EP0748374A1 - Verfahren zur herstellung von klonogenen fibroblasten, verfahren zur gentransfizierung von fibroblasten und so erhaltene gentransfizierte fibroblasten - Google Patents

Verfahren zur herstellung von klonogenen fibroblasten, verfahren zur gentransfizierung von fibroblasten und so erhaltene gentransfizierte fibroblasten

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Publication number
EP0748374A1
EP0748374A1 EP95909773A EP95909773A EP0748374A1 EP 0748374 A1 EP0748374 A1 EP 0748374A1 EP 95909773 A EP95909773 A EP 95909773A EP 95909773 A EP95909773 A EP 95909773A EP 0748374 A1 EP0748374 A1 EP 0748374A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
fibroblasts
cells
gene
transfected
csf
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP95909773A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Felicia M. Rosenthal
Albrecht Lindemann
Thomas Boehm
Roland Mertelsmann
Hendrik Veelken
Peter Kulmburg
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaetsklinikum Freiburg
Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Original Assignee
Universitaetsklinikum Freiburg
Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaetsklinikum Freiburg, Albert Ludwigs Universitaet Freiburg filed Critical Universitaetsklinikum Freiburg
Publication of EP0748374A1 publication Critical patent/EP0748374A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0656—Adult fibroblasts
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
    • C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C12N2510/02—Cells for production

Definitions

  • the present invention relates to a process for the production of clonogenic fibroblasts, a process for gene transfecting fibroblasts and the gene-transfected fibroblasts obtained in this way.
  • SU 13 17 021 AI relates to diploid stem cells of human skin and embryonic muscle cells which have been isolated for the cultivation of viruses.
  • the SU 15 18 370 AI concerns embryonic stem cell cultures of human skin and muscles for the production of diagnostic preparations.
  • a method for the production of human, clonogenic fibroblasts is disclosed, as well as a method for gene transfection of fibroblasts.
  • tissue samples are first taken from the serosa and, in a preferred form, from the skin of the donor, wherein these samples can have a size of 0.5 to about 2 cm *.
  • Tissue samples of this type can be obtained from the biopsy using known routine surgical methods.
  • the samples obtained as part of the biopsy are then cut up into parts with a diameter of less than 2 mm using a scalpel or a comparable device. These parts can then be laid out on cell culture plates with the epidermis layer upwards.
  • Dulbecco's modified Eagles Medium (DMEM) with 101 fetal calf serum and the usual additives can preferably be used as the culture medium.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagles Medium
  • Tissue samples are first crushed only to a size of about 0.5 cm and these parts are then incubated in culture medium (DMEM), the medium containing enzymes which promote cell separation.
  • DMEM culture medium
  • Collagenase, dispase (a neutral protease) or hyaluronidase are preferably used in the context of the present invention as such enzymes which promote cell separation, the enzymes being able to be used either individually or in various combinations.
  • the cells released by the enzymatic treatment are then washed with phosphate-buffered saline and sown at a density of about 2 ⁇ 10 ⁇ / crn- ⁇ in cell culture bottles.
  • the fibroblast cultures are usually provided with fresh growth medium twice a week. When the cultures have reached confluence, the cells can be harvested by treatment with trypsin / EDTA. After washing, counting, and again
  • Sowing at 1 x 10 cells / cm starts a new growth cycle.
  • feeder cells added to about 10 2 clonogenic fibroblast cells in dishes with a diameter of 10 cm.
  • the feeder cells are irradiated with an intensity of about 50 Gy.
  • Human embryonic WS-1 fibroblasts which are available from the American Type Culture Collection or mice NIH3T3 fibroblasts are preferably used for this purpose.
  • the tissue samples obtained by biopsy are first crushed into pieces that have no more than 0.5 cm ⁇ . These pieces of tissue are then digested with the enzyme dispase at a concentration of 2.5 units / ml for 16 hours at 4 ° C. After removing the epidermis, the skin cells are shredded into pieces that are only a few millimeters in size. The material thus obtained is further digested with a mixture of collagenase (200 units / ml) and hyaluronidase (300 units / ml) for 3 hours at 37 ° C. in a water shaking bath. Finally, the cells are sieved through a sieve with a mesh size of 70 ⁇ m, washed and transferred to the cell culture.
  • Figure 1 shows that the mean doubling time is about 4.3 ( ⁇ 0.6) days. The further growth was significantly slower in some cases and in some cases a plateau was reached, no increase in the number of cells was allowed. In some cultures, however, a cell count of more than 10 cells could be reached without a flattening of the curve being observed. It turned out that the von cultures from older donors have slower growth rates and tend to stagnate.
  • FIG. 2 shows a comparison of fibroblasts depending on the type of cell production.
  • the enzymatically produced fibroblasts clearly showed a better ability to proliferate than those obtained only by mechanical production from skin biopsies.
  • the cell cultures from different donors always showed better propagation behavior when the cells were produced after enzymatic treatment compared to those cells that only grew out of the biopsy samples.
  • FIG. 3 shows that autologous fibroblasts could also be obtained effectively from peritoneal cells using the enzymatic production method. Serosa and skin cultures initially grew at approximately the same rates, but the diploid fibroblasts from Serosa reached the plateau sooner than cultures of the same age.
  • GM-CSF colony stimulating factor
  • TNF ⁇ tumor necrosis factor
  • the diploid fibroblasts that can be produced by the method according to the invention can easily be obtained, for example, from cancer patients. These clonogenic fibroblasts serve as a suitable starting material for gene transfection. Such transfected fibroblasts can then be returned to the donors as autologous cells.
  • the fibroblasts obtainable by the method described in more detail above can be genetically manipulated by transfection.
  • Gene transfection involves introducing one or more genes into the clonogenic fibroblasts that code for a gene product that is therapeutically valuable.
  • gene products are growth factors, in particular hematopoietic growth factors, but also hormones, such as insulin, or coagulation factors, such as factor VIII, coagulation inhibitors, enzymes, such as lysosomal enzymes or adenosine deaminase.
  • hematopoietic growth factors such as G-CSF or erythropoietin are introduced into the fibroblasts by the transfection.
  • Suitable vectors are required for transfection.
  • a retroviral vector is used.
  • this vector can also contain a so-called suicide gene, such as the thymidine kinase gene derived from herpes simplex virus. Thereby selective cell killing is allowed in the presence of gancyclovir.
  • the vectors can contain inducible promoters which enable regulation of gene expression.
  • One vector that can preferably be used is the retroviral vector N2, which is derived from the genome of the Moloney Murine Leukemia Virus (MLV) and contains a bacterial neomycin resistance gene as a selective marker.
  • MMV Moloney Murine Leukemia Virus
  • the origin of the fragments and the restriction enzymes used to obtain DNA fragments encoding human interleukin-2, mouse interferon- ⁇ and herpes simplex virus thymidine kinase promoter and other genes have already been described [Gansbacher et al., J. Exp. Med., 172 (1990) pp. 1217-1224; Gansbacher et al., Cancer Res., 50 (1990) pp. 7820-7825 and Gansbacher et al., Blood, 80 (1992) pp. 2817-2825].
  • Another vector which can preferably be used in the present method has been described in Science, Vol. 256, April 1992, p. 445.
  • This is the outer shell of an adenovirus in which the adenoviral genes have either been deleted or otherwise inactivated.
  • An antibody with a lysine tail is bound to the viral envelope, the lysine tail binding to the DNA to be transfected.
  • the DNA is not packaged inside the viral envelope, but is appended to the outside of the viral envelope. This vector enables the transfection of larger DNA fragments.
  • the human clonogenic fibroblasts obtained by the method according to the invention can be transfected by the methods described above. Since only the clonogenic fibroblasts as target cells for stable gene transfection in Question, are the fibroblasts obtained in this way very suitable for the expression of foreign genes.
  • fibroblasts that have been transfected with cytokine genes can be used as so-called "bystander" cells in the context of vaccinations against tumors or for the prophylaxis of infections.
  • Fibroblasts transfected with other genes can be returned to the donor and the long-term care of the organism serve those molecules that are missing from the corresponding disease, for example, blood coagulation factor VIII, protein S, protein C, insulin, erythropoietin or other hematopoietic growth factors, or the provision of enzymes such as glucocerebrosidase or adenosine desaminase possible.
  • the fibroblasts according to the invention can either be used in the autologous system or also in the allologic system if this is possible from an immunological point of view.
  • the gene transfected fibroblasts are obtained by means of a physical gene transfer process.
  • Typical examples of such physical gene transfer methods are electroporation, microinjection, particle bombardment and anionic or cationic lipofection.
  • Electroporation is carried out as follows, for example: A quantity of 4 ⁇ 10 cells is washed twice with phosphate-buffered saline, in 0.5 ml of an electroporation buffer (20 mmol HEPES, 137 mmol sodium chloride, 5 mmol potassium chloride, 0.7 mmol Na 2 HP0 4, 6 mmol sucrose, 1 mg / ml bovine serum albumin, pH 7.0; (Goldstein et al, Nucleic. Acid Research, Volume 17 (1989), pages 3959 to 3971) and incubated for 10 minutes on ice with 20 ⁇ g of DNA in a 0.4 cm electroporation cuvette from Bio-Rad, Kunststoff, Germany.
  • an electroporation buffer (20 mmol HEPES, 137 mmol sodium chloride, 5 mmol potassium chloride, 0.7 mmol Na 2 HP0 4, 6 mmol sucrose, 1 mg / ml bovine serum albumin, pH 7.0; (Goldstein et al, Nu
  • the cells are then electroporated with a capacitance of 960 ⁇ F in an electroporation device that is charged with 250 V. After a second incubation on ice for 10 minutes, the cells are applied in a 50 ml cell culture vessel with a regular nutrient solution.
