WO2014139809A1 - Verfahren und kit zur herstellung von biomaterial zur geweberegeneration - Google Patents

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WO2014139809A1
WO2014139809A1 PCT/EP2014/054005 EP2014054005W WO2014139809A1 WO 2014139809 A1 WO2014139809 A1 WO 2014139809A1 EP 2014054005 W EP2014054005 W EP 2014054005W WO 2014139809 A1 WO2014139809 A1 WO 2014139809A1
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rinsing solution
rinsing
edta
solution
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Kerstin GALLER
Gottfried SCHMALZ
Andreas SCHÖNEBAUM
Hardy SCHWEIGEL
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Mühlbauer Technology Gmbh
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    • A61L2430/12—Materials or treatment for tissue regeneration for dental implants or prostheses

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing a growth factor-loaded biomaterial suitable for use in tissue regeneration, and to a kit for producing a growth factor-loaded biomaterial for use in tissue regeneration.
  • the invention is in the field of medical tissue regeneration, in particular in dentistry or bone healing.
  • the tooth pulp is enveloped by a hard tooth mantle (enamel, dentin and cementum of the tooth crown and root). Damage to the hard tissue jacket may result in the ingress of bacteria and inflammation of the pulp tissue.
  • This makes advanced Stadi ⁇ to usually a root canal treatment is required.
  • the pulp tissue is completely removed, whereupon the root canal system is disinfected and sealed with bioinertem synthetic filling material.
  • the cleaning and / or disinfection of the root canal system usually takes place by means of aqueous rinsing solutions.
  • alternating rinses are carried out with sodium hypochlorite and chlorhexidine solution.
  • the rinse solutions may also contain chlorophenol-camphor-menthol, hydrogen peroxide, iodine-potassium iodide, calcium hydroxide, MTAD (a mixture of racyclin, an acid and a surfactant), citric acid or EDTA.
  • the rinsing solutions are discarded after use.
  • a disadvantage of this root canal treatment is that possibly not irreversibly damaged pulp tissue is completely removed, whereby the pulp function is not maintained.
  • the invention is based on the object to provide simple and relatively inexpensive measures or means for dental or bone healing, which support a tissue regeneration, such as a regeneration of the pulp tissue.
  • a tissue regeneration such as a regeneration of the pulp tissue.
  • the invention has recognized that in hard tissues such as dentin or bone bioactive growth factors are incorporated, which can be solved or released by the treatment with suitable rinsing solutions. This allows that kör ⁇ pereigene growth factors can be incorporated into a biomaterial and used for tissue regeneration.
  • the invention is an in-vitro method for producing a growth factor-loaded, for use tissue regeneration suitable biomaterial, comprising the following steps:
  • biomaterial refers to biocompatible materials or compositions which can be physiologically tolerated and introduced for long-term retention in an animal or human body, in particular a mammalian body.
  • the growth factor-loaded biomaterial contains a framework and growth factors as well as possibly other substances.
  • a Ge ⁇ rüstmaterial (engl. Scaffold) forms a three-dimensional porous structure.
  • the scaffold material serves both as a carrier for growth factors, and possibly other sub punch ⁇ and secondly tion as a scaffold for Geweberegenera-.
  • Frameworks for tissue regeneration are known in the art. In the context of the invention, all known natural or synthetic frameworks for tissue regeneration or combinations of these materials may be used. used. Suitable scaffold materials for the regeneration of tissue are described in Galler KM et al. (2011), Scaffolds for Dental Pulp Tlssue Engineering, Adv Dent Res 23 (3): 333-339.
  • the framework material prepared in the context of the method according to the invention can advantageously be selected from the group consisting of synthetic polymers, natural biomaterials, in particular biopolymers and combinations of the abovementioned.
  • the framework material is selected from the group consisting of self-assembling peptides (SAP), polyethers, polylactic acid, polyglycolic acid (PGA), copolymers of polylactic acid with polyethers (PLGA), poly-s-caprolactone (PCL), polyurethanes, collagen , Fibrin, polysaccharides and combinations of the foregoing.
  • the Ge ⁇ rüstmaterial is selected from the group consisting of self-assembling peptides (SAPs), collagen, fibrin, and combinations of the foregoing.
  • self-assembling peptides are very particularly preferred as the framework.
  • the growth factor-loaded biomaterial is preferably implantable and / or injectable into a root canal.
  • the biomaterial may be liquid or solid or in the form of a gel.
  • flowable or biomaterials which can be used by means of a syringe are particularly preferred. These can be injected into a root canal who ⁇ .
  • the biomaterial can preferably be applied by cannulas having an inner diameter of less than 2 mm, more preferably less than 1 mm. Preference is furthermore given to a curable, preferably polymerizable, biomaterial which, after introduction into a lesion, for example a root canal, nal, hardens or can be made to harden.
  • the biomaterial can harden into a gel in the root canal or is present as a gel.
  • the biomaterial can be cured to a gel having a final strength of between 200 and 10000 Pa [G '].
  • This self ⁇ properties of the biomaterial can be achieved by choosing a ge ⁇ suitable framework.
  • the framework material is preferably implantable in a root canal
  • the framework material can preferably be applied by cannulas having an inner diameter of less than 2 mm, more preferably less than 1 mm. Preference is further given a härtba ⁇ res, preferably polymerizable scaffold material that after introduction into a lesion, such as a root canal cures or can be brought to hardening.
  • a framework material initially consists of precursors for the cured framework material, in particular monomers, oligomers and polymers.
  • the framework material can carry polymerizable or crosslinking groups and be cured via these, wherein the polymerizable or crosslinking groups are not limited to reactive double bonds.
  • the polymerization or cross-linking is preferably carried out by electrostatic interactions, in ⁇ play, in self-assembling peptides, or via covalent bonds. It is particularly advantageous if the framework material in the root canal can harden to a gel or is present as a gel.
  • the framework material can be made into a gel having a final strength of between 200 and 200 Cure 10000 Pa [G '].
  • the Ge ⁇ rüstmaterial comprises at least two components and is curable self-curing (by mixing and reaction of at least two of the encompassed by the framework material components), preferably assumes a gel state.
  • hydrogels at ⁇ play as self-assembling peptides or polyether.
  • Advantageous polyethers are polyethylene glycols (PEGs).
  • PEGs polyethylene glycols
  • the polyethers can carry polymerizable or crosslinking groups and cured over them.
  • the framework is advantageously in the body depleting ⁇ bar.
  • the degradation of the framework material can be controlled.
  • the degradation is controlled by the cell. This has the advantage that degradation takes place proportio ⁇ nal to Gewebenu Struktur.
  • the framework material is cell adhesive.
  • the framework material has adhesive groups to which mediator molecules for growth factors and / or growth factors can preferably be reversibly bound.
  • the mediator molecules preferably serve to stabilize and bind the growth factors.
  • the framework material has degradable groups in the body.
  • groups are by proteinase, e.g. By MMP-2, degradable groups.
  • the adhesive and / or body degradable groups are preferably suitable amino acid sequences.
  • Growth factors are proteins that promote cell proliferation and differentiation.
  • both dentin as well as bone growth are tums tileen incorporated into hard tissue, the bioactive lead ⁇ ben or can be activated.
  • the invention has recognized that both hard tissues can thus serve as a reservoir for these growth factors.
  • a rinse solution for rinsing of hard tissue is a solution which is provided with human or animal hard tissue, to be brought into contact, for example in the bone or in the tooth, and is capable of releasing ge ⁇ Thematic growth factors in the hard tissue.
  • the release can be achieved by demineralization of the hard tissue or its surface layer, for example by pressure-driven ⁇ loading and / or calcium complexation, but preferably carried out by calcium complexation, thus bound in the hard tissue growth factors are exposed.
  • the growth factors can also be brought into solution.
  • Scope of the invention preferred hard tissue is Zahnhartge ⁇ tissue, particularly dentin. While the dentin at the time of tooth development various growth factors are formed by dentin horrenden cells which are embedded in the dentin matrix and there bioactive lead ⁇ ben or be bioactivated by the inventive method. It is a mixture of growth factors ⁇ .
  • the rinse solution for rinsing hard tissue contains at least one demineralizer.
  • demineralizer Within the scope of the invention be ⁇ the term Demineralmaschinesstoff draws a means which is adapted in hard tissue, such. B. in dentin or bone, released growth factors bound.
  • the demineralization agent should not lead to a de ⁇ naturtechnik the growth factors.
  • the at least one preferential Demineralmaschinesstoff is selected from the group consisting of acids, salt ⁇ agents and chelating agents.
  • An advantageous salt former is z.
  • Other suitable formers of (sparingly soluble) calcium salts may also be used.
  • a beneficial acid is citric acid.
  • Chelating agents are preferred demineralizing agents in the invention.
  • Advantageous chelating agents are selected from the group consisting of EDTA (ethylene diamintetraeesigklare or salts thereof, preferably Alkalime ⁇ metal compounds, especially of sodium), EGTA (ethyl englycol-bis (aminoethyl ether) - ⁇ , ⁇ , ⁇ ', ⁇ ' - tetraacetic acid or its acetates, preferably alkali metal salts, especially of sodium.) and citric acid or citrates, before ⁇ Trains t alkali metal citrates, in particular of sodium. It is advantageous if the rinse solution for rinsing hard tissue has a pH of greater than 4, preferably a pH of greater than 5.
  • the rinsing ⁇ solution for washing hard tissue may have a pH value of from 4 to 10, more preferably a pH of 5 to 9, more preferably a pH of 5 to 8, more preferably pH of 6, 5 to 7.5, more preferably have a pH of 7. It should be noted here that when using acids, a pH of> 6 of the rinse solution for rinsing hard tissue is only preferred if the acid is simultaneously a good calcium salt former or calcium chelating agent. To adjust the pH of the rinse solution may contain suitable buffer systems, crizspielswei ⁇ se phosphate buffer (NaH 2 P0 4 / Na2HP04).
  • the concentration of the at least one demineralizing agent in the rinse solution for rinsing hard tissue at least 5 wt .-%, more preferably at least 10 wt .-%, more preferably 10 wt .-% to 20 wt. %, more preferred
  • the rinsing solution for rinsing hard tissue as a chelating agent contains EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid or ethylenediamine tetraacetate).
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid or ethylenediamine tetraacetate
  • it is at the Spüllö ⁇ solution for washing hard tissue is an aqueous EDTA solution.
  • EDTA solutions are used in endodontics, where they are used, for example, to remove a
  • the manufacturing process of the invention provides for the Be ⁇ riding position of a sample taken an animal or human body rinse solution for hard tissue.
  • This is a rinsing solution which, over a certain period of time, is treated with animal or human hard tissue, eg. As bone or tooth hard tissue was in contact.
  • the rinsing solution contains at least one Demineraltechnischsstoff for Hartge's ⁇ weave and a product obtained by contact of the rinse solution with the hard tissue from the hard tissue growth factor mixture.
  • the at least one of the extracted Demineralmaschinesstoff in an animal or human body washing solution is an above-described Deminera ⁇ lmaschinesstoff. It may advantageously be selected from the group consisting of acids, salt formers and chelating agents.
  • the at least one Deminera ⁇ l Deutschensstoff is preferably selected from the group consisting of EDTA (Ethylendiamintetraeesigklare or ethylenediaminetetraacetate), EGTA (ethylene glycol bis (aminoethyl ether) -N, ⁇ ', N' tetraacetic acid and ethyl englycol bis (aminoethyl ether) - ⁇ , ⁇ , ⁇ ', N'tetraacetat) and citric acid or citrate.
  • Particularly preferred Deminerali ⁇ stechniksstoff are citric acid and citrate, and EDTA.
  • the growth factor mixture in the rinsing solution taken from an animal or human body generally contains all the growth factors occurring in the hard tissue, the ratio of the growth factors to one another in the tissue Rinse solution corresponds to the natural ratio of growth factors in the hard tissue.
  • the rinsing solution taken from an animal or human body has growth factors whose concentration in the rinsing solution is particularly preferably between 0.0001 ng / ml and 1000 ng / ml, preferably between 0.0001 ng / ml and 100 ng / ml between 0.0001 ng / ml and 50 ng / ml, most preferably between 0.001 ng / ml and 10 ng / ml.
  • the rinsing solution taken from an animal or human body contains at least 0.01 ng / ml of a transforming growth factor (TGF), preferably at least 0.05 ng / ml TGF, more preferably at least 0.1 ng / ml TGF, most preferably at least 0.3 ng / ml TGF.
  • TGF transforming growth factor
  • taken from a human or animal body flushing solution is between 0.01 ng / ml and 500 ng / ml contains preference between 0.01 ng / ml and 100 ng / ml, particularly before ⁇ Trains t between 0, 1 ng / ml and 50 ng / ml, most preferably between 0.1 ng / ml and 10 ng / ml TGF.
  • a preferred transforming growth factor is TGF-beta growth factor (TGF- ⁇ ).
  • TGF- ⁇ TGF-beta growth factor
  • a particularly preferred transforming growth factor is the transforming one
  • TGF-ß-1 Growth factor beta-1
  • the rinse solution taken from an animal or human body contains at least 0.0001 ng / ml vascular endothelial growth factor (VEGF), preferably at least 0.001 ng / ml VEGF.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • taken from a human or animal body rinse solution contains between 0.0001 ng / ml and 5 ng / ml VEGF, preferably between 0.0001 ng / ml and 10 ng / ml VEGF, more preferably between 0.001 ng / ml and 1 ng / ml VEGF, most preferably between 0.001 ng / ml and 0, 1 ng / ml VEGF.
  • the rinse solution taken from an animal or human body contains at least 0.0001 ng / ml fibroblast growth factor (FGF), preferably at least 0.001 ng / ml FGF.
  • FGF fibroblast growth factor
  • the rinsing solution taken from an animal or human body contains between 0.0001 ng / ml and 5 ng / ml FGF, preferably between 0.0001 ng / ml and 10 ng / ml FGF, more preferably between 0.001 ng / ml and 1 ng / ml FGF, most preferably between 0.001 ng / ml and 0.1 ng / ml FGF.
  • a preferred fibroblast growth factor is fibroblast growth factor 2 (FGF-2).
  • the rinsing solution taken from an animal or human body contains between 0.0001 ng / ml and 100 ng / ml, preferably between 0.0001 ng / ml and 10 ng / ml, more preferably between 0.001 ng / ml and 1 ng / ml, most preferably ng / ml of a growth factor which is selected from ⁇ from the group consisting of the weave is between 0.001 ng / ml and 0.1 in Zahnhartge- occurring and bone growth factors.
  • the rinsing solution taken from an animal or human body contains between 0.0001 ng / ml and 100 ng / ml, preferably between 0.0001 ng / ml and 10 ng / ml, more preferably between 0.001 ng / ml and 1 ng / ml, most preferably between 0.001 ng / ml and 0.1 ng / ml egg ⁇ nes growth factor is selected from the group sawn standing from platelet-associated growth factors
  • PDGF bone morphogenetic growth factors
  • IGF insulin-like growth factors
  • EGF epidermal growth factors
  • the rinsing solution taken from an animal or human body preferably has a pH of greater than 4, particularly preferably greater than 5.
  • Advantageous pH values for the extracted an animal or human body washing solution is between 4 and 10, preferably between 5 and 9, more preferably between 5 and 8, more preferably between 6.5 and 7.5, very particularly before Trains t ⁇ at a pH of 7.
  • the framework material is loaded with at least ei ⁇ nem growth factor.
  • the loading of the framework material is carried out according to the invention by contacting the rinsing solution taken from an animal or human body with the framework material.
