DE10025609A1 - Transfektionssystem - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Wundheilung, Reparatur und Regeneration von menschlichem und tierischem Gewebe, umfassend die folgenden Schritte: DOLLAR A a. Bereitstellung einer Plasmid DNA, die für ein Gen kodiert, das einen positiven Effekt auf den Verlauf der Regeneration des Gewebes ausübt, in im wesentlichen reiner Form, DOLLAR A b. Bereitstellung von Komponente/n eines selbst-härtenden Biopolymers und DOLLAR A c. Bereitstellung einer Zellsuspension mit Zellen, die förderlich bei der Regenerierung sind, DOLLAR A dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten (a), (b) und (c) gleichzeitig oder nacheinander miteinander inkubiert werden, so dass das Plasmid und die Zellsuspension homogen in einer der Biopolymerkomponenten verteilt erhalten sind. DOLLAR A Des weiteren werden Transfektionssysteme, enthaltend eine Plasmid DNA, eine Komponente eines selbst-härtenden Biopolymers und eine Zellsuspension mit Zellen, die bei der Regenerierung förderlich sind, offenbart. Dieses Transfektionssystem enthält keine weiteren, die Transfektion fördernden oder vermittelnden Substanzen. Außerdem werden therapeutische Kits, pharmazeutische Zusammensetzungen und deren Verwendungen zur Behandlung von Gewebedefekten, insbesondere von Verbrennungswunden und zur Wundheilung in der Haut beschrieben. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Transfektionssystem, enthaltend ein Plasmid DNA, eine Komponente des Fibrinklebers und eine Zellsuspension.

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft Matrix-vermittelte Transfektionssysteme, wobei die Matrix aus einem selbst­ härtenden Biopolymer besteht. Weiterhin betrifft die Erfindung Verfahren zur Herstellung eines Präparats enthaltend Plasmid DNA, eine Komponente des selbst-härtenden Materials und eine Zellsuspension der zu transfizierenden Zellen, das Präparat selbst und dessen Verwendung zur Behandlung von Gewebe-Verletzungen und -Veränderungen.

Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Fibrin­ vermitteltes Transfektionssystem für Zellen zur verbesserten Wundheilung, Geweberegeneration und Gewebereparatur.

Hintergrund der Erfindung

Gewebedefekte und deren Behandlungen stellen ein großes Problem in der Medizin dar. Sowohl bei operativen Eingriffen als auch durch Verschleiß, externen Einwirkungen wie Verletzungen durch Verbrennung, Schlag usw., tritt ein entsprechendes Trauma des Gewebes auf, dessen Heilung und Regeneration entscheidend ist. Auch bei vielen Erkrankungen tritt eine Schädigung des Gewebes auf, beispielhaft sei hier die Psoriasis oder Arthritis genannt.

Ziel ist es daher, Verfahren und Möglichkeiten zu entwickeln, die diese Heilungs- und Regenerationsprozesse verbessern und beschleunigen. Gerade bei großflächigen Gewebeschädigungen, wie Hautschädigungen, Knochenschädigungen, Knorpelschädigungen oder bei prädisponierten Personen, deren eigenen Fähigkeiten der Regeneration und Heilung eingeschränkt sind, ist es notwendig, diesen natürlichen Prozess zu unterstützen, insbesondere auch unter dem Gesichtspunkt, dass diese Regeneration so erfolgen soll, dass sie sich von der natürlichen Umgebung nicht unterscheidet, also nicht durch unnatürliches Wachstum zu eingeschränktem und verändertem Gewebe führt, z. B. Narbenbildung. Dazu werden u. a. Matrizes eingesetzt, die den Heilungsprozess unterstützen sollen. Diese Matrizes sind häufig so konstruiert, dass sie Faktoren freisetzen, die den Heilungsprozess positiv unterstützen.

Bei großflächigen Verbrennungen wird bei konventionellen Verfahren z. B. eine Transplantation von Keratinozyten durchgeführt. Diese werden als autologe oder allogene Transplantate auf die Wunde aufgebracht. Diese Zellen werden als so genannte "sheets", also als mehrschichtige Zelllagen auf die Wunde transplantiert. Dazu ist es notwendig, von dem Individuum vorher Keratinozyten zu gewinnen, diese zu isolieren und in vitro zu kultivieren, um mit einer unterstützenden Matrix mehrschichtige Zelllagen auszubilden, damit diese dann auf die Wunde transplantiert werden können.

Eine weitere Möglichkeit, die Regeneration des geschädigten Gewebes zu beschleunigen, ist die externe Gabe von fördernden Faktoren. Diese Faktoren können einerseits das Wachstum der Zellen, die in der Regeneration involviert sind, fördern. Andererseits können diese Faktoren aber auch Prozesse hemmen, die der schnellen Regeneration entgegenwirken.

Diese Faktoren, bei denen es sich vor allem um Wachstumsfaktoren handelt, wurden bisher auf verschiedene Art und Weise dem geschädigten Gewebe zugeführt, wie z. B. durch externe Applikation. Dieses hat aber den Nachteil, dass hohe Dosen zugeführt werden mussten. Weiterhin weist der Großteil der Faktoren in vivo nur eine kurze Halbwertszeit auf, so dass die Verabreichung mehrfach erfolgen musste. Bei der externen Verabreichung von Faktoren besteht auch die Gefahr, dass diese Verunreinigungen aufweisen können. Sowohl bei der Aufreinigung aus natürlichen Quellen, als auch bei der rekombinanten Herstellung der Faktoren besteht die Gefahr, dass Verunreinigungen in den Präparationen enthalten sind, die einen negativen Effekt auf den Verlauf der Regeneration haben können. Daher stellte sich die externe Gabe von Mediatoren, wie Wachstumsfaktoren, als ein ineffizientes System heraus, vor allem auch unter dem Gesichtspunkt, dass einige Mediatoren überhaupt nicht extern verabreicht werden können.

