DE60114193T2

DE60114193T2 - Transfektionssystem

Info

Publication number: DE60114193T2
Application number: DE60114193T
Authority: DE
Inventors: Christoph Andree; Matthias Voigt; Björn G. STARK
Original assignee: Universitaetsklinikum Freiburg
Current assignee: Universitaetsklinikum Freiburg
Priority date: 2000-05-24
Filing date: 2001-05-23
Publication date: 2006-11-23
Anticipated expiration: 2021-05-24
Also published as: ATE306946T1; CA2410000C; EP1292340A1; AU2001260328A1; ES2252234T3; EP1292340B1; DE60114193D1; AU2007201342B2; DE10025609A1; CA2410000A1; JP4951185B2; JP2012021034A; WO2001089593A1; JP2004531453A; AU2007201342A1; US20040043007A1; JP2008208145A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Matrix-vermittelte Transfektionssysteme, wobei die Matrix aus einem selbst-härtenden Biopolymer besteht. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung eines Präparats, enthaltend Plasmid-DNA, eine Komponente des selbst-härtenden Materials und eine Zellsuspension der zu transfizierenden Zellen, das Präparat selbst und dessen Verwendung zur Behandlung von Gewebeverletzungen und -veränderungen.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Fibrin-vermitteltes Transfektionssystem für Zellen zur verbesserten Wundheilung, Geweberegeneration und Gewebereparatur.
Hintergrund der Erfindung
Gewebeverletzungen und deren Behandlungen stellen in der Medizin ein großes Problem dar. Sowohl bei operativen Eingriffen als auch durch Verschleiß, externen Einwirkungen wie Verletzungen durch Verbrennungen, Schlag usw., tritt ein entsprechendes Trauma des Gewebes auf, dessen Heilung und Regeneration entscheidend ist. Auch bei vielen Erkrankungen tritt eine Schädigung des Gewebes auf, beispielhaft sei hier die Psoriasis oder Arthritis genannt.
Es ist daher eine Aufgabe, Verfahren und Möglichkeiten zu entwickeln, die diese Heilungs- und Regenerationsprozesse verbessern und beschleunigen. Insbesondere bei großflächigen Gewebeschädigungen, wie Hautschädigungen, Knochenschädigungen und Knorpelschädigungen oder bei prädisponierten Personen, deren eigene Fähigkeiten der Regeneration und Heilung eingeschränkt sind, ist es notwendig, die sen natürlichen Prozeß zu unterstützen, insbesondere natürlich auch unter dem Gesichtspunkt, daß diese Regeneration so erfolgen soll, daß sie sich von der natürlichen Umgebung nicht unterscheidet, d.h. nicht durch unnatürliches Wachstum zu eingeschränktem und verändertem Gewebe führt, z. B. Narbenbildung. Zu diesem Zweck werden u. a. Matrizes eingesetzt, die den Heilungsprozeß unterstützen sollen. Diese Matrizes sind häufig so konstruiert, daß die Faktoren freisetzen, die den Heilungsprozeß unterstützen.
In konventionellen Verfahren wird eine Transplantation von Keratinozyten beispielsweise für großflächige Verbrennungen angewendet. Diese werden als autologe oder allogene Transplantate auf die Wunde aufgebracht. Diese Zellen werden als sogenannte „sheets", d.h. als mehrschichtige Zellagen auf die Wunde gepfropft. Dazu ist es notwendig, von dem Individuum vorher Keratinozyten zu gewinnen, diese zu isolieren und in vitro zu kultivieren, um mit einer unterstützenden Matrix mehrschichtige Zellagen auszubilden, damit diese dann auf die Wunde gepfropft werden können.
Eine weitere Möglichkeit, die Regeneration des geschädigten Gewebes zu beschleunigen, ist die externe Gabe von fördernden Faktoren. Diese Faktoren können einerseits das Wachstum der Zellen, die in die Regeneration involviert sind, fördern. Andererseits können diese Faktoren aber auch Prozesse hemmen, die der schnellen Regeneration entgegenwirken. Diese Faktoren, bei denen es sich vor allem um Wachstumsfaktoren handelt, wurden bisher auf verschiedene Art und Weise dem geschädigten Gewebe zugeführt, wie z. B. durch externe Applikation. Dieses hat aber den Nachteil, daß hohe Dosen zugeführt werden mussten. Weiterhin weist der Großteil der Faktoren in vivo nur eine kurze Halbwertszeit auf, so daß die Verabreichung mehrfach erfolgen musste. Bei der externen Verabreichung von Faktoren besteht auch die Gefahr, daß diese Verunreinigungen aufweisen können. Sowohl bei der Aufreinigung von natürlichen Quellen, als auch bei der rekombinanten Herstellung der Faktoren besteht die Gefahr, daß Verunreinigungen in den Präparationen enthalten sind, die einen negativen Effekt auf den Verlauf der Regeneration haben können. Daher stellte sich die externe Gabe von Mediatoren, wie Wachstumsfaktoren, als ein ineffizientes System heraus, vor allem auch unter dem Gesichtspunkt, daß einige Mediatoren überhaupt nicht extern verabreicht werden können.
Daher wird seit kurzem versucht, durch Transfektion von Zellen (Gentransfer) diese Wachstumsfaktoren in vivo zu erzeugen. Andree et al. (PNAS, 91, S. 12188–12192, 1994) konnten zeigen, daß der in vivo Transfer eines Plasmids, das ein Gen enthält, das für einen Wachstumsfaktor für die Epidermis kodiert, in Keratinozyten die Wundheilung im Tiermodell verbessert. Der Gentransfer wurde mit einem herkömmlichen Verfahren mittels einer so genannten „gene gun" durchgeführt, wobei die an einen Träger gekoppelten Plasmide auf die Wunde und die darin vorkommenden Zellen eingebracht werden. Die Zellen werden dann unspezifisch mit den Plasmiden transfiziert. Trotz einem schnellen Verheilen der Wunde wurde bei diesem Transfektionssytem beobachtet, daß der Faktor nur von Zellen exprimiert wird, die am Rande der Wunde zu diesem Zeitpunkt vorhanden waren. Auch ist mit diesem Verfahren keine spezifische Transfektion möglich. Eine systematische Verabreichung von Faktoren ist aber wünschenswert. Hierfür eignet sich die Transfektion von Zellen besonders gut.
Bisher sind allerdings im wesentlichen nur Transfektionsverfahren von Zellen bekannt, bei denen durch externe Träger die DNA in die Zelle eingebracht wird. Dabei gelangt aber auch der Träger in die Zelle, was negative Folgen haben kann.
Bekannte Transfektionsverfahren schließen die virale Transfektion mit Retroviren, Adenoviren oder anderen Viren ein. Das größte Problem bei der Transfektion von eukaryontischen Zellen ist die Effektivität der Transfektion. Weiterhin besteht ein großes Problem gerade bei den viralen Vektoren in deren Tropismus, d.h. deren Affinität gegenüber bestimmten Zellarten. Daher werden bereits adenovirale Vektoren verwendet, die einen breiten Tropismus aufweisen und auch Zellen wie Muskelzellen, Hepatozyten, Synovialzellen, Epithelzellen und ähnliche transfizieren. Weiterhin sind Adenoviren in der Lage, Zellen, die sich nicht teilen, zu transfizieren.
