DE102013204212A1

DE102013204212A1 - Verfahren und Kit zur Herstellung von Biomaterial zur Geweberegeneration

Info

Publication number: DE102013204212A1
Application number: DE102013204212.4A
Authority: DE
Inventors: Kerstin Galler; Gottfried Schmalz; Andreas Schönebaum; Hardy Schweigel
Original assignee: Muehlbauer Technology GmbH
Current assignee: Muehlbauer Technology GmbH
Priority date: 2013-03-12
Filing date: 2013-03-12
Publication date: 2014-10-02
Also published as: DE112014001245A5; DE112014001245B4; WO2014139809A1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein in vitro Verfahren zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen, zur Verwendung bei der Geweberegeneration geeigneten Biomaterials, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen einer einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung für Hartgewebe, wobei die Spüllösung mindestens ein Demineralisierungsmittel für Hartgewebe und ein durch Kontakt der Spüllösung mit dem Hartgewebe aus dem Hartgewebe gewonnenes Wachstumsfaktorgemisch enthält; b) Bereitstellen von Gerüstmaterial; c) Beladen des Gerüstmaterials mit mindestens einem Wachstumsfaktor durch Inkontaktbringen der Spüllösung mit dem Gerüstmaterial. Die Erfindung betrifft ferner ein Kit zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen, zur Verwendung bei der Geweberegeneration geeigneten Biomaterials und ein Kit zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials zur Verwendung bei der Geweberegeneration.
Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der medizinischen Geweberegeneration, insbesondere in der Zahn- bzw. Knochenheilkunde. Die Zahnpulpa, wird von einem Zahnhartgewebemantel (Zahnschmelz, Dentin und Zement der Zahnkrone und -wurzel) umhüllt. Aufgrund einer Schädigung des Hartgewebemantels kann es zum Eindringen von Bakterien und zur Entzündung des Pulpagewebes kommen. Dies macht im fortgeschrittenen Stadium in der Regel eine Wurzelkanalbehandlung erforderlich. Bei herkömmlichen Wurzelkanalbehandlungen wird das Pulpagewebe vollständig entfernt, woraufhin das Wurzelkanalsystem desinfiziert und mit bioinertem synthetischem Füllmaterial verschlossen wird. Im Stand der Technik erfolgt die Reinigung und/oder Desinfektion des Wurzelkanalsystems üblicherweise mittels wässriger Spüllösungen. Vorzugsweise werden Wechselspülungen mit Natriumhypochlorit- und Chlorhexidinlösung durchgeführt. Die Spüllösungen können jedoch auch Chlorphenol-Kampher-Menthol, Wasserstoffperoxid, Jod-Kaliumjodid, Calciumhydroxid, MTAD (Mischung aus einem Tetracyclin, einer Säure und einem Tensid), Zitronensäure oder EDTA enthalten. Die Spüllösungen werden nach der Anwendung verworfen. Ein Nachteil dieser Wurzelkanalbehandlung besteht darin, dass gegebenenfalls auch nicht irreversibel geschädigtes Pulpagewebe vollständig entfernt wird, wodurch die Pulpafunktion nicht erhalten bleibt.
Ausgehend von dem oben beschriebenen Stand der Technik, liegt der Erfindung die Aufgabe zu Grunde, einfache und vergleichsweise kostengünstige Maßnahmen bzw. Mittel für die Zahn- bzw. Knochenheilkunde bereitzustellen, die eine Geweberegeneration, beispielsweise eine Regeneration des Pulpagewebes, unterstützen.
Gelöst wird die Aufgabe durch das In-vitro-Verfahren zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials gemäß Anspruch 1, sowie durch den Kit zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials gemäß Anspruch 9. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.
Die Erfindung hat erkannt, dass in Hartgeweben wie Dentin bzw. Knochen bioaktive Wachstumsfaktoren eingelagert sind, die durch die Behandlung mit geeigneten Spüllösungen gelöst bzw. freigesetzt werden können. Dies erlaubt es, dass körpereigene Wachstumsfaktoren in ein Biomaterial eingebunden und zur Gewebeneubildung genutzt werden können.
Zunächst seien einige im Rahmen der Erfindung verwendete Begriffe erläutert.
Gegenstand der Erfindung ist ein In-vitro-Verfahren zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen, zur Verwendung bei der Geweberegeneration geeigneten Biomaterials, umfassend die folgenden Schritte:

a) Bereitstellen einer einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung für Hartgewebe, wobei die Spüllösung mindestens ein Demineralisierungsmittel für Hartgewebe und ein durch Kontakt der Spüllösung mit dem Hartgewebe aus dem Hartgewebe gewonnenes Wachstumsfaktorgemisch enthält;
b) Bereitstellen von Gerüstmaterial;
c) Beladen des Gerüstmaterials mit mindestens einem Wachstumsfaktor durch Inkontaktbringen der Spüllösung mit dem Gerüstmaterial.

Im Rahmen der Erfindung bezeichnet der Begriff Biomaterial biokompatible Materialien bzw. Zusammensetzungen, die physiologisch verträglich und zum längerfristigen Verbleib in einen tierischen oder menschlichen Körper, insbesondere einen Säugerkörper, eingebracht werden können. Das wachstumsfaktorbeladene Biomaterial enthält ein Gerüstmaterial und Wachstumsfaktoren sowie ggf. weitere Substanzen. Ein Gerüstmaterial (engl. Scaffold) bildet eine dreidimensionale poröse Struktur. Das Gerüstmaterial dient einerseits als Trägermaterial für Wachstumsfaktoren und ggf. weitere Substanzen und andererseits als Gerüst für die Geweberegeneration. Gerüstmaterialien für die Geweberegeneration sind dem Fachmann bekannt. Im Rahmen der Erfindung können alle bekannten natürlichen oder synthetischen Gerüstmaterialien für die Geweberegeneration bzw. Kombinationen dieser Materialien verwendet werden. Geeignete Gerüstmaterialien zur Regeneration von Gewebe sind in Galler K. M. et al.(2011), Scaffolds for Dental Pulp Tissue Engineering, Adv Dent Res 23(3):333–339 beschrieben.
Das im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellte Gerüstmaterial kann vorteilhafterweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus synthetischen Polymeren, natürlichen Biomaterialien, insbesondere Biopolymeren und Kombinationen der Vorgenannten. Vorzugsweise ist das Gerüstmaterial ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus selbstorganisierenden Peptiden (SAP), Polyethern, Polymilchsäure, Polyglykolsäure (PGA), Copolymeren von Polymilchsäure mit Polyethern (PLGA), Poly-ε-Caprolacton (PCL), Polyurethanen, Kollagen, Fibrin, Polysacchariden und Kombinationen der Vorgenannten. Besonders bevorzugt ist das Gerüstmaterial ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus selbstorganisierenden Peptiden (SAP), Kollagen, Fibrin und Kombinationen der Vorgenannten. Im Rahmen der Erfindung sind selbstorganisierende Peptide als Gerüstmaterial ganz besonders bevorzugt.
Das wachstumsfaktorbeladene Biomaterial ist bevorzugt in einen Wurzelkanal implantierbar und/oder injizierbar. Das Biomaterial kann flüssig oder fest sein oder in Form eines Gels vorliegen. Im Rahmen der Erfindung sind fließfähige bzw. mittels Spritze anwendbare Biomaterialien besonders bevorzugt. Diese können in einen Wurzelkanal injiziert werden. Das Biomaterial kann bevorzugt durch Kanülen mit einem Innendurchmesser unter 2 mm, weiter bevorzugt unter 1 mm appliziert werden. Bevorzugt ist weiterhin ein härtbares, vorzugsweise polymerisierbares, Biomaterial, das nach dem Einbringen in eine Läsion, beispielsweise einen Wurzelkanal, härtet bzw. zur Erhärtung gebracht werden kann. Es ist besonders vorteilhaft, wenn das Biomaterial im Wurzelkanal zu einem Gel härten kann bzw. als ein Gel vorliegt. Bevorzugt kann das Biomaterial zu einem Gel mit einer Endfestigkeit zwischen 200 und 10000 Pa [G’] aushärten. Diese Eigenschaften des Biomaterials können durch die Wahl eines geeigneten Gerüstmaterials erreicht werden. Das Gerüstmaterial ist bevorzugt in einen Wurzelkanal implantierbar und/oder injizierbar. Es kann flüssig oder fest sein oder in Form eines Gels vorliegen. Besonders bevorzugt sind fließfähige bzw. mittels Spritze anwendbare Gerüstmaterialien, da diese in einen Wurzelkanal injiziert werden können. Das Gerüstmaterial kann bevorzugt durch Kanülen mit einem Innendurchmesser unter 2 mm, weiter bevorzugt unter 1 mm appliziert werden. Bevorzugt ist weiterhin ein härtbares, vorzugsweise polymerisierbares, Gerüstmaterial, das nach dem Einbringen in eine Läsion, beispielsweise einen Wurzelkanal, härtet bzw. zur Erhärtung gebracht werden kann.
Bevorzugt besteht ein Gerüstmaterial zunächst aus Vorstufen für das gehärtetes Gerüstmaterial, insbesondere Monomere, Oligomere und Polymere. Das Gerüstmaterial kann polymerisierbare bzw. vernetzende Gruppen tragen und über diese gehärtet werden, wobei sich die polymerisierbaren bzw. vernetzenden Gruppen nicht auf reaktionsfähige Doppelbindungen beschränken. Die Polymerisation bzw. Vernetzung erfolgt vorzugsweise über elektrostatische Wechselwirkungen, beispielsweise bei selbstorganisierenden Peptiden oder über kovalente Bindungen. Es ist besonders vorteilhaft, wenn das Gerüstmaterial im Wurzelkanal zu einem Gel härten kann bzw. als ein Gel vorliegt. Bevorzugt kann das Gerüstmaterial zu einem Gel mit einer Endfestigkeit zwischen 200 und 10000 Pa [G’] aushärten. Es ist vorteilhaft, wenn das Gerüstmaterial mindestens zwei Komponenten umfasst und durch Selbsthärtung (durch Mischen und Reaktion von mindestens zwei der durch das Gerüstmaterial umfassten Komponenten) härtbar ist, bevorzugt einen Gelzustand annimmt. Bei einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist das verwendete Gerüstmaterial durch Energiezufuhr, beispielsweise durch Lichtpolymerisation unter Einsatz eines geeigneten Initiatorsystems härtbar.
