DE69836853T2

DE69836853T2 - Etablierte Mikrogliazellen

Info

Publication number: DE69836853T2
Application number: DE69836853T
Authority: DE
Inventors: Makoto Sawada
Original assignee: Japan Science and Technology Agency
Current assignee: Japan Science and Technology Agency
Priority date: 1997-03-05
Filing date: 1998-03-05
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2018-03-06
Also published as: US6673605B2; US20060233769A1; DE69836853D1; US20040072346A1; EP0949331A1; JP3410738B2; WO1998039415A1; EP0949331A4; US20020115206A1; EP0949331B1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine subkultivierbare etablierte Zelllinie der Mikroglia, ein Verfahren zur Abtrennung derselben und ihre Verwendung als einem pharmazeutischen Träger.
Außerdem wird eine Mikroglia-Zelllinie, in die ein fremdes Gen oder ein Medikament eingeführt wurde, ein Verfahren zu seiner Einführung und eine die Zelllinie umfassende pharmazeutische Zusammensetzung beschrieben.
Hintergrund der Erfindung
Es gibt eine große Anzahl von Erbkrankheiten des Nervensystems, deren Ursachen verschiedene kausale Faktoren sind, zum Beispiel ein Defekt eines einzigen Enzyms, etc., oder deren Ursachen unbekannt sind. Unter diesen Umständen wird eine ergänzende Therapie angewandt, um eine große Anzahl derartiger Krankheiten zu bekämpfen.
Weltweit sind zahlreiche Studien über Systeme für eine selektive Beförderung in das Gehirn durchgeführt worden. Für die Einführung eines Gens in das Gehirn eines Tieres ist ein Verfahren zur Verwendung neuronphiler Viren, wie Adenovirus-Vektoren, entwickelt worden, und ein System zur spezifischen Einführung eines Gens in Neurone ist bekannt (Kozarsky, K. F. und Wilson, J. M., Curr. Opin. Genet. Dev. 3, 499–503, 1993). Ein Verfahren zur Verwendung eines Retrovirus-Vektors ist ebenfalls entwickelt worden und ist für die Einführung eines Gens in Leberzellen, Blutzellen, etc. erfolgreich angewandt worden (Mulligan, R. C., Science 260, 926–932, 1993).
Im Gehirn jedoch ist die Blut-Hirn-Schranke vorhanden, so dass es schwierig ist, eine ergänzende Therapie durchzuführen und ein wirksames Medikament einzuführen, wobei selbst dann, wenn eine Substanz (z.B. Antikrebs-Medikament, DNA, etc.) von einer peripheren Position eingeführt wird, sie nicht spezifisch in das Gehirn eingeführt werden kann. Deshalb gab es kein anderes Verfahren als eine direkte Injektion der Substanz mit Hilfe chirurgischer Eingriffe.
Als ein Verfahren, das keine invasiven Mittel, wie beispielsweise chirurgische Eingriffe, umfasst, besteht ein Verfahren unter Verwendung von Liposomen, und Liposomen, denen die Fähigkeit verliehen worden ist, relativ einfach in das Gehirn durch Änderung ihrer konstitutiven Elemente zu gelangen, sind von einer japanischen Gruppe entwickelt worden. Allerdings ist selbst auch bei diesem Verfahren die Einführung von Liposomen in das Gehirn mit etwa 1 %, bezogen auf die injizierte Menge, gering, weshalb von diesem Verfahren nicht behauptet werden kann, dass es für das Gehirn spezifisch ist.
Wie oben beschrieben, gibt es im Gehirn eine Blut-Hirn-Schranke, so dass in das Gehirn fast keine Infiltration von Zellen oder einer Substanz aus der Peripherie erfolgt, was es folglich schwierig macht, ein Medikament oder ein Gen in das Gehirn einzuführen. In der Tat ist eine Infiltration des normalen Gehirns mit Immunozyten, wie beispielsweise T-Zellen und Makrophagen, kaum zu beobachten.
Mikroglia sind Zellen mit Makrophagen-artigen Eigenschaften im Zentralnervensystem, die nicht nur als immunkompetente Zellen bei inflammatorischen Reaktionen und viralen Infektionen und als Phagozyten für die Beseitigung von Zellen fungieren, sondern ebenfalls eine zentrale Rolle in einem Zytokin-Netzwerk im Zentralnervensystem spielen (Sawada, M. et al., Int. J. Dev. Neurosci., 13, 253–264, 1995). Vor kurzem ist gezeigt worden, dass die Mikroglia-Zellen für die Expression höherer Gehirnfunktionen, wie beispielsweise Lernen und Gedächtnisbildung, essentiell sind und als spezialisierte Zellen betrachtet werden, die eine für das Gehirn spezifische Rolle besitzen. Bis jetzt ist vermutet worden, dass Mikroglia-Zellen von Monozyten abstammen, die in der perinatalen Periode in das Gehirn infiltrieren und spezialisiert sowie differenziert sind.
Die Mikroglia-Zellen können mittels Primärkultur aus Gehirnzellen gewonnen werden. Für diese Primärkultur sollte allerdings das Gehirn entnommen und für eine Verwendung gereinigt werden, wobei eine Primärkultur normalerweise einen Zeitraum von ungefähr 2 Wochen erfordert, so dass diese Verfahren zeitraubend sind. Außerdem sind die Zellen während der Kultivierung schwierig zu vermehren und schwer in Subkultur zu halten, so dass es nach der Primärkultur extrem schwierig ist, ein Gen in die Mikroglia-Zellen einzuführen, um es darin zu exprimieren.
