DE60125381T2

DE60125381T2 - Zusammensetzungen und verfahren mit analogen von g-csf

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Publication number: DE60125381T2
Application number: DE60125381T
Authority: DE
Inventors: A. Casim Cambridge SARKAR; A. Douglas Cambridge LAUFFENBURGER; Bruce Lexington TIDOR
Original assignee: Massachusetts Institute of Technology
Current assignee: Massachusetts Institute of Technology
Priority date: 2000-09-08
Filing date: 2001-09-10
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2021-09-11
Also published as: US20030166527A1; MXPA03002045A; WO2002020767A2; US6946548B2; DE60125381D1; WO2002020766A2; US20020151488A1; ATE348883T1; US20050003453A1; AU9084601A; JP2004524005A; US7371370B2; MXPA03002046A; WO2002020766A3; US20050123508A1; AU9096001A; AU2006201824A1; JP4799803B2; CA2421760A1; JP2004508044A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen mit Polypeptid-Analoga des Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktors ("G-CSF"), damit zusammenhängende Nukleinsäuren, und Vektoren, Wirtszellen und Verfahren zur Herstellung der vorliegenden, zu G-CSF analogen Polypeptide mit rekombinanter DNA. Zusätzlich werden pharmazeutische Zusammensetzungen und Verfahren der Verwendung bereitgestellt. Einige Ausführungsformen der Erfindung sollten auch noch über Zusammensetzungen mit G-CSF-Analoga hinaus verallgemeinerbar sein.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Viele therapeutische Liganden rufen zelluläre Reaktionen durch Binden an Zelloberflächenrezeptoren hervor, um zelluläre Reaktionen hervorzurufen. Das Arzneistoffdesign konzentriert sich typischerweise auf die Fähigkeit eines Liganden, fest und spezifisch an sein beabsichtigtes Ziel zu binden. Wenn der Arzneistoff jedoch ein Protein und das Ziel ein Zelloberflächenrezeptor ist, gibt es, von einer Analyse auf der Systemebene aus, zusätzliche Sachverhalte zu berücksichtigen. Wenn therapeutische Liganden auf der Oberfläche einer Zelle an Rezeptoren binden, wird eine intrazelluläre Signalkaskade ausgelöst, die letztendlich zu einer angemessenen zellulären Reaktion führt. Zusätzlich beginnt fast sofort eine Modulation – im Allgemeinen eine Abschwächung – dieser Signale durch zelluläres Trafficking der Liganden-Rezeptor-Komplexe. Die Komplexe auf der Oberfläche der Zelle werden in Vesikel internalisiert, die mit endosomalen Kompartimenten fusionieren. Von Endosomen aus können die Moleküle entweder zur Degradation in Lysosomen geleitet werden oder intakt der Wiederverwendung auf der Zelloberfläche zugeführt werden, wo freie und ligandengebundene Rezeptoren erneut präsentiert werden und freier Ligand in das extrazelluläre Medium freigesetzt wird. Neueste Evidenz legt nahe, dass das Resultat dieser Sortierentscheidung für Komplexe, die Wachstumsfaktoren oder Cytokine einbeziehen, häufig mit der endosomalen Affinitätskonstante für die Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung zusammenhängt: Komplexe, die gebunden bleiben, werden leicht abgebaut, während die, die dissoziieren, der Wiederverwendung zugeführt werden [Lauffenburger et al., Chem. Biol. 5: R257–R263 (1998)]. Im Allgemeinen scheint die Dissoziation von Komplexen in Endosomen das Rezeptor-Recycling zu verstärken, weil es zu veränderten Wechselwirkungen zwischen den Rezeptoren und endosomalen Rückhaltekomponenten führt.
Zusätzlich deutet das Modellieren für eine geringe Zahl intrazellulärer Komplexe, was für viele klinisch wichtige Cytokin-Rezeptor-Systeme der Fall ist, eine besonders starke positive Korrelation zwischen der inversen endosomalen Affinität und der Fraktion der Wiederverwendung zugeführter Liganden an [French und Lauffenburger, Ann. Biomed. Eng. 25: 690–707 (1997)]. So könnte der Arzneistoff, falls ein Ligand so gestaltet werden könnte, dass er die endosomale Dissoziation nach dem Binden an seine Zielzelle und Erzeugen von Signalen in seiner Zielzelle verstärkt, die Herunterregulierung des Rezeptors reduzieren, so dass Zellen auf weitere Ligandenstimulation ansprechbarer würden. Die Lebensdauer und Wirksamkeit des Arzneistoffes könnten auch verstärkt werden, falls das Liganden-Recycling durch endosomale Dissoziation vermehrt würde. Dies steht im Gegensatz zu dem herkömmlichen Ansatz, die Ligandenstärke durch verstärkte Affinität zu verbessern. Falls sich Verstärkungen der extrazellulären Affinität auf Endosomen ausdehnen, könnten derartige Versuche tatsächlich kontraproduktiv sein, weil sie die Herunterregulierung des Rezeptors und möglicherweise die Liganden-Verarmung erhöhen. So kann das zelluläre Trafficking ein Engpass beim Verstärken der Ligandenstärke sein, besonders in Fällen, wo Abbau durch rezeptorvermittelte Endozytose signifikant ist.
Ein System, bei dem die Optimierung zellulärer Trafficking-Eigenschaften eine tiefgreifende Auswirkung auf die Stärke haben könnte, ist das des Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktors (G-CSF) und dessen Rezeptors (G-CSFR). G-CSF ist ein Cytokin von 19 kD, bei dem es sich um einen der hämatopoetischen Wachstumsfaktoren handelt, die auch koloniestimulierende Faktoren genannt werden. G-CSF wird verwendet, um die Zahlen der weißen Blutzellen (neutrophilen Zellen) zu erhöhen, wenn die Blutwerte derartiger Zellen gefährlich niedrig sind. Dies kommt häufig vor, wenn bestimmte Antikörper, anti-HIV-Therapien und/oder Chemotherapien das Knochenmark supprimieren. Eine neueste Untersuchung dokumentiert, dass G-CSF nicht nur die Zahl der neutrophilen Zellen im Blut erhöht, sondern auch noch die funktionellen Killing-Fähigkeiten dieser Zellen verstärkt [Vecchiarelli et al., J. Infect. Dis. 171: 1448–1454 (1995)]. G-CSF stimuliert spezifisch die Proliferation und Differenzierung neutrophiler Vorläuferzellen zu reifen neutrophilen Zellen [Fukunaga et al., Cell 74: 1079–1087 (1993)] und ist zum Behandeln bei Neutropenie-Leiden nützlich [Welte et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 152–1530 (1985); Souza et al., Science 232: 61–65 (1986); Gabrilove, Sem. Hematol. 26(2): 1–14 (1989)]. G-CSF erhöht die Zahl der zirkulierenden Granulozyten und es ist berichtet worden, dass es die Infektion in Sepsis-Modellen verbessert. G-CSF-Verabreichung hemmt auch die Freisetzung des Tumor-Nekrose-Faktors (TNF), einem bei Gewebeverletzung während Sepsis und Abstoßung wichtigen Cytokin [Wendel et al., J. Immunol. 149: 918–924 (1992)]. G-CSF ist ein Mitglied der Gruppe-I-Cytokin-Superfamilie, die durch eine antiparallele 4-helikale Bündel-Struktur gekennzeichnet ist und andere therapeutisch wichtige Arzneistoffe, wie zum Beispiel Erythropoetin und das Wachstumshormon, einschließt. G-CSF bindet spezifisch und mit hoher Affinität (scheinbare K_D ~ 100 pM) [Morstyn, Dexter, & Foote (Hrsg.) Filgrastim (r-metHuG-CSF) in: Clinical Practice, Ausg. 2., Marcel Dekker, Inc., New York (1998)] an G-CSFR, was zu einem Liganden-Rezeptor-Komplex mit einer 2:2-Stöchiometrie führt [Horan et al., Biochemistry 35: 4886–4896 (1996); Horan et al., J. Biochem. 121: 370–375 (1997)]. Der extrazelluläre Bereich von G-CSFR enthält die ligandenbindende Cytokin-Rezeptor-Homologie-(CRH-) Domäne [Fukunaga et al., EMBO J. 10: 2855–2865 (1991)] und kürzlich wurde die Kristallstruktur von G-CSF im Komplex mit der CRH-Domäne von G-CSFR aufgeklärt, wobei sie die erwartete 2:2-Stöchiometrie von Ligand:Rezeptor zeigte [Aritomi et al., Nature, 401: 713–717 (1999)].
Bei Menschen ist endogenes G-CSF im Blutplasma nachweisbar [Jones et al., Bailliere's Clin. Hematol. 2(1): 83–111 (1989)]. G-CSF wird von Fibroblasten, Makrophagen, T-Zellen, Trophoblasten, Endothelzellen und Epithelzellen produziert und ist das Expressionsprodukt eines Gens mit nur einer Kopie, das vier Exons und fünf Introns umfasst und auf Chromosom siebzehn liegt. Die Transkription dieses Locus produziert eine mRNA-Spezies, die unterschiedlich prozessiert wird, was zu zwei Formen der G-CSF-mRNA führt, wobei eine Version ein Protein von 177 Aminosäuren kodiert und die andere ein Protein von 174 Aminosäuren kodiert [Nagata et al., EMBO J. 5: 575–581 (1986)]. Es ist festgestellt worden, dass die aus 174 Aminosäuren bestehende Form spezifische biologische Aktivität in vivo aufweist. SEQ ID NO: 1 legt eine DNA vor, welche die 174-Aminosäuren-Spezies von G-CSF kodiert und die entsprechende Sequenz von Aminosäuren wird in SEQ ID NO: 2 dargelegt. G-CSF ist mit anderen Arten kreuzreaktiv, so dass anhaltende Neutrophil-Leukozytose hervorgerufen wird, wenn menschliches G-CSF einem anderen Säuger, wie zum Beispiel einer Maus, einem Hund oder einem Affen, verabreicht wird [Moore et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7134–7138 (1987)].
Menschliches G-CSF kann aus etlichen Quellen erhalten und gereinigt werden. Natürliches menschliches G-CSF kann aus den Überständen kultivierter menschlicher Tumorzelllinien isoliert werden. Die Entwicklung rekombinanter DNA-Technologie hat die Herstellung von Mengen an G-CSF in glykosylierter Form als Produkt eukaroytischer Wirtszellexpression und G-CSF in nicht glykosylierter Form als Produkt prokaroytischer Wirtszellexpression im kommerziellen Maßstab ermöglicht. Siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 4.810.643 (Souza).
Es ist festgestellt worden, dass G-CSF bei der Behandlung von Indikationen, bei denen eine Zunahme der neutrophilen Zellen Vorteile bereitstellt, nützlich ist. Für Krebspatienten ist G-CSF zum Beispiel als Mittel zum selektiven Stimulieren der Produktion neutrophiler Zellen vorteilhaft, um hämatopoetische Defizite zu kompensieren, die sich aus Chemotherapie oder Strahlentherapie ergeben. Andere Indikationen schließen die Behandlung verschiedener Infektionskrankheiten und damit zusammenhängender Leiden, wie zum Beispiel Sepsis, die typischerweise durch einen Bakterienmetaboliten verursacht wird, ein. G-CSF ist auch alleine oder in Kombination mit anderen Verbindungen, wie zum Beispiel anderen Cytokinen, zum Wachstum oder zur Expansion von Zellen in Kultur nützlich (zum Beispiel für Knochenmarktransplantate oder ex-vivo-Expansion). G-CSF ist Transplantatpatienten als ein Zusatz zur Behandlung einer Infektion oder zur Behandlung der Neutropenie verabreicht worden [Diflo et al., Hepatology 16: PA 278 (1992); Wright et al., Hepatology 14: PA 48 (1991); Lachaux et al., J. Ped. 123:1005–1008 (1993); Colquehoun et al., Transplantation 56: 755–758 (1993)]. G-CSF wird jedoch schnell durch rezeptorvermittelte Endozytose von peripheren neutrophilen Zellen und Vorläuferzellen im Knochenmark, die G-CSFR exprimieren, beseitigt [Morstyn, Dexter, & Foote (Hrsg.) Filgrastim (r-metHuG-CSF) in: Clinical Practice, Ausg. 2., Marcel Dekker, Inc., New York (1998)]. So wird die Stärke des Arzneistoffes durch diesen negativen Rückkopplungsmechanismus reduziert. Da Zellen G-CSFR normalerweise in geringen Mengen exprimieren, kann das Senken der endosomalen Affinität des Komplexes nicht nur die Herunterregulierung des Rezeptors reduzieren, sondern kann auch das Liganden-Recycling verstärken, wie durch Modellieren vorhergesagt wird [French und Lauffenburger, Ann. Biomed. Eng. 25: 690–707 (1997)]. Deshalb ist G-CSF ein erstklassiger Kandidat für Mutagenese, um die Trafficking-Eigenschaften zu verstärken und damit die Arzneistoffstärke zu verbessern.
Von verschiedenen veränderten G-CSFs ist berichtet worden. Im Allgemeinen ist beim Gestalten von Arzneistoffen bekannt, dass bestimmte Änderungen bestimmte strukturelle Wirkungen haben. Zum Beispiel könnte das Deletieren eines Cysteins zum Entfalten eines Moleküls führen, das in seinem unveränderten Zustand normalerweise über eine Disulfidbrücke gefaltet ist. Es gibt andere, dem Fachmann bekannte, Verfahren zum Hinzufügen, Deletieren oder Substituieren von Aminosäuren, um die Funktion eines Proteins zu ändern.
Rekombinante menschliche G-CSF-Mutanten sind hergestellt worden, aber das Herstellungsverfahren schließt eine umfassende Information über die Struktur-Funktions-Beziehung nicht ein. Zum Beispiel ist von der Mutation und biochemischen Modifikation von Cys18 berichtet worden [Kuga et al., Biochem. Biophy. Res. Comm. 159: 103–111 (1989); Lu et al., Arch. Biochem. Biophys. 268: 81–92 (1989)].
Im US-Patent Nr. 4.810.643 mit dem Titel "Production of Pluripotent Granulocyte Colony-Stimulating Factor" (das hier durch Bezugnahme aufgenommen ist) werden Polypeptid-Analoga und Peptidfragmente von G-CSF im Allgemeinen offenbart. Bestimmte offenbarte G-CSF Analoga schließen solche ein, bei denen die Cysteine an den Positionen 17, 36, 42, 64 und 74 (von den Spezies mit 174 Aminosäuren oder denen mit 175 Aminosäuren, wobei die zusätzliche Aminosäure ein N-terminales Methionin ist) durch andere Aminosäuren (wie zum Beispiel Serin) substituiert sind, und G-CSF mit einem Alanin an der ersten (N-terminalen) Position.
EP 0 335 423 mit dem Titel "Modified human G-CSF" offenbart wie verlautet die Modifikation von mindestens einer Aminogruppe in einem Polypeptid mit hG-CSF-Aktivität.
EP 0 272 703 mit dem Titel "Novel Polypeptide" offenbart wie verlautet G-CSF-Derivate mit einer substituierten oder deletierten Aminosäure am oder "in der Nachbarschaft" des N-Terminus. Auch Okabe et al. [Blood 75 (9): 1788–1793 (1990)] offenbart wie verlautet Modifikationen von fünf Positionen des N-terminalen Bereichs von menschlichem G-CSF.
EP 0 459 630 mit dem Titel "Polypeptides" offenbart wie verlautet Derivate von natürlich vorkommendem G-CSF mit mindestens einer der biologischen Eigenschaften des natürlich vorkommenden G-CSF und einer Lösungsstabilität von mindestens 35 bei 5 mg/ml, wobei bei dem Derivat mindestens das Cys¹⁷ der nativen Sequenz durch einen Ser¹⁷-Rest ersetzt ist und das Asp²⁷ der nativen Sequenz durch einen Ser²⁷-Rest ersetzt ist.
EP 0 256 843 mit dem Titel "Expression of G-CSF and Muteins Thereof and Their Uses" offenbart wie verlautet eine modifizierte DNA-Sequenz, die G-CSF-kodiert, wobei der N-Terminus zur verstärkten Proteinexpression in rekombinanten Wirtszellen modifiziert ist, ohne die Aminosäurequenz des Proteins zu ändern.
EP 0 243 153 mit dem Titel "Human G-CSF Protein Expression" offenbart wie verlautet, dass G-CSF durch Inaktivieren von mindestens einer Hefe-KEX2-Protease-Prozessierungsstelle für eine erhöhte Ausbeute bei der rekombinanten Herstellung unter Verwendung von Hefe modifiziert werden soll.
Shaw, US-Patent Nr. 4.904.584 mit dem Titel "Site-Specific Homogeneous Modification of Polypeptides", offenbart wie verlautet Lysin-veränderte Proteine.
WO/9012874 offenbart wie verlautet Cystein-veränderte Varianten von Proteinen.
Das australische Patentanmeldungs-Dokument Nr. AU-A-10948/92 mit dem Titel "Improved Activation of Recombinant Proteins" offenbart wie verlautet das Hinzufügen von Aminosäuren zu einem Terminus eines G-CSF-Moleküls zu dem Zweck, beim Falten des Moleküls nach prokaryotischer Expression zu helfen.
Das australische Patentanmeldungs-Dokument Nr. AU-A-76380/91 mit dem Titel "Muteins of the Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF)" offenbart wie verlautet Muteine von G-CSF in der Sequenz Leu-Gly-His-Ser-Leu-Gly-Ile an Position 50–56 des G-CSF mit 174 Aminosäuren und Position 53 bis 59 des G-CSF mit 177 Aminosäuren und/oder mindestens einem der vier Histidinreste an den Positionen 43, 79, 156 und 170 des reifen G-CSF mit 174 Aminosäuren oder an den Positionen 46, 82, 159 oder 173 des reifen G-CSF mit 177 Aminosäuren.
GB 2 213 821 mit dem Titel "Synthetic Human Granulocyte Colony Stimulating Factor Gene" offenbart wie verlautet eine synthetische, G-CSF kodierende Nukleinsäuresequenz, die Restriktionsstellen eingliedert, um die Kassetten-Mutagenese ausgewählter Bereiche zu erleichtern und flankierende Restriktionsstellen, um das Eingliedern des Gens in ein erwünschtes Expressionssystem zu erleichtern.
Das US-Patent Nr. 5.214.132 offenbart wie verlautet die Modifikation von menschlichem G-CSF an den Aminosäurepositionen 1, 3, 4, 5 und 17 [siehe auch Kuga et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 159: 103–111 (1989)].
Das US-Patent Nr. 5.218.092 offenbart wie verlautet die Modifikation von menschlichem G-CSF an den Aminosäurepositionen 1, 3, 4, 5, 17, 145 und 147.
Das US-Patent Nr. 5.581.476 offenbart die dreidimensionale Struktur von G-CSF auf atomarer Ebene. Aus dieser dreidimensionalen Struktur kann man mit deutlicher Bestimmtheit vorhersagen, wie Änderungen in der Zusammensetzung eines G-CSF-Moleküls zu strukturellen Änderungen führen können. Diese strukturellen Kennzeichen können mit biologischer Aktivität korreliert werden, um G-CSF-Analoga zu gestalten und herzustellen.
Signaltransduktion, der Weg, auf dem G-CSF den zellulären Stoffwechsel beeinflusst, ist derzeit nicht gründlich verstanden. Im Allgemeinen bindet G-CSF an und aktiviert den G-CSF-Zelloberflächenrezeptor durch Konformationsänderungen. Diese Bindung löst dadurch eine Signal-Kaskade aus (z.B. das Rekrutieren von Kinasen zur cytoplasmatischen Domäne), was anscheinend die Änderungen in bestimmten Vorläuferzellen auslöst, die zu zellulären Reaktionen wie zum Beispiel Differenzierung, Proliferation und Wanderung führt. Man denkt, dass der G-CSF/G-CSFR-Komplex endozytischen Trafficking-Vorgängen der Internalisierung und Sortierung zum Recycling oder Abbau unterworfen wird [Lauffenburger und Linderman, Rezeptors: Models for Binding, Trafficking, and Signaling, New York: Oxford University Press (1993)].
Die endozytische Aufnahme von G-CSF ermöglicht den intrazellulären proteolytischen Cytokin-Abbau in endosomalen und/oder lysosomalen Kompartimenten. Internalisierte Cytokinrezeptoren können, wenn sie nicht der Wiederverwendung zugeführt werden, zerstört werden. So könnte endozytisches Trafficking die Verarmung von G-CSF aus dem extrazellulären Medium sowie die Herunterregulierung des G-CSF-Rezeptors verursachen. Demgemäß wäre es vorteilhaft, die G-CSF-Struktur in einer Weise zu verändern, die richtige Rezeptoraktivierung zur Signaltransduktion erhält, aber die endozytische Internalisierung verringert und/oder das endosomale Sortieren in Richtung Recycling statt Abbau verstärkt [Lauffenburger et al., Scratching The (Cell) Surface: Cytokine Engineering For Improved Ligand/Receptor Trafficking Dynamics, Chem & Biol 5: R257–R263 (1988)].
Es gibt also einen Bedarf, bessere therapeutische Liganden von G-CSF zu entwickeln. Derartige Mittel hätten längere Halbwertszeiten und würden stärkere Zellproliferation induzieren, falls der Ligand nicht so zu Endozytose und anschließendem lysosomalen Abbau neigen würde. Demgemäß ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, diese Liganden und Verfahren zu ihrer Herstellung und zum Testen von ihnen bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In dieser Erfindung beschreiben wir einen Ansatz, die Stärke von G-CSF durch gestaltete Verbesserungen im zellulären Trafficking zu verbessern. Es ist festgestellt worden, dass die Substitutionen der vorliegenden Erfindung im Vergleich zum G-CSF von SEQ ID NO: 2 oder rekombinantem G-CSF mit einem Methioninrest an Position –1 ("metG-CSF" oder "r-met-HuG-CSF") zu G-CSF-Analoga mit einer Wirkung auf zelluläres Trafficking führen. Soweit hierin nicht anders angegeben, werden diese Spezies gemeinsam als "Wildtyp" bezeichnet. Die Wirkungen von diesen Modifikationen demonstrieren Vorteile in der Stabilität und der Stärke, die bei anderen G-CSF-Spezies nicht gesehen werden. Insbesondere stellen dieses Analoga eine verstärkte zelluläre Reaktion (eine G-CSF-agonistische Art von Aktivität) bereit. Derartige Änderungen der zellulären Reaktion finden durch Beeinflussen der G-CSF-Rezeptorbindung und/oder der Vorgänge des Sortierens, Recyclings und Abbaus über die endozytischen Liganden/Rezeptor-Traffickingwege statt.