  • the contacting may include the application or introduction of the rinse solution onto or into the framework material.
  • the loading of the framework material takes place by mixing the rinse solution with the framework material.
  • a dispersion or solution by mixing framework material and rinse solution is prepared.
  • the framework material is loaded with at least one naturally occurring growth factor in bone or tooth hard tissue.
  • the at least one growth factor from ⁇ is preferably selected from the group consisting of transforming growth factors (TGF), vascular endothelial growth Factors (VEGF), fibroblast growth factors (FGF), platelet-associated growth factors (PDGF), bone morphogenetic growth factors (BMP), insulin-like growth factors (IGF) and epidermal growth factors (EGF).
  • TGF transforming growth factors
  • VEGF vascular endothelial growth Factors
  • FGF fibroblast growth factors
  • PDGF platelet-associated growth factors
  • BMP bone morphogenetic growth factors
  • IGF insulin-like growth factors
  • EGF epidermal growth factors
  • BMP-2 bone morphogenetic growth factor 2
  • the scaffold is preferably with the at least one material growth in amounts between 0.0001 ⁇ Factor ng / mL and 100 ng / ml, preferably upstream from 0.0001 ng / ml and 10 ng / ml, particularly be ⁇ 0.001 ng between vorzugt / ml and 1 ng / ml, most preferably loaded between 0.001 ng / ml and 0.1 ng / ml.
  • the framework material is loaded with a growth factor mixture.
  • the growth factor mixture contains at least two growth factor components.
  • At least one growth factor component is preferably of the at least two equipsmidpo ⁇ components a trans- formiere growth factor (TGF), wherein the transforming growth factor TGF-beta-growth factor (TGF-ß) is especially preferred and wherein the transforming growth factor-beta-1 ( TGF- ⁇ -1) is very particularly preferred.
  • TGF trans- formiere growth factor
  • TGF-ß transforming growth factor-beta-growth factor
  • TGF- ⁇ -1 TGF- ⁇ -1
  • the framework material with at least 0.01 ng / ml TGF, preferably at least 0.05 ng / ml TGF, more preferably at least 0.1 ng / ml TGF especially be ⁇ vorzugt at least 0.3 ng / ml TGF loaded.
  • the framework material with a quantity of TGF between 0.01 ng / ml and 500 ng / ml, vorzugswei- se is between 0.01 ng / ml and 100 ng / ml, more preferably between 0.1 ng / ml and 50 ng / ml, most preferably between 0.1 ng / ml and 10 ng / ml loaded.
  • at least one growth factor is preferably selected from the group consisting of vascular endothelial growth factors (VEGF) and fibroblast growth factors (FGF).
  • VEGF vascular endothelial growth factors
  • FGF fibroblast growth factor 2
  • FGF-2 fibroblast growth factor 2
  • the framework material is loaded with at least 0.0001 ng / ml VEGF, preferably at least 0.001 ng / ml VEGF.
  • the framework material with an amount of VEGF is between 0.0001 ng / ml and 5 ng / ml, preferably between 0.0001 ng / ml and 10 ng / ml, more preferably between 0.001 ng / ml and 1 ng / ml. ml, most preferably loaded between 0.001 ng / ml and 0.1 ng / ml.
  • the framework material is loaded with at least 0.0001 ng / ml FGF, preferably at least 0.001 ng / ml FGF.
  • the framework material with an amount of FGF is between 0.0001 ng / ml and 5 ng / ml, preferably between 0.0001 ng / ml and 10 ng / ml, more preferably between 0.001 ng / ml and 1 ng / ml. ml, most preferably loaded between 0.001 ng / ml and 0.1 ng / ml.
  • the growth factor components with which the skeleton material is loaded the growth factor mixture corresponding to the growth factor components in the growth factor mixture of the extracted an animal or human body washing solution, that the framework material is loaded with all growth ⁇ factor components that are found in the rinse solution.
  • the rinsing solution in step c) is brought in an amount on the scaffold ⁇ material which enables loading of the scaffold with a growth factor mixture in the size range of the concentration in the rinse solution, or even larger.
  • the immobilization of the growth factors in or on the biomaterial or framework material preferably takes place via weak, non-covalent bonds, so that it is reversible.
  • the binding can be via mediator molecules, such as heparin.
  • the rinsing solution taken from an animal or human body is prepared for use with the framework material before the skeleton material is loaded.
  • the conditioning of the rinse solution includes any steps that require the use of the rinse solution in a biomaterial.
  • the treatment of the rinse solution may include the sterilization of the rinse solution and / or the inactivation of toxins in the rinse solution and / or the removal of toxins from the rinse solution and / or the addition of one or more adjuvants to the rinse solution.
  • the treatment of the rinsing solution taken from an animal or human body preferably comprises the addition of at least one pharmaceutically active substance and / or the addition of at least one mediator for stabilizing and binding growth factors.
  • the pharmaceutically active substance is preferably an antibiotic.
  • the term intermediary refers to chemical substances or molecules, in particular special biopolymers, which causes the binding of at least one growth factor to the framework material or under ⁇ supported.
  • a preferred mediator is heparin. Heparin is a sulfated and thus negatively charged glycosaminoglycan, which occurs naturally in the extracellular matrix and can bind certain growth factors (heparin-binding growth factors) and protect against proteolytic degradation. This effect can be imitated in synthetic matrices.
  • An advantage of treating the rinsing solution with heparin is that the heparin-binding growth factors released from the dentin can be bound to the framework via heparin and thus their half-life can be extended.
  • Rinsing solution removed from the body may include the removal of demineralizing agent from the rinse solution.
  • the at least one demineralizing agent is EDTA and the treatment of the rinse solution comprises the degradation of EDTA and / or the partial or complete removal of EDTA and / or its degradation products from the rinse solution. Removal of EDTA from the rinse solution may involve recomplexing of EDTA and removal and / or degradation of the EDTA complex.
  • the EDTA may preferably be through the
  • the treatment may therefore include the degradation of EDTA with addition of iron (III) salts and / or by irradiation with UV light.
  • the irradiation with UV light preferably takes place in the wave length range above 200 nm.
  • the preparation of the rinse solution advantageously teilwei ⁇ se or complete removal of EDTA from the rinsing solution and / or nenleyerharzpizer of its degradation products using suitable anion may, for example, bonded by means of quaternary ammonium ⁇ groups to suitable carrier polymers For example, crosslinked agarose gels.
  • suitable carrier polymers For example, crosslinked agarose gels.
  • a preferred hard tissue in the context of the invention is hard dental tissue, in particular dentin.
  • the growth factor-loaded biomaterial may contain autologous or allogeneic stem cells. In a preferred embodiment, the growth factor-loaded biomaterial contains autologous stem cells. In another preferred
  • Embodiment contains the growth factor-loaded Bioma ⁇ material no stem cells.
  • the invention also contemplates growth factor-loaded biologic material for use in tissue regeneration, which is obtainable by the method described above.
  • the invention provides a biomaterial loaded with a growth factor mixture comprising at least two naturally occurring growth factors in the dentin for use in the pulp tissue regeneration, which is characterized in that the weight ratio of the wax Factors in the biomaterial with the natural weight ratio of the growth factors to each other in the dentin is correlated.
  • the at least two na ⁇ Moslich occurring in the dentine growth factors selected from the group consisting of transforming growth ⁇ factors (TGF), are vascular endothelial growth factors
  • VEGF fibroblast growth factors
  • FGF fibroblast growth factors
  • PDGF platelet-associated growth factors
  • BMP bone morphogenetic growth factors
  • IGF insulin-like growth factors
  • bone morphogenetic growth factor 2 BMP-2
  • BMP-2 bone morphogenetic growth factor 2
  • the biomaterial may be loaded with a growth factor mixture of all growth factors naturally occurring in the dentin.
  • a corresponding biomaterial can be obtained by the above described driving Ver ⁇ . The correlation of the weight ratio of the growth factors to each other in the biomaterial with the natural weight ratio of the profundsfakto ⁇ ren one another in the dentine is then obtained by the production method.
  • the rinsing solution or the absolute concentration and / or the ratio of the ratios of the growth factors in the dentin to one another can be imitated in the biomaterial.
  • the growth factors used for this purpose can originate from humans or animals or be genetically engineered.
  • the biomaterial preferably contains at least one transforming growth factor (TGF), in particular TGF- ⁇ -1, in an amount between TGF- ⁇ -1 and TGF- ⁇ -1.
  • TGF trans ⁇ transforming growth factor
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • TGF: FGF FGF is 2: 1 to
  • TGF FGF equal to 2: 1 to 50: 1 or 2: 1 to 20: 1.
  • the invention also relates to a kit for producing a growth factor-loaded biomaterial for use in tissue regeneration.
  • the kit according to the invention comprises a) framework material and b) a rinsing solution for rinsing human or animal hard tissue which contains at least one hard tissue degradation agent.
  • suitable framework materials have already been described in the context of the manufacturer ⁇ development method according to the invention. These explanations are referred to.
  • the framework materials described therein can also be used in the context of the kit according to the invention as component a).
  • the framework material is selected from the group consisting of synthetic poly mers ⁇ , natural biomaterials, in particular polymers and combinations of the foregoing; wherein the framework material is preferably selected from the group consisting of self-organizing peptides (SAP), polyethers, polylactic acid, polyglycolic acid (PGA), copolymers of polylactic acid with polyethers (PLGA), poly-s-caprolactone (PCL), polyurethanes, Collagen, fibrin, polysaccharides and combinations of the foregoing; wherein the framework is more preferably selected from the group consisting of self-assembling peptides (SAP), collagen, fibrin, and combinations of the foregoing.
  • SAP self-organizing peptides
  • PGA polyglycolic acid
  • PCL poly-s-caprolactone
  • the framework is more preferably selected from the group consisting of self-assembling peptides (SAP), collagen, fibrin, and combinations of the foregoing.
  • the framework material has adhesive groups may be reversibly bound to the mediator molecules for wax ⁇ tums tinten and / or growth factors and / or it has degradable groups in the body.
  • the adhesive and / or degradable groups are preferably amino acid sequences.
  • the rinse solution (component b) is intended to be contacted with tie ⁇ hari whatsoeverm or human hard tissue, such as bone or teeth in contact.
  • tie ⁇ hari symbolizem or human hard tissue such as bone or teeth in contact.
  • inventive production process have been for fiction, ⁇ proper kit suitable irrigation solutions for rinsing of human or animal hard tissue or appropriate in the context Demineraltechnischsstoff described. On these explanations are referred to.
  • the beschrie there ⁇ surrounded irrigation solutions for rinsing of human or animal hard tissue can also be used as part of the invention shown SEN kits as component b).
  • component b) of the kit may be a ready-to-use rinse solution for rinsing human or animal hard tissue.
  • a ready-to-use rinse solution already contains the at least one demineralizing agent in a ready-to-use concentration. This has the advantage that the solution before use with the hard tissue z. B. no longer needs to be diluted extra.
  • the concentra ⁇ on the at least one Demineraltechnischsstoffs in the rinse solution for rinsing of hard tissue at least 5 wt .-%, more preferably 10 wt .-% of at least further preference ⁇ , 10 wt .-% to 20 wt .-%, particularly preferably from 10% to 17% by weight, most preferably 17% by weight.
  • Wash hard tissue may advantageously a pH of greater than 4, preferably a pH of greater than 5, white ⁇ ter preferably has a pH value of 4 to 10, further before ⁇ preferably a pH of 5 to 9, more preferably have a pH of 5 to 8, more preferably a pH of 6.5 to 7.5, particularly preferably a pH of 7.
  • the at least one demineralization agent is selected from the group consisting of
  • Acids, salt and chelating agents wherein the at least one demineralizing agent is preferably selected from the group consisting of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid or ethylenediaminetetraacetate), EGTA (ethylene glycol bis (aminoethyl ether) -N, ⁇ ', N'-tetraacetic acid or ethyleneglycol bis (aminoethyl ether) - ⁇ , ⁇ , ⁇ ', N'tetraacetate) and citric acid / citrate ,
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid or ethylenediaminetetraacetate
  • EGTA ethylene glycol bis (aminoethyl ether) -N, ⁇ ', N'-tetraacetic acid or ethyleneglycol bis (aminoethyl ether) - ⁇ , ⁇ , ⁇ ', N'tetraacetate
  • citric acid / citrate
  • the component b) of the kit can preferably be an aqueous solution of a calcium chelating agent.
  • the at least one Demineraltechnischsstoff lemons ⁇ acid or citrate and the rinsing solution for rinsing of hard tissue has a pH value of greater than 4, preferably a pH of 5 to 7, more preferably from 4.5 up to 6.5.
  • the at least one demineralization agent is EDTA and the rinsing solution for rinsing hard tissue has a pH of at least 6, preferably a pH of at least 7, more preferably a pH of 7 to 9 on.
  • a kit of the invention may advantageously further comprise at least one component that is selected to support from the group consisting of means for the removal of EDTA from a solution promoters, which effect the binding of at least one growth factor to the biomaterial, insbesonde ⁇ re of the framework material or and ei ⁇ ner device for applying the rinse solution.
  • the means for removing EDTA from a solution may preferably comprise ferric salts and / or anion exchange resins.
  • a preferred mediator is heparin.
  • the device for application of the rinsing solution preferably comprises a syringe and a cannula, particularly preferably a blunt endo-cannula.
  • a preferred hard tissue in the context of the invention is hard dental tissue, in particular dentin.
  • the method of treatment comprises the steps of: a) providing a rinse solution for rinsing human or animal hard tissue containing at least one hard tissue demineralizer selected from the group consisting of acids, calcium salt and calcium chelators; b) contacting the hard tissue with the rinse solution to rinse human or animal hard tissue under conditions allowing release of growth factors bound in hard tissue; c) removal of growth factor enriched
  • Rinsing solution from the animal or human body d) preparing a growth factor-loaded biomaterial, according to the in-vitro method of the invention described above, using the growth factor-enriched rinse solution of step c); e) introducing the growth factor-loaded biomaterial into an animal or human body.
  • hard tissue is hard dental tissue, in particular dentin.
  • the hard tissue may also be bone tissue.
  • t is human hard tissue.
  • Preference ⁇ example is introduced in step e) the growth factor-laden Bioma ⁇ TERIAL in the body, with the hard tissue, the rinsing solution was contacted for washing the human or animal hard tissue in step b), ie the Bioma ⁇ TERIAL in view of the human or animal Body in which it is introduced an autologous bioma ⁇ material.
  • the introduction of autologous biomaterials is preferred because no immune response is expected.
  • the Bioma ⁇ TERIAL may contain autologous or allogeneic stem cells.
  • the biomaterial contains autologous stem cells.
  • the biomaterial does not contain stem cells.
  • suitable irrigation solutions for rinsing of human or animal hard tissue or suitable Demineralmaschinesstoff be ⁇ already or the kit of the invention have been described in the context of the invention Heinrichsverfah- proceedings. These explanations are referred to.
  • the rinsing solutions described there for rinsing human or animal hard tissue can also be used in the treatment method described above.
  • ⁇ 6 more preferably at least 10 wt .-%, more preferably 10 wt .-% to 20 wt .-%, particularly preferably 10 wt .-% to 17 wt .-%, most preferably 17 wt .-% is ,
  • the at least one demineralizing agent is selected from the group consisting of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid or ethylenediaminetetraacetate), EGTA (ethylene glycol bis (aminoethyl ether) - ⁇ , ⁇ , ⁇ ', ⁇ '-tetraacetic acid and ethylene glycol bis ( aminoethyl ether) - N, N, ⁇ ', N' tetraacetate) and citric acid / citrate.