Die Transfektion von Zellen durch virale Vektoren weist aber einige Nachteile auf. Da die Position, wo die Integration des Vektors erfolgt, zufällig ist, können diese Zellen transformiert werden und Gene, die für das Leben der Zelle kritisch sein können verändert werden. Viren und virale Vektoren können eine hohe Polymorphismusrate aufweisen, und dies kann zu inaktiven Vektoren oder Genen führen. Wie bereits angesprochen stellt der Tropismus der viralen Vektoren ein weiteres Problem dar.
Auch Adenoviren weisen, obwohl sie in der Lage sind nicht-proliferierende Zellen zu transfizieren, die oben genannten Nachteile der viralen Vektoren auf, d. h. sie integrieren zufällig in das Genom der Zielzelle. Dadurch können andere wichtige Gene zerstört werden. Die Polymorphismusraten in Viren sind hoch und letztendlich müssen diese erst rekombinant hergestellten Viren propagiert und zur Transfektion aufbereitet werden.
Andere Transfektionssysteme mit nicht-viralen Zusammensetzungen sind z. B. Liposomen-vermittelte Verfahren (z.B. Lipofektin^®). Ein Nachteil dieser Liposomen ist z. B. eine verbleibende Zytotoxizität des liposomalen Transfektionsagens gegenüber den Zielzellen. D. h. durch das Transfektionsagens selbst werden die zu transfizierenden Zellen (Zielzellen) geschädigt, so daß sie sterben.
Weiterhin sind polykationische Systeme, Systeme unter Verwendung von Calcium (Calciumphosphat-DNA Präzipitationen), DEAE-Dextran-Transfektionen und andere beschrieben.
Als mechanische Verfahren zur Transfektion von Zellen sind die Elektroporation von Zellen oder das bereits genannte „gene gun"-Verfahren bekannt.
Mit dem „gene gun"-Verfahren kann direkt die nackte DNA oder die mit Liposomen oder anderen Trägermolekülen assoziierte DNA auf die zu transfizierenden Zellen geschossen werden. Dieses Verfahren erlaubt zwar z. T. die Transfektion von Zellen ohne Träger, stellt aber ein zufälliges Transfizieren der Zelle dar, ohne daß die Menge an transfiziertem Material bestimmt werden kann. Die Spezifizität des Systems ist ebenfalls nicht gegeben, vor allem bei der transienten Transfektion von Zellen. Bei der Transfektion mittels Elektroporation ist der Nachteil, daß die Transfektion in vitro in einer speziellen Apparatur geschieht. Die Zellen müssen erst propagiert werden. Dabei sind verschiedene Arbeitsschritte notwendig und die Gefahr einer Kontamination der Zellsuspension ist groß. Auch wurden schon Versuche unternommen, DNA direkt ohne Hilfsmittel in Zellen zu transfizieren. Hier ist aber die Transfektionseffizienz zu niedrig.
Es ist daher notwendig, andere Transfektionssysteme zu entwickeln, die die oben genannten Nachteile überwinden.
In WO 97/38729 wurde beschrieben, daß eine verbesserte Transfektionseffizienz von Zellen erzielt werden kann, wenn dem zu behandelnden Patienten das Plasmid zusammen mit einer Matrix verabreicht wird. Zellen, die in den geschädigten Bereich wandern, wo diese Matrix zusammen mit dem Plasmid aufgebracht wurde, weisen dann eine effektivere Transfektion auf. Bei diesem Verfahren ist es notwendig, daß die Zellen zu den Matrix wandern, um das Plasmid aufzunehmen. Weiterhin bedeutet dies, daß keine homogene Verteilung der Zellen bei der Regeneration des geschädigten Bereichs vorliegt, sondern die Zellen vom Rand aus transfiziert werden. Eine gleichzeitige Transfektion ist also nicht gegeben.
In DE 197 16 098 A1 wurde beschrieben, daß mit einem Fremdgen transfizierte Fibroblasten, wobei das Fremdgen für einen die Wundheilung fördernden Faktor kodiert, zur Behandlung von Wunden verwendet werden können. Diese Fibroblasten stellen aber nur ein Medium dar, das die externe Gabe von dem zur Wundheilung fördernden Faktor vermeiden soll.
Die verabreichten Fibroblasten selbst sind so bestrahlt worden, daß sie sich nicht mehr teilen können. Sie nehmen somit nicht selbst als Zelle an der Wundheilung teil. Des weiteren stellt die in DE 197 16 098 beschriebene Fibroblastenzellinie eine immortalisierte Zellinie dar, die permanent mit dem Plasmid transfiziert ist. Eine permanente Transfektion der Zellen ist aber nicht in jedem Fall wünschenswert, sondern es ist eher bevorzugt, daß eine transiente Transfektion der Zellen erfolgt, damit nur über einen bestimmten Zeitraum die Expression des durch das Plasmid kodierenden Faktors erfolgt. Nach Abschluß der Wundheilung ist eine weitere Expression dieses Faktors nicht wünschenswert. Im Gegenteil, dieses könnte beispielsweise die Narbenbildung und eine anormale Ausbildung der Gewebestruktur fördern, die unerwünscht ist.
Vor kurzem wurde von Horch et al. (Cell Transplantation, 7, 3, S. 309–317, 1998) beschrieben, daß im Nacktmaus-Tiermodell eine Einzelzellsuspension von kultivierten Keratinozyten mit Hilfe eines Fibrinklebers auf die Wunde aufgebracht wurde. Dadurch war es möglich, eine Epidermis von guter Qualität zu rekonstruieren. Durch dieses Verfahren ist es bereits möglich, die Zeit zwischen Entnahme der Zellen und dem Transplantieren der expandierten Zellen zu verkürzen.
Daher war es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine einfaches, sofort verfügbares System bereitzustellen, mit dem mit minimalem Zeitaufwand und möglichst kleinen operativen Eingriffen in Patienten, die unter größeren – akuten oder chronischen – Gewebeverletzungen leiden, Zellen, insbesondere autologe Zellen, bereitgestellt werden, die mit Genen, die Substanzen kodieren, die einen positiven Effekt auf die Wundheilung haben, transfiziert werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Wundheilung und zur Reparatur und Regeneration von Gewebe. Erfindungsgemäß wird dieses durch folgende Schritte erreicht:

(a) Bereitstellung einer Plasmid-DNA in im wesentlichen reiner Form, die ein Gen kodiert, das einen positiven Effekt auf den Verlauf der Regeneration des Gewebes ausübt,
(b) Bereitstellung einer Komponente bzw. von Komponenten eines selbsthärtenden Biopolymers und
(c) Bereitstellung einer Zellsuspension mit Zellen, welche die Regeneration fördern,

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Wundheilung und zur Reparatur und Regeneration des geschädigten Gewebes selbst. Diese Zusammensetzung umfaßt:

(a) eine Plasmid-DNA, die ein Gen kodiert, das einen positiven Effekt auf den Verlauf der Wundheilung bzw. Reparatur und Regeneration des Gewebes ausübt, in im wesentlichen reiner Form;
(b) Komponente(n) eines selbst-härtenden Biopolymers und
(c) eine Zellsuspension von Zellen, die involviert sind in die Wundheilung bzw. Reparatur und Regeneration des geschädigten Gewebes.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung kann diese Zubereitung zur Behandlung von geschädigtem Gewebe und zur Wundbehandlung eingesetzt werden. Des weiteren betrifft die Erfindung ein Kit, enthaltend ein Plasmid, welches ein Gen umfaßt, das eine Substanz, vorzugsweise ein Protein, kodiert, das einen positiven Effekt auf den Wundheilungsprozeß und Regenerationsprozeß des geschädigten Gewebes hat, eine Zellsuspension von Zellen, die in die Regeneration des geschädigten Gewebes involviert ist, und eine Komponente eines selbst-härtenden Biopolymers, sowie gegebenenfalls eine zweite Komponente dieses Biopolymers, welche für die Aushärtung oder Verfestigung des Polymers notwendig ist oder diese vereinfacht.
Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Herstellung eines Medikaments zum Behandeln von Gewebedefekten unter Verwendung einer Zusammensetzung, hergestellt gemäß der vorliegenden Erfindung, eine hierin definierte pharmazeutische Zusammensetzung oder ein Kit gemäß der vorliegenden Erfindung.
Beschreibung der Figuren
1: In vitro-Transfektionen von kultivierten humanen Keratinozyten mit dem EGF-Plasmid unter Verwendung des erfindungsgemäßen Tranfektionssystems. Die Zellen wurden für 3 Stunden mit dem humanen EGF-Plasmid in der Thrombinkomponente (Gruppe 1a) oder mit EGF-Plasmid ohne Thrombin (Gruppe 2a) oder mit Zellen ohne Plasmid und ohne Thrombin (Gruppe 3a) inkubiert. Die EGF- Proteiniveaus wurden an den Tagen 1, 3, 5, 7, 10 und 14 gemessen.
2: In vitro-Transfektion von nicht-kultivierten humanen Keratinozyten mit dem EGF-Plasmid unter Verwendung des erfindungsgemäßen Transfektionssystems. Die Zellen wurden für 3 Stunden mit humanem EGF-Plasmid in der Thrombinkomponente (Gruppe 1b) oder mit EGF-Plasmid ohne Thrombin (Gruppe 2b) oder mit Zellen ohne Plasmid und ohne Thrombin (Gruppe 3b) inkubiert. Die EGF-Proteinniveaus wurden an den Tagen 1, 2, 3, 4 und 5 gemessen.
3: In vivo-Transfektion von kultivierten humanen Keratinozyten mit hEGF-Plasmid unter Verwendung des erfindungsgemäßen Transfektionssystems. In Gruppe 1a wurden Zellen mit EGF inkubiert, anschließend in der Thrombinkomponente des Fibrinklebers suspendiert und auf eine großflächige Wunde (engl.: full thickness wound) von Nacktmäusen transplantiert. Biopsien wurden an den Tagen 1, 3, 5, und 7 genommen und die Proteinniveaus in den homogenisierten Wunden mittels ELISA bestimmt. Kontrollwunden (Gruppe 2a) wurden mit Zellen, die mit humanem b-Galactosidase-Plasmid präinkubiert waren, behandelt.
4: In vivo-Transfektion von nicht-kultivierten humanen Keratinozyten mit humanem EGF-Plasmid. In Gruppe 1b wurden Zellen mit EGF inkubiert, anschließend in der Thrombinkomponente des Fibrinklebers suspendiert und auf eine großflächige Wunde von Nacktmäusen transplantiert. Biopsien wurden an den Tagen 1, 3, 5, und 7 genommen und die Proteinniveaus in den homogenisierten Wunden mittels ELISA bestimmt. Kontrollwunden (Gruppe 2b) wurden mit Zellen, die mit humanem b-Galactosidase-Plasmid präinkubiert waren, behandelt
5: Bestimmung der optimalen Keratinozyten-Konzentration. Unterschiedliche Anzahlen von Keratinozyten wurden mit 200 μg EGF-Plasmid in 5.7 μl PBS-Puffer transfiziert und für 3 h präinkubiert. Das Volumen des Koagulats betrug 333 μl, die EGF-Expression wurde nach 1, 3, 5 und 7 Tagen gemessen.
6–9: Histologien der Re-Epithelisierung von großflächigen Wunden, wie beschrieben in Beispiel 1, wurden nach unterschiedlichen Behandlungen (Gruppen 1–4) durchgeführt. Bei all diesen Untersuchungen war die Menge des verwendeten Fibrins 333 μl, die Menge an EGF-Plasmid war 200 μg und Biopsien wurden an Tag 12 genommen. Die verwendete Vergrößerung betrug 2,5.
6: Behandlung großflächiger Wunden mit Fibrin und EGF-Plasmid (Gruppe 1).
7: Behandlung großflächiger Wunden mit Fibrin und Keratinozyten (Gruppe 2).
8: Behandlung großflächiger Wunden mit Fibrin, EGF-Plasmid und Endothelzellen (Gruppe 3).
9: Behandlung großflächiger Wunden mit Fibrin, EGF-Plasmid und Keratinozyten (Gruppe 4).
10: Wie 9, jedoch mit einer Vergrößerung von 10.
11: Transfektion verschiedener Zelltypen mit dem erfindungsgemäßen Transfektionssystem.
Definitionen, der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Ausdrücke:
"Gewebedefekte" schließen hier sowohl großflächige Wunden (engl.: full thickness wounds), wie sie z. B. bei großflächigen Verbrennungen auftreten, als auch andere Schädigungen der Haut, genauso wie Schädigungen von Knochen, Knorpeln, Nerven und anderen Geweben ein.
Das "selbst-härtende Biopolymer" ist ein biologisch abbaubares, biokompatibles Biopolymer, das erfindungsgemäß durch die Zugabe oder die Anwesenheit einer zweiten Komponente aushärtet oder sich selbst verfestigt. Es umfaßt sowohl natürliche Zusammensetzungen, also auch synthetische Substanzen.
Ein "Gen mit positivem Effekt" auf die Regeneration des geschädigten bzw. defekten Gewebes schließt alle DNA-Sequenzen ein, die einen fördernden Effekt auf die Re generation aufweisen, wenn sie als ein Protein oder Polypeptid, aber auch als Antisense-Molekül oder als Ribozym translatiert werden.
"Zellen, die in die Wundheilung involviert sind" schließen sowohl Zellen ein, die selbst Gewebe neu bilden, als auch Zellen, die in der Lage sind, negative Faktoren zu inhibieren.
"Reparaturzellen" sind Zellen, die aktiv in den geeigneten Wundheilungs- und/oder Reparaturprozessen involviert sind und die unter Verwendung eines Transfektionssystems gemäß der vorliegenden Erfindung stimuliert und/oder aktiviert werden können.
"Stützzellen" sind nicht Zellen, die direkt oder aktiv in den geeigneten Wundheilungs- und/oder Reparaturprozessen involviert sind.