Für das Gerüstmaterial bevorzugte Gele sind Hydrogele, beispielsweise selbstorganisierende Peptide oder Polyether. Vorteilhafte Polyether sind Polyethylenglykole (PEGs). Die Polyether können polymerisierbare bzw. vernetzende Gruppen tragen und über diese ausgehärtet werden.
Das Gerüstmaterial ist vorteilhafterweise im Körper abbaubar. Vorteilhafterweise kann der Abbau des Gerüstmaterials gesteuert werden. Vorzugsweise ist der Abbau zellvermittelt gesteuert. Dies hat den Vorteil, dass der Abbau proportional zur Gewebeneubildung erfolgt.
Vorzugsweise ist das Gerüstmaterial zelladhäsiv.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform weist das Gerüstmaterial adhäsive Gruppen auf, an die Vermittlermoleküle für Wachstumsfaktoren und/oder Wachstumsfaktoren bevorzugt reversibel gebunden werden können. Die Vermittlermoleküle dienen bevorzugt zur Stabilisierung und Bindung der Wachstumsfaktoren.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform weist das Gerüstmaterial im Körper abbaubare Gruppen auf. Bei den abbaubaren Gruppen handelt es sich bevorzugt um durch Proteinase, z. B. durch MMP-2, abbaubare Gruppen.
Die adhäsiven und/oder im Körper abbaubaren Gruppen sind bevorzugt geeignete Aminosäuresequenzen.
Wachstumsfaktoren sind Proteine, die die Zellproliferation und -differenzierung fördern. Im Rahmen der Bildung von Hartgewebe, sowohl Dentin wie auch Knochen, werden Wachstumsfaktoren ins Hartgewebe eingelagert, die bioaktiv bleiben beziehungsweise aktiviert werden können. Die Erfindung hat erkannt, dass beide Hartgewebe somit als Reservoir für diese Wachstumsfaktoren dienen können.
Eine Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe ist eine Lösung, die dazu vorgesehen ist mit tierischem oder menschlichem Hartgewebe, z.B. im Knochen oder im Zahn, in Kontakt gebracht zu werden und dazu geeignet ist, im Hartgewebe gebundene Wachstumsfaktoren freizusetzen. Die Freisetzung kann durch eine Demineralisation des Hartgewebes bzw. dessen Oberflächenschicht, beispielsweise durch Säureeinwirkung und/oder Calciumkomplexierung, bevorzugt jedoch durch Calciumkomplexierung erfolgen, wodurch im Hartgewebe gebundene Wachstumsfaktoren exponiert werden. Die Wachstumsfaktoren können dabei auch in Lösung gebracht werden. Ein im Rahmen der Erfindung bevorzugtes Hartgewebe ist Zahnhartgewebe, insbesondere Dentin. Während der Dentinbildung zum Zeitpunkt der Zahnentwicklung werden von dentinbildenden Zellen verschiedene Wachstumsfaktoren gebildet, welche in die Dentinmatrix eingebettet werden und dort bioaktiv bleiben bzw. durch das erfindungsgemäße Verfahren bioaktiviert werden. Dabei handelt es sich um ein Gemisch aus Wachstumsfaktoren. Durch die Konditionierung mittels der Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe werden Wachstumsfaktoren freigesetzt. Ein Teil geht in die Spüllösung über, ein Teil bleibt, bspw. an das freigelegte Kollagengerüst des Dentins, gebunden.
Die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe enthält mindestens ein Demineralisierungsmittel. Im Rahmen der Erfindung bezeichnet der Begriff Demineralisierungsmittel ein Mittel, welches dazu geeignet ist im Hartgewebe, z. B. im Dentin oder Knochen, gebundene Wachstumsfaktoren freizusetzen. Ferner soll das Demineralisierungsmittel nicht zu einer Denaturierung der Wachstumsfaktoren führen.
Das mindestens eine Demineralisierungsmittel ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Säuren, Salzbildnern und Chelatbildnern. Ein vorteilhafter Salzbildner ist z. B. Dinatriumhydrogenphosphat/Natriumhydrogenphosphat. Andere geeignete Bildner von (schwerlöslichen) Calciumsalzen können auch Verwendung finden. Eine vorteilhafte Säure ist Zitronensäure. Zitronensäure, bzw. deren Salze, bevorzugt Alkalimetallverbindungen, insbesondere des Natriums, ist auch ein Calciumchelatbildner. Chelatbildner sind im Rahmen der Erfindung bevorzugte Demineralisierungsmittel. Vorteilhafte Chelatbildner sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EDTA (Ethylendiamintetraeesigsäure bzw. deren Salze, bevorzugt Alkalimetallverbindungen, insbesondere des Natriums), EGTA (Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraessigsäure bzw. deren Acetate, bevorzugt Alkalimetallsalze, insbesondere des Natriums.) und Zitronensäure bzw. Citrate, bevorzugt Alkalimetallcitrate, insbesondere des Natriums.
Es ist vorteilhaft, wenn die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe einen pH-Wert von größer 4, vorzugsweise einen pH-Wert von größer 5 aufweist. Vorzugsweise kann die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe einen pH-Wert von 4 bis 10, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 9, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 8, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 6,5 bis 7,5, besonders bevorzugt einen pH-Wert von 7 aufweisen. Zu beachten ist hierbei, dass bei Verwendung von Säuren, ein pH-Wert > 6 der Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe nur bevorzugt ist, wenn die Säure gleichzeitig ein guter Calciumsalzbildner oder Calciumchelatbildner ist. Zur Einstellung des pH-Wertes kann die Spüllösung geeignete Puffersysteme enthalten, beispielsweise Phosphatpuffer (NaH₂PO₄/Na₂HPO₄).
Im Rahmen der Erfindung ist es vorteilhaft, wenn die Konzentration des mindestens einen Demineralisierungsmittels in der Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe mindestens 5 Gew.-%, weiter vorzugsweise mindestens 10 Gew.-%, weiter vorzugsweise 10 Gew.-% bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 10 Gew.-% bis 17 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt 17 Gew.-% beträgt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe als Chelatbildner EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure bzw. Ethylendiamintetraacetat). Vorteilhafterweise handelt es sich bei der Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe um eine wässrige EDTA-Lösung. EDTA-Lösungen finden unter anderem Anwendung in der Endodontie, wo sie beispielsweise zur Entfernung einer Schmierschicht im Rahmen einer Wurzelkanalbehandlung eingesetzt werden. Im Stand der Technik werden diese Lösungen nach der Entnahme aus dem tierischen bzw. menschlichen Körper, d.h. nach der Anwendung, verworfen. Demgegenüber hat die Erfindung erkannt, dass bei der Anwendung der Spüllösung körpereigene, im Hartgewebe gebundene Wachstumsfaktoren freigesetzt werden, die in ein Biomaterial eingebunden und zur Geweberegeneration genutzt werden können.
Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren sieht die Bereitstellung einer einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung für Hartgewebe vor. Hierbei handelt es sich um eine Spüllösung, die über einen bestimmten Zeitraum mit tierischem oder menschlichem Hartgewebe, z. B. Knochen oder Zahnhartgewebe, in Kontakt war. Die Spüllösung enthält mindestens ein Demineralisierungsmittel für Hartgewebe und ein durch Kontakt der Spüllösung mit dem Hartgewebe aus dem Hartgewebe gewonnenes Wachstumsfaktorgemisch. Bei dem mindestens einen Demineralisierungsmittel in der einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung handelt es sich um ein oben beschriebenes Demineralisierungsmittel. Es kann vorteilhafterweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Säuren, Salzbildnern und Chelatbildnern. Bevorzugt ist das mindestens eine Demineralisierungsmittel vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EDTA (Ethylendiamintetraeesigsäure bzw. Ethylendiamintetraacetat), EGTA (Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraessigsäure bzw. Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N’,N’tetraacetat) und Zitronensäure bzw. Citrat. Besonders bevorzugte Demineralisierungsmittel sind Zitronensäure bzw. Citrat und EDTA. Das Wachstumsfaktorgemisch in der einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung enthält in der Regel alle im Hartgewebe vorkommenden Wachstumsfaktoren, wobei das Verhältnis der Wachstumsfaktoren zueinander in der Spüllösung dem natürlichen Verhältnis der Wachstumsfaktoren im Hartgewebe entspricht.
Vorteilhafterweise weist die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung Wachstumsfaktoren auf, deren Konzentration in der Spüllösung jeweils zwischen 0,0001 ng/ml und 1000 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 100 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,0001 ng/ml und 50 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 10 ng/ml liegt.
Vorteilhafterweise enthält die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung mindestens 0,01 ng/ml eines transformierenden Wachstumsfaktors (TGF), vorzugsweise mindestens 0,05 ng/ml TGF, weiter vorzugsweise mindestens 0,1 ng/ml TGF, besonders bevorzugt mindestens 0,3 ng/ml TGF. Bei einer Ausführungsform der Erfindung enthält die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung zwischen 0,01 ng/ml und 500 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,01 ng/ml und 100 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,1 ng/ml und 50 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,1 ng/ml und 10 ng/ml TGF. Ein bevorzugter transformierender Wachstumsfaktor ist TGF-beta-Wachstumsfaktor (TGF-β). Ein besonders bevorzugter transformierender Wachstumsfaktor ist der transformierende Wachstumsfaktor-beta-1 (TGF-β-1).
Vorteilhafterweise enthält die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung mindestens 0,0001 ng/ml vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), vorzugsweise mindestens 0,001 ng/ml VEGF. Bei einer Ausführungsform der Erfindung enthält die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml VEGF, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 5 ng/ml VEGF, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml VEGF, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml VEGF.