Daher wird seit kurzem versucht, durch Transfektion von Zellen (Gentransfer) diese Wachstumsfaktoren in vivo zu produzieren. Andree et al. (PNAS, 91, S. 12188-12192, 1994) konnten zeigen, dass der in vivo Transfer eines Plasmids, das ein Gen enthält, das für einen Wachstumsfaktor für die Epidermis kodiert, in Keratinozyten die Wundheilung im Tiermodell verbessert. Der Gentransfer wurde mit einem herkömmlichen Verfahren mittels einer so genannten "gene gun" durchgeführt, bei dem die an einen Träger gekoppelten Plasmide auf die Wunde und die darin vorkommenden Zellen eingebracht werden. Die Zellen werden dann unspezifisch mit den Plasmiden transfiziert. Trotz einem schnelleren Verheilen der Wunde wurde bei diesem Transfektionssystem beobachtet, dass der Faktor nur von Zellen exprimiert wird, die am Rande der Wunde zu diesem Zeitpunkt vor Ort waren. Auch ist mit diesem Verfahren keine spezifische Transfektion möglich.

Eine systemische Verabreichung von Faktoren ist aber wünschenswert. Hierfür eignet sich die Transfektion von Zellen besonders gut.

Bisher sind allerdings im wesentlichen nur Transfektionsverfahren von Zellen bekannt, bei denen durch externe Träger die DNA in die Zelle eingebracht wird. Dabei gelangt aber auch der Träger in die Zelle, was negative Folgen haben kann.

Bekannte Transfektionsverfahren schließen die virale Transfektion mit Retroviren, Adenoviren oder anderen Viren ein. Das größte Problem bei der Transfektion von eukaryontischen Zellen ist die Effektivität der Transfektion. Weiterhin besteht ein großes Problem gerade bei den viralen Vektoren in deren Tropismus, d. h. deren Affinität gegenüber bestimmten Zellarten. Daher werden bereits adenovirale Vektoren verwendet, die einen breiten Tropismus aufweisen und auch Zellen, wie Muskelzellen, Hepatocyten, Synovialzellen, Epithelzellen und ähnliche transfizieren können. Weiterhin sind Adenoviren in der Lage, Zellen, die sich nicht teilen, zu transfizieren.

Die Transfektion von Zellen durch virale Vektoren weist aber einige Nachteile auf. Da die Position, wo die Integration des Vektors erfolgt, zufällig ist, können diese Zellen transformiert werden oder es können für das Leben der Zellen kritische Gene verändert werden. Viren und virale Vektoren können eine hohe Polymorphismusrate aufweisen, was zu inaktiven Vektoren oder Genen führen kann. Wie bereits angesprochen stellt der Tropismus der viralen Vektoren ein weiteres Problem dar.

Auch Adenoviren, weisen - obwohl sie in der Lage sind nicht- proliferierende Zellen zu transfizieren - die oben genannten Nachteile der viralen Vektoren auf, d. h. sie integrieren zufällig in das Genom der Zielzelle. Dadurch können andere wichtige Gene zerstört werden. Die Polymorphismusraten in Viren sind hoch und letztendlich müssen erst diese rekombinant hergestellten Viren propagiert und zur Transfektion aufbereitet werden.

Andere Transfektionsysteme mit nicht-viralen Zusammensetzungen sind z. B. Liposomen-vermittelte Verfahren (z. B. Lipofektin®). Nachteil dieser Liposomen sind z. B. eine verbleibende Zytotoxizität des liposomalen Transfektionsagenz gegenüber den Zielzellen. D. h. durch das Transfektionsagenz selbst werden die zu transfizierenden Zellen (Zielzellen) geschädigt, so dass sie sterben.

Weiterhin sind polykationische Systeme, Systeme unter Verwendung von Calcium (Calciumphosphat DNA Präzipitationen), DEAE-Dextran Transfektionen und andere beschrieben.

Als mechanische Verfahren zur Transfektion von Zellen sind die Elektroporation von Zellen oder das bereits genannte "gene gun"-Verfahren bekannt.

Mit dem "gene gun"-Verfahren kann direkt die nackte DNA oder DNA assoziert mit Liposomen oder anderen Trägermolekülen auf die zu transfizierenden Zellen geschossen werden. Dieses Verfahren erlaubt zwar z. T. die Transfektion von Zellen ohne Träger, stellt aber ein zufälliges Transfizieren der Zelle dar, ohne dass die Menge an transfiziertem Material bestimmt werden kann. Die Spezifizität des Systems ist ebenfalls nicht gegeben, vor allem bei der transienten Transfektion von Zellen. Bei der Transfektion mittels Elektroporation ist der Nachteil, dass die Transfektion in vitro in einer speziellen Apparatur geschieht. Die Zellen müssen erst propagiert werden. Dabei sind verschiedenste Arbeitsschritte notwendig und die Gefahr einer Kontamination der Zellsuspension ist groß. Auch wurden schon Versuche gemacht, DNA direkt ohne Hilfsmoleküle in Zellen zu transfizieren. Hier ist aber die Transfektionseffizienz zu niedrig.

Es ist daher notwendig, andere Transfektionssysteme zu entwickeln, die die oben genannten Nachteile überwinden.

In der WO 97/38729 wurde beschrieben, dass eine verbesserte Transfektionseffizienz von Zellen erzielt werden kann, wenn dem zu behandelten Patienten das Plasmid zusammen mit einer Matrix verabreicht wird. Zellen, die in den geschädigten Bereich wandern, wo diese Matrix zusammen mit dem Plasmid aufgebracht wurde, weisen dann eine effektivere Transfektion auf. Bei diesem Verfahren ist es notwendig, dass die Zellen zu der Matrix migrieren, um das Plasmid aufzunehmen. Weiterhin bedeutet dies, dass keine homogene Verteilung der Zellen bei der Regeneration des geschädigten Bereichs vorliegt, sondern die Zellen vom Rand aus transfiziert werden. Eine gleichzeitige Transfektion der Zellen ist also nicht gegeben.

In der DE 197 16 098 A1 wurde beschrieben, dass mit einem Fremdgen transfizierte Fibroblasten, wobei das Fremdgen für einen die Wundheilung fördernden Faktor kodiert, zur Behandlung von Wunden verwendet werden können. Diese Fibroblasten stellen aber nur ein Medium dar, das die externe Gabe von dem zur Wundheilung fördernden Faktor vermeiden soll.