Im Verlauf von Untersuchungen über Mikroglia-Zellen, die als Gehirn-spezifische Makrophagen betrachtet werden, waren die Erfinder bei der Gewinnung hochreiner Mikroglia erfolgreich und haben deren Eigenschaften untersucht und als ein Ergebnis festgestellt, dass, anders als die Makrophagen, Mikroglia-Zellen eine spezifische Affinität für das Gehirn besitzen.
Außerdem haben die Erfinder festgestellt, dass Mikroglia-Zellen sich entscheidend von Makrophagen hinsichtlich der Affinität für das Gehirn und der Fähigkeit, das Gehirn zu infiltrieren, unterscheiden. Außerdem untersuchten die Erfinder mittels Färbung die Verteilung der Zellen mittels eines Verfahrens, mit dem die beiden unterschieden werden können, und stellten fest, dass Mikroglia-Zellen von einem frühen Entwicklungsstadium an im Gehirn vorhanden sind. Dementsprechend wird vermutet, dass Mikroglia-Zellen nicht von einer im Knochenmark differenzierten und gereiften Monozyte abstammt, sondern von einer Zellgruppe abstammt, die eine spezifische Affinität für das Gehirn besitzt und das Gehirn in einem frühen Entwicklungsstadium infiltriert und der Regulation höherer Funktionen, wie beispielsweise zerebrale Morphogenese, Lernen und Gedächtnisbildung dient.
Dementsprechend injizierten die Erfinder einen isolierten Makrophagen und Mikroglia-Zellen in periphere Arterien einer Ratte, um die zwei auf eine selektive Affinität für das Gehirn zu vergleichen, und als ein Ergebnis haben sie festgestellt, dass, wenn die mit einem fluoreszierenden Pigment markierten Mikroglia-Zellen injiziert waren, viele fluoreszierende Zellen im Gehirn, aber kaum in der Leber festzustellen waren. Wenn andererseits die Makrophagen injiziert waren, wurden kaum fluoreszierende Zellen in den normalen Zellen beobachtet, aber viele fluoreszierende Zellen wurden in der Leber beobachtet.
Dann untersuchten die Erfinder, ob eine Mikroglia-Zelle des von den Erfindern etablierten Stammes ein Gen selektiv im Gehirn exprimieren kann, indem sie einen lacZ-Expressionsvektor in die Zelllinie einführten und die resultierenden Zellen in den Blutstrom einer Ratte injizierten, und als ein Ergebnis konnten die Erfinder die β-Galactosidase-Aktivität in einem Schnitt des Gehirns der Ratte detektieren, in die die lacZ exprimierenden Zellen injiziert worden waren. Mit Hilfe dieser Ergebnisse wurde festgestellt, dass die Mikroglia-Zelle anders als Makrophagen eine Zelle ist, die eine spezifische Affinität für das Gehirn besitzt und mit Hilfe dieser Affinität eine spezifische Substanz oder Gen über einen peripheren Blutstrom in das Gehirn eingeführt werden kann.
Offenbarung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine etablierte Zelllinie der Mikroglia mit einer spezifischen Affinität für das Gehirn und der Fähigkeit zur Phagozytose, und mit der Fähigkeit zum Zellwachstum in Abhängigkeit vom Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), dadurch gekennzeichnet, dass die Zelllinie in Gegenwart von GM-CSF subkultivierbar ist und eine im Wesentlichen Makrophagen-artige oder globuläre Form in Gegenwart von GM-CSF und eine verzweigte Form ähnlich der verzweigten Mikroglia im Gehirn in Abwesenheit von GM-CSF aufweist.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Produzieren der etablierten Zelllinie der Mikroglia, welches den Schritt des Klonierens einer Zelllinie der Mikroglia aus gereinigter Mikroglia durch die Zellkultur in Gegenwart von GM-CSF umfasst.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend die etablierte Zelllinie der Mikroglia.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung die pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung einer zerebralen Erkrankung.
Es wird außerdem ein Verfahren zum Abtrennen einer subkultivierbaren etablierten Zelllinie der Mikroglia von Mikroglia-Zellen in Gegenwart eines Zytokins, bevorzugt in Gegenwart von Kolonie-stimulierendem Faktor (CSF), bevorzugter in Gegenwart von Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierendem Faktor (GM-CSF), noch bevorzugter in Gegenwart von IL-3 und/oder gereinigten Astrozyten, beschrieben.
Darüber hinaus wird ein pharmazeutischer Träger beschrieben, der die oben beschriebene etablierte Zelllinie der Mikroglia umfasst.
Außerdem wird die oben beschriebene etablierte Zelllinie der Mikroglia mit einem darin eingefügten Gen oder Medikament beschrieben.
Weiterhin wird eine pharmazeutische Zusammensetzung beschrieben, die die oben beschriebene Mikroglia mit einem darin eingefügten Gen oder Medikament und einen pharmazeutischen Träger umfasst, und insbesondere eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Agens für eine Behandlung zerebraler Erkrankung ist.
