EP1341915A1 - Verwendung von aus embryonalen stammzellen hergeleiteten zellen zur erhöhung der transplantationstoleranz und zur wiederherstellung zerstörten gewebes - Google Patents

Verwendung von aus embryonalen stammzellen hergeleiteten zellen zur erhöhung der transplantationstoleranz und zur wiederherstellung zerstörten gewebes

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EP1341915A1
EP1341915A1 EP01995556A EP01995556A EP1341915A1 EP 1341915 A1 EP1341915 A1 EP 1341915A1 EP 01995556 A EP01995556 A EP 01995556A EP 01995556 A EP01995556 A EP 01995556A EP 1341915 A1 EP1341915 A1 EP 1341915A1
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EP
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ecl
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donor
cell
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EP01995556A
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Michael Bader
Bert Binas
Giuxuan Chai
Fred FÄNDRICH
Detlev Ganten
Xiongbin Lin
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Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
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Max Delbrueck Centrum fuer Molekulare in der Helmholtz Gemeinschaft
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Definitions

  • the invention relates to the use of cells from cell lines, which are derived from early embryonic stages, for the donor-specific increase of the transplant tolerance and for the restoration of destroyed tissue. Areas of application of the invention are medicine and the pharmaceutical industry.
  • tolerance immune tolerance
  • AG specific antigen
  • tolerance can be defined as persistent tissue persistence in the absence of a deleterious immune response that can be achieved without ongoing therapeutic intervention.
  • tolerance is not an innate characteristic of an individual, but is acquired (Owen, Science 102: 400-401, 1945; Billingham et al., Nature 172: 603-606, 1953). It is also known that the tolerant state that exists at birth changes constantly, especially when the body is confronted with new antigens in the course of life.
  • the immune system must be able to tolerate certain "foreign" antigens, such as physiological hormones released during puberty and pregnancy (Fowlkes and Ramsdell, Curr. Opin. Immunol. 5: 873-879, 1993).
  • fetal life can develop and survive in a host that is not adapted to major histocompatibility complex (MHC) is another example of nature's ability to distinguish not only between foreign and non-foreign, but also between dangerous and harmless can (Vacchio and Jiang, Grit. Rev. Immunol. 19: 461-480, 1999).
  • the invention is based on the object of generating a donor-specific immune tolerance in order to prevent rejection of the transplanted tissue by an immune reaction and thus to be able to restrict the administration of immunosuppressive agents.
  • ECL embryonic stem cell-like cell lines
  • the use of the cells from the ECLs as "tolerance vectors" is opened by a lack of MHC antigen expression and the associated immunogenic inactivity of the ECL.
  • Research has shown that cells from ECLs can be transplanted and survive in the long term, producing hematopoietic cells of different origins.
  • these hematopoietic cells derived from ECL have generated a constant mixed chimerism (donor and recipient hematopoietic cells coexist in the same host) and thus create the basis for long-term allograft acceptance. As a result, they can either be used as an ideal means of creating tolerance, or alternatively they can be used in a situation in which the parenchymal injury of a particular organ has to be remedied.
  • WKY Wistar Kyoto
  • SD Sprague Dawley
  • ACI ACI
  • WKY blastocysts grew very rapidly, showed strong primary growth, and more than 10% of the embryos achieved permanent cell lines (Table 1).
  • SD blastocysts grew with some delay, achieved a moderate number of primary clumps, and the effectiveness of cell line generation was poor.
  • ACI blastocysts took the longest time to grow, produced a very small number of primary clumps, and no cell line could be generated by this breed.
  • the use of the cells from the cell lines, which were generated from the embryonic stem cells, as "tolerance vectors" to bring about donor-specific immune tolerance also requires the expression of the donor-specific MHC antigens.
  • This property is achieved according to the invention in that cells of the ECLs are transfected with the genes of the donor which code for the MHC antigens.