Die vorliegende Erfindung betrifft zum menschlichen G-CSF analoge Polypeptide, die eine Aminosäuresubstitution in der Sequenz von SEQ ID NO: 2 umfassen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: 1) Substitution von Asparaginsäure durch Histidin an Position Nummer 109, [His¹⁰⁹]G-CSF; 2) Substitution von Asparaginsäure durch Histidin an Position Nummer 112, [His¹¹²]G-CSF; 3) Substitution von Glutamin durch Histidin an Position Nummer 119, [His¹¹⁹]G-CSF; und 4) eines der Polypeptidanaloga, wahlweise einschließlich eines N-terminalen Methionylrestes. Derartige Analoga können zusätzlich mit einem oder mehreren wasserlöslichen Polymeren derivatisiert werden.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Polynukleotide bereit, die vorstehend beschriebene, zum menschlichen G-CSF analoge Polypeptide kodieren. Derzeit bevorzugte Polynukleotide werden in den DNA-Sequenzen von SEQ ID NO: 3, 5 oder 7 (und den Komplementärsträngen) dargelegt und schließen solche ein, die zusätzlich einen N-terminalen Methionylrest kodieren.
In noch einer anderen Ausführungsform beinhaltet die Erfindung ein Expressionskonstrukt, das ein Polynukleotid, wie vorstehend dargelegt, enthält.
Darüberhinaus stellt die Erfindung eine Wirtszelle bereit, die ein Polynukleotid, wie vorstehend dargelegt, enthält. Derzeit bevorzugte Wirtszellen werden aus der Gruppe, bestehend aus Bakterien, Säugerzellen, Tumorzellen, Hefezellen und Insektenzellen, ausgewählt.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen der zu G-CSF analogen Polypeptide [His¹⁰⁹]G-CSF, [His¹¹²]G-CSF, [His¹¹⁹]G-CSF und deren Met^–1-Spezies aus einer Wirtszelle bereit, die Nukleinsäure, die derartige Analoga kodiert, enthält, wobei das Verfahren umfasst: Kultivieren der Wirtszelle, die ein Polypeptid, wie vorstehend dargelegt, enthält, unter Bedingungen, welche die Expression eines derartigen Polypeptids erleichtern; und Erhalten eines derartigen, zu G-GSF analogen Polypeptids.
Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die ein zu G-CSF analoges Polypeptid, wie vorstehend dargelegt, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen. Diese Zusammensetzungen können bei Verfahren zum Behandeln von hämatopoetischen, neurologischen oder mit der Fortpflanzung zusammenhängenden Leiden eingesetzt werden, die daraus bestehen, eine wirksame Menge einer wie vorstehend dargelegten Zusammensetzung an einen Patienten, der dessen bedarf, zu verabreichen. Derartige Leiden schließen reduzierte hämatopoetische Funktion, reduzierte Immunfunktion, reduzierte Zahl neutrophiler Zellen, reduzierte Mobilisierung neutrophiler Zellen, Mobilisierung peripherer Blutvorläuferzellen, Sepsis, schwerwiegende chronische Neutropenie, Knochenmarktransplantate, Infektionskrankheiten, Leukopenie, Thrombozytopenie, Anämie, Verbessern der Übertragung von Knochenmark während einer Transplantation, Verbessern der Knochenmarkerholung bei der Behandlung von strahlungs-, chemisch oder chemotherapeutisch induzierter Knochenmarkaplasie oder Myelosuppression und erworbenes Immundefektsyndrom ein.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren bereit, Zellen für Chemotherapie oder Strahlentherapie zu sensibilisieren, bestehend aus dem Verabreichen einer wirksamen Menge einer pharmazeutischen Zusammensetzung, wie vorstehend dargelegt, an einen Patienten, der dessen bedarf.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Kultivieren hämatopoetischer Zellen in vitro bereit, umfassend: Platzieren der Zellen in ein geeignetes Kulturmedium, wobei das geeignete Kulturmedium ein zu G-CSF analoges Polypeptid, wie vorstehend dargelegt, enthält; und Bereitstellen geeigneter Bedingungen für das Wachstum der hämatopoetischen Zellen.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren, wie vorstehend dargelegt, bereit, wobei die Behandlung, das Sensibilisieren oder Kultivieren die Verwendung von mindestens einem zusätzlichen Faktor, ausgewählt aus EPO, G-CSF, SCF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, Interleukinen, IGF-1, LIF, Interferon, einem neurotrophen Faktor, dem flt-3/flk-2-Liganden und einem Fibroblastenwachstumsfaktor, einschließt. Dementsprechend stellt die Erfindung ein Kit bereit, das Komponenten für das Kultivieren hämatopoetischer Zellen enthält, bestehend aus: einem der Polypeptidanaloga, wie vorstehend dargelegt, zum Herstellen von Medium zum Kultivieren hämatopoetischer Zellen geeignete Komponenten und wahlweise mindestens einen zusätzlichen Faktor, wie vorstehend dargelegt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Es ist festgestellt worden, dass G-CSF bei der Behandlung verschiedener Leiden, bei denen eine Zunahme der neutrophilen Zellen Vorteile bereitstellt, nützlich ist. Zum Beispiel ist G-CSF für Krebspatienten als Mittel zum selektiven Stimulieren der Produktion neutrophiler Zellen vorteilhaft, um hämatopoetische Defizite zu kompensieren, die sich aus Chemotherapie oder Strahlentherapie ergeben. Andere Indikationen schließen die Behandlung verschiedener Infektionskrankheiten und damit zusammenhängender Leiden, wie zum Beispiel Sepsis, die typischerweise durch einen Bakterienmetaboliten verursacht wird, ein. G-CSF ist auch alleine oder in Kombination mit anderen Verbindungen, wie zum Beispiel anderen Cytokinen, zum Wachstum oder zur Expansion von Zellen in Kultur (zum Beispiel für Knochenmarktransplantate oder ex-vivo-Expansion) nützlich. G-CSF ist Transplantatpatienten als ein Zusatz zur Behandlung einer Infektion oder zur Behandlung der Neutropenie verabreicht worden. G-CSF wird jedoch schnell durch rezeptorvermittelte Endozytose von peripheren neutrophilen Zellen und Vorläuferzellen im Knochenmark, die G-CSFR exprimieren, beseitigt und so wird die Stärke des Arzneistoffes durch diesen negativen Rückkopplungsmechanismus reduziert. Da Zellen G-CSFR normalerweise in geringen Mengen exprimieren, kann das Senken der endosomalen Affinität des Komplexes nicht nur die Herunterregulierung des Rezeptors reduzieren sondern kann auch das Liganden-Recycling verstärken, wie durch Modellieren vorhergesagt wird. Deshalb würde die Arzneistoffstärke durch Mutationen des G-CSF verbessert, welche die Trafficking-Eigenschaften verbessern würden.
Die vorliegende Erfindung befasst sich mit neuen, zu G-CSF analogen Polypeptiden, die Vorteile in der Stabilität demonstrieren, die bei anderen G-CSF-Spezies nicht gesehen werden. Insbesondere stellen diese Analoga eine verstärkte zelluläre Reaktion (eine superagonistische oder G-CSF-agonistische Art von Aktivität) im Vergleich zu Wildtyp-G-CSF bereit. Derartige Änderungen der zellulären Reaktion ergeben sich durch Beeinflussen der G-CSF-Rezeptorbindung und/oder der Vorgänge des Sortierens, Recyclings und Abbaus über die endozytischen Liganden/Rezeptor-Traffickingwege.
Alle analogen Änderungen der vorliegenden Erfindung beruhen auf der 174-Aminosäuren-Sequenz für G-CSF in SEQ ID NO: 2. Einem Fachmann wird ersichtlich sein, dass die Analoga der vorliegenden Erfindung auch mit einem N-terminalen Methioninrest konstruiert werden können.
Die Überschriften der Abschnitte werden hierin nur für organisatorische Zwecke verwendet und sollen nicht so ausgelegt werden, dass sie in irgendeiner Weise den beschriebenen Inhalt beschränken.
A. Rolle von G-CSF bei der Behandlung von Neutropenie
Es ist festgestellt worden, dass G-CSF bei der Behandlung von Leiden nützlich ist, bei denen eine Zunahme der neutrophilen Zellen Vorteile bereitstellt. Für Krebspatienten ist G-CSF zum Beispiel als Mittel zum selektiven Stimulieren der Produktion neutrophiler Zellen vorteilhaft, um hämatopoetische Defizite zu kompensieren, die sich aus Chemotherapie oder Strahlentherapie ergeben. Andere Indikationen schließen die Behandlung verschiedener Infektionskrankheiten und damit zusammenhängender Leiden, wie zum Beispiel Sepsis, die typischerweise durch einen Bakterienmetaboliten verursacht wird, ein. G-CSF ist auch alleine oder in Kombination mit anderen Verbindungen, wie zum Beispiel anderen Cytokinen, zum Wachstum oder zur Expansion von Zellen in Kultur (zum Beispiel für Knochenmarktransplantate oder ex-vivo-Expansion) nützlich. G-CSF ist Transplantatpatienten als ein Zusatz zur Behandlung einer Infektion oder zur Behandlung der Neutropenie verabreicht worden (Diflo et al., Hepatology 16: PA 278 (1992); Wright et al., Hepatology 14: PA 48 (1991); Lachaux et al., J. Ped. 123: 1005–1008 (1993); Colquehoun et al., Transplantation 56: 755–758 (1993)].
Der Begriff "Neutropenie" bezeichnet ein Leiden mit einer abnormal geringen Zahl neutrophiler Zellen im peripheren Blutkreislauf. Die neutrophile Zelle entsteht aus dem Knochenmark und ist vollständig reif, wenn sie in den Blutkreislauf freigesetzt wird. Sie ist dann vollständig bereit, in ihrer Rolle an vorderster Front der zellulären Abwehr zu funktionieren. Sie wird aktiviert, d. h. fähig, viele ihrer Funktionen auszuüben, indem sie bestimmten proinflammatorischen Mediatoren und den chemotaktischen Faktoren, die sie zum Ort eines anreizenden Stimulus anziehen, ausgesetzt wird. Schwerwiegende Neutropenie kann lebensbedrohlich sein, weil sie zu schwerwiegenden Infektionen führen kann.
Alternativ dazu bezeichnet der Begriff "Neutrophilie" ein Leiden mit einer abnormal hohen Zahl neutrophiler Zellen im peripheren Blutkreislauf. Neutrophilie, oder eine erhöhte Leukozytenzahl, hat viele Ursachen, einschließlich Belastung durch extreme Kälte, Hitze, kürzliche Operation, körperliches Trauma, jede Art von Infektion, Verbrennungen, Schocks, Tumore, nicht durch Infektion verursachte Entzündung, wie zum Beispiel Gicht, Arthritis, Schilddrüsenprobleme und Drogen.
B. G-CSF-Analoga der vorliegenden Erfindung
Die vorliegende Erfindung zieht die Herstellung von Analoga der Wildtyp-G-CSF-Polypeptide und der sie kodierenden Polypeptide in Betracht, wobei 1) Histidin für Asparaginsäure an Position 109 substituiert wird, [His¹⁰⁹]G-CSF; 2) Histidin für Asparaginsäure an Position 112 substituiert wird, [His¹¹²]G-CSF; und 3) Histidin für Glutamin an Position 119 substituiert wird, [His¹¹⁹]G-CSF, und deren Met^–1-Spezies. Die vorstehenden Substitutionen entsprechen der Nummerierung von SEQ ID NO: 2. Die Aminosäuresequenzen für diese drei Analoga können in SEQ ID NO: 4, 6 bzw. 8 gefunden werden. Die vorliegende Erfindung zieht die Herstellung von Polypeptiden in Betracht, die zum menschlichen G-CSF analog sind, die eine erhöhte Stärke relativ zu Wildtyp-G-CSF beim Stimulieren der zellulären Proliferation und erhöhte Halbwertszeiten haben. Derartige Änderungen der zellulären Reaktion finden durch Beeinflussen der G-CSF-Rezeptorbindung und/oder der Vorgänge des Sortierens, Recyclings und Abbaus über die endozytischen Liganden/Rezeptor-Traffickingwege statt.
Diese Analoga wurden mittels eines allgemeinen Computersystems für das Design von Liganden unter Verwendung einzelner Substitutionen zu Histidin entwickelt, die als pH-aktivierte Schalter wirken, um die zellulären Trafficking-Eigenschaften zu verbessern. Die hierin beschriebene Strategie nutzt den pH-Unterschied zwischen dem extrazellulären Medium und endosomalen Kompartimenten als Schalter zur Protonierung von Histidin aus, um die endosomale Affinität des Liganden-Rezeptor-Komplexes zu reduzieren, und es wird vorausgesagt, dass dies das Recycling von intaktem Liganden zurück in das extrazelluläre Medium verstärkt.
Die Auswahl von Resten für eine Mutation zu Histidin wurde durch elektrostatische Erwägungen geleitet. Es war die Absicht, G-CSF-Analoga zu schaffen, die G-CSFR mit nahezu der (oder wenn möglich, höherer als) Wildtyp-Affinität bei neutralem Histidin binden würden, die aber bei positiv geladenem Histidin schwach binden würden. Bei saurem pH-Wert würde die Bindungsaffinität von der bei neutralem pH-Wert auf Kosten des Deprotonierens von Histidin in ungebundenem G-CSF gesenkt [Yang und Honig, J. Mol. Biol. 231: 459–474 (1993)]. Falls der pK_a-Wert von Histidin in ungebundenem Protein 6,5 wäre [Tanokura, Biochim. Biophys. Acta. 742: 576–585 (1982)], würde dies zu einer 10-fach geringeren Affinität bei pH 5,5 führen.
Kandidaten für Histidinmutationen wurden durch ein Drei-Schritt-Verfahren in silico identifiziert. Zuerst wurde die Beschaffenheit der elektrostatischen Bindungswechselwirkungen unter Verwendung eines Verfahrens [Kangas und Tidor, J. Chem. Phys. 109: 7522–7545 (1998)] quantifiziert, das ausdrücklich Liganden-Ablösung und -Wechselwirkung berücksichtigt und Bereiche an der Berührungsfläche lokalisiert, die für optimales Binden etwas zu negativ oder zu positiv sind. Zweitens wurden Versuchs-Histidinanaloga von G-CSF (sowohl neutrale als auch positiv geladene) konstruiert und energieminimiert. Drittens wurde die elektrostatische freie Bindungsenergie von jedem berechnet.
Das hierin ausführlich beschriebene Konzept bezieht neue G-CSF-Mutanten ein, die rational gewählt wurden. Die Kristallstruktur des Komplexes aus G-CSF und dessen Rezeptor, G-CSFR, wurde benutzt, um das elektrostatische Nettopotenzial an der Hauptbindungs-Berührungsfläche zwischen Ligand und Rezeptor zu berechnen. Aminosäurereste auf G-CSF, die restliches elektrostatisches Nettopotenzial beitrugen, wurden als Kandidaten für Mutagenese gewählt. Die Vorherrschaft übermäßig negativer Bereiche zeigt eine überhöhte negative Ladungsdichte an und schließt Stellen ein, die den geladenen Resten Glu¹⁹, Asp¹⁰⁹ und Asp¹¹² sowie den polaren Resten Gln²⁰, Thr¹¹⁶ und Gln¹¹⁹ entsprechen, was anzeigt, dass es eine unzureichende entsprechende positive Ladungsdichte vom Rezeptor gibt. Elektrostatische Beiträge zum Binden können durch verringerte negative Ladung auf dem Liganden an diesen sechs Stellen verstärkt werden; neutrales Histidin kann im Komplex toleriert werden, aber positiv geladenes Histidin könnte die positive Ladungsdichte des Rezeptors abstoßen. Um diese Stellen zu testen, wurden an den identifizierten Resten einzelne Histidinmutanten mit Hilfe eines Computers konstruiert.
Unter Verwendung der dreidimensionalen kristallographischen Struktur des Komplexes aus G-CSF und seinem Rezeptor (G-CSFR) kann das elektrostatische Nettopotenzial an der Hauptbindungs-Berührungsfläche zwischen Ligand und Rezeptor berechnet werden. Siehe US-Patent Nr. 5.581.476 (hierin durch Bezugnahme aufgenommen); Aritomi et al., Nature 401(6754): 713–718 (1999). Aminosäurereste auf G-CSF, die restliches elektrostatisches Nettopotenzial beitrugen, wurden als Kandidaten für Mutagenese gewählt. Sechs derartige Reste wurden auf G-CSF identifiziert: Asp¹¹², Asp¹⁰⁹, Gln¹¹⁹, Gln²⁰, Thr¹¹⁶ und Glu¹⁹. Insbesondere sind drei der vorgeschlagenen einzelnen Histidinsubstitutionen hergestellt und getestet worden: Asp¹⁰⁹His ([His¹⁰⁹]G-CSF), Asp¹¹²His ([His¹¹²]G-CSF) und Gln¹¹⁹His ([His¹¹⁹]G-CSF) (unter Verwendung der Nummerierung von SEQ ID NO: 2 mit dem Methionin bei –1).
Das Grundprinzip der Histidinmutagenese von G-CSF war, das zellluläre Trafficking von G-CSF und/oder G-CSFR zu beeinflussen. Nach dem Binden an G-CSFR auf der Oberfläche einer Zelle wird G-CSF in die Zelle internalisiert und in endosomalen Vesikeln wird eine Sortierentscheidung gefällt. Die Komponenten des Komplexes können entweder in den Lysosomen abgebaut werden oder intakt der Wiederverwendung auf der Oberfläche zugeführt werden. Bei vielen anderen Liganden/Rezeptorsystemen ist bekannt, dass der Ligand und Rezeptor, wenn sie im Komplex bleiben, vorzugsweise abgebaut werden; wenn der Komplex jedoch in den Endosomen dissoziiert, gibt es verstärktes Recycling des Liganden und/oder Rezeptors. Auf der Zelloberfläche ist der pH-Wert der Umgebung ungefähr 7,0; in den Endosomen ist der pH-Wert etwa 5,0–6,0. Da die Aminosäure Histidin der einzige Rest ist, von dem erwartet wird, dass er in diesem pH-Bereich titriert, ist zu erwarten, dass die Histidinsubstitution die zellulären Trafficking-Eigenschaften beeinflusst. Genauer gesagt verändern einzelne Histidinmutanten die Trafficking-Eigenschaften, beruhend auf den Unterschieden in der elektrostatischen freien Bindungsenergie bei pH 7,0 versus pH 5,0, ausschließlich infolge einer Protonierung des mutierten Histidins bei pH 5,0.
Speziell durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen wird eine ortsspezifische Mutagenese genomischer, cDNA- und synthetischer DNA-Sequenzen des Wiltdtyp-G-CSF-Polypeptids. Derzeit bevorzugte erfindungsgemäße Polynukleotidsequenzen schließen die DNA-Sequenzen von SEQ ID NO: 3 [His¹⁰⁹]G-CSF; SEQ ID NO: 5 [His¹¹²]G-CSF; SEQ ID NO: 7 [His¹¹⁹]G-CSF und deren Met^–1-Spezies ein. Diese DNA-Sequenzen können auch modifiziert werden, um eine andere Version von G-CSF zu kodieren, die mindestens eine der hämatopoetischen biologischen Eigenschaften des natürlich vorkommenden menschlichen G-CSF hat. Vorzugsweise handelt es sich bei der biologischen Eigenschaft um die Eigenschaft, an einen G-CSF-Rezeptor zu binden, aber eine andere biologische Eigenschaft ist die Fähigkeit, die Proliferation hämatopoetischer Zellen zu stimulieren. Andere biologische Eigenschaften sind Fachleuten ersichtlich (siehe auch Souza, vorstehend).
Diese DNA-Sequenzen können Kodons eingliedern, welche die Transkription und Translation von mRNA in mikrobiellen Wirten erleichtern. Derartige Herstellungs-Sequenzen können gemäß den auf dem Fachgebiet wohlbekannten Verfahren leicht konstruiert werden. Siehe auch Alton et al., PCT-veröffentlichte Anmeldung WO 83/04053. Die vorstehenden DNAs können auch wahlweise einen N-terminalen Methionylrest kodieren.
Die durch die Erfindung bereitgestellten DNA-Sequenzen sind beim Erzeugen neuer und nützlicher viraler und Plasmid-DNA-Vektoren, neuer und nützlicher transformierter und transfizierter prokaryotischer und eukaryotischer Wirtszellen (einschließlich Bakterien-, Hefe- und Säugerzellen, die man in Kultur wachsen lässt) und neuer und nützlicher Verfahren für das Wachstum derartiger Wirtszellen in Kultur, die zur Expression der vorliegenden G-CSF-Analoga fähig sind, nützlich. Die DNA-Sequenzen, welche die hierin beschriebenen, biologisch aktiven G-CSF-Analoga kodieren (oder die entsprechenden RNAs) können zur Gentherapie in Fällen nützlich sein, wo Unterproduktion von G-CSF gelindert würde oder der Bedarf für erhöhte G-CSF-Spiegel besteht.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung der vorliegenden G-CSF-Analoga mit rekombinanter DNA bereit. Bereitgestellt wird ein Verfahren zum Herstellen der G-CSF-Analoga aus einer Wirtszelle, die Nukleinsäure enthält, die derartige Analoga kodiert, bestehend aus: a) Kultivieren der Wirtszelle, die eine Nukleinsäure enthält, die derartige G-CSF-Analoga kodiert, unter Bedingungen, welche die Expression eines derartigen DNA-Moleküls erleichtern; und b) Erhalten derartiger G-CSF-Analoga.
Man kann derartige G-CSF-Analoga wahlweise von anderen im Verfahren erhaltenen Komponenten reinigen und isolieren. Verfahren zur Reinigung können im US-Patent Nr. 5.849.883 gefunden werden. Andere Verfahren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt (siehe auch Souza, vorstehend).