  • a typical cationic lipofection is as follows:
  • the cells are applied at a density of 10 per wall to a 35 ml petri dish, for example from Falcon.
  • 2 ⁇ g of the DNA with various proportions of lipofection agents (DOSPA / DOSPE 3: 1), available from Gibco in Germany, are added to 200 ⁇ l DMEM and incubated for 30 minutes at room temperature.
  • the cells are then washed twice with DMEM and the transfection complexes are added to the cells after dilution to 1 mm using DMEM. After 1 hour, 1 ml of a conventional culture medium is added, and 24 hours later the medium has changed completely.
  • the gene-transfected fibroblasts obtained according to the invention can be used as medicaments, in particular for in vivo treatment.
  • the gene-transfected fibroblasts serve, for example, to mobilize hematopoietic stem cells, provided there is a growth factor gene.
  • Another object of the present invention is a carrier made of biocompatible, preferably usable in endoprostheses Material containing the gene transfected fibroblasts discussed above.
  • the gene-transfected fibroblasts are first cocultivated with the biocompatible material in vitro, and the material covered in this way is then implanted.
  • the endoprosthesis is a vascular prosthesis made of a biocompatible, preferably human-compatible, synthetic material, for example fluoropolymers or a polyester, and the gene-transfected fibroblasts are implanted in vivo with this prosthesis.
  • the endoprosthesis in the form of a vascular prosthesis can consist of a biocompatible, preferably human-compatible, material derived from natural sources, for example a collagen fleece or a material obtained from bovine pericard, the gene-transfected fibroblasts being implanted with this prosthesis in vivo.
  • fibroblasts with collagen-coated polyvinylpyrrolidone matrices cocultured and applied as organoid intraperitoneally (ip) or subcutaneously (sc) in this form are known to be neovascularized in vivo.
  • the amount of gene product required in vivo is controlled by the amount of transfected cells and, if necessary, additionally by the inducible promoter.
  • suitable carriers such as fluoropolymer fibers, in particular polytetrafluoroethylene fibers, can also be used, which are then coated with a suitable coating agent such as collagen. These fibers can then be embedded in an extracellular gel matrix and applied intraperitoneally, for example by a small surgical procedure.
  • fluoropolymer fibers in particular polytetrafluoroethylene fibers
  • Skin and serosa samples of approximately 0.5-2 cm2 were obtained from 50 donors who had cancer. The biopsy samples were stored in Dulbecco's modified Eagles Medium (DMEM) and processed on the day of collection.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagles Medium
  • DMEM Gibco BRL
  • fetal calf serum Boehringer Mannheim
  • the fibroblast cultures were grown at 37 C in a humid atmosphere containing 5% CO2, twice per
  • NIH3T3 added per culture plate.
  • the two cell lines available from ATCC, Rockville, MD served as so-called feeder cells after irradiation with 100 Gy. After 4
  • Example 1c The test conditions given in Example 1 were carried out using various enzymes (Example 1c) in order to determine the effectiveness for the creation of long-term cultures of diploid fibroblasts.
  • the best results were obtained when the cut biopsy samples were first digested with Dispase at a concentration of approximately 2.5 U / ml for 16 hours at 4 ° C. After this treatment, the epidermis could be easily removed from the cell fragments.
  • the skin cells were then further crushed into pieces of a few mm. This cell material was subjected to a second enzymatic treatment with a mixture of collagenase (200 U / ml) and hyaluronidase (300 U / ml) for 3 hours at 37 ° C. in a water shaking bath. Finally, the cells were separated by passage through a 70 ⁇ m sieve, washed and transferred to cell culture.
  • Figure 1 shows a plot of the donor cells (pieces) against the number of days of cultivation, the cells behind / after the curve indicate the age of the human donor.
  • Figure 2 shows a plot of donor cells (pieces) against the number of days of cultivation for human Donors of different ages.
  • ü denotes production of the fibroblasts by enzymatic treatment and ⁇ denotes only mechanical cell separation. It follows from this that the fibroblast cultures produced with the aid of the enzymatic method clearly had a better propagation capacity than those fibroblast cultures which were obtained only by mechanical treatment of the skin biopsy samples.
  • diploid fibroblast cultures can be obtained not only from skin cells but also from peritoneal cells. It was found that the cell cultures derived from the serosa initially grew similarly to the cell cultures derived from the skin, but the diploid fibroblasts derived from the serosa reached the plateau with a significantly lower cell number than the diploid fibroblast cultures of skin comparable in old age.
  • FIG. 3 shows a comparison of the cell numbers plotted against the number of days of cultivation of fibroblast cultures which originate either from skin (left diagram) or from Serosa (right diagram) from donors with an age of 45 to 59 years.
  • Figure 4 shows the influence of so-called feeder cells on the plating efficiency of the diploid fibroblast cultures.
  • Diploid fibroblast cultures of skin cells were prepared which were treated enzymatically. Their plating efficiency was determined by sowing the cells in a very low density on the cell culture bottles. While the diploid fibroblasts without feeder cells showed hardly any colony formation under these conditions, the plating efficiency could be increased to 9-24% by the addition of irradiated human fibroblasts from the WS-1 cell line.
  • Example 3 Example 3:
  • culture supernatants were taken from non-irradiated diploid fibroblasts and also from diploid fibroblasts that were irradiated with 20 or 100 Gy. The culture supernatants of the irradiated cells were removed on the 3rd and 8th day after irradiation.
  • the retroviral base vector N2 is derived from the genome of the Moloney Murine Leukemia Virus (MLV) and contains the bacterial neomycin resistance gene as a selection marker. DNA fragments coding for the Major Immediate Early Human CMV- Promoter, the promoter of adenosine deaminase (ADA promoter), the poly-A signal and the mouse GM-CSF hub cloned different sites of the N2 vector. The construct N2 vector / CMV promoter / mouse GM-CSF cloned into different sites of the N2 vector.
  • MMV Moloney Murine Leukemia Virus
  • N2 vector / CMV promoter / mouse GM-CSF was made by cloning the CMV-GM-CSF fusion product into an Xho I restriction site of the neomycin resistance gene in the N2 vector (Fig. 6, top).
  • the mouse GM-CSF cDNA was also cloned in reverse orientation into an interface generated by the restriction enzyme SnaB 1 and the poly-A signal into a Klenow-filled Apa I site in the 3'LTR polylinker.
  • the retroviral vectors were converted into the corresponding viruses by electroporation of the vector DNA into a helper-free echotropic packaging cell line (GP + E-86). After G418 selection (0.7 mg / ml genticin, Gibco Laboratory, Grand Island, NY), colonies were isolated and expanded into producer cell lines. Cell-free supernatant was tested for NIH 3T3 cells to determine the titer of the virus.
  • Figure 6 shows the structure of the retroviral vectors used.
  • CMS5 is a methylcholantrene-induced, non-metastatic fibrosarcoma from a BALB / c genetic background.
  • NIH 3T3 is a contact-inhibited fibroblast cell line established by NIH Swiss mouse embryos (CRL 1658).
  • BALB 3T3 clone A31 are contact-inhibited, non-tumorogenic fibroblasts established by BALB / c mouse embryos (CCL 163). Both fibroblast cell lines were purchased from ATCC.
  • the cells were cultured in Dulbecco's modified Eagles medium, supplemented with 10% fetal calf serum, 100 U / ml penicillin, 100 n3g / ml streptomycin and 2 mmol / 1 L-glutamine.
  • Virus-producing cell lines that have secreted high titers of the virus were used to infect the CMS5 cells and the fibroblast cells. Clones or bulk-infected cells were expanded into lines after G418 selection and further analyzed.
  • the secretion of GM-CSF in the supernatant of retrovirally infected CMS5 cells and fibroblasts and the GM-CSF serum concentration of treated mice were determined by means of a bioassay and confirmed by means of an ELISA test.
  • the supernatant from icon-confluent parenteral or GM-CSF-secreting cells was collected after 24 hours, the cell number was determined and the supernatant was examined for the production of mouse GM-CSF.
  • CMS5 cells irradiated with 50 Gy or cells transfected with the vector N2 / CMV / GM-CSF / CMS5 were examined.
  • the cells were plated into small tissue culture flasks on the day of irradiation and the amount of GM-CSF in the 24 hour culture supernatant was determined on the 3rd, 6th, 9th and 12th day after the irradiation.
  • the biological activity of the GM-CSF to be investigated was determined by determining the ability of the GM-CSF containing
  • GM-CSF activity was expressed as counts per minute (cpm) and production in ng per 24 hours of 10 cells was calculated by comparison with a standard curve of recombinant mouse GM-CSF. In addition, GM-CSF production was confirmed using an ELISA test.
  • GM-CSF-secreting cells were therefore first irradiated with 50 Gy and the GM-CSF secretion was determined up to 12 days after the irradiation.
  • Figure 7 it can be seen that the GM-CSF production after radiation was initially increased.
  • the values on the 3rd and 6th day after irradiation are about 130 ng / 10 6 cells / 24 hours.
  • mice Female BALB / c mice that were 7-10 weeks old were used for the experiments. On day 0 and day 2, all mice received 150 mg / kg cyclophosphamide intraperitoneally. A portion of the mice received no further injections, a second portion was subcutaneously injected on day 3 twice daily with 100 ng recombinantly produced mouse GM-CSF.
  • the last group received a total of 10 N2 / CMV / GM-CSF-CMS5 cells irradiated with 50 Gy subcutaneously.
  • blood from the tail veins of the mice was transferred daily to heparinized Eppendorf vessels.