  • the administration of the transfected cells e.g. via the portal vein, by intraperitoneal, subcutaneous or intravenous injection.
  • Mouse embryo fibroblasts (MEF) or rat embryo fibroblasts (REF) are prepared from 13-14 day pregnant animals that have been mitotically inactivated by 3-5 treatments with mitomycin C (10 ⁇ g / ml) for 2 or 1 hours, washed with phosphate buffered saline ( PBS) and planted in Nunc 4-wells.
  • mitomycin C 10 ⁇ g / ml
  • PBS phosphate buffered saline
  • the blastocysts are flushed with PBS / 20% FCS (fetal calf serum) or a culture medium from the uterus of rats 4.5 days pregnant, planted on inactivated embryo fibroblasts and 3-4 days in DMEM / 15% FCS / 2,500 ⁇ / ml LIF ( "Leukemia inhibiting factor", ESGRO, Life Technologies) with additives (Iannaccone et al, Dev. Biol. 1994; 163: 288-292) left untreated in a medium of 6% CO 2 / air.
  • the blastocysts develop and tie themselves to the supplier, and the ICM begins to grow, with the Efficiency depends on the genetic background.
  • Outgrowths with an ES-cell-like appearance are picked up and broken up into several lumps by suction in drawn glass capillaries with a somewhat smaller diameter than the outgrowths and applied to fresh supply plates. Picking up and breaking up occurs either daily or every other day. Crumbled colonies are reset in rows until a small number of clean, steadily growing ES-like clumps are obtained. The clump population is then expanded to several dozen, stored in 35 mm dishes and slightly trypsinized into a mixture of individual cells and small aggregates. The rat ES cells produced were passaged every or every other day by trypsinization (0.05% trypsin, 0.02% EDTA-4Na, 1% chicken serum, in Ca / Mg-free PBS). The species identity of the resulting cell lines is checked by PCR using Renin gene primers (Brenin et al., Transplant. Proc. 1997; 29: 1761-1765) in order to rule out contamination by mouse ES cells.
  • a first series of experiments examined the fate of a single intraportal injection of WKY-derived 1.0 x 10 6 ECL into allogeneic DA (RTl. Avl ) host rats that had received no immunosuppressive or myeloablative treatment.
  • the investigations show that these cells can survive long-term (> 150 days) in DA host rats. It was found that the ECL and its descendants can produce a state of constantly mixed chimerism (hematopoietic cells of the donor and the recipient coexist in the same host). It was also found that these cells differentiate into hematopoietic cells that express class II MHC antigens (Ox-3) and B cell lineage markers (Ox-45).
  • the monoclonal antibody (mAb) Ox-3 is a specific antibody of a (WKY) MHC class II donor that binds to class II MHC epitopes that are expressed on WKY but not to DA MHC positive cells class II.
  • WB double-stained leukocytes
  • Ox-3 + cells were detected histomorphologically (10-15%) in the interstitial space of the recipient (DA) hearts, which were selectively destroyed 100 days after a single intraportal injection of 1.0 x 10 6 ECL derived from WKY (see Fig.l).
  • the stable chimeric state of these animals provides the basis for examining the fate of the WKY cardiac allograft transplanted in DA rats seven days after the intraportal ECL injection.
  • Kaplan Meier diagrams show that pretreatment of DA rats with 1.0 x 10 6 ECL intraportally and heart transplantation (HTx) seven days later led to long-term (> 150 days) non-rejection allograft acceptance, whereas untreated DA rats caused WKY Reject allografts acutely (see Fig. 2).
  • CAP rat heart transplants were rejected from DA rats injected with WKY-ECL within 12.4 ⁇ 1.4 days, demonstrating the immune competence of these rats.
  • ECL cells described above assume differentiation into astrocytes or cardiomyocytes and hepatocytes by co-cultivation with somatic cells of neuronal or entodermal origin.