Die verabreichten Fibroblasten selbst sind so bestrahlt worden, dass sie sich nicht mehr teilen können. Sie nehmen somit nicht selbst als Zelle an der Wundheilung teil. Des weiteren stellt die in der DE 197 16 098 beschriebene Fibroblastenzelllinie eine immortalisierte Zelllinie dar, die permanent mit dem Plasmid transfiziert ist. Eine permanente Transfektion der Zellen ist aber nicht in jedem Fall wünschenswert, sondern es ist eher bevorzugt, dass eine transiente Transfektion der Zellen erfolgt, damit nur über einen bestimmten Zeitraum die Expression des durch das Plasmid kodierenden Faktors erfolgt. Nach Abschluss der Wundheilung ist eine weitere Expression dieses Faktors nicht wünschenswert. Im Gegenteil, dieses könnte beispielsweise die Narbenbildung und eine anormale Ausbildung der Gewebestruktur fördern, die störend ist.

Vor kurzem wurde von Horch et al (Cell Transplantation, 7, 3, S. 309-317, 1998) beschrieben, dass im Nacktmaus-Tiermodell eine Einzelzellsuspension von kultivierten Keratinozyten mit Hilfe eines Fibrinklebers auf die Wunde aufgebracht wurde. Dadurch war es möglich, eine Epidermis von guter Qualität zu rekonstruieren. Durch dieses Verfahren ist es bereits möglich, die Zeit zwischen Entnahme der Zellen und dem Transplantieren der expandierten Zellen zu verkürzen.

Daher war eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, die Bereitstellung eines einfachen, sofort verfügbaren Systems, mit dem bei Patienten mit großen Gewebeschädigungen, die akut oder chronisch sein können, mit minimalem Zeitaufwand und möglichst kleinen operativen Eingriffen Zellen, insbesondere autologe Zellen, bereitgestellt werden, die mit Genen, die Substanzen kodieren, die einen positiven Effekt auf die Wundheilung haben, transfiziert werden.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Wundheilung, Reparatur und Regeneration von Gewebe. Erfindungsgemäß wird dieses durch folgende Schritte erreicht:

• a) Bereitstellung einer Plasmid DNA, die für ein Gen kodiert, das einen positiven Effekt auf den Verlauf der Regeneration des Gewebes ausübt, in im wesentlichen reiner Form,
• b) Bereitstellung der Komponente/Komponenten eines selbst­ härtenden Biopolymers und
• c) Bereitstellung einer Zellsuspension mit Zellen; die förderlich bei der Regenerierung sind,

dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten (a), (b) und (c) gleichzeitig oder nacheinander miteinander inkubiert werden, so dass das Plasmid und die Zellsuspension homogen in einer der Biopolymerkomponenten verteilt erhalten sind.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Zusammensetzung zur Wundheilung, Reparatur und Regeneration des geschädigten Gewebes selbst. Diese Zusammensetzung umfasst

• a) eine Plasmid DNA, die für ein Gen kodiert, das einen positiven Effekt auf den Verlauf der Wundheilung bzw. Reparatur und Regeneration des Gewebes ausübt, in im wesentlichen reiner Form;
• b) Komponente(n) eines selbst-härtenden Biopolymers und
• c) eine Zellsuspension von Zellen, die involviert sind in die Wundheilung bzw. Reparatur und Regeneration des geschädigten Gewebes.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung kann dieses Präparat zur Behandlung von geschädigten Gewebe und zur Wundbehandlung eingesetzt werden. Des weiteren richtet sich die Erfindung auf ein Kit enthaltend ein Plasmid, welches ein Gen umfasst, das für eine Substanz, vorzugsweise ein Protein kodiert, das eine positive Auswirkung auf den Wundheilungsprozess und Regenerationsprozess des geschädigten Gewebes hat, eine Zellsuspension von Zellen, die in der Regeneration des geschädigten Gewebes involviert ist, und eine Komponente eines selbst-härtenden Biopolymers sowie gegebenenfalls die zweite Komponente dieses Biopolymers, welche zur Aushärtung des Polymers notwendig ist.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1: In vitro Transfektionen von kultivierten humanen Keratinozyten mit dem EGF Plasmid unter Verwendung des erfindungsgemäßen Tranfektionssystems. Die Zellen wurden für 3 Stunden mit dem humanen EGF Plasmid in der Thrombinkomponente (Gruppe 1a) oder mit EGF Plasmid ohne Thrombin (Gruppe 2a) oder mit Zellen ohne Plasmid und ohne Thrombin (Gruppe 3a) inkubiert. Die EGF Proteinniveaus wurden an den Tagen 1, 3, 5, 7, 10 und 14 gemessen.

Fig. 2: In vitro Transfektion von nicht kultivierten humanen Keratinozyten mit dem EGF Plasmid unter Verwendung des erfindungsgemäßen Transfektionssystems. Die Zellen wurden für 3 Stunden mit humanem EGF Plasmid in der Thrombinkomponente (Gruppe 1b) oder mit EGF Plasmid ohne Thrombin (Gruppe 2b) oder mit Zellen ohne Plasmid und ohne Thrombin (Gruppe 3b) inkubiert. Die EGF Proteinniveaus wurden an den Tagen 1, 2, 3, 4 und 5 gemessen.

Fig. 3: In vivo Transfektion von kultivierten humanen Keratinozyten mit hEGF Plasmid unter Verwendung des erfindungsgemäßen Transfektionssystems. In Gruppe 1a wurden Zellen mit EGF inkubiert, anschließend in der Thrombinkomponente des Fibrinklebers suspendiert und auf eine großflächige Wunde (full thickness wound) von Nacktmäusen transplantiert. Biopsien wurden an den Tagen 1, 3, 5, und 7 genommen und die Proteinniveaus in den homogenisierten Wunden mittels ELISA bestimmt. Kontrollwunden (Gruppe 2a) wurden mit Zellen, die mit humanem β-Galactosidase-Plasmid preinkubiert waren, behandelt.