Außerdem wird ein Verfahren zum Durchmustern oder Produzieren einer Mikroglia-Zelle mit einem darin eingeführten fremden Gen, umfassend das Einführen eines fremden Gens und eines ein fluoreszierendes Protein produzierenden Gens, bevorzugt ein von einer Qualle abstammendes Gen, in eine Mikroglia-Zelle beschrieben. Als die Mikroglia kann ebenfalls eine herkömmliche Mikroglia verwendet werden, aber die oben beschriebene Zelllinie der Mikroglia wird bevorzugt verwendet.
Noch weiter wird die Verwendung der oben beschriebenen pharmazeutischen Zusammensetzung beschrieben, um ein Medikament oder ein Gen spezifisch zum Gehirn zu befördern.
Die Erfindung ist unten detaillierter beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Foto, welches die Form der etablierten Zelllinie der Mikroglia der vorliegenden Erfindung (Morphologie der Zellen) zeigt.
2 ist ein Foto, welches den Unterschied in der Gewebespezifität zwischen der etablierten Zelllinie der Mikroglia der vorliegenden Erfindung und den Makrophagen (Morphologie der Zellen) zeigt.
3 zeigt eine Elektrophorese, die eine Zytokinexpression durch Stimulation mit Lipopolysacchariden zeigt.
4 zeigt eine GM-CSF-abhängige Proliferation der etablierten Zelllinie der Mikroglia der vorliegenden Erfindung.
5 ist ein Foto, welches die Expression in einem Rattengehirn (Morphologie der Zellen) zeigt.
6 zeigt die Genexpression in einem Rattengehirn.
7 zeigt das Ergebnis einer FACS-Analyse von Zellen, in die kein Gen eingeführt war.
8 zeigt ein Ergebnis einer FACS-Analyse von Zellen, in die GFP eingeführt war.
Primäre Ausführungsform der Erfindung
Die etablierte Zelllinie der Mikroglia der vorliegenden Erfindung kann von Gehirnzellen der Maus oder Ratte nach Primärkultivierung gereinigt werden und dann mit den folgenden Mitteln von diesen gereinigten Mikroglia-Zellen abgetrennt werden. Weil die etablierte Zelllinie der Mikroglia der vorliegenden Erfindung leicht handhabbar ist und eine Affinität für das Gehirn besitzt, kann zusätzlich ein Gen oder Medikament in die etablierte Zelllinie der Mikroglia eingeführt werden und in periphere Blut gefäße injiziert werden, um das Gen im Gehirn zu exprimieren oder um das Medikament spezifisch in das Gehirn zu befördern.
Das Verfahren zur Herstellung der etablierten Zelllinie der Mikroglia der vorliegenden Erfindung wird unten detaillierter beschrieben.
(1) Aufreinigung der Mikroglia
Zuerst werden die Hirnhäute von den gesammelten Maus- oder Rattengehirnen entfernt und mit Hilfe einer Pipette, eines Nylonnetzes etc. in Einzelzellen zerteilt. Die Maus und Ratte sind vorzugsweise neugeborene Tiere. Die Maus umfasst, ist aber hierauf nicht beschränkt C57BL6, C3H, ICR, Balb/c etc., und die Ratte umfasst, ist aber hierauf nicht beschränkt, Fisher, Wister, SD etc.
Die resultierenden Zellen werden auf üblichen Tierzellkulturmedium (z.B. 10 % FCS oder CS-haltiges EMEM) ausplattiert und 10 bis 14 Tage kultiviert. Das Medium wurde alle 3 bis 4 Tage gegen frisches Medium ausgetauscht.
Dann werden die so erhaltenen, kultivierten Zellen selektiert, um eine etablierte Zelllinie im nachfolgenden Schritt zu präparieren.
Es gibt als Typ I und Typ II bezeichnete Mikroglia, wobei Typ I lose Zellen sind, die aus dem Kulturgefäß nach mechanischer Stimulation (das heißt durch Bespritzen der Zellen mit Medium mit Hilfe einer Pipette, durch Schütteln des Kulturgefäßes, etc.) nach der Primärkultur entfernt werden. Typ II sind Zellen (adhärente Zellen), die durch diese mechanische Stimulation nicht abgelöst werden. Da die Mikroglia der vorliegenden Erfindung zum Typ II gehören, können gereinigte Mikroglia auf folgende Art und Weise selektiert werden.
Die adhärenten Zellen, die sich durch die obige mechanische Stimulation nicht lösen, werden mit Trypsin-EDTA behandelt, dann in Einzelzellen geteilt, auf einer unbehandelten Plastikschale (einem unbeschichteten Plastikgefäß) ausplattiert, und dürfen darauf haften. Im allgemeinen wird ein herkömmliches Kulturgefäß mit Chemikalien behandelt, so dass es positiv geladen ist, aber es sollte keine derart behandelte Schale verwendet werden, um die adhärenten Zellen zu erhalten. Nach 1 Stunde Inkubation in einem CO₂-Inkubator bei 37 °C werden Zellen, die sich nach der mechanischen Stimulation lösen, entfernt und Zellen, die am Gefäß zur Proliferation fähig sind, werden mit einem „Gummischaber", etc. abgelöst, und das gleiche Verfahren wird zweimal wiederholt, um Zellen zu erhalten, die zur Etablierung einer Zelllinie der Mikroglia verwendet werden. Obwohl die so erhaltene gereinigte Mikroglia von einer hinreichenden Reinheit ist, können Zellsortierer etc. ebenfalls verwendet werden, um die Reinheit zu verbessern.
(2) Trennung der etablierten Zelllinie der Mikroglia.
