN e expressão do gene. 0 termo "promotor" será aqui utilizado para se referir a um grupo de módulos de controlo de transcrição que estão agrupados à volta do sítio de iniciação para a polimerase de ARN II. Muito do pensamento sobre o modo como os promotores estão organizados deriva das análises de vários promotores virais, incluindo aqueles para as unidades de transcrição de cinase de timidina de HSV (tk) e SV40. Estes estudos, aumentados por trabalho mais recente, demonstraram que os promotores são compostos por módulos funcionais discretos, cada um consistindo em aproximadamente 7-20 pb de ADN, e contendo um ou mais sítios de reconhecimento para proteínas activadoras ou repressoras de transcrição. 36

Pelo menos um módulo em cada promotor funciona para posicionar o sítio do início para a síntese de ARN. 0 exemplo mais bem conhecido deste é a caixa TATA, mas em alguns promotores sem uma caixa TATA, tais como o promotor para o gene da transferase de desoxinucleotidilo terminal de mamífero e o promotor para os genes tardios de SV40, um elemento discreto sobrepondo-se ao próprio sítio ajuda a fixar o local de iniciação.

Elementos de promotor adicionais regulam a frequência da iniciação de transcrição. Tipicamente, estes estão localizados na região 30-110 pb a montante do sítio de iniciação, embora tenha sido demonstrado recentemente que um número de promotores contenha elementos funcionais também a jusante do sítio de iniciação. O espaçamento entre elementos promotores é frequentemente flexível, de modo a que a função de promotor seja preservada quando os elementos são invertidos ou movidos um em relação ao outro. No promotor tk, o espaçamento entre os elementos promotores pode ser aumentado para 50 pb de distância antes de a actividade começar a diminuir. Dependendo do promotor, parece que os elementos individuais podem funcionar quer co-operacionalmente como independentemente para activar a transcrição. Não se crê que o promotor particular empregue para controlar a expressão de uma sequência de ácido nucleico de interesse seja importante, desde que seja capaz de dirigir a expressão do ácido nucleico na célula alvo. Deste modo, quando uma célula humana é tornado alvo, é preferido posicionar região do ácido nucleico codificante adjacente a e sob o controlo de um promotor que é 37 capaz de ser expresso numa célula humana. De um modo geral, um tal promotor pode incluir um promotor quer humano ou virai.

Em várias formas de realização, o promotor do gene precoce imediato de citomegalovirus humano (CMV), o promotor precoce de SV40, a repetição terminal longa do virus do sarcoma de Rous, p-actina, promotor da insulina de rato, o promotor da cinase de fosfoglicerol, e o promotor da desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato, sendo todos promotores bem conhecidos e prontamente disponiveis dos especialistas na técnica, podem ser utilizados para obter expressão de nível elevado da sequência codificante de interesse. A utilização de outros promotores virais ou de células de mamíferos ou de fagos bacterianos que são bem conhecidos na técnica para alcançar a expressão de uma sequência codificante de interesse também está contemplada, desde que os níveis de expressão sejam suficientes para um dado objectivo. Empregando um promotor com propriedades bem conhecidas, o nivel e padrão e expressão da proteína de interesse após transfecção ou transformação pode ser optimizado. A selecção de um promotor que é regulado em resposta a sinais fisiológicos ou sintéticos específicos pode permitir a expressão indutivel do produto genético. Vários sistemas de promotores indutíveis estão disponiveis para a produção de vectores virais. Um desses sistemas é o sistema ecdysone (Invitrogen, Carlsbad, CA) , que é concebido para permitir expressão regulada de um gene de interesse em células mamíferos. Este consiste num mecanismo de expressão firmemente regulado que não permite virtualmente nenhum nível basal de expressão do transgene, mas indutibilidade de mais de 200 vezes. 38

Outro sistema indutível que seria útil é o sistema Tet-Off™ ou Tet-On™ (Clontech, Paio Alto, CA), originalmente desenvolvido por Gossen e Bujard [Gossen e Bujard, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 15; 89 (12): 5547-51 (1992); Gossen et al., Science 268 (5218): 1766-9 (1995)].

Em alguns casos, pode ser desejável regular a expressão de um transgene num vector de terapia génica. Por exemplo, promotores virais diferentes com forças de actividade variáveis podem ser utilizados dependendo do nivel de expressão desejada. Nas células de mamíferos, o promotor precoce imediato de CMV é frequentemente utilizado para proporcionar forte activação de transcrição. As versões modificadas do promotor de CMV que são menos potentes também foram utilizadas quando são desejados niveis de expressão reduzidos do transgene. Quando é desejada a expressão de um transgene em células hematopoéticas, são frequentemente utilizados os promotores retrovirais, tais como os LTRs de MLV ou MMTV. Outros promotores virais que também podem ser utilizados dependendo do efeito desejado incluem SV40, RSV LTR, HIV-1 e HIV-2 LTR, promotores de adenovirus, tais como da região EI A, E2A, ou MLP, AAV LTR, virus do mosaico da couve-flor, HSV-TK, e virus do sarcoma de aves.

De modo semelhante, os promotores específicos para o tecido podem ser utilizados para realizar a transcrição em tecidos específicos ou células, de modo a reduzir a toxicidade potencial ou efeitos indesejados para tecidos não constituídos alvos. Por exemplo, promotores tais como a PSA, probasina, fosfatase do ácido prostático, ou a calicreína glandular específica para a próstata (hK2) podem ser utilizados para direccionar a expressão genética na próstata. 39

Em certas indicações, pode ser desejável activar a transcrição em tempos específicos após a administração do vector da terapia génica. Isto pode ser realizado com promotores tais como aqueles que são reguláveis por hormona ou citocina. Por exemplo, em aplicações de terapia génica em que a indicação é um tecido de gónadas em que os esteróides específicos são produzidos ou direccionados para, utilização de promotores regulados por androgénio ou estrogénio podem ser vantajosos. Os promotores que são reguláveis por hormonas incluem MMTV, MT-1, ecdysone, e RuBisco. Outros promotores regulados por hormonas, tais como que respondem a hormonas da tiróide, pituitária, e supra-renais, são provavelmente úteis na presente invenção. Promotores de resposta a citocina e proteina inflamatória que podem ser utilizados incluem Quininogénio K e T [Kageyama et al., J. Biol. Chem. 262 (5): 2345-51 (1987)], c-fos, TNF-alfa, proteina C-reactiva [Arcone et al., Nucleic Acids Res. 16 (8): 3195-207 (1988)], haptoglobina [Oliviero et al., EMBO J. 6 (7): 1905-12 (1987)], A2 amilóide do soro, C/EBP alfa, IL-1, IL-6 [Poli e Cortese, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (21): 8202-6 (1989)], complement C3 [Wilson et al., Mol. Cell. Biol. 10(12): 6181-91 (1990)], IL-8, glicoproteina do ácido alfa-1 [Prowse e Baumann, Mol. Cell. Biol. 8 (1): 42-51 (1988)], antitripsina alfa-1, lipase de lipoproteina [Zechner et al., Mol. Cell. Biol. 8(6): 2394-401 (1988)], angiotensinogénio [Ron et al., Mol. Cell. Biol. 11(5): 2887-95 (1991)], fibrinogénio, c-jun (indutivel por ésteres de forbol, TNF-alfa, radiação UV, ácido retinóico, e peróxido de hidrogénio), colagenase (induzida por ésteres de forbol e ácido retinóico), metalotioneina (indutivel por metal pesado e glucocorticóide), estromelisina (indutivel por éster de forbol, interleucina-1 e EGF), alfa-2 macroglobulina e alfa-1 antiquimiotripsina. 40

Outros promotores que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção incluem promotores reguláveis por Lac, indutiveis por calor (hipertermia) , e indutiveis por radiação, e. g., EGR [Joki et al., Hum. Gene Ther. 6(12):1507-13 (1995)], alfa-inibina, met de ATNt de pol III de ARN, e outros promotores de aminoácido, Ul ARNsn [Bartlett et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 20; 93(17):8852-7 (1996)], MC-1, PGK, β-actina e cx-globina. Muitos outros promotores que podem ser úteis são listados em Walther e Stein [J. Mol. Med. 74(7):379-92 (1996)].

Entende-se que qualquer dos promotores acima, isolado ou em combinação com outros, pode útil de acordo com a presente invenção dependendo da acção desejada. Adicionalmente, esta lista de promotores não deve ser encarada como exaustiva ou limitante, e os especialistas na técnica conhecerão outros promotores que podem ser utilizados em conjunto com os promotores e métodos aqui revelados.

Outro elemento regulador contemplado para utilização na presente invenção é um intensificador. Estes são elementos genéticos que aumentam a transcrição de um promotor localizado a uma posição distante na mesma molécula de ADN. Os intensificadores estão organizados muito como os promotores. Isto é, eles são compostos por muitos elementos individuais, cada um dos quais liga-se a uma ou mais proteinas de transcrição. A distinção básica entre intensificadores e promotores é operacional. Uma região intensificadora como um todo deve ser capaz de estimular a transcrição a uma distância; isto não tem que ser verdade para uma região promotora ou seus elementos componentes. Por outro lado, um promotor deve possuir um ou mais elementos que dirigem a iniciação da sintese de ARN num sitio particular e numa orientação particular, enquanto que 41 os intensificadores não têm estas especificidades. Os promotores e intensificadores são frequentemente sobreponíveis e contíguos, parecendo possuir frequentemente uma organização molecular muito semelhante. Intensificadores úteis na presente invenção são bem conhecidos dos especialistas na técnica e dependerão do sistema de expressão particular a ser empregue [Scharf et al., Results Probl. Cell. Differ. 20: 125-62 (1994); Bittner et al., Meth. Enzymol. 153: 516-544 (1987)].

Sinais de Poliadenilação. Quando é empregue uma inserção de ADNc, desejar-se-á tipicamente incluir um sinal de poliadenilação para realizar poliadenilação apropriada do transcrito genético. Não se crê que a natureza do sinal de poliadenilação seja crucial para o sucesso da prática da invenção, e qualquer dessas sequências pode ser empregue, tais como hormona do crescimento humana ou bovina e sinais de poliadenilação de SV40. Também contemplado como um elemento de uma cassete de expressão está um terminador. Estes elementos podem servir para aumentar os niveis de mensagem e para minimizar o seguimento da leitura da cassete para outras sequências. IRES. Em certas formas de realização da invenção, a utilização de elementos internos de sitios de entrada de ribossomas (IRES) está contemplada para criar mensagens multigénicas ou policistrónicas. Os elementos de IRES são capazes de ultrapassar o modelo de varrimento do ribossoma de tradução dependente de Cap metilado em 5' e inicia a tradução nos sitios internos [Pelletier e Sonenberg, Nature 334: 320-325 (1988) ] . Foram descritos elementos de IRES dos dois membros da 42 família de picornavírus (poliovírus e encefalomiocardite) (Pelletier e Sonenberg, 1988, supra), bem como um IRES de uma mensagem de mamífero [Macejak e Sarnow, Nature 353: 90-94 (1991)] . Os elementos de IRES podem ser ligados a grelhas de leitura aberta heterólogas. Podem ser transcritas em conjunto múltiplas de grelhas de leitura aberta, cada uma separada por um IRES, criando mensagens policistrónicas. Em virtude do elemento de IRES, cada grelha de leitura aberta está acessível a ribossomas para tradução eficiente. Múltiplos genes podem ser expressos eficientemente utilizando um único promotor/intensificador para transcrever uma mensagem única.