Fig. 4: In vivo Transfektion von nicht kultivierten humanen Keratinozyten mit humanem EGF Plasmid. In Gruppe 1b wurden Zellen mit EGF inkubiert, anschliessend in der Thrombinkomponente des Fibrinklebers suspendiert und auf eine großflächige Wunde von Nacktmäusen transplantiert. Biopsien wurden an den Tagen 1, 3, 5, und 7 genommen und die Proteinniveaus in den homogenisierten Wunden mittels ELISA bestimmt. Kontrollwunden (Gruppe 2b) wurden mit Zellen, die mit humanem β-Galactosidase-Plasmid preinkubiert waren, behandelt.

Definitionen, der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Ausdrücke:

"Gewebedefekte" schließen hierbei sowohl großflächige Wunden, wie sie z. B. bei großflächigen Verbrennungen auftreten als auch andere Schädigungen der Haut, genauso wie Schädigungen von Knochen, Knorpeln, Nerven und anderen Geweben ein.

Das "selbst-härtende Biopolymer" ist ein biologisch abbaubares, biokompatibles Biopolymer, das erfindungsgemäß durch Zugabe oder Anwesenheit einer zweiten Komponente selbst aushärtet. Es umfasst sowohl natürlich vorkommende Verbindungen, also auch synthetische Substanzen.

Ein "Gen, mit positivem Effekt" auf die Regeneration des geschädigten bzw. defekten Gewebes schließt alle DNA- Seguenzen ein, die translatiert als Protein oder Polypeptid, aber auch als Antisense-Molekül oder als Ribozym einen fördernden Effekt auf die Regeneration aufweisen.

"Zellen, die in der Wundheilung involviert sind", schließen sowohl Zellen ein, die das Gewebe selbst neu ausbilden, als auch Zellen, die in der Lage sind, negative Faktoren zu inhibieren.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Methode zur Verfügung, die keine Extrakomponenten zur Transfektion der Zellen in vitro benötigt, d. h. es sind keine Hilfsmittel zur Transfektion, wie virale Vektoren, Liposomen, usw. oder Verfahren wie z. B. Elektroporation, notwendig. Weiterhin sind keine Transfektions-vermittelnde Substanzen notwendig, wie z. B. Poly-Lysin. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Transfektion von Zellen durch Plasmide erfolgt durch eine selbst-härtende Biopolymermatrix. Diese Transfektion kann in vitro oder in vivo erfolgen, bevorzugt findet die Transfektion ex vivo statt. Entscheidend dabei ist, dass eine Zusammensetzung enthaltend die oben genannten Komponenten, d. h. die Zellen, das Plasmid und die selbst-härtende Biopolymermatrix bzw. eine Komponente davon gemeinsam auf die geschädigte Fläche appliziert wird. Dabei sind die Zellen entweder bereits vor Transplantation der Zusammensetzung auf den geschädigten Bereich transfiziert oder die Transfektion erfolgt unmittelbar nach der Verabreichung der Zusammensetzung auf das geschädigte Gewebe, bevorzugt findet die Transfektion der Zelle ex vivo statt, so dass die gleichförmig verteilten Zellen transfiziert vorliegen. Das selbst-härtende Biopolymer kann bei der Verabreichung auf die geschädigte Gewebefläche bzw. den Gewebedefekt bereits ausgehärtet sein. Ebenso kann die Aushärtung aber auch nach Verabreichung der Zusammensetzung auf den zu behandelnden Bereich erfolgen. Die Zusammensetzung kann aber auch in zwei Komponenten vorliegen, wobei eine Komponente das aushärtbare Biopolymer, die Zellen und das Plasmid enthält, während die zweite Komponente eine weitere Verbindung zur Aushärtung des Biopolymers enthält. Die zweite Komponente kann aber auch durch das zu behandelnde Gewebe selbst, sozusagen in vivo, zur Verfügung gestellt werden, z. B. Thrombin bei einem Fibrinkleber, welche dann das Aushärten des Biopolymer in vivo ermöglicht. Die letztere Möglichkeit stellt eine weitere bevorzugte Form dar.

Des weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein transientes Transfektionssystem zur Verfügung, umfassend eine Plasmid DNA, die für ein Gen, kodiert, das einen positiven Effekt auf den Verlauf der Regeneration des Gewebes ausübt, eine Zellsuspension von Zellen, die transfiziert werden sollen und ein selbst-härtendes Biopolymer. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Transfektionssystem, welches Zellen, die in der Wundheilung, Regeneration und Reparatur von Gewebedefekten, insbesondere der Haut, involviert sind, mit einem Plasmid, enthaltend ein Gen, welches für eine zu exprimierende Substanz kodiert, und ein selbst-härtendes Biopolymer, wie eine Komponente/Komponenten eines Fibrinklebers, umfasst.

Durch die Komponente des selbst-härtenden Biopolymers wird ein besseres Eindringen des Plasmids/Aufnehmen durch die Zellen ermöglicht. Das nicht gebundene Plasmid wird leichter durch die Zellen aufgenommen, die Transfektionsrate ist stark verbessert, ohne dass weitere Transfektions-fördernde oder -vermittelnde Substanzen verwendet werden.

Weiterhin ist es mit Hilfe dieses Transfektionssystems möglich, transfizierte Zellen, die die Wundheilung und Regeneration des beschädigten Gewebes beschleunigen, homogen auf den geschädigten Bereich aufzutragen. Damit ist es möglich, den geschädigten Bereich, wie z. B. eine großflächige Wunde, komplett abzudecken, so dass die Wundheilung bzw. Regeneration des geschädigten bzw. defekten Gewebes schnell geschieht. Dabei beschleunigt die durch die transfizierten Zellen exprimierte Substanz die Heilung.

Das erfindungsgemäße Transfektionssystem erlaubt auch die ex vivo Herstellung von lebenden Zellkonstrukten, d. h. von transfizierten Zellen, ohne dass andere Transfektions­ fördernde oder -vermittelnde Substanzen als die Biopolymerkomponente verwendet werden.