Um die subkultivierbare etablierte Zelllinie der Mikroglia der vorliegenden Erfindung von der auf der oben beschriebenen Art und Weise (1) erhaltenen, gereinigten Mikroglia abzutrennen, wurde die gereinigte Mikroglia durch Kultivierung in Gegenwart eines Zytokins, bevorzugt des Kolonie-stimulierenden Faktors (CSF), bevorzugter des Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierenden Faktors (GM-CSF), kloniert. Wenn das Zytokin während der Kultivierung vorhanden sein darf, kann GM-CSF allein verwendet werden, aber IL-3 und/oder ein von gereinigten Astrozyten stammender Überstand kann zusätzlich zu GM-CSF vorhanden zu sein. Das verwendete Zytokin kann ein natürlich vorkommendes oder ein genetisch rekombinantes Zytokin sein. Zum Beispiel sind spezifische Verfahren folgendermaßen:
Die in (1) oben erhaltenen gereinigten Mikroglia-Zellen werden in einem Gefäß mit etwa 10 cm im Durchmesser ausplattiert und 7 bis 10 Tage in Gegenwart von genetisch rekombinantem Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (rGM-CSF) kultiviert. Nach Kultivierung werden die Zellen wiedergewonnen und in einer Grenzverdünnung werden sie 4 bis 10 Wochen in Gegenwart von rGM-CSF weiter kultiviert. Dann werden Zellen, die eine Einzelkolonie in jeder Vertiefung in der Testplatte gebildet hatten, mit Hilfe eines „Gummischabers" abgelöst, wodurch die klonierten Zellen sortiert und getrennt werden, um schließlich eine etablierte Zelllinie der Mikroglia zu ergeben.
Die so erhaltene, etablierte Zelllinie der Mikroglia, besitzt die folgenden Eigenschaften.
(a) Form
Werden die Zellen nach Färbung mit einem fluoreszierenden Pigment unter einem Fluoreszenz-Mikroskop oder ohne Färbung unter einem Phasenkontrast-Mikroskop beobachtet, so weisen die Zellen in Gegenwart von rGM-CSF eine Makrophagenartige oder globuläre Form auf, oder weisen in Abwesenheit von rGM-CSF eine verzweigte Form ähnlich der im Gehirn vorhandenen verzweigten Mikroglia auf. Ansonsten weisen die Zellen beide der obigen Formen auf.
(b) Funktionale Merkmale
Nach Verabreichung in eine Arterie einer Maus wandert die etablierte Mikroglia der vorliegenden Erfindung spezifisch in das Gehirn, was anzeigt, das sie eine spezifische Affinität für das Gehirn besitzt. Außerdem produzieren die Mikroglia-Zellen, wenn sie mit Lipopolysacchariden stimuliert werden, Interleukin-1 (IL-1) und Interleukin-6 (IL-6). Bei Stimulation mit Interferon γ produzieren sie IL-5. Diese Eigenschaft unterscheidet die Mikroglia-Zellen von Makrophagen, da Makrophagen IL-5 nach Stimulation mit IFN-γ nicht exprimieren. Wenn die phagozytische Fähigkeit der Zelllinie der vorliegenden Erfindung mit Hilfe des Einbaus eines fluoreszierenden Pigments als Indikator untersucht wurde, zeigt sie eine starke phagozytische Fähigkeit. Die etablierte Zelllinie der Mikroglia der vorliegenden Erfindung besitzt eine phagozytische Fähigkeit, die hundert- bis tausendmal höher ist als die der Astrozyten.
(c) Zellwachstumsfähigkeit.
Da die etablierte Mikroglia der vorliegenden Erfindung nach Entfernen von rGM-CSF aus dem Medium nicht proliferiert, proliferiert sie abhängig von GM-CSF.
Die Form und Merkmale der etablierten Mikroglia der vorliegenden Erfindung werden in den spezifischen Beispielen in den 1 bis 4 beispielhaft dargestellt.
(3) Einführung eines Gens in die etablierte Zelllinie der Mikroglia.
Die Einführung eines Gens in die etablierte Zelllinie der Mikroglia der vorliegenden Erfindung ist für eine spezifische Expression des Gens im Gehirn wichtig. Ein erwünschtes Gen kann mittels bekannter Klonierungsverfahren erhalten werden, und jedes im Handel erhältliche Gen kann ebenfalls verwendet werden und der Gentyp ist nicht besonders eingeschränkt.
Als ein Mittel einer effizienten Einführung eines Gens in die etablierte Zelllinie der Mikroglia gibt es zum Beispiel ein Verfahren unter Verwendung von DOTAP (Boehringer-Mannheim Co.). Das heißt, es gibt ein Verfahren zur Kultivierung der etablierten Zelllinie der Mikroglia zusammen mit dem erwünschten Gen in einem Gen-einführenden Medium, das DOTAP enthält. Die Zellen werden in einem CO₂-Inkubator bei 37 °C 16 bis 24 Stunden kultiviert und dann des Weiteren zusammen mit rGM-CSF für 30 bis 72 Stunden (vorzugsweise für 48 Stunden) in einem Medium zur Kultivierung von Mikroglia weiter kultiviert.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Mitteln umfasst das Verfahren zur Einführung des Gens in die Mikroglia herkömmliche Verfahren, wie Calciumphosphat-Verfahren, DEAE-Dextran-Verfahren, Lipofektionsverfahren, Elektroporationsverfahren, Verfahren mit Partikel-Kanone, etc.