Qualquer grelha de leitura aberta heteróloga pode ser ligada a elementos de IRES. Isto inclui genes para proteínas secretadas, proteínas de multi-subunidade, codificadas por genes independentes, proteínas intracelulares ou ligadas à membrana, e marcadores seleccionáveis. Deste modo, a expressão de várias proteínas pode ser simultaneamente construída numa célula com uma única construção e um único marcador de selecção. b. Distribuição de Vectores de Expressão

Existem vários modos através dos quais os vectores de expressão podem ser introduzidos nas células. Em certas formas de realização da invenção, a construção de expressão compreende um vírus ou construção efectuada derivada de um genoma virai. Noutras formas de realização, está contemplada distribuição não virai. A capacidade de certos vírus para entrarem nas células através de endocitose mediada por receptor, para se integrarem no genoma da célula hospedeira, e expressar genes virais de forma estável e eficientemente tornou-os candidatos atraentes 43

para a transferência de genes estranhos para células de mamíferos [Ridgeway, Em: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez & Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 467-492, 1988; Nicolas e Rubenstein, Em: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez & Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth, 493-513, 1988; Baichwal e Sugden, Em: Gene Transfer, Kucherlapati (ed.), Nova Iorque, Plenum Press, 117-148,1986; Temin, Em: Gene Transfer,

Kucherlapati (ed.), Nova Iorque: Plenum Press, 149-188, 1986)].

Os primeiros virus utilizados como vectores genéticos foram virus de ADN incluindo os papovavírus (vírus símio 40, vírus de papiloma bovino, e polioma) (Ridgeway, 1988, supra; Baichwal e Sugden, 1986, supra) e adenovírus (Ridgeway, 1988, supra;

Baichwal e Sugden, 1986, supra). Estes possuem uma capacidade relativamente baixa para sequências de ADN estranho e possuem um espectro de hospedeiros restrito. Além disso, o seu potencial oncogénico e efeitos citopáticos em células permissivas levantam preocupações de segurança. Eles podem acomodar apenas até 8 kb de material genético estranho, mas podem ser rapidamente introduzidos numa variedade de linhas celulares e animais de laboratório (Nicolas e Rubenstein, 1988, supra; Temin, 1986, supra) . É agora largamente reconhecido que o ADN pode ser introduzido numa célula utilizando uma variedade de vectores virais. Nessas formas de realização, construções de expressão compreendendo vectores virais contendo os genes de interesse podem ser vectores adenovirais (ver, por exemplo, Patente US N° 5824544; Patente US N° 5707618; Patente US N° 5693509; Patente US N° 5670488; Patente US N° 5585362; retrovirais (ver por exemplo, Patente US N° 5888502; Patente US N° 5830725; Patente US N° 5770414; Patente US N° 5686278; e Patente US N° 4861719; 44 virais adeno-associados (ver por exemplo, Patente US N° 5474935;

Patente US N° 5139941; Patente US N° 5622856; Patente US N° 5658776; Patente US N° 5773289; Patente US N° 5789390; Patente US N° 5834441; Patente US N° 5863541; Patente US N° 5851521; e Patente US N° 5252479; um virai hibrido adenoviral-adenoassociado (ver, por exemplo, Patente US N° 5856152, ou um vector de vírus vaccinia ou de um virus herpes (ver, por exemplo, Patente US N° 5879934; Patente US N° 5849571; Patente US N° 5830727; Patente US N° 5661033; e Patente US N° 5328688.

Existem várias alternativas para transferência virai de construções genéticas. Esta secção proporciona uma discussão de métodos e composições de transferência de genes não virais. As construções de ADN da presente invenção são geralmente distribuídas a uma célula, e em certas situações, o ácido nucleico ou a proteína a serem transferidos podem ser transferidos utilizando métodos não virais.

Estão contemplados pela presente invenção vários métodos não virais para a transferência de construções de expressão para células de mamíferos cultivadas. Estes incluem precipitação por fosfato de cálcio [Graham e Van Der Eb, Virology 52: 456-467 (1973); Chen e Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752 (1987);

Rippe et al., Mol. Cell. Biol. 10: 689-695 (1990)], DEAE-dextrano [Gopal, Mol. Cell. Biol., 5: 1188-1190 (1985)],

electroporação [Tur-Kaspa et al., Mol. Cell. Biol. 6: 716-718 (1986); Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 7161-7165 (1984)], microinjecção directa [Harland e Weintraub, J Cell Biol. 101: 1094-1099 (1985)], lipossomas carregados com ADN

[Nicolau e Sene, Biochim. Biophys. Acta. 721: 185-190 (1982);

Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76: 3348-3352 (1979);

Felgner, Sei. Am. 276 (6): 102-106 (1997); Felgner, Hum. Gene 45

Ther. 7 (15): 1791-3 (1996)], sonicação celular [Fechheimer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84: 8463-8467 (1987)], bombardeamento de genes utilizando microprojécteis a velocidade elevada [Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 9568-9572 (1990)], e transfecção mediada por receptor [Wu e Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987); Wu e Wu, Biochem., 27: 887-892 (1988); Wu e Wu, Adv. Drug Deliv. Rev. 12: 159-167 (1993)].

Assim que a construção tenha sido distribuída para dentro da célula, o ácido nucleico codificando o gene terapêutico pode ser posicionado e expresso em sitios diferentes. Em certas formas de realização, o ácido nucleico codificando o gene terapêutico pode ser estavelmente integrado no genoma da célula. Esta integração pode estar na localização e orientação cognata através de recombinação homóloga (substituição de genes), ou pode ser integrada numa localização aleatória, não especifica (aumento genético). Ainda noutras formas de realização, o ácido nucleico pode ser mantido estavelmente na célula como um segmento de ADN separado, epissómico. Esses segmentos de ácido nucleico ou "epissomas" codificam sequências suficientes para permitir a manutenção e replicação independente de, ou em sincronização com, o ciclo da célula hospedeira. Como a construção de expressão é distribuída para uma célula, e onde, na célula é que o ácido nucleico permanece, está dependente do tipo de construção de expressão empregue.

Numa forma de realização particular da invenção, a construção de expressão pode ser encapsulada num lipossoma. Os lipossomas são estruturas vesiculares caracterizadas por uma membrana de bicamada de fosfolipidos e um meio aquoso interno. Os lipossomas multilamelares possuem múltiplas camadas lipídicas separadas por meio aquoso. Eles formam-se espontaneamente quando 46 os fosfolípidos são suspensos num excesso de solução aquosa. Os componentes lipídicos sofrem auto-rearranjo antes da formação de estruturas fechadas e encapsulam água e solutos dissolvidos entre as bicamadas lipidicas [Ghosh e Bachhawat, Em: Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands. Wu & Wu (ed.), Nova Iorque: Mareei Dekker, pp. 87-104 (1991)]. A adição de ADN a lipossomas catiónicos provoca uma transição topológica de lipossomas para glóbulos condensados cristalinos líquidos opticamente birefringentes [Radler et al., Science 275(5301): 810-4 (1997)]. Estes complexos ADN-lípido são potenciais vectores não virais para utilização em terapia génica e distribuição. A distribuição de ácido nucleico mediada por lipossomas e a expressão de ADN in vitro tem sido muito bem sucedida. Estão também contempladas na presente invenção várias abordagens comerciais envolvendo tecnologia de "lipofecção". Em certas formas de realização da invenção, o lipossoma pode ser complexado com um vírus de hemaglutinação (HVJ). Foi demonstrado que isto facilita a fusão com a membrana celular e promove a entrada na célula de ADN encapsulado por lipossomas [Kaneda et al., Science 243: 375-378 (1989)]. Noutras formas de realização, o lipossoma pode ser complexado ou empregue m conjunto com proteínas cromossómicas não histona nucleares (HMG-1) [Kato et al., J. Biol. Chem. 266:3361-3364 (1991)]. Ainda noutras formas de realização, o lipossoma pode ser complexado ou empregue em conjunto com ambos HVJ e HMG-1. Nesse sentido essas construções de expressão foram empregues com sucesso na transferência e expressão de ácido nucleico in vitro e in vivo. Depois, eles são aplicáveis para a presente invenção. 47

Outros sistemas de vector de distribuição que podem ser empregues para distribuir um ácido nucleico codificando um gene terapêutico nas células incluem veículos de distribuição mediada por receptor. Estes tiram vantagem da incorporação selectiva de macromoléculas por endocitose mediada por receptor em quase todas as células eucariotas. Devido à distribuição específica para o tipo de célula de vários receptores, a distribuição pode ser altamente específica (Wu e Wu, 1993, supra).

Veículos de direccionamento de genes mediados pelo receptor, consistem geralmente em dois componentes: um ligando específico para o receptor celular e um agente de ligação ao ADN. Foram utilizados vários ligandos para transferência de genes mediada por receptor. Os ligandos caracterizados mais exaustivamente são asialoorosomucóide (ASOR) (Wu e Wu, 1987, supra) e transferrina [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87(9): 3410-3414 (1990)]. Recentemente, foi utilizada uma neoglicoproteína sintética que reconhece o mesmo receptor que ASOR, como um veículo de distribuição de genes [Ferkol et al., FASEB J. 7: 1081-1091 (1993); Perales et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 91: 4086-4090 (1994)] e o factor de crescimento da epiderme (EGF) também foi utilizado para distribuir genes a células de carcinoma escamoso (Myers, EPO 0273085).

Noutras formas de realização, o veículo de distribuição pode compreender um ligando e um lipossoma. Por exemplo, Nicolau et al. [Methods Enzymol. 149: 157-176 (1987)] empregaram lactosil-ceramida, um asialgangliósido terminal de galactose, incorporado em lipossomas e observaram um aumento na incorporação do gene da insulina por hepatócitos. Deste modo, é exequível que um ácido nucleico codificando um gene terapêutico também pode ser especificamente distribuído a um tipo de célula particular por 48 qualquer número de sistemas receptor-ligando com ou sem lipossomas.