  • the number of leukocytes was determined after lysing the erythrocytes in a Neubauer cell chamber. Differential blood count was taken every two days and the differential blood count was determined after staining with May-Grünwald-Gie sa.
  • Serum values of mouse GM-CSF were determined on day 1, 4 and 10 after injection of the irradiated GM-CSF-secreting fibrosarcoma cells.
  • mice Female BALB / c mice were treated as described in Example 4d. The peripheral leukocyte counts were determined daily from the 3rd day and a differential blood count was made every 2 days. The base leukocyte numbers in these mouse strains are around 9,000 to 10,000 leukocytes / ml. Through the application of cyclophosphamide, the leukocytes on the 3rd day are around 1,000 to 1,500
  • FIG. 8 shows the differential blood count of the various treatment groups as absolute leukocyte subpopulations (monocytes, granulocytes and lymphocytes). In untreated BALB / c mice, there are about 1% monocytes, 15-30% granulocytes and 70-85% lymphocytes in the differential blood count. On the 5th day after the start of cyclophosphamide treatment, i.e.
  • lymphocytes are almost exclusively found in all treatment groups in the differential blood count.
  • On day 7 when the absolute white blood cell count of 'treated with recombinant GM-CSF and GM-CSF-secreting cells mice is about twice as high as in the treated with cyclophosphamide animals, a clear difference is noted in the differential blood count.
  • the animals not treated with growth factor had only about 15% of the monocytes and 25% of the granulocytes of the mice treated subcutaneously with GM-CSF or with GM-CSF-secreting fibroblasts, which had already reached normal absolute granulocytes. There are no differences in the absolute lymphocyte values between the different treatment groups.
  • FIG. 8 therefore shows that a single injection of irradiated gene-transfected autologous cells already has biological effects on the blood count of mice treated with chemotherapy.
  • FIG. 9 shows the number of leukocytes that changes over time.
  • the mice were each treated with cyclophosphamide.
  • a control group received no GM-CSF.
  • recombinantly produced GM-CSF was injected subcutaneously.
  • gene transfected cells that produced GM-CSF were applied subcutaneously.
  • pCMV.GCSF.iresNEO contains the human G-CSF gene under control of the CMV promoter and the neomycin resistance gene via an IRES (internal ribosomal entry site). So G-CSF and neomycin phosphotransferase are to be expressed here.
  • pCMV.GCSF.iresTK / NEO contains the G-CSF gene under control of the CMV promoter and a herpes simplex virus thymidine kinase-neomycin resistance fusion gene via an IRES.
  • the TK are also to be expressed and thus, after administration of gancyclovir, this prodrug is to be phosphorylated and activated.
  • FIG. 10 shows on the left a plot of the number of leukocytes as pieces per nl (n nl) against the time (in days) after subcutaneous tumor inoculation of 2.5 ⁇ 10 unirradiated CMS-5 cells of the aforementioned construct 1 (far left) and the Constructs 2 (middle) in 3 BALB-c mice.
  • the diagrams at the bottom left and left in the middle show the time course of leukocyte development after tumor ⁇ oculation, where the prodrug Gancyclovir was also given ip twice daily.
  • the time development (in days) of the tumor size (mm) for three BALB-c test mice is again shown on the right-hand side of FIG. 10 for the same constructs.
  • mice The two groups of BALB-c mice were injected subcutaneously with 2.5 x 10 unirradiated CMS-5 cells each, which had been transfected with the above-mentioned vectors.
  • Each group of mice received gancyclovir (GCV) i.p. twice daily from the third day (D4). (see Figure 10, each of the four lower diagrams).
  • GCV gancyclovir
  • the experimental group which was treated with GCV and received CMS-5 cells transfected with p.CMV.GCSF.iresTK / NEO, shows a drop in the leukocytes and a regression of the tumor (see Figure 10, bottom center, and bottom right).
  • FIG. 11 shows a plot of the number of leukocytes (WBC / ⁇ l) against the time after the injection (in days) after the Chemotherapy and cytokine therapy in the presence / absence of transfected fibroblasts.
  • WBC / ⁇ l the number of leukocytes
  • rhG-CSF twice daily subcutaneous administration of the recombinant human G-CF
  • the diagram in the middle right shows the time course of the development of leukocytes after the addition of cyclophosphamide and the single injection of 5 x 10 G-CSF-transfected BALB-3T3 fibroblasts, and on the right side the time course of the development of leukocytes after the addition of Cyclophosphamide and a single injection of 5 x 10 irradiated G-CSF gene transfected B.ALB-3T3 fibroblasts.
  • the curves marked with a square, a diamond and a dot represent the development of the leukocyte contents of the three test mice used.
  • the three graphics show that the regeneration of the leukocytes in the groups with a single injection of the transfected fibroblasts (middle right as well as on the right) takes place at least as quickly as when the recombinant protein is injected twice a day subcutaneously (center left).
  • the following table shows the effect of GCSF application on the mobilization of hematopoietic stem cells in the peripheral blood.
  • the number of colony forming cells, ie the cells that provide information about the number of hematopoietic stem cells, is also called CFU in the following, and the value of CFU to leukocytes in the four different treatment groups.
  • Leukocytes ⁇ SE CFU / ul ⁇ SE CFU / leukocytes ⁇ SE leukocytes ⁇ SE CFU / ul ⁇ SE CFU / leukocytes ⁇ SE
  • Cyclophosphamide dO + d2 (i.p. 150 mg / kg)
  • G-CSF cyclophosphamide + rhG-CSF d3 - d7 (s.c, 125 ug / kg 2 x daily)
  • G-CSF / B ⁇ LB cyclophosphamide + hG-CSF gene lipofected BALB 3T3, d3 (sc, 5 x 10 6 )
  • G-CSF / B ⁇ LB Cyclophosphamide + irradiated (50 Gy) hG-CSF gene lipofected BALB 3T3, d3 (s.c, 5 x 10 ")
  • CD ro day x Day on which all mice in the group (3 mice / group each) had at least 3500 / ul leukocytes.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von klonogenen Fibroblasten, wobei man dem Spender Gewebe entnimmt und die Zellen aus dem Gewebe vereinzelt, die so entstandene Zellsuspension siebt, die in der Zellsuspension enthaltenen Zellen wäscht und die Zellen in eine Gewebekultur überführt, ausgenommen eine Vereinzelung von Zellen durch mechanische Zerkleinerung gefolgt von einer enzymatischen Behandlung mit ausschließlich Kollagenase und wobei durch die Transfektion in die Fibroblasten wenigstens ein Gen eingeschleust wird, daß für ein biologisch aktives Protein, vorzugsweise therapeutisch aktives Protein, beispielsweise einen Wachstumsfaktor, ein Hormon, ein Enzym, einen Gerinnungsfaktor oder Gerinnungsinhibitor codiert.

Description

Verfahren zur Herstellung von klonogenen Fibroblasten, Verfahren zur Gentransfizierung von Fibroblasten und so erhaltene gentransfizierte Fibroblasten
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von klonogenen Fibroblasten, Verfahren zur Gentransfizierung von Fibroblasten und so erhaltene gentransfizierte Fibroblasten.
Bei der Therapie verschiedenster Krankheiten ist es wünschenswert, bestimmte biologisch aktive Moleküle, die auch vom menschlichen Körper produziert werden können, in einer gesteigerten, medizinisch wirksamen Dosis dem Körper zuzuführen. Die medikamentöse Zuführung von außerhalb des Körpers hergestellten biologisch aktiven Molekülen hat jedoch auch den Nachteil, daß derartige Wirkstoffe häufig, manchmal sogar mehrmals täglich parenteral appliziert werden müssen, wobei eine einfache subkutane Applikation oft nicht ausreicht, sondern mehrfach täglich Intravenösgaben erforderlich sind.
Die SU 13 17 021 AI betrifft diploide Stammzellen der menschlichen Haut und embryonale Muskelzellen, welche zum Kultivieren von Viren isoliert worden sind. Die SU 15 18 370 AI betrifft embryonale Stammzellenkulturen der menschlichen Haut und Muskeln zur Herstellung von diagnostischen Präparaten.
Das Handbuch von R. Jan Freshney, „Culture of Animal Cells", 2. Auflage, Alan R. Liss Inc., New York, 1988, beschreibt in Kapitel 9 die Vereinzelung von Gewebe und Primär(Zeil)Kulturen. Auf den folgenden Seiten wird ein Verfahren zur Herstellung von humanen Fibroblasten beschrieben, bei dem man das Gewebe der Spender im Rahmen einer Biopsie aus der Haut entnommen hat, woraufhin man die Zellen aus dem Gewebe vereinzelt, die in der Zellsuspension enthaltenen Zellen wäscht und die Zellen in eine Gewebekultur überführt. Dieses Verfahren umfaßt aber ausschließlich im Rahmen der Vereinzelung von Zellen eine mechanische Vereinzelung von Zellen gefolgt von einer enzymatischen Behandlung mit Collagenase.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem solche Zellen zur Verfügung gestellt werden, die derart verändert wurden, daß sie biologisch aktive Moleküle produzieren können.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von humanen, klonogenen Fibroblasten offenbart, sowie ein Verfahren zur Gentransfizierung von Fibroblasten.