Beispielsweise wäre in der Wundreparatur ein geeignetes Reparatur-/Stützzellen-Paar zum Beschleunigen des Prozesses der Re-Epithelialisierung Keratinozyten/endotheliale Zellen. Andere geeignete Paare von Reparatur-/Stützzellen-Paaren sind gemäß der/des zu heilende(n), reparierende(n) und/oder regenerierende(n) Wunde/Gewebe zu definieren.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine neues Verfahren zur Verfügung, die keine Extrakomponenten zur Transfektion der Zellen in vitro benötigt, d. h. es sind keine Hilfsmittel zur Transfektion, wie virale Vektoren, Liposomen, usw. oder Verfahren wie z. B. Elektroporation, notwendig. Weiterhin sind keine Transfektions-vermittelnde Substanzen notwendig, wie z. B. Poly-Lysin. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Transfektion von Zellen durch Plasmide wird durch eine selbst-härtende Biopolymermatrix bewirkt. Diese Transfektion kann in vitro oder in vivo bewirkt werden, bevorzugt findet die Transfektion ex vivo statt. Entscheidend dabei ist, daß eine Zusammensetzung enthaltend die oben genannten Komponenten, d. h. die Zellen, das Plasmid und die selbst-härtende Biopolymermatrix bzw. eine Komponente davon, gemeinsam auf die geschädigte Fläche appliziert wird. Dabei sind die Zellen entweder bereits vor Pfropfen bzw. Transplantation der Zusammensetzung auf den geschädigten Bereich transfiziert oder die Transfektion erfolgt unmittelbar nach der Verabreichung der Zusammensetzung auf das geschädigte Gewebe, bevorzugt findet die Transfektion der Zelle ex vivo statt, so daß die gleichförmig verteilten Zellen in einem transfizierten Zustand vorliegen. Das selbst-härtende Biopolymer kann bereits bei der Verabreichung auf die geschädigte Gewebefläche bzw. den Gewebedefekt ausgehärtet, verfestigt oder geliert sein bzw. werden. Ebenso kann die Aushärtung aber auch nach Verabreichung der Zusammensetzung auf den zu behandelnden Bereich erfolgen. Die Zusammensetzung kann aber auch in zwei Komponenten vorliegen, wobei eine Komponente das aushärtbare Biopolymer, die Zellen und das Plasmid enthält, während die zweite Komponente eine weitere Verbindung zur Aushärtung des Biopolymers enthält. Die zweite Komponente kann aber auch durch das zu behandelnde Gewebe selbst, sozusagen in vivo, zur Verfügung gestellt werden, z. B. Thrombin bei einem Fibrinkleber, welche dann das Aushärten des Biopolymers in vivo ermöglicht. Die letztere Möglichkeit stellt eine weitere bevorzugte Form dar.
Des weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein transientes Transfektionssystem zur Verfügung, umfassend eine Plasmid-DNA, die ein Gen kodiert, das einen positiven Effekt auf den Verlauf der Regeneration des Gewebes ausübt, eine Zellsuspension von Zellen, die zu transfizieren sind und ein selbst-härtendes Biopolymer. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Transfektionssystem, umfassend Zellen, die in der Wundheilung und in der Regeneration und Reparatur von Gewebedefekten, insbesondere der Haut, involviert sind, mit einem Plasmid, das ein Gen kodiert, welches eine zu exprimierende Substanz kodiert, und ein selbsthärtendes Biopolymer, wie eine Komponente/Komponenten eines Fibrinklebers.
Die Komponente des selbst-härtenden Biopolymers ermöglicht ein besseres Eindringen des Plasmids/Aufnehmen durch die Zellen. Das nicht gebundene Plasmid wird leichter durch die Zellen aufgenommen, die Transfektionsrate ist stark verbessert, ohne daß weitere Transfektions-fördernde oder -vermittelnde Substanzen verwendet werden
Weiterhin ist es mit Hilfe dieses Transfektionssystems möglich, transfizierte Zellen, welche die Wundheilung und Regeneration des geschädigten Gewebes beschleunigen, homogen auf den geschädigten Bereich aufzutragen. Damit ist es möglich, den geschädigten Bereich, wie z. B. eine großflächige Wunde, komplett abzudecken, so daß die Wundheilung bzw. Regeneration des geschädigten bzw. defekten Gewebes schnell geschieht. Dabei beschleunigt die durch die transfizierten Zellen exprimierte Substanz die Heilung.
Das erfindungsgemäße Transfektionssystem erlaubt auch die ex vivo Herstellung von lebenden Zellkonstrukten, d. h. von transfizierten Zellen, ohne daß andere Transfektions-fördernde oder -vermittelnde Substanzen als die Biopolymerkomponente verwendet werden.
Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein einfaches, sofort verfügbares System bereit, mit dem mit minimalem Zeitaufwand und möglichst kleinen operativen Eingriffen in Patienten, die unter großen Verbrennungswunden oder chronischen Wunden leiden, autologe Zellen, bereitgestellt werden, die mit Genen, die Proteine beziehungsweise Peptide kodieren, die einen positiven Effekt auf die Wundheilung haben, transfiziert werden oder worden sind.
Der Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt in der schnellen Verfügbarkeit von transfizierten, autologen/allogenen Zellen, die in sich das Potential tragen, Zelldefekte auszugleichen und gleichzeitig durch Eigensynthese die notwendigen Stoffe in optimaler Form bereitstellen. Weiterhin ist es durch die homogene Verteilung der transfizierten Zellen möglich, schnell einen therapeutischen Effekt zu erzielen. Dieses trifft besonders auf die Wundheilung der Haut zu.
Mit Hilfe des Systems wird die sofortige Verfügbarkeit von transfizierten Zellen gesteigert, ohne daß vorher aufwendige labortechnische Schritte und langwierige Kultur- und Selektionsverfahren notwendig sind, die des weiteren die Gefahr von Kontamination bergen und einen hohen Zeitverlust bedeuten.
Weiterhin umfaßt die vorliegende Erfindung ein Kit, enthaltend die Bestandteile des Transfektionssystems, d. h. ein Plasmid, enthaltend ein Gen/Gene, die eine Substanz, insbesondere ein Protein/Peptid, kodieren, die einen positiven Effekt auf die Regeneration des Gewebes hat, Zielzellen, die transfiziert sind sowie das selbst-härtende Polymer bzw. eine Komponente davon.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Zubereitung kann zur Behandlung von geschädigtem bzw. defektem Gewebe, insbesondere großflächigen Wunden, wie der Haut, verwendet werden. Es erlaubt also die Behandlung von Menschen und Tieren mit geschädigtem bzw. defektem Gewebe und großflächigen Wunden, insbesondere von Hautwunden. Beispiele für bevorzugt behandelte Krankheiten oder Störungen beinhalten Verbrennungswunden, Knochen-, Muskel-, Nerven- oder Knorpeldefekte, chronische Wunden oder Gewebeaugmentationen, besonders bevorzugt ist eine Methode zur Wundheilung in der Haut.