Noutra forma de realização da invenção, a construção de expressão pode consistir simplesmente de ADN recombinante não encapsulado ou plasmídeos. A transferência da construção pode ser realizada por qualquer um dos métodos acima mencionados que fisicamente ou quimicamente permeabilizam a membrana celular. Isto é aplicável, particularmente para transferência in vitro; todavia, pode ser aplicado também para utilização in vivo. Dubensky et ai. [Proc. Nat. Acad. Sei. USA 81: 7529-7533 (1984)] injectaram com sucesso ADN de poliomavírus na forma de precipitados de CaP04 no fígado e no baço de murganhos adultos e recém nascidos, demonstrando replicação virai activa e infecção aguda. Benvenisty e Neshif [Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 9551-9555 (1986)] também demonstraram que a injecção intraperitoneal directa de plasmídeos precipitados com CaP04 resulta em expressão dos genes transfectados.

Outra forma de realização da invenção para transferir uma construção de expressão de ADN não encapsulado para as células pode envolver o bombardeamento de partículas. Este método depende da capacidade para acelerar microprojécteis revestidos de ADN até uma velocidade elevada, permitindo-lhes que perfurem as membranas celulares e outras células sem as matar [Klein et al.r Nature 327: 70-73 (1987)]. Foram desenvolvidos vários dispositivos para acelerar pequenas partículas. Um desses dispositivos baseia-se numa descarga de voltagem elevada para criar uma corrente eléctrica que, por sua vez, proporciona a força motriz [Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 9568-9572 (1990)]. Os microprojécteis utilizados consistiram em 49 tais como esferas de substâncias biologicamente inertes tungsténio ou ouro. F. Métodos de Tratamento de Neutropenia

Como aqui mencionado, está contemplado que os análogos de G-CSF humano ou os vectores compreendendo polinucleótidos codificando essas proteínas serão empregues em protocolos de terapêutica de substituição para o tratamento de neutropenia. Verificou-se que G-CSF é útil no tratamento de vários estados, em que um aumento nos neutrófilos irá proporcionar benefícios. Por exemplo, para doentes com cancro, G-CSF é benéfico como um meio de estimular selectivamente a produção de neutrófilos para compensar défices hematopoiéticos resultantes de quimioterapêutica ou terapêutica por radiação. Outras indicações incluem o tratamento de várias doenças infecciosas e estados relacionados, tais como sepsia, que é tipicamente causada por um metabolito de bactéria. G-CSF é também útil isolado, ou em combinação com outros compostos, tais como outras citocinas, para crescimento ou expansão de células em cultura (por exemplo, para transplantes de medula óssea ou expansão ex vivo). 0 G-CSF tem sido administrado a doentes com transplante como um adjunto para tratamento de infecção ou para tratamento de neutropenia. a. Terapêutica à Base de Proteína

Uma das formas de realização terapêuticas da presente invenção é o fornecimento, a um indivíduo em necessidade deste, de composições compreendendo os análogos de G-CSF humano da presente invenção. Como discutido acima, as proteínas podem ter 50 sido criadas através de meios recombinantes ou por sintese automatizada de péptidos. As formulações do análogo de G-CSF humano para uma tal terapêutica podem ser seleccionadas com base na via de administração e podem incluir formulações lipossomais bem como preparações farmacêuticas clássicas.

As proteínas do análogo de G-CSF humano são formuladas numa preparação apropriada e administradas a um ou mais sitios no indivíduo numa quantidade terapeuticamente eficaz. Em formas de realização particularmente preferida, a terapêutica baseada na proteina do análogo de G-CSF humano é realizada de modo continuo ou intermitente por administração intravenosa. Por "quantidade terapeuticamente eficaz" a presente invenção refere-se à quantidade de um análogo de G-CSF humano que é suficiente para suportar uma alteração observável no nivel de uma ou mais actividades biológicas de G-CSF. A alteração pode ser um aumento do nivel da actividade de G-CSF. De um modo preferido, a alteração é um aumento na proliferação de neutrófilos.

Os especialistas na técnica irão compreender que as quantidades de análogo de G-CSF humano para utilização terapêutica pode variar. Está contemplado que a actividade especifica da preparação de proteina do análogo de G-CSF humano pode estar no intervalo de cerca de 100 unidades/mg de proteina até cerca de 500 unidades/mg de proteina. Deste modo, uma dada preparação de um análogo de G-CSF humano pode compreender cerca de 100 unidades/mg de proteina, cerca de 125 unidades/mg de proteina, cerca de 150 unidades/mg de proteina, cerca de 175 unidades/mg de proteina, cerca de 200 unidades/mg de proteina, cerca de 225 unidades/mg de proteina, cerca de 250 unidades/mg de proteina, cerca de 275 unidades/mg de proteina, cerca de 300 unidades/mg de proteina, cerca de 325 unidades/mg de proteina, 51 cerca de 350 unidades/mg de proteína, cerca de 375 unidades/mg de proteína, cerca de 400 unidades/mg de proteína, cerca de 425 unidades/mg de proteína, cerca de 450 unidades/mg de proteína, cerca de 475 unidades/mg proteína e cerca de 500 unidades/mg de proteína. Um intervalo, particularmente preferido, é de cerca desde 100 unidades/mg proteína até cerca de 200 unidades/mg de proteína; um intervalo mais preferido está entre cerca de 150 a cerca de 200 unidades/mg de proteína. De um modo preferido, a composição de proteína está substancialmente livre de factores contaminantes, um nível de contaminação inferior a 0,02% (p/p). Composições de análogo de G-CSF humano, adequadas para injecção a um doente, podem ser preparadas, por exemplo, por reconstituição com um diluente farmacologicamente aceitável de uma amostra liofilizada compreendendo o análogo de G-CSF humano purificado e sais de estabilização. A administração das composições pode ser sistémica ou local, e pode compreender um sítio de injecção único de uma quantidade terapeuticamente eficaz da composição da proteína do análogo de G-CSF humano. Qualquer via conhecida dos especialistas na técnica para a administração de uma composição terapêutica da invenção está contemplada incluindo, por exemplo, intravenosa, intramuscular, subcutânea ou um cateter para administração a longo termo. Alternativamente, está contemplado que a composição terapêutica pode ser distribuída a um doente em múltiplos sítios. As administrações múltiplas podem ser realizadas simultaneamente ou podem ser administradas ao longo de um período de várias horas. Em certos casos, pode ser benéfico proporcionar um fluxo contínuo da composição terapêutica. A terapêutica adicional pode ser administrada na base de um período, por exemplo, diariamente, semanalmente ou mensalmente. 52 b. Terapêutica de Combinação

Adicionalmente às terapêuticas com base apenas na distribuição dos análogos de G-CSF humano, a terapêutica de combinação está especificamente contemplada. No contexto da presente invenção, está contemplado que a terapêutica do análogo de G-CSF humano pode ser utilizada de modo semelhante em conjunto com outros agentes normalmente utilizados para o tratamento de neutropenia.

Para alcançar o resultado terapêutico apropriado, utilizando os métodos e composições da presente invenção, deve geralmente proporcionar-se uma composição compreendendo o análogo de G-CSF humano e, pelo menos, um outro agente terapêutico (segundo agente terapêutico). Na presente invenção, está contemplado que o segundo agente terapêutico pode envolver a administração ou inclusão, pelo menos, um factor adicional seleccionado de entre EPO, G-CSF, M-GDF, SCF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, 1IL-12, ou outras vários interleucinas, IGF-1, LIF, interferão (tais como α, β, gama ou de consenso), factores neurotróficos (tais como BDNF, NT-3, CTNF ou noggin), outros factores de crescimento multi-potentes (tais como, até ao ponto em que estes demonstraram ser tais factores de crescimento multi-potentes, ligando flt-3/flk-2, factor de proliferação de células estaminais, e factor de células estaminais totipotentes) , factores de crescimento de fibroblastos (tais como FGF), e análogos, moléculas de fusão, ou outros derivados daqueles acima. Por exemplo, verificou-se que G-CSF em combinação com SCF mobiliza as células progenitoras do sangue periférico in vivo. Verificou-se ex vivo, por exemplo, que G-CSF em combinação com SCF, IL-3 e IL-6 é útil para a expansão de células do sangue 53 periférico. De igual modo, os presentes análogos de G-CSF irão proporcionar utilizações semelhantes.

As composições de terapêutica de combinação seriam proporcionadas numa quantidade eficaz combinada para produzir o resultado terapêutico desejado no tratamento de neutropenia. Este processo pode envolver contactar as células com o análogo de G-CSF humano e o segundo agente(s) ou factor(es) ao mesmo tempo. Isto pode ser alcançado administrando uma única composição ou formulação farmacológica que inclui ambos os agentes, ou por administração de duas composições ou formulações distintas, ao mesmo tempo, em que uma composição inclui a composição terapêutica do análogo de G-CSF humano e o outro inclui o segundo agente terapêutico.

Alternativamente, o tratamento com o análogo de G-CSF humano pode preceder ou seguir o outro tratamento por agente em intervalos que variam entre minutos e semanas. Nas formas de realização em que o segundo agente terapêutico e o análogo de G-CSF humano são administrados separadamente, deve geralmente assegurar-se que um período significativo de tempo não expirou entre o tempo de cada distribuição, tal que o segundo agente e o análogo de G-CSF humano deve ainda ser capaz de exercer vantajosamente um efeito combinado. Nesses casos, está contemplado que se deve administrar ambas as modalidades com cerca de 12-24 horas entre uma e outra e, de um modo mais preferido, com cerca de 6-12 horas entre uma e outra, com um tempo de atraso de apenas cerca de 12 horas, sendo o mais preferido. Nalgumas situações, pode ser desejável estender significativamente o período de tempo para tratamento, todavia, nos casos de vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a várias semanas 54 (1, 2,3,4,5,6,7 ou 8) de intervalo entre as respectivas administrações. A distribuição sistémica das construções de expressão do análogo de G-CSF humano ou proteínas a doentes podem ser um método muito eficiente para distribuir um gene terapeuticamente eficaz para contra-actuar as manifestações clínicas imediatas da doença. Alternativamente, a distribuição local do análogo de G-CSF humano e/ou o segundo agente terapêutico pode ser apropriada em certas circunstâncias.

G. Ensaios para Determinar Actividade e Ligação do Análogo de G-CSF

Em certos aspectos da presente invenção, pode ser necessário determinar a actividade do análogo de G-CSF-humano. Em particular, o efeito das composições terapêuticas da presente invenção em neutropenia pode necessitar de ser monitorizada. Os especialistas na técnica estão conscientes dos numerosos ensaios para determinar a actividade de G-CSF, alguns dos quais são descritos na presente secção. Isto não pretende, de modo algum, ser uma lista exaustiva desses ensaios e pretende meramente proporcionar certos ensaios de exemplo, bem conhecidos dos especialistas na técnica, que podem ser utilizados na determinação da actividade de G-CSF da presente invenção. Além disso, a presente secção também descreve ensaios para a determinação da ligação de G-CSF ao seu receptor. A título de exemplo, são aqui proporcionados abaixo ensaios in vitro e in vivo para determinar essas actividades. 55 a. Ensaios In Vitro

Ensaios de Proliferação Celular. Os ensaios de proliferação celular, alguns dos quais são aqui descritos, são utilizados para determinar o efeito do análogo de G-CSF na indução da proliferação celular. Muitos ensaios são bem conhecidos na técnica e alguns destes ensaios são descritos como se segue.