  • the rinse solution contains Rinsing of hard tissue from step a) as a demineralizing EDTA (eg disodium salt).
  • the rinse solution is an aqueous EDTA solution.
  • the concentration of EDTA is preferably in the rinse solution for rinsing of human or animal hard tissue, at least 5 wt .-%, more preferably Minim ⁇ least 10 wt .-%, more preferably 10 wt .-% to 17 wt, -%, more preferably at least 15 wt .-%, particularly preferably ⁇ 17 wt .-%.
  • the contacting of the hard tissue with rinsing solution for rinsing of human or animal hard tissue in step b) can be carried out, for example, using a syringe system.
  • the syringe system preferably comprises a blunt endocannula.
  • the exposure time to the rinse solution is the hard tissue in step b) is between 0.1 min and 30 min, before ⁇ preferably between 1 min and 30 min, more preferably between 1 min and 20 min, more preferably between 2 min and 15 min, more preferably between 5 min and 20 min, most preferably between 5 min and 15 min.
  • a sonic or ultrasound-assisted activation of the rinse solution can take place.
  • step c) can take place, for example, by means of a syringe system.
  • the syringe system preferably comprises a blunt endocannula.
  • Step d) relates to the dung OF INVENTION ⁇ modern manufacturing method of a loaded with at least one growth factor with the biomaterial bathga ⁇ be already above described, that the rinse solution from step c is used).
  • the preparation process according to the invention has already been described above. Reference is made to these explanations.
  • the growth factor-laden Bioma TERIAL at least one na ⁇ Moslich occurring in bone or tooth tissue growth factor.
  • at least one growth factor is selected from the group consisting of transforming growth factors (TGF), vascular endothelial growth factors (VEGF), fibroblast growth factors (FGF), platelet-associated growth factors (PDGF), bone morphogenetic growth factors (BMP), insulin-like growth factors ( IGF) and epidermal growth factors (EGF).
  • TGF transforming growth factors
  • VEGF vascular endothelial growth factors
  • FGF fibroblast growth factors
  • PDGF platelet-associated growth factors
  • BMP bone morphogenetic growth factors
  • IGF insulin-like growth factors
  • EGF epidermal growth factors
  • BMP-2 bone morphogenetic growth factor 2
  • the bio ⁇ material contains the at least one growth factor in amounts between 0.0001 ng / ml and 500 ng / ml, preferably between 0.0001 ng / ml and 100 ng / ml, more preferably between 0.0001 ng / ml and 10 ng / ml, more preferably between 0.001 ng / ml and 1 ng / ml, most preferably between 0.001 ng / ml and 0.1 ng / ml.
  • the biomaterial contains a growth factor mixture containing at least two growth factors.
  • At least one growth factor is preferably of the at least two growth factors transforming wax tums tile (TGF), particularly preferably the transformie ⁇ Rende growth factor a TGF-beta-growth factor (TGF-ß) is very particularly preferably the transforming equipsfak tor beta-1 (TGF- ⁇ -1).
  • TGF transforming wax tums contouring
  • TGF-ß transformie ⁇ Rende growth factor
  • TGF-ß TGF-beta-growth factor
  • TGF-ß the transformie ⁇ Rende growth factor a TGF-beta-growth factor
  • TGF-ß the transformie ⁇ Rende growth factor a TGF-beta-growth factor
  • TGF-ß the transformie ⁇ Rende growth factor a TGF-beta-growth factor
  • TGF-ß the transformie ⁇ Rende growth factor a TGF-beta-growth factor
  • TGF-ß the transforming equipsfak tor beta-1
  • the loaded biomaterial contains between 0.01 ng / ml and 500 ng / ml, preferably between 0.01 ng / ml and 100 ng / ml, more preferably between 0.1 ng / ml and 50 ng / ml, most preferably between 0.1 ng / ml and 10 ng / ml TGF.
  • At least one growth factor is preferably selected from the group of vascular endothelial growth factors (VEGF) and fibroblast growth factors (FGF), particularly preferably the fibroblasts are growth factors of the fibroblasts
  • VEGF vascular endothelial growth factors
  • FGF fibroblast growth factors
  • the loaded biomaterial at least 0.0001 ng / ml VEGF, preferably ⁇ example at least 0.001 ng / ml VEGF.
  • the loaded biomaterial contains at least 0.0001 ng / ml FGF, preferably at least 0.001 ng / ml FGF.
  • the biomaterial loaded from 0.0001 ng / ml and 5 ng / ml, more preferably between 0.0001 ng / ml and 10 ng / ml, more preferably Zvi ⁇ rule 0.001 ng / ml and 1 ng / ml, very particularly preferably between 0.001 ng / ml and 0.1 ng / ml FGF.
  • the loaded biomaterial preferably contains more wax ⁇ tums tinten. These are preferably more occurring in the tooth ⁇ tissue and / or bone growth factors.
  • The- Other growth factors may preferably be selected from the group consisting of platelet-associated growth factors (PDGF), bone morphogenetic growth factors (BMP), insulin-like growth factors (IGF), epidermal growth factors (EGF).
  • PDGF platelet-associated growth factors
  • BMP bone morphogenetic growth factors
  • IGF insulin-like growth factors
  • EGF epidermal growth factors
  • a preferred bone morphogenetic growth factor is bone morphogenetic growth factor 2 (BMP-2).
  • the loaded biomaterial contains between 0.0001 ng / ml and 500 ng / ml, preferably between 0.0001 ng / ml and 100 ng / ml, preferably between 0.0001 ng / ml and 10 ng / ml between, more preferably between 0.001 ng / ml and 1 ng / ml, more preferably between 0.001 ng / ml and 0.1 ng / ml of a growth factor occurring in the tooth hard tissue and / or bone.
  • the loaded biomaterial contains between 0.0001 ng / ml and 100 ng / ml, preferably between 0.0001 ng / ml and 10 ng / ml, more preferably between 0.001 ng / ml and 1 ng / ml, more preferably between 0.001 ng and 0.1 ng / ml of a growth factor selected from the group consisting of platelet-associated growth factors (PDGF), bone morphogenetic growth factors (BMP), insulin-like growth factors (IGF), epidermal cells
  • PDGF platelet-associated growth factors
  • BMP bone morphogenetic growth factors
  • IGF insulin-like growth factors
  • EGF Growth Factors
  • the growth factor components of the growth factor mixture with which the biomaterial is loaded correspond to the growth factor components in the growth factor mixture of the rinse solution from step c), ie the biomaterial is loaded with all growth factor components which are present in the rinsing solution from step c) taken from the animal or human body ) Find.
  • the biomaterial may be liquid or solid or in the form of a gel. It may be any biomaterial already described above in the context of the production process according to the invention.
  • the biomaterial or the suspension or solution of the (loaded) framework material can be ⁇ suspension or solvent or other components removed partially or completely. It can also be added to further compo ⁇ nents.
  • the biomaterial can be partially or completely hardened before or after introduction into a root canal.
  • the biomaterial is hardened or hardened in the root canal. Preferably, it ⁇ following hardening by polymerization.
  • the invention allows an improved method for root canal treatment, comprising the following steps:
  • Root canal preparation wherein a) tissue disorders with prior partial removal of the Pulpage- (Step 2 a) takes place a slight Extension C ⁇ tion of the root canal to allow the Desin Stammi ⁇ one; b) pagewebes by prior complete removal of the powder diffractometer (step 2b) is carried out an expansion of the Wur ⁇ zelkanals, wherein the apex (apex) is extended to at least 0.8 mm to the A ⁇ growth of cells for regeneration and Blutge- to promote cask sprouting;
  • Desin ⁇ fection is done, for example, chlorhexidine, sodium hypochlorite;
  • the rinse solution for rinsing human or animal hard tissue containing at least one demineralizer selected from group best ⁇ starting from acids, salt and / or chelating agents;
  • Removal of the at least one growth factor is ⁇ enriched rinse solution from the body
  • step 2 If in step 2 is effected a complete removal of the powder-pagewebes, it is advantageous between the crotch ⁇ th 4 and 5 for a period of 1 to 2 weeks a me- dikamentinate insert into the root canal to introduce.
  • step 4 is derholt before starting from step 5 as ⁇ .
  • the drug insert may be selected from the group consisting of calcium hydroxide pastes, antibiotic corticosteroid preparations and antibiotic mixtures.
  • Rinsing solutions suitable for the method of root canal treatment for rinsing human or animal hard tissue or suitable demineralizing agents have already been described in the context of the preparation method or the kit according to the invention. These explanations are referred to.
  • the rinsing solutions described therein for rinsing human or animal hard tissue can also be used in the above-described method for root canal treatment.
  • the rinsing solution for rinsing human or animal hard tissue has a pH of greater than 4, preferably a pH greater than 5, more preferably a pH of from 4 to 10, more preferably a pH of from 5 to 9, more preferably a pH of 6 to 8, more preferably a pH of 6.5 to 7.5, most preferably a pH of 7.
  • the concentration of the at least one Demineral Deutschensstoffs in the rinse solution to the SPC ⁇ len of hard tissue at least 5 wt .-%, more preferably least 10 wt .-%, more preferably 10 wt .-% to 20 wt .-%, more preferably 10 wt .-% to 17 wt .-%, most preferably 17 wt .-% is.
  • At least one demineralizing agent is selected from the group consisting of EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid or ethylenediaminetetraacetate), EGTA (ethylene glycol bis (aminoethyl ether) - ⁇ , ⁇ , ⁇ ', ⁇ '-tetraacetic acid or ethylene glycol bis (aminoethyl ether) N, N, ⁇ ', N' tetraacetate) and citric acid or citrate.
  • EDTA ethylenediaminetetraacetic acid or ethylenediaminetetraacetate
  • EGTA ethylene glycol bis (aminoethyl ether) - ⁇ , ⁇ , ⁇ ', ⁇ '-tetraacetic acid or ethylene glycol bis (aminoethyl ether) N, N, ⁇ ', N' tetraacetate
  • citric acid or citrate In a preferred method corresponds to the root canal treatment keeps the rinse solution
  • the concentration of EDTA in the rinse solution for rinsing human or animal hard tissue is at least 5 wt%, more preferably at least 10 wt%, more preferably 10 wt% to 17 wt%, more preferably at least 15 Wt .-%, particularly preferably 17 wt .-%.
  • a particularly preferred rinse solution for rinsing hard tissue in the context of the method is a 10% (w / w) to 17% (w / w) aqueous EDTA solution having a pH of 7.
  • the contacting of the dentin with the rinse solution for rinsing human or animal hard tissue in step 5 can be done, for example, using a syringe system.
  • the syringe system preferably comprises a luer lock syringe and / or a blunt endocannula.
  • Advantageous ingly is the exposure time to the rinse solution to the dentin in step 5 is between 0.1 min and 30 min, preferably ⁇ between 1 min and 30 min, more preferably between 1 min and 20 min, more preferably between 2 min and 15 min, especially preferably between 5 minutes and 20 minutes, most preferably between 5 minutes and 15 minutes.
  • the removal in step 6) can take place, for example, by means of a syringe system.
  • the syringe system preferably comprises Luer-Lock syringe and / or a blunt endocannula.
  • the biomaterial may be covered with a suitable material, such as MTA (mineral trioxide aggregate), and the root canal sealed with bacteria by laying a conventional filling.
  • a suitable material such as MTA (mineral trioxide aggregate)
  • MTA mineral trioxide aggregate
  • Fig. 1 Data for the release of the growth factor TGFßl of dentine in response to the pH of the rinse solution ⁇ ,
  • FIG. 2 shows data for the release of the growth factor TGFßl of dentine in response to the type of pretreatment ⁇ lung
  • Fig. 3 Data for the release of the growth factor VEGF of dentine in response to the type of pretreatment ⁇ lung
  • Fig. 4 cell vitality of dental pulp stem cells in one
  • FIG. 5 Release of the growth factors from a biomaterial
  • FIG. 6 Cell numbers of dental pulp stem cells in growth factor-loaded biomaterial
  • Fig. 7 Tissue formation in Dentinzylindern after
  • the thickness of hole saw dentine slices were 200 ym and diam ⁇ sers 8 mm prepared and stored up to the beginning of the experiment in 10 ⁇ 6iger chloramine solution from extracted teeth using an inside.
  • the disks were washed with phosphate buffered saline (1x PBS, pH 7) and each disk was placed in the well of a 48-well plate. As a result, each slice was filled with 100 ⁇ one
  • Rinse solution aqueous EDTA solution 10% or 0.268 M, pH 6 or pH 7, prepared with EDTA disodium salt dihydrate, Appellant No. A3234
  • ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
  • aqueous EDTA rinse solution (10% or 0.268 M, pH 7) was contacted with dentine by the procedure of Example 1.
  • Figure 2 compares the concentration of TGF ⁇ 1 in the rinse solution after a rinse solution exposure time to the dentin of 5 minutes, 10 minutes, and 20 minutes, respectively, in the case where the dentin was used to rinse hard tissue prior to application of the EDTA-containing solution Procedure in Example 1 with sodium hypochlorite (NaOCl, 5.25%) or
  • Chlorhexidine (chlorhexidine digluconate, 0.12%) was pretreated for 5 min or 10 min or the EDTA-containing Solution for rinsing hard tissue without pretreatment of the dentin with chlorhexidine or sodium hypochlorite was applied.
  • TGF ⁇ 1 is released from the dentin when the rinse solution containing EDTA is used. It shows a time-dependent effect, with longer exposure time of EDTA more TGFßl is released. If disinfectant chlorhexidine is used before EDTA, this effect is slightly increased with an exposure time of chlorhexidine of 5 min. Rinsing with sodium hypochlorite before EDTA application reduces the profunda period of EDTA.
  • FIG. 3 shows higher growth factor concentrations in the case of previous use of chlorhexidine than with NaOCl.
  • An EDTA rinse solution according to Example 1 was admixed with iron (III) chloride and irradiated with UV light at 254 nm (mains handlamp UVA / C (No. 862 506), Dr. Göbel UV-Elektronik GmbH).
  • the residual content of EDTA in the rinse solution was less than 5% of the rinse solution used, determined by means of HPLC (Waters 2695 Separations Module and Waters 2998 Photo ⁇ diode Array Detector with HPLC column Nucleodur Sphinx RP 5 ym (CC250 / 4)).
  • starting component A is a solution of a part of self-organizing peptides (Sequences 1) in a designated, multi-chamber syringe system.
  • the rinse solution is removed from the root canal, the EDTA is removed from the solution using methods described in Example 4 and / or 5, this is mixed with the heparin / PBS solution.
  • the growth factors in solution are bound and stabilized by the heparin.
  • this solution is mixed with the second part of the self-assembling peptides (pendant sequences) and with the starting component A and injected into the root canal. Within 3-5 minutes, gelation occurs, which is induced in this material by electrostatic interaction between the two peptide sequences.
  • the PBS solution a phosphate-buffered saline solution (lx PBS, pH 7), is introduced into the channel, pipetted up and down and finally removed from the channel. To this solution was added, followed by heparin ⁇ ver mixed with the powdered framework material.
  • a stock solution of peptide in lxPBS of 2% by weight was prepared.
  • the respective growth factor was dissolved in a heparin / PBS solution.
  • both components were mixed and wells pipetted into a 96-well plate, mixing induces gelation.
  • the volume per gel was 100 yL, the final concentration of peptide 1 wt-6, heparin 1 mg / ml, and growth factor 100 ng per gel.
  • gels without heparin were prepared and the samples were prepared in triplicates. Each gel was now with
  • dental pulp stem cells are sown in a monolayer in 24-well plates, the cell density was 2.5 ⁇ 10 3 cells per well. The cells remained untreated for 24 hours, during which time cell adhesion occurred.