  • the embryonic cell lines described are therefore also suitable for the treatment of organ-specific diseases of the central nervous system (e.g. as dopaminergic cells for the treatment of Parkinson's disease, as hepatocytes for the treatment of cirrhosis of the liver or as cardiomyocytes for the treatment of fresh heart attacks).
  • organ-specific diseases of the central nervous system e.g. as dopaminergic cells for the treatment of Parkinson's disease, as hepatocytes for the treatment of cirrhosis of the liver or as cardiomyocytes for the treatment of fresh heart attacks.
  • the forthcoming isolation of the signal proteins necessary for these specific forms of differentiation is of great clinical importance, since it could enable problem-free programming of the ECLs for the desired cell population.
  • the goal is therefore the exact sequencing of these functional proteins in order to enable their recombinant production.
  • the large sequence homology between rat and human protein would also provide information on the analog production of human functional proteins.
  • the associated therapeutic application possibilities include both the use of the ECL-derived somatic cell lines described above and the functional proteins derived therefrom for future clinical use on all indication levels of tissue engineering for organ replacement, for gene therapy and for the treatment of metabolic diseases in the area of the CNS, the liver and the heart.

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwindung von Zellen aus Zellinien, die aus frühen Embryoalstadien abgeleitet werden, zur spenderspezifischen Erhöhung der Transplantationstoleranz und zur Wiederherstellung zerstörten Gewebes. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie. Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine spenderspezifische Immuntoleranz zu erzeugen, um eine Abstoßung des transplantierten Gewebes durch eine Immunreaktion zu verhindern und so die Verabreichung von Immunsuppressiva einschränken zu können. Für die Erzeugung einer spenderspezifischen Immuntoleranz werden embryonalen Stammzellen ähnliche Zellinien (embryonic stem cell like cell lines, ECL) aus Blastozysten gewonnen und mit genetischem Material des Spenders, das für die MHC-Haplotypen kodiert, transfiziert. Die so erzeugten Zellen werden dem Empfänger schließlich vor der Transplantation zur Erzeugung der Immuntoleranz gegen das zu transplantierende Gewebe bzw.zur Erneuerung bereits geschädigten Gewebes verabreicht.

Description

Verwendung von aus embryonalen Stammzellen hergeleiteteten Zellen zur Erhöhung der Transplantationstoleranz und zur Wiederherstellung zerstörten Gewebes
Beschreibung:
Die Erfindung betrifft die Nerwendung von Zellen aus Zelllinien, die aus frühen Embryonalstadien abgeleitet werden, zur spenderspezifischen Erhöhung der Transplantationstoleranz und zur Wiederherstellung zerstörten Gewebes. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Stand der Technik:
In der Transplantationsmedizin hat die Entwicklung zunehmend starker Immunosuppressiva wie Prednison, Cyclosporin, Tacrolimus, Mycophenolatmefetil und Antilymphozyt- Antikörper die Überlebensdauer der Patienten und die Verweildauer der Transplantate um durchschnittlich ein Jahr erhöht. Die routinemäßige Anwendung dieser Medikamente hat die klinische Transplantation zu einer Standardbehandlung gemacht, die für die meisten nichtmalignen terminalen Erkrankungen des Herzens, der Nieren und der Leber gewählt wird. Eine Verbesserung der frühen Überlebensdauer der Transplantate wurde jedoch nicht ohne eine beachtliche infektiöse Morbidität und nichtimmune Nebeneffekte (Gaber et al., Transplantation 66:29-37, 1998) erreicht. Darüber hinaus konnte eine bessere frühe Überlebensdauer nicht in eine bessere langfristige Überlebensdauer des Transplantates überfuhrt werden, da die chronische Abstoßung weiterhin die Transplantate nach dem ersten Jahr in einer Häufigkeit, die sich in den letzten 20 Jahren im wesentlichen nicht verändert hat (Cecka and Terasaki, Clinical Transplants 1997, Los Angeles, UCLA Tissue Typing Laboratory, 1998), funktionsunfähig gemacht hat. Außerdem zeigten sich bei längerem Verfolgen des klinischen Verlaufs von Transplantationen (Pirsch and Friedman, J. Gen. Intern. Med. 9:29-37, 1994) zunehmend eine späte Morbidität und Mortalität aufgrund der weiteren Notwendigkeit einer nichtspezifischen Immunsuppression.