Bei den erfindungsgemäßen Verfahren werden dem Spender zunächst Gewebeproben von der Serosa und in bevorzugter Form von der Haut entnommen, wobei diese Proben eine Größe von 0,5 bis etwa 2 cm*-- aufweisen können. Derartige Gewebeproben können durch bekannte chirurgische Routineverfahren der Biopsie entnommen werden. Die im Rahmen der Biopsie erhaltenen Proben werden dann mit einem Skalpell oder einem vergleichbaren Gerät in Teile von weniger als 2 mm Durchmesser zerkleinert. Diese Teile können dann auf Zellkulturplatten mit der Epidermisschicht nach oben ausgelegt werden. Als Kulturmedium kann in bevorzugter Weise Dulbeccos modifiziertes Eagles Medium (DMEM) mit 101 fötalem Kälberserum und den üblichen Zusatzstoffen verwendet werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat es sich herausgestellt, daß es vorteilhafter ist, wenn die
Gewebeproben zunächst nur auf eine Größe von etwa 0,5 crn-^ zerkleinert werden und diese Teile dann in Kulturmedium (DMEM) inkubiert werden, wobei das Medium die Zellvereinzelung fördernde Enzyme enthält. Als derartige die Zellvereinzelung fördernde Enzyme werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugt Collagenase, Dispase (eine neutrale Protease) oder Hyaluronidase eingesetzt, wobei die Enzyme entweder einzeln oder in verschiedenen Kombinationen verwendet werden können.
Die durch die enzymatische Behandlung freigesetzten Zellen werden anschließend mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und bei einer Dichte von etwa 2 x lO^/crn-^ in Zellkulturflaschen ausgesät.
Die Fibroblastenkulturen werden üblicherweise zweimal pro Woche mit frischen Wachstumsmedium versehen. Wenn die Kulturen Konfluenz erreicht haben, können die Zellen durch Behandlung mit Trypsin/EDTA geerntet werden. Nach Waschen, Zählen, und wieder
Aussäen bei 1 x 10 Zellen/cm beginnt ein neuer Wachstumszyklus.
Es hat sich herausgestellt, daß im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Zugabe von sogenannten Feeder-Zellen zu etwa 102 klonogenen Fibroblastenzellen in Schalen mit einem Durchmesser von 10 cm gegeben. Die Feeder-Zellen werden mit einer Intensität von etwa 50 Gy bestrahlt. In bevorzugter Weise werden hierzu menschliche embryonale WS-1 Fibroblasten verwendet, die von der American Type Culture Collection erhältlich sind, oder auch Mäuse NIH3T3 Fibroblasten.
Bei einem besonders wirksamen Verfahren zur Herstellung von humanen, klonogenen Fibroblasten werden die durch Biopsie erhaltenen Gewebeproben zunächst zerkleinert in Stücke, die nicht mehr als 0,5 cm^ aufweisen. Diese Gewebestücke werden dann mit dem Enzym Dispase bei einer Konzentration von 2,5 Einheiten/ml für 16 Stunden bei 4 °C verdaut. Nach dem Entfernen der Epidermis werden die Hautzellen in Stücke zerkleinert, die nur wenige Millimeter groß sind. Das so erhaltene Material wird weiter mit einer Mischung von Collagenase (200 Einheiten/ml) und Hyaluronidase (300 Einheiten/ml) für 3 Stunden bei 37 °C im Wasserschüttelbad verdaut. Schließlich werden die Zellen durch ein Sieb mit einer Maschengröße von 70 μm gesiebt, gewaschen und in die Zellkultur überführt.
Es wurde festgestellt, daß von Spendern, die jünger als 60 Jahre waren, nach einer durchschnittlichen Zeit von 89 Tagen + 8 Tage) etwa 1011 Zellen erhalten werden konnten.
Die Figur 1 zeigt, daß die mittlere Verdopplungszeit etwa 4,3 (± 0,6) Tage beträgt. Das weitere Wachstum war deutlich langsamer in einigen Fällen und in manchen Fällen wurde ein Plateau erreicht, war keine Steigerung der Zellzahl mehr zuließ. Bei manchen Kulturen konnte jedoch eine Zellzahl von mehr als 10 Zellen erreicht werden, ohne daß eine Abflachung der Kurve beobachtet werden konnte. Es stellte sich heraus, daß die von älteren Spendern stammenden Kulturen langsamere Wachstumsraten haben und eher stagnieren.
Figur 2 zeigt eine Gegenüberstellung von Fibroblasten in Abhängigkeit von der Art der Herstellung der Zellen. Die enzymatisch hergestellten Fibroblasten zeigten eindeutig eine bessere Fähigkeit der Proliferation als diejenigen, die nur durch mechanische Herstellung aus Hautbiopsien erhalten wurden. Die von verschiedenen Spendern stammenden Zellkulturen zeigten immer dann ein besseres Vermehrungsverhalten, wenn die Zellen nach enzymatischer Behandlung hergestellt wurden gegenüber denjenigen Zellen, die nur aus den Biopsieproben herauswuchsen.
Figur 3 zeigt, daß autologe Fibroblasten auch wirksam aus Peritonealzellen mit Hilfe der enzymatischen Herstellungsmethode erhalten werden konnten. Zwar wuchsen Serosa- und Hautkulturen anfänglich mit etwa gleichen Raten, jedoch erreichten die diploiden Fibroblasten aus Serosa das Plateau eher als gleich alte Kulturen von Haut.
Im Bezug auf permanent transfizierte Klone ist die Piatiereffizienz der diploiden Fibroblasten von großer Bedeutung. Figur 4 zeigt, daß diploide Fibroblasten ohne "Feeder"-Zellen nur schlecht wuchsen. Durch die Zugabe von bestrahlten menschlichen WS-1 Fibroblasten wurde die Platierungseffizienz auf 9 bis 24% gesteigert. Es wurden von nicht bestrahlten Zellen die Überstände ebenso geerntet wie die von mit 20 Gy und 100 Gy bestrahlten Zellen nach 3 und 8 Tagen. In den Überständen von nicht bestrahlten diploiden Fibroblasten wurden 1,2 ng bis 1,4 ng Interleukin-6 pro 24 Stunden und 10^ Zellen gefunden. Die Bestrahlung änderte nicht wesentlich die Interleukin-6 Sekretion. Nicht bestrahlte diploide Fibroblasten produzierten dagegen nicht nennenswerte Mengen von
GM-CSF (colony stimulating factor) oder TNFα (tumor necrose factor) , wohingegen nach Bestrahlung in den Überständen bis zu 90 pg GM-CSF und 50 pg TNFα pro 24 Stunden und 106 Zellen gemessen wurden. Die Induktion dieser Zytokine durch Bestrahlung war stark abhängig von den jeweiligen individuellen Kulturen.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren herstellbaren diploiden Fibroblasten können leicht beispielsweise von Krebspatienten erhalten werden. Diese klonogenen Fibroblasten dienen als geeignetes Ausgangsmaterial für die Gentransfektion. Derartig transfizierte Fibroblasten können dann als autologe Zellen den Spendern wieder zugeführt werden.
Die nach dem oben näher beschriebenen Verfahren erhältlichen Fibroblasten können durch Transfektion genetisch manipuliert werden. Bei der Gentransfizierung werden in die klonogenen Fibroblasten ein oder mehrere Gene eingeschleust, die für ein Genprodukt kodieren, das therapeutisch wertvoll ist. Derartige Genprodukte sind Wachstumsfaktoren, insbesondere hämatopoetische Wachstumsfaktoren, aber auch Hormone, wie beispielsweise Insulin, oder Gerinnungsfaktoren, wie beispielsweise Faktor VIII, Gerinnungsinhibitoren, Enzyme, wie beispielsweise lysosomale Enzyme oder Adenosindesaminase.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden durch die Transfektion hämatopoetische Wachstumsfaktoren wie G-CSF oder Erythropoetin in die Fibroblasten eingeschleust.
Zur Transfektion sind geeignete Vektoren erforderlich. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein retroviraler Vektor verwendet. Dieser Vektor kann neben den erforderlich essentiellen Genen aus dem retroviralen System weiterhin ein sogenanntes Suizidgen, wie das aus Herpes simplex Virus stammende Thymidinkinase-Gen, enthalten. Dadurch wird eine selektive Abtötung der Zellen in Gegenwart von Gancyclovir erlaubt. Außerdem können die Vektoren induzierbare Promotoren enthalten, die eine Regulation der Genexpression ermöglichen.
Ein Vektor, der bevorzugt verwendet werden kann, ist der retrovirale Vektor N2, der von dem Genom des Moloney Murine Leukemia Virus (MLV) abgeleitet ist und ein bakterielles Neomyzinresistenzgen als selektiven Marker enthält. Die Herkunft der Fragmente und die Restriktionsenzyme, die verwendet wurden, um DNA-Fragmente zu erhalten, die für menschliches Interleukin-2, Mäuseinterferon-γ und Herpes simplex Virus Thymidinkinasepromotor und andere Gene kodieren, wurden bereits beschrieben [Gansbacher et al., J. Exp. Med., 172 (1990) S. 1217-1224; Gansbacher et al., Cancer Res., 50 (1990) S. 7820-7825 und Gansbacher et al., Blood, 80 (1992) S. 2817-2825] .
Ein weiterer Vektor, der im vorliegenden Verfahren bevorzugt eingesetzt werden kann, wurde in Science, Vol. 256, April 1992, S. 445 beschrieben. Hierbei handelt es sich um die äußere Hülle eines Adenovirus, bei dem die adenoviralen Gene entweder deletiert oder anderweitig inaktiviert wurden. An die virale Hülle ist ein Antikörper mit einem Lysinschwanz gebunden, wobei der Lysinschwanz an die zu transfizierende DNA bindet. Bei diesem Vektorsystem wird die DNA nicht innerhalb der viralen Hülle verpackt, sondern außen an die virale Hülle angehängt. Dieser Vektor ermöglicht die Transfektion von größeren DNA- Fragmenten.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen humanen klonogenen Fibroblasten können nach den oben beschriebenen Methoden transfiziert werden. Da nur die klonogenen Fibroblasten als Zielzellen für eine stabile Gentransfektion in Frage kommen, sind die so erhaltenen Fibroblasten für die Expression von Fremdgenen sehr geeignet.