  • An insert was then placed in each well containing a heparin and growth factor enriched peptide hydrogel. The volume per gel in the insert was 25 yl, the amount of growth factor for TGF ⁇ 1 was 25 ng, for FGF-2 100ng.
  • the gels in the inserts were overlayed with cell culture medium, allowing continuous delivery of growth factor into the medium over the 14 day trial period.
  • control groups no gels have been used in the insert, but the growth factors were added to the cell culture medium was changed every 2 days, whereby a renewed supply of growth factor was ⁇ .
  • 3 experimental groups (1: cells and gels in inserts without growth factor, 2: gels in inserts with 25ng TGF ⁇ 1 and 3: gels in inserts with 100ng of FGF-2).
  • 3 control groups (1: cells without gels, normal cell culture medium, 2: cells without gels, cell culture medium with 2.5 ng TGF ⁇ 1, 3: cells without gels, cell culture medium with 10 ng FGF-2).
  • the cell morphology was photographically documented after 3 and 14 days. Cell growth was determined after 3, 7 and 14 days by counting in a Neubauer counting chamber.
  • TGF-1 treated Zel ⁇ len showed an increase in the cell body and cluster formation after 14 days, while the proliferation was slowed.
  • FGF-2 induced a spindle-shaped cell type with increased proliferation rate.
  • the described experiment demonstrates that TGF ⁇ 1 as well as FGF-2 retain their bioactivity upon incorporation and subsequent release from hydrogels.
  • Biomaterial loaded with growth factors is introduced into the root canal by means of a syringe system.
  • the gel in the root canal serves as a guide for regeneration, it should be attracted by the recirculated growth factors cells and brought in the gel for proliferation, differentiation and tissue formation. Furthermore, growth factors are also exposed to the dentin surface after EDTA pretreatment. For this purpose, experiments were imitated with the root canal
  • FIG. 7 shows tissue formation in dentinal cylinders after transplantation of dental pulp cells.
  • Sodium hypochlorite-treated dentin is shown in the left column.
  • EDTA-treated dentin is shown in the right column.
  • Figures (C) and (D) are illustrations after HE staining.
  • Figures (E) and (F) are representations of Masson's trichrome stain. Tissue formation is visible in the middle of the cylinder (A, B).
  • 0.5 ml of the prepared solution was placed in a zip-sealed PE bag (40 mm x 60 mm, DMG No. 101207) equipped with a filter paper. After sealing the bag, it is irradiated with UV light (254 nm, UV hand lamp, distance lower edge of device - PE bag: 17 mm) for 15, 30, 60, 90 and 120 min. After the end of irradiation, the filter paper was removed from the PE bag and rinsed twice with 10 ml of HPLC water (Baker 4218). These rinse solutions were placed in a 100 mL volumetric flask.
  • the remaining sample remaining in the PE bag was also transferred to the 100 ml volumetric flask and the PE bag was rinsed twice with 5 ml of HPLC water each time. These rinsing solutions were also transferred to the volumetric flask. The volumetric flask was filled to the mark and a sample was analyzed by HPLC (Waters Alliance 2695 with UV detector Waters 2998) (HPLC method: Application No. 119780 "Complexing Agents acc
  • the starting value (100%) is a solution of 500 ⁇ M 0.1 M EDTA solution (Merck, Darmstadt) in 100.0 ml of HPLC water.
  • the EDTA degradation was determined as a double determination (with two PE bags per irradiation period).
  • Example 12 Degradation rate of EDTA by means of UV light
  • Example 11 a solution according to Example 11, to which 10 ml of HPLC water had been added instead of 5 ml of the FeC13 and 5 ml of the CaC12 solution and which was investigated by the method described in Example 11, showed no degradation after 15 minutes 20 min and after 90 min less than 40% of the EDTA were degraded.
  • Example 13 Degradation rate of EDTA by FeCl3
  • Example 14 Degradation rate of EDTA using FeCl3, UV light and ion exchanger
  • Example 11 was repeated with the difference that instead of the filter paper a IonenonenonerpapierstMail (35 mm x 57 mm, Schleicher & Schuell 589 1 Schwarz band ⁇ ash free, Lot Bez. DU0901-1 or Whatman DE81 grade Cat.No. 3658-915, Lot No. F1646846) was contained in the PE bag.
  • the EDTA content only initially decreased faster than in Example 11. It was 30% after 15 minutes.
  • Example 15 Determination of Protein Breakdown After the end of the irradiation (see Example 11), a sample was taken from the PE bags and stored cool in brown glass vials (refrigerator).
  • the protein concentration dropped to 80% after 30 minutes and to 65% after 90 minutes.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein in vitro Verfahren zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen, zur Verwendung bei der Geweberegeneration geeigneten Biomaterials, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen einer einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung für Hartgewebe, wobei die Spüllösung mindestens ein Demineralisierungsmittel für Hartgewebe und ein durch Kontakt der Spüllösung mit dem Hartgewebe aus dem Hartgewebe gewonnenes Wachstumsfaktorgemisch enthält; b) Bereitstellen von Gerüstmaterial; c) Beladen des Gerüstmaterials mit mindestens einem Wachstumsfaktor durch Inkontaktbringen der Spüllösung mit dem Gerüstmaterial. Die Erfindung betrifft ferner ein Kit zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials.

Description

Verfahren und Kit zur Herstellung von Biomaterial zur Gewe beregeneration
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen, zur Verwendung bei der Geweberegeneration geeigneten Biomaterials und ein Kit zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials zur Verwendung bei der Geweberegeneration. Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der medizinischen Geweberegeneration, insbesondere in der Zahn- bzw. Knochenheilkunde. Die Zahnpulpa, wird von einem Zahnhartgewebemantel (Zahnschmelz, Dentin und Zement der Zahnkrone und -wurzel) umhüllt. Aufgrund einer Schädigung des Hartgewebemantels kann es zum Eindringen von Bakterien und zur Entzündung des Pulpagewebes kommen. Dies macht im fortgeschrittenen Stadi¬ um in der Regel eine Wurzelkanalbehandlung erforderlich. Bei herkömmlichen Wurzelkanalbehandlungen wird das Pulpagewebe vollständig entfernt, woraufhin das Wurzelkanalsystem desinfiziert und mit bioinertem synthetischem Füllmaterial verschlossen wird. Im Stand der Technik erfolgt die Reinigung und/oder Desinfektion des Wurzelkanalsystems üblicherweise mittels wässriger Spüllösungen. Vorzugsweise werden Wechselspülungen mit Natriumhypochlorit- und Chlorhexidin- lösung durchgeführt. Die Spüllösungen können jedoch auch Chlorphenol-Kampher-Menthol, Wasserstoffperoxid, Jod- Kaliumjodid, Calciumhydroxid, MTAD (Mischung aus einem Tet- racyclin, einer Säure und einem Tensid) , Zitronensäure oder EDTA enthalten. Die Spüllösungen werden nach der Anwendung verworfen. Ein Nachteil dieser Wurzelkanalbehandlung besteht darin, dass gegebenenfalls auch nicht irreversibel geschädigtes Pulpagewebe vollständig entfernt wird, wodurch die Pulpafunktion nicht erhalten bleibt.
Ausgehend von dem oben beschriebenen Stand der Technik, liegt der Erfindung die Aufgabe zu Grunde, einfache und vergleichsweise kostengünstige Maßnahmen bzw. Mittel für die Zahn- bzw. Knochenheilkunde bereitzustellen, die eine Geweberegeneration, beispielsweise eine Regeneration des Pulpagewebes , unterstützen. Gelöst wird die Aufgabe durch das In-vi tro-Verfahren zur
Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials gemäß Anspruch 1, sowie durch den Kit zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials gemäß Anspruch 9. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den ab- hängigen Ansprüchen definiert.
Die Erfindung hat erkannt, dass in Hartgeweben wie Dentin bzw. Knochen bioaktive Wachstumsfaktoren eingelagert sind, die durch die Behandlung mit geeigneten Spüllösungen gelöst bzw. freigesetzt werden können. Dies erlaubt es, dass kör¬ pereigene Wachstumsfaktoren in ein Biomaterial eingebunden und zur Gewebeneubildung genutzt werden können.
Zunächst seien einige im Rahmen der Erfindung verwendete Begriffe erläutert.
Gegenstand der Erfindung ist ein In-vi tro-Verfahren zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen, zur Verwendung bei der Geweberegeneration geeigneten Biomaterials, umfassend die folgenden Schritte:
Bereitstellen einer einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung für Hartgewebe, wobei die Spüllösung min¬ destens ein Demineralisierungsmittel für Hartgewebe und ein durch Kontakt der Spül¬ lösung mit dem Hartgewebe aus dem Hartge¬ webe gewonnenes Wachstumsfaktorgemisch enthält ; b) Bereitstellen von Gerüstmaterial;
Beladen des Gerüstmaterials mit mindestens einem Wachstumsfaktor durch Inkontaktbrin- gen der Spüllösung mit dem Gerüstmaterial.
Im Rahmen der Erfindung bezeichnet der Begriff Biomaterial biokompatible Materialien bzw. Zusammensetzungen, die physiologisch verträglich und zum längerfristigen Verbleib in einen tierischen oder menschlichen Körper, insbesondere einen Säugerkörper, eingebracht werden können. Das wachstums- faktorbeladene Biomaterial enthält ein Gerüstmaterial und Wachstumsfaktoren sowie ggf. weitere Substanzen. Ein Ge¬ rüstmaterial (engl. Scaffold) bildet eine dreidimensionale poröse Struktur. Das Gerüstmaterial dient einerseits als Trägermaterial für Wachstumsfaktoren und ggf. weitere Sub¬ stanzen und andererseits als Gerüst für die Geweberegenera- tion. Gerüstmaterialien für die Geweberegeneration sind dem Fachmann bekannt. Im Rahmen der Erfindung können alle bekannten natürlichen oder synthetischen Gerüstmaterialien für die Geweberegeneration bzw. Kombinationen dieser Mate- rialien verwendet werden. Geeignete Gerüstmaterialien zur Regeneration von Gewebe sind in Galler K.M. et al . (2011) , Scaffolds for Dental Pulp Tlssue Engineering, Adv Dent Res 23 (3) : 333-339 beschrieben.
Das im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitge¬ stellte Gerüstmaterial kann vorteilhafterweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus synthetischen Polymeren, natürlichen Biomaterialien, insbesondere Biopolymeren und Kombinationen der Vorgenannten. Vorzugsweise ist das Gerüstmaterial ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus selbstorganisierenden Peptiden (SAP) , Polyethern, Poly- milchsäure, Polyglykolsäure (PGA) , Copolymeren von Poly- milchsäure mit Polyethern (PLGA) , Poly-s-Caprolacton (PCL) , Polyurethanen, Kollagen, Fibrin, Polysacchariden und Kombinationen der Vorgenannten. Besonders bevorzugt ist das Ge¬ rüstmaterial ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus selbstorganisierenden Peptiden (SAP) , Kollagen, Fibrin und Kombinationen der Vorgenannten. Im Rahmen der Erfindung sind selbstorganisierende Peptide als Gerüstmaterial ganz besonders bevorzugt.
Das wachstumsfaktorbeladene Biomaterial ist bevorzugt in einen Wurzelkanal implantierbar und/oder injizierbar. Das Biomaterial kann flüssig oder fest sein oder in Form eines Gels vorliegen. Im Rahmen der Erfindung sind fließfähige bzw. mittels Spritze anwendbare Biomaterialien besonders bevorzugt. Diese können in einen Wurzelkanal injiziert wer¬ den. Das Biomaterial kann bevorzugt durch Kanülen mit einem Innendurchmesser unter 2 mm, weiter bevorzugt unter 1 mm appliziert werden. Bevorzugt ist weiterhin ein härtbares, vorzugsweise polymerisierbares , Biomaterial, das nach dem Einbringen in eine Läsion, beispielsweise einen Wurzelka- nal, härtet bzw. zur Erhärtung gebracht werden kann. Es ist besonders vorteilhaft, wenn das Biomaterial im Wurzelkanal zu einem Gel härten kann bzw. als ein Gel vorliegt. Bevorzugt kann das Biomaterial zu einem Gel mit einer Endfestig- keit zwischen 200 und 10000 Pa [G' ] aushärten. Diese Eigen¬ schaften des Biomaterials können durch die Wahl eines ge¬ eigneten Gerüstmaterials erreicht werden. Das Gerüstmaterial ist bevorzugt in einen Wurzelkanal implantierbar
und/oder injizierbar. Es kann flüssig oder fest sein oder in Form eines Gels vorliegen. Besonders bevorzugt sind fließfähige bzw. mittels Spritze anwendbare Gerüstmateria¬ lien, da diese in einen Wurzelkanal injiziert werden kön¬ nen. Das Gerüstmaterial kann bevorzugt durch Kanülen mit einem Innendurchmesser unter 2 mm, weiter bevorzugt unter 1 mm appliziert werden. Bevorzugt ist weiterhin ein härtba¬ res, vorzugsweise polymerisierbares , Gerüstmaterial, das nach dem Einbringen in eine Läsion, beispielsweise einen Wurzelkanal, härtet bzw. zur Erhärtung gebracht werden kann .
Bevorzugt besteht ein Gerüstmaterial zunächst aus Vorstufen für das gehärtetes Gerüstmaterial, insbesondere Monomere, Oligomere und Polymere. Das Gerüstmaterial kann polymeri- sierbare bzw. vernetzende Gruppen tragen und über diese ge- härtet werden, wobei sich die polymerisierbaren bzw. vernetzenden Gruppen nicht auf reaktionsfähige Doppelbindungen beschränken. Die Polymerisation bzw. Vernetzung erfolgt vorzugsweise über elektrostatische Wechselwirkungen, bei¬ spielsweise bei selbstorganisierenden Peptiden oder über kovalente Bindungen. Es ist besonders vorteilhaft, wenn das Gerüstmaterial im Wurzelkanal zu einem Gel härten kann bzw. als ein Gel vorliegt. Bevorzugt kann das Gerüstmaterial zu einem Gel mit einer Endfestigkeit zwischen 200 und 10000 Pa [G' ] aushärten. Es ist vorteilhaft, wenn das Ge¬ rüstmaterial mindestens zwei Komponenten umfasst und durch Selbsthärtung (durch Mischen und Reaktion von mindestens zwei der durch das Gerüstmaterial umfassten Komponenten) härtbar ist, bevorzugt einen Gelzustand annimmt. Bei einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung ist das verwendete Gerüstmaterial durch Energiezufuhr, bei¬ spielsweise durch Lichtpolymerisation unter Einsatz eines geeigneten Initiatorsystems härtbar.
Für das Gerüstmaterial bevorzugte Gele sind Hydrogele, bei¬ spielsweise selbstorganisierende Peptide oder Polyether. Vorteilhafte Polyether sind Polyethylenglykole (PEGs) . Die Polyether können polymerisierbare bzw. vernetzende Gruppen tragen und über diese ausgehärtet werden.
Das Gerüstmaterial ist vorteilhafterweise im Körper abbau¬ bar. Vorteilhafterweise kann der Abbau des Gerüstmaterials gesteuert werden. Vorzugsweise ist der Abbau zellvermittelt gesteuert. Dies hat den Vorteil, dass der Abbau proportio¬ nal zur Gewebeneubildung erfolgt.