Der Begriff der Immuntoleranz (nachfolgend als Toleranz bezeichnet), der allgemein mit dem Ausbleiben einer Immunreaktion nach Verabreichung oder Aufnahme eines bestimmten Antigens (AG) beschrieben werden kann, besitzt in der Transplantationsmedizin eine zentrale Rolle. Vom Standpunkt des Transplantationsimmunologen kann die Toleranz als anhaltende Persistenz eines Gewebes in Abwesenheit einer schädlichen Immunreaktion definiert werden, die ohne andauernden therapeutischen Eingriff erreicht werden kann. In diesem Zusammenhang ist es wichtig festzustellen, daß die Toleranz keine angeborene Eigenschaft eines Individuums ist, sondern erworben wird (Owen, Science 102:400-401, 1945; Billingham et al., Nature 172:603-606, 1953). Es ist weiterhin bekannt, daß sich der tolerante Zustand, der bei der Geburt besteht, ständig verändert und zwar vor allem dann, wenn der Körper im Laufe des Lebens mit neuen Antigenen konfrontiert wird. Das Immunsystem muß z.B. in der Lage sein, bestimmte "fremde" Antigene, wie während der Pubertät und Schwangerschaft freigesetzte physiologische Hormone, zu tolerieren (Fowlkes and Ramsdell, Curr. Opin. Immunol. 5:873-879, 1993). Auch die Tatsache, daß sich fötales Leben entwickeln und in einem an major histocompatibility complex (MHC) nichtangepaßten Wirt überleben kann, ist ein weiteres Beispiel für die Fähigkeit der Natur, nicht nur zwischen fremd und nicht fremd, sondern auch zwischen gefährlich und ungefährlich unterscheiden zu können (Vacchio and Jiang, Grit. Rev. Immunol. 19:461-480, 1999).
Bei einer allogenen hämatopoetischen Stammzellentransplantation (CD34+) wird eine erfolgreiche Transplantation in an MHC nichtangepaßten Wirten nur dann erreicht, wenn der Empfänger sublethal myeloablatiert oder bestrahlt wird.
Nachteile der bisherigen Organ- bzw. Gewebetransplantationen
Um eine Abstoßung des Transplantats durch eine Immunreaktion zu verhindern, werden gegenwärtig starke Immunsuppressiva verabreicht, die jedoch wiederum eine gesteigerte Infektanfälligkeit hervorrufen. So können ubiquitäre Keime, die bei einem normal funktionierenden Immunsystem keinerlei Gefahr darstellen, in einem immunsuppressiven Zustand schwerwiegende Erkrankungen hervorrufen. Bei einer Blutstammzellen- transplantation (CD34+) wird zum Beispiel eine erfolgreiche Transplantation in einen an MHC nichtangepassten Empfänger nur dann erreicht, wenn das Knochenmark des Empfängers vorher entfernt bzw. durch Bestrahlung mit Röntgenstrahlen zerstört wurde.
Aufgabenstellung:
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine spenderspezifische Immuntoleranz zu erzeugen, um eine Abstoßung des transplantierten Gewebes durch eine Immunreaktion zu verhindern und so die Verabreichung von Immunsuppressiva einschränken zu können.