Genauer gesagt stellt die vorliegende Erfindung ein einfaches, sofort verfügbares System zur Verfügung, mit dem bei Patienten mit großen Verbrennungswunden oder chronischen Wunden mit Minimalzeitaufwand und möglichst kleinem operativen Eingriff autologe Zellen bereitstellen, die mit Genen, die Proteine bzw. Peptide kodieren, die einen positiven Effekt auf die Wundheilung haben, transfiziert werden bzw. sind.

Der Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt in der schnellen Verfügbarkeit von transfizierten, autologen/allogenen Zellen, die in sich die Potenz bergen, Zelldefekte auszugleichen und gleichzeitig durch Eigensynthese die notwendigen Stoffe in optimaler Form bereitstellen. Weiterhin ist es durch die homogene Verteilung der transfizierten Zellen möglich, schnell einen therapeutischen Effekt zu erzielen. Dieses trifft besonders auf die Wundheilung der Haut zu.

Mit Hilfe des Systems wird die sofortige Verfügbarkeit von transfizierten Zellen gesteigert, ohne dass vorher aufwendige labortechnische Schritte und langwierige Kultur- und Selektionsverfahren notwendig sind, die des weiteren die Gefahr von Kontamination bergen und einen hohen Zeitverlust bedeuten.

Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung ein Kit enthaltend die Bestandteile des Transfektionssystems, d. h. ein Plasmid enthaltend ein Gen/Gene, die für eine Substanz, insbesondere Protein/Peptide kodieren, die einen positiven Effekt auf die Regeneration des Gewebes haben, Zielzellen, die transfiziert werden sowie das selbst-härtende Polymer bzw. eine Komponente davon.

Das durch das erfindungsgemäße Verfahren erhaltene Präparat kann zur Behandlung von geschädigtem bzw. defektem Gewebe, insbesondere großflächigen Wunden, wie der Haut, verwendet werden. Es erlaubt also die Behandlung von Menschen und Tieren mit geschädigtem bzw. defektem Gewebe und großflächigen Wunden, insbesondere von Hautwunden.

Die durch das Verfahren erhaltene Zusammensetzung erlaubt die schnelle therapeutische Behandlung von geschädigtem bzw. defektem Gewebe. Insbesondere ist es durch die homogene Verteilung der transfizierten Zellen möglich, großflächige Wunden schnell und homogen zu behandeln. Insbesondere kann auch die unästhetische Narbenbildung bei großflächigen Wunden reduziert oder vermieden werden.

Die Zielzellen, die durch das erfindungsgemäße Transfektionssystem transfiziert werden, liegen nach einer möglichen Alternative bereits in der Matrix in transfizierter Form vor. Diese Zellen sind homogen in der Matrix verteilt, so dass eine homogene Heilung erfolgen kann. Erfindungemäß wird also auf das geschädigte Gewebe eine Matrix aufgebracht, welche die ex vivo transfizierten Zielzellen enthält, die wiederum Gene enthalten, die für Substanzen kodieren, die einen positiven Effekt auf die Regeneration des geschädigten Gewebes haben. Die Transfektion der Zellen kann aber nach einer weiteren Alternative auch erst nach dem Auftragen in der Matrix erfolgen. Durch die homogene Verteilung des Plasmids und der Zellen ist eine homogene Transfektion der Zellen möglich, die dann zu einer homogenen Expression des Faktors führt, der einen positiven Effekt auf den Fortgang der Regeneration ausübt.

Unter selbst-härtenden Polymer wird erfindungsgemäß insbesondere ein solcher Stoff verstanden, der nach dem sogenannten Aushärten geänderte physikalische Eigenschaften aufweist, beispielsweise eine unterschiedliche Viskosität.

So liegt das selbst-härtende Polymer beispielsweise nach dem Aushärten als ein Gel vor, während der Stoff vor Aushärtung eine unterschiedliche, insbesondere niedrigere Viskosität hatte.

Als Biopolymer, welches selbst-härtend sein kann und biologisch abbaubar ist, können insbesondere folgende Verbindungen genannt werden: Fibrinkleber oder Komponenten davon, Collagene, Gelatine, Alginate, Hyaluronsäure, Polysaccharide, organische Polymere (z. B. PEG, PGA, PLA), Derivate davon bzw. verschiedene Kombinationen dieser Substanzen.

Gewebeklebstoffe auf Basis von Fibrinogen sind z. B. aus AT-B- 359 653, AT-B-359 652 und AT-B-369 990 bekannt. Sie enthalten neben Fibrinogen noch einen Faktor, der das Fibrinogen in Fibrin umwandelt. Dieser kann z. B. Thrombin sein. Durch Einwirkung von Thrombin wird das enthaltene Fibrinogen in Fibrin überführt. Der im Gewebekleber gegebenenfalls enthaltene Faktor XIII wird zu Faktor XIIIa aktiviert. Dieser vernetzt das gebildete Fibrin zu einem Hochpolymer. Die benötigte Thrombinaktivität wird in Form einer Thrombin und Ca²⁺-Ionen enthaltenden Lösung dem Fibrinogen zugesetzt. Das Fibrinogen kann des weiteren noch weitere Proteine, wie Fibronectin, Plasminogen und Albumin enthalten.

Der Gewebeklebstoff kann z. B. einer wie in DE 195 21 324 oder EP 0 345 246 beschriebener sein; besonders bevorzugt wwird ein Fibrinkleber, wie er unter dem Handelsnamen Tissucol® von Baxter, Deutschland, erhältlich ist, verwendet.

Bevorzugt wird die Plasmid-DNA in die Thrombin-Komponente des Fibrinklebers gemischt. Ebenso werden die Zellen bevorzugt in die Thrombinkomponente gegeben und dort vermischt, da die Fibrinogenkomponente eine höhere Viskosität aufweist. Die Plasmid-DNA und die Zellsuspension kann aber ebenso in die Fibrinogenkomponente gemischt sein. Wenn die Plasmid-DNA und die Zellsuspension in die Fibrinogenkomponente gemischt wird, kann das Thrombin durch das zu behandelnde Gewebe selbst, d. h. in vivo, zur Verfügung gestellt werden.