Von den bekannten Verfahren zur Abtrennung eines Stammes, der ein eingeführtes Gen stabil exprimiert, ist das am häufigsten angewandte Verfahren ein Verfahren, worin ein Stoffresistenzgen gleichzeitig mit einem erwünschten Gen in die Zellen eingeführt und in den Zellen aufgrund des Einbaus des Gens in ihre chromosomale DNA exprimiert wird, und andere Zellen als diejenigen Zellen, die das Gen stabil und konstant exprimieren, werden durch eine chemische Behandlung abgetötet und aus der Kultur entfernt, wodurch die gewünschten Zellen abgetrennt werden.
Wenn dieses Durchmusterungsverfahren auf die Mikroglia-Zellen angewandt wird, werden die Mikroglia-Zellen, die das eingeführte Gen stabil exprimieren und ständig tote Zellen erkennen, folglich eine starke phagozytische Fähigkeit exprimieren und gleichzeitig einer Aktivierung unterliegen, um ihre Zellwachstumsfähigkeit zu verlieren. Dementsprechend ist das Verfahren zur Einführung eines Gens in die vorliegende Erfindung vorzugsweise ein Verfahren, worin ein Expressionsvektor derart modifiziert ist, dass er in höheren Tieren die Fähigkeit zur Expression eines fluoreszierenden Proteins, vorzugsweise eines von einer Ohrenqualle abstammenden grün fluoreszierenden Proteins (GFP), verleiht, und anstelle eines Stoffresistenzgens verwendet wird und mit Hilfe eines Unterschieds in der Fluoreszenzintensität werden die Mikroglia-Zellen als die erwünschten Zellen abgetrennt, die eine stabile und konstante Expression zeigen.
Ob die Zellen, die das eingeführte Gen in sich tragen, das Gehirn erreicht haben und ob das Gen exprimiert worden ist, kann folgendermaßen bestätigt werden: Die einzuführenden Zellen werden mit einem für Phagozyten spezifischen fluoreszierenden Pigment gefärbt. Nach Einführung der Zellen in ein Tier, wird das Gehirn entnommen und eingefroren, davon wird ein etwa 8 μm dicker Schnitt präpariert und auf fluoreszierende Zellen unter einem Fluoreszenz-Mikroskop untersucht, oder der Schnitt wird mit einem Substrat einer Aktivitätsfärbung des eingeführten Gens unterzogen.
Die Zellen können ebenfalls mit Hilfe eines Kernspinresonanztomographie-Bildes (MRI), Positronenemissions-Tomographie (PET), etc. bestätigt werden. Zum Beispiel können Kontrastmedien, etc. für MRI, in die Zellen eingebaut werden, die dann in ein Tier injiziert werden, so dass die Zellen in dem Tier beobachtet werden können. Gemäß diesen Verfahren ist es nicht erforderlich, das Tier zu töten, und die Zellen können leicht auf eine nichtinvasive Art und Weise kontrolliert werden.
Beispiele
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung mit Bezug auf die Beispiele genauer beschrieben.
Beispiel 1. Abtrennen eines etablierten Mikroglia-Klons
(1) Mikroglia-Isolierung
Gehirne neugeborener Mäuse (C57BL6, op/op) und neugeborener Ratten (Fisher) wurden entnommen und die Hirnhäute wurden entfernt und in einem eiskalten Mikroglia-Kulturmedium (als Mi-Medium bezeichnet; 10 % bovines Serum, 0,2 Glucose und 5 μg/ml bovines Insulin enthaltendes Eagles MEM) überführt. Die Hirnhautzellen wurden mit einer Pasteurpipette oder einem Nylonnetz in Einzelzellen geteilt und dann in MI-Medium kultiviert. Für die Zellen von den Mäusegehirnen wurden 20 ml MI-Medium je Gehirn und für die Zellen von den Rattengehirnen wurden 40 ml MI-Medium je Gehirn verwendet und die erstgenannten Zellen wurden in 2 Kulturschalen mit 10 cm Durchmesser und die letztgenannten Zellen wurden in 4 Kulturschalen mit 10 cm Durchmesser in einem CO₂-Inkubator (5 % CO₂, 95 % Luft) bei 37 °C für 10 bis 14 Tage inkubiert. Das Medium wurde gegen frisches Medium alle 3 bis 4 Tage ausgetauscht.
Wenn runde Zellen mit heller Struktur (PBRCs) auftraten, wurden die PBRCs durch mechanisches Schütteln entfernt und die verbliebenen Zellen wurden mit 200 U/ml Tryosin-0,02 % EDTA entfernt und in einem unbeschichteten Plastikgefäß bei 37 °C 30 Minuten inkubiert. Die Zellen, die an dem unbeschichteten Plastikgefäß hafteten, wurden zweimal mit Mi-Medium gewaschen und die Zellen wurden dann entfernt und wiedergewonnen. Das gleiche Verfahren wurde zusätzlich zweimal wiederholt, um gereinigte Mikroglia-Zellen zu ergeben.
(2) Trennung der Klone
1 × 10⁵ gereinigte Mikroglia-Zellen, die in (1) oben erhalten wurden, wurden in einem 10 cm Gefäß ausplattiert und 7 Tage in MI-Medium in Gegenwart von rGM-CSF (Genzyme Co.) kultiviert.