Beschreibung der Erfindung:
Die Erfindung wird gemäß Anspruch 1 realisiert, die Unteransprüche sind Vorzugsvarianten. Für die Erzeugung einer spenderspezifischen Immuntoleranz werden embryonalen Stammzellen ähnliche Zelllinien (embryonic stem cell like cell lines, ECL) aus Blastozysten gewonnen und mit genetischem Material des Spenders, das für die MHC-Haplotypen kodiert, transfiziert. Die so erzeugten Zellen werden dem Empfänger schließlich vor der Transplantation zur Erzeugung der Lnmuntoleranz gegen das zu transplantierende Gewebe bzw. zur Erneuerung bereits geschädigten Gewebes verabreicht.
Der Einsatz der Zellen aus den ECLs als "Toleranzvektoren" wird durch einen Mangel an MHC-Antigen-Expression und die damit verbundene immunogene Inaktivität der ECL eröffnet. Durch Untersuchungen wurde festgestellt, daß Zellen von ECLs transplantiert werden können und langfristig überleben, wobei sie hämatopoetische Zellen unterschiedlicher Abstammung erzeugen. Darüber hinaus haben diese aus ECL abgeleiteten hämatopoetischen Zellen einen ständigen gemischten Chimärismus erzeugt (hämatopoetische Zellen des Spenders und des Empfängers existieren nebeneinander im gleichen Wirt) und schaffen somit die Basis für eine langfristige Allo-Transplantatakzeptanz. Demzufolge können sie entweder als ideales Mittel für die Toleranzerzeugung eingesetzt werden oder alternativ in einer Situation Anwendung finden, in der die parenchymatöse Verletzung eines bestimmten Organs zu beheben ist.
Die Erfindung wird nachfolgend näher erläutert.
Für die ECL-Isolation wurden drei Rattenrassen gewählt, Wistar Kyoto (WKY), Sprague Dawley (SD) und ACI.
Aus diesen gewonnene Blastozysten wurden auf durch Mitomyzin inaktivierte Embryofibroblasten von Mäusen (MEF) oder Ratten (REF) als Versorger gepflanzt. Die MEF erwiesen sich als besser und beide, MEF und REF, waren eindeutig Gelatine überlegen. Wenn sich Auswüchse der inneren Zellmasse (ICM) nach dem Anwachsen der Blastozysten an die Versorgerschicht bildeten, konnten sie gewöhnlich leicht in Gruppen von ES-ähnlichen Zellklumpen (Primärklumpen) etwa 10 Tage lang erweitert werden (Primärwachstum). Danach differenzierten sich die Zellen weitgehend in ein Gemisch verschiedener Zelltypen und wurden bald von runden, locker angebundenen, endodermartigen Zellen überwachsen. Nur ein kleiner Teil der Zellen aus den Primärklumpen überlebte und wurde zu einer Zelllinie erweitert.
WKY-Blastozysten wuchsen sehr schnell an, zeigten ein starkes Primärwachstum und mehr als 10 % der Embryos erzielten ständige Zelllinien (Tabelle 1). SD-Blastozysten wuchsen mit etwas Verzögerung an, erzielten eine moderate Anzahl von Primärklumpen und die Effektivität der Zelllinienerzeugung war gering. ACI-Blastozysten brauchten die längste Zeit für das Anwachsen, erzeugten eine sehr kleine Zahl von Primärklumpen und keine Zelllinie konnte von dieser Rasse erzeugt werden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß die Geschwindigkeit, mit der sich die Blastozysten an die Versorgerzellschicht binden und die Anzahl der Primärklumpen während des größten Primärwachstums positiv mit der Effektivität der ECL-Ableitung verbunden (Tabelle 1) sind. Es ist interessant, daß bei den Hybridblastozysten der WKY-Genotyp die ACI bei der Herstellung der ECLs schlägt, jedoch nicht den SD-Genotyp (Tabelle 1).