Vorzugsweise ist das Gerüstmaterial zelladhäsiv. Bei einer vorteilhaften Ausführungsform weist das Gerüstmaterial adhäsive Gruppen auf, an die Vermittlermoleküle für Wachstumsfaktoren und/oder Wachstumsfaktoren bevorzugt reversibel gebunden werden können. Die Vermittlermoleküle dienen bevorzugt zur Stabilisierung und Bindung der Wachs- tumsfaktoren .
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform weist das Gerüstmaterial im Körper abbaubare Gruppen auf. Bei den abbaubaren Gruppen handelt es sich bevorzugt um durch Proteinase, z. B. durch MMP-2, abbaubare Gruppen.
Die adhäsiven und/oder im Körper abbaubaren Gruppen sind bevorzugt geeignete Aminosäuresequenzen.
Wachstumsfaktoren sind Proteine, die die Zellproliferation und -differenzierung fördern. Im Rahmen der Bildung von Hartgewebe, sowohl Dentin wie auch Knochen, werden Wachs- tumsfaktoren ins Hartgewebe eingelagert, die bioaktiv blei¬ ben beziehungsweise aktiviert werden können. Die Erfindung hat erkannt, dass beide Hartgewebe somit als Reservoir für diese Wachstumsfaktoren dienen können. Eine Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe ist eine Lösung, die dazu vorgesehen ist mit tierischem oder menschlichem Hartgewebe, z.B. im Knochen oder im Zahn, in Kontakt gebracht zu werden und dazu geeignet ist, im Hartgewebe ge¬ bundene Wachstumsfaktoren freizusetzen. Die Freisetzung kann durch eine Demineralisation des Hartgewebes bzw. dessen Oberflächenschicht, beispielsweise durch Säureeinwir¬ kung und/oder Calciumkomplexierung, bevorzugt jedoch durch Calciumkomplexierung erfolgen, wodurch im Hartgewebe gebundene Wachstumsfaktoren exponiert werden. Die Wachstumsfak- toren können dabei auch in Lösung gebracht werden. Ein im
Rahmen der Erfindung bevorzugtes Hartgewebe ist Zahnhartge¬ webe, insbesondere Dentin. Während der Dentinbildung zum Zeitpunkt der Zahnentwicklung werden von dentinbildenden Zellen verschiedene Wachstumsfaktoren gebildet, welche in die Dentinmatrix eingebettet werden und dort bioaktiv blei¬ ben bzw. durch das erfindungsgemäße Verfahren bioaktiviert werden. Dabei handelt es sich um ein Gemisch aus Wachstums¬ faktoren. Durch die Konditionierung mittels der Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe werden Wachstumsfaktoren freigesetzt. Ein Teil geht in die Spüllösung über, ein Teil bleibt, bspw. an das freigelegte Kollagengerüst des Den¬ tins, gebunden.
Die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe enthält mindestens ein Demineralisierungsmittel . Im Rahmen der Erfindung be¬ zeichnet der Begriff Demineralisierungsmittel ein Mittel, welches dazu geeignet ist im Hartgewebe, z. B. im Dentin oder Knochen, gebundene Wachstumsfaktoren freizusetzen.
Ferner soll das Demineralisierungsmittel nicht zu einer De¬ naturierung der Wachstumsfaktoren führen.
Das mindestens eine Demineralisierungsmittel ist vorzugs- weise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Säuren, Salz¬ bildnern und Chelatbildnern . Ein vorteilhafter Salzbildner ist z. B. Dinatriumhydrogenphos- phat/Natriumhydrogenphosphat . Andere geeignete Bildner von (schwerlöslichen) Calciumsalzen können auch Verwendung fin- den. Eine vorteilhafte Säure ist Zitronensäure. Zitronen¬ säure, bzw. deren Salze, bevorzugt Alkalimetallverbindungen, insbesondere des Natriums, ist auch ein Calciumchelat- bildner. Chelatbildner sind im Rahmen der Erfindung bevorzugte Demineralisierungsmittel. Vorteilhafte Chelatbildner sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EDTA (Ethylen- diamintetraeesigsäure bzw. deren Salze, bevorzugt Alkalime¬ tallverbindungen, insbesondere des Natriums) , EGTA (Ethyl- englycol-bis (aminoethylether) -Ν,Ν,Ν' ,Ν' -tetraessigsäure bzw. deren Acetate, bevorzugt Alkalimetallsalze, insbeson- dere des Natriums.) und Zitronensäure bzw. Citrate, bevor¬ zugt Alkalimetallcitrate, insbesondere des Natriums. Es ist vorteilhaft, wenn die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe einen pH-Wert von größer 4, vorzugsweise einen pH-Wert von größer 5 aufweist. Vorzugsweise kann die Spül¬ lösung zum Spülen von Hartgewebe einen pH-Wert von 4 bis 10, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 9, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 8, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 6,5 bis 7,5, besonders bevorzugt einen pH-Wert von 7 aufweisen. Zu beachten ist hierbei, dass bei Verwendung von Säuren, ein pH-Wert > 6 der Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe nur bevorzugt ist, wenn die Säure gleichzeitig ein guter Calciumsalzbildner oder Calcium- chelatbildner ist. Zur Einstellung des pH-Wertes kann die Spüllösung geeignete Puffersysteme enthalten, beispielswei¬ se Phosphatpuffer (NaH2P04/Na2HP04) .
Im Rahmen der Erfindung ist es vorteilhaft, wenn die Konzentration des mindestens einen Demineralisierungsmittels in der Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe mindestens 5 Gew.-%, weiter vorzugsweise mindestens 10 Gew.-%, weiter vorzugsweise 10 Gew.-% bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt
10 Gew.-% bis 17 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt 17 Gew.-% beträgt .
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung enthält die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe als Chelatbildner EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure bzw. Ethylendiamintetra- acetat) . Vorteilhafterweise handelt es sich bei der Spüllö¬ sung zum Spülen von Hartgewebe um eine wässrige EDTA- Lösung. EDTA-Lösungen finden unter anderem Anwendung in der Endodontie, wo sie beispielsweise zur Entfernung einer
Schmierschicht im Rahmen einer Wurzelkanalbehandlung eingesetzt werden. Im Stand der Technik werden diese Lösungen nach der Entnahme aus dem tierischen bzw. menschlichen Kör- per, d.h. nach der Anwendung, verworfen. Demgegenüber hat die Erfindung erkannt, dass bei der Anwendung der Spüllö¬ sung körpereigene, im Hartgewebe gebundene Wachstumsfakto¬ ren freigesetzt werden, die in ein Biomaterial eingebunden und zur Geweberegeneration genutzt werden können.
Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren sieht die Be¬ reitstellung einer einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung für Hartgewebe vor. Hierbei han- delt es sich um eine Spüllösung, die über einen bestimmten Zeitraum mit tierischem oder menschlichem Hartgewebe, z. B. Knochen oder Zahnhartgewebe, in Kontakt war. Die Spüllösung enthält mindestens ein Demineralisierungsmittel für Hartge¬ webe und ein durch Kontakt der Spüllösung mit dem Hartgewe- be aus dem Hartgewebe gewonnenes Wachstumsfaktorgemisch. Bei dem mindestens einen Demineralisierungsmittel in der einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung handelt es sich um ein oben beschriebenes Deminera¬ lisierungsmittel. Es kann vorteilhafterweise ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Säuren, Salzbildnern und Chelatbildnern . Bevorzugt ist das mindestens eine Deminera¬ lisierungsmittel vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EDTA (Ethylendiamintetraeesigsäure bzw. Ethy- lendiamintetraacetat ) , EGTA (Ethylenglycol- bis (aminoethylether) -N, , Ν' , N' -tetraessigsäure bzw. Ethyl- englycol-bis (aminoethylether) -Ν,Ν,Ν' ,N'tetraacetat) und Zitronensäure bzw. Citrat. Besonders bevorzugte Deminerali¬ sierungsmittel sind Zitronensäure bzw. Citrat und EDTA. Das Wachstumsfaktorgemisch in der einem tierischen oder mensch- liehen Körper entnommenen Spüllösung enthält in der Regel alle im Hartgewebe vorkommenden Wachstumsfaktoren, wobei das Verhältnis der Wachstumsfaktoren zueinander in der Spüllösung dem natürlichen Verhältnis der Wachstumsfaktoren im Hartgewebe entspricht.
Vorteilhafterweise weist die einem tierischen oder mensch- liehen Körper entnommene Spüllösung Wachstumsfaktoren auf, deren Konzentration in der Spüllösung jeweils zwischen 0,0001 ng/ml und 1000 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 100 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,0001 ng/ml und 50 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 10 ng/ml liegt.
Vorteilhafterweise enthält die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung mindestens 0,01 ng/ml eines transformierenden Wachstumsfaktors (TGF) , vor- zugsweise mindestens 0,05 ng/ml TGF, weiter vorzugsweise mindestens 0,1 ng/ml TGF, besonders bevorzugt mindestens 0,3 ng/ml TGF. Bei einer Ausführungsform der Erfindung enthält die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung zwischen 0,01 ng/ml und 500 ng/ml, vorzugs- weise zwischen 0,01 ng/ml und 100 ng/ml, besonders bevor¬ zugt zwischen 0,1 ng/ml und 50 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,1 ng/ml und 10 ng/ml TGF. Ein bevorzugter transformierender Wachstumsfaktor ist TGF-beta- Wachstumsfaktor (TGF-ß) . Ein besonders bevorzugter trans- formierender Wachstumsfaktor ist der transformierende
Wachstumsfaktor-beta-1 (TGF-ß-1) .
Vorteilhafterweise enthält die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung mindestens 0,0001 ng/ml vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) , vorzugsweise mindestens 0,001 ng/ml VEGF. Bei einer Ausfüh¬ rungsform der Erfindung enthält die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung zwischen 0,0001 ng/ml und 5 ng/ml VEGF, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml VEGF, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml VEGF, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml VEGF.
Vorteilhafterweise enthält die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung mindestens 0,0001 ng/ml Fibroblasten Wachstumsfaktor (FGF) , vorzugsweise mindestens 0,001 ng/ml FGF. Bei einer Ausführungsform der Er- findung enthält die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung zwischen 0,0001 ng/ml und 5 ng/ml FGF, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml FGF, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml FGF, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml FGF. Ein bevorzugter Fibroblasten Wachstumsfaktor ist der Fibroblasten Wachstumsfaktor 2 (FGF-2).
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform enthält die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung zwischen 0,0001 ng/ml und 100 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml eines Wachstumsfaktors, der aus¬ gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den in Zahnhartge- webe und Knochen vorkommenden Wachstumsfaktoren.
In einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung zwischen 0,0001 ng/ml und 100 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml ei¬ nes Wachstumsfaktors, der ausgewählt ist aus der Gruppe be- stehend aus Plättchen-assoziierten Wachstumsfaktoren
(PDGF) , Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP) , Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF) und Epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF) .
Vorzugsweise weist die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung einen pH-Wert von größer 4, besonders bevorzugt von größer 5 auf. Vorteilhafte pH-Werte für die einem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung liegen zwischen 4 und 10, vorzugsweise zwischen 5 und 9, weiter vorzugsweise zwischen 5 und 8, besonders bevorzugt zwischen 6,5 und 7,5, ganz besonders bevor¬ zugt bei einem pH-Wert von 7.
Erfindungsgemäß wird das Gerüstmaterial mit mindestens ei¬ nem Wachstumsfaktor beladen. Das Beladen des Gerüstmaterials erfolgt erfindungsgemäß durch Inkontaktbringen der der einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung mit dem Gerüstmaterial. Das Inkontaktbringen kann das Aufbringen bzw. das Einbringen der Spüllösung auf bzw. in das Gerüstmaterial umfassen. Vorzugsweise erfolgt das Beladen des Gerüstmaterials durch Mischen der Spüllösung mit dem Gerüstmaterial. In Abhängigkeit davon, ob das Ge¬ rüstmaterial fest oder flüssig, löslich oder unlöslich ist, wird eine Dispersion bzw. Lösung durch Mischung von Gerüstmaterial und Spüllösung hergestellt.
In einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung wird das Gerüstmaterial mit mindestens einem in Knochen oder Zahnhartgewebe natürlich vorkommenden Wachstumsfaktor beladen. Bevorzugt ist der mindestens eine Wachstumsfaktor aus¬ gewählt aus der Gruppe bestehend aus transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF) , vaskulären endothelialen Wachs- tumsfaktoren (VEGF) , Fibroblasten Wachstumsfaktoren (FGF) , Plättchen-assoziierten Wachstumsfaktoren (PDGF) , Knochen- morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP) , Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF) und Epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF) . Innerhalb der Gruppe der Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP) ist der Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktor 2 (BMP-2) besonders bevorzugt. Vorzugsweise wird das Gerüstmaterial mit dem mindestens einen Wachstums¬ faktor in Mengen zwischen 0,0001 ng/ml und 100 ng/ml, vor- zugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, besonders be¬ vorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml beladen.
Vorteilhafterweise wird das Gerüstmaterial mit einem Wachs- tumsfaktorgemisch beladen. Das Wachstumsfaktorgemisch enthält mindestens zwei Wachstumsfaktorkomponenten.
Bevorzugt ist von den mindestens zwei Wachstumsfaktorkompo¬ nenten mindestens eine Wachstumsfaktorkomponente ein trans- formierender Wachstumsfaktor (TGF) , wobei der transformierende Wachstumsfaktor TGF-beta-Wachstumsfaktor (TGF-ß) besonders bevorzugt ist und wobei der transformierende Wachs- tumsfaktor-beta-1 (TGF-ß-1) ganz besonders bevorzugt ist. Vorteilhafterweise wird das Gerüstmaterial mit mindestens 0,01 ng/ml TGF, vorzugsweise mindestens 0,05 ng/ml TGF, weiter vorzugsweise mindestens 0,1 ng/ml TGF, besonders be¬ vorzugt mindestens 0,3 ng/ml TGF beladen. In einer vorteil¬ haften Ausführungsform wird das Gerüstmaterial mit einer Menge an TGF zwischen 0,01 ng/ml und 500 ng/ml, vorzugswei- se zwischen 0,01 ng/ml und 100 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,1 ng/ml und 50 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,1 ng/ml und 10 ng/ml beladen. Bevorzugt ist von den mindestens zwei Wachstumsfaktoren mindestens ein Wachstumsfaktor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF)und Fibroblasten Wachstumsfaktoren (FGF) . In der Gruppe der Fibroblasten Wachstumsfaktoren ist der Fibroblasten Wachstumsfaktor 2 (FGF-2) besonders bevorzugt.
Vorteilhafterweise wird das Gerüstmaterial mit mindestens 0,0001 ng/ml VEGF, vorzugsweise mit mindestens 0,001 ng/ml VEGF beladen. In einer vorteilhaften Ausführungsform wird das Gerüstmaterial mit einer Menge an VEGF zwischen 0,0001 ng/ml und 5 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml beladen.
Vorteilhafterweise wird das Gerüstmaterial mit mindestens 0,0001 ng/ml FGF, vorzugsweise mindestens 0,001 ng/ml FGF beladen. In einer vorteilhaften Ausführungsform wird das Gerüstmaterial mit einer Menge an FGF zwischen 0,0001 ng/ml und 5 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml beladen.
Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung entsprechen die Wachstumsfaktorkomponenten des Wachstumsfaktorgemisches, mit dem das Gerüstmaterial beladen wird, den Wachstumsfaktorkomponenten im Wachstumsfaktorgemisch der einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung, d.h. das Gerüstmaterial wird mit allen Wachstums¬ faktorkomponenten beladen, die sich in der Spüllösung finden . Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Spüllösung in Schritt c) in einer Menge auf das Gerüst¬ material gebracht, die eine Beladung des Gerüstmaterials mit einem Wachstumsfaktorgemisch im Größenordnungsbereich der Konzentration in der Spüllösung oder sogar größer ermöglicht .