Vorteilhafterweise enthält die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung mindestens 0,0001 ng/ml Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF), vorzugsweise mindestens 0,001 ng/ml FGF. Bei einer Ausführungsform der Erfindung enthält die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml FGF, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 5 ng/ml FGF, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml FGF, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml FGF. Ein bevorzugter Fibroblasten Wachstumsfaktor ist der Fibroblasten Wachstumsfaktor 2 (FGF-2).
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform enthält die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung zwischen 0,0001 ng/ml und 100 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml eines Wachstumsfaktors, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den in Zahnhartgewebe und Knochen vorkommenden Wachstumsfaktoren.
In einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung zwischen 0,0001 ng/ml und 100 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml eines Wachstumsfaktors, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Plättchen-assoziierten Wachstumsfaktoren (PDGF), Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP), Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF) und Epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF).
Vorzugsweise weist die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung einen pH-Wert von größer 4, besonders bevorzugt von größer 5 auf. Vorteilhafte pH-Werte für die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung liegen zwischen 4 und 10, vorzugsweise zwischen 5 und 9, weiter vorzugsweise zwischen 5 und 8, besonders bevorzugt zwischen 6,5 und 7,5, ganz besonders bevorzugt bei einem pH-Wert von 7.
Erfindungsgemäß wird das Gerüstmaterial mit mindestens einem Wachstumsfaktor beladen. Das Beladen des Gerüstmaterials erfolgt erfindungsgemäß durch Inkontaktbringen der der einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung mit dem Gerüstmaterial. Das Inkontaktbringen kann das Aufbringen bzw. das Einbringen der Spüllösung auf bzw. in das Gerüstmaterial umfassen. Vorzugsweise erfolgt das Beladen des Gerüstmaterials durch Mischen der Spüllösung mit dem Gerüstmaterial. In Abhängigkeit davon, ob das Gerüstmaterial fest oder flüssig, löslich oder unlöslich ist, wird eine Dispersion bzw. Lösung durch Mischung von Gerüstmaterial und Spüllösung hergestellt.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird das Gerüstmaterial mit mindestens einem in Knochen oder Zahnhartgewebe natürlich vorkommenden Wachstumsfaktor beladen. Bevorzugt ist der mindestens eine Wachstumsfaktor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF), Fibroblasten Wachstumsfaktoren (FGF), Plättchen-assoziierten Wachstumsfaktoren (PDGF), Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP), Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF) und Epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF). Innerhalb der Gruppe der Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP) ist der Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktor 2 (BMP-2) besonders bevorzugt. Vorzugsweise wird das Gerüstmaterial mit dem mindestens einen Wachstumsfaktor in Mengen zwischen 0,0001 ng/ml und 500 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 100 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 50 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml beladen.
Vorteilhafterweise wird das Gerüstmaterial mit einem Wachstumsfaktorgemisch beladen. Das Wachstumsfaktorgemisch enthält mindestens zwei Wachstumsfaktorkomponenten.
Bevorzugt ist von den mindestens zwei Wachstumsfaktorkomponenten mindestens eine Wachstumsfaktorkomponente ein transformierender Wachstumsfaktor (TGF), wobei der transformierende Wachstumsfaktor TGF-beta-Wachstumsfaktor (TGF-β) besonders bevorzugt ist und wobei der transformierende Wachstumsfaktor-beta-1 (TGF-β-1) ganz besonders bevorzugt ist. Vorteilhafterweise wird das Gerüstmaterial mit mindestens 0,01 ng/ml TGF, vorzugsweise mindestens 0,05 ng/ml TGF, weiter vorzugsweise mindestens 0,1 ng/ml TGF, besonders bevorzugt mindestens 0,3 ng/ml TGF beladen. In einer vorteilhaften Ausführungsform wird das Gerüstmaterial mit einer Menge an TGF zwischen 0,01 ng/ml und 500 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,01 ng/ml und 100 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,1 ng/ml und 50 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,1 ng/ml und 10 ng/ml beladen.
Bevorzugt ist von den mindestens zwei Wachstumsfaktoren mindestens ein Wachstumsfaktor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF) und Fibroblasten Wachstumsfaktoren (FGF). In der Gruppe der Fibroblasten Wachstumsfaktoren ist der Fibroblasten Wachstumsfaktor 2 (FGF-2) besonders bevorzugt.
Vorteilhafterweise wird das Gerüstmaterial mit mindestens 0,0001 ng/ml VEGF, vorzugsweise mit mindestens 0,001 ng/ml VEGF beladen. In einer vorteilhaften Ausführungsform wird das Gerüstmaterial mit einer Menge an VEGF zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 5 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml beladen.
Vorteilhafterweise wird das Gerüstmaterial mit mindestens 0,0001 ng/ml FGF, vorzugsweise mindestens 0,001 ng/ml FGF beladen. In einer vorteilhaften Ausführungsform wird das Gerüstmaterial mit einer Menge an FGF zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 5 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml beladen.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung entsprechen die Wachstumsfaktorkomponenten des Wachstumsfaktorgemisches, mit dem das Gerüstmaterial beladen wird, den Wachstumsfaktorkomponenten im Wachstumsfaktorgemisch der einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung, d.h. das Gerüstmaterial wird mit allen Wachstumsfaktorkomponenten beladen, die sich in der Spüllösung finden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Spüllösung in Schritt c) in einer Menge auf das Gerüstmaterial gebracht, die eine Beladung des Gerüstmaterials mit einem Wachstumsfaktorgemisch im Größenordnungsbereich der Konzentration in der Spüllösung oder sogar größer ermöglicht.
Die Immobilisierung der Wachstumsfaktoren im oder am Biomaterial bzw. Gerüstmaterial erfolgt bevorzugt über schwache, nichtkovalente Bindungen, sodass sie reversibel ist. Die Bindung kann über Vermittlermoleküle, wie Heparin erfolgen.
Im Rahmen der Erfindung kann vorgesehen sein, dass die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung vor dem Beladen des Gerüstmaterials zur Verwendung mit dem Gerüstmaterial aufbereitet wird. Die Aufbereitung der Spüllösung umfasst jedwede Schritte, die die Verwendung der Spüllösung in einem Biomaterial erfordert. Insbesondere kann die Aufbereitung der Spüllösung die Sterilisation der Spüllösung und/oder die Inaktivierung von Toxinen in der Spüllösung und/oder die Entfernung von Toxinen aus der Spüllösung und/oder die Zugabe von einem oder mehreren Hilfsstoffen zu der Spüllösung umfassen.
Vorzugsweise umfasst die Aufbereitung der einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung die Zugabe von mindestens einer pharmazeutisch wirksamen Substanz und/oder die Zugabe von mindestens einem Vermittler zur Stabilisierung und Bindung von Wachstumsfaktoren. Bevorzugt handelt es sich bei der pharmazeutisch wirksamen Substanz um ein Antibiotikum. Im Rahmen der Erfindung bezeichnet der Begriff Vermittler chemische Stoffe bzw. Moleküle, insbesondere Biopolymere, welche die Bindung mindestens eines Wachstumsfaktors an das Gerüstmaterial bewirkt oder unterstützt. Ein bevorzugter Vermittler ist Heparin. Heparin ist ein sulfatiertes und damit negativ geladenes Glykosaminoglykan, welches natürlich in der extrazellulären Matrix vorkommt und bestimmte Wachstumsfaktoren (Heparin-bindende Wachstumsfaktoren) binden sowie vor proteolytischem Abbau schützen kann. Dieser Effekt kann in synthetischen Matrizes imitiert werden. Ein Vorteil der Aufbereitung der Spüllösung mit Heparin liegt darin, dass die aus dem Dentin herausgelösten heparin-bindenden Wachstumsfaktoren über Heparin an das Gerüstmaterial gebunden werden können und somit deren Halbwertszeit verlängert werden kann.
Die Aufbereitung der einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung kann die Entfernung von Demineralisierungsmittel aus der Spüllösung umfassen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das mindestens eine Demineralisierungsmittel EDTA und die Aufbereitung der Spüllösung umfasst den Abbau von EDTA und/oder die teilweise oder vollständige Entfernung von EDTA und/oder dessen Abbauprodukten aus der Spüllösung. Die Entfernung von EDTA aus der Spüllösung kann die Rekomplexierung von EDTA und die Entfernung und/oder den Abbau des EDTA-Komplexes umfassen. Das EDTA kann vorzugsweise durch die Zugabe löslicher Eisen(III)-salze zur Spüllösung rekomplexiert werden. Durch Bestrahlung mit UV-Licht kann der so entstandene Komplex zerstört werden. Die Zerfallsprodukte sind nicht oder weniger toxisch als EDTA. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Aufbereitung deshalb den Abbau von EDTA unter Zugabe von Eisen(III)-salzen und/oder durch Bestrahlung mit UV-Licht umfassen. Die Bestrahlung mit UV-Licht erfolgt bevorzugt im Wellenlängenbereich über 200 nm. Im Rahmen der Erfindung kann die Aufbereitung der Spüllösung vorteilhafterweise die teilweise oder vollständige Entfernung von EDTA aus der Spüllösung und/oder von dessen Abbauprodukten mittels geeigneter Anionentauscherharzpartikel, bspw. mittels quartärer Ammoniumgruppen gebunden an geeignete Trägerpolymere, bspw. vernetzte Agarosegele, umfassen. Falls die Spüllösung EDTA enthält, erfolgt der Abbau von EDTA und/oder die teilweise oder die vollständige Entfernung von EDTA und/oder dessen Abbauprodukten aus der Spüllösung vorzugsweise zu Beginn der Aufbereitung bevor weitere Aufbereitungsschritte durchgeführt werden.
Ein im Rahmen der Erfindung bevorzugtes Hartgewebe ist Zahnhartgewebe, insbesondere Dentin.
Das wachstumsfaktorbeladene Biomaterial kann autologe oder allogene Stammzellen enthalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält das wachstumsfaktorbeladene Biomaterial autologe Stammzellen. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das wachstumsfaktorbeladene Biomaterial keine Stammzellen.
Die Erfindung sieht auch ein wachstumsfaktorbeladenes Biomaterial zur Verwendung bei der Geweberegeneration vor, welches durch das oben beschriebene Verfahren erhältlich ist.