Wirtszellen können prokaryotisch oder eukaryotisch sein und schließen Bakterien, Säugerzellen (wie zum Beispiel Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO), Affenzellen, Nierenzellen von Babyhamstern, Krebszellen oder andere Zellen), Hefezellen und Insektenzellen ein. Bevorzugt wegen der größten Bequemlichkeit bei der kommerziellen Herstellung ist eine Herstellung unter Verwendung einer Bakterien-Wirtszelle.
C. Proteinherstellung
In Anbetracht der vorstehenden Offenbarung von Polypeptiden, die zum menschlichen G-CSF analog sind, wird es dem Fachmann möglich sein, zum menschlichen G-CSF analoge Polypeptide durch automatisierte Peptidsynthese, durch rekombinante Techniken oder beides herzustellen.
Die Analoga des menschlichen G-CSF der Erfindung können in Lösung oder auf einem festen Träger in Übereinstimmung mit herkömmlichen Techniken synthetisiert werden. Verschiedene automatische Synthetisierer sind im Handel erhältlich und können in Übereinstimmung mit bekannten Protokollen verwendet werden. Siehe zum Beispiel Stewart und Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausgabe, Pierce Chemical Co. (1984); Tam et al., J. Am. Chem. Soc. 105: 6442 (1983); Merrifield, Science 232: 341–347 (1986) und Barany und Merrifield, The Peatides, Gross und Meienhofer (Hrsg.), Academic Press, New York, 1–284 (1979). Das aktive Protein kann leicht synthetisiert und dann in Durchmusterungsassays durchgemustert werden, die so gestaltet werden, dass reaktive Peptide identifiziert werden.
Alternativ dazu kann eine Vielfalt von Vektor/Wirt-Expressionssystemen benutzt werden, um eine für ein Analogon des menschlichen G-CSF kodierende Sequenz zu enthalten und zu exprimieren. Dieses schließen Mikroorganismen wie Bakterien, die mit rekombinanten Bakteriophagen-, Plasmid- oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren transformiert sind, Hefe, die mit Hefe-Expressionsvektoren transformiert ist, Insektenzellsysteme, die mit viralen Expressionsvektoren (z.B. Baculovirus) infiziert sind, Pflanzenzellsysteme, die mit viralen Expressionsvektoren (z.B. Blumenkohlmosaikvirus, CaMV; Tabakmosaikvirus, TMV) transfiziert oder mit bakteriellen Expressionsvektoren (z.B. dem Plasmid Ti oder pBR322) transformiert sind oder tierische Zellsysteme ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Säugerzellen, die bei rekombinanten Proteinherstellungen nützlich sind, schließen VERO-Zellen, HeLa-Zellen, Ovarzelllinien aus chinesischem Hamster (CHO), COS-Zellen (wie zum Beispiel COS-7), die Zellen W138, BHK, HepG2, 3T3, RIN, MDCK, A549, PC12, K562 und 293 ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Exemplarische Protokolle für die rekombinante Expression des Proteins werden hierin nachstehend beschrieben.
Ein Hefesystem kann eingesetzt werden, um die Analoga des menschlichen G-CSF der vorliegenden Erfindung zu erzeugen. Der kodierende Bereich der cDNA für ein Analogon des menschlichen G-CSF wird durch PCR amplifiziert. Eine DNA, welche die Hefe-Leadersequenz Prepro-Alpha kodiert, wird aus genomischer Hefe-DNA in einer PCR-Reaktion unter Verwendung eines Primers, der die Nukleotide 1–20 des Gens für den alpha-Mating-Faktor enthält, und eines weiteren Primers, der zu den Nukleotiden 255–235 dieses Gens komplementär ist, amplifiziert [Kurjan und Herskowitz, Cell 30: 933–943 (1982)]. Die kodierende Sequenz für den Prepro-Alpha-Leader und Fragmente mit der kodierenden Sequenz für ein menschliches G-CSF-Analogon werden in ein Plas mid ligiert, das den Promotor der Hefe-Alkohol-Dehydrogenase (ADH2) enthält, so dass der Promotor die Expression eines Fusionsproteins steuert, das aus dem Prepro-Alpha-Faktor besteht, der an das reife, zum menschlichen G-CSF analoge Polypeptid fusioniert ist. Wie von Rose und Broach [Meth. Enz. 185: 234–279, Goeddel (Hrsg.), Academic Press, Inc., San Diego, CA (1990)] gelehrt wird, schließt der Vektor weiterhin einen ADH2-Transkriptionsterminator stromabwärts von der Klonierungsstelle, den Hefe-Replikationsursprung "2-micron", das Hefegen leu-2d, die Hefegene REP1 und REP2, das E.-coli-Gen für beta-Lactamase und einen E.-coli-Replikationsursprung ein. Die Gene für beta-Lactamase und leu-2d stellen Selektion in Bakterien bzw. Hefe bereit. Das Gen leu-2d ermöglicht auch eine erhöhte Kopienzahl des Plasmids in Hefe, um höhere Expressionswerte zu induzieren. Die Gene REP1 und REP2 kodieren Proteine, die an der Regulation der Plasmid-Kopienzahl beteiligt sind.
Das im vorhergehenden Absatz beschriebene DNA-Konstrukt wird unter Verwendung eines bekannten Verfahrens, z.B. Lithiumacetat-Behandlung [Stearns et al., Meth. Enz. 185: 280–297 (1990)], in Hefezellen transformiert. Der ADH2-Promotor wird nach Erschöpfung der Glukose im Wachstumsmedium induziert [Price et al., Gene 55: 287 (1987)]. Die Prepro-Alpha-Sequenz bewirkt eine Sekretion des Fusionsproteins aus den Zellen. Dazu begleitend spaltet das Hefeprotein KEX2 die Prepro-Sequenz von den reifen Analoga des menschlichen G-CSF ab [Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5330–5334 (1984)].
Alternativ dazu können Analoga des menschlichen G-CSF unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Expressionssysstems, z.B. des Pichia-Expressionssystems (Invitrogen, San Diego, CA), in Hefe rekombinant exprimiert werden, indem den Anleitungen des Herstellers gefolgt wird. Dieses System beruht auch auf der Prepro-Alpha-Sequenz, um die Sekretion zu steuern, aber die Transkription des Inserts wird nach Induktion durch Methanol durch den Promotor der Alkoholoxidase (AOX1) angetrieben.
Das sezernierte Analogon des menschlichen G-CSF wird aus dem Hefe-Wachstumsmedium z.B. durch die Verfahren gereinigt, die verwendet werden, um ein Analogon des menschlichen G-CSF aus Überständen von Bakterien- und Säugerzellen zu reinigen.
Alternativ dazu kann die cDNA, die Analoga des menschlichen G-CSF kodiert, in den Baculovirus-Expressionsvektor pVL1393 kloniert werden (PharMingen, San Diego, CA). Dieser Vektor, der ein Analogon des menschlichen G-CSF enthält, wird dann gemäß den Anleitungen des Herstellers (PharMingen) verwendet, um Spodoptera frugiperda Zellen in proteinfreien sF9-Medien zu infizieren und rekombinantes Protein herzustellen. Das Protein wird unter Verwendung einer Heparin-Sepharose-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) und aufeinanderfolgender Säulen, die nach Molekulargröße ordnen (Amicon, Beverly, MA), aus den Medien gereinigt und konzentriert und in PBS resuspendiert. Eine SDS-PAGE-Analyse zeigt eine einzelne Bande und bestätigt die Größe des Proteins und eine Edman-Sequenzierung auf einem Proton 2090 Peptid-Sequenzierer bestätigt dessen N-terminale Sequenz.
Alternativ dazu können die Analoga des menschlichen G-CSF in einem Insektensystem exprimiert werden. Insektensysteme zur Proteinexpression sind Fachleuten wohlbekannt. In einem derartigen System wird ein Autographa californica nuclear polyhedrosis-Virus (AcNPV) als ein Vektor verwendet, um fremde Gene in Spodoptera frugiperda Zellen oder in Trichoplusia Larven zu exprimieren. Die kodierende Sequenz für ein Analogon des menschlichen G-CSF wird in einen nichtessentiellen Bereich des Virus kloniert, wie zum Beispiel das Polyhedrin-Gen, und unter Kontrolle des Polyhedrin-Promotors gestellt. Eine erfolgreiche Insertion des Analogons des menschlichen G-CSF macht das Polyhedrin-Gen inaktiv und produziert einen rekombinanten Virus, dem die Hüllprotein-Hülle fehlt. Die rekombinanten Viren werden dann verwendet, um S. frugiperda Zellen oder Trichoplusia Larven zu infizieren, in denen ein Analogon des menschlichen G-CSF exprimiert wird [Smith et al., J. Virol. 46: 584 (1983); Engelhard EK et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3224–7 (1994)].
In einem anderen Beispiel wird die DNA-Sequenz, welche die reife Form des Proteins kodiert, durch PCR amplifiziert und in einen geeigneten Vektor kloniert, zum Beispiel pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, NJ). Der pGEX Vektor wird so gestaltet, dass er ein Fusionsprotein herstellt, das Glutathion-S-transferase (GST), die durch den Vektor kodiert wird, und ein Protein umfasst, das durch ein DNA-Fragment kodiert wird, das in die Klonierungsstelle des Vektors eingefügt wird. Die Primer für die PCR können so erzeugt werden, dass sie zum Beispiel eine geeignete Spaltungsstelle einschließen.
Das rekombinante Fusionsprotein kann dann von dem GST-Anteil des Fusionsproteins abgespalten werden. Das Konstrukt aus pGEX-3X/Analogon des menschlichen G-CSF wird dann in E. coli XL-1 Blue Zellen (Stratagene, La Jolla CA) transformiert und einzelne Transformanten werden isoliert und wachsen gelassen. Plasmid-DNA aus einzelnen Transformanten wird gereinigt und unter Verwendung eines automatisierten Sequenzierers teilweise sequenziert, um die Anwesenheit des Gen- Inserts, das das erwünschte Analogon des menschlichen G-CSF kodiert, in der richtigen Orientierung zu bestätigen.
Während bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in Betracht ziehen, das zum menschlichen G-CSF analoge Protein unter Verwendung synthetischer Peptid-Synthetisierer und anschließender FPLC-Analyse und geeigneter Neufaltung der Cystein-Doppelbindungen herzustellen, wird in Betracht gezogen, dass eine rekombinante Proteinherstellung auch verwendet werden kann, um zum menschlichen G-CSF analoge Peptidzusammensetzungen herzustellen. Zum Beispiel wird eine Induktion des Fusionsproteins aus GST/Analogon des menschlichen G-CSF erreicht, indem man die transformierte XL-1 Blue Kultur bei 37°C in LB-Medium (ergänzt durch Carbenicillin) bis zu einer optischen Dichte von 0,4 bei einer Wellenlänge von 600 nm wachsen lässt, gefolgt von weiterer, 4 Stunden langer Inkubation in Anwesenheit von 0,5 mM Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (Sigma Chemical Co., St. Louis MO).
Das Fusionsprotein, von dem erwartet wird, dass es als unlöslicher Einschlusskörper in den Bakterien hergestellt wird, kann folgendermaßen gereinigt werden. Zellen werden durch Zentrifugation geerntet, in 0,15 M NaCl, 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA gewaschen und mit 0,1 mg/ml Lysozym (Sigma Chemical Co.) 15 Min. lang bei Raumtemperatur behandelt. Das Lysat wird durch Sonifizieren geklärt und Zellüberreste werden durch 10 Min. lange Zentrifugation bei 12.000 × g pelletiert. Das Pellet, welches das Fusionsprotein enthält, wird in 50 mM Tris, pH 8 und 10 mM EDTA resuspendiert, auf 50% Glycerin überschichtet und 30 Min. lang bei 6.000 × g zentrifugiert. Das Pellet wird in Mg⁺⁺- und Ca⁺⁺-freier phosphatgepufferter Standard-Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert. Das Fusionsprotein wird weiter durch Fraktionieren des resuspendierten Pellets in einem denaturierenden SDS-Polyacrylamid-Gel (Sambrook et al., vorstehend) gereinigt. Das Gel wird in 0,4 M KCl eingeweicht, um das Protein sichtbar zu machen, das dann ausgeschnitten und in Gel-Laufpuffer ohne SDS eluiert wird. Falls das Fusionsprotein aus GST/Analogon des menschlichen G-CSF in Bakterien als lösliches Protein hergestellt wird, kann es unter Verwendung des GST-Reinigungs-Moduls (Pharmacia Biotech) gereinigt werden.
Das Fusionsprotein kann Verdauung unterworfen werden, um die GST von dem reifen, dem menschlichen G-CSF analogen Protein abzuspalten. Die Verdauungsreaktion (20–40 μg Fusionsprotein, 20–30 Einheiten menschliches Thrombin (4000 U/mg (Sigma) in 0,5 ml PBS]) wird 16–48 Std. bei Raumtemperatur inkubiert und auf ein denaturierendes SDS-PAGE-Gel geladen, um die Reaktionsprodukte zu fraktionieren.
Das Gel wird in 0,4 M KCl eingeweicht, um die Proteinbanden sichtbar zu machen. Die Identität der Proteinbande, die dem erwarteten Molekulargewicht des Analogons des menschlichen G-CSF entspricht, kann durch teilweise Aminosäuresequenzanalyse unter Verwendung eines automatisierten Sequenzierers (Applied Biosystems Model 473A, Foster City, CA) bestätigt werden.
Alternativ dazu kann die DNA-Sequenz, die das vorhergesagte reife, zum menschlichen G-CSF analoge Protein kodiert, in ein Plasmid kloniert werden, das einen erwünschten Promotor und wahlweise eine Leadersequenz enthält [siehe z.B. Better et al., Science 240: 1041–43 (1988)]. Die Sequenz dieses Konstrukts kann durch automatisiertes Sequenzieren bestätigt werden. Das Plasmid wird dann in den E.-coli-Stamm MC1061 unter Verwendung von Standardverfahren, die CaCl₂-Inkubation und Hitzeschockbehandlung der Bakterien einsetzen (Sambrook et al., vorstehend), transformiert. Man lässt die transformierten Bakterien in mit Carbenicillin ergänztem LB-Medium wachsen und die Herstellung des exprimierten Proteins wird durch Wachstum in einem geeigneten Medium induziert. Falls vorhanden, beeinflusst die Leadersequenz die Sekretion des reifen, zum menschlichen G-CSF analogen Proteins und wird während der Sekretion abgespalten.
Das sezernierte rekombinante Protein wird aus dem bakteriellen Kulturmedium durch das hierin nachstehende Verfahren gereinigt.
Säuger-Wirtssysteme zur Expression des rekombinanten Proteins sind Fachleuten auch wohlbekannt. Wirtszell-Stämme können wegen einer besonderen Fähigkeit gewählt werden, das exprimierte Protein zu prozessieren oder bestimmte posttranslationale Modifikationen zu produzieren, die beim Bereitstellen der Proteinaktivität nützlich sind. Derartige Modifikationen des Polypeptids schließen Acetylierung, Carboxylierung, Glykosylierung, Phosphorylierung, Modifikation mit Lipiden und Acylierung ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Posttranslationales Prozessieren, das eine "Prepro"-Form des Proteins spaltet, kann auch für eine korrekte Insertion, Faltung und/oder Funktion wichtig sein. Unterschiedliche Wirtszellen, wie zum Beispiel CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38 und dergleichen haben eine spezifische zelluläre Maschinerie und kenzeichnende Mechanismen für derartige posttranlationale Aktivitäten und können gewählt werden, um die korrekte Modifikation und Prozessierung des eingeführten fremden Proteins sicherzustellen.
In einem besonders bevorzugten Verfahren der rekombinanten Expression der zum menschlichen G-CSF analogen Proteine der vorliegenden Erfindung werden 293- Zellen mit Plasmiden, welche die cDNA für ein Analogon des menschlichen G-CSF enthalten, in den pCMV-Vektor (5' CMV Promotor, 3' HGH poly-A-Sequenz) und pSV2neo (der das neo-Resistenzgen enthält) durch das Calciumphosphatverfahren kotransfiziert. Vorzugsweise sollten die Vektoren vor der Transfektion mit Sca I linearisiert werden. In ähnlicher Weise kann ein alternatives Konstrukt unter Verwendung eines ähnlichen pCMV-Vektors, bei dem das neo-Gen eingegliedert ist, verwendet werden. Stabile Zelllinien werden aus einzelnen Zellklonen durch beschränkende Verdünnung in Wachstumsmedien, die 0,5 mg/ml G418 (ein Neomycin-ähnliches Antibiotikum) enthalten, 10–14 Tage lang selektiert. Die Zelllinien werden auf die Expression eines Analogons des menschlichen G-CSF hin durch ELISA oder Western-Blot durchgemustert und hoch exprimierende Zelllinien werden für ein Wachstum im großen Maßstab expandiert.
Es ist vorzuziehen, dass die transformierten Zellen für eine Langzeit-Proteinherstellung mit hoher Ausbeute verwendet werden, und stabile Expression ist an sich wünschenswert. Sobald derartige Zellen mit Vektoren transformiert sind, die selektierbare Marker zusammen mit der erwünschten Expressionskassette enthalten, kann man den Zellen erlauben, 1–2 Tage in einem angereicherten Medium zu wachsen, bevor sie auf selektive Medien umgestellt werden. Der selektierbare Marker wird so gestaltet, dass er Resistenz gegen Selektion verleiht, und seine Anwesenheit erlaubt Wachstum und Gewinnung von Zellen, welche die eingeführten Sequenzen erfolgreich exprimieren. Resistente Klumpen stabil transformierter Zellen können unter Verwendung von Zellkulturtechniken, die für die Zelle geeignet sind, proliferiert werden.
Etliche Selektionssysteme können verwendet werden, um die Zellen, die transformiert worden sind, für die rekombinante Proteinherstellung zu gewinnen. Derartige Selektionssysteme schließen die Gene für Thymidinkinase aus HSV, Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase und Adenin-Phosphoribosyltransferase in tk-, hgprt- beziehungsweise aprt-Zellen ein, sind aber nicht darauf beschränkt. Anti-Metaboliten-Resistenz kann auch als Selektionsbasis für dhfr, das Resistenz gegen Methotrexat verleiht, gpt, das Resistenz gegen Mycophenolsäure verleiht, neo, das Resistenz gegen das Aminoglycosid G418 verleiht, also, das Resistenz gegen Chlorsulfuron verleiht, und hygro, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, verwendet werden. Zusätzliche selektierbare Gene, die nützlich sein können, schließen trpB, das Zellen erlaubt, Indol anstelle von Tryptophan zu benutzen, oder hisD, das Zellen erlaubt, Histinol anstelle von Histidin zu benutzen, ein. Marker, die einen sichtbaren Hinweis zur Identifikation von Transformanten ergeben, schließen Anthocyane, β-Glucuronidase und dessen Substrat GUS und Luciferase und dessen Substrat Luciferin ein.
D. Proteinreinigung
Es wird wünschenswert sein, die zum menschlichen G-CSF analogen Proteine, die durch die vorliegende Erfindung erzeugt werden, zu reinigen. Proteinreinigungstechniken sind Fachleuten wohlbekannt. Diese Techniken beziehen auf einer Ebene die grobe Fraktionierung des zellulären Milieus in eine Polypeptidfraktion und Fraktionen ohne Polypeptid ein. Wenn das Polypeptid von anderen Proteinen abgetrennt worden ist, kann das Polypeptid von Interesse unter Verwendung chromatographischer und elektrophoretischer Techniken weiter gereinigt werden, um eine teilweise oder vollständige Reinigung (oder Reinigung bis zur Homogenität) zu erreichen. Analytische Verfahren, die besonders zur Herstellung eines reinen Peptids geeignet sind, sind Ionenaustauschchromatographie, Ausschlusschromatographie, Polyacrylamid-Gelelektrophorese und isoelektrische Fokussierung. Ein besonders effizientes Verfahren, Peptide zu reinigen, ist schnelle Protein-Flüssigchromatographie oder sogar HPLC.
Bestimmte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen die Reinigung, und, in besonderen Ausführungsformen, die wesentliche Reinigung eines kodierten Proteins oder Peptids. Der Begriff "gereinigtes Protein oder Peptid", wie hierin verwendet, soll eine Zusammensetzung, die frei von anderen Komponenten isolierbar ist, bezeichnen, wobei das Protein oder Peptid zu einem Grad relativ zu seinem natürlich erhältlichen Zustand gereinigt wird. Ein gereinigtes Protein oder Peptid bezeichnet deshalb auch ein Protein oder Peptid, das frei von der Umgebung ist, in der es natürlicherweise vorkommen kann.
Im Allgemeinen bezeichnet "gereinigt" eine Protein- oder Peptidzusammensetzung, die einer Fraktionierung unterworfen worden ist, um verschiedene andere Komponenten zu entfernen, wobei die Zusammensetzung im Wesentlichen ihre exprimierte biologische Aktivität beibehält. Wo der Begriff "wesentlich gereinigt" verwendet wird, bezeichnet diese Benennung eine Zusammensetzung, bei der das Protein oder Peptid die Hauptkomponente der Zusammensetzung bildet, wobei sie zum Beispiel etwa 50%, etwa 60%, etwa 70%, etwa 80%, etwa 90%, etwa 95% oder mehr der Proteine in der Zusammensetzung ausmacht.
Verschiedene Verfahren zum Quantifizieren des Reinigungsgrades des Proteins oder Peptids sind Fachleuten angesichts der vorliegenden Offenbarung bekannt. Diese schließen zum Beispiel das Bestimmen der spezifischen Aktivität einer aktiven Fraktion oder das Abschätzen der Polypeptidmenge in einer Fraktion durch SDS/PAGE-Analyse ein. Ein bevorzugtes Verfahren zum Abschätzen der Reinheit einer Fraktion ist es, die spezifische Aktivität der Fraktion zu berechnen, sie mit der spezifischen Aktivität des anfänglichen Extrakts zu vergleichen, und so den Reinheitsgrad zu berechnen, der hierin durch eine "-fache Reinigungszahl" abgeschätzt wird. Die tatsächlichen Einheiten, die verwendet werden, um die Aktivitätsmenge zu repräsentieren, hängen natürlich von der besonderen Assaytechnik ab, die gewählt wird, um der Reinigung zu folgen, und davon, ob das exprimierte Protein oder Peptid eine nachweisbare Aktivität aufweist.