Beispielsweise können Fibroblasten, die mit Zytokingenen transfiziert wurden, als sogenannte „Bystander"-Zellen im Rahmen von Vakzinationen gegen Tumoren oder auch zur Prophylaxe von Infektionen eingesetzt werden. Mit anderen Genen transfizierte Fibroblasten können in den Spender zurückgebracht werden und der langfristigen Versorgung des Organismus mit denjenigen Molekülen dienen, die bei der entsprechenden Krankheit fehlen. Hierbei kann es sich beispielsweise um den Blutgerinnungsfaktor VIII, das Protein S, das Protein C, oder auch Insulin, Erythropoetin oder andere hämatopoetische Wachstumsfaktoren handeln. Auch die Bereitstellung von Enzymen wie Glucocerebrosidase oder Adenosindesaminase ist möglich.
Die erfindungsgemäßen Fibroblasten können entweder im autologen System verwendet werden oder auch im allologen System, sofern dies in immunologischer Hinsicht möglich ist.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden die gentransfizierten Fibroblasten mittels eines physikalischen Gentransferverfahrens erhalten. Typische Beispiele für derartige physikalische Gentransferverfahren sind die Elektroporation, die Mikroinjektion, das Partikel-Bombardement und die anionische oder kationische Lipofektion.
Eine Elektroporation wird beispielsweise wie folgt durchgeführt: Eine Menge von 4 x 10 Zellen werden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, in 0,5 ml eines Elektroporations-Puffers (20 mmol HEPES, 137 mmol Natriumchlorid, 5 mmol Kaliumchlorid, 0,7 mmol Na2HP04, 6 mmol Saccharose, 1 mg/ml bovines Albuminserum, pH 7.0; (Goldstein et al., Nucleic Acid Research, Band 17 (1989), Seite 3959 bis 3971) und 10 Minuten auf Eis mit 20 μg einer DNA in einer 0,4 cm Elektroporationsküvette der Firma Bio-Rad, München, Deutschland, inkubiert. Die Zellen werden dann mit einer Kapazität von 960 μF in einer Elektroporationseinrichtung, die mit 250 V geladen sind, elektroporiert. Nach einer zweiten Inkubation auf Eis für 10 Minuten werden die Zellen in einem 50 ml Zellkulturgefäß mit einer regulären Nährlösung aufgebracht.
Eine typische kationische Lipofektion verläuft beispielsweise wie folgt:
An dem Tag vor der Transfizierung werden die Zellen mit einer Dichte von 10 pro Wand auf eine 35 ml Petrischale, beispielsweise der Firma Falcon, aufgebracht. Um die Transfektionskomplexe zu sammeln, werden 2 μg der DNA mit verschiedenen Anteilen von Lipofektionsmitteln (DOSPA/DOSPE 3:1), erhältlich von der Firma Gibco in Deutschland, in 200 μl DMEM gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zellen werden daraufhin zweimal mit DMEM gewaschen, und die Transfektionskomplexe werden zu den Zellen nach einer Verdünnung auf 1 mm mittels DMEM gegeben. Nach einer Stunde wird 1 ml eines üblichen Kultivierungsmediums hinzugefügt, und 24 Stunden später hat sich das Medium vollständig verändert.
Die erfindungsgemäß erhaltenen gentransfizierten Fibroblasten können als Arzneimittel, insbesondere zur in vivo-Behandlung eingesetzt werden. Hierbei dienen die gentransfizierten Fibroblasten beispielsweise zur Mobilisierung von hämatopoietischen Stammzellen, soweit ein Wachstumsfaktorgen vorliegt.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Träger aus biokompatiblem, vorzugsweise in Endoprothesen verwendbarem Material, welches die vorstehend diskutiterten gentransfizierten Fibroblasten enthält. Hierbei werden die gentransfizierten Fibroblasten zunächst in vitro mit dem biokompatiblen Material kokultiviert und das so bewachsene Material wird dann implantiert. Nach einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Endoprothese eine Gefäßprothese aus einem biokompatiblem, vorzugsweise humankompatiblen, synthetischen Material, beispielsweise Fluorpolymeren oder einem Polyester, und die gentransfizierten Fibroblasten werden in vivo mit dieser Prothese implantiert. Alternativ kann die Endoprothese in Form einer Gefäßprothese aus einem biokompatiblem, vorzugsweise humankompatiblem, aus natürlichen Quellen stammendem Material bestehen, beispielsweise einem Kollagenvlies oder einem aus bovinem Pericard gewonnenem Material, wobei die gentransfizierten Fibroblasten in vivo mit dieser Prothese implantiert werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die gemäß' dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Fibroblasten mit Collagen beschichteten Polyvinylpyrrolidon Matrizes kokultiviert und in dieser Form als Organoid intraperitoneal (i.p.) oder subkutan (s.c.) appliziert. Es ist bekannt, daß derartige Objekte in vivo neovaskularisiert werden. Die Menge des in vivo erforderlichen Genproduktes wird über die Menge der transfizierten Zellen gesteuert und gegebenenfalls zusätzlich durch den induzierbaren Promotor. Anstelle der Polyvinylpyrrolidon Matrizes können auch andere geeignete Trägerstoffe wie beispielsweise Fluorpolymerfasern, insbesondere Polytetrafluorethylenfasern verwendet werden, die dann mit einem geeigneten Beschichtungsmittel wie Collagen überzogen werden. Diese Fasern können dann in eine extrazelluläre Gelmatrix eingebettet werden und beispielsweise durch einen kleinen chirurgischen Eingriff intraperitoneal appliziert werden. Beispiel 1
a) Biopsien
Mit Hilfe von routinemäßigen chirurgischen Eingriffen wurden
Haut- und Serosaproben von etwa 0,5-2 cm2 erhalten von 50 Spendern, die an Krebs erkrankt waren. Die Biopsieproben wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DMEM) aufbewahrt und am Tag der Entnahme weiterbearbeitet.
b) Mechanische Behandlung
Die Biopsieproben wurden mit einem Skalpell in Stücke von weniger als 2 mm Durchmesser geschnitten. Diese Stücke wurden dann auf Zellkulturplatten mit der Epidermis nach oben ausplatiert. Als Wachstumsmedium wurde DMEM (Gibco BRL) mit hohem Glucosegehalt, das 10% fötales Kälberserum (Boehringer Mannheim) enthielt und mit L-Glutamin und Natriumpyruvat angereichert wurde, verwendet.
c) Enzymatische Behandlung
Nachdem die Biopsieproben in Stücke von weniger als etwa 0,5 crn-^ zerkleinert wurden, wurden diese Proben mit DMEM Medium, das Collagenase (Biochrom, Berlin) , Dispase (Boehringer Mannheim) oder Hyaluronidase (Sigma, Deisenhofen) entweder einzeln oder in verschiedenen Kombinationen enthielt, inkubiert. Zellen, die durch diese Behandlung in die Suspension freigesetzt wurden, wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in einer Dichte von 2 x lC cm2 in Zellkulturflaschen ausplatiert.
d) Langzeitkultur
o
Die Fibroblastenkulturen wurden bei 37 C in feuchter Atmosphäre, die 5% CO2 enthielt, angezogen, wobei zweimal pro
Woche frisches Wachstumsmedium hinzugefügt wurde. Sobald die Kulturen Konfluenz erreichten, wurden die Zellen durch Behandlung mit Trypsin/EDTA geerntet, anschließend gewaschen, gezählt und mit einer Dichte von 1 x 10 Zellen/cm-^ erneut ausgesät. Die Zellzahlen wurden ausgehend von der Anzahl der Zellen und dem Verdünnungsfaktor bei jeder Passage hochgerechnet.
e) Platierungseffizienz
100 Zellen wurden in Kulturplatten mit 10 cm Durchmesser
5 ausplatiert. .Am folgenden Tag wurden 5 x 10 menschliche embryonale WS-1 Fibroblasten oder Mäusefibroblasten mit der
Bezeichnung NIH3T3 pro Kulturplatte hinzugefügt. Die beiden von der ATCC, Rockville, MD erhältlichen Zellinien dienten als sogenannte Feeder-Zellen nach Bestrahlung mit 100 Gy. Nach 4
Wochen Kultur wurden die Kolonien mit 2% Methylenblau in 50%
Ethanol gefärbt und gezählt, wobei während der Kulturdauer das
Medium alle 2 Wochen gewechselt wurde.
f) Bestimmung der Zytokine
Die Überstände von subkonfluenten Kulturen wurden 24 Stunden nach einem vollständigen Wechsel des Nährmediums geerntet. Die Zellen wurden gezählt und die Zytokinkonzentrationen in den Überständen wurden gezählt und die Zytokinkonzentrationen in den Überständen wurden bestimmt unter Verwendung von kommerziell erhältlichen ELISA-Tests.
Beispiel 2
Die in Beispiel 1 angegebenen Versuchsbedingungen wurden unter Verwendung von verschiedenen Enzymen (Beispiel lc) durchgeführt, um die Wirksamkeit für die Erstellung von Langzeitkulturen von diploiden Fibroblasten zu ermitteln. Die besten Ergebnisse wurden erhalten, wenn die in kleine Stücke zerschnittenen Biopsieproben zunächst mit Dispase bei einer Konzentration von etwa 2,5 U/ml für 16 Stunden bei 4 °C verdaut wurden. Nach dieser Behandlung konnte die Epidermis leicht von den Zellfragmenten entfernt werden. Die Hautzellen wurden dann weiter in Stücke von wenigen mm zerkleinert. Dieses Zellmaterial wurde einer zweiten enzymatischen Behandlung mit einer Mischung von Collagenase (200 U/ml) und Hyaluronidase (300 U/ml) für 3 Stunden bei 37 °C im Wasserschüttelbad unterzogen. Schließlich wurden die Zellen durch eine Passage durch ein 70 μm Sieb aufgetrennt, gewaschen und in Zellkultur überführt.