Die erfindungsgemäß erhaltene Zusammensetzung erlaubt die schnelle therapeutische Behandlung von geschädigtem bzw. defektem Gewebe. Insbesondere ist es durch die homogene Verteilung der transfizierten Zellen möglich, großflächige Wunden schnell und homogen zu behandeln. Insbesondere kann auch die unästhetische Narbenbildung bei großflächigen Wunden reduziert oder vermieden werden.
Die Zielzellen, die durch das erfindungsgemäße Transfektionssystem transfiziert werden, liegen nach einer möglichen Alternative bereits in der Matrix in transfizierter Form vor. Diese Zellen sind homogen in der Matrix verteilt, so daß eine homogene Heilung erfolgen kann. Erfindungemäß wird also auf das geschädigte Gewebe eine Matrix aufgebracht, welche die ex vivo transfizierten Zielzellen enthält, die wiederum Gene enthalten, die für Substanzen kodieren, die einen positiven Effekt auf die Regeneration des geschädigten Gewebes haben. Die Transfektion der Zellen kann aber nach einer weiteren Alternative auch erst nach dem Auftragen in der Matrix erfolgen. Durch die homogene Verteilung des Plasmids und der Zellen ist eine homogene Transfektion der Zellen möglich, die dann zu einer homogenen Expression des Faktors führt, der einen positiven Effekt auf den Fortgang bzw. Verlauf der Regeneration ausübt.
Zur Transfektion von Zellen können mehrere Parameter wie z. B. Puffer, Pufferkonzentration, Zeitabschnitt oder Verhältnisse von Puffer zu selbst-härtender Polymerkomponente für die unterschiedlichen Zelltypen optimiert werden. Im Besonderen wurde gefunden, daß die Anwesenheit von CaCl₂, besonders in den verwendeten geringen Mengen, keinen Effekt auf die Transfektionseffizienz hat.
Unter selbst-härtendem Polymer wird erfindungsgemäß insbesondere eine solche Substanz verstanden, der nach dem sogenannten Aushärten geänderte physikalische Eigenschaften aufweist, beispielsweise eine unterschiedliche Viskosität.
So liegt das selbst-härtende Polymer beispielsweise nach dem Aushärten als ein Gel vor, während der Stoff vor Aushärtung eine unterschiedliche, insbesondere niedrigere Viskosität hatte.
Als Biopolymer, welches selbst-härtend und biologisch abbaubar sein kann, können insbesondere folgende Verbindungen genannt werden: Fibrinkleber oder Komponenten davon, Collagene, Gelatine, Alginate, Hyaluronsäure, Polysaccharide, organische Polymere (z B. PEG, PGA, PLA), Derivate davon bzw. verschiedene Kombinationen dieser Substanzen.
Gewebeklebstoffe auf Basis von Fibrinogen sind z. B. aus AT-B-359 653, AT-B-359 652 und AT-B-369 990 bekannt. Sie enthalten neben Fibrinogen noch einen Faktor, der das Fibrinogen in Fibrin umwandelt. Dieser kann z B. Thrombin sein. Durch Einwirkung von Thrombin wird das enthaltene Fibrinogen in Fibrin überführt. Der im Gewebekleber gegebenenfalls enthaltene Faktor XIII wird zu Faktor XIIIa aktiviert. Dieser vernetzt das gebildete Fibrin zu einem Hochpolymer. Die benötigte Thrombinaktivität wird in Form einer Thrombin und Ca²⁺-Ionen enthaltenden Lösung dem Fibrinogen zugesetzt. Das Fibrinogen kann des weiteren noch weitere Proteine, wie Fibronectin, Plasminogen und Albumin, enthalten.
Der Gewebeklebstoff kann z B. einer wie in DE 195 21 324 oder in EP 0 345 246 beschriebener sein; besonders bevorzugt wird ein Fibrinkleber, wie er unter dem Handelsnamen Tissucol^® von Baxter, Deutschland, erhältlich ist, verwendet.
Bevorzugt wird die Plasmid-DNA in die Thrombinkomponente des Fibrinklebers gemischt. Ebenso werden die Zellen bevorzugt in die Thrombinkomponente gegeben und dort vermischt, da die Fibrinogenkomponente eine höhere Viskosität aufweist. Die Plasmid-DNA und die Zellsuspension kann aber ebenso in die Fibrinogenkomponente gemischt sein. Wenn die Plasmid-DNA und die Zellsuspension in die Fibrinogenkomponente gemischt wird, kann das Thrombin durch das zu behandelnde Gewebe selbst, d. h. in vivo, zur Verfügung gestellt werden.
Das erfindungsgemäße Biopolymer fördert die Effizienz der Transfektion, wird aber gleichzeitig auch als Kultivierungsmatrix für die Zellen verwendet. Das heißt, daß die Transfektion und die Kultivierung in vivo in derselben Matrix erfolgen und keine weiteren Aufreinigungs- und Isolierungsschritte und keine weiteren Transfektionsfördernden Mittel sind erforderlich. Insbesondere sind keine Transfektionsvermittelnde Stoffe, wie z B. Poly-Lysin notwendig, die eine "Vermittlerrolle" zwischen der Matrix und den Plasmid einnehmen. Anders gesagt, das Plasmid liegt nicht an die Matrix gebunden vor, sondern als freies Plasmid.
Die Matrixkomponente kann in verschiedenen Formen vorliegen, sowohl in lyophylisierter als auch in flüssiger Form, als trockenes Pulver, Mikropartikel oder Nanopartikel. Es ist des weiteren möglich, daß das Biopolymer als bereits ausgehärtete Matrix in einer gelartigen Masse vorliegt, enthaltend die transfizierten Zellen und das Plasmid in einer homogenen Verteilung.
Plasmid-Biopolymer-Kombinationen können auf das entsprechende Gewebe entweder gemeinsam oder hintereinander aufgebracht, insbesondere aufgesprüht, werden.
Die Zellen, die erfindungsgemäß bei dem Verfahren zur Herstellung des Präparats verwendet werden und damit in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung ent halten sind, umfassen alle Zellarten, die einen positiven Effekt auf die Regeneration des Gewebes haben. Insbesondere handelt es sich um Keratinozyten, Thrombozyten, Osteoblasten, Osteoklasten, Fibroblasten, Epithel- und Endothelzellen, Muskelzellen, Adipozyten, Myoblasten, Schwann-Zellen, andere Bindegewebszellen oder Vorläufer davon usw. Besonders bevorzugt sind Zellen, die bei der Wundheilung der Haut eine wesentliche Rolle spielen, wie Keratinozyten.
Die Zellen sind vorzugsweise autologe oder allogene Zellen. Die Zellen, wie sie erfindungsgemäß verwendet werden, können vorher kultiviert worden sein oder frisch isoliert, d. h. nicht-kultiviert, sein.
Das Plasmid enthaltend ein Gen/Gene, das (die) für eine Substanz kodiert, die einen positiven Effekt auf die Regeneration des Gewebes hat, kann ein Expressionsplasmid sein, wie es herkömmerlicherweise zur Expression von Genen in eukaryontischen Zellen verwendet wird.