Verschiedene zur Verwendung bei einer Proteinreinigung geeignete Techniken sind Fachleuten wohlbekannt. Diese schließen zum Beispiel Präzipitation mit Ammoniumsulfat, PEG, Antikörpern oder dergleichen, Hitzedenaturierung, gefolgt von Zentrifugation, Chromatographieschritte, wie zum Beispiel Ionenaustausch, Gelfiltration, Umkehrphasen-, Hydroxylapatit- und Affinitätschromatographie, isoelektrische Fokussierung, Gelelektrophorese und Kombinationen derartiger und anderer Techniken ein. Wie auf dem Fachgebiet allgemein bekannt ist, glaubt man, dass die Reihenfolge, mit der die verschiedenen Reinigungsschritte ausgeführt werden, geändert werden kann, oder dass bestimmte Schritte ausgelassen werden können, und immer noch ein geeignetes Verfahren zur Herstellung eines wesentlich gereinigten Proteins oder Peptids ergeben.
Es gibt keine allgemeine Erfordernis, dass das Protein oder Peptid immer in dem gereinigtesten Zustand bereitgestellt werden muss. Es wird in der Tat in Betracht gezogen, dass weniger wesentlich gereinigte Produkte in bestimmten Ausführungsformen von Nutzen sind. Eine teilweise Reinigung kann erreicht werden, indem weniger Reinigungsschritte in Kombination verwendet werden, oder durch Benutzen unterschiedlicher Arten des gleichen allgemeinen Reinigungsschemas. Es ist zum Beispiel ersichtlich, dass eine Kationenaustausch-Säulenchromatographie, die unter Verwendung einer HPLC-Apparatur durchgeführt wird, im Allgemeinen einer höhere "-fache" Reinigung ergeben wird als die gleiche Technik unter Verwendung eines Niedrigdruck-Chromatographiesystems. Verfahren, die einen niedrigen Grad relativer Reinigung aufweisen, können Vorteile bei der Gesamtgewinnung eines Proteinprodukts oder beim Aufrechterhalten der Aktivität eines exprimierten Proteins haben.
Es ist bekannt, dass die Wanderung eines Polypeptids bei unterschiedlichen Bedingungen von SDS/PAGE manchmal signifikant variieren kann [Capaldi et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 76: 425 (1977)]. Es ist deshalb ersichtlich, dass unter unterschiedlichen Elektrophoresebedingungen die scheinbaren Molekulargewichte gereinigter oder teilweise gereinigter Expressionsprodukte variieren können.
Man kann derartige G-CSF-Analoga wahlweise von anderen Komponenten, die bei dem Verfahren erhalten werden, reinigen und isolieren. Reinigungsverfahren können im US-Patent Nr. 5.849.883 gefunden werden. Andere Verfahren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt (siehe auch Souza, vorstehend, jedes hier durch Bezugnahme aufgenommen). Diese Dokumente beschreiben spezifische beispielhafte Verfahren zur Isolierung und Reinigung von G-CSF-Zusammensetzungen, die beim Isolieren und Reinigen der G-CSF-Analoga der vorliegenden Erfindung nützlich sein können. In Anbetracht der Offenbarung dieser Patente ist es offensichtlich, dass sich ein Fachmann zahlreicher Reinigungstechniken bewusst wäre, die verwendet werden können, um G-CSF aus einer bestimmten Quelle zu isolieren.
Es wird auch in Betracht gezogen, dass eine Kombination von Anionenaustausch- und Immunaffinitätschromatographie eingesetzt werden kann, um gereinigte Zusammensetzungen mit einem G-CSF-Analogon der vorliegenden Erfindung herzustellen.
E. Vektoren zum Klonieren, zum Gentransfer und zur Expression
Wie im vorhergehenden Abschnitt diskutiert wurde, werden Expressionsvektoren eingesetzt, um das zum menschlichen G-CSF analoge Polypeptidprodukt zu exprimieren, das dann gereinigt werden und zur Behandlung der Neutropenie verwendet werden kann. In anderen Ausführungsformen können Expressionsvektoren in Gentherapie-Anwendungen verwendet werden, um die Nukleinsäuren, die ein Analogon des menschlichen G-CSF kodieren, in Zellen einzuführen, die dessen bedürfen, und/oder um die Expression eines Analogons des menschlichen G-CSF in derartigen Zellen zu induzieren. Der vorliegende Abschnitt ist auf eine Beschreibung der Herstellung derartiger Expressionsvektoren gerichtet.
Expression erfordert, dass geeignete Signale in den Vektoren bereitgestellt werden, die verschiedene regulatorische Elemente einschließen, wie zum Beispiel Enhancer/Promotoren aus sowohl Virus- als auch Säuger-Quellen, die eine Expression der Gene von Interesse in Wirtszellen antreiben. Elemente, die so gestaltet sind, dass die Stabilität und Translatierbarkeit von messenger-RNA in Wirtszellen optimiert wird, werden auch beschrieben. Die Bedingungen für die Verwendung etlicher dominanter Arzneistoff-Selektionsmarker zum Etablieren permanenter, stabiler Zellklone, die das Produkt exprimieren, werden auch bereitgestellt, sowie ein Element, dass die Expression der Arzneistoff-Selektionsmarker mit der Expression des Polypeptids verbindet.
a. Regulatorische Elemente
Promotoren und Enhancer.
Überall in dieser Anwendung soll der Begriff "Expressionskonstrukt" oder "Expressionsvektor" jede Art eines genetischen Konstrukts einschließen, das eine Nukleinsäure enthält, die Genprodukte kodiert, wobei ein Teil oder die ganze kodierende Nukleinsäuresequenz fähig ist, transkribiert zu werden. Das Transkript kann zu einem Protein translatiert werden, muss aber nicht. In bestimmten Ausführungsformen schließt die Expression sowohl die Transkription eines Genes als auch die Translation von mRNA zu einem Genprodukt ein. Die Nukleinsäure, die ein Genprodukt kodiert, steht unter transkriptioneller Kontrolle eines Promoters. Ein "Promotor" bezeichnet eine DNA-Sequenz, die durch die Synthesemaschinerie der Zelle oder eine eingeführte Synthesemaschinerie erkannt wird, und die erforderlich ist, um die spezifische Transkription eines Gens zu initiieren. Der Begriff "unter transkriptioneller Kontrolle" bedeutet, dass der Promotor am richtigen Ort und in der richtigen Orientierung in Relation zu der Nukleinsäure ist, um die Initiation der RNA-Polymerase und die Expression des Gens zu kontrollieren.
Der Begriff "Promotor" wird hierin verwendet, um eine Gruppe transkriptioneller Kontrollmodule zu bezeichnen, die um die Initiationsstelle für RNA-Polymerase II herum angehäuft sind. Vieles am Denken darüber, wie Promotoren organisiert sind, wird aus Analysen einiger viraler Promotoren abgeleitet, einschließlich derer für die Thymidin-Kinase-(tk) aus HSV und die SV40 frühen Transkriptionseinheiten. Diese Untersuchungen, vermehrt durch neuere Arbeit, haben gezeigt, dass sich Promotoren aus diskreten funktionellen Modulen zusammensetzen, wobei jedes aus ungefähr 7–20 bp DNA besteht und eine oder mehrere Erkennungsstellen für transkriptionelle Aktivator- oder Repressorproteine enthält.
Mindestens ein Modul in jedem Promotor hat die Funktion, die Startstelle für die RNA-Synthese zu positionieren. Das am besten bekannte Beispiel dafür ist die TATA-Box, aber in einigen Promotoren, denen eine TATA-Box fehlt, wie zum Beispiel dem Promotor für das Gen der terminalen Säuger-Desoxynucleotidyltransferase und dem Promotor für die späten SV40-Gene, hilft ein diskretes Element, das über der Startstelle selbst liegt, den Inititationsort festzulegen.
Zusätzliche Promotorelemente regulieren die Häufigkeit der transkriptionellen Initiation. Typischerweise liegen diese im Bereich 30–110 bp stromaufwärts von der Startstelle, obwohl von etlichen Promotoren kürzlich gezeigt wurde, dass sie funktionelle Elemente auch stromabwärts der Startstelle enthalten. Der Abstand zwischen Promotorelementen ist häufig flexibel, so dass die Promotorfunktion erhalten bleibt, wenn Elemente umgekehrt oder relativ zueinander bewegt werden. Im tk-Promotor kann der Abstand zwischen Promotorelementen auf 50 bp auseinander erhöht werden, bevor die Aktivität zu sinken beginnt. Abhängig vom Promotor scheint es, dass einzelne Elemente entweder kooperativ oder unabhängig funktionieren können, um die Transkription zu aktivieren.
Man glaubt nicht, dass der jeweilige Promoter, der eingesetzt wird, um die Expression einer Nukleinsäuresequenz von Interesse zu kontrollieren, wichtig ist, so lange er fähig ist, die Expression der Nukleinsäure in der gezielt veränderten Zelle zu steuern. So ist es vorzuziehen, wo eine menschliche Zelle gezielt verändert wird, den kodierenden Nukleinsäurebereich angrenzend an und unter die Kontrolle eines Promotors zu platzieren, der fähig ist, in einer menschlichen Zelle exprimiert zu werden. Allgemein ausgedrückt könnte ein derartiger Promotor entweder einen menschlichen oder viralen Promotor einschließen.
In verschiedenen Ausführungsformen können der Promotor des immediate-early-Gens des menschlichen Cytomegalovirus (CMV), der frühe SV40-Promotor, das lange terminale Repeat des Rous Sarcoma Virus, β-Aktin, der Ratten-Insulin-Promotor, der Promotor der Phosphoglycerinkinase und der Promotor der Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, die alle wohlbekannte Promotoren und Fachleuten leicht erhältlich sind, verwendet werden, um eine Expression der kodierenden Sequenz von Interesse auf hohem Niveau zu erhalten. Die Verwendung anderer viraler oder Säugerzellen- oder bakterieller Phagen-Promotoren, die auf dem Fachgebiet wohlbekannt sind, um die Expression einer kodierenden Sequenz von Interesse zu erreichen, wird ebenfalls in Betracht gezogen, vorausgesetzt, dass die Expressionsniveaus für einen bestimmten Zweck ausreichen. Durch Einsetzen eines Promotors mit wohlbekannten Eigenschaften können das Niveau und Muster der Expression des Proteins von Interesse nach Transfektion oder Transformation optimiert werden.
Die Auswahl eines Promotors, der in Reaktion auf spezifische physiologische oder synthetische Signale reguliert wird, kann eine induzierbare Expression des Genprodukts gestatten. Einige induzierbare Promotorsysteme sind zur Herstellung viraler Vektoren erhältlich. Ein derartiges System ist das Ecdyson-System (Invitrogen, Carlsbad, CA), das so gestaltet wird, dass es die regulierte Expression eines Gens von Interesse in Säugerzellen ermöglicht. Es besteht aus einem straff regulierten Expressionsmechanismus, der praktisch keine Grundexpression des Transgens erlaubt, aber eine über 200-fache Induzierbarkeit.
Ein anderes induzierbares System, das nützlich wäre, ist das Tet-Off^TM oder Tet-On^TM-System (Clontech, Palo Alto, CA), das ursprünglich von Gossen und Bujard entwickelt wurde [Gossen und Bujard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15; 89 (12): 5547–51 (1992); Gossen et al., Science 268 (5218): 1766–9 (1995)].
Unter einigen Umständen kann es wünschenswert sein, die Expression eines Transgens in einem Gentherapie-Vektor zu regulieren. Zum Beispiel können unterschiedliche virale Promotoren mit variierenden Aktivitätsstärken, abhängig von dem erwünschten Expressionsniveau, benutzt werden. In Säugerzellen wird der Immediate-early-Promotor aus CMV oft verwendet, um eine starke transkriptionelle Aktivierung bereitzustellen. Modifizierte Versionen des CMV-Promotors, die weniger stark sind, sind auch verwendet worden, wenn reduzierte Expressionsniveaus des Transgens erwünscht sind. Wenn die Expression eines Transgens in hämatopoetischen Zellen erwünscht ist, werden oft retrovirale Promotoren, wie zum Beispiel die LTRs von MLV oder MMTV, verwendet. Andere virale Promotoren, die abhängig von der erwünschten Wirkung verwendet werden können, schließen SV40, das LTR von RSV, die LTRs von HIV-1 und HIV-2, Adenovirus-Promotoren, zum Beispiel aus dem E1A-, E2A- oder MLP-Bereich, das LTR von AAV, den Blumenkohlmosaikvirus, HSV-TK und den Avian Sarcoma Virus ein.
Auf ähnliche Weise können gewebespezifische Promotoren verwendet werden, um Transkription in spezifischen Geweben oder Zellen zu bewirken, um so die potenzielle Toxizität oder unerwünschte Wirkungen auf Gewebe zu reduzieren, auf die nicht gezielt wird. Zum Beispiel können Promotoren wie zum Beispiel PSA, Probasin, saure Prostataphosphatase oder Prostata-spezifisches glandulares Kallikrein (hK2) verwendet werden, um auf Genexpression in der Prostata abzuzielen.
Bei bestimmten Indikationen kann es wünschenswert sein, Transkription zu spezifischen Zeiten nach Verabreichung des Gentherapie-Vektors zu aktivieren. Dies kann mit Promotoren wie zum Beispiel jenen durchgeführt werden, die durch ein Hormon oder Cytokin regulierbar sind. Zum Beispiel kann die Verwendung von durch Androgen oder Östrogen regulierten Promotoren bei Gentherapie-Anwendungen vorteilhaft sein, bei denen die Indikation ein Gonadengewebe ist, wo spezifische Steroide produziert oder hingeleitet werden. Derartige Promotoren, die durch ein Hormon regulierbar sind, schließen MMTV, MT-1, Ecdyson und RuBisco ein. Man erwartet, dass andere, durch ein Hormon regulierte Promotoren, wie zum Beispiel die auf Schilddrüsen-, Hypophysen- und Nebennierenrindenhormone ansprechenden, in der vorliegenden Erfindung nützlich sind. Auf Cytokine und Entzündungsproteine ansprechende Promotoren, die verwendet werden könnten, schließen K- und T-Kininogen [Kageyama et al., J. Biol. Chem. 262 (5): 2345–51(1987)], c-fos, TNF-alpha, C-reaktives Protein [Arcone et al., Nucleic Acids Res. 16 (8): 3195–207 (1988)], Haptoglobin [Oliviero et al., EMBO J. 6 (7): 1905–12 (1987)], Serumamyloid A2, C/EBP-alpha, IL-1, IL-6 [Poli und Cortese, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (21): 8202–6 (1989)], Komplement C3 [Wilson et al., Mol. Cell. Biol. 10 (12): 6181-91 (1990)], IL-8, saures Alpha-1-Glykoprotein [Prowse und Baumann, Mol. Cell. Biol. 8 (1):42–51 (1988)], Alpha-1-Antitrypsin, Lipoprotein-Lipase [Zechner et al., Mol. Cell. Biol. 8 (6): 2394–401 (1988)], Angiotensinogen [Ron et al., Mol. Cell. Biol. 11 (5): 2887–95 (1991)], Fibrinogen, c-Jun (durch Phorbolester, TNF-alpha, UV-Strahlung, Retinsäure und Wasserstoffperoxid induzierbar), Collagenase (durch Phorbolester und Retinsäure induziert), Metallothionein (durch Schwermetall und Glucocorticoid induzierbar), Stromelysin (durch Phorbolester, Interleukin-1 und EGF induzierbar), Alpha-2-Makroglobulin und Alpha-1-Antichymotrypsin ein.
Andere Promotoren, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnten, schließen Lac-regulierbare, durch Wärme (Überhitzung) induzierbare Promotoren und strahlungsinduzierbare, z.B. EGR [Joki et al., Hum. Gene Ther. 6 (12): 1507–13 (1995)], Alpha-Inhibin, RNA Pol III tRNA met und andere Aminosäurepromotoren, U1 snRNA [Bartlett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 20; 93 (17): 8852–7 (1996)], MC-1, PGK, β-Aktin und α-Globin ein. Viele andere Promotoren, die nützlich sein können, werden in Walther und Stein [J. Mol. Med. 74 (7): 379–92 (1996)] aufgeführt.
Es ist vorgesehen, dass jeder der vorstehenden Promotoren, allein oder in Kombination mit einem anderen, gemäß der vorliegenden Erfindung abhängig von der erwünschten Wirkung nützlich sein kann. Zusätzlich sollte diese Promotorenliste nicht als erschöpfend oder beschränkend aufgefasst werden und Fachleuten werden andere Promotoren bekannt sein, die in Verbindung mit den hierin offenbarten Promotoren oder Verfahren verwendet werden können.
Ein anderes regulatorisches Element, das für eine Verwendung in der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird, ist ein Enhancer. Dabei handelt es sich um genetische Elemente, welche die Transkription von einem Promotor aus erhöhen und an einer entfernten Position auf dem gleichen DNA-Molekül liegen. Enhancer sind ganz wie Promotoren organisiert. Das heißt, sie bestehen aus vielen einzelnen Elementen, von denen jedes ein oder mehrere transkriptionelle Proteine bindet. Die Grundunterscheidung zwischen Enhancern und Promotoren ist funktionsbedingt. Ein Enhancerbereich als ganzer muss fähig sein, Transkription aus der Entfernung zu stimulieren; dies muss auf eine Promotorregion oder ihre Komponenten-Elemente nicht zutreffen. Auf der anderen Seite muss ein Promotor ein oder mehrere Elemente haben, welche die Initiation der RNA-Synthese an einer bestimmten Stelle und in einer bestimmten Richtung steuern, während Enhancern diese Spezifitäten fehlen. Promotoren und Enhancer sind oft überlappend und zusammenhängend und scheinen oft eine sehr ähnliche modulare Organisation zu haben. Bei der vorliegenden Erfindung nützliche Enhancer sind Fachleuten wohlbekannt und hängen von dem jeweiligen Expressionssystem, das eingesetzt wird, ab [Schart et al., Results Probl. Cell. Differ. 20: 125–62 (1994); Bittner et al., Meth. Enzymol. 153: 516–544 (1987)].
Polyadenylierungssignale.
Dort, wo ein cDNA-Insert eingesetzt wird, wird man typischerweise wünschen, ein Polyadenylierungssignal einzuschließen, um eine richtige Polyadenylierung des Gentranskripts zu bewirken. Es wird nicht geglaubt, dass die Art des Polyadenylierungssignals ausschlaggebend für die erfolgreiche Ausführung der Erfindung ist und jede derartige Sequenz, wie zum Beispiel die Polyadenylierungssignale des menschlichen oder Rinder-Wachstumshormons und SV40, kann eingesetzt werden. Auch ein Terminator wird als ein Element der Expressionskassette in Betracht gezogen. Diese Elemente können dazu dienen, die Niveaus der Message zu verstärken und das Durchlesen von der Kassette in andere Sequenzen hinein zu minimieren.
IRES.
In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung wird die Verwendung von internen Ribosomen-Eintrittsstellen-(IRES) Elementen in Betracht gezogen, um Multigen- oder polycistronische Messages zu schaffen. IRES-Elemente sind fähig, das Ribosomen-Scanning-Modell der von 5'-methyliertem Cap abhängigen Translation zu umgehen und die Translation an internen Stellen zu beginnen [Pelletier und Sonenberg, Nature 334: 320–325 (1988)]. IRES-Elemente aus zwei Mitgliedern der Picornavirus-Familie (Poliovirus und Encephalomyocarditis) sind beschrieben worden (Pelletier und Sonenberg, 1988, vorstehend), sowie ein IRES aus einer Säuger-Message [Macejak und Sarnow, Nature 353: 90–94 (1991)]. IRES-Elemente können an heterologe offene Leserahmen gebunden werden. Mehrere offene Leserahmen können zusammen transkribiert werden, jeder durch ein IRES abgetrennt, wodurch polycistronische Messages geschaffen werden. Kraft des IRES-Elementes ist den Ribosomen jeder offene Leserahmen für eine effiziente Translation zugänglich. Mehrere Gene können unter Verwendung eines einzigen Promotors/Enhancers, um eine einzige Message zu transkribieren, effizient exprimiert werden.
Jeder heterologe offene Leserahmen kann an IRES-Elemente gebunden werden. Dies schließt Gene für sezernierte Proteine, Proteine mit mehreren Untereinheiten, die durch unabhängige Gene kodiert werden, intrazelluläre oder membrangebundene Proteine und selektierbare Marker ein. Auf diese Weise kann die Expression einiger Proteine gleichzeitig mit einem einzigen Konstrukt und einem einzigen selektierbaren Marker in eine Zelle gentechnisch eingebaut werden.
b. Abgabe von Expressionsvektoren
Es gibt etliche Weisen, auf die Expressionsvektoren in Zellen eingeführt werden können. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung umfasst das Expressionskonstrukt einen Virus oder ein gentechnisch verändertes Konstrukt, das von einem Virusgenom abgeleitet ist. In anderen Ausführungsformen wird nicht-virale Abgabe in Betracht gezogen. Die Fähigkeit bestimmter Viren, in Zellen durch Rezeptor-vermittelte Endocytose zu gelangen, in ein Wirtszellgenom zu integrieren und Virus-Gene stabil und effizient zu exprimieren, hat sie zu attraktiven Kandidaten für den Transfer fremder Gene in Säugerzellen gemacht [Ridgeway, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez & Denhardt (Hrsg.), Stoneham: Butterworth, 467–492, 1988; Nicolas und Rubenstein, In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez & Denhardt (Hrsg.), Stoneham: Butterworth, 493–513, 1988; Baichwal und Sugden, In: Gene Transfer, Kucherlapati (Hrsg.), New York, Plenum Press, 117–148, 1986; Temin, In: Gene Transfer, Kucherlapati (Hrsg.), New York: Plenum Press, 149–188, 1986)]. Die ersten als Genvektoren verwendeten Viren waren DNA-Viren einschließlich der Papovaviren (Simian Virus 40, Rinderpapillomavirus und Polyomavirus) (Ridgeway, 1988, vorstehend; Baichwal und Sugden, 1986, vorstehend) und Adenoviren (Ridgeway, 1988, vorstehend; Baichwal und Sugden, 1986, vorstehend). Sie haben eine relativ niedrige Kapazität für fremde DNA-Sequenzen und haben ein restringiertes Wirtsspektrum. Darüberhinaus werfen ihr onkogenes Potenzial und ihre zytopathischen Wirkungen in permissiven Zellen Sicherheitsbedenken auf. Sie können nur bis zu 8 kb fremdes genetisches Material unterbringen, können aber leicht in eine Vielfalt von Zelllinien und Labortieren eingeführt werden (Nicolas und Rubenstein, 1988, vorstehend; Temin, 1986, vorstehend).