Contagem de Células. As células são passadas para o meio MEMa suplementado (sem G-CSF) 24 h antes da iniciação da experiência de proliferação celular, altura em que frascos de células paralelos a uma densidade de 105 células/mL são incubados em meio MEMa com G-CSF a 125 pM de tipo selvagem ou análogos de G-CSF. 0 crescimento celular em cada frasco é medido nos dias 2, 5, e 8 como se segue. Resumidamente, as células são diluidas numa solução isotónica (ISOTON II, Coulter Diagnostics, Hialeah, FL), e contadas num contador Coulter (Coulter Electronics, Hialeah, FL).

Incorporação de 3H-Timidina. Este ensaio baseia-se na incorporação de timidina marcada com 3H no ADN sintetizado de novo das células em divisão celular. Alguns investigadores também utilizam o análogo da timidina 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) em vez de [3H]-timidina em ensaios de proliferação. Resumidamente, as células são passadas para meio MEMa suplementado (sem G-CSF) 24 h antes da iniciação da experiência de proliferação celular, em cujo momento os poços/frascos paralelos de células a uma densidade de 105 células/mL são 56 incubados em meio MEMa com G-CSF de tipo selvagem a 125 pM ou análogos de G-CSF. É adicionada 3H-timidina à cultura de células 12-24 h após a contagem (terminação da experiência) , e no final do ensaio a quantidade de incorporação radioactiva no ADN é medida num contador de cintilações em líquido. Detalhes deste método são bem conhecidos para o especialista da técnica. MTT. É utilizado MTT para a determinação quantitativa de proliferação e activação celular, e. g. em resposta a factores de crescimento e citocinas. Também é utilizado para a quantificação de efeitos antiproliferativos ou citotóxicos, e. g. , mediados pelo factor α ou β da necrose tumoral e para a medição da acção do interferão. O ensaio é baseado na clivagem do sal de tetrazólio amarelo, MTT, em cristais púrpuras de formazano por células activas metabólicas. Estes cristais de sal são insolúveis em solução aquosa, mas podem ser solubilizados adicionando a solução de solubilização incluída no kit e incubando as placas durante a noite em atmosfera humidificada (e. g. 37 °C, CO2 a 6,5%). 0 produto de formazano solubilizado é quantificado espectrofotometricamente utilizando um leitor de ELISA. Um aumento no número de células vivas resulta num aumento na actividade metabólica total na amostra. Este aumento está directamente correlacionado com a quantidade de cristais púrpuras de formazano formados, como monitorizado pela absorvência. 0 ensaio de MTT comercial pode ser adquirido à Roche Diagnostics (Indianapolis, IN).

Ensaio de Depleção de Ligando. A depleção de ligando para cada proteína é medida ao longo do tempo, como aqui descrito. Como nas experiências acima, células dependentes de G-CSF 57 (0CI/AML1) são passadas para meio MEMa suplementado (sem G-CSF) 24 h antes da iniciação das experiências de depleção de ligando, em cujo momento os frascos de células a uma densidade de 105 células/mL são incubadas em meio MEMa com G-CSF de tipo selvagem a 125 pM ou análogo de G-CSF. Após 24 h, o número de células em cada frasco é medido, como descrito acima, e uma fracção de cada sobrenadante do meio, obtido após centrifugação para sedimentar os resíduos celulares, é armazenada a -20 °C para medição da concentração de G-CSF. Isto é repetido a cada 24 h durante oito dias. As concentrações de G-CSF nas amostras do sobrenadante do meio são então quantificadas utilizando kits de ensaio de imunoabsorção ligados a enzima (ELISA) obtidos de R&D Systems (Minneapolis, MN)

Experiências de Internalização e Reciclagem. As experiências de internalização são realizadas durante um período de tempo de 5 min., de um modo semelhante ao trabalho publicado [Kuwabara et al., Amer. J. Physiol. Endocrinol. Metabol. 32:E1-E9 (1995)]. Resumidamente, 108 células são lavadas duas vezes com PBS e depois incubadas em gelo em ligando marcado durante 30 min. para obter complexos de superfície. As células são novamente lavadas duas vezes com PBS gelado e ressuspenso em MEMa a 37 °C a t=0. A alteração nos complexos de superfície e complexos internos é seguida durante um período de tempo de 5 min./ um gráfico de complexos internos versus o integral do tempo dos complexos de superfície produz uma relação linear, cujo declive é a taxa constante de internalização do complexo [Wiley et al., J. Biol. Chem. 257: 4222-4229 (1982)]. As experiências de reciclagem são realizadas de modo idêntico às experiências de internalização, excepto durante um período de tempo de 25 min. Os resultados das 58 experiências de reciclagem são parâmetros ajustados para obter constantes de taxa de reciclagem.

Ensaios de Ligação. Ensaios de ligação molecular, alguns dos quais são aqui descritos, são utilizados para avaliar a ligação do análogo de G-CSF a G-CSFR. Estes ensaios in vitro e à base de células são descritos como se segue. BIACORE. A afinidade de ligação ao ligando do análogo de G-CSF ao receptor de G-CSF é medido utilizando um BIAcore®2000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) . G-CSF de tipo selvagem marcada com histidina é imobilizada na superfície do chip, e o receptor isento (-0,25-10 nM) é passado sobre o chip para criar uma curva de equilíbrio convencional e para calcular a afinidade de ligação do tipo selvagem utilizando um modelo de ligação 1:1. Para determinar a afinidade de ligação de cada mutante, é misturado receptor livre a 2 nM com uma concentração conhecida de ligando mutante e passado sobre o chip. As afinidades de ligação de equilíbrio do mutante são determinadas, utilizando um modelo de ligação 1:1 com competição. Os resultados da afinidade de ligação são analisados utilizando o programa informático BIA evaluation 3.1 (BIAcore, Inc.); e as constantes de dissociação de equilíbrio (KD) são determinadas. ELISA. A ligação de análogos de mutante de G-CSF a G-CSFR é medida num ensaio de competição de formato ELISA. Neste ensaio, a G-CSFR é capturada com o anticorpo de receptor de G-CSF não neutralizante LMM741 (PharMingen, San Diego, CA) pelo protocolo do fabricante. As proteínas análogas são então ensaiadas quanto 59 à sua capacidade para competir com G-CSF marcado com HRP para a ligação ao receptor. b. Ensaios In Vivo

Antes das composições do análogo de G-CSF humano da presente invenção serem empregues em protocolos terapêuticos humanos, pode ser desejável monitorizar os efeitos dessas composições em modelos animais. Existem vários modelos animais que podem ser utilizados em ensaios in vivo, conhecidos dos especialistas na técnica que podem ser úteis na presente invenção.

De modo a determinar a eficiência do análogo da proteína de G-CSF humano e composições de terapia génica da presente invenção, esses animais podem ser injectados intramuscularmente e/ou intravenosamente com as composições da presente invenção, e a capacidade para estimular a proliferação de neutrófilos na presença e ausência das composições pode ser determinada. Essas determinações serão úteis no fornecimento de orientação nas dosagens e tempos de administração e na eficiência de uma dada composição contra neutropenia. Em protocolos de terapia génica, a coloração de imunofluorescência de secções, obtidas a partir de músculo sujeito a biopsia, pode ser realizada, e a expressão do análogo de G-CSF humano nas fibras do músculo transduzidas pode ser determinada. Ή. Composições farmacêuticas A presente invenção também compreende composições farmacêuticas compreendendo quantidades eficazes de produtos de 60 polipéptido da invenção juntamente com diluentes, conservantes, solubilizadores, emulsificadores, adjuvantes e/ou veículos, farmaceuticamente aceitáveis úteis na terapêutica de G-CSF. Essas composições incluem diluentes de vários teores de tampão (e. g., Tris-HCl, acetato, fosfato), pH e força iónica; aditivos tais como detergentes e agentes de solubilização (e. g., Tween 80, Polissorbato 80), anti-oxidantes (e. g., ácido ascórbico, metabissulfito de sódio), conservantes (e. g., timersol, álcool benzílico), e substâncias de avultamento (e. g., lactose, manitol); incorporação do material em preparações particuladas de compostos poliméricos, tais como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, etc., ou em associação com lipossomas. Essas composições irão influenciar o estado físico, estabilidade, taxa de libertação in vivo, e taxa de eliminação in vivo dos presentes análogos de G- CSF. Ver, e. g., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Ed. (1990) Mack Publishing Co.,

Easton, PA, páginas 1435-1712.

Derivados dos presentes análogos de G-CSF são também aqui compreendidos. Esses derivados incluem moléculas modificadas por uma ou mais moléculas de polímero solúveis em água, tais como polietilenoglicol, ou através da adição de poliaminoácidos, incluindo proteínas de fusão (cujos processos são bem conhecidos na técnica). Esses derivados podem ocorrer singularmente nos terminais N ou C, ou podem existir múltiplos sítios de derivatização. A substituição de um ou mais aminoácidos com lisina pode proporcionar sítios adicionais por derivação. (Ver Patente US N°: 5824784 e Patente US N°: 5824778.

Os presentes análogos ou seus derivados podem ser formulados para injecção, ou tipos de administração oral, nasal, pulmonar, tópica, ou outras como um especialista na técnica irá 61 reconhecer. A formulação pode ser líquida ou pode ser sólida, tal como liofilizada, para reconstituição.

Em geral, os presentes análogos (ou os seus derivados) serão úteis do mesmo modo que as G-CSFs presentemente disponíveis são úteis, excepto que os presentes análogos proporcionam resposta celular aumentada (actividade superagonista ou agonistas para G-CSF). Essas alterações na resposta celular ocorre afectando a ligação ao receptor de G-CSF e/ou os processos de selecção, reciclagem e degradação através de vias de tráfego ligando/receptor endocíticas.

Estas utilizações incluem o tratamento de uma variedade de estados hematopoiéticos, neurológicos, e relacionados com a reprodução. Deste modo, as presentes composições e métodos para o fabrico de medicamentos pode ser útil para o tratamento desses estados. Estados aliviados ou modulados pela administração dos presentes análogos são tipicamente aqueles caracterizados por uma função hematopoiética ou imunitária reduzida e mais especificamente, uma contagem de neutrófilos reduzida. Esses estados podem ser induzidos como um método de terapêutica para outros objectivos, tais como quimioterapêutica ou terapêutica por radiação. Esses estados podem resultar de doença infecciosa, tal como bacteriana, virai, fúngica, ou outra doença infecciosa. Por exemplo, os resultados de sepsia de infecção bacteriana. Ou, esse estado pode ser hereditário ou provocado pelo ambiente, tais como neutropenia crónica severa ou leucemias. A idade também pode desempenhar um factor, como nos doentes de ambiente geriátrico; podem possuir uma contagem de neutrófilos reduzida ou mobilização de neutrófilos reduzidos. Algumas condições são revistas em Filgrastim (r-metHuG-CSF) Em: Clinicai Practice, Morstyn e Dexter (eds.), Mareei Dekker, Inc., Nova Iorque 62 (1993), ρ. 351. Outros estados menos estudados que podem ser aliviados ou modulados pela administração dos presentes análogos podem incluir a redução de lípidos (ou colesterol) na corrente sanguinea e certos estados cardiovasculares, na medida em que o G-CSF pode induzir a produção de activadores de plasminogénio. Adicionalmente, as presentes composições análogas de G-CSF podem ser utilizadas para mobilização de células progenitoras de sangue periférico.