Das Gen/die Gene bzw. die DNA, das/die im Plasmid enthalten ist/sind, kann für Protein(e) bzw. Peptid(e) kodieren, die einen positiven Effekt auf die Geweberegeneration haben. Insbesondere kodiert dieses Gen für Faktoren wie Wachstumsfaktoren, Zytokine, therapeutische Proteine, Hormone und Peptidfragmente von Hormonen, Zytokininhibitoren, peptidische Wachstums- und Differenzierungsfaktoren. Beispielhaft sollen hier genannt werden: Moleküle der TGF-β-Superfamilie, wie die verschiedenen TGF-β-Isoformen; Keratinozyten-, Hepatozyten-, epidermaler Wachstumsfaktor, PDGF, EGF, VEGF, NGF, Erythropoietin, TPA, FGF-1 und FGF-2. Weiterhin Hormone wie Wachstumshormon, PTH, usw. Peptide, die agonistische oder antagonistische Aktivitäten auf Rezeptoren oder auf andere Moleküle haben, die bei pathologischen Prozessen eine Rolle aufgrund einer veränderten Expression spielen.
Diese Faktoren können alleine oder in Kombination eingesetzt werden.
Das Plasmid kann eine oder mehrere DNA-Sequenzen enthalten, die für ein oder mehrere der oben genannten Faktoren kodieren.
Erfindungsgemäß kann es allerdings auch für eine antisense-RNA oder Ribozym-RNA kodieren, die dann Faktoren hemmen, die mit der Wundheilung interferieren.
Das erfindungsgemäße Präparat und das erfindungsgemäße Kit können insbesondere für therapeutische Anwendungen verwendet werden. Sie sind geeignet zur Behandlung von geschädigtem bzw. defektem Gewebe, wie geschädigten bzw. defekten Knochen, Knorpeln, Muskeln, Nerven oder Hautpartien, insbesondere sind sie bei der Heilung von Hautwunden nützlich. Somit ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von defekten Geweben, umfassend ein selbsthärtendes Biopolymer, ein Plasmid mit den vorstehend genannten Eigenschaften und Ziel- insbesondere Reparaturzellen, die in den Regenerationsprozeß des defekten Gewebes, insbesondere der Heilung von Hautwunden, involviert sind.
Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können in mehreren Komponenten vorliegen. Abgesehen von den Zielzellen, die kurz vor der Verwendung des pharmazeutischen Präparates zugegeben werden, kann die pharmazeutische Zusammensetzung in flüssiger, lyophilisierter oder tiefgefrorener Form vorliegen.
Die Einsatzgebiete der pharmazeutischen Zusammensetzung umfassen insbesondere Humanmedizin, Veterinärmedizin und Zahnmedizin.
Die relativen Mengen von Plasmid, Biopolymerkomponente und Zeilen können abhängig von der Art des zu behandelnden Gewebes gezielt eingestellt werden bzw. variiert werden. Beispielsweise beträgt das Verhältnis von Plasmid zu Biopolymerkomponente wenigstens 5 μg/ml und liegt vorzugsweise zwischen 5 und 100 μg/ml. Besonders bevorzugte Bereiche sind 5–25 μg/ml und Werte um 50 μg/ml.
Das Verhältnis von Zellen zu Plasmid liegt beispielsweise zwischen 25.000 und 2.500.000 Zellen/μg Plasmid. Bevorzugte Bereiche sind 25.000–75.000 Zellen/μg Plasmid, 75.000–100.000 und 250.000–750.000.
Auch das Verhältnis von Zellen zu Biopolymerkomponente kann entsprechend für jeden zu behandelnden Zelltyp und/oder jede(s) Wunde/Gewebe eingestellt und optimiert werden. Die Anzahl der Zellen pro ml des Biopolymers kann in einem breiten Bereich variieren, z. B. zwischen 100 000 und 8 Millionen Zellen pro ml der Biopolymerkomponente(n).
Für Keratinozyten liegt ein bevorzugter Bereich zwischen 200 000 und 6 Millionen, besonders bevorzugt ist eine Menge um 3 Millionen Zellen pro ml einer Biopolymerkomponente (= 6 Millionen Zellen pro ml Koagulat, welches aus einem 1:1 Gemisch von 2 Komponenten gebildet wird).
Die Verhältnisse hängen insbesondere auch davon ab, ob eine in vitro- oder eine in vivo-Transfektion durchgeführt wird. In vivo meint insbesondere die Transfektion der ex vivo zu der Matrix zugegebenen Zellen, die homogen in der Matrix verteilt sind, mit der ebenfalls homogen verteilten Plasmid-DNA. So liegt beispielsweise das Verhältnis von Zellen pro ml Biopolymerkomponente bei einer in vivo-Transfektion um einen Faktor 3–10, vorzugsweise 4–6, höher als bei einer in vitro-Transfektion.
Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgend aufgeführten Beispiele weiter erläutert.
Beispiel 1
Erhöhung der Transfektionsrate durch die Anwesenheit eines selbst-härtenden Biopolymers
Expressionsplasmid: Als Expressionsplasmid wurden in diesem Beispiel pCMVβ-Gal und CMVhEGF verwendet, welche bereits von Andree et al. (supra) beschrieben wurden. Das EGF-Expressionsplasmid besteht aus dem sehr frühen Trans kriptionspromotor des CMV und kodiert das sekretorische Signalpeptid des humanen Wachstumsfaktors (hGF) und das reife EGF-Polypeptid in einer In-Leserahmen-Fusion.
Als Fibrinkleber wurde Tissucol^® von Baxter, Heidelberg, Deutschland, verwendet. Dieser Zweikomponenten Fibrinkleber besteht aus heterologen humanen Plasmaprotein-Fraktionen, der Fibrinogen- und der Thrombinkomponente. Die Fibrinogenkomponente enthält Fibrinogen, Plasmafibronektin, Faktor VIII, Plasminogen, Aprotinin und humanes Albumin. Die Thrombinkomponente besteht aus Thrombin und Calciumchlorid.
Zellpräparationen der Zellen wurden aus Hautproben nach plastischen Operationen erhalten. Die Keratinozyten wurden von der Dermis unter Verwendung von 0,3% Dispase (Boehringer, Mannheim, Deutschland) nach Inkubation für zwei Stunden bei 40°C abgetrennt. Epidermale Zellen wurden anschließend als Einzelzellsuspension unter Verwendung von 0,05% Trypsin und 0,02% EDTA (GIBCO, Deutschland) bei 37°,C für 30 Minuten erhalten und in serumfreiem Medium resuspendiert. Die Zellen wurden entweder direkt verwendet oder gemäß Standardprotokollen (Horch et al., supra) kultiviert.
Gruppe 1
Kultivierte (Gruppe 1a) und nicht-kultivierte (Gruppe 1b) humane Keratinozyten wurden mit CMVhEGF-Plasmid für 3 Stunden vermischt und anschließend in der Thrombinkomponente resuspendiert. Nach der Resuspension in Thrombin wurde der Fibrinkleber in eine 24-Vertiefungs (well)-Platte gegeben und 2 ml serumfreies Medium zugegeben.
Das Medium wurde alle 24 Stunden gewechselt und bei –70°C schockgefroren.