Die Zellen wurden wiedergewonnen und gezählt, und Klone wurden aus den Zellen auf die folgende Art und Weise mit Hilfe einer Grenzverdünnung gewonnen. Die Zellen wurden in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen (Falcon Co.) mit einer Dichte von 0,5 Zellen/Vertiefung (in 100 μl) gegeben und etwa 3 Wochen in Gegenwart von 2 ng/ml rekombinantem Mausgen GM-CSF (Genzyme Co.) kultiviert. Jede Vertiefung wurde auf das Vorhandensein des Klons untersucht und die Zielklone wurden abgetrennt.
Als Ergebnis wurden fünf Typen etablierter Mikroglia (Ra2, GMI-M6-1, GMI-M6-3, GMI-M5-2, GMI-MF11), die sich von Gehirnen der Mäuse ableiten, und ein Typ (GMI-R1) aus Rattengehirnen erhalten.
Von diesen sind die etablierten Mikroglia-Zelllinien, Ra2 und GMI-R1, die als "Maus-Mikroglia Ra2" und „Ratten-Mikroglia GMI-R1" bezeichnet worden sind, als FERM P-16109 beziehungsweise FERM P-16110 am National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, hinterlegt worden.
Die Eigenschaften der resultierenden Klone werden dann untersucht.
(a) Form
Wenn GMI-R1 in Anwesenheit oder Abwesenheit von rGM-CSF inkubiert wurde, wurde unter einem Phasenkontrastmikroskop beobachtet, dass sie eine Makrophagen-artige oder globuläre Form in Anwesenheit von rGM-CSF (1A) und in Abwesenheit von rGM-CSF (1B) eine verzweigte Form aufwies.
(b-1) Funktionale Merkmale (Affinität für das Gehirn)
Der etablierte Mikroglia-Zelllinie GMI-R1 der vorliegenden Erfindung durfte an einem Plastikgefäß haften. Ein fluoreszierendes Pigment PKH26 (Zynaxis Co.), das in einer Phagozyten-Färbungslösung (Diluent B, Zynaxis Co.) zubereitet wurde, und 10 Serum wurden in einem Verhältnis 1:1 gemischt und zu dem obigen Gefäß gegeben und GMI-R1 wurde mit dem fluoreszierenden Pigment bei 37 °C 15 Minuten gefärbt (Isihara, S., Sawada, M. et al., Exp. Neurol., 124, 219–230, 1993).
Die Zellen wurden wiedergewonnen und 2 × 10⁶ Zellen wurden in eine Arterie in der Achselhöhle von jeweils 5 Wochen alten Ratten des gleichen Stamms (Fisher) injiziert. 48 Stunden und 1, 2, und 3 Wochen nach der Injektion wurde jedes Organ den Ratten entnommen und in einer OCT-Lösung (Tissue Tek Co.) eingefroren.
Mikroglia GMI-R1 und Makrophagen, die zum Vergleich mittels Waschen mit kaltem PBS aus dem Abdomen einer Ratte des gleichen Stamms (Fisher) isoliert worden war, wurden jeweils mit einem für Phagozyten spezifischen fluoreszierenden Pigment markiert und dann in Arterien der Achselhöhlen von Ratten injiziert, und Gewebeschnitte werden zur Untersuchung der Gewebeorientierung hergestellt.
Nachdem die etablierte Mikroglia-Zelllinie der vorliegenden Erfindung injiziert war, wurden viele fluoreszierende Zellen in den normalen Gehirnzellen (2A) beobachtet, aber nicht in der Leber (2B) beobachtet. Andererseits waren nachdem die Makrophagen injiziert waren, fluoreszierende Zellen in normalen Gehirnzellen kaum feststellbar (2C), während in der Leber viele fluoreszierende Zellen beobachtet werden konnten (2D).
Dementsprechend besaß die etablierte Mikroglia-Zelllinie der vorliegenden Erfindung eine spezifische Affinität für das Gehirn.
(b-2) Funktionale Merkmale (die Fähigkeit zur Produktion von IL-1 und IL-6).
1 × 10⁶ Ra2-Zellen wurden in einer 6 cm Kulturschale ausplattiert und die Gesamt-RNA wurde aus Zellen, die 12 Stunden mit Lipopolysacchariden stimuliert wurden, und aus nicht stimulierten Zellen mit RNeasy (Qiagen Co.) extrahiert und 2 μg der RNA wurde verwendet, um eine cDNA-Mischung mittels reverser Transkriptase (BRL) herzustellen. Eine PCR wurde unter Verwendung der resultierenden cDNA als Template durchgeführt, wobei ein IL-1 spezifischer synthetischer Primer und ein IL-6 spezifischer synthetischer Primer mit den folgenden Sequenzen verwendet wurde.
IL-1 spezifischer synthetischer Primer (Sawada et al., Int. J. Dev. Neurosci., 13, 253–264, 1995):
Sense-Strang: 5'-ATGGCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3' (SEQ ID NR. 1)
Antisense-Strang: 5'- CAGGACAGGTATAGATTCTTTCCTTT-3' (SEQ ID NR. 2)
IL-6 spezifischer synthetischer Primer (Sawada et al., Brain Res. 583, 296–299, 1992):
Sense-Strang: 5-ATGAAGTTCCTCTCTGCAAGAGACT-3' (SEQ ID NR. 3)
Antisense-Strang: 5-CACTAGGTTTGCCGAGTAGATCTC-3' (SEQ ID NR. 4)
Die PCR wurde mit 30 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Zyklus aus einer Reaktion bei 55 °C für 1 Minute, 72 °C für 2 Minuten und 94 °C für 1 Minute bestand (Omnigene von HYBAID Co., Ltd, wurde verwendet). Nach der PCR wurde das Amplifizierungsprodukt einer Agarosegel-Elektrophorese unterzogen, um die Genexpression zu untersuchen.
Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass Ra2 eine erhöhte Expression von IL-1 und IL-6 (3, „LPS" Spuren) zeigte. In 3 ist „M" ein Molekulargewichtsmarker und „cont" eine Kontrolle (nicht stimuliert).
Die Produktion von IL-1 und IL-6 wurde ebenfalls mittels ELISA bestätigt. Außerdem wurde ein Kulturüberstand der etablierten Mikroglia der vorliegenden Erfindung nach Stimulation mit Lipopolysacchariden zu MH60-Zellen gegeben, deren Proliferation von IL-6 abhängt, oder zu D10-Zellen gegeben, deren Proliferation von IL-1 abhängt, und im Anschluss an die Inkubation wurde untersucht, ob die MH60-Zellen und D10-Zellen proliferierten oder nicht proliferierten.
Als ein Ergebnis wurde festgestellt, dass beide Zelltypen in Gegenwart des Kulturüberstandes der etablierten Mikroglia der vorliegenden Erfindung proliferierten, die mit den Lipopolysacchariden stimuliert waren.
(c) Zellwachstumsfähigkeit
5 × 10⁴ GMI-RI-Zellen wurden auf einer Testplatte mit 96 Vertiefungen ausplattiert und 2 μg/ml rGM-CSF wurden zugegeben, so dass eine 1000-, 5000-, beziehungsweise 10000fache Verdünnung erhalten wurde und die Zellen werden 4 Tage inkubiert und dann MTT-Assays unterzogen. Als Kontrolle wurden 400 μ/ml humanes M-CSF (The Green Cross Corporation) 1000fach verdünnt und 0,1 mg/ml PMA (Phorbolmyristatacetat) wurde 1000- oder 5000fach verdünnt und diese wurden als Kontrolle verwendet (4A).
Separat wurden rGM-CSF 5000fach verdünnt und jeweils 100 μ/ml IL-3, IL-4 und IL-6 der Maus (diese wurden von Genzyme Co. hergestellt) wurden in einem Vergleichstest untersucht. Zwei Tage und vier Tage nach Zugabe der jeweiligen Reagenzien wurden MTT-Assays durchgeführt (4B).
Als ein Ergebnis wurde gefunden, dass GMI-R1 abhängig von rGM-CSE proliferierte.
Beispiel 2. Einführung eines Gens in die Mikroglia-Zellen der vorliegenden Erfindung
Der von E. coli abgeleitete Vektor ptkβ (Clonetech Co.) zur Expression des lac Z-Gens und DOTAP-Lipid (Boehringer-Mannheim Co.) wurden mit einer Endkonzentration von 1 μg/ml gemischt. Die Mischung wurde mit Serum-haltigem Medium gemischt, dann zu der etablierten Mikroglia-Zelllinie der vorliegenden Erfindung gegeben und 16 Stunden lang behandelt. Als Kontrolle wurden die etablierten Mikroglia der vorliegenden Erfindung, in die das Gen nicht eingeführt war, und Makrophagen, die auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 erhalten waren, verwendet.
Dann wurden die Zellen weitere 48 Stunden in einem üblichen Medium (EMEM plus 10 % FCS) kultiviert und dann mit dem fluoreszierenden Pigment gefärbt, wie in Beispiel 1 beschrieben (b-1 ), um zu untersuchen, ob das Gen in das Gehirn befördert war und exprimiert wurde: Eine Arterie in der linken Achselhöhle einer adulten Ratte (250 bis 300 g) wurde unter Anästhesie mit Nembutal freigelegt. Nach hämostatischer Behandlung wurde eine Kanüle in die Arterie eingeführt und zur Injektion von 1 bis 2 × 10⁶ Zellen in die Ratte verwendet. Nach Injektion wurde die Schnittstelle vernäht und die Ratte durfte sich erholen.
48 Stunden nach Injektion der Zellen wurde das Gehirn der Ratte entnommen und 3 aufeinander folgende gefrorene Schnitte des Gehirns wurden präpariert und jeweils unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet. Außerdem wurde die Färbung und die quantitative Bestimmung der β-Galactosidase-Aktivität folgendermaßen durchgeführt.
Einer der drei Schnitte wurde in 0,5 % Glutaraldehyd fixiert und einer Aktivitätsfärbung mit X-Gal als Substrat gemäß dem Verfahren von Lim et al. (Bio Techniques 7, 576–579, 1989) unterzogen. Um die Aktivität quantitativ zu bestimmen, wurde einer der Schnitte in einem Lösepuffer mit Hilfe von Ultraschall homogenisiert und auf seine Aktivität mit einem im Handel erhältlichen Kit (Galacto Light; Boehringer-Mannheim) getestet.