Es wird jetzt allgemein anerkannt, dass DNA unter Verwendung einer Vielfalt von Virus-Vektoren in eine Zelle eingeführt werden kann. In derartigen Ausführungsformen kann es sich bei den Expressionskonstrukten, die virale Vektoren umfassen, welche die Gene von Interesse enthalten, um einen Adenovirus- (siehe zum Beispiel US Patent Nr. 5.824.544, US Patent Nr. 5.707.618, US Patent Nr. 5.693.509, US Patent Nr. 5.670.488, US Patent Nr. 5.585.362), einen Retrovirus- (siehe zum Beispiel US Patent Nr. 5.888.502, US Patent Nr. 5.830.725, US Patent Nr. 5.770.414, US Patent Nr. 5.686.278 und US Patent Nr. 4.861.719), einen mit Adenovirus assoziierten Virus- (siehe zum Beispiel US Patent Nr. 5.474.935, US Patent Nr. 5.139.941, US Patent Nr. 5.622.856, US Patent Nr. 5.658.776, US Patent Nr. 5.773.289, US Patent Nr. 5.789.390, US Patent Nr. 5.834.441, US Patent Nr. 5.863.541, US Patent Nr. 5.851.521 und US Patent Nr. 5.252.479), einen Adenovirus-, mit Adenovirus assoziierten Hybridvirus- (siehe zum Beispiel. US Patent Nr. 5.856.152) oder einen Vaccinia-Virus- oder einen Herpes-Virus-(siehe zum Beispiel US Patent Nr. 5.879.934, US Patent Nr. 5.849.571, US Patent Nr. 5.830.727, US Patent Nr. 5.661.033 und US Patent Nr. 5.328.688) Vektor handeln.
Es gibt etliche Alternativen zu einem viralen Transfer genetischer Konstrukte. Dieser Abschnitt stellt eine Diskussion von Verfahren und Zusammensetzungen nicht-viralen Gentransfers bereit. DNA-Konstrukte der vorliegenden Erfindung werden im Allgemeinen an eine Zelle abgegeben, und in bestimmten Situationen kann die Nukleinsäure oder das zu transferierende Protein unter Verwendung nicht-viraler Verfahren transferiert werden.
Einige nicht-virale Verfahren zum Transfer von Expressionskonstrukten in kultivierte Säugerzellen werden durch die vorliegende Erfindung in Betracht gezogen. Diese schließen die Calciumphosphat-Präzipitation [Graham und Van Der Eb, Virology 52: 456–467 (1973); Chen und Okayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745–2752 (1987); Rippe et al., Mol. Cell. Biol. 10: 689–695 (1990)], DEAE-Dextran [Gopal, Mol. Cell. Biol. 5: 1188–1190 (1985)], Elektroporation [Tur-Kaspa et al., Mol. Cell. Biol. 6: 716–718 (1986); Potter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7161–7165 (1984)], direkte Mikroinjektion [Harland und Weintraub, J. Cell Biol. 101: 1094–1099 (1985)], mit DNA beladene Liposomen [Nicolau und Sene, Biochim. Biophys. Acta. 721: 185–190 (1982); Fraley et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA 76: 3348–3352 (1979); Felgner, Sci. Am. 276 (6): 102–106 (1997); Felgner, Hum. Gene Ther. 7 (15): 1791–3 (1996)], Sonifikation von Zellen [Fechheimer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 8463–8467 (1987)], Genbombardierung unter Verwendung von Hochgeschwindigkeits-Mikroprojektilen [Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9568–9572 (1990)], und rezeptorvermittelte Transfektion [Wu und Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429–4432 (1987); Wu und Wu, Biochem. 27: 887–892 (1988); Wu und Wu, Adv. Drug Deliv. Rev. 12: 159–167 (1993)] ein.
Sobald das Konstrukt in die Zelle abgegeben worden ist, kann die Nukleinsäure, die das therapeutische Gen kodiert, an unterschiedlichen Stellen platziert und exprimiert werden. In bestimmten Ausführungsformen kann die Nukleinsäure, die das therapeutische Gen kodiert, stabil in das Genom der Zelle integriert werden. Diese Integration kann am verwandten Ort und in der verwandten Orientierung durch homologe Rekombination geschehen (Gen-Ersetzung) oder sie kann an einem zufälligen, unspezifischen Ort integriert werden (Genvermehrung). In noch weiteren Ausführungsformen kann die Nukleinsäure in der Zelle stabil als ein getrenntes, episomales DNA-Segment aufrechterhalten werden. Derartige Nukleinsäure-Segmente oder "Episome" kodieren Sequenzen, die ausreichen, um die Aufrechterhaltung und Replikation unabhängig von oder synchron mit dem Zellzyklus der Wirtszelle zu gestatten. Wie das Expressionskonstrukt an eine Zelle abgegeben wird und wo in der Zelle die Nukleinsäure verbleibt, hängt von der Art des eingesetzten Expressionskonstrukts ab.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung kann das Expressionskonstrukt in einem Liposom eingefangen sein. Liposomen sind vesikuläre Strukturen, die durch eine zweischichtige Phospholipidmembran und ein inneres wässriges Medium gekennzeichnet sind. Multilamellare Liposomen haben mehrere Lipidschichten, die durch wässriges Medium getrennt sind. Sie bilden sich spontan, wenn Phospholipide in einem Überschuss an wässriger Lösung suspendiert werden. Die Lipidkomponenten unterziehen sich vor der Bildung von geschlossenen Strukturen einer Selbst-Umlagerung und fangen Wasser und gelöste Stoffe zwischen den Lipid-Doppelschichten ein [Ghosh und Bachhawat, In: Liver diseases, targeted diagnosis and therapy using specific receptors and ligands, Wu & Wu (Hrsg.), New York: Marcel Dekker, S. 87–104 (1991)]. Die Zugabe von DNA zu kationischen Liposomen verursacht einen topologischen Übergang von Liposomen zu optisch doppelbrechenden flüssigkristallinen kondensierten Kügelchen [Radler et al., Science 275 (5301): 810–4 (1997)]. Diese DNA-Lipidkomplexe sind potenzielle nicht-virale Vektoren zur Verwendung bei Gentherapie und -abgabe.
Liposomvermittelte Nukleinsäureabgabe und Expression fremder DNA in vitro ist sehr erfolgreich gewesen. In der vorliegenden Erfindung werden auch verschiedene kommerzielle Ansätze in Betracht gezogen, welche die Technologie der "Lipofektion" einbeziehen. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann das Liposom einen Komplex mit einem hämagglutinierenden Virus (HVJ) bilden. Es ist gezeigt worden, dass dies die Fusion mit der Zellmembran erleichtert und den Zelleintritt von liposomverkapselter DNA fördert [Kaneda et al., Science 243: 375–378 (1989)]. In anderen Ausführungsformen kann das Liposom in Verbindung mit nukleären chromosomalen Nicht-Histon-Proteinen (HMG-1) komplexiert sein oder eingesetzt werden [Kato et al., J. Biol. Chem. 266: 3361–3364 (1991)]. In noch weiteren Ausführungsformen kann das Liposom in Verbindung mit sowohl HVJ als auch HMG-1 komplexiert oder eingesetzt werden. Insofern sind derartige Expressionskonstrukte erfolgreich beim Transfer und der Expression von Nukleinsäure in vitro und in vivo eingesetzt worden. Dann sind sie für die vorliegende Erfindung anwendbar.
Andere Vektor-Abgabesysteme, die eingesetzt werden können, um eine Nukleinsäure, die ein therapeutisches Gen kodiert, in Zellen abzugeben, schließen rezeptorvermittelte Abgabevehikel ein. Diese nutzen die selektive Aufnahme von Makromolekülen durch rezeptorvermittelte Endocytose in fast allen eukaryotischen Zellen aus. Wegen der zelltypspezifischen Verteilung verschiedener Rezeptoren kann die Abgabe hochspezifisch sein (Wu und Wu, 1993, vorstehend).
Vehikel für das rezeptorvermittelte Gen-Targeting bestehen im Allgemeinen aus zwei Komponenten: einem für den Zellrezeptor spezifischen Liganden und einem DNA-bindenden Mittel. Einige Liganden sind für rezeptorvermittelten Gentransfer verwendet worden. Die am ausgiebigsten charakterisierten Liganden sind Asialo-Orosomucoid (ASOR) (Wu und Wu, 1987, vorstehend) und Transferrin [Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (9): 3410–3414 (1990)]. Kürzlich ist ein synthetisches Neoglycoprotein, das den gleichen Rezeptor wie ASOR erkennt, als Genabgabevehikel verwendet worden [Ferkol et al., FASEB J. 7: 1081–1091 (1993); Perales et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4086 –4090 (1994)] und der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) ist auch verwendet worden, um Gene an Plattenepithelkarzinomzellen abzugeben (Myers, EPO 0273085).
In anderen Ausführungsformen kann das Abgabevehikel einen Liganden und ein Liposom umfassen. Zum Beispiel setzten Nicolau et al. [Methods Enzymol. 149: 157–176 (1987)] Lactosylceramid, ein Galaktose-terminales Asialgangliosid, das in Liposo men eingebaut war, ein und beobachteten eine Zunahme bei der Aufnahme des Insulingens durch Hepatozyten. Es ist daher praktikabel, dass eine Nukleinsäure, die ein therapeutisches Gen kodiert, durch beliebig viele Rezeptor-Liganden-Systeme mit oder ohne Liposomen auch spezifisch in einen bestimmten Zelltyp abgegeben werden kann.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das Expressionskonstrukt einfach aus nackter rekombinanter DNA oder Plasmiden bestehen. Der Transfer des Konstrukts kann durch jedes der vorstehend erwähnten Verfahren durchgeführt werden, welche die Zellmembran physikalisch oder chemisch permeabilisieren. Dies ist besonders für Transfer in vitro anwendbar; es kann jedoch ebenfalls für eine in-vivo-Verwendung angewendet werden. Dubensky et al. [Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81: 7529–7533 (1984)] injizierten Polyomavirus-DNA in Form von CaPO₄-Präzipitaten erfolgreich in Leber und Milz von erwachsenen und neugeborenen Mäusen und demonstrierten aktive virale Replikation und akute Infektion. Benvenisty und Neshif [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 9551–9555 (1986)] demonstrierten auch, dass direkte intraperitoneale Injektion von CaPO₄-präzipitierten Plasmiden zur Expression der transfizierten Gene führte.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung zum Transferieren nackter DNA-Expressionskonstrukte in Zellen kann Teilchenbeschuss einbeziehen. Dieses Verfahren hängt von der Fähigkeit ab, DNA-beschichtete Mikroprojektile auf hohe Geschwindigkeit zu beschleunigen, wodurch ihnen erlaubt wird, Zellmembranen zu durchbohren und in Zellen hineinzukommen, ohne sie zu töten [Klein et al., Nature 327: 70 –73 (1987)]. Einige Geräte zum Beschleunigen kleiner Teilchen sind entwickelt worden. Ein derartiges Gerät beruht auf einer hohen Spannungsentladung, um einen elektrischen Strom zu erzeugen, der wiederum die Bewegungskraft bereitstellt [Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 9568–9572 (1990)]. Die verwendeten Mikroprojektile haben aus biologisch inerten Stoffen wie zum Beispiel Wolfram- oder Goldkügelchen bestanden.
F. Verfahren zum Behandeln der Neutropenie
Wie hierin vorstehend erwähnt, wird in Betracht gezogen, dass die Analoga des menschlichen G-CSF oder die Vektoren, die Polynukleotide umfassen, die derartige Proteine kodieren, bei Ersatztherapie-Protokollen für die Behandlung der Neutropenie eingesetzt werden. Es ist festgestellt worden, dass G-CSF bei der Behandlung von Indikationen nützlich ist, bei denen eine Zunahme der neutrophilen Zellen Vorteile bereitstellt. Für Krebspatienten ist G-CSF zum Beispiel als Mittel zum selektiven Stimulieren der Produktion neutrophiler Zellen vorteilhaft, um hämatopoetische Defizite zu kompensieren, die sich aus Chemotherapie oder Strahlentherapie ergeben. Andere Indikationen schließen die Behandlung verschiedener Infektionskrankheiten und damit zusammenhängender Leiden, wie zum Beispiel Sepsis, die typischerweise durch einen Bakterienmetaboliten verursacht wird, ein. G-CSF ist auch alleine oder in Kombination mit anderen Verbindungen, wie zum Beispiel anderen Cytokinen, zum Wachstum oder zur Expansion von Zellen in Kultur (zum Beispiel für Knochenmarktransplantate oder ex-vivo-Expansion) nützlich. G-CSF ist Transplantatpatienten als ein Zusatz zur Behandlung einer Infektion oder zur Behandlung der Neutropenie verabreicht worden.
a. Auf Protein beruhende Therapie
Eine der therapeutischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Zusammensetzungen, welche die Analoga des menschlichen G-CSF der vorliegenden Erfindung umfassen, für einen Patienten, der dessen bedarf. Wie vorstehend diskutiert können die Proteine durch rekombinante Mittel oder durch automatisierte Peptidsynthese erzeugt worden sein. Die Formulierungen mit Analoga des menschlichen G-CSF können für eine derartige Therapie, beruhend auf dem Verabreichungsweg, ausgewählt werden und können Liposom-Formulierungen ebenso wie klassische pharmazeutische Zubereitungen einschließen.
Die zum menschlichen G-CSF analogen Proteine werden zu einer geeigneten Zubereitung formuliert und an eine oder mehrere Stellen im Patienten in einer therapeutisch wirksamen Menge verabreicht. In besonders bevorzugten Ausführungsformen erfolgt die auf Proteinen, die zum menschlichen G-CSF analog sind, beruhende Therapie durch kontinuierliche oder zeitweise intravenöse Verabreichung. Mit "therapeutisch wirksamer Menge" bezeichnet die vorliegende Erfindung die Menge eines Analogons des menschlichen G-CSF, die ausreicht, um eine beobachtbare Änderung im Niveau einer oder mehrerer biologischer Aktivitäten von G-CSF zu unterstützen. Die Änderung kann entweder ein erhöhtes Niveau der G-CSF-Aktivität sein. Vorzugsweise handelt es sich bei der Änderung um eine Erhöhung der Proliferation neutrophiler Zellen.
Fachleute werden verstehen, dass die Mengen eines Analogons des menschlichen G-CSF zur therapeutischen Verwendung variieren können. Es wird in Betracht gezogen, dass die spezifische Aktivität der zum menschlichen G-CSF analogen Proteinherstellung im Bereich von etwa 100 Einheiten/mg Protein bis etwa 500 Einheiten/mg Protein liegen kann. Eine bestimmte Herstellung eines Analogons des menschlichen G- CSF kann so etwa 100 Einheiten/mg Protein, etwa 125 Einheiten/mg Protein, etwa 150 Einheiten/mg Protein, etwa 175 Einheiten/mg Protein, etwa 200 Einheiten/mg Protein, etwa 225 Einheiten/mg Protein, etwa 250 Einheiten/mg Protein, etwa 275 Einheiten/mg Protein, etwa 300 Einheiten/mg Protein, etwa 325 Einheiten/mg Protein, etwa 350 Einheiten/mg Protein, etwa 375 Einheiten/mg Protein, etwa 400 Einheiten/mg Protein, etwa 425 Einheiten/mg Protein, etwa 450 Einheiten/mg Protein, etwa 475 Einheiten/mg Protein und etwa 500 Einheiten/mg Protein umfassen. Ein besonders bevorzugter Bereich reicht von etwa 100 Einheiten/mg Protein bis etwa 200 Einheiten/mg Protein; ein stärker bevorzugter Bereich liegt zwischen etwa 150 und etwa 200 Einheiten/mg Protein. Vorzugsweise ist die Proteinzusammensetzung im Wesentlichen frei von kontaminierenden Faktoren, Kontaminationsniveau weniger als 0,02 % (Gew./Gew.). Zusammensetzungen mit Analoga des menschlichen G-CSF, die zur Injektion in einen Patienten geeignet sind, können zum Beispiel aus einer lyophilisierten Probe, die ein gereinigtes Analogon des menschlichen G-CSF und stabilisierende Salze umfasst, durch Rekonstitution mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel hergestellt werden.
Die Verabreichung der Zusammensetzungen kann systemisch oder lokal sein und kann eine Injektion einer therapeutisch wirksamen Menge der Proteinzusammensetzung mit einem Analogon des menschlichen G-CSF an einer einzelner Stelle umfassen. Jede Fachleuten bekannte Verabreichungsweise einer therapeutischen Zusammensetzung der Erfindung wird in Betracht gezogen, einschließlich zum Beispiel intravenös, intramuskulär, subkutan oder ein Katheter für Langzeitverabreichung. Alternativ dazu wird in Betracht gezogen, dass die therapeutische Zusammensetzung an mehreren Stellen an den Patienten abgegeben wird. Die mehrfachen Verabreichungen können gleichzeitig erbracht oder über einen Zeitraum von einigen Stunden verabreicht werden. In bestimmten Fällen kann es vorteilhaft sein, einen kontinuierlichen Fluss der therapeutischen Zusammensetzung bereitzustellen. Eine zusätzliche Therapie kann auf einer periodischen Basis verabreicht werden, zum Beispiel täglich, wöchentlich oder monatlich.
b. Kombinationstherapie
Zusätzlich zu Therapien, die ausschließlich auf der Abgabe der Analoga des menschlichen G-CSF beruhen, wird Kombinationstherapie ausdrücklich in Betracht gezogen. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wird in Betracht gezogen, dass die Therapie mit dem Analogon des menschlichen G-CSF in ähnlicher Weise in Verbin dung mit anderen Mitteln verwendet werden könnte, die gewöhnlich zur Behandlung der Neutropenie verwendet werden.
Um das geeignete therapeutische Resultat unter Verwendung der Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung zu erreichen, würde man im Allgemeinen eine Zusammensetzung bereitstellen, die das Analogon des menschlichen G-CSF und mindestens ein anderes therapeutisches Mittel (zweites therapeutisches Mittel) umfasst. In der vorliegenden Erfindung wird in Betracht gezogen, dass das zweite therapeutische Mittel die Verabreichung oder den Einschluss mindestens eines zusätzlichen Faktors einbezieht, der aus EPO, G-CSF, M-GDF, SCF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 oder verschiedenen anderen Interleukinen, IGF-1, LIF, Interferon (wie zum Beispiel α, β, gamma oder Konsensus), neurotrophen Faktoren (wie zum Beispiel BDNF, NT-3, CTNF oder Noggin), anderen multipotenten Wachstumsfaktoren (wie zum Beispiel, in dem Ausmaß, wie von diesen gezeigt wurde, dass sie derartige multipotente Wachstumsfaktoren sind, der flt-3/flk-2-Ligand, der Stammzellproliferationsfaktor und der Faktor aus totipotenten Stammzellen), Fibroblastenwachstumsfaktoren (wie zum Beispiel FGF) und Analoga, Fusionsmoleküle oder andere Derivate der Vorstehenden. Zum Beispiel ist festgestellt worden, dass G-CSF in Kombination mit SCF periphere Blutvorläuferzellen in vivo mobilisiert. Ex vivo wurde zum Beispiel festgestellt, dass G-CSF in Kombination mit SCF, IL-3 und IL-6 zur Expansion peripherer Blutzellen nützlich ist. In ähnlicher Weise werden die vorliegenden G-CSF-Analoga ähnliche Verwendungen bereitstellen.
Die Kombinationstherapie-Zusammensetzungen würden in einer kombinierten Menge bereitgestellt, die wirksam ist, um das erwünschte therapeutische Resultat bei der Behandlung der Neutropenie herzustellen. Dieser Vorgang kann das In-Kontakt-Bringen der Zellen mit dem Analogon des menschlichen G-CSF und dem(n) zweiten Mittel(n) oder Faktor(en) zur gleichen Zeit einbeziehen. Dies kann durch Verabreichen einer einzelnen Zusammensetzung oder pharmakologischen Formulierung, die beide Mittel enthält, erreicht werden, oder durch Verabreichen von zwei getrennten Zusammensetzungen oder Formulierungen zur gleichen Zeit, wobei eine Zusammensetzung die therapeutische Zusammensetzung mit einem Analogon des menschlichen G-CSF einschließt und die andere das zweite therapeutische Mittel einschließt.
Alternativ dazu kann die Behandlung mit dem Analogon des menschlichen G-CSF der Behandlung mit dem anderen Mittel um Abstände, die von Minuten bis Wochen reichen, vorangehen oder folgen. In Ausführungen, bei denen das zweite therapeutische Mittel und das Analogon des menschlichen G-CSF getrennt verabreicht werden, würde man im Allgemeinen sicherstellen, dass kein signifikanter Zeitraum zwischen der Zeit jeder Abgabe verstreichen würde, so dass das zweite Mittel und das Analogon des menschlichen G-CSF immer noch fähig wären, eine vorteilhaft kombinierte Wirkung auszuüben. In derartigen Fällen wird in Betracht gezogen, dass man beide Modalitäten innerhalb von etwa 12 –24 Stunden voneinander und stärker bevorzugt innerhalb von 6–12 Stunden voneinander verabreichen würde, wobei eine Verzögerungszeit von nur etwa 12 Stunden am meisten bevorzugt würde. In einigen Situationen kann es jedoch wünschenswert sein, den Zeitraum zur Behandlung signifikant auszudehnen, wobei einige Tage (2, 3, 4, 5, 6 oder 7) bis einige Wochen (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8) zwischen den jeweiligen Verabreichungen verstreichen.