Gruppe 2
Kultivierte und nicht-kultivierte Keratinozyten (Gruppe 2a bzw. Gruppe 2b) wurden in 2 ml Medium, enthaltend das CMVhEGF-Plasmid, resuspendiert und für 3 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden anschließend in 24-Vertiefungs-Platten gegeben und das Medium wurde alle 24 Stunden gewechselt und bei –70°C schockgefroren.
Gruppe 3
Kultivierte (3a) und nicht-kultivierte (3b) Keratinozyten wurden in 2 ml Medium resuspendiert und dann in 24-Vertiefungs-Platten gegeben. Das Medium wurde alle 24 Stunden gewechselt und entsprechend bei –70°C schockgefroren.
Die Plasmid-DNA-Konzentration belief sich auf 20 μg/ml Thrombin. Das exprimierte Protein wurde in vitro mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen ELISA-Kits (Quantikin, R&D Systems, Minneapolis, USA) nachgewiesen.
Die Ergebnisse der Messung des EGF-Proteins im Kulturüberstand sind in der 1 dargestellt. Es hat sich gezeigt, daß bei der Gruppe 1 eine bis zu 100-fache Erhöhung der EGF-Proteinkonzentration im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Gruppe 2 und Gruppe 3) erzielt werden konnte. Die maximale EGF-Konzentration wurde nach 24 Stunden gemessen (Gruppe 1a: 102,14 μg/ml; Gruppe 1b: 119,3 μg/ml; Kontrolle 5,1 bzw. 2,26 μg/ml). Nach 5 Tagen war eine Abnahme auf 23,3 bzw. 8,85 μg/ml zu sehen). Die EGF-Konzentration, gemessen 14 Tage nach Inkubation, zeigte für die Gruppe 1a eine weitere Abnahme auf 2,24 μg/ml am Tag 14.
In vivo-Untersuchung der Transfektionsrate
Als Versuchstiere wurden 6 bis 8 Wochen alte Nacktmäuse verwendet.
Wunden und Pfropfverfahren
2 × 2 cm große Vollhautwunden (großflächige Wunden) wurden auf die Rücken von anästhesierten Nacktmäusen erzeugt. Diese Wunden wurden bis zum Panniculus carnosus Muskel gesetzt und die Wundecken genäht, um die Wundkontraktion zu verzögern.
Die humane Keratinozytensuspension, kultiviert oder nicht-kultiviert, wurden in dem Thrombinteil des Fibrinklebers resuspendiert. Die Thrombinkomponente enthielt entweder das pCMVβ-Gal oder das EGF-Expressionsplasmid. Sieben Wunden von jeder Gruppe wurden entweder mit kultivierten oder nicht-kultivierten Keratinozyten und den verschiedenen Plasmiden (Tabelle 2) bedeckt. Die Wunden wurden mit einem semipermeablen Klebefilm (Opsite, Smith & Nephew, Largo, FL) abgedeckt, der dann an die Stelle angeheftet und mit einer antimikrobiellen Salbe bedeckt wurde.
Eine tägliche Kontrolle zur Sicherstellung der Integrität der Abdeckung wurden vorgenommen. Die experimentellen Gruppen wurden entweder mit dem hEGF-Plasmid (Gruppe 1a n = 7, Gruppe 1b n = 7) oder mit dem pCMVβ-Gal Plasmid (Gruppe 2a n = 7, Gruppe 2b n = 7) transplantiert. Die Expression des EGF-Transgens wurde am Tag 1, 3, 5 und 7 durch Messung der EGF-Konzentration in dem Wundhomogenisat überwacht. Am Tag 1, 3, 5 (jeweils zwei Mäuse pro Gruppe) und am Tag 7 (eine Maus pro Gruppe) wurden Biopsien genommen, welche die gesamte Wunde umfassen, um ein Homogenat der Wunde zu erhalten und damit das EGF-Protein nachzuweisen. Andererseits wurden immunhistochemische Untersuchungen mit herkömmlichen Histologieverfahren durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der 2 dargestellt. Wie zu erkennen ist, weisen die nicht-kultivierten humanen Keratinozyten 24 Stunden nach der Transformation mit dem EGF-Plasmid eine 181-fach erhöhte EGF-Konzentration verglichen mit Wunden, die mit den pCMVβ-Gal als Kontrolle transfiziert wurden, auf (4). EGF-Konzentrationen wurden für den gesamten siebentägigen Untersuchungszeitraum nachgewiesen. Sie nahmen aber innerhalb der ersten drei Tage schnell ab, ausgehend von 180 μg/ml am Tag 1 nach Behandlung bis ungefähr 20 μg/ml am Tag 7 nach Behandlung.
Nach dem Transplantieren von kultivierten humanen Keratinozyten, enthaltend das EGF-Plasmid, die mit der Fibrinmatrix, resuspendiert wurden, wurden ähnliche Konzentrationsmuster für das EGF-Protein erhalten (3), (200,5 μg/ml; Tag 7, 20 μg/ml)
Beispiel 2
Bestimmung der optimalen Keratinozytenkonzentration für einen vorgegebenen Puffer. EGF-Plasmid, Tissucol^® und Zellbereitungen wurden gemäß der Beschreibung aus Beispiel 1 verwendet. Lediglich die Anzahl der Keratinozyten wurde zwischen 100 000, 1 Millionen, 2 Millionen und 5 Millionen variiert. Die höchste EGF-Expressionsrate wurde durch Verwenden einer Zellzahl von 2 Millionen Zellen/333 μl Fibrin-Koagulat, was einer ungefähren Zellzahl von 6 Millionen Zellen/ml Koagulat entspricht, erhalten (siehe 5).
Beispiel 3
Optimierung einer Gen-aktivierten Matrix zur Behandlung von großflächigen Wunden von Nacktmäusen.
Großflächige Wunden von Nacktmäusen (12 Mäuse pro Gruppe) wurden mit unterschiedlichen Kombinationen behandelt (Gruppe 1–4). Die Menge an Fibrin betrug in jedem Fall 333 μl, die Menge an Plasmid 200 μg. In jedem Fall wurde eine Präinkubation von geeigneten Zellen mit dem Plasmid in 5,7 μl PBS für 3 Stunden durchgeführt. Die verwendete Anzahl an Keratinozyten betrug 2 Millionen. Biopsien wurden an den Tagen 1, 3, 5, 7, 9 und 12 genommen und Histologien begannen von Tag 5 an.

Gruppe 1: Fibrin und EGF-Plasmid
Gruppe 2: Fibrin und Keratinozyten
Gruppe 3: Fibrin, EGF-Plasmid und Endothelzellen (= Stützzellen)
Gruppe 4: Fibrin, EGF-Plasmid und Keratinozyten (= Reparaturzellen)

Die Ergebnisse der Histologien zeigen klar, daß nur Gruppe 4 zu einer vollständigen Re-Epithelisierung von großflächigen Wunden bei Nacktmäusen führt, mit einem vollständig regenerierten Epithelium, bestehend aus 9–11 Zellschichten (siehe 9 und 10).
Bei allen anderen Gruppen (1–3) ist lediglich etwas Re-Epithelisierung am Rand der Wunden sichtbar, wohingegen keine Re-Epithelisierung in der Mitte der Wunden stattfand (siehe 6, 7 und 8).