Daneben sieht die Erfindung ein mit einem Wachstumsfaktorgemisch aus mindestens zwei natürlich im Dentin vorkommenden Wachstumsfaktoren beladenes Biomaterial zur Verwendung bei der Pulpageweberegeneration vor, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass das Gewichtsverhältnis der Wachstumsfaktoren zueinander im Biomaterial mit dem natürlichen Gewichtsverhältnis der Wachstumsfaktoren zueinander im Dentin korreliert ist. Bevorzugt sind die mindestens zwei natürlich im Dentin vorkommenden Wachstumsfaktoren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF), Fibroblasten Wachstumsfaktoren (FGF), Plättchen-assoziierten Wachstumsfaktoren (PDGF), Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP), Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF) und Epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF). Innerhalb der Gruppe der Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP) ist der Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktor 2 (BMP-2) besonders bevorzugt. Vorteilhafterweise kann das Biomaterial mit einem Wachstumsfaktorgemisch aus mindestens drei, vorzugsweise mindestens vier, vorzugsweise mindestens fünf, besonders bevorzugt mindestens sechs natürlich im Dentin vorkommenden Wachstumsfaktoren beladen sein, wobei die Wachstumsfaktoren vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF), Fibroblasten Wachstumsfaktoren (FGF), Plättchen-assoziierten Wachstumsfaktoren (PDGF), Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP), Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF) und Epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF). Innerhalb der Gruppe der Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP) ist der Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktor 2 (BMP-2) besonders bevorzugt. Ganz besonders bevorzugt kann das Biomaterial mit einem Wachstumsfaktorgemisch aus allen natürlich im Dentin vorkommenden Wachstumsfaktoren beladen sein. Ein entsprechendes Biomaterial kann durch das oben beschriebene Verfahren erhalten werden. Die Korrelation des Gewichtsverhältnisses der Wachstumsfaktoren zueinander im Biomaterial mit dem natürlichen Gewichtsverhältnis der Wachstumsfaktoren zueinander im Dentin ergibt sich dann über das Herstellungsverfahren. Es ist aber auch möglich, dass die Spüllösung bzw. die absolute Konzentration und/oder das Mengenverhältnis der Wachstumsfaktoren im Dentin zueinander im Biomaterial nachgeahmt werden. Die hierfür verwendeten Wachstumsfaktoren können von Menschen oder Tieren stammen oder gentechnisch hergestellt sein. Das Biomaterial enthält bevorzugt mindestens einen transformierenden Wachstumsfaktor (TGF), insbesondere TGF-ß-1, in einer Menge zwischen 0,01 ng/ml und 500 ng/ml. Das Mengenverhältnis eines transformierenden Wachstumsfaktors (TGF), insbesondere TGF-ß-1, im Biomaterial zu einem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) im Biomaterial ist in einer bevorzugten Ausführungsform TGF:VEGF gleich 2:1 bis 100:1, besonders bevorzugt TGF:VEGF gleich 2:1 bis 50:1 oder 2:1 bis 20:1. Das Mengenverhältnis eines transformierenden Wachstumsfaktors (TGF), insbesondere TGF-ß-1, im Biomaterial zu einem Fibroblasten Wachstumsfaktoren (FGF) im Biomaterial beträgt in einer bevorzugten Ausführungsform TGF:FGF gleich 2:1 bis 100:1, besonders bevorzugt TGF:FGF gleich 2:1 bis 50:1 oder 2:1 bis 20:1.
Die Erfindung betrifft zudem ein Kit zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials zur Verwendung bei der Geweberegeneration. Der erfindungsgemäße Kit umfasst

a) Gerüstmaterial und
b) eine Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe, die mindestens ein Demineralisierungsmittel für Hartgewebe enthält.

Für den erfindungsgemäßen Kit geeignete Gerüstmaterialien wurden bereits im Kontext des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens beschrieben. Auf diese Erläuterungen wird Bezug genommen. Die dort beschriebenen Gerüstmaterialien können auch im Rahmen des erfindungsgemäßen Kits als Komponente a) eingesetzt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits ist das Gerüstmaterial ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus synthetischen Polymeren, natürlichen Biomaterialien, insbesondere Polymeren und Kombinationen der Vorgenannten; wobei das Gerüstmaterial bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus selbstorganisierenden Peptiden (SAP), Polyethern, Polymilchsäure, Polyglykolsäure (PGA), Copolymeren von Polymilchsäure mit Polyethern (PLGA), Poly-ε-Caprolacton (PCL), Polyurethanen, Kollagen, Fibrin, Polysacchariden und Kombinationen der Vorgenannten; wobei das Gerüstmaterial besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus selbstorganisierenden Peptiden (SAP), Kollagen, Fibrin und Kombinationen der Vorgenannten. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Kits weist das Gerüstmaterial adhäsive Gruppen auf, an die Vermittlermoleküle für Wachstumsfaktoren und/oder Wachstumsfaktoren reversibel gebunden werden können und/oder es weist im Körper abbaubare Gruppen auf. Die adhäsiven und/oder abbaubaren Gruppen sind vorzugsweise Aminosäuresequenzen.
Die Spüllösung (Komponente b) ist dazu vorgesehen, mit tierischem oder menschlichem Hartgewebe, z.B. im Knochen oder im Zahn, in Kontakt gebracht zu werden. Für den erfindungsgemäßen Kit geeignete Spüllösungen zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe beziehungsweise geeignete Demineralisierungsmittel wurden bereits im Kontext des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens beschrieben. Auf diese Erläuterungen wird Bezug genommen. Die dort beschriebenen Spüllösungen zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe können auch im Rahmen des erfindungsgemäßen Kits als Komponente b) eingesetzt werden.
Vorteilhafterweise kann es sich bei der Komponente b) des Kits um eine anwendungsfertige Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe handeln. Eine anwendungsfertige Spüllösung enthält das mindestens eine Demineralisierungsmittel bereits in einer anwendungsfertigen Konzentration. Dies hat den Vorteil, dass die Lösung vor der Anwendung mit dem Hartgewebe z. B. nicht mehr extra verdünnt werden muss. Vorzugsweise beträgt die Konzentration des mindestens einen Demineralisierungsmittels in der Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe mindestens 5 Gew.-%, weiter vorzugsweise mindestens 10 Gew.-%, weiter vorzugsweise 10 Gew.-% bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 10 Gew.-% bis 17 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt 17 Gew.-%.
Die als Komponente b) des Kits vorgesehene Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe kann vorteilhafterweise einen pH-Wert von größer 4, vorzugsweise einen pH-Wert von größer 5, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 4 bis 10, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 9, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 8, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 6,5 bis 7,5, besonders bevorzugt einen pH-Wert von 7 aufweisen.
Bei einem bevorzugten Kit ist das mindestens eine Demineralisierungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Säuren, Salz- und Chelatbildnern wobei das mindestens eine Demineralisierungsmittel bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EDTA (Ethylendiamintetraeesigsäure bzw. Ethylendiamintetraacetat), EGTA (Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraessigsäure bzw. Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N’,N’tetraacetat) und Zitronensäure/Citrat.
Bei der Komponente b) des Kits kann es sich bevorzugt um eine wässrige Lösung eines Calciumchelatbildners handeln.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Kits ist das mindestens eine Demineralisierungsmittel Zitronensäure bzw. Citrat und die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe weist einen pH-Wert von größer 4, vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 7, weiter vorzugsweise von 4,5 bis 6,5 auf. Bei einer anderen besonders bevorzugten Ausführungsform des Kits ist das mindestens eine Demineralisierungsmittel EDTA und die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe weist einen pH-Wert von mindestens 6, vorzugsweise einen pH-Wert von mindestens 7, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 7 bis 9 auf.
Ein erfindungsgemäßer Kit kann vorteilhafterweise ferner mindestens eine Komponente umfassen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mitteln zur Entfernung von EDTA aus einer Lösung, Vermittlern, welche die Bindung mindestens eines Wachstumsfaktors an das Biomaterial, insbesondere des Gerüstmaterials bewirken oder unterstützen, einer UV-Lampe, und einer Vorrichtung zur Applikation der Spüllösung. Die Mittel zur Entfernung von EDTA aus einer Lösung können bevorzugt Eisen(III)-Salze und/oder Anionentauscherharze umfassen. Ein bevorzugter Vermittler ist Heparin. Die Vorrichtung zur Applikation der Spüllösung umfasst vorzugsweise eine Spritze und eine Kanüle, besonders bevorzugt eine stumpfe Endo-Kanüle.
Ein im Rahmen der Erfindung bevorzugtes Hartgewebe ist Zahnhartgewebe, insbesondere Dentin.
Es ist ein besonderer Vorteil der Erfindung, dass sie ein verbessertes Behandlungsverfahren zur Geweberegeneration, insbesondere ein verbessertes Verfahren zur Wurzelkanalbehandlung erlaubt.
Das Konzept dieses verbesserten Behandlungsverfahrens beruht auf der Nutzung, Aktivierung und Unterstützung der körpereigenen Mechanismen zur Gewebebildung durch 1) Freisetzung körpereigener, im Hartgewebe gebundener Wachstumsfaktoren, 2) Einbindung dieser Wachstumsfaktoren in ein Gerüst- bzw. Biomaterial, 3) Einbringen des wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials in den Körper und damit Rückführung der körpereigenen Wachstumsfaktoren, und 4) Mobilisierung residenter Stammzellen durch die enthaltenen Wachstumsfaktoren. Das Biomaterial fungiert hierbei als Matrix für die Geweberegeneration, welche auch ohne Zugabe von exogenen Stammzellen und/oder exogenen Wachstumsfaktoren erfolgen soll.