Eine systemische Abgabe von Expressionskonstrukten oder -proteinen, die zum menschlichen G-CSF analog sind, an Patienten kann ein sehr wirksames Verfahren zum Abgeben eines therapeutisch wirksamen Gens sein, um der sofortigen klinischen Manifestation der Krankheit entgegenzuwirken. Alternativ dazu kann die örtliche Abgabe des Analogons des menschlichen G-CSF und/oder des zweiten therapeutischen Mittels unter bestimmten Umständen angemessen sein.
G. Assays zum Bestimmen der Aktivität und Bindung eines G-CSF-Analogons
In bestimmten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann es notwendig sein, die Aktivität eines Analogons des menschlichen G-CSF zu bestimmen. Insbesondere muss die Wirkung der therapeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung auf die Neutropenie vielleicht überwacht werden. Fachleute sind sich zahlreicher Assays zum Bestimmen der G-CSF-Aktivität bewusst, von denen einige im vorliegenden Abschnitt beschrieben werden. Es ist auf keinen Fall beabsichtigt, dass dies eine erschöpfende Liste derartiger Assays sein soll und es wird nur beabsichtigt, dass dies bestimmte beispielhafte Assays bereitstellt, die Fachleuten wohlbekannt sind, die beim Bestimmen der G-CSF-Aktivität der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Weiterhin beschreibt der vorliegende Abschnitt auch Assays zur Bestimmung der G-CSFBindung von G-CSF an dessen Rezeptor. Beispielhafte in-vitro- und in-vivo-Assays zum Bestimmen dieser Aktivitäten werden hierin nachstehend bereitgestellt.
a. In-vitro-Assays
Zellproliferationsassays.
Zellproliferationsassays, von denen einige hierin beschrieben werden, werden verwendet, um die Wirkung eines G-CSF-Analogons auf das Induzieren der Zellproliferation zu bestimmen. Viele Assays sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt und einiger dieser Assays werden wie folgt beschrieben.
Zählen von Zellen.
Zellen werden 24 Std, vor der Initiierung des Zellproliferationsexperimentes in ergänztes MEMα-Medium (ohne G-CSF) passagiert, und zu diesem Zeitpunkt werden parallele Kolben mit Zellen bei einer Dichte von 10⁵ Zellen/ml in MEMα-Medium mit 125 pM Wildtyp-G-CSF oder G-CSF-Analoga inkubiert. Das Zellwachstum in jedem Kolben wird an den Tagen 2, 5 und 8 wie folgt gemessen. Kurz gesagt werden Zellen in einer isotonischen Lösung (ISOTON II, Coulter Diagnostics, Hialeah, FL) verdünnt und in einem Coulter-Zellgerät gezählt (Coulter Electronics, Hialeah, FL).
Einbau von ³H-Thymidin.
Dieser Assay beruht auf dem Einbau von markiertem ³H-Thymidin die neu sythetisierte DNA von Zellen nach der Zellteilung. Einige Forscher verwenden auch das Thymidin-Analogon 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) anstelle von [³H]-Thymidin in Proliferationsassays. Kurz gesagt werden Zellen 24 Std. vor der Initiierung des Zellproliferationsexperimentes in ergänztes MEMα-Medium (ohne G-CSF) passagiert, und zu diesem Zeitpunkt werden parallele Vertiefungen/Kolben mit Zellen bei einer Dichte von 10⁵ Zellen/ml in MEMα-Medium mit 125 pM Wildtyp-G-CSF oder G-CSF-Analoga inkubiert. ³H-Thymidin wird 12 –24 Std. vor dem Zählen (Beenden des Experiments) zu der Zellkultur gegeben und am Ende des Assays wird die Menge radioaktiven Einbaus in die DNA mit einem Flüssig-Szintillationszähler gemessen. Einzelheiten dieses Verfahrens sind einem Fachmann wohlbekannt.
MTT.
MTT wird für die quantitative Bestimmung der Zellproliferation und -aktivierung z.B. als Reaktion auf Wachstumsfaktoren und Cytokine verwendet. Es wird auch für die Quantifizierung antiproliferativer oder cytotoxischer Wirkungen, die z.B. durch den Tumornekrosefaktor α oder β vermittelt werden, und für die Messung der Interferon-Wirkung verwendet. Der Assay beruht auf der Spaltung des gelben Tetrazoliumsalzes MTT zu lila Formazan-Kristallen durch metabolisch aktive Zellen. Diese Salzkristalle sind in wässrigen Lösungen unlöslich, können aber durch Zugeben der Solubilisierungslösung, die im Kit eingeschlossen ist, und Inkubieren der Platten über Nacht in befeuchteter Atmosphäre (z.B. 37 °C, 6,5% CO₂) solubilisiert werden. Das solubilisierte Formazan-Produkt wird unter Verwendung eines ELISA-Lesegerätes spektrophotometrisch quantifiziert. Eine Zunahme der Zahl der lebenden Zellen führt zu einer Zunahme der gesamten metabolischen Aktivität in der Probe. Diese Zunahme korreliert direkt mit der Menge gebildeter lila Formazan-Kristalle, wie durch die Absorption überwacht wird. Ein im Handel erhältlicher MTT-Assay kann von Roche Diagnostics (Indianapolis, IN) gekauft werden.
Ligandenverarmungsassay.
Eine Ligandenverarmung wird für jedes Protein im Zeitverlauf wie hierin beschrieben gemessen. Wie in den vorstehenden Experimenten werden G-CSF-abhängige (OCI/AML1) Zellen 24 Std. vor der Initiierung des Ligandenverarmungsexperimentes in ergänztes MEMα-Medium (ohne G-CSF) passagiert, und zu diesem Zeitpunkt werden parallele Kolben mit Zellen bei einer Dichte von 10⁵ Zellen/ml in MEMα-Medium mit 125 pM Wildtyp-G-CSF oder einem G-CSF-Analogon inkubiert. Nach 24 Std. wird die Zellzahl in jedem Kolben wie vorstehend beschrieben gemessen und ein Aliquot von jedem Medium-Überstand, der nach einer Zentrifugation zum Pelletieren von Zellresten erhalten wird, wird bei –20 °C zum Messen der G-CSF-Konzentration gelagert. Dies wird 8 Tage lang alle 24 Std. wiederholt. Die Konzentrationen von G-CSF in den Proben der Medium-Überstände werden dann unter Verwendung eines enzymverbundenen Immunadsorptionsassay- (ELISA-) Kits quantifiziert, das von R & D Systems (Minneapolis, MN) erhalten wurde.
Internalisierungs- und Recycling-Experimente.
Internalisierungsexperimente werden über einen Zeitraum von 5 Min. durchgeführt, ähnlich wie in publizierter Arbeit [Kuwabara et al., Amer. J. Physiol. Endocrinol. Metabol. 32: E1–E9 (1995)]. Kurz gesagt werden 10⁸ Zellen zweimal mit PBS gewaschen und dann in markiertem Ligand 30 Min. lang auf Eis inkubiert, um Oberflächenkomplexe zu erhalten. Die Zellen werden wieder zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und bei t = 0 bei 37 °C in MEMα resuspendiert. Die Änderung bei Oberflächenkomplexen und internen Komplexen wird über einen Zeitraum von 5 Min. verfolgt; ein Graph von internen Komplexen gegen das Zeitintegral der Oberflächenkomplexe ergibt eine lineare Beziehung, deren Steigung die Geschwindigkeitskonstante der Komplexinternalisierung ist [Wiley et al., J. Biol. Chem. 257: 4222 –4229 (1982)]. Recycling-Experimente werden auf eine mit den Internalisierungsexperimenten identische Weise durchgeführt, außer über einen Zeitraum von 25 Min. Ergebnisse aus Recycling-Experimenten werden Parameter-angepasst, um Recycling-Geschwindigkeitskonstanten zu erhalten.
Bindungsassays.
Molekulare Bindungsassays, von denen manche hierin beschrieben werden, werden verwendet, um das Binden eines G-CSF-Analogons an G-CSFR abzuschätzen. Diese in-vitro- und auf Zellen beruhenden Assays werden wie folgt beschrieben.
BIACORE.
Die Ligandenbindungsaffinität eines G-CSF-Analogons an den G-CSF-Rezeptor wird unter Verwendung eines BIAcore^®2000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) gemessen. Wildtyp-G-CSF, an das Histidin angehängt wurde, wird auf der Chip-Oberfläche immobilisiert und freier Rezeptor (~ 0,25–10 nM) wird über den Chip geleitet, um eine Standard-Gleichgewichtskurve zu erzeugen und um die Wildtyp-Bindungsaffinität unter Verwendung eines 1:1 -Bindungsmodells zu berechnen. Um die Bindungsaffinität jeder Mutante zu bestimmen, wird 2 nM freier Rezeptor mit einer bekannten Konzentration des mutanten Liganden gemischt und über den Chip geleitet. Die Gleichgewichtsbindungsaffinitäten der Mutanten werden unter Verwendung eines 1:1 -Bindungsmodells mit Kompetition bestimmt. Bindungsaffinitätsergebnisse werden unter Verwendung der BIA Auswertungssoftware 3.1 (BIAcore, Inc.) analysiert und Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (K_D) werden bestimmt.
ELISA.
Die Bindung von mutanten G-CSF-Analoga an G-CSFR wird in einem Kompetitionsassay im ELISA-Format gemessen. In diesem Assay wird G-CSFR mit dem nicht neutralisierenden G-CSF-Rezeptor-Antikörper LMM741 (PharMingen, San Diego, CA) gemäß dem Protokoll des Herstellers eingefangen. Analoge Proteine werden dann auf ihre Fähigkeit hin analysiert, mit HRP-markiertem G-CSF um die Rezeptorbindung zu kompetieren.
b. In-vivo-Assays
Bevor die Zusammensetzungen mit Analoga des menschlichen G-CSF der vorliegenden Erfindung in menschlichen therapeutischen Protokollen eingesetzt werden, kann es wünschenswert sein, die Wirkungen derartiger Zusammensetzungen in Tiermodellen zu überwachen. Es gibt etliche Tiermodelle, die in in-vivo-Assays verwendet werden können, die Fachleuten bekannt sind und die bei der vorliegenden Erfindung nützlich sein können.
Um die Wirksamkeit der Protein- und Gentherapie-Zusammensetzungen mit Analoga des menschlichen G-CSF der vorliegenden Erfindung zu bestimmen, können derartigen Tieren die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung intramuskulär und/oder intravenös injiziert werden, und die Fähigkeit, die Proliferation neutrophiler Zellen zu stimulieren, kann in Anwesenheit und Abwesenheit der Zusammensetzungen bestimmt werden. Derartige Bestimmungen sind hilfreich beim Bereitstellen einer Beratung über die Dosierungen und Verabreichungszeiten und die Wirksamkeit einer bestimmten Zusammensetzung gegen Neutropenie. Bei Gentherapieprotokollen kann Immunfluoreszenzfärbung von Schnitten, die aus biopsiertem Muskel erhalten werden, durchgeführt werden, und die Expression des Analogons des menschlichen G-CSF in den transduzierten Muskelfasern kann bestimmt werden.
H. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die wirksame Mengen Polypeptidprodukte der Erfindung zusammen mit pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmitteln, Konservierungsmitteln, Lösungsvermittlern, Emulgatoren, Adjuvantia und/oder Trägern, die in der G-CSF-Therapie nützlich sind, umfassen. Derartige Zusammensetzungen schließen Verdünnungsmittel mit verschiedenem Puffergehalt (z.B. Tris-HCl, Acetat, Phosphat), pH-Wert und Ionenstärke, Zusätze wie zum Beispiel Detergenzien und solubilisierende Mittel (z.B. Tween 80, Polysorbat 80), Anitoxidantien (z.B. Ascorbinsäure, Natriummetabisulfit), Konservierungsmittel (z.B. Thimersol, Benzylalkohol) und Volumenvergrößerungsmittel (z.B. Laktose, Mannitol), Einschluss des Materials in teilchenförmigen Zubereitungen polymerer Verbindungen, wie zum Beipiel Polymilchsäure, Polyglykolsäure usw. oder in Assoziation mit Liposomen, ein. Derartige Zusammensetzungen beeinflussen den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Geschwindigkeit der in-vivo-Freisetzung, und die Geschwindigkeit der in-vivo-Clearance der vorliegenden G-CSF-Analoga. Siehe z.B. Remington's Pharmaceutical Sciences. 18. Ausg. (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA, Seiten 1435 –1712.
Derivate der vorliegenden G-CSF-Analoga sind auch hierin beinhaltet. Derartige Derivate schließen Moleküle ein, die durch ein oder mehrere wasserlösliche Polymermoleküle, wie zum Beispiel Polyethylenglykol, oder durch die Zugabe von Polyaminosäuren, einschließlich Fusionsproteinen (Verfahren dafür sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt) modifiziert werden. Derartige Derivatisierungen können einzeln am N- oder C-Terminus vorkommen oder es kann mehrere Derivatisierungsstellen geben. Eine Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren mit Lysin kann zusätzliche Stellen für eine Derivatisierung bereitstellen. (Siehe US-Patent Nr. 5.824.784 und US Patent Nr. 5.824.778).
Die vorliegenden Analoga oder deren Derivate können zur Injektion oder zur oralen, nasalen, pulmonalen, topischen oder anderen Arten der Verabreichung formuliert werden, wie ein Fachmann erkennen wird. Die Formulierung kann flüssig sein oder zur Rekonstitution fest, wie zum Beispiel lyophilisiert, sein.
Im Allgemeinen sind die vorliegenden Analoga (oder deren Derivate) auf die gleiche Weise nützlich wie derzeit erhältliche G-CSFs nützlich sind, außer dass die vorliegenden Analoga eine verstärkte zelluläre Reaktion bereitstellen (superagonistische oder G-CSF-agonistische Aktivität). Derartige Änderungen in der zellulären Reaktion finden durch Beeinflussung der G-CSF-Rezeptorbindung und/oder der Vorgänge des Sortierens, Recyclings und Abbaus mittels der endozytischen Liganden/Rezeptor-Trafficking-Wege statt.
Diese Verwendungen schließen die Behandlung einer Vielfalt von hämatopoetischen, neurologischen und mit der Fortpflanzung zusammenhängenden Leiden ein. Die vorliegenden Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung von Medikamenten können so für die Behandlung derartiger Leiden nützlich sein. Leiden, die durch die Verabreichung der vorliegenden Analoga gelindert oder moduliert werden, sind typischerweise diejenigen, die durch eine reduzierte hämatopoetische oder Immun-Funktion gekennzeichent sind und, genauer gesagt, durch eine reduzierte Zahl neutrophiler Zellen. Derartige Leiden können als ein Verlauf der Therapie für andere Zwecke induziert werden, wie zum Beispiel Chemotherapie oder Strahlentherapie. Derartige Leiden können sich aus Infektionskrankheiten, wie zum Beispiel bakteriellen, viralen, Pilz- oder anderen Infektionskrankheiten ergeben. Zum Beispiel ergibt sich Sepsis aus bakterieller Infektion. Oder derartige Leiden können erblich oder durch die Umwelt verursacht sein, wie zum Beispiel schwerwiegende Neutropenie oder Leukämien. Das Alter kann auch eine Rolle spielen, wie in der geriatrischen Situation; Patienten können eine reduzierte Zahl neutrophiler Zellen oder eine reduzierte Mobilisierung neutrophiler Zellen aufweisen. Einige derartige Leiden werden in Filgrastim (r-metHuG-CSF) In: Clinical Practice, Morstyn und Dexter (Hrsg.), Marcel Dekker, Inc., New York (1993), S. 351, rezensiert. Andere, weniger untersuchte Leiden, die durch die Verabreichung der vorliegenden Analoga gelindert oder moduliert werden können, können die Reduktion von Lipiden (oder Cholesterin) im Blutkreislauf und bestimmte kardiovaskuläre Leiden einschließen, da G-CSF die Produktion von Plasminogenaktivatoren induzieren kann. Zusätzlich können die vorliegenden G-CSF-Analoga zur Mobilisierung peripherer Blutvorläuferzellen verwendet werden.
Die vorliegenden G-CSF-Analoga (oder Derivat-Zusammensetzungen) können auch in vitro verwendet werden. Zum Beispiel kann man in einer Gentherapiesituation wünschen, eine hämatopoetische Zelle mit exogener DNA zu transfizieren und diese Zelle unter Verwendung der vorliegenden Formulierungen mit G-CSF-Analoga zu kultivieren. Daher bezieht die Erfindung, in noch einer anderen Ausführungsform, ein Verfahren zum Kultivieren hämatopoetischer Zellen in vitro ein, umfassend: a) Platzieren der Zellen in ein geeignetes Kulturmedium, wobei das geeignete Kulturmedium eine Zusammensetzung mit einem G-CSF-Analogon gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, und b) Bereitstellen geeigneter Bedingungen für das Wachstum der hämatopoetischen Zellen.
Vor allem stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Transfizieren hämatopoetischer Zellen mit exogener DNA bereit, umfassend: a) das Kultivieren der hämatopoetischen Zellen mit einer Zusammensetzung mit einem G-CSF-Analogon gemäß der vorliegenden Erfindung und b) das Transfizieren der kultivierten Zellen mit exogener DNA. Bei den hämatopoetischen Zellen kann es sich zum Beispiel um Knochenmarkzellen oder periphere Blutvorläuferzellen handeln. Zusätzlich können andere, einem Fachmann wohlbekannte Zellen verwendet werden.
Um Zusammensetzungen, die ein Analogon des menschlichen G-CSF enthalten, zur klinischen Verwendung herzustellen, ist es notwendig, die viralen Expressionsvektoren, Proteine und Nukleinsäuren als pharmazeutische Zusammensetzungen herzustellen, d. h. in einer für in-vivo-Anwendungen geeigneten Form. Im Allgemeinen wird dies das Herstellen von Zusammensetzungen erforderlich machen, die im Wesentlichen frei von Pyrogenen sowie anderen Verunreinigungen, die für Menschen oder Tiere schädlich sein könnten, sind.
Man wird im Allgemeinen wünschen, geeignete Salze und Puffer einzusetzen, um die Abgabevektoren stabil zu machen und die Aufnahme durch Zielzellen zu ermöglichen. Puffer werden auch eingesetzt, wenn rekombinanten Zellen in einen Patienten eingeführt werden. Wässrige Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen eine wirksame Menge des Analogons des menschlichen G-CSF oder eines Expressionsvektors für Zellen, in einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder wässrigen Medium gelöst oder dispergiert. Derartige Zusammensetzungen werden auch als Inokula bezeichnet. Der Begriff "pharmazeutisch oder pharmakologisch verträglich" bezeichnet molekulare Einheiten und Zusammensetzungen, die keine nachteiligen, allergischen oder anderen unpassenden Reaktionen produzieren, wenn sie an ein Tier oder einen Menschen verabreicht werden. Wie hierin verwendet schließt "pharmazeutisch verträglicher Träger" jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Überzüge, antibakterielle und antifungale Mittel, isotonische und die Absorption verzögernde Mittel und dergleichen ein. Die Verwendung derartiger Medien und Mittel für pharmazeutische Wirkstoffe ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Außer insofern, als ein herkömmliches Medium oder Mittel mit den Vektoren oder Zellen der vorliegenden Erfindung inkompatibel ist, wird dessen Verwendung in therapeutischen Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Ergänzende Wirkstoffe können auch in die Zusammensetzungen eingegliedert werden.
Die wirksamen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen klassische pharmazeutische Zubereitungen ein. Eine Verabreichung dieser Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung wird auf jedem herkömmlichen Weg stattfinden, sofern das Zielgewebe auf diesem Weg zugänglich ist. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können durch jedes herkömmliche Verfahren in den Patienten eingeführt werden, d. h. durch intravenöse, intradermale, intramuskuläre, intramammäre, intraperitoneale, intrathekale, retrobulbäre, intrapulmonale (z.B. termingerechte Freisetzung), durch orale, sublinguale, nasale, anale, vaginale oder transdermale Abgabe oder durch chirurgische Einpflanzung an einer bestimmten Stelle. Die Behandlung kann aus einer einzelnen Dosis oder einer Vielzahl von Dosen über einen Zeitraum bestehen.
Die wirksamen Verbindungen können zur Verabreichung als Lösungen der freien Base oder pharmakologisch verträgliche Salze in Wasser, die auf geeignete Weise mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie zum Beispiel Hydroxypropylcellulose, gemischt werden, hergestellt werden. Auch können Dispersionen in Glycerin, flüssigen Polyethylenglykolen und Gemischen davon und in Ölen hergestellt werden. Unter gewöhnlichen Lagerungs- und Verwendungsbedingungen enthalten diese Zubereitungen ein Konservierungsmittel, um das Wachstum von Mikroorganismen zu verhindern.
Die zur injizierbaren Verwendung geeigneten pharmazeutischen Formen schließen sterile wässrige Lösungen oder Dispersionen und sterile Pulver zur jederzeit möglichen Herstellung steriler injizierbarer Lösungen oder Dispersionen ein. Auf jeden Fall muss die Form steril sein und muss in dem Ausmaß flüssig sein, dass eine leichte Spritzbarkeit existiert. Sie muss unter den Herstellungs- und Lagerungsbedingungen stabil sein und muss gegen die kontaminierende Wirkung von Mikororganismen, wie zum Beispiel Bakterien und Pilzen, konserviert werden. Der Träger kann ein Lösungsmittel oder ein Dispersionsmedium sein, das zum Beispiel Wasser, Ethanol, Polyol (zum Beispiel Glycerin, Propylenglykol und flüssiges Polyethylenglykol und dergleichen), geeignete Gemische davon und Pflanzenöle enthält. Die richtige Fluidität kann zum Beispiel durch die Verwendung eines Überzugs, wie zum Beispiel Lecithin, aufrecht erhalten werden, durch die Aufrechterhaltung der erforderlichen Teilchengröße im Falle von Dispersion und durch die Verwendung von oberflächenaktiven Mitteln. Die Verhinderung der Wirkung von Mikroorganismen kann durch verschiedene antibakterielle und antifungale Mittel herbeigeführt werden, zum Beispiel Parabens, Chlorbutanol, Phenol, Sorbinsäure, Thimerosal und dergleichen. In vielen Fällen ist es vorzuziehen, isotonische Mittel einzuschließen (zum Beispiel Zucker oder Natriumchlorid). Eine verlängerte Absorption der injizierbaren Zusammensetzungen kann durch die Verwendung von Mitteln in den Zusammensetzungen herbeigeführt werden, welche die Absorption verzögern (zum Beispiel Aluminiummonostearat und Gelatine).