Figur 1 zeigt eine Auftragung der Spenderzellen (Stück) gegen die Anzahl der Tage der Kultivierung, wobei die Zellen hinter/nach der Kurve das Alter des menschlichen Spenders angeben. Hieraus ergibt sich, daß diploide Fibroblastenkulturen, die mit Hilfe dieses Verfahrens von Spendern erhalten wurden, die jünger als 60 Jahre alt waren, im allgemeinen ähnliche Wachstumscharakteristiken aufwiesen mit einer mittleren
Verdopplungszeit von 4,3 ± 0,6 Tagen.
Figur 2 zeigt eine Auftragung der Spenderzellen (Stück) gegen die Anzahl der Tage der Kultivierung für menschliche Spender verschiedener Altersstufen. In der Figur bezeichnen ü eine Herstellung der Fibroblasten durch enzymatische Behandlung und Δ eine nur mechanische Zellvereinzelung. Hieraus ergibt sich, daß die mit Hilfe des enzymatischen Verfahrens hergestellten Fibroblastenkulturen eindeutig eine bessere Vermehrungskapazität hatten als diejenigen Fibroblastenkulturen, die lediglich durch eine mechanische Behandlung der Hautbiopsieproben erhalten wurden.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können diploide Fibroblastenkulturen nicht nur aus Hautzellen erhalten werden, sondern auch von Peritonealzellen. Es zeigte sich, daß die von der Serosa abgeleiteten Zellkulturen anfangs ähnlich wuchsen wie die von der Haut abgeleiteten Zellkulturen, wobei aber die von der Serosa abstammenden diploiden Fibroblasten das Plateau bei einer deutlich niedrigeren Zellzahl erreichten als die im Alter vergleichbaren diploiden Fibroblastenkulturen von Haut. Die Figur 3 zeigt einen Vergleich der Zellzahlen aufgetragen gegen die Anzahl der Tage der Kultivierung von Fibroblastenkulturen, die entweder von Haut (linkes Diagramm) oder von Serosa (rechtes Diagramm) stammen von Spendern mit einem Alter von 45 bis 59 Jahren.
Figur 4 zeigt den Einfluß von sogenannten Feeder-Zellen auf die Platierungseffizienz der diploiden Fibroblastenkulturen. Es wurden diploide Fibroblastenkulturen von Hautzellen hergestellt, die enzymatisch behandelt wurden. Ihre Platierungseffizienz wurde bestimmt, indem die Zellen in einer sehr geringen Dichte auf den Zellkulturflaschen ausgesät wurden. Während die diploiden Fibroblasten ohne Feeder-Zellen kaum irgendeine Koloniebildung unter diesen Bedingungen zeigten, konnte die Platierungseffizienz auf 9-24% durch die Zugabe von bestrahlten menschlichen Fibroblasten der Zellinie WS-1 erhöht werden. Beispiel 3 :
Besonderes Augenmerk wurde der Produktion von Zytokinen in den autologen diploiden Fibroblastenkulturen gewidmet. Hierzu wurden Kulturüberstände von nicht bestrahlten diploiden Fibroblasten entnommen und ebenso von diploiden Fibroblasten, die mit 20 bzw. 100 Gy bestrahlt wurden. Die Kulturüberstände der bestrahlten Zellen wurden am 3. und am 8. Tag nach Bestrahlung entnommen.
In den Überständen von nicht bestrahlten diploiden Fibroblasten wurden zwischen 1,2 ng und 1,4 ng Interleukin-6 pro 24 Stunden und 10 Zellen gefunden. Die Bestrahlung verursachte keine wesentlichen Änderungen bei der IL-6 Sekretion. Im Unterschied dazu produzierten die nicht bestrahlten diploiden Fibroblasten keine meßbaren Mengen an GM-CSF und bis zu 50 pg TNFα pro 24 Stunden und 10 Zellen in den Überständen nach Bestrahlung gemessen werden konnten. Diese Ergebnisse sind in Figur 5 dargestellt, wobei die Bezeichnungen HP-33, KE-58 und KP-68 verschiedenen Zellinien angeben.
Beispiel 4:
Um die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gentransfizierung von humanen Fibroblasten zu demonstrieren, wurden Vorversuche im Mausmodell durchgeführt, die nachfolgend näher erläutert werden. Die Ergebnisse aus dem Mausmodell können entsprechend auf menschliche Fibroblasten angewendet werden.
a) Vektor
Der retrovirale Basisvektor N2 leitet sich vom Genom des Moloney- Murine-Leukemia-Virus (MLV) ab und enthält das bakterielle Neomycin-Resistenzgen als Selektrionsmarker. Es wurden DNA- Fragmente kodierend für den Major Immediate Early Human CMV- Promotor, den Promotor der Adenosine-Desaminase (ADA-Promotor) , das Poly-A-Signal und das Mäuse-GM-CSF hub verschiedene Stellen des N2-Vektors kloniert. Das Konstrukt N2-Vektor/CMV- Promotor/Mäuse-GM-CSF in verschiedene Stellen des N2-Vektors kloniert. Das Konstrukt N2-Vektor/CMV-Promotor/Mäuse-GM-CSF wurde durch das Klonieren des CMV-GM-CSF-Fusionsprodukts in eine Xho I Restriktionsstelle des Neomycinresistenzgens in dem N2-Vektor hergestellt (Fig. 6, oben) .
Um den retroviralen Vektor DC/AD/R/GM-CSF herzustellen (Fig. 6, unten) , wurde der ADA-Promotor in umgekehrter Orientierung in eine mit dem Klenow-Fragment aufgefüllte
Restriktionsschnittstelle des Enzyms Mlu 1 kloniert. Die Mäuse- GM-CSF cDNA wurde ebenfalls in reverser Orientierung in eine durch das Restriktionsenzym SnaB 1 erzeugte Schnittstelle kloniert und das Poly-A-Signal in eine mit Klenow aufgefüllte Apa I Stelle in den 3'LTR Polylinker. Durch Elektroporation der Vektor-DNA in eine helferfreie echotrope Verpackungszellinie (GP + E-86) wurden die retroviralen Vektoren in die korrespondierenden Viren umgewandelt. Nach G418-Selektion (0,7 mg/ml Genticin, Gibco Labor, Grand Island, NY) wurden Kolonien isoliert und zu Producer-Zellinien expandiert. Zellfreier Überstand wurde zur Titerbestimmung des Virus auf NIH 3T3 Zellen getestet.
Figur 6 zeigt die Struktur der verwendeten retroviralen Vektoren.
b) Zellinien und Infektion der Tumorzellen und Fibroblasten
CMS5 ist ein methylcholantreninduziertes, nicht meta¬ stasisches Fibrosarkom aus BALB/c-genetischem Hintergrund. NIH 3T3 ist eine kontaktinhibierte Fibroblastenzellinie, die von NIH Swiss Maus-Embryonen etabliert wurde (CRL 1658) . BALB 3T3 Klon A31 sind kontaktinhibierte, nicht tumorogene Fibroblasten etabliert von BALB/c-Mäuseembryonen (CCL 163) . Beide Fibroblastenzellinien wurden von ATCC erworben. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium kultiviert, supplementiert mit 10% fötalem Kälberserum, 100 U/ml Penicillin, 100 n3g/ml Streptomycin und 2 mmol/1 L-Glutamin. Virus-producer-Zellinien, die hohe Titer des Virus sezerniert haben, wurden zur Infektion der CMS5-Zellen und der Fibroblastenzellen eingesetzt. Klone oder auch bulk- infizierte Zellen wurden nach G418-Selektion zu Linien expandiert und weiter analysiert.
c) Zytokinbestimmung
Es wurde die Sekretion von GM-CSF in den Überstand von retroviral infizierten CMS5-Zellen und Fibroblasten und die GM- CSF-Serumkonzentration behandelter Mäuse durch einen Bioassay bestimmt und mit Hilfe eines ELISA-Tests bestätigt. Der Überstand von se ikonfluenten parenteralen oder GM-CSF-sezernierenden Zellen wurde nach 24 Stunden gesammelt, die Zellzahl bestimmt und der Überstand hinsichtlich der Produktion von Mäuse-GM- CSF untersucht.
Es wurden jeweils 106 mit 50 Gy bestrahlte CMS5-Zellen oder mit dem Vektor N2/CMV/GM-CSF/CMS5 transfizierte Zellen untersucht. Die Zellen wurden am Tag der Bestrahlung in kleine Gewebekulturflaschen platiert und am 3., 6., 9. und 12. Tag nach der Bestrahlung wurde die GM-CSF Menge im 24 Stunden- Kulturüberstand bestimmt.
Die biologische Aktivität des zu untersuchenden GM-CSF wurde bestimmt durch Ermittlung der Fähigkeit der GM-CSF enthaltenden
Überstände, eine 3H-Thymidininkorporation in die DNA von GM-CSF abhängigen Mäuse 32DC13-Zellen zu induzieren. Nachdem die
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Zellen ohne GM-CSF über Nacht inkubiert wurden, wurden 10 Zellen pro Loch einer Mikrotiterplatte mit 96 Löchern inkubiert mit Verdünnungen der Testflüssigkeiten und die Zellen wurden 6 Stunden bei 37 °C und 6% C02 kultiviert. Hierauf wurde 1 μCi von zugegeben und die Inkubation wurde weitere 15 o
Stunden bei 37 C fortgeführt. Nach Waschen wurden die Zellen mit Hilfe eines Flüssig-Szintillationszählers ausgewertet. Die GM- CSF-Aktivität wurde als counts per minute (cpm) ausgedrückt und es wurde die Produktion in ng pro 24 Stunden von 10 Zellen berechnet durch Vergleich mit einer Standardkurve von rekombinantem Mäuse-GM-CSF. Darüber hinaus wurde die GM-CSF- Produktion mittels eines ELISA-Tests bestätigt.