Das Behandlungsverfahren umfasst folgende Schritte:

a) Bereitstellen einer Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe, die mindestens ein Demineralisierungsmittel für Hartgewebe enthält, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Säuren, Calciumsalz- und Calcium-Chelatbildnern;
b) Kontaktieren des Hartgewebes mit der Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe unter Bedingungen, die ein Freisetzen im Hartgewebe gebundener Wachstumsfaktoren ermöglicht;
c) Entnahme der mit Wachstumsfaktoren angereicherten Spüllösung aus dem tierischen oder menschlichen Körper;
d) Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials, gemäß dem oben beschriebenen In-Vitro-Verfahren der Erfindung unter Verwendung der mit Wachstumsfaktoren angereicherten Spüllösung aus Schritt c);
e) Einbringen des wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials in einen tierischen oder menschlichen Körper.

Ein im Rahmen des Verfahrens bevorzugtes Hartgewebe ist Zahnhartgewebe, insbesondere Dentin. Es kann sich bei dem Hartgewebe allerdings auch um Knochengewebe handeln. Bevorzugt handelt es sich um menschliches Hartgewebe. Vorzugsweise wird in Schritt e) das wachstumsfaktorbeladene Biomaterial in den Körper eingebracht, mit dessen Hartgewebe die Spüllösung zum Spülen von menschlichen oder tierischen Hartgewebe in Schritt b) kontaktiert wurde, d.h. das Biomaterial ist im Hinblick auf den menschlichen oder tierischen Körper in welchen es eingebracht wird ein autologes Biomaterial. Das Einbringen von autologen Biomaterialien ist bevorzugt, da keine Immunantwort zu erwarten ist. Das Biomaterial kann autologe oder allogene Stammzellen enthalten. Bei einem bevorzugten Behandlungsverfahren enthält das Biomaterial autologe Stammzellen. Bei einem weiteren bevorzugten Behandlungsverfahren enthält das Biomaterial keine Stammzellen.
Für das Behandlungsverfahren geeignete Spüllösungen zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe beziehungsweise geeignete Demineralisierungsmittel wurden bereits im Kontext des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens bzw. des erfindungsgemäßen Kits beschrieben. Auf diese Erläuterungen wird Bezug genommen. Die dort beschriebenen Spüllösungen zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe können auch im oben beschriebenen Behandlungsverfahren eingesetzt werden.
Vorteilhafterweise weist die Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe aus Schritt a) einen pH-Wert von größer 4, vorzugsweise einen pH-Wert von größer 5, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 4 bis 10, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 9, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 8, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 6,5 bis 7,5, besonders bevorzugt einen pH-Wert von 7 auf.
Es ist vorteilhaft, wenn die Konzentration des mindestens einen Demineralisierungsmittels in der Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe aus Schritt a) mindestens 5 Gew.-%, weiter vorzugsweise mindestens 10 Gew.-%, weiter vorzugsweise 10 Gew.-% bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 10 Gew.-% bis 17 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt 17 Gew.-% beträgt.
Vorzugsweise ist das mindestens eine Demineralisierungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EDTA (Ethylendiamintetraeesigsäure bzw. Ethylendiamintetraacetat), EGTA (Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraessigsäure bzw. Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N’,N’tetraacetat) und Zitronensäure/Citrat. Bei einem bevorzugten Behandlungsverfahren enthält die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe aus Schritt a) als Demineralisierungsmittel EDTA (z.B. Dinatriumsalz). Vorteilhafterweise handelt es sich bei der Spüllösung um eine wässrige EDTA-Lösung. Vorzugsweise beträgt die Konzentration von EDTA in der Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe mindestens 5 Gew.-%, weiter vorzugsweise mindestens 10 Gew.-%, weiter vorzugsweise 10 Gew.-% bis 17 Gew,-%, weiter vorzugsweise mindestens 15 Gew.-%, besonders bevorzugt 17 Gew.-%.
Das Kontaktieren des Hartgewebes mit Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe in Schritt b) kann beispielsweise unter Verwendung eines Spritzensystems erfolgen. Das Spritzensystem umfasst bevorzugt eine stumpfe Endokanüle. Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung beträgt die Einwirkzeit der Spüllösung auf das Hartgewebe in Schritt b) zwischen 0,1 min und 30 min, vorzugsweise zwischen 1 min und 30 min, weiter vorzugsweise zwischen 1 min und 20 min, weiter vorzugsweise zwischen 2 min und 15 min, besonders bevorzugt zwischen 5 min und 20 min, ganz besonders bevorzugt zwischen 5 min und 15 min.
Eine Schall- oder Ultraschall-unterstützte Aktivierung der Spüllösung kann erfolgen.
Die Entnahme in Schritt c) kann zum Beispiel mittels eines Spritzensystems erfolgen. Das Spritzensystem umfasst bevorzugt eine stumpfe Endokanüle.
Schritt d) betrifft das bereits oben beschriebene erfindungsgemäße Herstellungsverfahren für ein mit mindestens einem Wachstumsfaktor beladenes Biomaterial mit der Maßgabe, dass die Spüllösung aus Schritt c) verwendet wird.
Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren wurde bereits oben beschrieben. Auf diese Erläuterungen wird Bezug genommen.
Vorteilhafterweise weist das wachstumsfaktorbeladene Biomaterial mindestens einen in Knochen oder Zahnhartgewebe natürlich vorkommenden Wachstumsfaktor auf. Bevorzugt ist der mindestens eine Wachstumsfaktor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF), vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF), Fibroblasten Wachstumsfaktoren (FGF), Plättchen-assoziierten Wachstumsfaktoren (PDGF), Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP), Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF) und Epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF). Innerhalb der Gruppe der Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP) ist der Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktor 2 (BMP-2) besonders bevorzugt. Vorzugsweise enthält das Biomaterial den mindestens einen Wachstumsfaktor in Mengen zwischen 0,0001 ng/ml und 500 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 100 ng/ml, weiter vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml.
Vorzugsweise enthält das Biomaterial ein Wachstumsfaktorgemisch, welches mindestens zwei Wachstumsfaktoren enthält.
Bevorzugt ist von den mindestens zwei Wachstumsfaktoren mindestens ein Wachstumsfaktor ein transformierender Wachstumsfaktor (TGF), besonders bevorzugt ist der transformierende Wachstumsfaktor ein TGF-beta-Wachstumsfaktor (TGF-β), ganz besonders bevorzugt der transformierende Wachstumsfaktor-beta-1 (TGF-β-1). Vorteilhafterweise enthält das beladene Biomaterial mindestens 0,01 ng/ml TGF, vorzugsweise mindestens 0,05 ng/ml TGF, weiter vorzugsweise mindestens 0,1 ng/ml TGF, besonders bevorzugt mindestens 0,3 ng/ml TGF. Vorteilhafterweise enthält das beladene Biomaterial zwischen 0,01 ng/ml und 500 ng/ml, bevorzugt zwischen 0,01 ng/ml und 100 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,1 ng/ml und 50 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,1 ng/ml und 10 ng/ml TGF.
Bevorzugt ist von den mindestens zwei Wachstumsfaktoren mindestens ein Wachstumsfaktor ausgewählt aus der Gruppe der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF) und Fibroblasten Wachstumsfaktoren (FGF), besonders bevorzugt ist der Fibroblasten Wachstumsfaktoren der Fibroblasten Wachstumsfaktor 2 (FGF-2). Vorteilhafterweise enthält das beladene Biomaterial mindestens 0,0001 ng/ml VEGF, vorzugsweise mindestens 0,001 ng/ml VEGF. Vorzugsweise enthält das beladene Biomaterial zwischen 0,0001 ng/ml und 5 ng/ml, weiter vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml VEGF. Vorteilhafterweise enthält das beladene Biomaterial mindestens 0,0001 ng/ml FGF, vorzugsweise mindestens 0,001 ng/ml FGF. Vorzugsweise enthält das beladene Biomaterial zwischen 0,0001 ng/ml und 5 ng/ml, weiter vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml FGF.
Das beladene Biomaterial enthält bevorzugt weitere Wachstumsfaktoren. Diese sind vorzugsweise weitere im Zahnhartgewebe und/oder Knochen vorkommende Wachstumsfaktoren. Diese weiteren Wachstumsfaktoren können bevorzugt ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Plättchen-assoziierten Wachstumsfaktoren (PDGF), Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP), Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF), Epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF). Ein bevorzugter Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren ist der Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktor 2 (BMP-2).
Vorteilhafterweise enthält das beladene Biomaterial zwischen 0,0001 ng/ml und 500 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 100 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, weiter vorzugsweise zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml eines im Zahnhartgewebe und/oder Knochen vorkommenden Wachstumsfaktors. Vorteilhafterweise enthält das beladene Biomaterial zwischen 0,0001 ng/ml und 100 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, weiter vorzugsweise zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml eines Wachstumsfaktors, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend der Plättchen-assoziierten Wachstumsfaktoren (PDGF), Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP), der Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF), der Epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF) und der weiteren in Zahnhartgewebe und Knochen vorkommenden Wachstumsfaktoren.
Vorzugsweise entsprechen die Wachstumsfaktorkomponenten des Wachstumsfaktorgemisches, mit dem das Biomaterial beladen ist, den Wachstumsfaktorkomponenten im Wachstumsfaktorgemisch der Spüllösung aus Schritt c), d.h. das Biomaterial ist mit allen Wachstumsfaktorkomponenten beladen, die sich in der dem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung aus Schritt c) finden.
Das Biomaterial kann flüssig oder fest sein oder in Form eines Gels vorliegen. Es kann sich um jegliches bereits oben im Kontext des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens beschriebene Biomaterial handeln.
Vor dem Einbringen des wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials in einen Wurzelkanal können weitere Verfahrensschritte erfolgen. So können dem Biomaterial bzw. der Suspension oder Lösung des (beladenen) Gerüstmaterials Suspensions- bzw. Lösungsmittel oder weitere Komponenten teilweise oder vollständig entzogen werden. Es können auch weitere Komponenten zugefügt werden. Das Biomaterial kann vor oder nach dem Einbringen in einen Wurzelkanal teilweise oder vollständig gehärtet werden. Bevorzugt wird das Biomaterial im Wurzelkanal gehärtet bzw. härten gelassen. Bevorzugt erfolgt die Härtung mittels Polymerisation.