Das erfindungsgemäße Biopolymer fördert die Effizienz der Transfektion, wird aber gleichzeitig auch als Kultivierungsmatrix für die Zellen verwendet. D. h., Transfektion und Kultivierung in vivo erfolgen in derselben Matrix, keine weiteren Aufreinigungs- und Isolierungsschritte sind notwendig und keine weiteren Transfektions-fördernden Mittel sind erforderlich. Insbesondere sind keine Transfektions-vermittelnde Stoffe, wie z. B. Poly-Lysin notwendig, die eine "Vermittlerrolle" zwischen der Matrix und den Plasmid einnehmen. Anders gesagt, das Plasmid liegt nicht an der Matrix gebunden vor, sondern als freies Plasmid.

Die Matrixkomponente kann in verschiedenen Formen vorliegen, sowohl in lyophylisierter als auch in flüssiger Form, als trockenes Pulver, Mikropartikel oder Nanopartikel. Es ist des weiteren möglich, dass das Biopolymer als bereits ausgehärtete Matrix, enthaltend in einer Homogenverteilung, die transfizierten Zellen und das Plasmid, als eine gelartige Masse vorliegt.

Plasmid-Biopolymer Kombinationen können auf das entsprechende Gewebe entweder gemeinsam oder hintereinander aufgebracht, insbesondere aufgesprayt, werden.

Die Zellen, die erfindungsgemäß bei dem Verfahren zur Herstellung des Präparats verwendet werden und damit in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthalten sind, umfassen alle Zellarten, die einen positiven Effekt auf die Regeneration des Gewebes haben. Insbesondere handelt es sich um Keratinozyten, Thrombocyten, Osteoblasten, Osteoklasten, Fibroblasten, Epithel- und Endothelzellen, Muskelzellen, Adipozyten oder andere Bindegewebszellen usw. Ganz besonders bevorzugt sind Zellen, die bei der Wundheilung der Haut eine wesentliche Rolle spielen, wie Keratinozyten.

Die Zellen sind bevorzugterweise autologe bzw. allogene Zellen. Die Zellen, wie sie erfindungsgemäß verwendet werden, können vorher kultiviert worden sein oder frisch isoliert, d. h. nicht kultiviert sein.

Das Plasmid enthaltend ein Gen/Gene, das/die für eine Substanz kodiert, die einen positiven Effekt auf die Regeneration des Gewebes hat, kann ein Expressionsplasmid sein, wie es herkömmerlicherweise zur Expression von Genen in eukaryontischen Zellen verwendet wird.

Das Gen/die Gene bzw. die DNA, enthaltend im Plasmid, kann für Protein(e) bzw. Peptide kodieren, die einen positiven Effekt auf die Regeneration des Gewebes haben. Insbesondere kodiert dieses Gen für Faktoren wie Wachstumsfaktoren, Zytokine, therapeutische Proteine, Hormone und Peptidfragmente von Hormonen, Zytokininhibitoren, peptidische Wachstums und Differenzierungsfaktoren. Beispielhaft sollen hier genannt werden: Moleküle der TGF-β Superfamilie, wie die verschiedenen TGF-β Isoformen; Keratinozyten-, Hepatozyten-, epidermaler Wachstumsfaktor, PDGF, EGF, VEGF, NGF, Erythropoietin, TPA, FGF-1 und FGF-2. Weiterhin Hormone wie Wachstumshormon, PTH, usw. Peptide, die agonistische oder antagonistische Aktivitäten auf Rezeptoren oder auf andere Moleküle haben, die bei pathologischen Prozessen eine Rolle aufgrund einer veränderten Expression spielen.

Diese Faktoren können alleine oder als Kombinationen eingesetzt werden.

Das Plasmid kann ein oder mehrere der DNA-Sequenzen enthalten, die für ein oder mehrere der oben genannten Faktoren kodieren.

Erfindungsgemäß kann es aber auch für eine antisense-RNA oder Ribozym-RNA kodieren, die dann Faktoren hemmen, die der Wundheilung entgegenstehen.

Das erfindungsgemäße Präparat und der erfindungsgemäße Kit können insbesondere für therapeutische Anwendungen verwendet werden. Sie sind nützlich bei der Behandlung von geschädigtem bzw. defekten Gewebe, wie geschädigten bzw. defekten Knochen, Knorpeln, Muskeln, Nerven oder Hautpartien, insbesondere sind sie bei der Wundheilung in der Haut nützlich. Somit ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Behandlung von defekten Geweben, umfassend ein selbst-härtendes Biopolymer, ein Plasmid mit den oben genannten Eigenschaften und Zielzellen, die im Regenerationsprozess des defekten Gewebes, insbesondere der Wundheilung der Haut, involviert sind.

Diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können in mehreren Komponenten vorliegen. Abgesehen von den Zielzellen, die kurz vor der Verwendung des pharmazeutischen Präparates zugegeben werden, kann die pharmazeutische Zusammensetzung in flüssiger, lyophilisierter oder gefrorener Form vorliegen.

Die Einsatzgebiete der pharmazeutischen Zusammensetzung umfassen insbesondere humanmedizinische, veterinärmedizinische und zahnmedizinische Gebiete.

Die Mengenverhältnisse von Plasmid, Biopolymerkomponente und Zellen können gezielt eingestellt werden bzw. je nach Art des zu behandelnden Gewebes variiert werden. Beispielsweise beträgt das Verhältnis von Plasmid zu Biopolymerkomponente wenigstens 5 µg/ml und liegt bevorzugterweise zwischen 5 und 100 µg/ml. Besonders bevorzugte Bereiche sind 5-25 µg/ml bzw. Werte um 50 µg/ml.

Das Verhältnis von Zellen zu Plasmid liegt beispielsweise zwischen 25.000 und 2.500.000 Zellen/µg Plasmid. Bevorzugte Bereiche sind 25.000-75.000 Zellen/µg Plasmid, 75.000- 100.000 und 250.000-750.000.