Der Einsatz der Zellen aus den Zelllinien, die aus den embryonalen Stammzellen erzeugt wurden, als "Toleranzvektoren" zur Herbeiführung einer spenderspezifischen Immuntoleranz bedingt weiterhin die Expression der spenderspezifischen MHC-Antigene. Diese Eigenschaft wird erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß Zellen der ECLs mit den Genen des Spenders, die für die MHC-Antigene codieren, transfiziert werden. Dies kann durch (i) Fusion der ECL mit einer gegebenen somatischen Zelle oder Zelllinie erfolgen, die die MHC-Gene, die von Interesse sind, aufweist, durch (ii) Transfektion der ECL mit einem gegebenen MHC- kodierenden Plasmid, durch (iii) Schaffung transgener Ratten mit einem MHC-kodierenden Plasmid und die Erstellung von ECL von dieser Rasse oder durch (iv) Peptid-Beladung der ECL mit MHC-Allopeptiden der Klasse I, die für die hochpolymorphe 0.1-Helix eines spezifischen MHC-Antigens der Klasse I kodieren. Für die Verabreichung der transfizierten Zellen stehen verschiedene Varianten, z.B. über die Portalvene, durch intraperitoneale, subkutane oder intravenöse Injektion, zur Verfügung.
In der klinischen Praxis der Organtransplantation wird dadurch die Möglichkeit geschaffen, die Alloreaktion der Empfänger durch die Verabreichung von ECLs, die die spenderspezifischen MHC-Antigene exprimieren, zu modifizieren. Eine exakte Phänotypisierung und morphologische Charakterisierung der von ECL abgeleiteten Abkömmlinge ermöglicht, ähnliche Zellen mit Stammzellenmerkmalen im erwachsenen Wirt zu suchen. Dies ermöglicht, zu einem besseren Verständnis der Plastizität der aus einem erwachsenenen Gewebe hergeleiteten Stammzellen zu kommen, die, alternativ zu den ECL, die ECL-Eigenschaften teilen und in ähnlicher Form verwendet werden können.
Ausführungsbeispiele:
1. Isolation und Kultivierung der Ratten-ECL
Mausembryofibroblasten (MEF) oder Rattenembryofibroblasten (REF) werden aus 13-14- Tage schwangeren Tieren bereitet, die mitotisch inaktiviert wurden durch 3 - 5 Behandlungen mit Mitomyzin C (10 μg/ml) 2 oder 1 Stunden lang, gewaschen mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) und in Nunc 4-Muldenschalen (well-dishes) gepflanzt. Die Blastozysten werden mit PBS/20 % FCS (fötales Kälberserum) oder einem Kulturmedium aus dem Uterus von 4,5 Tage schwangeren Ratten gespült, auf inaktivierte Embryofibroblasten gepflanzt und 3 - 4 Tage in DMEM/15 % FCS/2,500 μ/ml LIF („Leukemia inhibiting factor", ESGRO, Life Technologies) mit Zusätzen (Iannaccone et al, Dev. Biol. 1994;163:288-292) in einem Medium von 6% CO2/Luft unbehandelt belassen. In dieser Zeit entwickeln sich die Blastozysten und binden sich an den Versorger, und die ICM beginnt zu wachsen, wobei die Effizienz vom genetischen Hintergrund abhängt. Auswüchse mit einer ES-zellenartigen Erscheinung werden aufgenommen und in mehrere Klumpen zerbrochen durch Ansaugen in gezogene Glaskapillaren mit einem etwas geringeren Durchmesser als die Auswüchse und auf frische Versorgerplatten aufgebracht. Das Aufnehmen und Zerbrechen erfolgt entweder täglich oder jeden zweiten Tag. Zerfallene Kolonien werden reihenweise zurückgesetzt, bis man eine kleine Zahl sauberer, stabil wachsender ES-artiger Klumpen erhält. Die Population der Klumpen wird dann auf mehrere Dutzend erweitert, in 35 mm-Schalen aufbewahrt und leicht trypsiniert in ein Gemisch einzelner Zellen und kleiner Aggregate. Die hergestellten Ratten-ES-Zellen wurden jeden oder jeden zweiten Tag durch Trypsinierung (0,05 % Trypsin, 0,02 % EDTA-4Na, 1 % Hühnerserum, in Ca/Mg-freier PBS) passagiert. Die Artenidentität der sich ergebenden Zelllinien wird durch PCR, unter Anwendung von Renin-Gen-Primern (Brenin et al., Transplant. Proc. 1997;29:1761-1765), geprüft, um eine Verunreinigung durch Maus-ES-Zellen auszuschließen.