Um eine weitere Proliferation wachstumsfaktorproduzierender autologer oder allogener Zellen nach Injektion in vivo zu verhindern, bietet sich die Bestrahlung dieser Zellen an. Es wurden daher GM-CSF-sezernierende Zellen zunächst mit 50 Gy bestrahlt und die GM-CSF-Sekretion bis zu 12 Tage nach Bestrahlung bestimmt. In Abbildung 7 ist zu sehen, daß zunächst die GM-CSF-Produktion nach Bestrahlung erhöht wurde.
Während vor Bestrahlung etwa 40 ng/106 Zellen/24 Stunden gemessen wurden, liegen am 3. und 6. Tag nach Bestrahlung die Werte bei etwa 130 ng/106 Zellen/24 Stunden. Am 9. Tag fallen die Werte auf die vor Bestrahlung erhaltenen Werte ab und am 12. Tag nach Bestrahlung ist die GM-CSF-Produktion/24 Stunden bei etwa einem Drittel des Ausgangswerts. Da die Zahl der überlebenden Zellen bereits am 6. Tag auf ein Zehntel des Ausgangswerts abgefallen ist, wird deutlich, daß aus bereits nicht mehr vitalen Zellen weiterhin GM-CSF freigesetzt wird.
d) Übertragung der gentransfizierten Zellen in Mäuse Für die Experimente wurden weibliche BALB/c-Mäuse, die 7-10 Wochen alt waren, eingesetzt. Am Tag 0 und am Tag 2 erhielten alle Mäuse 150 mg/kg Cyclophosphamid intraperitoneal appliziert. Ein Teil der Mäuse erhielt keine weiteren Injektionen, ein zweiter Teil wurde am Tag 3 zweimal täglich mit 100 ng rekombinant hergestelltem Mäuse-GM-CSF subkutan injiziert.
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Die letzte Gruppe erhielt am Tag 3 insgesamt 10 mit 50 Gy bestrahlte N2/CMV/GM-CSF-CMS5-Zellen an 2 Stellen subkutan injiziert. Ab dem viertem Tag wurde täglich Blut aus den Schwanzvenen der Mäuse in heparinisierte Eppendorf-Gefäße überführt. Die Anzahl der Leukozyten wurde nach Lysieren der Erythrozyten in einer Neubauer-Zellkammer bestimmt. Alle zwei Tage wurden Differentialblutbilder angefertigt und nach Färbung mit May-Grünwald-Gie sa das Differentialblutbild bestimmt. Serumwerte von Mäuse-GM-CSF wurden am Tag 1, 4 und 10 nach Injektion der bestrahlten GM-CSF-sezernierenden Fibrosarkomzellen bestimmt.
Beispiel 5
Weibliche BALB/c-Mäuse wurden wie in Beispiel 4d beschrieben behandelt. Ab dem 3. Tag wurden täglich die peripheren Leukozytenzahlen ermittelt und alle 2 Tage wurde ein Differentialblutbild angefertigt. Die Basisleukozytenzahlen in diesen Mäusestämmen liegen bei etwa 9.000 bis 10.000 Leukozyten/ml. Durch die Applikation von Cyclophosphamid sind die Leukozyten am 3. Tag auf etwa 1.000 bis 1.500
Leukozyten/μl abgefallen. Bis zum 6. Tag nach der Injektion von Cyclophosphamid zeigten sich keine großen Änderungen der Leukozytenwerte. Alle Behandlungsgruppen liegen bei etwa gleichen Werten. Ab dem 7. Tag zeigt sich ein Unterschied in der absoluten Leukozytenzahl zwischen den GM-CSF behandelten Mäusen und den nur mit Cyclophosphamid injizierten Kontrollmäusen. Die Werte in den mit Wachstumsfaktor behandelten Tieren nach subkutaner Injektion oder einmaliger Injektion von GM-CSF- sezernierenden autologen Zellen liegen etwa doppelt so hoch wie bei den Kontrollmäusen am 7. und 8. Tag nach Beginn der Behandlung. Die mit rekombinantem Wachstumsfaktor behandelten Gruppen, wie die mit GM-CSFsezernierenden Fibrosarkomzellen behandelten Tiere erreichen die normalen Leukozytenwerte am 8. Tag nach der Cyclophosphamidinjektion. Dagegen liegen die Kontrollmäuse noch bei halbnormalen Werten. In Figur 8 ist das Differentialblutbild der verschiedenen Behandlungsgruppen als absolute Leukozytensubpopulationen (Monozyten, Granulozyten und Lymphozyten) angegeben. Bei unbehandelten BALB/c-Mäusen sind im Differentialblutbild etwa 1%.Monozyten, 15-30% Granulozyten und 70-85% Lymphozyten vorhanden. Am 5. Tag nach Beginn der Cyclophosphamidbehandlung, also in der Phase der absoluten Neutropenie, sind bei allen Behandlungsgruppen im Differentialblutbild fast ausschließlich Lymphozyten zu finden. Am 7. Tag, an dem die absoluten Leukozytenwerte der' mit rekombinantem GM-CSF und mit GM-CSF-sezernierenden Zellen behandelten Mäuse etwa doppelt so hoch wie bei den nur mit Cyclophosphamid behandelten Tieren liegt, ist auch ein deutlicher Unterschied im Differentialblutbild festzustellen. Die nicht mit Wachstumsfaktor behandelten Tiere haben nur etwa 15% der Monozyten und 25% der Granulozyten der subkutan mit GM-CSF oder mit GM-CSF-sezernierenden Fibroblasten behandelten Mäuse, die bereits normale absolute Granulozyten zahlen erreicht haben. Es sind keine Unterschiede bei den absoluten Lymphozytenwerten zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen festzustellen.
Figur 8 zeigt also, daß bereits eine einmalige Injektion bestrahlter gentransfizierter autologer Zellen biologische Effekte auf das Blutbild von chemotherapiebehandelten Mäusen zeigt. Beispiel 6
In Figur 9 wird die Anzahl der Leukozyten, die sich im Verlauf der Zeit ändert, dargestellt. Die Mäuse wurden jeweils mit Cyclophosphamid behandelt. Eine Kontrollgruppe erhielt kein GM- CSF. Bei einer weiteren Kontrollgruppe wurde rekombinant hergestelltes GM-CSF subkutan injiziert. Bei der dritten Gruppe wurden gentransfizierte Zellen subkutan appliziert, die GM-CSF produzierten.
Beispiel 7:
Selektive Abtötung gentransfizierter Zellen in vivo.
Hier wurden murine CMS-Fibrosarkomzellen mit 2 verschiedenen
Konstrukten transfiziert:
1. pCMV.GCSF.iresNEO enthält unter Kontrolle des CMV-Promotors das humane G-CSF-Gen sowie über eine IRES (internal ribosomal entry site) das Neomycinresistenzgen. Hier sollen also G-CSF- und Neomycinphosphotransferase exprimiert werden.
2. pCMV.GCSF.iresTK/NEO enthält unter Kontrolle des CMV-Promotors das G-CSF-Gen sowie über eine IRES ein Herpes simplex Virus Thymidinkinase-Neomycinresistenzfusionsgen. Hier sollen neben G- CSF und Neomycinphosphotransferase noch die TK exprimiert werden und somit nach Gabe von Gancyclovir diese Prodrug phosphoryliert und aktiviert werden.
Figur 10 zeigt auf der linken Seite eine Auftragung der Anzahl an Leukozyten als Stück pro nl (n nl) gegen die Zeit (in Tagen) nach der subkutanen Tumorinokulation von 2.5 x 10 unbestrahlten CMS- 5-Zellen des vorgenannten Konstrukts 1 (ganz links) und des Konstrukts 2 (Mitte) bei 3 BALB-c-Mäusen. Auf den Diagrammen links unten und links mitte ist der zeitliche Verlauf der Leukozytenentwicklung nach der Tumσrinokulation zu sehen, wobei dort zusätzlich die Prodrug Gancyclovir zweimal täglich i.p. gegeben worden ist. Auf der rechten Seite von Figur 10 ist für die gleichen Konstrukte wiederum bei drei BALB-c-Testmäusen die zeitliche Entwicklung (in Tagen) der Tumorgröße (mm) angegeben.
Die zwei Gruppen von BALB-c-Mäusen wurden mit je 2,5 x 10 unbestrahlten CMS-5-Zellen subkutan injiziert, die mit obengenannten Vektoren transfiziert worden waren. Jeweils eine Gruppe der Mäuse erhielt von dem dritten Tage (D4) an zweimal täglich Gancyclovir {GCV) i.p. (siehe Figur 10, jeweils die vier unteren Diagramme) . Die Leukozytenwerte und die Entwicklung von Tumoren wurden beobachtet. Die Versuchsgruppe, die mit GCV behandelt und CMS-5-Zellen transfiziert mit p.CMV.GCSF.iresTK/NEO erhalten hat, zeigt einen Abfall der Leukozyten sowie eine Regression des Tumors (siehe Figur 10, Mitte unten, sowie rechts unten) . Dies zeigt, daß selbst TK-gentransfizierte Tumorzellen in vivo selektiv über den Mechanismus der „Suizidgen"-Expression abgeschaltet werden können. Nebenwirkungen wurden in den Mäusen nicht beobachtet, die Mäuse sind auch 5 Wochen nach dem Ende der GCV-Gabe tumorfrei.