Als ein Ergebnis konnte bestätigt werden, dass in dem Fall, in dem das Gen in die etablierten Mikroglia der vorliegenden Erfindung eingeführt war, lacZ-positive Zellen in dem Rattengehirnschnitt vorhanden waren (5). Außerdem wurde als ein Ergebnis der quantitativen Bestimmung der β-Galactosidase-Aktivität mit dem Chemilumineszenz-Verfahren eine beachtliche höhere Aktivität in dem Rattengehirnschnitt detektiert, in den der E. coli abgeleitete lacZ-Expressionsvektor eingeführt worden war, als in dem entsprechenden Schnitt, in dem das Gen nicht eingeführt worden war (6).
Beispiel 3. Einführung einer chemischen Substanz in die Mikroglia der Erfindung und spezifische Einführung dieser in das Gehirn.
Das in Beispiel 1 verwendete fluoreszierende Pigment PKH26 bildet in Diluent B Granula. Die Zelllinie der Mikroglia der vorliegenden Erfindung inkorporiert diese Granula spezifisch und transferiert sie in das Gehirn, so dass das fluoreszierende Pigment PKH26 als eine chemische Modellsubstanz (Antitumor-Medikament) verwendet wurde.
Als ein Ergebnis wurden, wenn die etablierte Mikroglia-Zelllinie der vorliegenden Erfindung eingeführt war, viele fluoreszierende Zellen in normalen Gehirnzellen beobachtet, aber nicht in der Leber beobachtet. Daraus folgt, dass die Mikroglia der vorliegenden Erfindung die chemische Substanz (Medikament) spezifisch in das Gehirn transferiert.
Beispiel 4. Einführung eines Gens mit GFP
1 × 10⁶ GMI-R1-Zellen wurden in einer Petrischale ausplattiert und 16 Stunden später wurde 10 μg GFP-Expressionsvektor pEGFP (Clonteck Co.) zu einem Geneinführenden Medium gegeben, gegen welches das vorherige Medium dann ausgetauscht wurde, und die Zellen wurden bei 37 °C 24 Stunden in einem CO₂-Inkubator kultiviert und dann zusammen mit rGM-CSF 7 weitere Tage in einem Medium für Mikroglia-Zellen kultiviert.
Nach 7 Tagen Kultivierung wurden die Zellen suspendiert und diejenigen Zellen, die eine mindestens 100mal höhere Fluoreszenzintensität zeigten, als die Zellen, in die das Gen nicht eingeführt worden war, wurden fraktioniert und mit Hilfe eines Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierers (FACS), FACS Calibur, von Becton-Dickinson hergestellt, aufkonzentriert und dann zusammen mit rGM-CSF in einem Medium für Mikroglia-Zellen kultiviert.
Das gleiche Verfahren wurde zusätzlich zweimal alle 7 Tage wiederholt, wobei fast 90 % oder mehr Zellen in einer Fraktion wiedergewonnen werden konnten, die eine etwa 100fache Fluoreszenz besaßen, und diese Zellen wurden auf eine TP96-Testplatte mit einer Dichte von 1 Zelle/Vertiefung mit Hilfe der Grenzverdünnung der Zellen ausgebracht und weiter zusammen mit rGM-CSF in einem Medium für Mikroglia-Zellen kultiviert. Die Mikroglia-Zellen, die das eingeführte pEGFP-Gen konstant und stabil exprimierten, konnten dabei abggetrennt werden.
Ein Beispiel für Ergebnisse der FACS-Analyse, wie die Zellen mit diesen Verfahren abgetrennt werden konnten, wird in den Zeichnungen gezeigt. 7 zeigt ein Ergebnis einer FACS-Analyse der Zellen in die das Gen nicht eingeführt worden war, während 8 das Ergebnis einer FACS-Analyse der Zellen zeigt, in die GFP eingeführt worden war.
Industrielle Anwendbarkeit
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine etablierte Mikroglia-Zelllinie bereitgestellt, die eine spezifische Affinität für das Gehirn besitzt. Die etablierte Mikroglia-Zelllinie gemäß der vorliegenden Erfindung ist nicht nur als ein Träger zur Einführung eines Gens in das Gehirn sondern ebenfalls als ein Träger zur spezifischen Einführung einer chemischen Substanz, wie beispielsweise eines Medikaments, in das Gehirn zweckdienlich.
SEQUENZLISTE

Claims

Etablierte Zelllinie der Mikroglia mit einer spezifischen Affinität für die Gehirn- und Phagozytentätigkeit, und mit Zellwachstumsfähigkeit in Abhängigkeit vom Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (GM-CSF), dadurch gekennzeichnet, dass die Zelllinie in Gegenwart von GM-CSF subkultivierbar ist und im wesentlichen eine Makrophagen-artige oder globuläre Form in Gegenwart von GM-CSF und eine verzweigte Form ähnlich der verzweigten Mikroglia im Gehirn in Abwesenheit von GM-CSF aufweist.
Verfahren zum Produzieren einer etablierten Zelllinie der Mikroglia nach Anspruch 1, welches den Schritt des Klonierens einer Zelllinie der Mikroglia aus gereinigter Mikroglia durch die Zellkultur in Gegenwart von GM-CSF umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der GM-CSF ein genetisch rekombinierter ist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei die Zellkultur in Gegenwart von IL-3 und/oder einem Kulturüberstand von gereinigten Astrozyten, zusätzlich zum GM-CSF, durchgeführt wird.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine etablierte Zelllinie der Mikroglia, wie in Anspruch 1 definiert.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 5 für die Anwendung bei einer Methode zur Behandlung einer zerebralen Erkrankung.