Sterile injizierbare Lösungen werden durch Einbringen der wirksamen Verbindungen in der erforderlichen Menge im geeigneten Lösungsmittel mit verschiedenen anderen, vorstehend aufgeführten Bestandteilen nach Bedarf hergestellt, gefolgt von Sterilfiltration. Im Allgemeinen werden Dispersionen durch Einbringen der verschiedenen sterilisierten wirksamen Bestandteile in ein steriles Vehikel hergestellt, der das Grund-Dispersionsmedium und die erforderlichen anderen Bestandteile aus den vorstehend aufgeführten enthält. Im Falle von sterilen Pulvern zur Herstellung steriler injizierbarer Lösungen sind die bevorzugten Herstellungsverfahren Vakuumtrocknungs- und Gefriertrocknungstechniken, die ein Pulver des wirksamen Bestandteils plus jedes zusätzlichen erwünschten Bestandteils aus einer vorher sterilfiltrierten Lösung davon ergeben.
Wie hierin verwendet schließt "pharmazeutisch verträglicher Träger" jedes und alle Lösungsmittel, Dispersionsmedien, Überzüge, antibakterielle und antifungale Mittel, isotonische und die Absorption verzögernde Mittel und dergleichen ein. Die Verwendung derartiger Medien und Mittel für pharmazeutisch wirksame Substanzen ist auf dem Fachgebiet wohlbekannt. Außer insofern, als herkömmliche Medien oder ein Mittel mit dem wirksamen Bestandteil inkompatibel ist, wird dessen Verwendung in den therapeutischen Zusammensetzungen in Betracht gezogen. Ergänzende wirksame Bestandteile können auch in die Zusammensetzungen eingebracht werden.
Zur oralen Verabreichung können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung mit Exzipienten eingebracht werden und in Form von nicht einnehmbaren Mundspülungen und Zahnpasten verwendet werden. Eine Mundspülung kann hergestellt werden, die den wirksamen Bestandteil in der erforderlichen Menge in einem geeigneten Lösungsmittel, wie zum Beispiel einer Natriumboratlösung (Dobell's Solution) enthält. Alternativ dazu kann der wirksame Bestandteil in eine antiseptische Spülung eingebracht werden, die Natriumborat, Glycerin und Kaliumbicarbonat enthält. Der wirksame Bestandteil kann auch in Zahnpasten dispergiert werden, einschließlich Gelen, Pasten, Pulver und Aufschwemmungen. Der wirksame Bestandteil kann in einer therapeutisch wirksamen Menge zu einer Zahnpaste gegeben werden, die Wasser, Bindemittel, Schleifmittel, Geschmacksmittel, Schäummittel und Feuchthaltemittel einschließen kann.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in einer neutralen Form oder als Salz formuliert werden. Pharmazeutisch verträgliche Salze schließen die Säureadditionssalze (gebildet mit den freien Aminogruppen des Proteins) und die mit anorganischen Säuren, wie zum Beispiel Salz- oder Phosphorsäure, oder organischen Säuren, wie zum Beispiel Essig-, Oxal-, Wein-, Mandelsäure und dergleichen, gebildeten ein. Salze, die mit den freien Carboxylgruppen gebildet werden, können auch von anorganischen Basen wie zum Beispiel Natrium-, Kalium-,Ammonium-, Kalzium- oder Eisen(III)-hydroxiden und solchen organischen Basen wie Isopropylamin, Trimethylamin, Histidin, Procain und dergleichen abgeleitet werden.
Nach der Formulierung werden die Lösungen auf eine Weise verabreicht, die mit der Dosierungsformulierung kompatibel ist, und in einer derartigen Menge, wie sie therapeutisch wirksam ist. Die Formulierungen werden leicht in einer Vielfalt von Dosierungsformen wie zum Beispiel als injizierbare Lösungen, Arzneistoff freisetzende Kapseln und dergleichen verabreicht. Zur parenteralen Verabreichung in einer wässrigen Lösung sollte die Lösung zum Beispiel auf geeignete Weise gepuffert sein, falls nötig, und das flüssige Verdünnungsmittel zuerst mit ausreichend Kochsalzlösung oder Glukose isotonisch gemacht werden. Diese besonderen wässrigen Lösungen sind speziell zur intravenösen, intramuskulären, subkutanen und intraperitonealen Verabreichung geeignet.
Im Allgemeinen wird eine wirksame Menge der vorliegenden G-CSF-Analoga (oder ihrer Derivate) durch das Alter, Gewicht, und das Leiden oder den Schweregrad der Krankheit des Empfängers bestimmt. Siehe Remington's Pharmaceutical Sciences, vorstehend, Seiten 697–773, hierin durch Bezugnahme aufgenommen. Typischerweise kann eine Dosierung zwischen etwa 0,001 μg/kg Körpergewicht/Tag und etwa 1000 μg/kg Körpergewicht/Tag verwendet werden, aber, wie ein Fachmann erkennen wird, kann mehr oder weniger verwendet werden. Das Dosieren kann einmal oder mehrmals täglich stattfinden, oder weniger häufig, und kann in Verbindung mit anderen Zusammen setzungen wie hierin beschrieben stattfinden. Es sollte angemerkt werden, dass die vorliegende Erfindung nicht auf die hierin zitierten Dosierungen beschränkt ist.
Eine "Einheitsdosis" wird als diskrete Menge einer therapeutischen Zusammensetzung definiert, die in einem geeigneten Träger dispergiert ist. Zum Beispiel werden die Polypeptidzusammensetzungen, wo Polypeptide parenteral verabreicht werden, im Allgemeinen in Dosen injiziert, die von 1 μg/kg bis 100 mg/kg Körpergewicht/Tag reichen, vorzugsweise in Dosen, die von 0,1 mg/kg bis etwa 50 mg/kg Körpergewicht/Tag reichen. Eine parenterale Verabreichung kann mit einem anfänglichen Bolus ausgeführt werden, gefolgt von kontinuierlicher Infusion, um therapeutische Kreislaufniveaus des Arzneistoffprodukts aufrechtzuerhalten. Fachleute werden die wirksamen Dosierungen und Verabreichungsregimes leicht optimieren, wie sie durch gute medizinische Praxis und den klinischen Zustand des einzelnen Patienten bestimmt werden.
Die Dosierungshäufigkeit hängt von den pharmakokinetischen Parametern der Mittel und den Verabreichungswegen ab. Die optimalen pharmazeutischen Formulierungen werden von einem Fachmann, abhängig vom Verabreichungsweg und der erwünschten Dosierung, bestimmt. Siehe zum Beispiel Remington's Pharmaceutical Sciences, vorstehend, Seiten 1435–1712. Derartige Formulierungen können den physikalischen Zustand, die Stabilität, die Geschwindigkeit der in-vivo-Freisetzung und die Geschwindigkeit der in-vivo-Clearance der verabreichten Mittel beeinflussen. Abhängig vom Verabreichungsweg kann eine geeignete Dosis gemäß dem Körpergewicht, der Körperoberflächen oder der Organgröße berechnet werden. Eine weitere Verfeinerung der Berechnungen, die nötig ist, um die geeignete Behandlungsdosis zu bestimmen, wird von Fachleuten routinemäßig ohne übermäßiges Experimentieren durchgeführt, speziell angesichts der Dosierungsinformation und der Assays, die hierin offenbart werden, sowie der pharmakokinetischen Ergebnisse, die bei Tieren oder menschlichen Klinikversuchen beobachtet wurden.
Geeignete Dosierungen können durch die Verwendung etablierter Assays zum Bestimmen des Grades der Neutropenie in Verbindung mit relevanten Dosis-Wirkungs-Ergebnissen nachgeprüft werden. Das endgültige Dosierungsregime wird durch den behandelnden Arzt unter Berücksichtigung von Faktoren, welche die Wirkung von Arzneistoffen modifizieren, z.B. der spezifischen Aktivität des Arzneistoffes, des Schweregrades der Schädigung und der Ansprechbarkeit des Patienten, des Alters, des Zustands, des Körpergewichts, des Geschlechts und der Ernährung des Patienten, des Schweregrades einer Infektion, der Verabreichungszeit und anderer klinischer Faktoren bestimmt. Während Untersuchungen durchgeführt werden, wird weitere Information bezüglich geeigneter Dosierungsniveaus und einer geeigneten Behandlungsdauer für spezifische Krankheiten und Leiden hervorkommen.
Bei Gentherapieausführungsformen, die virale Abgabe einsetzen, kann die Einheitsdosis bezüglich der Dosis von Virusteilchen, die verabreicht werden, berechnet werden. Virusdosen schließen eine bestimmte Zahl von Virusteilchen oder Plaque-bildenden Einheiten (pfu) ein. Für Ausführungsformen, die Adenovirus einbeziehen, schließen bestimmte Einheitsdosen 10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶, 10⁷, 10⁸, 10⁹, 10¹⁰, 10¹¹, 10¹², 10¹³ oder 10¹⁴ pfu ein. Die Teilchendosen können wegen der Anwesenheit von infektionsunfähigen Teilchen etwas höher liegen (10- bis 100-fach).
Es ist selbstverständlich, dass die pharmazeutischen Zusammensetzungen und Behandlungsverfahren der Erfindung in den Gebieten der Humanmedizin und Tiermedizin nützlich sein können. So kann der zu behandelnde Patient ein Säugetier sein, vorzugsweise ein Mensch oder ein anderes Tier. Für tiermedizinische Zwecke schließen die Patienten zum Beispiel Nutztiere, einschließlich Kühen, Schafen, Schweinen, Pferden und Ziegen, Haustiere, wie zum Beispiel Hunde und Katzen, exotische und/oder Zootiere, Labortiere, einschließlich Mäusen, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen und Hamstern, und Geflügel, wie zum Beispiel Hühner, Truthähne, Enten und Gänse, ein.
Zusätzlich zieht die vorliegende Erfindung ein Kit in Betracht, das Komponenten zum Kultivieren von Knochenmarkzellen oder peripheren Blutvorläuferzellen enthält, umfassend: a) eine Zusammensetzung mit einem G-CSF-Analogon der vorliegenden Erfindung; und b) Komponenten, die zum Herstellen von Medium zum Kultivieren von Knochenmarkzellen oder peripheren Blutvorläuferzellen geeignet sind.
I. Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden, nichtbeschränkenden Beispiele genauer beschrieben, die angeboten werden, um die Erfindung vollständiger zu veranschaulichen, aber nicht so ausgelegt werden sollen, dass sie deren Umfang beschränken. Die Beispiele veranschaulichen die Herstellung der vorliegenden G-CSF-Analoga und das Testen dieser Analoga in vitro. Fachleuten wird selbstverständlich sein, dass die in diesen Beispielen beschriebenen Techniken Techniken repräsentieren, die von den Erfindern als in der Durchführung der Erfindung gut funktionierend beschrieben werden und als solche bevorzugte Weisen für deren Durchführung ausmachen. Es sollte jedoch ersichtlich sein, dass Fachleute angesichts der vorliegenden Offenbarung anerkennen, dass viele Änderungen in den bestimmten Verfahren gemacht werden können, die offenbart werden, und immer noch ein gleiches oder ähnliches Ergebnis erhalten werden kann, ohne vom Wesen und Umfang der Erfindung abzuweichen.
BEISPIEL 1
Grundprinzip des Designs für Histidinmutanten
G-CSF-Mutanten wurden auf dem Prinzip beruhend, dass eine Histidin-Titrierung eine relativ enge Bindung auf der Zelloberfläche aufrechterhalten aber zu schwächerer Bindung in endosomalen Kompartimenten führen könnte, gestaltet. Unter Ausnutzung der pH-Senkung von ungefähr 7 auf der Zelloberfläche auf zwischen 5 und 6 in Endosomen wurden die Mutanten so gestaltet, dass sie die elektrostatischen Wechselwirkungen bei extrazellulärem pH-Wert größtenteils aufrechterhalten (oder verbessern), aber die Wechselwirkung bei endosomalem pH-Wert verschlechtern. Der pK_a-Wert von Histidin auf der Oberfläche von freiem Liganden (~ 6,5) [Tanokura, Biochim. Biophys. Acta. 742: 576–585 (1982)] legt, in Anbetracht der geeigneten lokalen Proteinumgebung, nahe, dass die Histidin-Titrierung zu großen pH-abhängigen Wirkungen auf die Bindung zwischen extrazellulären und endosomalen Medien führen könnte. Berechnungen wurden verwendet, um Kandidaten für Stellen für eine Histidinsubstitution zu identifizieren. Bevorzugte Stellen waren solche, bei denen die berechnete Bindungsaffinität bei neutralem Histidin mit Wildtyp vergleichbar und bei positiv geladenem Histidin signifikant schwächer war.
BEISPIEL 2
Herstellung und Charakterisierung von G-CSF-Analoga
G-CSF-Analoga wurden entweder durch Insertions- oder ortsspezifische Mutagenese von DNA, die r-met-HuG-CSF kodiert, unter Verwendung des Verfahrens der Overlap-Extension PCR [Aiyar et al., Meth. Mol. Biol. 57: 177 –191 (1996)] hergestellt. Nach dem Bestätigen der Mutationen durch Sequenzanalyse wurde jede Mutante in E. coli K12 exprimiert, erneut gefaltet und wie in [Lu et al., J. Biol. Chem. 267: 8770 –8777 (1992)] beschrieben gereinigt. Für Protokolle und Verfahren [siehe auch "Recombinant PCR", Russell Higuchi, In: PCR Protocols, Innis, Gelfand, Sninsky und White (Hrsg.), Academic Press, Inc. San Diego, CA (1990); und "Site-directed mutagenesis of cloned DNA", In: Molecular Cloning: A Lab Manual, Sambrook, Fritsch und Maniatis (Hrsg.), Cold Spring Harbor Press, CSH, N. Y. (1989)]. Über die E. coli Expression von r-met-HuG-CSF ist zuvor berichtet worden. Siehe US Patent Nr. 4.810.643 und US Patent Nr. 5.849.883. Die DNA, die rekombinantes menschliches G-CSF kodiert, hatte am Anfang ein Methioninkodon, gefolgt von Kodons für die 174-Aminosäure-Spezies des menschlichen G-CSF. Die gereinigten r-met-HuG-CSF-Analoga behalten das initiierende Methioninkodon bei (Position Met –1).
Die Aminosäuresequenz und Nukleinsäuresequenz für [His¹⁰⁹]G-CSF werden in SEQ ID NO: 3 (DNA) und 4 (Aminosäure) gezeigt. Die Aminosäuresequenz und Nukleinsäuresequenz für [His¹¹²]G-CSF werden in SEQ ID NO: 5 (DNA) und 6 (Aminosäure) gezeigt. Die Aminosäuresequenz und Nukleinsäuresequenz für [His¹¹⁹]G-CSF werden in SEQ ID NO: 7 (DNA) und 8 (Aminosäure) gezeigt.
Eine Bestätigung der Identität der G-CSF-Analoga der vorliegenden Erfindung wurde durch N-terminale Aminosäuresequenzierung der intakten Proteine erreicht. Die Sequenzen der gereinigten G-CSF-Analoga passten zu den Sequenzen, die aus den jeweiligen DNA-Sequenzen, wie zum Beispiel den in SEQ ID NO: 3, 5 und 7 gezeigten, vorhergesagt wurde. Derartige Verfahren sind auf dem Fachgebiet wohlbekannt [Shively, EXS 88: 99–117 (2000)].
Strukturherstellung von Histidinmutanten
Die Röntgenkristallstruktur von G-CSF im 2:2 -Komplex mit der ligandenbindenden Domäne von G-CSFR wurde von Aritomi et al. [Nature, 401: 713 –717 (1999)] unter Verwendung von Ergebnissen bis 2,8 Å aus Kristallen, die bei pH 7,5 gewachsen waren und aufrechterhalten wurden, gelöst [Aritomi et al., Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 56: 751 –753 (2000)]. Die Struktur (Eingang 1 CD9) wurde aus der Proteindatenbank (www.rcsb.org/pdb/) [Berman et al., Nucl. Acids Res. 28; 235 –242 (2000)] erhalten. Die hierin beschriebenen Berechnungen konzentrieren sich auf die Berührungsfläche, die durch die Segmente A und B gebildet wird, bei der es sich um die Hauptbindungs-Berührungsfläche handelt, die ein G-CSF-Molekül (A) und eine CRH-Domäne von G-CSFR (B) einbezieht. Die Koordinaten für diese Ketten wurden aus dem Koordinaten-File extrahiert und die Positionen polarer und aromatischer Wasserstoffatome wurden unter Verwendung von CHARMM konstruiert [Brooks et al., J. Comput. Chem. 4: 187–217 (1983); Brunger und Karplus, Proteins 4: 148 –156 (1988)]. Zusätzlich wurde eine kleine Zahl fehlender Positionen schwerer Atome, alte weit von der Berührungsfläche entfernt, in Standardgeometrie unter Verwendung von CHARMM konstruiert. Eine Untersuchung der titrierbaren Seitenketten an der Berührungsfläche im Wildtypkomplex, von denen es sich bei keiner um Histidin handelte, legte nahe, alle in ihren neutralen Standard-pH-Titrierzuständen zu lassen.
In-silico-Mutagenese von G-CSF für Histidinmutanten
Die potenziellen Stelle für Histidinmutationen wurden durch ein in-silico-Verfahren identifiziert. Die Konformationen aller Liganden- und Rezeptorseitenketten an der Bindungs-Berührungsfläche innerhalb von 10 Å von der Mutation, einschließlich der Mutation selbst, wurden unter Verwendung einer Standard-Rotamerbibliothek auf ein rigides Gerüst umgepackt [Dunbrack und Karplus, J. Mol. Biol. 230; 543 –574 (1993)]. Die Energiefunktion gliederte van der Waals-Wechselwirkungen und elektrostatische Wechselwirkungen mit einer entfernungsabhängigen Dielektrizitätskonstante (ε = 4r, wobei r in Å ist) und ohne Cutoff ein, wie in CHARMM19 implementiert ist [Brooks et al. J. Comput. Chem. 4: 187–217 (1983); Gilson und Honig, Nature 330: 84 –86 (1987)], das ausgeweitet wurde, um PARSE partielle atomare Ladungen einzuschließen [Sitkoff et al., J. Phys. Chem. 98; 1978–1988 (1994)]. Energieminimierte Komplexe wurden unter Verwendung der Dead-end-Elimination (und A*) gefunden [Desmet et al., Nature 356; 539–542 (1992); Goldstein, Biophys. J. 66: 1335 –1340 (1994)]. Wenn dieses Verfahren auf den Wildtypkomplex angewendete wurde, rekonstruierte es die Kristallstruktur auf korrekte Weise bis zur Auflösung der Rotamerbibliothek.
Elektrostatische Berechnungen für Histidinmutanten
Die Auswahl von Resten in G-CSF für Mutationen zu Histidin wurde durch elektrostatische Erwägungen bestimmt. Die Berechnungsdetails waren ähnlich zu publizierter Arbeit [Hendsch und Tidor, Protein Sci. 8; 1381 –1392 (1999)]. Berechnungen des elektrostatischen Kontinuums wurden durch Lösen der linearisierten Poisson-Boltzmann-Gleichung mit Differenzenverfahren unter Verwendung einer lokal modifizierten Version des Computerprogramms DELPHI ausgeführt [Gislon und Honig, Nature, 330, 84–86 (1987); Gilson et al., J. Comput. Chem. 9: 327 –335 (1988); Sharp und Honig, Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 19: 301 –332 (1990). Die PARSE-Parameter wurden für Atomradien und partielle atomare Ladungen verwendet (Sitkoff et al., J. Phys. Chem. 98; 1978–1988 (1994)]. Für die Protein-Dielektrizitätskonstante wurde ein Wert von 4 verwendet und für das Lösungsmittel ein Wert von 80. Die molekulare Oberfläche wurde unter Verwendung einer kugelförmigen Sonde von 1,4 Å beschrieben und die Gesamtionenstärke wurde als 145 mM gewählt, mit einer Stern-Schicht von 2 Å. Berechnungen wurden unter Verwendung eines Zwei-Schritt-Fokussierungsverfahrens mit 23% und 92% Füllung durchgeführt. Zur Sichtbarmachung des elektrostatischen Potenzials wurde ein würfelförmiges Gitter von 65 × 65 × 65 Rastereinheiten verwendet. Für Berechnungen der elektrostatischen freien Bindungsenergie wurde ein Raster von 191 × 191 × 191 verwendet (endgültiges Rastermaß 0,476 Å) und jeder angegebene Wert war der Mittelwert von 10 Verschiebungen des Moleküls relativ zum Raster. Eine elektrostatische Komplementarität legte sechs Kandidaten-Mutationsstellen nahe. Die Vorherrschaft übermäßig negativer Bereiche zeigt eine überhöhte negative Ladungsdichte an und schließt Stellen ein, die den geladenen Resten Glu¹⁹, Asp¹⁰⁹ und Asp¹¹², sowie den polaren Resten Gln²⁰, Thr¹¹⁶ und Gln¹¹⁹ entsprechen.
Strukturerzeugung der Histidinmutanten
Mutante Komplexe, in denen jeder der sechs Ligandenreste (Glu¹⁹, Gln²⁰, Asp¹⁰⁹, Asp¹¹², Thr¹¹⁶ und Gln¹¹⁹) einzeln zu Histidin mutiert wurde, wurden durch Berechnung erzeugt. Jede Position wurde mit zwei neutralen Histidin-Tautomeren (die entweder am δ- oder ε-Stickstoff protoniert waren, was als His_δ ⁰ beziehungsweise His_ε ⁰ angezeigt wird) und positiv geladenem Histidin (His⁺) substituiert. Ein eingeschränktes Minimierungsverfahren wurde benutzt, bei dem den Mutantenseitenketten und denen der benachbarten Reste vollständige Freiheit gegeben wurde, sich unter Verwendung von Algorithmen, die auf Dead-end-Elimination und A* beruhen, umzupacken [Desmet et al., Nature 356; 539–542 (1992); Goldstein, Biophys. J. 66: 1335 –1340 (1994); Leach und Lemon, Proteins 33: 227 –239 (1998)]. Die Komplementarität der mutanten Komplexe wurde sichtbar gemacht und mit Wildtyp verglichen.