2. Intraportale Injektion von WKY-abgeleiteten ECL in allogene Wirtsratten
Eine erste Reihe von Experimenten untersuchte das Schicksal einer einmaligen intraportalen Injektion von 1,0 x 106 von WKY abgeleiteten ECL in allogene DA (RTl.avl)-Wirtsratten, die keinerlei immunsuppressive oder myeloablative Behandlung erhalten haben. Die Untersuchungen zeigen, daß diese Zellen langfristig (> 150 Tage) in DA- Wirtsratten überleben können. Dabei wurde herausgefunden, daß die ECL und ihre Abkömmlinge einen Zustand eines ständig gemischten Chimärismus (Hämatopoetische Zellen des Spenders und des Empfängers bestehen nebeneinander im gleichen Wirt) erzeugen können. Weiterhin wurde herausgefunden, daß sich diese Zellen in hämatopoetische Zellen differenzieren, die MHC-Antigene der Klasse II (Ox-3) und B-Zellenabstammungsmarker (Ox-45) exprimieren. Der monoklonale Antikörper (mAb) Ox-3 ist ein spezifischer Antikörper eines (WKY)- MHC-Spenders der Klasse II, der sich an MHC-Epitope der Klasse II bindet, die an WKY exprimiert werden, jedoch nicht an positive DA MHC-Zellen der Klasse II. Eine fließzytometrische Bestimmung von doppelt gefärbten Leukozyten (WBC) ergab, daß 3 bis 5 % der WBC, die DA-Ratten entnommen wurden (100 Tage nach der ECL-Injektion), Ox-3+- Zellen exprimierten, wobei 15 - 20 % der Milzlymphozytenpopulation Ox-3+ enthielten. Diese Ergebnisse weisen die Tatsache nach, daß ECL hämatopoetische Zellen erzeugen können. Dementsprechend wurden Ox-3+-Zellen histomorphologisch (10 - 15 %) im interstitiellen Raum der Empfänger- (DA-) Herzen nachgewiesen, die selektiv 100 Tage nach einer einmaligen intraportalen Injektion von 1,0 x 106 von WKY abgeleiteten ECL zerstört wurden (siehe Abb.l). Der stabile chimärische Zustand dieser Tiere schafft die Grundlage für die Untersuchung des Schicksals der WKY-Herzallotransplantats, die in DA-Ratten transplantiert wurden, sieben Tage nach der intraportalen ECL-Injektion. Kaplan Meier Diagramme zeigen, daß die Vorbehandlung der DA-Ratten mit 1,0 x 106 ECL intraportal und die Herztransplantation (HTx) sieben Tage später zu einer langfristigen (> 150 Tage) abstoßungsfreien Allotransplantatakzeptanz führten, während nichtbehandelte DA-Ratten die WKY-Allografts akut abstießen (siehe Abb. 2). Gleichzeitig wurden die Herzallotransplantate von CAP Ratten von mit WKY-ECL injizierten DA-Ratten innerhalb von 12,4 ± 1,4 Tagen abgestoßen, was die Immunkompetenz dieser Ratten beweist.