Die Verhältnisse hängen insbesondere auch davon ab, ob eine in vitro oder eine in vivo Transfektion durchgeführt wird. In vivo meint insbesondere die Transfektion der ex vivo zu der Matrix zugegebenen Zellen, die homogen in der Matrix verteilt mit der ebenfalls homogen verteilten Plasmid-DNA. So liegt beispielsweise das Verhältnis von Zellen pro ml Biopolymerkomponente bei einer in vivo Transfektion um einen Faktor 3-10, vorzugsweise 4-6, höher als bei der in vitro Transfektion.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgend aufgeführten Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1 Erhöhung der Transfektionsrate durch die Anwesenheit eines selbst-härtenden Biopolymers Expressionsplasmid

Als Expressionsplasmid wurde in diesem Beispiel pCMVβ-Gal und CMVhEGF verwendet, welche bereits von Andree et al. (supra) beschrieben wurden. Das EGF Expressionsplasmid besteht aus dem sehr frühen Transkriptionspromotor des CMV und kodiert in einer In- Leserahmen-Fusion das sekretorische Signalpeptid des humanen Wachstumsfaktors (hGF) und das reife EGF Polypeptid.

Als Fibrinkleber wurde Tissuecol®, Baxter, Heidelberg, Deutschland, verwendet. Dieser Zweikomponenten Fibrinkleber besteht aus heterologen humanen Plasmaproteinfraktionen, der Fibrinogen- und der Thrombinkomponente. Die Fibrinogenkomponente enthält Fibrinogen, Plasmafibronektin, Faktor VIII, Plasminogen, Aprotinin und humanes Albumin. Die Thrombinkomponente besteht aus Thrombin und Kalziumchlorid.

Zellpräparationen der Zellen wurden aus Hautproben nach plastischen Operationen erhalten. Die Keratinozyten wurden aus der Dermis unter Verwendung von 0,3% Dispase (Boehringer, Mannhein, Deutschland) nach Inkubation für zwei Stunden bei 40°C abgetrennt. Epidermalzellen wurden anschliessend als Einzelzellsuspension unter Verwendung von 0,05% Trypsin und 0,02% EDTA (GIBCO Deutschland) bei 37°C für 30 Minuten erhalten und in serumfreien Medium resuspendiert. Die Zellen wurden entweder direkt verwendet oder gemäß Standardprotokollen (Horch et al., supra) kultiviert.

Gruppe 1

Kultivierte (Gruppe 1a) und nicht kultivierte (Gruppe 1b) humane Keratinozyten wurden mit CMVhEGF Plasmid für 3 Stunden vermischt und anschliessend in der Thrombinkomponente resuspendiert. Nach der Resuspension in Thrombin wurde der Fibrinkleber in eine 24 Wellplatte gegeben und 2 ml serumfreies Medium zugegeben.

Das Medium wurde alle 24 Stunden gewechselt und bei -70°C schockgefroren.

Gruppe 2

Kultivierte und nicht kultivierte Keratinozyten (Gruppe 2a bzw. Gruppe 2b) wurden in 2 ml Medium, enthaltend das CMVhEGF Plasmid, resuspendiert und für 3 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden anschliessend in 24 Wellplatten gegeben und das Medium wurde alle 24 Stunden gewechselt und bei -70°C schockgefroren.

Gruppe 3

Kultivierte (3a) und nicht kultivierte (3b) Keratinozyten wurden in 2 ml Medium resuspendiert und dann in 24 Wellplatten gegeben. Das Medium wurde alle 24 Stunden gewechselt und entsprechend bei -70°C schockgefroren.

Die Plasmid DNA Konzentration belief sich auf 20 µg/1 l Thrombin. Das exprimierte Protein wurde in vitro mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen ELISA Kits (Quantikin, R Systems, Mineapolis, USA) nachgewiesen.

Die Ergebnisse der Messung des EGF Proteins im Kulturüberstand sind in der Fig. 1 dargestellt. Es zeigt sich, dass bei der Gruppe 1 eine bis zu 100-fache Erhöhung der EGF Proteinkonzentration im Vergleich zu den Kontrollgruppen (Gruppe 2 und Gruppe 3) erzielt werden konnte. Die maximale EGF Konzentration wurde nach 24 Stunden Inkubation gemessen (Gruppe 1a: 102,14 µg/ml; Gruppe 1b: 119,3 µg/ml; Kontrolle 5,1 bzw. 2,26 µg/ml). Nach 5 Tage war eine Abnahme auf 23,3 bzw. 8,85 µg/ml zu sehen). Die Konzentration an EGF, gemessen 14 Tage nach Inkubation, zeigte für die Gruppe 1a eine weitere Abnahme auf 2,24 µg/ml am Tag 14.

In vivo Untersuchung der Transfektionsrate

Als Versuchstiere wurden 6- bis 8-Wochen alte Nacktmäuse verwendet.

Wunden und Transplantationsverfahren

2 × 2 cm große Vollhautwunden (großflächige Wunden) wurden auf die Rücken von anästhesierten Nacktmäusen gesetzt. Diese Wunden wurden bis zum Panniculus carnosus Muskel gesetzt und die Wundecken genäht, um die Wundkontraktion zu verzögern.

Die humane Keratinozytensuspension, kultiviert oder nicht­ kultiviert, wurden in dem Thrombinteil des Fibrinklebers resuspendiert. Die Thrombinkomponente enthielt entweder das pCMVβ-Gal oder das EGF-Expressionsplasmid. Sieben Wunden von jeder Gruppe wurden entweder mit kultivierten oder nicht­ kultivierten Keratinozyten und den verschiedenen Plasmiden (Tabelle 2) bedeckt. Die Wunden wurden mit einem semipermeablen Klebefilm (Op-site, Smith & Nephew, Largo, FL) abgedeckt, der dann an die Stelle angeheftet und mit einer antimikrobiellen Salbe bedeckt wurde.