Os presentes análogos de G-CSF (ou composições derivadas) também podem ser utilizadas in vitro. Por exemplo, num ambiente de terapia génica, pode ser desejável transfectar uma célula hematopoiética com ADN exógeno, e cultura da referida célula utilizando as presentes formulações de análogos de G-CSF. Deste modo, ainda noutro aspecto, a presente invenção envolve um método para cultivar células hematopoiéticas in vitro compreendido por: a) colocar as referidas células num meio de cultura adequado, contendo o referido meio de cultura adequado uma composição de análogo de G-CSF de acordo com a presente invenção, e b) proporcionar condições adequadas para o crescimento das referidas células hematopoiéticas.

Mais particularmente, a presente invenção proporciona um método de transfectar células hematopoiéticas com ADN exógeno compreendendo: a) cultivar as referidas células hematopoiéticas com uma composição de análogo de G-CSF de acordo com a presente invenção, e b) transfectar as referidas células cultivadas com ADN exógeno. As células hematopoiéticas podem ser, por exemplo, células da medula óssea ou células progenitoras de sangue periférico. Adicionalmente, podem ser utilizadas outras células bem conhecidas dos especialistas na técnica. 63

De modo a preparar o análogo de G-CSF humano contendo composições para utilização clinica, será necessário preparar os vectores de expressão virais, proteínas, e ácidos nucleicos como composições farmacêuticas, i. e., numa forma apropriada para aplicações in vivo. Geralmente, isto irá requerer preparar composições que são essencialmente isentas de pirogénios, bem como outras impurezas que poderiam ser prejudiciais para seres humanos ou animais.

Será geralmente desejável empregar sais apropriados e tampões para tornar os vectores de distribuição estáveis e permitir a incorporação pelas células alvo. Os tampões também serão empregues quando as células recombinantes são introduzidas num doente. As composições aquosas da presente invenção compreendem uma quantidade eficaz do análogo de G-CSF humano ou um vector de expressão às células, dissolvido ou disperso num veiculo farmaceuticamente aceitável ou meio aquoso. Essas composições também são referidas como um inoculo. A frase "farmaceuticamente ou farmacologicamente aceitável" refere-se a entidades e composições moleculares que não produzem reacções adversas, alérgicas, ou outras desfavoráveis quando administradas a um animal ou um ser humano. Como aqui utilizado, "veiculo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de retardamento isotónico e de absorção e semelhantes. A utilização destes meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é bem conhecida na técnica. Excepto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com os vectores ou células da presente invenção, a sua utilização em composições terapêuticas está contemplada. Ingredientes activos suplementares também podem ser incorporados nas composições. 64

As composições activas da presente invenção incluem preparações farmacêuticas clássicas. A administração destas composições de acordo com a presente invenção será através de qualquer via comum, desde que o tecido alvo esteja disponível através dessa via. As composições farmacêuticas podem ser introduzidas no indivíduo através de qualquer método convencional, e. g., através de distribuição intravenosa, intradérmica, intramuscular, intramamária, intraperitoneal, intratecal, retrobolbar, intrapulmonar (e. g., libertação a termo); por oral, sublingual, nasal, anal, vaginal ou transdérmica, ou por implantação cirúrgica num sítio particular. 0 tratamento pode consistir numa única dose ou numa pluralidade de doses ao longo de um período de tempo.

Os compostos activos podem ser preparados para administração como soluções de base livre ou sais farmacologicamente aceitáveis em água adequadamente misturada com um tensioactivo, tal como hidroxipropilcelulose. Também podem ser preparadas Dispersões em glicerol, polietilenoglicóis líquidos, e misturas destes e em óleos. Em condições armazenamento e utilização normais, estas preparações contêm um conservante para prevenir o crescimento dos microrganismos.

As formas farmacêuticas adequadas para utilização injectável incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões estéreis injectáveis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida até ao ponto em que exista facilidade de capacidade de administração por seringa. Deve ser estável nas condições de fabrico e armazenamento e deve ser preservada contra a acção de contaminação dos microorganismos, tais como 65 bactérias e fungos. 0 veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido, e semelhantes), suas misturas adequadas, e óleos vegetais. A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento, tal como lecitina, através da manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e através da utilização de tensioactivos. A prevenção da acção dos microrganismos pode ser realizada através de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos (por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio). A absorção prolongada das composições injectáveis pode ser realizada através da utilização nas composições de agentes que atrasam a absorção (por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina).

Soluções estéreis injectáveis são preparadas incorporando os compostos activos na quantidade requerida no solvente apropriado com vários de outros ingredientes acima enumerados, conforme necessário, seguido por esterilização filtrada. Geralmente, as dispersões são preparadas incorporando os vários ingredientes esterilizados activos num veículo estéril que contém o meio de dispersão básico e os outros ingredientes necessários, para além do enumerado acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são técnicas de vácuo a seco e liofilização que produz um pó do ingrediente activo mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma sua solução previamente esterilizada por filtração. 66

Como aqui utilizado, "veiculo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de atraso de absorção e semelhantes. A utilização desses meios e agentes para substâncias activas farmacêuticas é bem conhecida na técnica. Excepto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o ingrediente activo, a sua utilização nas composições terapêutica está contemplada. Também podem ser incorporados nas composições ingredientes activos suplementares.

Para a administração oral, os polipéptidos da presente invenção podem ser incorporados com excipientes e utilizados na forma de colutórios não ingeriveis e dentifricos. Um colutório pode ser preparado incorporando o ingrediente activo na quantidade necessária num solvente apropriado, tal como uma solução de borato de sódio (Solução de Dobell). Alternativamente, o ingrediente activo pode ser incorporado numa lavagem com anti-séptico contendo borato de sódio, glicerina e bicarbonato de potássio. 0 ingrediente activo também pode ser disperso em dentifricos, incluindo: géis, pastas, pós e lamas. 0 ingrediente activo pode ser adicionado numa quantidade terapeuticamente eficaz a uma pasta dentifrica que pode incluir água, ligandos, abrasivos, agentes aromatizantes, agentes espumantes, e humectantes.

As composições da presente invenção podem ser formuladas numa forma neutral ou de um sal. Os sais f armaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com os grupos amino livres da proteina) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídricos ou fosfóricos, ou ácidos orgânicos como acético, oxálico, 67 tartárico, mandélico, e semelhantes. Sais formados com os grupos carboxilo livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónia, cálcio, ou férrico, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaina e semelhantes.

As composições da presente invenção podem ser formuladas numa forma neutra ou de um sal. Sais f armaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição ácida (formados com os grupos amino livres da proteina) e que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou ácidos orgânicos, tais como acético, oxálico, tartárico, mandélico, e semelhantes. Sais formados com os grupos carboxilo livres também podem ser derivados de bases inorgânicas, tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amónia, cálcio, ou férrico, e bases orgânicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaina e semelhantes.

Após a formulação, as soluções serão administradas de um modo compatível com a formulação de dosagem e nessa quantidade como é terapeuticamente eficaz. As formulações são facilmente administradas numa variedade de formas de dosagem tais como soluções injectáveis, cápsulas de libertação de fármaco e semelhantes. Para administração parentérica numa solução aquosa, por exemplo, a solução deve ser adequadamente tamponada se necessário e o diluente líquido é primeiro tornado isotónico com salina ou glucose suficientes. Estas soluções aquosas particulares são especialmente adequadas para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal. 68

Geralmente, uma quantidade eficaz dos presentes análogos de G-CSF (ou derivados) serão determinados pela idade, peso, e estado ou severidade da doença do recipiente. Ver, Remington's Pharmaceutical Sciences, supra, páginas 697-773, aqui incorporado por referência. Tipicamente, pode ser utilizada uma dosagem entre cerca de 0,001 pg/kg de peso corporal/dia até cerca de 1000 pg/kg de peso corporal/dia, mas pode ser utilizado mais ou menos, como um especialista na técnica reconhecerá. A dosagem pode ser de uma ou mais vezes por dia, ou menos frequentemente, e pode ser em conjunto com outras composições como aqui descrito. Deve ser notado que a presente invenção não está limitada às dosagens aqui referidas. "Dose unitária" é definida como uma quantidade discreta de uma composição terapêutica dispersa num veiculo adequado. Por exemplo, quando os polipéptidos estão a ser administrados parentericamente, as composições polipeptidicas são geralmente injectadas em doses que variam desde 1 pg/kg até 100 mg/kg de peso corporal/dia, de um modo preferido a doses que variam desde 0,1 mg/kg até cerca de 50 mg/kg de peso corporal/dia. A administração parentérica pode ser realizada com um bolus inicial seguido por infusão continua para manter niveis de circulação terapêuticos de produto do fármaco. Os especialistas na técnica optimizarão prontamente as dosagens e os regimes de administração eficazes, como determinado pelas boas práticas médicas e o estado clínico do doente individual. A frequência de dosagem irá depender dos parâmetros farmacocinéticos dos agentes e das vias de administração. A formulação farmacêutica óptima será determinada por um especialista na técnica dependendo da via de administração e da dosagem desejada. Ver, por exemplo, Remington's Pharmaceutical 69

Sciences, supra, páginas 1435-1712. Essas formulações podem influenciar o estado fisico, estabilidade, taxa de libertação in vivo e taxa da eliminação in vivo dos agentes administrados. Dependendo da via de administração, uma dose adequada pode ser calculada de acordo com o peso corporal, áreas da superfície corporal ou tamanho do órgão. Refinamento adicional dos cálculos necessários para determinar a dose de tratamento apropriado é realizado de rotina pelos especialistas na técnica sem experimentação indesejável, especialmente à luz da informação da dosagem e ensaios aqui revelados, assim como os resultados farmacocinéticos observados em ensaios clínicos de animais ou humanos.

As dosagens apropriadas podem ser investigadas através da utilização de ensaios estabelecidos para determinar o nível de neutropenia em conjunto com resultados relevantes de dose-resposta. 0 regime de dosagem final será determinado pelo médico assistente, considerando factores que modificam a acção de fármacos, e. g, a actividade específica do fármaco, severidade da lesão e a capacidade de resposta do doente, a idade, estado, peso corporal, sexo e dieta do doente, a severidade de qualquer infecção, tempo de administração e outros factores clínicos. À medida que os estudos são realizados, mais informação irá emergir em relação aos níveis de dosagem apropriados e à duração do tratamento para doenças e estados específicos.