Beispiel 4
Transfektion verschiedener Zelltypen
200 000 Zellen, nämlich Muskelzellen, Schwann-Zellen, Endothelzellen, Prä-Adipozyten und Fibroblasten, wurden mit je 10 μg EGF-Plasmid transfiziert, die verwendete Menge an Fibrin betrug 333 μl. Die EGF-Expression wurde nach Tag 1, 2, 3, 4 und 5 gemessen und wird in 11 gezeigt.
Beispiele für Zellisolation
Schwann-Zellen
Zellen wurden mit Modifikationen präpariert gemäß des Verfahrens von Shahar et al., (1989) bei dem Schwann-Zellen vom Ischias-Nerv neugeborener Ratten geerntet wurden. Kurz beschrieben wurden die Schwann-Zellen von 7 mm großen Segmenten des Ischias-Nervs geerntet. Nerven wurden in HBSS gesammelt, von ihrem Epineurium abgestreift und in 1 mm² große Stücke gehackt. Die Nervenstücke wurden durch Inkubieren der Stücke mit 0,3% Trypsin und 0,1% Kollagenase für 30 min. bei 37°C, dissoziiert. Die Zellen wurden pulverisiert, gewaschen und in DMDM, enthaltend 10% FCS und Penicillin/Streptomycin, auf poly-D-Lysin beschichteten Flaschen kultiviert. Am folgenden Tag wurde Ara-C für 48 Stunden zum Kulturmedium zugegeben, bevor das Medium durch mitogenes Medium, enthaltend Forskolin, ersetzt wurde. Das Medium wurde alle 3 Tage gewechselt, bis die Schwann-Zellen Konfluenz erreichten.
Humane mikrovaskuläre Endothelzellen
Nach der Entfernung von Fett und Epidermis wurde die Dermis in ca. 4 cm² große Stücke gehackt. Die Endothelzellen wurden von der Dermis durch Trennung der Dermis und Epidermis nach Inkubation mit Dispase (2,4 U/ml) bei 4°C über Nacht erhalten. Die dermalen Stücke wurden wieder geschnitten und mit Trypsin für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Um die Endothelzellen zu erhalten, wurde unter Verwendung eines Skalpells Druck auf die dermalen Stücke ausgeübt. Die Petrischale wurde dann mit EGM (5%) gespült. Die Suspension wurde filtriert (70 μm). Nach der Zentrifugation für 5 Minuten bei 1300 U/min. wurde das Pellet in 5% EGM resuspensiert und auf Gelatine-beschichtete Flaschen aufgetragen.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Wundheilung und zur Reparatur und Regeneration von Säugergewebe, wobei das Verfahren die folgenden Schritte: a. Bereitstellung einer Plasmid-DNA in im wesentlichen reiner Form, die ein Gen kodiert, das einen positiven Effekt auf den Verlauf der Regeneration des Gewebes ausübt, b. Bereitstellung einer Komponente bzw. von Komponenten eines selbsthärtenden Biopolymers und c. Bereitstellung einer Zellsuspension mit Zellen, welche die Regeneration fördern, umfaßt dadurch gekennzeichnet, daß die Komponenten (a), (b) und (c) gleichzeitig oder nacheinander miteinander inkubiert werden, so daß das Plasmid und die Zellsuspension homogen verteilt in einer der Biopolymerkomponenten erhalten werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Biopolymer ausgewählt ist aus einem Fibrinkleber, Collagen, Gelatin, Alginat, Hyaluronsäure, Polysaccharid, organischem Polymer oder Derivaten davon bzw. Kombinationen davon.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Biopolymer ein Fibrinkleber ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid und die Zellen in der Thrombin-Komponente des Fibrinklebers vorliegen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Biopolymer in einer flüssigen oder lyophilisierten Form bereitgestellt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Plasmid zu Biopolymerkomponente 5–25 μg/ml, vorzugsweise 10–20 μg/ml, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von Plasmid zu Biopolymerkomponente 25–100 μg/ml, vorzugsweise um 50 μg/ml, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von 25.000–75.000 Zellen/μg Plasmid ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis von 75.000–100.000 Zellen/μg Plasmid, vorzugsweise um 50.000, ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das die Anzahl an Zellen pro ml Biopolymerkomponente 200.000 bis 5.000.000, vorzugsweise 3.000.000, ist.
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellsuspension eine Suspension von Zellen, ausgewählt aus Keratinozyten, Chondrozyten, Fibroblasten, Epithelzellen, Endothelzellen, Schwann-Zellen, Osteoblasten und Osteoklasten, ist.
Transfektionssystem, enthaltend eine Plasmid-DNA in im wesentlichen reiner Form, die ein Gen kodiert, das einen positiven Effekt auf den Verlauf der Regeneration des Gewebes ausübt, eine Komponente eines selbst-härtenden Biopolymers und eine Zellsuspension mit Zellen, welche die Regeneration fördern und das keine weiteren Transfektions-fördernde oder Transfektionsvermittelnde Substanzen enthält.
Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Plasmid-DNA in im wesentlichen reiner Form, die ein Gen kodiert, das einen positiven Effekt auf den Verlauf der Regeneration des Gewebes ausübt, Komponenten eines selbsthärtenden Biopolymers, eine Zellsuspension mit Zellen, welche die Regeneration fördern und gegebenenfalls einen weiteren pharmazeutisch verträglichen Träger, und keine weiteren Transfektions-fördernden oder Transfektionsvermittelnden Substanzen enthält.
Therapeutisches Kit zur Behandlung von Gewebedefekten, umfassend: – eine Plasmid-DNA in im wesentlicher reiner Form, die ein Gen kodiert, das einen positiven Effekt auf den Verlauf der Regeneration des Gewebes ausübt, – Komponenten eines selbst-härtenden Biopolymers und – eine Zellsuspension, die Zellen umfaßt, welche die erwähnte Regeneration fördern, und die keine weiteren Transfektions-fördernden oder Transfektions-vermittelnden Substanzen enthält.
Therapeutisches Kit, enthaltend eine Zusammensetzung, erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.
Verwendung eines Transfektionssystems, der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des therapeutischen Kits nach einem der Ansprüche 12 bis 15 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Gewebedefekten.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Gewebedefekte ausgewählt sind aus einer Gruppe, bestehend aus Verbrennungswunden, Knochen-, Muskel-, Nerven- oder Knorpeldefekten, chronischen Wunden und Gewebeaugmentationen.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Behandlung von Gewebedefekten eine Wundheilung in der Haut ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die Zusammensetzung auf den Gewebedefekt aufzusprühen ist.
Verwendung eines Gels, enthaltend die pharmazeutische Zusammensetzung erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Gewebedefekten.
Verwendung einer Zusammensetzung hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 11, des Systems nach Anspruch 12, der pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder des Kits nach Anspruch 14 oder 15 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Gewebedefekten.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei die Gewebedefekte ausgewählt sind aus einer Gruppe, bestehend aus Verbrennungswunden, Knochen-, Muskel-Nerven- oder Knorpeldefekte, chronischen Wunden und Gewebeaugmentationen.
Verwendung nach Anspruch 21 oder 22, wobei die Behandlung von Gewebedefekten eine Wundheilung in der Haut ist.