Die Erfindung erlaubt insbesondere ein verbessertes Verfahren zur Wurzelkanalbehandlung, umfassend die folgenden Schritte:

1. Eröffnung der Pulpakammer, vorzugsweise unter Kofferdam-Abschirmung;
2. Entfernung des (geschädigten) Pulpagewebes, wobei a) eine partielle Entfernung erfolgt, wenn Teile der Pulpa sich noch im reversiblen Entzündungsstadium befinden, oder b) eine vollständige Entfernung bei irreversibler Schädigung oder Pulpanekrose erfolgt;
3. Wurzelkanalaufbereitung, wobei a) bei vorheriger partieller Entfernung des Pulpagewebes (Schritt 2a) eine geringfügige Erweiterung des Wurzelkanals erfolgt, um die Desinfektion zu ermöglichen; b) bei vorheriger vollständiger Entfernung des Pulpagewebes (Schritt 2b) eine Aufweitung des Wurzelkanals erfolgt, wobei die Wurzelspitze (Apex) auf mindestens 0,8 mm erweitert wird, um das Einwachsen von Zellen zur Regeneration und Blutgefäßeinsprossung zu begünstigen;
4. Desinfektion des Wurzelkanalsystems, wobei die Desinfektion beispielsweise mit Chlorhexidin, Natriumhypochlorit erfolgt;
5. Kontaktieren des Dentins mit einer Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe unter Bedingungen, die ein Freisetzten von mindestens einem im Dentin gebundenen Wachstumsfaktor ermöglichen, wobei die Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe mindestens ein Demineralisierungsmittel enthält, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Säuren, Salz- und/oder Chelatbildnern;
6. Entnahme der mit mindestens einem Wachstumsfaktor angereicherten Spüllösung aus dem Körper;
7. Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials, gemäß dem oben beschriebenen in vitro Verfahren der Erfindung unter Verwendung der Spüllösung aus Schritt 6;
8. Einbringen des wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials in den Wurzelkanal.

Falls in Schritt 2 eine vollständige Entfernung des Pulpagewebes erfolgt, ist es vorteilhaft zwischen den Schritten 4 und 5 für einen Zeitraum von 1 bis 2 Wochen eine medikamentöse Einlage in den Wurzelkanal einzubringen. In diesem Fall wird Schritt 4 vor Aufnahme von Schritt 5 wiederholt. Die medikamentöse Einlage kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Calciumhydroxid-Pasten, Antibiotika-Kortikoid-Präparaten und Antibiotikamischungen.
Für das Verfahren zur Wurzelkanalbehandlung geeignete Spüllösungen zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe beziehungsweise geeignete Demineralisierungsmittel wurden bereits im Kontext des erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens bzw. des erfindungsgemäßen Kits beschrieben. Auf diese Erläuterungen wird Bezug genommen. Die dort beschriebenen Spüllösungen zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe können auch im oben beschriebenen Verfahren zur Wurzelkanalbehandlung eingesetzt werden.
Vorteilhafterweise weist die Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe einen pH-Wert von größer 4, vorzugsweise einen pH-Wert von größer 5, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 4 bis 10, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 9, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 6 bis 8, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 6,5 bis 7,5, besonders bevorzugt einen pH-Wert von 7 auf.
Es ist vorteilhaft, wenn die Konzentration des mindestens einen Demineralisierungsmittels in der Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe mindestens 5 Gew.-%, weiter vorzugsweise mindestens 10 Gew.-%, weiter vorzugsweise 10 Gew.-% bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 10 Gew.-% bis 17 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt 17 Gew.-% beträgt.
Vorzugsweise ist mindestens eine Demineralisierungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EDTA (Ethylendiamintetraeesigsäure bzw. Ethylendiamintetraacetat), EGTA (Ethylenglycolbis(aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraessigsäure bzw. Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N’,N’tetraacetat) und Zitronensäure bzw. Citrat. Bei einem bevorzugten Verfahren zur Wurzelkanalbehandlung enthält die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe als Demineralisierungsmittel EDTA (Ethylendiamintetraacetat). Vorteilhafterweise handelt es sich bei der Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe um eine wässrige EDTA-Lösung. Vorzugsweise beträgt die Konzentration von EDTA in der Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe mindestens 5 Gew.-%, weiter vorzugsweise mindestens 10 Gew.-%, weiter vorzugsweise 10 Gew.-% bis 17 Gew,-%, weiter vorzugsweise mindestens 15 Gew.-%, besonders bevorzugt 17 Gew.-%. Eine im Rahmen des Verfahrens besonders bevorzugte Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe ist eine 10%-ige (w/w) bis 17%-ige (w/w) wässrige EDTA-Lösung mit einem pH-Wert von 7.
Das Kontaktieren des Dentins mit der Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe in Schritt 5 kann beispielsweise unter Verwendung eines Spritzensystems erfolgen. Das Spritzensystem umfasst bevorzugt eine Luer-Lock-Spritze und/oder eine stumpfe Endokanüle. Vorteilhafterweise beträgt die Einwirkzeit der Spüllösung auf das Dentin in Schritt 5 zwischen 0,1 min und 30 min, vorzugsweise zwischen 1 min und 30 min, weiter vorzugsweise zwischen 1 min und 20 min, weiter vorzugsweise zwischen 2 min und 15 min, besonders bevorzugt zwischen 5 min und 20 min, ganz besonders bevorzugt zwischen 5 min und 15 min.
Die Entnahme in Schritt 6) kann zum Beispiel mittels eines Spritzensystems erfolgen. Das Spritzensystem umfasst bevorzugt Luer-Lock-Spritze und/oder eine stumpfe Endokanüle.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Schritten kann in Anschluss an Schritt 8, das Biomaterial mit einem geeigneten Material, wie beispielsweise MTA (Mineral-Trioxid-Aggregat) abgedeckt werden, und der Wurzelkanal durch Legen einer herkömmlichen Füllung bakteriendicht verschlossen werden. Eine erste Nachkontrolle kann beispielsweise zwei Wochen nach der Applikation erfolgen.
Nachfolgend werden beispielhafte Ausführungsformen der Erfindung anhand der Beispiele und Abbildungen beschrieben.
Es zeigen:
1: Daten zur Freisetzung des Wachstumsfaktors TGFβ1 aus Dentin in Abhängigkeit vom pH-Wert der Spüllösung,
2: Daten zur Freisetzung des Wachstumsfaktors TGFβ1 aus Dentin in Abhängigkeit der Art der Vorbehandlung,
3: Daten zur Freisetzung des Wachstumsfaktors VEGF aus Dentin in Abhängigkeit der Art der Vorbehandlung,
4: Zellvitalität dentaler Pulpastammzellen in einem Biomaterial,
5: Freisetzung der Wachstumsfaktoren aus einem Biomaterial
6: Zellzahlen dentaler Pulpastammzellen in wachstumsfaktorbeladenem Biomaterial
7: Gewebebildung in Dentinzylindern nach Transplantation dentaler Pulpastammzellen.
Beispiele
Nachfolgend werden die Beispiele beschrieben.
Beispiel 1
Wachstumsfaktorfreisetzung mit verschiedenen Spüllösungen
Hierzu wurden aus extrahierten Zähnen mittels einer Innenlochsäge Dentinscheiben der Dicke 200 µm und des Durchmessers 8 mm hergestellt und bis zum Versuchsbeginn in 10%iger Chloramin-Lösung gelagert. Die Scheiben wurden mit phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (1xPBS, pH 7) gewaschen und jede Scheibe wurde in das Well einer 48-Well-Platte eingelegt. Daraufhin wurde jede Scheibe mit 100 µl einer Spüllösung bedeckt (wässrige EDTA Lösung 10%, pH 6 oder pH7; hergestellt mit EDTA disodium salt dihydrate, Applichem Nr. A3234) oder Zitronensäure 10%, pH 3, 5 oder 7; hergestellt mit Citric acid monohydrate, Merck Nr. 1.00244.0500)), welche für jeweils 5, 10 oder 20 min einwirken konnte. Für jede Versuchsbedingung wurde mit Triplikaten gearbeitet. Die Spüllösung wurde nach der jeweiligen Einwirkdauer abgenommen und als Probe in ein ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)-Kit pipettiert (Human TGF-beta 1 Quantikine ELISA Kit, R&D Systems, Nr. DB100B). Anhand der im Kit enthaltenen Standards wurde die Menge an Wachstumsfaktor in den jeweiligen Proben berechnet.
Die Ergebnisse sind in 1 wiedergegeben. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen (n = 6).
Der Versuch zeigt eine zeitabhängige Wachstumsfaktorfreisetzung, die größte Menge an TGFß1 wurde nach 20 minütiger Einwirkzeit von EDTA bei pH 7 erzielt.
Beispiel 2
Freisetzung von TGFß1 nach kombinierter Anwendung verschiedener Spüllösungen
Eine wässrige EDTA-Spüllösung (10%, pH 7) wurde anlog dem Vorgehen im Beispiel 1 mit Dentin in Kontakt gebracht. 2 vergleicht die Konzentration von TGFβ1 in der Spüllösung nach einer Einwirkzeit der Spüllösung auf das Dentin von jeweils 5 min, 10 min und 20 min für den Fall, dass das Dentin vor der Anwendung der EDTA-haltigen Lösung zum Spülen von Hartgewebe analog zum Vorgehen in Beispiel 1 mit Natriumhypochlorit (NaOCl, 5,25%) oder Chlorhexidin (CHX) (Chlorhexidin-digluconat, 0,12%) jeweils 5 min oder 10 min vorbehandelt wurde oder die EDTA-haltige Lösung zum Spülen von Hartgewebe ohne Vorbehandlung des Dentins mit Chlorhexidin oder Natriumhypochlorit angewendet wurde. In 2 sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus 2 unabhängigen Versuchen (n = 6) dargestellt.
Die Daten in 2 belegen, dass bei der Anwendung der EDTA-haltigen Spüllösung TGFß1 aus dem Dentin freigesetzt wird. Es zeigt sich ein zeitabhängiger Effekt, wobei bei längerer Einwirkdauer von EDTA mehr TGFß1 freigesetzt wird. Wird desinfizierendes Chlorhexidin vor EDTA verwendet, ist dieser Effekt bei einer Einwirkdauer des Chlorhexidins von 5 min etwas gesteigert. Spülung mit Natriumhypochlorit vor der EDTA-Anwendung reduziert die Wachstumsfaktorfreisetzung.