Na terapia génica as formas de realização que empregam a distribuição virai, a dose unitária pode ser calculada em termos da dose de partículas virais a serem administradas. Doses virais incluem um número particular de partículas de vírus ou unidades de formação de placas (pfu). Para formas de realização 70 2 envolvendo adenovirus, doses de unidade particulares incluem 10 , 101 2 3 4, 105, ΙΟ6, ΙΟ7, ΙΟ8, ΙΟ9, ΙΟ10, ΙΟ11, ΙΟ12, 1013 ou 1014 pfu. As doses de partículas podem ser algo superiores (10 a 100 vezes) devido à presença de partículas deficientes de infecção.

Será apreciado que as composições farmacêuticas e os métodos de tratamento da invenção podem ser úteis nos campos da medicina humana e medicina veterinária. Assim, o indivíduo a ser tratado pode ser um mamífero, de um modo preferido um ser humano ou outro animal. Para objectivos veterinários, os indivíduos incluem, por exemplo, animais domésticos incluindo vacas, ovelhas, porcos, cavalos e cabras, animais de companhia, tais como cães e gatos, animais exóticos e/ou de zoo, animais de laboratório incluindo murganhos, ratos, coelhos, porquinhos-da-índia e hamsters; e aves de capoeira, tais como galinhas, perus, patos e gansos.

Adicionalmente, a presente invenção contempla um kit contendo componentes para cultivar células da medula óssea ou células progenitoras de sangue periférico compreendido por: a) uma composição de análogo de G-CSF da presente invenção; e b) componentes adequados para preparar meio para cultivar células da medula óssea ou células progenitoras de sangue periférico. 71 1

Exemplos 2 A presente invenção é descrita em mais detalhe com 3 referência aos seguintes exemplos não limitantes, que serão 4 fornecidos para ilustrar ainda mais a invenção, mas não devem 5 ser considerados como limitantes do seu âmbito. Os exemplos 6 ilustram a preparação dos presentes análogos de G-CSF e o teste destes análogos in vitro. Os especialistas na técnica entenderão que as técnicas descritas nestes exemplos representam técnicas descritas pelos requerentes para funcionar bem na prática da invenção, e como tal constituem modos preferidos para a sua prática. Todavia, deve ser entendido que os especialistas na técnica devem, à luz da presente revelação, apreciar que podem ser realizadas muitas alterações nos métodos específicos que são revelados e ainda obter um resultado parecido ou semelhante sem se afastar do espirito e do âmbito da invenção. EXEMPLO 1

Concepção Lógica para Mutantes de Histidina

Foram concebidos mutantes de G-CSF com base no principio de que a titulação da histidina pode manter a ligação relativamente apertada na superfície da célula mas conduzir a ligação mais fraca nos compartimentos endossómicos. Tirando vantagem da diminuição do pH de aproximadamente 7 na superfície da célula até entre 5 e 6 nos endossomas, os mutantes foram concebidos para manter largamente (ou melhorar) as interacções electrostáticas a pH extracelular mas piorar a interacção a pH endossómico. 0 pKa da histidina na superfície do ligando livre (~6,5) [Tanokura, Biochim. Biophys. Acta. 742: 576-585 (1982)] sugere que, dado o ambiente de proteína local apropriado, a titulação da histidina pode resultar em grandes efeitos dependentes do pH na ligação entre os meios extracelular e endossómico. Foram utilizados cálculos para identificar as localizações candidatas para a substituição da histidina.

Localizações preferidas são aquelas para as quais a afinidade de ligação computada foi comparável ao tipo selvagem para a 72 histidina neutra e, significativamente, mais fraca para a histidina carregada positivamente. EXEMPLO 2

Preparação e Caracterização de Análogos de G-CSF

Foram preparados análogos de G-CSF quer por mutagénese de inserção ou dirigida do ADN codificando r-met-HuG-CSF utilizando o método de extensão da sobreposição por PCR [Aiyar et al., Meth. Mol. Biol. 57: 177-191 (1996)]. Após confirmação das mutações por análise de sequência, cada um dos mutantes foi expresso em E. coli K12, remoldado, e purificado como descrito em [Lu et al., J. Biol. Chem. 267: 8770-8777 (1992)]. Para protocolos e processos [ver, também, "Recombinant PCR," Russell Higuchi, Em: PCR Protocols, Innis, Gelfand, Sninsky, e White (eds.), Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990); e "Site-directed mutagenesis of cloned DNA", Em: Molecular

Cloning. A Lab Manual, Sambrook, Fritsch, e Maniatis (eds.), Cold Spring Harbor Press, CSH, N.Y. (1989) . A expressão de E. coli de r-met-HuG-CSF foi previamente relatada. Ver

Patente US N° 4810643 e Patente US N° 5849883. O ADN codificando G-CSF-humano recombinante possui um codão de metionina inicial seguido pelos codões para a espécie de 174 aminoácidos de G-CSF humano. Os análogos de r-met-HuG-CSF purificada retêm a Met de iniciação (posição Met-1). A sequência de aminoácidos e a sequência de ácido nucleico para [His109] G-CSF são apresentadas em SEQ ID Nos: 3 (ADN) e 4 (aminoácido) . A sequência de aminoácidos e a sequência de ácido nucleico para [His112] G-CSF são apresentadas na SEQ ID Nos: 5 73 (ADN) e 6 (aminoácido) . A sequência de aminoácidos e a sequência de ácido nucleico para [His119] G-CSF são apresentadas em SEQ ID Nos: 7 (ADN) e 8 (aminoácido). A confirmação da identidade dos análogos de G-CSF da presente invenção foi realizada por sequenciação dos aminoácidos do terminal N das proteinas intactas. As sequências dos análogos de G-CSF purificados emparelham com as sequências previstas a partir das respectivas sequências de ADN, tais como aquelas apresentadas em SEQ ID Nos: 3, 5, e 7. Esses métodos são bem conhecidos na técnica [Shively, EXS 88:99-117 (2000)].

Preparação da Estrutura de Mutantes de Histidina A estrutura de cristais por raios X de G-CSF no complexo 2:2 com o dominio de ligação ao ligando de G-CSFR foi resolvida por Aritomi et al. [Nature 401: 713-717 (1999)] utilizando resultados para 2,8 Â a partir de cristais cultivados e mantidos a pH 7,5 [Aritomi et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 56: 751-753 (2000)]. A estrutura (entrada 1CD9) foi obtida a partir do Banco de Dados de Proteína (www.rcsb.org/pdb/) [Berman et al., Nucl. Acids Res. 28: 235-242 (2000)]. Os cálculos aqui descritos focam-se sobre a interface formada pelos segmentos A e B, que é a interface de ligação principal envolvendo uma molécula de G-CSF e um domínio CRH de G-CSFR (B). As coordenadas para estas cadeias foram extraídas a partir do ficheiro de coordenadas e as posições dos átomos de hidrogénio polares e aromáticos foram construídas utilizando CHARMM [Brooks et al., J. Comput. Chem. 4: 187-217 (1983); Brunger e Karplus, Proteins 4: 148-156 (1988)]. Adicionalmente, um pequeno número de posições a que faltam átomos pesados, todos distantes da 74 interface, foram construídas numa geometria convencional utilizando CHARMM. Do exame das cadeias laterais tituláveis na interface no complexo do tipo selvagem, nenhum deles era a histidina, sugerindo que ficam todos nos seus estados de titulação de pH neutros.

Mutagénese In Silico de G-CSF para Mutantes de Histidina

Os sítios potenciais para as mutações para histidina foram identificados para um processo in silico. As conformações de todas as cadeias laterais de ligando e receptor na interface de ligação a 10 Â da mutação, incluindo a própria mutação, foram reorganizadas numa estrutura rígida utilizando uma biblioteca de rotâmeros convencional [Dunbrack e Karplus, J. Mol. Biol. 230: 543-574 (1993)]. A função energia incorporou as interacções de van der Waals e interacções electrostáticas com uma constante dieléctrica dependente da distância (ε= 4r, em que r está em Ã) e sem selecção, como implementado em CHARMM19 [Brooks et al., J. Comput. Chem. 4: 187-217 (1983); Gilson e Honig, Nature 330: 84-86 (1987)], estendido para incluir cargas atómicas parciais PARSE [Sitkoff et al., J. Phys. Chem. 98: 1978-1988 (1994)].

Verificou-se que os complexos de energia minimizada utilizavam eliminação da terminação (e A*) [Desmet et al., Nature 356: 539-542 (1992); Goldstein, Biophys. J. 66: 1335-1340 (1994)].

Este procedimento, quando aplicado ao complexo de tipo selvagem, reconstrói correctamente a estrutura de cristal dentro da resolução da biblioteca de rotâmeros. 75 Cálculos Electrostáticos para Mutantes de Histldlna A selecção de resíduos em G-CSF para mutações em histidina foi determinada por considerações electrostáticas. Os detalhes computacionais foram semelhantes aos de um trabalho publicado [Hendsch e Tidor, Protein Sei. 8: 1381-1392 (1999)]. Os cálculos electrostáticos contínuos foram efectuados por resolução da equação de Poisson-Boltzmann linearizada com métodos de diferença finita utilizando uma versão localmente modificada do programa de computador DELPHI [Gilson e Honig, Nature 330: 84-86 (1987); Gilson et al., J. Comput. Chem. 9: 327-335 (1988); Sharp e Honig, Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19: 301-332 (1990)].

Os parâmetros PARSE foram utilizados para raios atómicos e cargas atómicas parciais [Sitkoff et al., J Plzys. Clieln. 98: 1978-1988 (1994) ] . Foi utilizado um valor de 4 para a constante dieléctrica da proteína e 80 para o solvente. A superfície molecular foi descrita utilizando uma esfera sonda de 1,4 Â e a força iónica global foi escolhida para ser 145 mM com uma camada Stern de 2 Â. Os cálculos foram realizados utilizando um processo de focalização de dois passos com enchimento de 23% e 92%. Para visualização de potenciais eléctricos, foi utilizada uma rede cúbica de 65 x 65 x 65 de unidade de grelha. Para os cálculos da energia livre de ligação electrostática, foi utilizada uma grelha de 191 x 191 x 191 (espaçamento final da grelha de 0,476 Â) e cada valor dado foi a média de 10 cópias da molécula em relação à grelha. A complementaridade electrostática sugeriu seis sítios de mutação candidatos. A predominância de regiões negativas indica a densidade excessiva de carga negativa, incluindo as localizações correspondendo aos resíduos carregados Glu19, Asp109 e Asp112 assim como os resíduos polares Gin20, Thr116, e Gin119. 76

Produção de Estruturas de Mutantes de Histidina

Complexos mutantes, em que cada um dos seis resíduos do ligando (Glu19, Gin20, Asp109, Asp112 Thr e Gin119) foram unicamente alterados na histidina, foram produzidos por análise computacional. Cada posição foi substituída com dois tautómeros de histidina neutros (protonados no azoto δ ou ε, indicados como carregada (His+) . Foi utilizado um processo de minimização restrita em que foi dada liberdade total de reorganização à cadeia lateral do mutante e os resíduos na vizinhança utilizando algoritmos baseados na eliminação da terminação e A* [Desmet et al., Nature 356: 539-542 (1992); Goldstein, Biophys. J. 66: 1335-1340 (1994); Leach e Lemon, Proteins 33: 227-239 (1998)]. A complementaridade dos complexos mutantes foi visualizada e comparada com o tipo selvagem.