Die Immobilisierung der Wachstumsfaktoren im oder am Bioma- terial bzw. Gerüstmaterial erfolgt bevorzugt über schwache, nicht-kovalente Bindungen, sodass sie reversibel ist. Die Bindung kann über Vermittlermoleküle, wie Heparin erfolgen.
Im Rahmen der Erfindung kann vorgesehen sein, dass die ei- nem tierischen oder menschlichen Körper entnommene Spüllösung vor dem Beladen des Gerüstmaterials zur Verwendung mit dem Gerüstmaterial aufbereitet wird. Die Aufbereitung der Spüllösung umfasst jedwede Schritte, die die Verwendung der Spüllösung in einem Biomaterial erfordert. Insbesondere kann die Aufbereitung der Spüllösung die Sterilisation der Spüllösung und/oder die Inaktivierung von Toxinen in der Spüllösung und/oder die Entfernung von Toxinen aus der Spüllösung und/oder die Zugabe von einem oder mehreren Hilfsstoffen zu der Spüllösung umfassen.
Vorzugsweise umfasst die Aufbereitung der einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung die Zugabe von mindestens einer pharmazeutisch wirksamen Substanz und/oder die Zugabe von mindestens einem Vermittler zur Stabilisierung und Bindung von Wachstumsfaktoren. Bevorzugt handelt es sich bei der pharmazeutisch wirksamen Substanz um ein Antibiotikum. Im Rahmen der Erfindung bezeichnet der Begriff Vermittler chemische Stoffe bzw. Moleküle, insbe- sondere Biopolymere, welche die Bindung mindestens eines Wachstumsfaktors an das Gerüstmaterial bewirkt oder unter¬ stützt. Ein bevorzugter Vermittler ist Heparin. Heparin ist ein sulfatiertes und damit negativ geladenes Glykosamino- glykan, welches natürlich in der extrazellulären Matrix vorkommt und bestimmte Wachstumsfaktoren (Heparin-bindende Wachstumsfaktoren) binden sowie vor proteolytischem Abbau schützen kann. Dieser Effekt kann in synthetischen Matrizes imitiert werden. Ein Vorteil der Aufbereitung der Spüllö- sung mit Heparin liegt darin, dass die aus dem Dentin herausgelösten heparin-bindenden Wachstumsfaktoren über Heparin an das Gerüstmaterial gebunden werden können und somit deren Halbwertszeit verlängert werden kann. Die Aufbereitung der einem tierischen oder menschlichen
Körper entnommenen Spüllösung kann die Entfernung von Demi- neralisierungsmittel aus der Spüllösung umfassen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das mindestens eine Demineralisierungsmittel EDTA und die Aufberei- tung der Spüllösung umfasst den Abbau von EDTA und/oder die teilweise oder vollständige Entfernung von EDTA und/oder dessen Abbauprodukten aus der Spüllösung. Die Entfernung von EDTA aus der Spüllösung kann die Rekomplexierung von EDTA und die Entfernung und/oder den Abbau des EDTA- Komplexes umfassen. Das EDTA kann vorzugsweise durch die
Zugabe löslicher Eisen (III) -salze zur Spüllösung rekomple- xiert werden. Durch Bestrahlung mit UV-Licht kann der so entstandene Komplex zerstört werden. Die Zerfallsprodukte sind nicht oder weniger toxisch als EDTA. Bei einer bevor- zugten Ausführungsform der Erfindung kann die Aufbereitung deshalb den Abbau von EDTA unter Zugabe von Eisen (III)- salzen und/oder durch Bestrahlung mit UV-Licht umfassen. Die Bestrahlung mit UV-Licht erfolgt bevorzugt im Wellen- längenbereich über 200 nm. Im Rahmen der Erfindung kann die Aufbereitung der Spüllösung vorteilhafterweise die teilwei¬ se oder vollständige Entfernung von EDTA aus der Spüllösung und/oder von dessen Abbauprodukten mittels geeigneter Anio- nentauscherharzpartikel , bspw. mittels quartärer Ammonium¬ gruppen gebunden an geeignete Trägerpolymere, bspw. vernetzte Agarosegele, umfassen. Falls die Spüllösung EDTA enthält, erfolgt der Abbau von EDTA und/oder die teilweise oder die vollständige Entfernung von EDTA und/oder dessen Abbauprodukten aus der Spüllösung vorzugsweise zu Beginn der Aufbereitung bevor weitere Aufbereitungsschritte durch¬ geführt werden.
Ein im Rahmen der Erfindung bevorzugtes Hartgewebe ist Zahnhartgewebe, insbesondere Dentin.
Das wachstumsfaktorbeladene Biomaterial kann autologe oder allogene Stammzellen enthalten. Bei einer bevorzugten Ausführungsform enthält das wachstumsfaktorbeladene Biomateri- al autologe Stammzellen. Bei einer weiteren bevorzugten
Ausführungsform enthält das wachstumsfaktorbeladene Bioma¬ terial keine Stammzellen.
Die Erfindung sieht auch ein wachstumsfaktorbeladenes Bio- material zur Verwendung bei der Geweberegeneration vor, welches durch das oben beschriebene Verfahren erhältlich ist .
Daneben sieht die Erfindung ein mit einem Wachstumsfaktor- gemisch aus mindestens zwei natürlich im Dentin vorkommenden Wachstumsfaktoren beladenes Biomaterial zur Verwendung bei der Pulpageweberegeneration vor, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass das Gewichtsverhältnis der Wachs- tumsfaktoren zueinander im Biomaterial mit dem natürlichen Gewichtsverhältnis der Wachstumsfaktoren zueinander im Dentin korreliert ist. Bevorzugt sind die mindestens zwei na¬ türlich im Dentin vorkommenden Wachstumsfaktoren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus transformierenden Wachstums¬ faktoren (TGF) , vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren
(VEGF) , Fibroblasten Wachstumsfaktoren (FGF) , Plättchen- assoziierten Wachstumsfaktoren (PDGF) , Knochen- morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP) , Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF) und Epidermalen Wachstumsfaktoren
(EGF) . Innerhalb der Gruppe der Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP) ist der Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktor 2 (BMP-2) besonders bevorzugt. Vorteilhaf¬ terweise kann das Biomaterial mit einem Wachstumsfaktorge¬ misch aus mindestens drei, vorzugsweise mindestens vier, vorzugsweise mindestens fünf, besonders bevorzugt mindes¬ tens sechs natürlich im Dentin vorkommenden Wachstumsfaktoren beladen sein, wobei die Wachstumsfaktoren vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus transformie¬ renden Wachstumsfaktoren (TGF) , vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF) , Fibroblasten Wachstumsfaktoren
(FGF) , Plättchen-assoziierten Wachstumsfaktoren (PDGF) , Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP) , Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF) und Epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF) . Innerhalb der Gruppe der Knochen- morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP) ist der Knochen- morphogenetischen Wachstumsfaktor 2 (BMP-2) besonders bevorzugt. Ganz besonders bevorzugt kann das Biomaterial mit einem Wachstumsfaktorgemisch aus allen natürlich im Dentin vorkommenden Wachstumsfaktoren beladen sein. Ein entsprechendes Biomaterial kann durch das oben beschriebene Ver¬ fahren erhalten werden. Die Korrelation des Gewichtsverhältnisses der Wachstumsfaktoren zueinander im Biomaterial mit dem natürlichen Gewichtsverhältnis der Wachstumsfakto¬ ren zueinander im Dentin ergibt sich dann über das Herstellungsverfahren. Es ist aber auch möglich, dass die Spüllösung bzw. die absolute Konzentration und/oder das Mengen- Verhältnis der Wachstumsfaktoren im Dentin zueinander im Biomaterial nachgeahmt werden. Die hierfür verwendeten Wachstumsfaktoren können von Menschen oder Tieren stammen oder gentechnisch hergestellt sein. Das Biomaterial enthält bevorzugt mindestens einen transformierenden Wachstumsfak- tor (TGF) , insbesondere TGF-ß-1, in einer Menge zwischen
0,01 ng/ml und 500 ng/ml. Das Mengenverhältnis eines trans¬ formierenden Wachstumsfaktors (TGF), insbesondere TGF-ß-1, im Biomaterial zu einem vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) im Biomaterial ist in einer bevorzugten Aus- führungsform TGF:VEGF gleich 2:1 bis 100:1, besonders bevorzugt TGF : VEGF gleich 2:1 bis 50:1 oder 2:1 bis 20:1. Das Mengenverhältnis eines transformierenden Wachstumsfaktors (TGF), insbesondere TGF-ß-1, im Biomaterial zu einem Fib¬ roblasten Wachstumsfaktoren (FGF) im Biomaterial beträgt in einer bevorzugten Ausführungsform TGF: FGF gleich 2:1 bis
100:1, besonders bevorzugt TGF:FGF gleich 2:1 bis 50:1 oder 2:1 bis 20:1.
Die Erfindung betrifft zudem ein Kit zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials zur Verwendung bei der Geweberegeneration. Der erfindungsgemäße Kit umfasst a) Gerüstmaterial und b) eine Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe, die mindestens ein Demine- ralisierungsmittel für Hartgewebe enthält. Für den erfindungsgemäßen Kit geeignete Gerüstmaterialien wurden bereits im Kontext des erfindungsgemäßen Herstel¬ lungsverfahrens beschrieben. Auf diese Erläuterungen wird Bezug genommen. Die dort beschriebenen Gerüstmaterialien können auch im Rahmen des erfindungsgemäßen Kits als Komponente a) eingesetzt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits ist das Gerüstmaterial ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus synthetischen Poly¬ meren, natürlichen Biomaterialien, insbesondere Polymeren und Kombinationen der Vorgenannten; wobei das Gerüstmaterial bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus selbstorganisierenden Peptiden (SAP) , Polyethern, Poly- milchsäure, Polyglykolsäure (PGA) , Copolymeren von Poly- milchsäure mit Polyethern (PLGA) , Poly-s-Caprolacton (PCL) , Polyurethanen, Kollagen, Fibrin, Polysacchariden und Kombinationen der Vorgenannten; wobei das Gerüstmaterial besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus selbstorganisierenden Peptiden (SAP) , Kollagen, Fibrin und Kombinationen der Vorgenannten. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Kits weist das Gerüstmaterial adhäsive Gruppen auf, an die Vermittlermoleküle für Wachs¬ tumsfaktoren und/oder Wachstumsfaktoren reversibel gebunden werden können und/oder es weist im Körper abbaubare Gruppen auf. Die adhäsiven und/oder abbaubaren Gruppen sind vorzugsweise Aminosäuresequenzen.
Die Spüllösung (Komponente b) ist dazu vorgesehen, mit tie¬ rischem oder menschlichem Hartgewebe, z.B. im Knochen oder im Zahn, in Kontakt gebracht zu werden. Für den erfindungs¬ gemäßen Kit geeignete Spüllösungen zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe beziehungsweise geeignete Demineralisierungsmittel wurden bereits im Kontext des er¬ findungsgemäßen Herstellungsverfahrens beschrieben. Auf diese Erläuterungen wird Bezug genommen. Die dort beschrie¬ benen Spüllösungen zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe können auch im Rahmen des erfindungsgemä¬ ßen Kits als Komponente b) eingesetzt werden.
Vorteilhafterweise kann es sich bei der Komponente b) des Kits um eine anwendungsfertige Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe handeln. Eine anwendungsfertige Spüllösung enthält das mindestens eine De- mineralisierungsmittel bereits in einer anwendungsfertigen Konzentration. Dies hat den Vorteil, dass die Lösung vor der Anwendung mit dem Hartgewebe z. B. nicht mehr extra verdünnt werden muss. Vorzugsweise beträgt die Konzentrati¬ on des mindestens einen Demineralisierungsmittels in der Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe mindestens 5 Gew.-%, weiter vorzugsweise mindestens 10 Gew.-%, weiter vorzugs¬ weise 10 Gew.-% bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 10 Gew.- % bis 17 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt 17 Gew.-%. Die als Komponente b) des Kits vorgesehene Spüllösung zum
Spülen von Hartgewebe kann vorteilhafterweise einen pH-Wert von größer 4, vorzugsweise einen pH-Wert von größer 5, wei¬ ter vorzugsweise einen pH-Wert von 4 bis 10, weiter vor¬ zugsweise einen pH-Wert von 5 bis 9, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 8, weiter vorzugsweise einen pH- Wert von 6,5 bis 7,5, besonders bevorzugt einen pH-Wert von 7 aufweisen.
Bei einem bevorzugten Kit ist das mindestens eine Deminera- lisierungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
Säuren, Salz- und Chelatbildnern wobei das mindestens eine Demineralisierungsmittel bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EDTA (Ethylendiamintetraeesigsäure bzw. Ethylendiamintetraacetat ) , EGTA (Ethylenglycol- bis (aminoethylether) -N, , Ν' , N' -tetraessigsäure bzw. Ethyl- englycol-bis (aminoethylether) -Ν,Ν,Ν' ,N'tetraacetat) und Zitronensäure/Citrat.
Bei der Komponente b) des Kits kann es sich bevorzugt um eine wässrige Lösung eines Calciumchelatbildners handeln.
Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform des Kits ist das mindestens eine Demineralisierungsmittel Zitronen¬ säure bzw. Citrat und die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe weist einen pH-Wert von größer 4, vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 7, weiter vorzugsweise von 4,5 bis 6,5 auf. Bei einer anderen besonders bevorzugten Ausführungs- form des Kits ist das mindestens eine Demineralisierungs¬ mittel EDTA und die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe weist einen pH-Wert von mindestens 6, vorzugsweise einen pH-Wert von mindestens 7, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 7 bis 9 auf.
Ein erfindungsgemäßer Kit kann vorteilhafterweise ferner mindestens eine Komponente umfassen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mitteln zur Entfernung von EDTA aus einer Lösung, Vermittlern, welche die Bindung mindes- tens eines Wachstumsfaktors an das Biomaterial, insbesonde¬ re des Gerüstmaterials bewirken oder unterstützen, und ei¬ ner Vorrichtung zur Applikation der Spüllösung. Die Mittel zur Entfernung von EDTA aus einer Lösung können bevorzugt Eisen (III) -Salze und/oder Anionentauscherharze umfassen. Ein bevorzugter Vermittler ist Heparin. Die Vorrichtung zur Applikation der Spüllösung umfasst vorzugsweise eine Sprit¬ ze und eine Kanüle, besonders bevorzugt eine stumpfe Endo- Kanüle . Ein im Rahmen der Erfindung bevorzugtes Hartgewebe ist Zahnhartgewebe, insbesondere Dentin. Es ist ein besonderer Vorteil der Erfindung, dass sie ein verbessertes Behandlungsverfahren zur Geweberegeneration, insbesondere ein verbessertes Verfahren zur Wurzelkanalbe¬ handlung erlaubt. Das Konzept dieses verbesserten Behandlungsverfahrens be¬ ruht auf der Nutzung, Aktivierung und Unterstützung der körpereigenen Mechanismen zur Gewebebildung durch 1) Freisetzung körpereigener, im Hartgewebe gebundener Wachstumsfaktoren, 2) Einbindung dieser Wachstumsfaktoren in ein Ge- rüst- bzw. Biomaterial, 3) Einbringen des wachstumsfaktor- beladenen Biomaterials in den Körper und damit Rückführung der körpereigenen Wachstumsfaktoren, und 4) Mobilisierung residenter Stammzellen durch die enthaltenen Wachstumsfaktoren. Das Biomaterial fungiert hierbei als Matrix für die Geweberegeneration, welche auch ohne Zugabe von exogenen Stammzellen und/oder exogenen Wachstumsfaktoren erfolgen soll .