Beispiel 3
Freisetzung von VEGF nach kombinierter Anwendung verschiedener Spüllösungen.
Hierzu wurde ein Versuch durchgeführt, dessen Aufbau analog zu dem in Beispiel 2 beschriebenen Versuch erfolgte. Die Ergebnisse sind in 3 wiedergegeben. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus 2 unabhängigen Versuchen (n = 6). 3 zeigt, bei vorheriger Anwendung von Chlorhexidin höhere Wachstumsfaktorkonzentrationen als bei NaOCl.
Beispiel 4
Aufbereitung der Spüllösung
0,5 ml einer 0,1 M der EDTA-Spüllösung wurde 5 min mit 3,3 mg Anionentauscher (DEAE-Sepharose, Sigma-Aldrich DCL6B100, Lot 041M1427, Trockenmasse)) verrührt und der Anionentauscher anschließend abfiltriert. Der Restgehalt EDTA in der Spüllösung betrug 31,5 % der eingesetzten Spüllösung, bestimmt mittels HPLC (Waters 2695 Separations Module und Waters 2998 Photodiode Array Detector mit HPLC-Säule Nucleodur Sphinx RP 5 µm (CC250/4)).
Beispiel 5
Eine EDTA-Spüllösung nach Beispiel 1 wurde mit Eisen(III)chlorid versetzt und mit UV-Licht bei 254 nm (Netzhandlampe UVA/C (Nr. 862 506); Dr. Göbel UV-Elektronik GmbH) bestrahlt. Der Restgehalt EDTA in der Spüllösung betrug weniger als 5 % der eingesetzten Spüllösung, bestimmt mittels HPLC (Waters 2695 Separations Module und Waters 2998 Photodiode Array Detector mit HPLC-Säule Nucleodur Sphinx RP 5 µm (CC250/4)).
Beispiel 6
Herstellung des mit Wachstumsfaktoren beladenen Biomaterials
Als Ausgangskomponente A liegt eine Lösung eines Teil selbstorganisierender Peptide (Sequenzen 1) in einem dafür vorgesehenen, mehrkammerigen Spritzensystem vor. Ausgangskomponente B stellt eine wässrige Lösung von Heparin (4 mg/mL, Heparin Sodium Salt, Akron Nr. AK3004) in phosphat-gepufferter Kochsalzlösung) in 1xPBS, pH = 7) dar, welche in einer davon getrennten Kammer im Spritzensystem gelagert ist. Währende des klinischen Behandlungsganges wird nun das Dentin im Wurzelkanal mittels EDTA-Spüllösung konditioniert. Nach 10minütiger Einwirkdauer wird die Spüllösung dem Wurzelkanal entnommen, das EDTA wird mittels in Beispiel 4 und/oder 5 beschriebener Methoden aus der Lösung entfernt, diese wird mit der Heparin/PBS-Lösung gemischt. Dabei werden die sich in Lösung befindlichen Wachstumsfaktoren durch das Heparin gebunden und stabilisiert. Nun wird diese Lösung mit dem zweiten Teil der selbstorganisierenden Peptide (Pendant-Sequenzen) und mit der Ausgangskomponente A vermischt und in den Wurzelkanal injiziert. Innerhalb von 3–5 Minuten tritt die Gelbildung ein, welche in diesem Material durch elektrostatische Wechselwirkung zwischen den beiden Peptidsequenzen induziert wird.
Beispiel 7
Hier wurde die EDTA-Spüllösung nicht in das Biomaterial eingemischt. Es wurde versucht, verbliebene Wachstumsfaktoren mittels Nachspülen mit PBS-Lösung (pH = 7) aufzunehmen und anschließend in ein Biomaterial einzubringen. Hierzu wurde eine EDTA-Spüllösung nach der entsprechender Einwirkdauer aus dem Wurzelkanal entnommen und verworfen. Im Folgenden wurde die PBS-Lösung, eine phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (1xPBS, pH 7) in den Kanal eingebracht, auf- und abpipettiert und schließlich dem Kanal entnommen. Dieser Lösung wurde Heparin zugegeben und anschließend mit dem pulverförmigen Gerüstmaterial vermischt.
Beispiel 8
Freisetzung von Wachstumsfaktoren aus Hydrogelen mit und ohne Heparin
Hierzu wurden Gele aus selbstorganisierenden Peptiden hergestellt (Galler KM et al. (2011), Dentin Conditioning Codetermines Cell Fate in Regenerative Endodontics, J Endod 37(11):1536–1541; Galler KM et al. (2010), Self-Assembling Multidomain Peptide Hydrogels: Designed Susceptibility to Enzymatic Cleavage Allows Enhanced Cell Migration and Spreadin, J Am Chem Soc 132, 3217–3223; Galler KM et al. (2008), Self-Assembling Peptide Amphiphile Nanofibers as a Scaffold for Dental Stem Cells, Tissue Eng Part A 12:2051-8).
Eine Stammlösung von Peptid in 1xPBS von 2 Gew.-% wurde angesetzt. Der jeweilige Wachstumsfaktor wurde in einer Heparin/PBS-Lösung gelöst. Nun wurden beide Komponenten vermischt und Wells einer 96-Well-Platte pipettiert, durch das Mischen wird die Gelbildung induziert. Das Volumen pro Gel betrug 100 µL, die Endkonzentration an Peptid 1 Gew%, an Heparin 1 mg/mL, und an Wachstumsfaktor 100 ng pro Gel. Als Kontrollen wurden Gele ohne Heparin hergestellt, und die Proben in Triplikaten angesetzt. Jedes Gel wurde nun mit 100 µL 1xPBS mit 1% BSA (bovines Serum-Albumin) überschichtet. Zu verschiedenen Zeitpunkten (Tag 1, 2, 3, 5 und 7) wurde der Überstand entnommen, bei –80°C eingefroren, und im Well durch neue PBS/BSA-Lösung ersetzt. Nach Abschluss einer Woche wurde die Proben aufgetaut, und die Menge an Wachstumsfaktor im Überstand wurde mittels ELISA quantifiziert.
Die Daten zeigen die Freisetzung der Wachstumsfaktoren TGFβ 1, FGF-2 und VEGF in Peptid-basierten Hydrogelen mit und ohne Heparin, die Freisetzungsprofile sind in dargestellt. Dargestellt sind Mittelwerte (n = 3). Ist Heparin im Gel vorhanden, erfolgt die Freisetzung der Wachstumsfaktoren verzögert.
Des Weiteren konnte deren Bioaktivität auch nach Einbindung und nachfolgender Freisetzung bestätigt werden, was in Zellkulturversuchen, welche in 6 dargestellt sind, getestet wurde. In 6 sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus 2 unabhängigen Versuchen (n = 6) dargestellt. Das Zeichen „*“ in der Abbildung kennzeichnet signifikante Unterschiede zur Kontrolle, p < 0,05.
Hierzu werden dentale Pulpastammzellen im Monolayer in 24-Well-Platten gesät, die Zelldichte betrug 2,5 × 10³ Zellen pro Well. Die Zellen blieben für 24 Stunden unbehandelt, in diesem Zeitraum erfolgte die Zelladhäsion. Daraufhin wurde in jedes Well ein Insert gesetzt, in welchem sich ein mit Heparin und Wachstumsfaktor angereichertes Peptidhydrogel befand. Das Volumen pro Gel im Insert betrug 25 µL, die Menge an Wachstumsfaktor für TGFß1 betrug 25 ng, für FGF-2 100ng. Die Gele in den Inserts wurden mit Zellkulturmedium überschichtet, wodurch eine kontinuierliche Abgabe von Wachstumsfaktor ins Medium über den Versuchszeitraum von 14 Tagen ermöglicht wurde. In Kontrollgruppen wurden keine Gele in Inserts verwendet, sondern die Wachstumsfaktoren wurden dem Zellkulturmedium zugefügt, welches jeden 2. Tag gewechselt wurde, wodurch eine erneute Zufuhr an Wachstumsfaktor erfolgte. Es wurden somit 3 Versuchsgruppen (1: Zellen und Gele in Inserts ohne Wachstumsfaktor, 2: Gele in Inserts mit 25ng TGFß1 und 3: Gele in Inserts mit 100 ng FGF-2) gebildet. Demgegenüber standen 3 Kontrollgruppen (1: Zellen ohne Gele, normales Zellkulturmedium, 2: Zellen ohne Gele, Zellkulturmedium mit 2,5 ng TGFß1, 3: Zellen ohne Gele, Zellkulturmedium mit 10 ng FGF-2). Die Zellmorphologie wurde nach 3 und 14 Tagen photographisch dokumentiert. Das Zellwachstum wurde nach 3, 7 und 14 Tagen durch Auszählen in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Zellmorphologie und -proliferation veränderten sich in Versuchs- und Kontrollgruppen durch Wachstumsfaktorzugabe. TGFß-1 behandelte Zellen zeigten eine Vergrößerung der Zellkörper sowie Clusterbildung nach 14 Tagen, während die Proliferation verlangsamt war. FGF-2 induzierte hingegen einen spindelförmigen Zelltyp mit erhöhter Proliferationsrate. Der beschriebene Versuch belegt, dass TGFß1 als auch FGF-2 nach Einbindung und nachfolgender Freisetzung aus Hydrogelen ihre Bioaktivität beibehalten.
Beispiel 9: Applikation des Biomaterials in den Wurzelkanal
Mit Wachstumsfaktoren beladenes Biomaterial wird mittels eines Spritzensystems in den Wurzelkanal eingebracht. Das Gel im Wurzelkanal dient als Leitschiene zur Regeneration, es sollen durch die rückgeführten Wachstumsfaktoren Zellen angelockt und im Gel zur Proliferation, Differenzierung und Gewebebildung gebracht werden. Des Weiteren bleiben auch an der Dentinoberfläche nach EDTA-Vorbehandlung Wachstumsfaktoren exponiert.