Beispiel 8:
Rekonstitution der Hämatopoiese nach einmaliger subkutaner Injektion von GCSF-gentransfizierten Fibroblasten. (Transfektion von Fibroblasten mittels physikalischer Gentransfermethoden, hier der Lipofektion, hier dargestellt am humanen G-CSF) .
Figur 11 zeigt eine Auftragung der Anzahl an Leukozyten (WBC/μl) gegen die Zeit nach der Injektion (in Tagen) nach der Chemotherapie und der Cytokintherapie in An/Abwesenheit transfizierter Fibroblasten. Auf der linken Seite sieht man den zeitlichen Verlauf bei alleiniger Zugabe von Cyclophosphamid in der Mitte links, den entsprechenden zeitlichen Verlauf bei der Zugabe von Cyclophosphamid plus 2 mal täglich subkutaner Gabe des rekombinanten humanen G-CF, im folgenden kurz rhG-CSF genannt. Auf dem Diagramm Mitte rechts ist der zeitliche Verlauf der Leukozytenentwicklung nach Zugabe von Cyclophosphamid und der einmaligen Injektion 5 x 10 G-CSF-gentransfizierter BALB-3T3- Fibroblasten zu sehen, und auf der rechten Seite ist der zeitliche Verlauf der Leukozytenentwicklung nach der Zugabe von Cyclophosphamid und der einmaligen Injektion 5 x 10 bestrahlter G-CSF-gentransfizierter B.ALB-3T3-Fibroblasten. In dieser Grafik stellen die mit einem Viereck, einer Raute und einem Punkt gekennzeichneten Kurven die Entwicklung der Leukozytgehalte der drei eingesetzten Testmäuse dar. Aus den drei Grafiken ergibt sich, daß die Regeneration der Leukozyten in den Gruppen mit einmaliger Injektion der transfizierten Fibroblasten (Mitte rechts sowie rechts) mindestens ebenso rasch erfolgt wie bei zweimaliger täglicher subkutaner Injektion des rekombinanten Proteins (Mitte links) .
Die nachfolgende Tabelle zeigt die Wirkung der GCSF-Applikation auf die Mobilisierung von hämatopoietischen Stammzellen in das periphere Blut. Dort erfolgt eine Gegenüberstellung des Tages, an dem alle Mäuse der Gruppe (je drei Mäuse pro Gruppe) mindestens 3500 Einheiten pro μl Leukozyten aufwiesen und die entsprechenden Werte des darauf folgenden Tages. Weiter ist dort die Anzahl der Colony Forming Cells, d. h. der Zellen, die Auskunft über die Anzahl von hämatopoetischen Stammzellen liefert, im folgenden kurz CFU genannt, sowie der Wert der CFU zu Leukozyten in den vier verschiedenen Behandlungsgruppen genannt. Man sieht, daß eine einmalige Injektion unbestrahlter sowie auch bestrahlter G- CSF-gentransfizierter Fibroblasten eine Mobilisierung der hämatopoetischen Stammzellen ins periphere Blut ermöglicht, die vergleichbar ist mit der zweimal täglichen Subkutaninjektion des rhG-CSF. Dies ist klinisch interessant, da bei der Stammzelltransplantation, die nach hochdosierter Chemotherapie bei Patienten mit unterschiedlichen Tumoren eingesetzt wird, diese Stammzellen beispielsweise durch Leukopherese gesammelt werden müssen. Derzeit erhalten die Patienten nach einer niedrig dosierten Chemotherapie hierzu über mehrere Tage (wie im vorstehenden Tiermodell erörtert) subkutan G-CSF.
Diese parenterale Applikationsform ist aber nicht nur technisch aufwendig, sondern auch viel teurer. Es wäre daher wünschenswert, die häufigen Subkutaninjektionen durch eine einmalige Injektion zu ersetzen.
day x day x+ l
Leukocytes ± SE CFU/ul ± SE CFU/Leukocytes ± SE Leukocytes ± SE CFU/ul ± SE CFU/Leukocytes ± SE
Cyclophosphamid 5533 ± 348 18 ± 3,8 0,333 ± 0,109 6067 ± 354 4 ± 1 ,3 0,060 ± 0,016
+ G-CSF s.c. 6500 ± 1021 35 ± 4,5 0,600 ±0,081 16767 ± 1573 66 ± 13,9 0,400 ± 0,047
+ G-CSF/BΛLB s.c. 4183 ± 261 10 ± 4,7 0,200 ± 0,081 9700 ± 1510 46 ± 9,6 0,467 ± 0,027
+ irrad. G-CSF/BΛLB s.c. 7483 ± 1204 29 ± 1,9 0,400 ± 0,047 12800 ± 1746 90 ± 8,0 0,733 ± 0,072
Effekt der G-CSF Applikation auf die Mobilisierung von hämatopoietischen/Stammzellen in das periphere Blut.
Cyclophosphamid: dO + d2 (i.p. 150 mg/kg)
+ G-CSF: Cyclophosphamid + rhG-CSF d3 - d7 (s.c, 125 ug/kg 2 x tgl.)
+ G-CSF/BΛLB: Cyclophosphamid + hG-CSF Gen lipofektierte BALB 3T3, d3 (s.c, 5 x 106)
+ irrad. G-CSF/BΛLB: Cyclophosphamid + bestrahlte (50 Gy) hG-CSF Gen lipofektierte BALB 3T3, d3 (s.c, 5 x 10")
% Die Werte sind jeweils ± Standardfehler angegeben.
CD ro day x: Tag an dem alle Mäuse der Gruppe (je 3 Mäuse/Gruppe) mindestens 3500/ul Leukozyten aufwiesen.
ZX3 m
CD
SS

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von klonogenen Fibroblasten, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Spender Gewebe entnimmt und die Zellen aus dem Gewebe vereinzelt, die so entstandene Zellsuspension siebt, die in der Zellsuspension enthaltenen Zellen wäscht und die Zellen in eine Gewebekultur überführt, ausgenommen eine Vereinzelung von Zellen durch mechanische Zerkleinerung gefolgt von einer enzymatischen Behandlung mit ausschließlich Kollagenase.
2. Verfahren nach .Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gewebe dem Spender im Rahmen einer Biopsie aus der Haut entnommen wird.
3. Verfahren nach vorstehenden .Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen humane oder xenogene Zellen sind.
4. Verfahren nach .Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß bei der enzymatischen Behandlung Kollagenase, Dispase und / oder Hyaluronidase eingesetzt wird.
5. Verfahren nach vorstehenden Ansprüchen, dadurch gekennzeichnet, daß die Fibroblasten in Gegenwart von bestrahlten humanen oder murinen Fibroblasten als „Feeder"- Zellen angezogen werden.
6. Klonogene Fibroblasten, erhältlich nach dem Verfahren nach .Ansprüchen 1 bis 5.
7. Fibroblasten nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um diploide Fibroblasten handelt.
8. Verfahren zur Transfektion von Fibroblasten, dadurch gekennzeichnet, daß durch die Transfektion in die Fibroblasten wenigstens ein Gen eingeschleust wird, daß für ein biologisch aktives Protein, vorzugsweise therapeutisch aktives Protein, beispielsweise einen Wachstumsfaktor, ein Hormon, ein Enzym, einen Gerinnungsfaktor oder Gerinnungsinhibitor codiert.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Wachstumsfaktor um einen hämatopoietischen Wachstumsfaktor handelt.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, neben dem therapeutischen Gen ein Suizidgen, beispielsweise das Herpes Simplex Virus Thymidinkinase-Gen eingeschleust wird.
11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet daß das therapeutische Gen über einen induzierbaren Promotor exprimiert wird.
12. Verfahren nach Ansprüchen 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Transfektion mit einem Vektor bewirkt wird, der auf Adenoviren oder Rezeptor ediierten Gentransfer zurückzuführen ist.
13. Verfahren nach Anspruch 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet , daß die Transfektion mittels physikalischer Gentransferverfahren durchgeführt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das physikalische Gentransferverfahren die Elektroporation, die Mikroinjektion, das Partikel-Bombardement oder die Lipofektion ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß zur Transfektion Fibroblasten nach Anspruch 6 oder 7 eingesetzt wird.
16. Gentransfizierte Fibroblasten, erhältlich nach irgendeinem der Ansprüche 8 bis 15.
17. Gentransfizierte Fibroblasten nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es klonale Fibroblasten sind.
18. Gentransfizierte Fibroblasten nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß diese bestrahlt werden.
19. Gentransfizierte Fibroblasten als Arzneimittel, insbesondere zur in vivo Behandlung.
20. Verwendung von gentransfizierten Fibroblasten nach Anspruch 19 zur Mobilisierung von hämatopoietischen Stammzellen.
21. Träger aus biokompatiblen vorzugsweise in Endoprothesen verwendbaren Material, enthaltend gentransfizierte Fibroblasten nach Ansprüchen 16 bis 18.
22. Träger nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Endoprothese eine Gefäßprothese, aus einem biokompatiblen, vorzugsweise humankompatiblen synthetischen Material, beispielsweise Fluorpolymeren wie Teflon oder einen Polyester wie Dakron ist, und die gentransfizierten Fibroblasten in vivo mit dieser Prothese implantiert werden.
23. Träger nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Endoprothese eine Gefäßprothese aus einem biokompatiblen, vorzugsweise humankompatiblen aus natürlichen Quellen stammenden Material beispielsweise einem Kollagenvlies oder einem aus bovinem Pericard gewonnenem Material ist, und die gentransfizierten Fibroblasten in vivo mit dieser Prothese implantiert werden.
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