Das Behandlungsverfahren umfasst folgende Schritte: a) Bereitstellen einer Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe, die mindestens ein Demineralisierungsmittel für Hartgewebe enthält, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Säuren, Calciumsalz- und Calcium-Chelatbildnern; b) Kontaktieren des Hartgewebes mit der Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe unter Bedingungen, die ein Freisetzen im Hartgewebe gebundener Wachstumsfaktoren ermöglicht; c) Entnahme der mit Wachstumsfaktoren angereicherten
Spüllösung aus dem tierischen oder menschlichen Körper; d) Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials, gemäß dem oben beschriebenen In-Vi tro-Verfahren der Erfindung unter Verwendung der mit Wachstumsfaktoren angereicherten Spüllösung aus Schritt c) ; e) Einbringen des wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials in einen tierischen oder menschlichen Körper.
Ein im Rahmen des Verfahrens bevorzugtes Hartgewebe ist Zahnhartgewebe, insbesondere Dentin. Es kann sich bei dem Hartgewebe allerdings auch um Knochengewebe handeln. Bevor¬ zugt handelt es sich um menschliches Hartgewebe. Vorzugs¬ weise wird in Schritt e) das wachstumsfaktorbeladene Bioma¬ terial in den Körper eingebracht, mit dessen Hartgewebe die Spüllösung zum Spülen von menschlichen oder tierischen Hartgewebe in Schritt b) kontaktiert wurde, d.h. das Bioma¬ terial ist im Hinblick auf den menschlichen oder tierischen Körper in welchen es eingebracht wird ein autologes Bioma¬ terial. Das Einbringen von autologen Biomaterialien ist bevorzugt, da keine Immunantwort zu erwarten ist. Das Bioma¬ terial kann autologe oder allogene Stammzellen enthalten. Bei einem bevorzugten Behandlungsverfahren enthält das Biomaterial autologe Stammzellen. Bei einem weiteren bevorzug¬ ten Behandlungsverfahren enthält das Biomaterial keine Stammzellen . Für das Behandlungsverfahren geeignete Spüllösungen zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe beziehungsweise geeignete Demineralisierungsmittel wurden be¬ reits im Kontext des erfindungsgemäßen Herstellungsverfah- rens bzw. des erfindungsgemäßen Kits beschrieben. Auf diese Erläuterungen wird Bezug genommen. Die dort beschriebenen Spüllösungen zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe können auch im oben beschriebenen Behandlungsverfahren eingesetzt werden.
Vorteilhafterweise weist die Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe aus Schritt a) einen pH-Wert von größer 4, vorzugsweise einen pH-Wert von größer 5, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 4 bis 10, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 9, weiter vor¬ zugsweise einen pH-Wert von 5 bis 8, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 6,5 bis 7,5, besonders bevorzugt einen pH-Wert von 7 auf. Es ist vorteilhaft, wenn die Konzentration des mindestens einen Demineralisierungsmittels in der Spüllösung zum Spü¬ len von Hartgewebe aus Schritt a) mindestens 5 Gew . ~6 , wei ter vorzugsweise mindestens 10 Gew.-%, weiter vorzugsweise 10 Gew.-% bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 10 Gew.-% bis 17 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt 17 Gew.-% beträgt.
Vorzugsweise ist das mindestens eine Demineralisierungsmit¬ tel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EDTA (Ethylen- diamintetraeesigsäure bzw. Ethylendiamintetraacetat ) , EGTA (Ethylenglycol-bis (aminoethylether) -Ν,Ν,Ν' ,Ν' - tetraessigsäure bzw. Ethylenglycol-bis (aminoethylether) - N, N, Ν' , N' tetraacetat ) und Zitronensäure/Citrat . Bei einem bevorzugten Behandlungsverfahren enthält die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe aus Schritt a) als Demineralisie- rungsmittel EDTA (z.B. Dinatriumsalz) . Vorteilhafterweise handelt es sich bei der Spüllösung um eine wässrige EDTA- Lösung. Vorzugsweise beträgt die Konzentration von EDTA in der Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe mindestens 5 Gew.-%, weiter vorzugsweise mindes¬ tens 10 Gew.-%, weiter vorzugsweise 10 Gew.-% bis 17 Gew, - %, weiter vorzugsweise mindestens 15 Gew.-%, besonders be¬ vorzugt 17 Gew.-%.
Das Kontaktieren des Hartgewebes mit Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe in Schritt b) kann beispielsweise unter Verwendung eines Spritzensystems erfolgen. Das Spritzensystem umfasst bevorzugt eine stumpfe Endokanüle. Bei einer vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung beträgt die Einwirkzeit der Spüllösung auf das Hartgewebe in Schritt b) zwischen 0,1 min und 30 min, vor¬ zugsweise zwischen 1 min und 30 min, weiter vorzugsweise zwischen 1 min und 20 min, weiter vorzugsweise zwischen 2 min und 15 min, besonders bevorzugt zwischen 5 min und 20 min, ganz besonders bevorzugt zwischen 5 min und 15 min.
Eine Schall-oder Ultraschall-unterstützte Aktivierung der Spüllösung kann erfolgen.
Die Entnahme in Schritt c) kann zum Beispiel mittels eines Spritzensystems erfolgen. Das Spritzensystem umfasst bevorzugt eine stumpfe Endokanüle. Schritt d) betrifft das bereits oben beschriebene erfin¬ dungsgemäße Herstellungsverfahren für ein mit mindestens einem Wachstumsfaktor beladenes Biomaterial mit der Maßga¬ be, dass die Spüllösung aus Schritt c) verwendet wird. Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren wurde bereits oben beschrieben. Auf diese Erläuterungen wird Bezug genom men .
Vorteilhafterweise weist das wachstumsfaktorbeladene Bioma terial mindestens einen in Knochen oder Zahnhartgewebe na¬ türlich vorkommenden Wachstumsfaktor auf. Bevorzugt ist de mindestens eine Wachstumsfaktor ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus transformierenden Wachstumsfaktoren (TGF) , vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF) , Fibroblasten Wachstumsfaktoren (FGF) , Plättchen-assoziierten Wachstumsfaktoren (PDGF) , Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP) , Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF) und Epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF) . Innerhalb der Gruppe der Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP) ist der Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktor 2 (BMP-2) besonders bevorzugt. Vorzugsweise enthält das Bio¬ material den mindestens einen Wachstumsfaktor in Mengen zwischen 0,0001 ng/ml und 500 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 100 ng/ml, weiter vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml.
Vorzugsweise enthält das Biomaterial ein Wachstumsfaktorge misch, welches mindestens zwei Wachstumsfaktoren enthält.
Bevorzugt ist von den mindestens zwei Wachstumsfaktoren mindestens ein Wachstumsfaktor ein transformierender Wachs tumsfaktor (TGF) , besonders bevorzugt ist der transformie¬ rende Wachstumsfaktor ein TGF-beta-Wachstumsfaktor (TGF-ß) ganz besonders bevorzugt der transformierende Wachstumsfak tor-beta-1 (TGF-ß-1). Vorteilhafterweise enthält das bela¬ dene Biomaterial mindestens 0,01 ng/ml TGF, vorzugsweise mindestens 0,05 ng/ml TGF, weiter vorzugsweise mindestens 0,1 ng/ml TGF, besonders bevorzugt mindestens 0,3 ng/ml TGF. Vorteilhafterweise enthält das beladene Biomaterial zwischen 0,01 ng/ml und 500 ng/ml, bevorzugt zwischen 0,01 ng/ml und 100 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,1 ng/ml und 50 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,1 ng/ml und 10 ng/ml TGF.
Bevorzugt ist von den mindestens zwei Wachstumsfaktoren mindestens ein Wachstumsfaktor ausgewählt aus der Gruppe der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktoren (VEGF)und Fibroblasten Wachstumsfaktoren (FGF) , besonders bevorzugt ist der Fibroblasten Wachstumsfaktoren der Fibroblasten
Wachstumsfaktor 2 (FGF-2). Vorteilhafterweise enthält das beladene Biomaterial mindestens 0,0001 ng/ml VEGF, vorzugs¬ weise mindestens 0,001 ng/ml VEGF. Vorzugsweise enthält das beladene Biomaterial zwischen 0,0001 ng/ml und 5 ng/ml, weiter vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, be¬ sonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml VEGF. Vorteilhafterweise enthält das beladene Biomaterial mindestens 0,0001 ng/ml FGF, vorzugsweise mindestens 0,001 ng/ml FGF. Vorzugsweise enthält das beladene Biomaterial zwischen 0,0001 ng/ml und 5 ng/ml, weiter vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, besonders bevorzugt zwi¬ schen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml FGF.
Das beladene Biomaterial enthält bevorzugt weitere Wachs¬ tumsfaktoren. Diese sind vorzugsweise weitere im Zahnhart¬ gewebe und/oder Knochen vorkommende Wachstumsfaktoren. Die- se weiteren Wachstumsfaktoren können bevorzugt ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Plättchen-assoziierten Wachstumsfaktoren (PDGF) , Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP) , Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF), Epidermalen Wachstumsfaktoren (EGF) . Ein bevorzugter Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren ist der Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktor 2 (BMP-2).
Vorteilhafterweise enthält das beladene Biomaterial zwi- sehen 0,0001 ng/ml und 500 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 100 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, weiter vorzugsweise zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml eines im Zahnhartgewebe und/oder Knochen vor- kommenden Wachstumsfaktors. Vorteilhafterweise enthält das beladene Biomaterial zwischen 0,0001 ng/ml und 100 ng/ml, vorzugsweise zwischen 0,0001 ng/ml und 10 ng/ml, weiter vorzugsweise zwischen 0,001 ng/ml und 1 ng/ml, besonders bevorzugt zwischen 0,001 ng/ml und 0,1 ng/ml eines Wachs- tumsfaktors, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend der Plättchen-assoziierten Wachstumsfaktoren (PDGF) , Knochen-morphogenetischen Wachstumsfaktoren (BMP) , der Insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF), der Epidermalen
Wachstumsfaktoren (EGF) und der weiteren in Zahnhartgewebe und Knochen vorkommenden Wachstumsfaktoren.
Vorzugsweise entsprechen die Wachstumsfaktorkomponenten des Wachstumsfaktorgemisches, mit dem das Biomaterial beladen ist, den Wachstumsfaktorkomponenten im Wachstumsfaktorge- misch der Spüllösung aus Schritt c) , d.h. das Biomaterial ist mit allen Wachstumsfaktorkomponenten beladen, die sich in der dem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung aus Schritt c) finden. Das Biomaterial kann flüssig oder fest sein oder in Form eines Gels vorliegen. Es kann sich um jegliches bereits oben im Kontext des erfindungsgemäßen Herstellungsverfah- rens beschriebene Biomaterial handeln.
Vor dem Einbringen des wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials in einen Wurzelkanal können weitere Verfahrensschritte erfolgen. So können dem Biomaterial bzw. der Suspension o- der Lösung des (beladenen) Gerüstmaterials Suspensions¬ bzw. Lösungsmittel oder weitere Komponenten teilweise oder vollständig entzogen werden. Es können auch weitere Kompo¬ nenten zugefügt werden. Das Biomaterial kann vor oder nach dem Einbringen in einen Wurzelkanal teilweise oder voll- ständig gehärtet werden. Bevorzugt wird das Biomaterial im Wurzelkanal gehärtet bzw. härten gelassen. Bevorzugt er¬ folgt die Härtung mittels Polymerisation.
Die Erfindung erlaubt insbesondere ein verbessertes Verfah- ren zur Wurzelkanalbehandlung, umfassend die folgenden Schritte :
1. Eröffnung der Pulpakammer, vorzugsweise unter Koffer- dam-Abschirmung;
2. Entfernung des (geschädigten) Pulpagewebes , wobei a) eine partielle Entfernung erfolgt, wenn Teile der Pulpa sich noch im reversiblen Entzündungsstadium befinden, oder b) eine vollständige Entfernung bei irreversibler Schädigung oder Pulpanekrose erfolgt; Wurzelkanalaufbereitung, wobei a) bei vorheriger partieller Entfernung des Pulpage- webes (Schritt 2 a) eine geringfügige Erweite¬ rung des Wurzelkanals erfolgt, um die Desinfekti¬ on zu ermöglichen; b) bei vorheriger vollständiger Entfernung des Pul- pagewebes (Schritt 2 b) eine Aufweitung des Wur¬ zelkanals erfolgt, wobei die Wurzelspitze (Apex) auf mindestens 0,8 mm erweitert wird, um das Ein¬ wachsen von Zellen zur Regeneration und Blutge- fäßeinsprossung zu begünstigen;
Desinfektion des Wurzelkanalsystems, wobei die Desin¬ fektion beispielsweise mit Chlorhexidin, Natriumhypochlorit erfolgt;
Kontaktieren des Dentins mit einer Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe unter Bedingungen, die ein Freisetzten von mindestens einem im Dentin gebundenen Wachstumsfaktor ermöglichen, wobei die Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe mindestens ein Demineralisierungsmit- tel enthält, das ausgewählt ist aus der Gruppe beste¬ hend aus Säuren, Salz- und/oder Chelatbildnern;
Entnahme der mit mindestens einem Wachstumsfaktor ange¬ reicherten Spüllösung aus dem Körper;
Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials, gemäß dem oben beschriebenen in vitro Verfahren der Erfindung unter Verwendung der Spüllösung aus Schritt 6;
8. Einbringen des wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials in den Wurzelkanal.
Falls in Schritt 2 eine vollständige Entfernung des Pul- pagewebes erfolgt, ist es vorteilhaft zwischen den Schrit¬ ten 4 und 5 für einen Zeitraum von 1 bis 2 Wochen eine me- dikamentöse Einlage in den Wurzelkanal einzubringen. In diesem Fall wird Schritt 4 vor Aufnahme von Schritt 5 wie¬ derholt. Die medikamentöse Einlage kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Calciumhydroxid-Pasten, Antibioti- ka-Kortikoid-Präparaten und Antibiotikamischungen.
Für das Verfahren zur Wurzelkanalbehandlung geeignete Spüllösungen zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe beziehungsweise geeignete Demineralisierungsmittel wurden bereits im Kontext des erfindungsgemäßen Herstel- lungsverfahrens bzw. des erfindungsgemäßen Kits beschrieben. Auf diese Erläuterungen wird Bezug genommen. Die dort beschriebenen Spüllösungen zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe können auch im oben beschriebenen Verfahren zur Wurzelkanalbehandlung eingesetzt werden.
Vorteilhafterweise weist die Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe einen pH-Wert von größer 4, vorzugsweise einen pH-Wert von größer 5, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 4 bis 10, weiter vorzugswei- se einen pH-Wert von 5 bis 9, weiter vorzugsweise einen pH- Wert von 6 bis 8, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 6,5 bis 7,5, besonders bevorzugt einen pH-Wert von 7 auf. Es ist vorteilhaft, wenn die Konzentration des mindestens einen Demineralisierungsmittels in der Spüllösung zum Spü¬ len von Hartgewebe mindestens 5 Gew.-%, weiter vorzugsweise mindestens 10 Gew.-%, weiter vorzugsweise 10 Gew.-% bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 10 Gew.-% bis 17 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt 17 Gew.-% beträgt.