Auswahl von Kandidaten für Histidinmutanten
Kandidaten wurden für experimentelle Tests auf dem Prinzip beruhend ausgewählt, dass Mutanten den Rezeptor etwa so gut wie (oder vielleicht sogar besser als) Wildtyp für das besser bindende His⁰-Tautomer (den Zelloberflächen-Bedingungen entsprechend) und signifikant schlechter als Wildtyp für His⁺ (den endosomalen Bedingungen entsprechend) binden sollten. Sobald der Unterschied zwischen der Bindung von His⁰ und His⁺ mehr als ein paar kcal/mol betrug, gab es keinen Vorteil darin, ihn größer zu machen, denn er wäre größer als die Kosten, His⁺ im ungebundenen Zustand zu deprotonieren und als His⁰ zu binden. So wurden Asp¹⁰⁹His und Asp¹¹²His hergestellt und zur experimentellen Charakterisierung gereinigt. Zusätzlich wurde auch Gln¹¹⁹His hergestellt und gereinigt, weil vorhergesagt wurde, dass es auf der Zelloberfläche besser als Wildtyp binden würde, obwohl es aus den Berechnungen nicht klar war, ob die Bindung in Endosomen signifikant schwächer sein würde.
Werte der elektrostatischen freien Bindungsenergie für Wildtyp und Histidinmutanten
Der elektrostatische Beitrag zur freien Bindungsenergie für Wildtyp und jede der His_δ ⁰-, His_ε ⁰ und His⁺- Mutanten wurde unter Verwendung eines einfachen rigiden Bindungsmodells und von Kontinuum-Elektrostatik berechnet. Obwohl es nicht alle Einzelheiten der Bindung explizit behandelt, ist dieses Modell unkompliziert anzuwenden und sollte fähig sein, mäßige bis große Bindungsunterschiede zwischen den Komplexen zu unterscheiden. Die Ergebnisse zeigen wenige unterschiedliche Verhaltensweisen. Die meisten Mutanten zeigen eine Bindung von His⁰ (mindestens einem der Histidin-Tautomere), die fast, aber nicht ganz so gut ist wie Wildtyp (bis zu 2,5 kcal/mol schlechter). Zwei Ausnahmen sind Glu¹⁹His⁰, das im Komplex nicht toleriert wird (berechnet als etwa 10 kcal/mol schlechter bindend als Wildtyp) und Glu¹¹⁹His⁰, das als etwas besser als Wildtyp bindend berechnet wird (mit 1,7 kcal/ml für das His_δ ⁰-Tautomer). Interessanterweise scheint Glu¹⁹ für die Rezeptorbindung essentiell zu sein [Reidhaar-Olson et al., Biochemistry 35: 9034–9041 (1996); Layton et al., J. Biol. Chem. 274: 17445 –17451 (1999)]. In einem Zellproliferationsassay bringt Glu¹⁹Ala im Wesentlichen keine Reaktion hervor (Ergebnisse nicht gezeigt), was mit dieser Berechnung konsistent ist. Für drei der Mutanten [Glu¹⁹His ([¹⁹His]G-CSF), Asp¹⁰⁹His ([¹⁰⁹His]G-CSF) und Asp¹¹²His ([His¹¹²]G-CSF) wird vorhergesagt, dass sich die pH-Abhängigkeit der Bindung in die gewünschte Richtung ändert, weil His⁺ eine berechnete freie Bindungsenergie hat, die etwa 5 oder mehr kcal/mol schlechter als His⁰ (und mehr als 7 kcal/mol schlechter als Wildtyp) ist. Für die anderen drei Mutanten, [Gln²¹His ([His²¹]G-CSF), Thr¹¹⁷His ([His¹¹⁷]G-CSF), und Gln¹¹⁹His ([His¹¹⁹]G-CSF)], ist der Unterschied in der Bindung zwischen His⁰ und His⁺ zu gering, um bezüglich der Vorhersagen sicher zu sein (weniger als 1 kcal/mol).
BEISPIEL 3
Experimentelles Material und Zellkultur
Minimales essentielles Medium alpha (MEMα), L-Glutamin, Penicillin-Streptomycin und fötales Rinderserum (FBS) wurde von Life Technologies, Inc. (Rockville, MD) erhalten. Die isotonische Lösung für das Coulter Zählgerät (ISOTON II, Coulter Diagnostics, Hialeah, FL) wurde von Curtin Matheson Scientific Inc. (Houston, TX) erhalten.
Die G-CSF-abhängige Suspensionszelllinie OCI/AML1, ein großzügiges Geschenk von Ernest A. McCulloch [Ontario Cancer Institute (OCI), Princess Margaret Hospital, 610 University Avenue, Toronto, Ontario, M5G 2M9, Canada], wurde für alle Experimente verwendet. Zellen wurden routinemäßig in 75 cm² großen Corning-Gewebekulturkolben in MEMα, ergänzt mit 20% FBS, 200 mM L-Glutamin, 100 Einheiten/ml Penicillin, 100 g/ml Streptomycin und 270 pM G-CSF, in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO₂ kultiviert. Die Zellen wurden alle 3 oder 4 Tage auf 10⁵ Zellen/ml passagiert.
BEISPIEL 4
Experimentelle Ergebnisse mit Histidinmutanten
Zellproliferationsassay
Alle drei Histidinmutanten-[His¹⁰⁹]G-CSF, [His¹¹²]G-CSF und [His¹¹⁹]G-CSF – wurden in einem G-CSF-abhängigen Zellproliferationsassay mit Wildtyp-G-CSF verglichen. OCI/AML1-Zellen wurden 24 Std. vor der Initiierung des Zellproliferationsexperimentes in ergänztes MEMα-Medium (ohne G-CSF) passagiert, und zu diesem Zeitpunkt wurden parallele Kolben mit Zellen bei einer Dichte von 10⁵ Zellen/ml in MEMα-Medium mit 125 pM Wildtyp-G-CSF, [His¹⁰⁹]G-CSF, [His¹¹²]G-CSF oder [His¹¹⁹]G-CSF inkubiert. Das Zellwachstum in jedem Kolben wurde an den Tagen 2, 5 und 8 unter Verwendung eines Coulter-Zellgerätes gemessen. Nach zwei Tagen konnten keine Unterschiede in der Zellproliferation nachgewiesen werden. Nach fünf Tagen jedoch erhöhte [His¹¹⁹]G-CSF die Zellproliferation signifikant. Bis zum Tag acht war die Zahl der mit [His¹¹⁹]G-CSF behandelten Zellen fast das doppelte der Zahl der Kontrolle und Zellen, die mit [His¹⁰⁹]G-CSF und [His¹¹²]G-CSF behandelt wurden, zeigten kleinere, aber signifikante Erhöhungen über die Kontrolle hinaus. Deshalb waren alle Mutanten stärker als Wildtyp beim Fördern der Zellproliferation, trotz der Tatsache, dass alle mutierten Reste direkt an der Berührungsfläche mit dem Rezeptor liegen.
Ligandenverarmung
Eine Ligandenverarmung wurde für jedes Protein im Zeitverlauf gemessen. Wie in den vorstehenden Experimenten wurden OCI/AML1-Zellen 24 Std. vor der Initiierung des Ligandenverarmungsexperimentes in ergänztes MEMα-Medium (ohne G-CSF) passagiert und zu diesem Zeitpunkt wurden parallele Kolben mit Zellen bei einer Dichte von 10⁵ Zellen/ml in MEMα-Medium mit 125 pM Wildtyp-G-CSF, [His¹⁰⁹]G-CSF, [His¹¹²]G-CSF oder [His¹¹⁹]G-CSF inkubiert. Nach 24 Std. wurde die Zellzahl in jedem Kolben wie vorstehend beschrieben gemessen und ein Aliquot von jedem Medium-Überstand, der nach einer Zentrifugation zum Pelletieren von Zellresten erhalten wurde, wurde zum Messen der G-CSF-Konzentration bei –20 °C gelagert. Dies wurde 8 Tage lang alle 24 Std. wiederholt. Die Konzentrationen von G-CSF, [His¹⁰⁹]G-CSF, [His¹¹²]G-CSF und [His¹¹⁹]G-CSF in den Proben der Medium-Überstände wurden dann unter Verwendung eines enzymverbundenen Immunadsorptionsassay- (ELISA-) Kits quantifiziert, das von R & D Systems (Minneapolis, MN) erhalten wurde. Jede Überstandsprobe wurde im Duplikat analysiert. Beide Asp→His-Mutanten, von denen vorhergesagt wurde, dass sie in Bezug auf Trafficking-Eigenschaften die Besten sein würden, ergaben Halbwertszeiten, die mindestens das 10-fache der Halbwertszeit von Wildtyp-G-CSF betrugen. Es scheint tatsächlich, dass die früher bemerkte Verstärkung der Zellproliferation beider Asp→His-Mutanten {[His¹⁰⁹]G-CSF und [His¹¹²]G-CSF} relativ zu Wildtyp bis zum Tag 8 ein direktes Ergebnis davon ist, genügend Liganden zur Verfügung zu haben, um die Zellen zu stimulieren. Zusätzlich hatte die Gln→His-Mutante, [His¹¹⁹]G-CSF, eine Halbwertszeit, die 6-fach größer als die Halbwertszeit von Wildtyp war. Dies war signifikant, da die Stärke dieser Mutante zu fast zweimal so viel Zellen wie Wildtyp bis Tag 8 führte, und man deshalb erwarten könnte, dass das zelluläre Trafficking dieser Mutante größer als das des Wildtyps wäre.
Mindestens zwei unabhängige Experimente wurden sowohl für die Zellproliferations- als auch für die Ligandenverarmungsuntersuchungen durchgeführt.
Ligandenbindung
Die Ligandenbindungsaffinität eines G-CSF-Analogons an den G-CSF-Rezeptor wird unter Verwendung eines BIAcore^®2000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) gemessen. Wildtyp-G-CSF, an das Histidin angehängt wurde, wird auf der Chip-Oberfläche immobilisiert und freier Rezeptor (~ 0,25–10 nM) wird über den Chip geleitet, um eine Stan dard-Gleichgewichtskurve zu erzeugen und um die Wildtyp-Bindungsaffinität unter Verwendung eines 1:1 -Modells zu berechnen. Um die Liganden-Bindungsaffinität jeder Mutante zu bestimmen, wird 2 nM freier Rezeptor mit einer bekannten Konzentration eines mutanten Liganden gemischt und über den Chip geleitet. Die Gleichgewichtsbindungsaffinitäten der Mutanten werden unter Verwendung eines 1:1 -Modells mit Kompetition bestimmt. Bindungsaffinitätsergebnisse werden unter Verwendung der BIA Auswertungssoftware 3.1 (BIAcore, Inc.) analysiert und Gleichgewichtsdissoziationskonstanten (K_D) werden bestimmt.
Um zu bestimmen, ob die Erhöhung der Halbwertszeit und Stärke der Mutanten höheren Ligandenrecycling-Geschwindigkeiten zuzuschreiben waren, wurden Geschwindigkeitskonstanten, die auf die Komplex-Internalisierung und das Ligandenrecycling schließen lassen, wie folgt gemessen und über sie wurde berichtet.
Internalisierung der G-CSF-Analoga
Internalisierungsexperimente wurden mit zwei der G-CSF-Analoga, [His¹⁰⁹]G-CSF, [His¹¹²]G-CSF, über einen Zeitraum von 5 Min. durchgeführt, ähnlich wie in publizierter Arbeit [Kuwabara et al., Amer. J. Physiol. Endocrinol. Metabol. 32: E1–E9 (1995)]. Kurz gesagt wurden 10⁸ Zellen zweimal mit PBS gewaschen und dann in markiertem Ligand 30 Min. lang auf Eis inkubiert, um Oberflächenkomplexe zu erhalten. Die Zellen werden wieder zweimal mit eiskaltem PBS gewaschen und bei t = 0 bei 37 °C in MEMα resuspendiert. Die Änderung bei Oberflächenkomplexen und internen Komplexen wurde über einen Zeitraum von 5 Min. verfolgt; ein Graph von internen Komplexen gegen das Zeitintegral der Oberflächenkomplexe ergibt eine lineare Beziehung, deren Steigung die Geschwindigkeitskonstante der Komplexinternalisierung ist [Wiley et al., J. Biol. Chem. 257: 4222 –4229 (1982)]. Zwischen dem Wildtyp-G-CSF und den Analoga [His¹⁰⁹]G-CSF und [His¹¹²]G-CSF wurden keine Unterschiede in den Internalisierungsgeschwindigkeiten nachgewiesen. Die Fehler, die mit den Internalisierungsexperimenten verbunden sind, sind Standardabweichungen von mindestens drei unabhängigen Experimenten.
Recycling der G-CSF-Analoga
Recycling-Experimente wurden mit zwei der G-CSF-Analoga, [His¹⁰⁹]G-CSF, [His¹¹²]G-CSF, auf eine mit den vorstehenden Internalisierungsexperimenten identische Weise durchgeführt, außer über einen Zeitraum von 25 Min. Ergebnisse aus Recycling-Experimenten wurden Parameter-angepasst, um Recycling-Geschwindigkeitskonstanten zu erhalten. Es wurde festgestellt, dass die Recycling-Geschwindigkeitskonstanten für die Mutanten mindestens 50% größer waren als die von Wildtyp, mit 95% Konfidenz durch den Zwei-Proben-t-Test. Die mit den Recyclingexperimenten verbundenen Fehler waren Standardabweichungen von mindestens drei unabhängigen Experimenten. Diese Verbesserung beim Ligandenrecycling war genau das Ziel, das durch die Verwendung des hierin vorgelegten Modellierens durch Berechnung angestrebt wurde. Während die gemessene Erhöhung des Recyclings gewissermaßen aus einer Internalisierungsrunde stammt, ergibt sich die enorme Vermehrung der Halbwertszeit der Mutanten aus der verbundenen Wirkung der Internalisierung, des Recyclings, der Reinternalisierung und so weiter. So kann die iterative Wirkung des Recycling-Phänomens die Arzneistoffstärke durch Erhöhen von dessen Lebensdauer in vivo und Reduzieren des negativen Feedbacks, das durch die Arzneistoff-induzierte Expansion von Zellen, die den Zellrezeptor exprimieren, propagiert wird, stark verbessern.
Demgemäß ist, wie vorstehend angezeigt, festgestellt worden, dass die Histidinsubstitutionen der vorliegenden Erfindung zu G-CSF-Analoga führen, die in einem Zellproliferationsassay die gleiche oder eine größere Stärke relativ zu Wildtyp-G-CSF aufweisen. Auch waren die Halbwertszeiten der Mutanten 6- bis 10-mal so hoch wie die von Wildtyp-G-CSF. Darüberhinaus induziert [His¹¹⁹]G-CSF die Zellproliferation so, dass sie bis zum Tag 8 fast das zweifache der von Wildtyp-G-CSF beträgt. Zusätzlich wurde das Ligandenrecycling signifikant verbessert, obwohl die Internalisierungsgeschwindigkeit unverändert war. Diese Ergebnisse sind signifikant, weil sie nahelegen, dass das zelluläre Trafficking dieser Mutanten relativ zu Wildtyp verbessert ist. Derartige Änderungen der zellulären Reaktion finden durch Beeinflussen der G-CSF-Rezeptorbindung und/oder der Vorgänge des Sortierens, Recyclings, und des Abbaus über die endozytischen Liganden/Rezeptor Trafficking-Wege statt.
Die hierin vorgelegte Methodik ist auch noch auf andere Systeme über das G-CSF/G-CSFR-System hinaus verallgemeinerbar. In Anbetracht einer Kristallstruktur eines Ligandenrezeptorkomplexes stellt die "Histidin-Austausch"-Technik einen Rahmen zum Erzeugen von Mutanten mit verstärktem endosomalen Recycling von Komponenten der dem Trafficking unterworfenen Komplexe bereit. Dies ist die erste Arbeit, die ein rationales Arzneistoffdesign im Zusammenhang einer zellulären Trafficking-Analyse auf einer System-Ebene demonstriert, anstelle von einzelnen Bindungs- oder Signal-Vorgängen per se.
Während die vorliegende Erfindung in Bezug auf bevorzugte Ausführungsformen beschrieben worden ist, ist es selbstverständlich, dass dem Fachmann Variationen und Modifikationen einfallen werden. Deshalb ist beabsichtigt, dass die angehängten Ansprüche alle derartigen äquivalenten Veränderungen abdecken, die, wie beansprucht, innerhalb des Umfangs der Erfindung vorkommen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Zum menschlichen Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktor (G-CSF) analoges Polypeptid, das in der Sequenz von SEQ ID NO: 2 eine Aminosäuresubstitution umfasst, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) Substitution von Asparaginsäure durch Histidin an Position Nummer 109, [His¹⁰⁹]G-CSF; b) Substitution von Asparaginsäure durch Histidin an Position Nummer 112, [His¹¹²]G-CSF; c) Substitution von Glutamin durch Histidin an Position Nummer 119, [His¹¹⁹]G-CSF; und d) eines der Analoga der Unterteilungen (a–c), wahlweise einschließlich eines N-terminalen Methionylrestes.
Zu G-CSF analoges Polypeptid nach Anspruch 1, das mit einem oder mehreren wasserlöslichen Polymeren derivatisiert ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein zu G-CSF analoges Polypeptid gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Polynukleotid, welches ein zum menschlichen G-CSF analoges Polypeptid kodiert, das in der Sequenz von SEQ ID NO: 2 eine Aminosäuresubstitution umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: a) Substitution von Asparaginsäure durch Histidin an Position Nummer 109, [His¹⁰⁹]G-CSF; b) Substitution von Asparaginsäure durch Histidin an Position Nummer 112, [His¹¹²]G-CSF; c) Substitution von Glutamin durch Histidin an Position Nummer 119, [His¹¹⁹]G-CSF; und d) eines der Analoga der Unterteilungen (a–c), wahlweise einschließlich eines N-terminalen Methionylrestes.
Polynukleotid nach Anspruch 4, wobei das Molekül aus der Gruppe, bestehend aus a) den in SEQ ID NO: 3, 5, oder 7 (und den komplementären Strängen) dargelegten DNA-Sequenzen; und b) einer der DNA-Sequenzen der Unterteilung (a), die zusätzlich einen N-terminalen Methionylrest kodiert, ausgewählt ist.
Expressionskonstrukt, das ein Polynukleotid gemäß Anspruch 4 enthält.
Wirtszelle, die ein Polynukleotid gemäß Anspruch 4 enthält.
Wirtszelle nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle aus der Gruppe, bestehend aus einem Bakterium, einer Säugerzelle, einer Krebszelle, einer Hefezelle und einer Insektenzelle, ausgewählt ist.
Verfahren zum Herstellen der zu G-CSF analogen Polypeptide [His¹⁰⁹]G-CSF, [His¹¹²]G-CSF, [His¹¹⁹]G-CSF oder deren Met^–1-Spezies aus einer Wirtszelle, die Nukleinsäure enthält, welche derartige Analoga kodiert, wobei das Verfahren umfasst: a) Kultivieren der Wirtszelle, die ein Polypeptid gemäß Anspruch 4 enthält, unter Bedingungen, die die Expression eines derartigen Polypeptids erleichtern; und b) Erhalten derartiger zu G-CSF analoger Polypeptide.
Verwendung eines Polypeptids gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 zum Herstellen einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Behandeln von hämatopoetischen, neurologischen oder mit der Fortpflanzung zusammenhängenden Leiden.
Verwendung eines Polypeptids gemäß Anspruch 10, wobei das Leiden aus der Gruppe, bestehend aus: reduzierter hämatopoetischer Funktion, reduzierter Immunfunktion, reduzierter Zahl neutrophiler Zellen, reduzierter Mobilisierung neutrophiler Zellen, Mobilisierung peripherer Blutvorläuferzellen, Sepsis, schwer wiegende chronische Neutropenie, Knochenmarktransplantate, Infektionskrankheiten, Leukopenie, Thrombozytopenie, Anämie, Verbessern der Übertragung von Knochenmark während einer Transplantation, Verbessern der Knochenmarkerholung bei der Behandlung von strahlungs-, chemischer oder chemo therapeutisch induzierter Knochenmarkaplasie oder Myelosuppression, und erworbenem Immundefektsyndrom, ausgewählt ist.
Verwendung eines Polypeptids gemäß den Ansprüchen 1 oder 2 zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zum Sensibilisieren von Zellen für Chemotherapie und Strahlentherapie.
Verwendung eines Polypeptids gemäß einem der Ansprüche 10 bis 11, wobei die pharmazeutische Zusammensetzung mindestens einen zusätzlichen Faktor, ausgewählt aus EPO, G-CSF, SCF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2,IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, Interleukinen, IGF-1, LIF, Interferon, einem neurotrophen Faktor, dem flt-3/flk-2-Liganden und einem Fibroblastenwachstumsfaktor, einschließt.
Verfahren zum Kultivieren hämatopoetischer Zellen in vitro, umfassend: a) Platzieren der Zellen in ein geeignetes Kulturmedium, wobei das geeignete Kulturmedium ein zu G-CSF analoges Polypeptid gemäß Anspruch 1 enthält; und b) Bereitstellen geeigneter Bedingungen für das Wachstum der hämatopoetischen Zellen.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das Kultivieren die Verwendung von mindestens einem zusätzlichen Faktor, ausgewählt aus EPO, G-CSF, SCF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, Interleukinen, IGF-1, LIF, Interferon, einem neurotrophen Faktor, dem flt-3/flk-2-Liganden und einem Fibroblastenwachstumsfaktor, einschließt.
Kit, das Komponenten zum Kultivieren hämatopoetischer Zellen enthält, bestehend aus: a) einem der analogen Polypeptide nach Anspruch 1; b) Komponenten, die zum Herstellen von Medium zum Kultivieren hämatopoetischer Zellen geeignet sind; und c) wahlweise mindestens einem zusätzlichen Faktor, ausgewählt aus EPO, G-CSF, SCF, M-GDF, GM-CSF, M-CSF, CSF-1, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, Interleukinen, IGF-1, LIF, Interferon, einem neurotrophen Faktor, dem flt-3/flk-2-Liganden und einem Fibroblastenwachstumsfaktor.