Hierzu wurden Versuche mit den Wurzelkanal imitierenden Dentinzylindern durchgeführt. In den Hohlraum der Zylinder wurde ein Gemisch aus Trägermaterial und dentalen Pulpastammzellen eingebracht. Die Zylinder wurden für 4 Wochen bei immundefizienten Mäusen transplantiert und nach Explantation histologisch untersucht. Die Aufnahmen zeigen, dass sich im Dentinzylinder ein pulpaähnliches, vaskularisiertes Weichgewebe bildet. An der Grenzschicht zum vorbehandelten Dentin zeigen sich differenzierte Zellen. Im Gegensatz dazu sind bei alleiniger Vorbehandlung mit Natriumhypochlorit Resorptionsvorgänge am Dentin erkennbar. Die Daten sind in 7 dargestellt. 7 zeigt die Gewebebildung in Dentinzylindern nach Transplantation dentaler Pulpastammzellen. Natriumhypochlorit-behandeltes Dentin ist in der linken Spalte dargestellt. EDTA-behandeltes Dentin ist in der rechten Spalte dargestellt. Abbildungen (C) und (D) sind Darstellungen nach HE-Färbung. Abbildungen (E) und (F) sind Darstellungen nach Masson’s Trichrom-Färbung. Mittig im Zylinder ist Gewebebildung erkennbar (A, B). NaOCl-Vorbehandlung bedingt Resorptionsvorgänge und Abbau des Dentins an der Grenzschicht zu den Zellen (C). EDTA-vorbehandeltes Dentin erlaubt eine enge Anlagerung der Zellen ans Dentin (D). Abbildung (E) zeigt eine deutlich erkennbare Resorption des Dentins. Abbildung (F) zeigt, dass die dem Dentin anliegenden Zellen differenzieren und Zellfortsätze in die Dentintubuli strecken, analog der physiologischerweise vorliegenden Situation im Dentin.
Beispiel 10: Zellvitalität in Kollagen
Die Daten in 4 zeigen steigende Zellvitalität durch zunehmende Zellzahlen von humanen dentalen Pulpastammzellen in dreidimensionalen Kollagen-Gelen über einen Versuchszeitraum von 14 Tagen. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus 2 unabhängigen Versuchen (n = 6).
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.
Zitierte Nicht-Patentliteratur

Galler K. M. et al.(2011), Scaffolds for Dental Pulp Tissue Engineering, Adv Dent Res 23(3):333–339 [0008]
Galler KM et al. (2011), Dentin Conditioning Codetermines Cell Fate in Regenerative Endodontics, J Endod 37(11):1536–1541 [0110]
Galler KM et al. (2010), Self-Assembling Multidomain Peptide Hydrogels: Designed Susceptibility to Enzymatic Cleavage Allows Enhanced Cell Migration and Spreadin, J Am Chem Soc 132, 3217–3223 [0110]
Galler KM et al. (2008), Self-Assembling Peptide Amphiphile Nanofibers as a Scaffold for Dental Stem Cells, Tissue Eng Part A 12:2051-8 [0110]

Claims

Ein in vitro Verfahren zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen, zur Verwendung bei der Geweberegeneration geeigneten Biomaterials, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen einer einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung für Hartgewebe, wobei die Spüllösung mindestens ein Demineralisierungsmittel für Hartgewebe und ein durch Kontakt der Spüllösung mit dem Hartgewebe aus dem Hartgewebe gewonnenes Wachstumsfaktorgemisch enthält; b) Bereitstellen von Gerüstmaterial; c) Beladen des Gerüstmaterials mit mindestens einem Wachstumsfaktor durch Inkontaktbringen der Spüllösung mit dem Gerüstmaterial.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gerüstmaterial in Schritt c) mit einem Wachstumsfaktorgemisch beladen wird, wobei dessen Wachstumsfaktorkomponenten vorzugsweise den Wachstumsfaktorkomponenten im Wachstumsfaktorgemisch der Spüllösung entsprechen und/oder dass in Schritt c) das Beladen des Gerüstmaterials durch Mischen der Spüllösung mit dem Gerüstmaterial erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Spüllösung vor dem Beladen des Gerüstmaterials zur Verwendung mit dem Gerüstmaterial aufbereitet wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufbereitung die Sterilisation der Spüllösung und/oder die Inaktivierung von Toxinen in der Spüllösung und/oder die Entfernung von Toxinen aus der Spüllösung und/oder die Zugabe von einem oder mehreren Hilfsstoffen zu der Spüllösung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufbereitung der Spüllösung die Zugabe von mindestens einer pharmazeutisch wirksamen Substanz und/oder die Zugabe von mindestens einem Vermittler, welcher die Bindung mindestens eines Wachstumsfaktors an das Gerüstmaterial bewirkt oder unterstützt, umfasst; wobei die pharmazeutisch wirksame Substanz vorzugsweise ein Antibiotikum ist und/oder wobei der Vermittler vorzugsweise Heparin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, i) dass das bereitgestellte Gerüstmaterial ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus synthetischen Polymeren, natürlichen Biomaterialien und Kombinationen der Vorgenannten; wobei das bereitgestellte Gerüstmaterial vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus selbstorganisierenden Peptiden (SAP), Polyethern, Polymilchsäure, Polyglykolsäure (PGA), Copolymeren von Polymilchsäure mit Polyethern (PLGA), Poly-ε-Caprolacton (PCL), Polyurethanen, Kollagen, Fibrin, Polysacchariden und Kombinationen der Vorgenannten; wobei das bereitgestellte Gerüstmaterial besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus selbstorganisierenden Peptiden (SAP), Kollagen, Fibrin und Kombinationen der Vorgenannten; und/oder j) dass das mindestens eine Demineralisierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Säuren, Salzbildnern und Chelatbildnern; wobei das mindestens eine Demineralisierungsmittel vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EDTA (Ethylendiamintetraeesigsäure bzw. Ethylendiamintetraacetat), EGTA (Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraessigsäure bzw. Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N’,N’tetraacetat) und Zitronensäure bzw. Citrat.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Demineralisierungsmittel EDTA ist und dass die Aufbereitung der Spüllösung den Abbau von EDTA und/oder die teilweise oder vollständige Entfernung von EDTA und/oder dessen Abbauprodukten aus der Spüllösung umfasst; wobei der Abbau von EDTA und/oder die teilweise oder vollständige Entfernung von EDTA und/oder dessen Abbauprodukten aus der Spüllösung vorzugsweise zu Beginn der Aufbereitung erfolgt bevor weitere Aufbereitungsschritte durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Spüllösung einen pH-Wert von größer 4, vorzugsweise einen pH-Wert von größer 5, aufweist und/oder dass es sich bei dem Hartgewebe um Zahnhartgewebe handelt.
Kit zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials zur Verwendung bei der Geweberegeneration, umfassend a) Gerüstmaterial und b) eine Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe, die mindestens ein Demineralisierungsmittel für Hartgewebe enthält.
Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Demineralisierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Säuren, Salzbildnern und Chelatbildnern; wobei das mindestens eine Demineralisierungsmittel bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EDTA (Ethylendiamintetraeesigsäure bzw. Ethylendiamintetraacetat), EGTA (Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraessigsäure bzw. Ethylenglycol-bis(aminoethylether)-N,N,N’,N’tetraacetat) und Zitronensäure bzw. Citrat.
Kit nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, i) dass die Konzentration des mindestens einen Demineralisierungsmittels in der Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe mindestens 5 Gew.-%, weiter vorzugsweise mindestens 10 Gew.-%, weiter vorzugsweise 10 Gew.-% bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 10 Gew.-% bis 17 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt 17 Gew.-% beträgt und/oder j) dass die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe einen pH-Wert von größer 4, vorzugsweise einen pH-Wert von größer 5, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 4 bis 10, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 9, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 8, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 6,5 bis 7,5, besonders bevorzugt einen pH-Wert von 7 aufweist.
Kit nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, a) dass das mindestens eine Demineralisierungsmittel Zitronensäure bzw. Citrat ist und die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe einen pH-Wert von größer 4, vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 7, weiter vorzugsweise von 4,5 bis 6,5 aufweist oder b) dass das mindestens eine Demineralisierungsmittel EDTA ist und die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe einen pH-Wert von mindestens 6, vorzugsweise einen pH-Wert von mindestens 7, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 7 bis 9 aufweist.
Kit nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Gerüstmaterial ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus synthetischen Polymeren, natürlichen Biomaterialien und Kombinationen der Vorgenannten; wobei das Gerüstmaterial bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus selbstorganisierenden Peptiden (SAP), Polyethern, Polymilchsäure, Polyglykolsäure (PGA), Copolymeren von Polymilchsäure mit Polyethern (PLGA), Poly-ε-Caprolacton (PCL), Polyurethanen, Kollagen, Fibrin, Polysacchariden und Kombinationen der Vorgenannten; wobei das Gerüstmaterial besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus selbstorganisierenden Peptiden (SAP), Kollagen, Fibrin und Kombinationen der Vorgenannten.
Kit nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Gerüstmaterial aufweist: i. adhäsive Gruppen, an die Vermittler für Wachstumsfaktoren und/oder Wachstumsfaktoren reversibel gebunden werden können und/oder ii. im Körper abbaubare Gruppen, wobei die Gruppen gemäß den Merkmalen i) und/oder ii) vorzugsweise Aminosäuresequenzen sind.
Kit nach einem der Ansprüche 9 bis 14, ferner umfassend mindestens eine Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mitteln zur Entfernung von EDTA aus einer Lösung, Vermittlern, welche die Bindung mindestens eines Wachstumsfaktors an das Gerüstmaterial bewirken oder unterstützen, einer UV-Lampe und einer Vorrichtung zur Applikation der Spüllösung; wobei die Mittel zur Entfernung von EDTA aus einer Lösung bevorzugt Eisen(III)-Salze und/oder Anionentauscherharze umfassen; wobei ein bevorzugter Vermittler Heparin ist; wobei die Vorrichtung zur Applikation der Spüllösung vorzugsweise eine Spritze und eine Kanüle, besonders bevorzugt eine stumpfe Endo-Kanüle umfasst.