3. Ko-Kultivierung von ECL mit somatischen Zellinien
In primären in vitro Untersuchungen wurde nachgewiesen, dass die zuvor beschriebenen ECL Zellen durch Ko-Kultivierung mit somatischen Zellen neuronalen oder entodermalen Ursprungs, eine Differenzierung in Astrozyten respektive Kardiomyozyten und Hepatozyten annehmen. Damit eignen sich die beschriebenen embryonalen Zellinien auch zur Behandlung Organ-spezifischer Erkrankungen des Zentralnervensystems (z.B. als dopaminerge Zellen zur Behandlung des M. Parkinson, als Hepatozyten zur Behandlung der Leberzirrhose oder als Kardiomyozyten zur Behandlung frischer Herzinfarkte). Die nunmehr anstehende Isolierung der für diese spezifischen Differenzierungsformen notwendigen Signalproteine ist von großer klinischer Bedeutung, da sie ein problemloses Programmieren der ECLs zur gewünschten Zellpopulation ermöglichen konnte. Das Ziel besteht daher in der exakten Sequenzierung dieser Funktionsproteine, um deren rekombinante Herstellung zu ermöglichen. Die große Sequenzhomologie zwischen Ratten- und Menschprotein würde darüber hinaus auch Aufschlüsse zur analogen Herstellung menschlicher Funktionsproteine geben. Die damit verbundenen therapeutischen Anwendungsmoglichkeiten umfassen sowohl den voran beschriebenen Einsatz der ECL-abgeleiteten somatischen Zellinien als auch der daraus abgeleiteten Funktionsproteine für den zukünftigen klinischen Einsatz auf allen Indikationsebenen des Tissue-Engineering zum Organersatz, für Gentherapie und zur Behandlung metabolischer Erkrankungen im Bereich des ZNS, der Leber und des Herzens.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Erzeugung einer spenderspezifischen Immuntoleranz gegen transplantierte Gewebe, dadurch gekennzeichnet, daß dem Empfänger vor der Transplantation Zellen verabreicht werden, die von frühen Embryonalstadien, z.B. Blastozysten, abgeleitet wurden („embryonal stem cell like cell lines", ECL).
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die verabreichten Zellen mit MHC-Genen und/oder Reportergenen transfiziert wurden.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen mit den spenderspezifischen MHC-Genen transfiziert wurden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Transfektion durch eine Fusion der ECL mit einer somatischen Zelle oder Zelllinie erfolgt, die die spenderspezifischen MHC-Gene aufweisen.
5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Transfektion mit einem bestimmten MHC-kodierenden Plasmid erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Transfektion durch Schaffung transgener nichtmenschlicher Säugetiere mit einem MHC-kodierenden Plasmid und die Herstellung von ECL von diesen transgenen Tieren erfolgt.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Transfektion durch Peptid- Beladung der ECL mit MHC-Allopeptiden der Klasse I, die für die hochpolymorphe αi- Helix eines spezifischen MHC-Antigens der Klasse I kodieren, erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die verabreichten Zellen mit einem LacZ-Plasmid transfiziert wurden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß Zellen von humanen Zelllinien eingesetzt werden.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-9, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen 3-7 Tage vor der Transplantation zugeführt werden.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen intravenös zugeführt werden.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen intraportal zugeführt werden.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen subkutan zugeführt werden.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-10, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen intraperitoneal zugeführt werden.
15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ECL Zellinie als Ausgangszelle zur Differenzierung in neuronale Zellen mit spezifischer Transmitterfunktion (z.B Dopamin) programmiert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ECL Zellinie als Ausgangszelle zur Differenzierung in Hepatozyten zur Unterstützung der leberspezifischen Metabolismen programmiert wird.
17. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ECL Zellinie als Ausgangszelle zur Differenzierung in Kardiomyozyten zur Regeneration der Herzmuskelfunktion programmiert wird.
18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die infolge der Ko-Kultivierung gefundenen Signalproteine mit spezifischem Differenzierungspotential für neuronale Zellen (dopamin-produzierende Zellen), Hepatozyten und Kardiomyozyten als rekombinante Proteine hergestellt werden.
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