Selecçâo de Candidatos Mutantes de Histidina

Os candidatos foram seleccionados para testes experimentais com base no princípio de que os mutantes se devem ligar ao receptor tão fracamente quanto (ou talvez ainda melhor do que) o tipo selvagem para a melhor ligação do tautómero His° (correspondente às condições à superfície da célula) e significativamente mais fracamente do que o tipo selvagem para His+ (correspondente às condições endossómicas). Quando a diferença entre a ligação de His° e His+ é mais do que apenas algumas kcal/mol, não existe vantagem em alargá-la porque será maior do que o custo da desprotonação de His+ no estado não ligado e a ligação como His°. Deste modo, foram preparados Asp109His e Aspll2His e purificados para caracterização 77 experimental. Adicionalmente, porque foi previsto que Gln119His se ligava melhor do que o tipo selvagem à superfície da célula, foi também preparado e purificado embora não fosse tão óbvio a partir dos cálculos que a ligação fosse significativamente mais fraca nos endossomas.

Valores de Energia Livre de Ligação Electrostática para o Tipo selvagem e Mutantes de Histidina A contribuição electrostática para a energia livre da ligação para o tipo selvagem e para cada um dos mutantes HíSõ°,

Hiss°, e His+ foi calculada utilizando um modelo simples de ligação rigida e de electrostática continuo. Embora não tratando todos os detalhes da ligação explicitamente, este modelo é directamente aplicável e deve ser capaz de distinguir de moderadas a grandes diferenças entre os complexos. Os resultados mostraram poucos comportamentos diferentes. A maior parte dos mutantes His° apresentam uma ligação (pelo menos um dos tautómeros de histidina) quase, mas não exactamente, como a do tipo selvagem (até 2,5 kcal/mol pior). Duas excepções são

Glu19HisO, que não é tolerado no complexo (calculado para ligar fracamente 10 kcal/mol pior do que o tipo selvagem) e Gln119His°, que é calculado para ligar, de alguma forma, melhor do que o tipo selvagem (em 1,7 kcal/mol para o tautómero ΗίΞδ0) .

Interessantemente, Glu19 parece essencial para a ligação ao receptor [Reidhaar-Olson et al., Biochemistry 35: 9034-9041 (1996); Layton et al., J. Biol. Chem. 274: 17445-17451 (1999)].

Num ensaio de proliferação de células, Glu19Ala promove essencialmente a não resposta (resultados não apresentados), consistente com este cálculo. Para três dos mutantes [Glu19His ( [His19] G-CSF) , Asp109His ( [His109] G-CSF) , e 78

Asp112His ( [His112] G-CSF) ] , é previsto que a dependência do pH da ligação se altere na direcção desejada porque His+ tem uma energia livre de ligação calculada em cerca de 5 ou mais kcal/mol pior do que His0 (e mais do que 7 kcal/mol pior do que o tipo selvagem). Para os outros três mutantes [Gln21His ( [His21] G-CSF) , Thr117His ( [His117] G-CSF) , e Gln119His ( [His119] G-CSF) ] a diferença na ligação entre His0 e His+ é muito próxima para ser de confiança de acordo com as previsões (menos do que 1 kcal/mol). EXEMPLO 3

Materiais Experimentais e Cultura de Células

Meio minimo essencial alfa (MEMa), L-glutamina, penicilina-estreptomicina, e soro fetal de bovino (FBS) foram obtidos de Life Technologies, Inc. (Rockville, MD). A solução isotónica para o contador Coulter (ISOTON II, Coulter Diagnostics, Hialeah, FL) foi obtida de Curtin Matheson Scientific Inc. (Houston, TX). A suspensão da linha de células dependente de G-CSF, OCI/AML1, uma generosa oferta de Ernest A. McCulloch [Ontario Câncer Institute (OCI), Princess Margaret Hospital, 610

University Avenue, Toronto, Ontario, MSG 2M9, Canadá], foi utilizada para todas as experiências. As células foram rotineiramente cultivadas em frascos de cultura de tecidos Corning 75-cm2 em MEMa suplementado com 20% de FBS, 200 mM de L-glutamina, 100 unidades/mL penicilina, 100 g/mL estreptomicina, e 270 pM de G-CSF numa atmosfera húmida com 5% 79 de CO2. As células foram passadas para 105 células/mL em cada 3 até 4 dias. EXEMPLO 4

Resultados Experimentais com Mutantes de Histidina

Ensaio de Proliferação Celular

Todos os mutantes de histidina - [His109] G-CSF, [His112]G-CS F, e [His119] G-CSF - foram comparados com G-CSF de tipo selvagem num ensaio de proliferação de células dependentes de G-CSF. Células 0CI/AML1 foram passadas para meio MEMa suplementado (sem G-CSF) 24 h antes do inicio da experiência de proliferação de células, ponto em que foram incubados frascos paralelos com células a uma densidade de 105 células/mL em meio MEMa com 125 pM de G-CSF de tipo selvagem, [His109] G-CSF, [His112] G-CSF, ou [His119]G-CSF. O crescimento celular em cada frasco foi medido nos dias 2, 5, e 8 utilizando um contador Coulter. Após dois dias, não foram detectadas diferenças na proliferação de células. Todavia, após cinco dias, [His119] G-CSF aumentou significativamente a proliferação celular. No dia 8, as células tratadas com [His119] G-CSF foram quase o dobro do número de controlo, e as células tratadas com [His109] G-CSF e [His112] G-CSF um menor aumento, mas significativo, sobre o controlo. Deste modo, todos os mutantes foram mais potentes do que G-CSF de tipo selvagem na promoção da proliferação de células, apesar do facto de que todos os resíduos alterados se situam directamente na interface com o receptor. 80

Depleção do Ligando A depleção do ligando para cada proteína foi medida ao longo do tempo. Como nas experiências acima, foram passadas células 0CI/AML1 em meio MEMaa suplementado (sem G-CSF) 24 h antes do início das experiências de depleção do ligando, ponto em que frascos paralelos de células com uma densidade de 105 células/mL foram incubadas em meio MEMa com 125 pM de G-CSF de tipo selvagem, [His109] G-CSF, [His112] G-CSF, ou [His119] G-CSF. após 24 h, o número de células em cada frasco foi medida conforme descrito acima e uma fracção de cada sobrenadante de meio, obtido após centrifugação para sedimentar os resíduos celulares, foi armazenado a -20 °C para medida da concentração de G-CS. Isto foi repetido a cada 24 h durante oito dias. As concentrações de G-CSF, [His L09] G-CSF, [His112] G-CSF, e [His119] G-CSF no sobrenadante de meio das amostras foram quantificadas utilizando kits de ensaio de imunoadsorventes ligados a enzima (ELISA) obtidos de R&D Systems (Minneapolis, MN). Cada amostra de sobrenadante foi analisada em duplicado. Ambos os mutantes Asp-His, que foram previstos como os melhores em termos de propriedades de tráfego, resultaram em semi-vidas, pelo menos, 10 vezes superiores às de G-CSF de tipo selvagem. De facto, parece que a melhoria salientada anteriormente na proliferação de células de ambos os mutantes Asp-His {[His109]G-CSF e [His112] G-CSF} no dia 8 em relação ao tipo selvagem é um resultado directo de possuir ligando suficiente disponível para estimular as células. Adicionalmente, o mutante Gln->His, [His119] G-CSF, possuía uma semi-vida 6 vezes superior à do tipo selvagem. Isto foi significativo, uma vez que a potência deste mutante resultou em quase duas vezes mais células do que o tipo selvagem no dia 8, e deste modo pode esperar-se que o tráfego celular deste mutante seja superior ao do tipo selvagem. 81

Foram efectuadas pelo menos duas experiências independentes para o estudo da proliferação de células e da depleção do ligando.

Ligação do Ligando A afinidade de ligação do ligando do análogo de G-CSF ao receptor de G-CSF é medida utilizando um BIAcore®2000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) . A GCSF do tipo selvagem marcada com histidina é imobilizada à superfície do chip, e o receptor livre (-0,25-10 nM) é passado ao longo do chip para produzir uma curva padrão de equilíbrio e para calcular a afinidade de ligação do tipo selvagem utilizando um modelo 1:1. Para determinar a afinidade de cada ligação ao ligando mutante, foram misturados 2 nM de receptor livre com uma concentração conhecida do ligando mutante e passados ao longo do chip. As afinidades de ligação de equilíbrio são determinadas, utilizando um modelo 1:1 com competição. Os dados de afinidade de ligação são analisados utilizando o programa de computador BIA evaluation 3.1 (BIAcore, Inc.); e são determinadas as constantes de dissociação de equilíbrio (KD).

Para determinar se o aumento na semi-vida e potência dos mutantes é atribuído a taxas superiores de reciclagem de ligando, as constantes das taxas indicativas da internalização do complexo e reciclagem de ligando foram medidas e reportadas como se segue. 82

Internaiização de Análogos de G-CSF

As experiências de internalização foram efectuadas em dois dos análogos de G-CSF, [His109] G-CSF, [His112] G-CSF, durante um periodo de 5 min., de modo semelhante ao publicado no trabalho [Kuwabara et al., Amer. J. Physiol. Endocrinol. Metabol. 32: El-E9 (1995)]. Resumidamente, foram lavadas 108 células duas vezes com PBS e depois incubadas em gelo em ligando marcado durante 30 min. para obter complexos de superfície. As células foram de novo lavadas duas vezes com PBS arrefecido em gelo e ressuspendidas em MEMa a 37 °C a t=0. A alteração nos complexos de superfície e complexos internos foi seguida durante um periodo de tempo de 5 min.; uma representação de complexos internos versus o tempo integral de complexos de superfície leva a uma relação linear, cujo declive é a constante da taxa de internalização do complexo [Wiley et al., J. Biol. Chem. 257: 4222-4229 (1982)]. Não foram detectadas diferenças na taxa de internalização entre o G-CSF de tipo selvagem e o [His109] G-CSF e os análogos de [His112] G-CSF. Os erros associados com as experiências de internalização são desvios padrão de, pelo menos, três experiências independentes.