Eine tägliche Kontrolle zur Sicherstellung der Integrität der Abdeckung wurden vorgenommen. Die experimentellen Gruppen wurden entweder mit dem hEGF Plasmid (Gruppe 1a n = 7, Gruppe 1b n = 7) oder mit dem pCMVβ-Gal Plasmid (Gruppe 2a n = 7, Gruppe 2b n = 7) transplantiert. Die Expression des EGF Transgens wurde am Tag 1, 3, 5 und 7 durch Messung der EGF Konzentration in dem Wundhomogenisat überwacht. Am Tag 1, 3, 5 (jeweils zwei Mäuse pro Gruppe) und am Tag 7 (eine Maus pro Gruppe) wurden Biopsien genommen, die die gesamte Wunde umfassen, um ein Homogenat der Wunde zu erhalten und damit das EGF Protein nachzuweisen. Andererseits wurden immunhistochemische Untersuchungen mit herkömmlichen Histologieverfahren durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der Fig. 2 dargestellt. Wie zu erkennen, ist bei den nicht ultivierten humanen Keratinozyten eine 181-fach erhöhte EGF Konzentration 24 Stunden nach Transformation mit dem EGF Plasmid gegenüber Wunden, die mit dem pCMVβ-Gal als Kontrolle tranfiziert wurden, zu beobachten (Fig. 4). EGF Konzentrationen wurden für den gesamten siebentägigen Untersuchungszeitraum nachgewiesen. Sie nahmen aber innerhalb der ersten drei Tage schnell ab, ausgehend von 180 µg/ml am Tag 1 nach Behandlung bis ca. 20 µg/ml am Tag 7 nach Behandlung.

Nach Transplantation von kultivierten humanen Keratinozyten, die mit der Fibrinmatrix, enthaltend das EGF Plasmid, resuspendiert wurden, wurden ähnliche Konzentrationsmuster für das EGF Protein erhalten (Fig. 3) (200,5 µg/ml, Tag 7 20 µg/ml)

Claims (19)

1. Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Wundheilung, Reparatur und Regeneration von Säugetiergewebe, umfassend die folgenden Schritte:

• a) Bereitstellung einer Plasmid DNA, die für ein Gen kodiert, das einen positiven Effekt auf den Verlauf der Regeneration des Gewebes ausübt, in im wesentlichen reiner Form,
• b) Bereitstellung von Komponenten eines selbst-härtenden Biopolymers und
• c) Bereitstellung einer Zellsuspension mit Zellen, die förderlich bei der Regenerierung sind,

dadurch gekennzeichnet, dass die Komponenten (a), (b) und (c) gleichzeitig oder nacheinander miteinander inkubiert werden, so dass das Plasmid und die Zellsuspension homogen in einer der Biopolymerkomponenten verteilt erhalten sind.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Biopolymer ausgewählt ist aus einem Fibrinkleber, Collagen, Gelatin, Alginat, Hyaluronsäure, Polysaccharid, organischem Polymer oder Derivaten davon bzw. Kombinationen davon.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Biopolymer ein Fibrinkleber ist.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid und die Zellen in der Thrombin-Komponente des Fibrinklebers sind.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Biopolymer in einer flüssigen oder lyophilisierten Form vorliegt.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Plasmid zu Biopolymerkomponente 5-25 µg/ml, bevorzugterweise 10- 20 µg/ml, ist.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von Plasmid zu Biopolymerkomponente 25-100 µg/ml, bevorzugterweise um 50 µg/ml, ist.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von 25.000-75.000 Zellen/µg Plasmid ist.

9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Verhältnis von 75.000-100.000 Zellen/µg Plasmid, bevorzugterweise um 50.000, ist.

10. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das die Anzahl an Zellen pro ml Biopolymerkomponente 250.000 bis 2.500.000, bevorzugterweise 250.000-750.000, ist.

11. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellsuspension eine Suspension von Zellen ausgewählt aus Keratinozyten, Chondrozyten, Fibroblasten, Epithelzellen, Endothelzellen, Osteoblasten und Osteoklasten, ist.

12. Transfektionssystem, enthaltend eine Plasmid DNA, die für ein Gen kodiert, das einen positiven Effekt auf den Verlauf der Regeneration des Gewebes ausübt, in im wesentlichen reiner Form, eine Komponente eines selbst­ härtenden Biopolymers und eine Zellsuspension mit Zellen, die förderlich bei der Regenerierung sind und das keine weiteren die Transfektion fördernden oder vermittelnden Substanzen enthält.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Plasmid DNA, die für ein Gen kodiert, das einen positiven Effekt auf den Verlauf der Regeneration des Gewebes ausübt, in im wesentlichen reiner Form, Komponenten eines selbst-härtenden Biopolymers, eine Zellsuspension mit Zellen, die förderlich bei der Regenerierung sind und gegebenenfalls einen weiteren pharmazeutisch annehmbaren Träger, und keine weiteren die Transfektion fördernden oder vermittelnden Substanzen enthält.

14. Therapeutisches Kit zur Behandlung von Gewebedefekten, umfassend:

• - eine Plasmid DNA, die für ein Gen kodiert, das einen positiven Effekt auf den Verlauf der Regeneration des Gewebes ausübt, in im wesentlichen reiner Form,
• - Komponenten eines selbst-härtenden Biopolymers und
• - eine Zellsuspension mit Zellen, die förderlich bei der Regenerierung sind

und das keine weiteren die Transfektion fördernden oder vermittelnden Substanzen enthält.

15. Therapeutisches Kit enthaltend eine Zusammensetzung erhältlich gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.

16. Verwendung des Transfektionssystems, der pharmazeutischen Zusammensetzung oder des therapeutischen Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15 zur Behandlung von Gewebedefekten.

17. Verwendung gemäß Anspruch 16 zur Behandlung von Verbrennungswunden, Knochen-, Muskel-, Nerven- oder Knorpelschädigungen, chronischen Wunden oder Gewebeaugmentationen, bevorzugt zur Wundheilung in der Haut.

18. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 16 bis 17, wobei die Zusammensetzung auf den Gewebedefekt aufgesprüht wird.

19. Verwendung eines Gels enthaltend die pharmazeutische Zusammensetzung erhältlich gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 zur Behandlung von Gewebedefekten.