Reciclagem de análogos de G-CSF

Foram realizadas experiências de reciclagem em dois dos análogos de G-CSF, [His109] G-CSF, [His112] G-CSF, de forma idêntica às experiências de internalização acima, excepto que ao longo de um periodo de 25 min. Os parâmetros dos dados da experiência de reciclagem foram ajustados para obter as constantes da taxa de reciclagem. Verificou-se que as constantes das taxas de reciclagem para os mutantes eram, pelo menos, superiores em 50% 83 às do tipo selvagem com 95% de confiança pelo teste de duas amostras. Os erros associados com as experiências de reciclagem eram desvios padrão de, pelo menos, três experiências independentes. Este melhoramento na reciclagem de ligando foi exactamente o objectivo pretendido através da utilização de modelação computacional aqui apresentado. Embora o aumento medido na reciclagem seja efectivamente de uma ronda de internalização, o grande aumento da semi-vida dos mutantes resulta do efeito composto da internalização, reciclagem, re-internalização e assim sucessivamente. Deste modo, o efeito interactivo do fenómeno da reciclagem pode melhorar fortemente a potência do fármaco, aumentando o seu tempo de vida in vivo e reduzindo a retroacção negativa propagada pela expansão induzida pelo fármaco de células que expressam o receptor alvo.

Consequentemente, como indicado acima, verificou-se que as substituições de histidina da presente invenção resultam em análogos de G-CSF que possuem igual ou maior potência em relação a G-CSF doe tipo selvagem num ensaio de proliferação de células. Também, as semi-vidas dos mutantes foram 6-10 vezes as de G-CSF de tipo selvagem. Além disso, [His119] G-CSF induziu a proliferação de células até quase duplicar a de G-CSF de tipo selvagem no dia 8. Adicionalmente, a reciclagem de ligando foi significativamente melhorada, embora a taxa de internalização tenha permanecido inalterada. Estes resultados são significativos, porque sugerem que o tráfego celular deste mutante é melhorado em relação ao tipo selvagem. Estas alterações na resposta celular ocorrem afectando a ligação ao receptor de G-CSF e/ou os processos de selecção, reciclagem, e degradação através das vias de tráfego endocitico de ligando/receptor. 84 A metodologia aqui apresentada é generalizável também a outros sistemas para além do sistema G-CSF/G-CSFR. Dada uma estrutura de cristal de um complexo ligando-receptor, a técnica de "desligar a histidina" proporciona uma base de trabalho para produzir mutantes com reciclagem de componentes endossómicos melhorada dos complexos transportados. Este é o primeiro trabalho para demonstrar a concepção reaccional de fármaco no contexto ao nivel de sistemas, de uma análise de tráfego celular, em vez de uma ligação individual ou acontecimentos de sinalização só por si.

Embora a presente invenção tenha sido descrita em termos de formas de realização preferidas, deve ser entendido que as variações e modificações ocorrerão ao especialista na técnica. Deste modo, pretende-se que as reivindicações em anexo cobrem todas as variações equivalentes que se integram no âmbito da invenção tal como reivindicado. 85

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Sarkar, Casim

Lauffenburger, Douglas Tidor, Bruce <12 0> Compc 'sições i <130> 01017 /37377 <160> 8 <17 0> Patent In ve. <210> 1 <211> 565 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0> <221> CDS <222> (33) . . (554)

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<210> 5 <211> 565 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (33)..(554) <22 0> <221> característica_misc <222> (368) <223> y = c ou t <400> 5 92 tctôg&saaa aec&sggagg fcg act eca fcfca Thr Pr© Leu 1 tct Ser ctg Les ccg Pio 20 ca a Gl» age Ser fctt Phe ate cag lie Ol» 2 5 ggt Gly gae Aâp ggt Gly gct Ala asa Lys 4(2 ctg Leu tgc Cys CS t HÍS ccg Pr© gsa Glu 4.S at© lie ©cg Pr© fcgs Trp gCt Ma «eg Pr© ee Ctg Leu gefc ggt tgt ctg tct CHS Ma Gly cy* Leu 75 Ser Gin ctt ctg eaa qcfc çtg gaa Leu Leu <31 n 90 Ãla Leu Glu gac act Ctg: cag ©ta gat Asp Thir 205 Leu Gla Leu Ásp eag atg gaa gag etc sst Gl» Hat 120 Ólv Gl« Leu Gly XSS get atg ceg gea tfcc gct Ãla Met Pr© Ala Pfee 140 Ala ctg gtt get tct cat etg Leu Vãl Ala Ser 155 His Lêu- ctg: cgt cafc ctg gct cag Leu Arg His 170 Leu Ala Gin ctg ctg aaa tgt ctg gas Leu Leu 25 Lys Cys Leu Glu gea ctg ca* gaa aaa ctg Ala 20 Leu Gin Glu Lys Leu 35 gct çtg- gta ctg stg ggt Ala Leu Vai Leu Leu. 56 Gly tct tct fcgc CÇ!ã tct Ser ser Cys Pr© 65 Ser Gl» ctg cat tct 99t ©tg fcte Leu MÍ.S .ser so «ly Leu ggt ate tct ccg gaa ctg Gly lia Ser Pr© Glu Leu gta gct csy ttt gct act Vai lio Ala Kia Pb® Ala Thx 115 atg gea CCS gct ctg caa »at Ala Pr© Ala Leu 230 Gl» tct gea fctç cag egfc cgt Ser Ala Phe Gin 14 S Arg Arg cáa tct fcte ctg gaa gta Gin Ser Pke leo Leu Glu Vai ©cg Pr© taatagãatt e 9St Gly ccfc P£© 5 gct. Ma tct Ser 53 eaq Cl» 20 gtt Vai ©gt Arg aaa Lys 101 tg© Cys gct Ala act Th» tac Tyr 24 f cat Bi# tct Ser ett Leu 009 Gly S5 197 gct. Ala ctt Leu çag Gin 70 ctg Leu .345

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Lisboa, 26 de Janeiro de 2007 97

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido análogo do Factor de Estimulação de Colónias de Granulócitos humano (G-CSF) que compreende uma substituição de aminoácidos na sequência de SEQ ID N°: 2 seleccionada a partir do grupo consistindo em: a) uma substituição de ácido aspártico com histidina na posição número 109, [His109] G-CSF; b) uma substituição de ácido aspártico com histidina na posição número 112, [His112] G-CSF; c) uma substituição de glutamina com histidina na posição número 119, [His119] G-CSF; e d) qualquer um dos referidos análogos das sub-partes (a-c) incluindo, opcionalmente, um residuo metionilo N-terminal.
2. Polipéptido análogo de G-CSF da reivindicação 1 derivado com um ou mais polímeros solúveis em água.
3. Composição farmacêutica compreendendo um polipéptido análogo de G-CSF de acordo com as reivindicações 1 ou 2, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
4. Polinucleótido codificando um análogo do polipéptido do G-CSF humano que compreende uma substituição de aminoácido na sequência de SEQ ID N°: 2 seleccionada a partir do grupo consistindo em: 1 a) uma substituição de ácido aspártico com histidina na posição número 109, [His109-CSF; ~ b) uma substituição de ácido aspártico com histidina na posição número 112, [His112] G-CSF; c) uma substituição de glutamina com histidina na posição número 119, [His119] G-CSF; e d) qualquer um dos referidos análogos das sub-partes (a-c) incluindo opcionalmente um residuo de metionilo N-terminal.
5. Polinucleótido da reivindicação 4 em que a referida molécula é seleccionada a partir do grupo consistindo em: a) as sequências de ADN apresentadas nas SEQ ID Nos: 3, 5, ou 7 (e cadeias complementares); e b) qualquer das sequências de ADN da sub-parte (a) adicionalmente codificando um residuo metionilo N-terminal.
6. Construção de expressão contendo um polinucleótido de acordo com a reivindicação 4.
7. Célula hospedeira contendo um polinucleótido de acordo com a reivindicação 4.
8. Célula hospedeira da reivindicação 7 em que a referida célula hospedeira é seleccionada a partir do grupo 2 consistindo numa bactéria, célula de mamífero, célula cancerosa, células de levedura, e célula de insecto.
9. Processo para produzir polipéptidos análogos a G-CSF [His109] G-CSF, [His112] G-CSF, [His119] G-CSF, ou a espécie Met"1 destes a partir de uma célula hospedeira contendo ácido nucleico codificando esses análogos, em que o referido processo compreende: a) cultivar a referida célula hospedeira contendo um polipéptido de acordo com a reivindicação 4 sob condições que facilitam a expressão desse polipéptido; e b) obter esse polipéptido análogo de G-CSF.
10. Utilização de um polipéptido de acordo com as reivindicações 1 ou 2 para preparar uma composição farmacêutica para tratar estados hematopoiéticos, neurológicos ou relacionados com a reprodução.
11. Utilização de um polipéptido de acordo com a reivindicação 10, em que o referido estado é seleccionado a partir do grupo consistindo em: função hematopoiética reduzida, função imunitária reduzida, contagem de neutrófilos reduzida, mobilização de neutrófilos reduzida, mobilização de células progenitoras de sangue periférico, sepsia, neutropenia crónica severa, transplantes de medula óssea, doenças infecciosas, leucopenia, trombocitopenia, anemia, aumento da enxertia da medula óssea durante o transplante, aumento da recuperação da medula óssea no tratamento de radiação, aplasia da medula óssea induzida por agentes químicos ou 3 quimioterapia ou mielossupressão, e sindrome da imunodeficiência adquirida.
12. Utilização de um polipéptido de acordo com as reivindicações 1 ou 2 para a preparação de uma composição farmacêutica para sensibilizar células para quimioterapia e radioterapia.
13. Utilização de um polipéptido de acordo com qualquer das reivindicações 10 até 11 em que a referida composição farmacêutica inclui pelo menos um factor adicional seleccionado de entre EPO, G-CSF, SCF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, interleucinas, IGF-1, LIF, interferão, um factor neurotrófico, ligando flt-3/flk-2, e um factor de crescimento de fibroblastos.
14. Método para cultivar células hematopoiéticas in vitro compreendendo: a) colocar as referidas células num meio de cultura adequado, contendo o referido meio de cultura um polipéptido análogo de G-CSF de acordo com a reivindicação 1; e b) proporcionar condições análogas para o cultivo das referidas células hematopoiéticas.
15. Método da reivindicação 14, em que o referido cultivo inclui a utilização de pelo menos, um factor adicional seleccionado de entre EPO, G-CSF, SCF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-β, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, interleucinas, IGF-1, LIF, interferão, um 4 factor neurotrófico, ligando flt-3/flk-2, e um factor de crescimento de fibroblastos.
16. Kit contendo os componentes para cultivar células hematopoiéticas compreendidas por: a) qualquer dos polipéptidos análogos da reivindicação 1; b) componentes adequados para preparar meio para cultivar células hematopoiéticas; e, c) opcionalmente, pelo menos um factor adicional seleccionado de entre EPO, G-CSF, SCF, M-GDF, GM-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, interleucinas, IGF-1, LIF, interferão, um factor neurotrófico, ligando flt-3/flk-2 e um factor de crescimento de fibroblasto. Lisboa, 26 de Janeiro de 2007 5