Vorzugsweise ist mindestens eine Demineralisierungsmittel ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus EDTA (Ethylendia- mintetraeesigsäure bzw. Ethylendiamintetraacetat ) , EGTA (Ethylenglycol-bis (aminoethylether) -Ν,Ν,Ν' ,Ν' - tetraessigsäure bzw. Ethylenglycol-bis (aminoethylether) - N, N, Ν' , N' tetraacetat ) und Zitronensäure bzw. Citrat. Bei einem bevorzugten Verfahren zur Wurzelkanalbehandlung ent- hält die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe als Deminera¬ lisierungsmittel EDTA (Ethylendiamintetraacetat) . Vorteil¬ hafterweise handelt es sich bei der Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe um eine wässrige EDTA-Lösung. Vorzugsweise beträgt die Konzentration von EDTA in der Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe mindestens 5 Gew.-%, weiter vorzugsweise mindestens 10 Gew.-%, weiter vorzugsweise 10 Gew.-% bis 17 Gew,-%, weiter vorzugsweise mindestens 15 Gew.-%, besonders bevorzugt 17 Gew.-%. Eine im Rahmen des Verfahrens besonders bevorzugte Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe ist eine 10%-ige (w/w) bis 17%-ige (w/w) wässrige EDTA-Lösung mit einem pH-Wert von 7.
Das Kontaktieren des Dentins mit der Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe in Schritt 5 kann beispielsweise unter Verwendung eines Spritzensystems erfolgen. Das Spritzensystem umfasst bevorzugt eine Luer- Lock-Spritze und/oder eine stumpfe Endokanüle. Vorteilhaf- terweise beträgt die Einwirkzeit der Spüllösung auf das Dentin in Schritt 5 zwischen 0,1 min und 30 min, vorzugs¬ weise zwischen 1 min und 30 min, weiter vorzugsweise zwischen 1 min und 20 min, weiter vorzugsweise zwischen 2 min und 15 min, besonders bevorzugt zwischen 5 min und 20 min, ganz besonders bevorzugt zwischen 5 min und 15 min.
Die Entnahme in Schritt 6) kann zum Beispiel mittels eines Spritzensystems erfolgen. Das Spritzensystem umfasst bevor- zugt Luer-Lock-Spritze und/oder eine stumpfe Endokanüle.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Schritten kann in An- schluss an Schritt 8, das Biomaterial mit einem geeigneten Material, wie beispielsweise MTA (Mineral-Trioxid-Aggregat ) abgedeckt werden, und der Wurzelkanal durch Legen einer herkömmlichen Füllung bakteriendicht verschlossen werden. Eine erste Nachkontrolle kann beispielsweise zwei Wochen nach der Applikation erfolgen. Nachfolgend werden beispielhafte Ausführungsformen der Erfindung anhand der Beispiele und Abbildungen beschrieben.
Es zeigen: Fig. 1: Daten zur Freisetzung des Wachstumsfaktors TGFßl aus Dentin in Abhängigkeit vom pH-Wert der Spül¬ lösung,
Fig. 2: Daten zur Freisetzung des Wachstumsfaktors TGFßl aus Dentin in Abhängigkeit der Art der Vorbehand¬ lung,
Fig. 3: Daten zur Freisetzung des Wachstumsfaktors VEGF aus Dentin in Abhängigkeit der Art der Vorbehand¬ lung,
Fig. 4: Zellvitalität dentaler Pulpastammzellen in einem
Biomaterial,
Fig. 5: Freisetzung der Wachstumsfaktoren aus einem Biomaterial Fig. 6: Zellzahlen dentaler Pulpastammzellen in wachs- tumsfaktorbeladenem Biomaterial
Fig. 7: Gewebebildung in Dentinzylindern nach
Transplantation dentaler Pulpastammzellen.
Beispiele
Nachfolgend werden die Beispiele beschrieben. Beispiel 1
Wachstumsfaktorfreisetzung mit verschiedenen Spüllösungen
Hierzu wurden aus extrahierten Zähnen mittels einer Innen- lochsäge Dentinscheiben der Dicke 200 ym und des Durchmes¬ sers 8 mm hergestellt und bis zum Versuchsbeginn in 10 ~6iger Chloramin-Lösung gelagert. Die Scheiben wurden mit phos- phat-gepufferter Kochsalzlösung (lx PBS, pH 7) gewaschen und jede Scheibe wurde in das Well einer 48-Well-Platte eingelegt. Daraufhin wurde jede Scheibe mit 100 μΐ einer
Spüllösung bedeckt (wässrige EDTA Lösung 10% bzw. 0,268 M, pH 6 oder pH7; hergestellt mit EDTA disodium salt dihydra- te, Applichem Nr. A3234) oder Zitronensäure 10% bzw. 0,476 M, pH 3, 5 oder 7; hergestellt mit Citric acid monohydrate, Merck Nr. 1.00244.0500)), welche für jeweils 5, 10 oder 20 min einwirken konnte. Für jede Versuchsbedingung wurde mit Triplikaten gearbeitet. Die Spüllösung wurde nach der je- weiligen Einwirkdauer abgenommen und als Probe in ein
ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) -Kit pipettiert (Human TGF-beta 1 Quantikine ELISA Kit, R&D Systems, Nr. DB100B) . Anhand der im Kit enthaltenen Standards wurde die Menge an Wachstumsfaktor in den jeweiligen Proben berech- net.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 wiedergegeben. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen (n=6) . Der Versuch zeigt eine zeitabhängige Wachstumsfaktorfrei¬ setzung, die größte Menge an TGFßl wurde nach 20minütiger Einwirkzeit von EDTA bei pH 7 erzielt.
Beispiel 2
Freisetzung von TGFßl nach kombinierter Anwendung verschiedener Spüllösungen
Eine wässrige EDTA-Spüllösung (10% bzw. 0,268 M, pH 7) wur- de anlog dem Vorgehen im Beispiel 1 mit Dentin in Kontakt gebracht. Fig. 2 vergleicht die Konzentration von TGFßl in der Spüllösung nach einer Einwirkzeit der Spüllösung auf das Dentin von jeweils 5 min, 10 min und 20 min für den Fall, dass das Dentin vor der Anwendung der EDTA-haltigen Lösung zum Spülen von Hartgewebe analog zum Vorgehen in Beispiel 1 mit Natriumhypochlorit (NaOCl, 5,25%) oder
Chlorhexidin (CHX) (Chlorhexidin-digluconat , 0,12%) jeweils 5 min oder 10 min vorbehandelt wurde oder die EDTA-haltige Lösung zum Spülen von Hartgewebe ohne Vorbehandlung des Dentins mit Chlorhexidin oder Natriumhypochlorit angewendet wurde. In Figur 2 sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus 2 unabhängigen Versuchen (n=6) dargestellt.
Die Daten in Figur 2 belegen, dass bei der Anwendung der EDTA-haltigen Spüllösung TGFßl aus dem Dentin freigesetzt wird. Es zeigt sich ein zeitabhängiger Effekt, wobei bei längerer Einwirkdauer von EDTA mehr TGFßl freigesetzt wird. Wird desinfizierendes Chlorhexidin vor EDTA verwendet, ist dieser Effekt bei einer Einwirkdauer des Chlorhexidins von 5 min etwas gesteigert. Spülung mit Natriumhypochlorit vor der EDTA-Anwendung reduziert die Wachstumsfaktorfreiset¬ zung .
Beispiel 3
Freisetzung von VEGF nach kombinierter Anwendung verschiedener Spüllösungen.
Hierzu wurde ein Versuch durchgeführt, dessen Aufbau analog zu dem in Beispiel 2 beschriebenen Versuch erfolgte. Die Ergebnisse sind in Figur 3 wiedergegeben. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus 2 unabhängigen Versuchen (n=6) . Figur 3 zeigt, bei vorheriger Anwendung von Chlorhexidin höhere Wachstumsfaktorkonzentrationen als bei NaOCl.
Beispiel 4
Aufbereitung der Spüllösung 0,5 ml einer 0,1 M der EDTA-Spüllösung wurde 5 min mit 3,3 mg Anionentauscher (DEAE-Sepharose, Sigma-Aldrich DCL6B100, Lot 041M1427, Trockenmasse)) verrührt und der Anionentau¬ scher anschließend abfiltriert. Der Restgehalt EDTA in der Spüllösung betrug 31,5 % der eingesetzten Spüllösung, bestimmt mittels HPLC (Waters 2695 Separations Module und Wa¬ ters 2998 Photodiode Array Detector mit HPLC-Säule Nucleo- dur Sphinx RP 5 ym (CC250/4)). Beispiel 5
Eine EDTA-Spüllösung nach Beispiel 1 wurde mit Eisen (III)- chlorid versetzt und mit UV-Licht bei 254 nm (Netzhandlampe UVA/C (Nr. 862 506); Dr. Göbel UV-Elektronik GmbH) be- strahlt. Der Restgehalt EDTA in der Spüllösung betrug weniger als 5 % der eingesetzten Spüllösung, bestimmt mittels HPLC (Waters 2695 Separations Module und Waters 2998 Photo¬ diode Array Detector mit HPLC-Säule Nucleodur Sphinx RP 5 ym (CC250/4) ) .
Beispiel 6
Herstellung des mit Wachstumsfaktoren beladenen Biomaterials
Als Ausgangskomponente A liegt eine Lösung eines Teil selbstorganisierender Peptide (Sequenzen 1) in einem dafür vorgesehenen, mehrkammerigen Spritzensystem vor. Ausgangskomponente B stellt eine wässrige Lösung von Heparin (4 mg/mL, Heparin Sodium Salt, Akron Nr. AK3004) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung) in lxPBS, pH=7) dar, welche in einer davon getrennten Kammer im Spritzensystem gelagert ist. Währende des klinischen Behandlungsganges wird nun das Dentin im Wurzelkanal mittels EDTA-Spüllösung konditio¬ niert. Nach lOminütiger Einwirkdauer wird die Spüllösung dem Wurzelkanal entnommen, das EDTA wird mittels in Bei¬ spiel 4 und/oder 5 beschriebener Methoden aus der Lösung entfernt, diese wird mit der Heparin/PBS-Lösung gemischt. Dabei werden die sich in Lösung befindlichen Wachstumsfaktoren durch das Heparin gebunden und stabilisiert. Nun wird diese Lösung mit dem zweiten Teil der selbstorganisierenden Peptide (Pendant-Sequenzen) und mit der Ausgangskomponente A vermischt und in den Wurzelkanal injiziert. Innerhalb von 3-5 Minuten tritt die Gelbildung ein, welche in diesem Material durch elektrostatische Wechselwirkung zwischen den beiden Peptidsequenzen induziert wird. Beispiel 7
Hier wurde die EDTA-Spüllösung nicht in das Biomaterial eingemischt. Es wurden Wachstumsfaktoren mittels Nachspülen mit PBS-Lösung (pH=7) gelöst und anschließend in ein Bioma- terial eingebracht. Hierzu wurde eine EDTA-Spüllösung nach der entsprechender Einwirkdauer aus dem Wurzelkanal entnommen und verworfen. Im Folgenden wird die PBS-Lösung, eine phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (lx PBS, pH 7) in den Kanal eingebracht, auf- und abpipettiert und schließlich dem Kanal entnommen. Dieser Lösung wurde Heparin zugegeben und anschließend mit dem pulverförmigen Gerüstmaterial ver¬ mischt .
Beispiel 8
Freisetzung von Wachstumsfaktoren aus Hydrogelen mit und ohne Heparin Hierzu wurden Gele aus selbstorganisierenden Peptiden hergestellt (Galler KM et al . (2011), Dentin Conditioning Co- determines Cell Fate in Regenerative Endodontics, J Endod 37 (11) : 1536-1541; Galler KM et al . (2010), Seif-Assembling Multidomain Peptide Hydrogels: Designed Susceptibility to Enzymatic Cleavage Allows Enhanced Cell Migration and
Spreadin, J Am Chem Soc 132, 3217-3223; Galler KM et al . (2008), Seif-Assembling Peptide Amphiphile Nanofibers as a Scaffold for Dental Stern Cells, Tissue Eng Part A 12:2051- 8) .
Eine Stammlösung von Peptid in lxPBS von 2 Gew.-% wurde angesetzt. Der jeweilige Wachstumsfaktor wurde in einer Hepa- rin/PBS-Lösung gelöst. Nun wurden beide Komponenten ver- mischt und Wells einer 96-Well-Platte pipettiert, durch das Mischen wird die Gelbildung induziert. Das Volumen pro Gel betrug 100 yL, die Endkonzentration an Peptid 1 Gew~6 , an Heparin 1 mg/mL, und an Wachstumsfaktor 100 ng pro Gel. Als Kontrollen wurden Gele ohne Heparin hergestellt, und die Proben in Triplikaten angesetzt. Jedes Gel wurde nun mit
100 yL lxPBS mit 1% BSA (bovines Serum-Albumin) überschichtet. Zu verschiedenen Zeitpunkten (Tag 1, 2, 3, 5 und 7) wurde der Überstand entnommen, bei -80 °C eingefroren, und im Well durch neue PBS/BSA-Lösung ersetzt. Nach Abschluss einer Woche wurde die Proben aufgetaut, und die Menge an
Wachstumsfaktor im Überstand wurde mittels ELISA quantifi¬ ziert .
Die Daten zeigen die Freisetzung der Wachstumsfaktoren TGFß 1, FGF-2 und VEGF in Peptid-basierten Hydrogelen mit und ohne Heparin, die Freisetzungsprofile sind in Abbildung 5 dargestellt. Dargestellt sind Mittelwerte (n=3) . Ist Hepa- rin im Gel vorhanden, erfolgt die Freisetzung der Wachstumsfaktoren verzögert.
Des Weiteren konnte deren Bioaktivität auch nach Einbindung und nachfolgender Freisetzung bestätigt werden, was in Zellkulturversuchen, welche in Figur 6 dargestellt sind, getestet wurde. In Figur 6 sind Mittelwerte und Standardab¬ weichungen aus 2 unabhängigen Versuchen (n=6) dargestellt. Das Zeichen „*" in der Abbildung kennzeichnet signifikante Unterschiede zur Kontrolle, p<0,05.
Hierzu werden dentale Pulpastammzellen im Monolayer in 24- Well-Platten gesät, die Zelldichte betrug 2,5 x 103 Zellen pro Well. Die Zellen blieben für 24 Stunden unbehandelt, in diesem Zeitraum erfolgte die Zelladhäsion. Daraufhin wurde in jedes Well ein Insert gesetzt, in welchem sich ein mit Heparin und Wachstumsfaktor angereichertes Peptidhydrogel befand. Das Volumen pro Gel im Insert betrug 25 yL, die Menge an Wachstumsfaktor für TGFßl betrug 25 ng, für FGF-2 lOOng. Die Gele in den Inserts wurden mit Zellkulturmedium überschichtet, wodurch eine kontinuierliche Abgabe von Wachstumsfaktor ins Medium über den Versuchszeitraum von 14 Tagen ermöglicht wurde. In Kontrollgruppen wurden keine Gele in Inserts verwendet, sondern die Wachstumsfaktoren wur- den dem Zellkulturmedium zugefügt, welches jeden 2. Tag gewechselt wurde, wodurch eine erneute Zufuhr an Wachstums¬ faktor erfolgte. Es wurden somit 3 Versuchsgruppen (1: Zellen und Gele in Inserts ohne Wachstumsfaktor, 2: Gele in Inserts mit 25ng TGFßl und 3: Gele in Inserts mit 100 ng FGF-2) gebildet. Demgegenüber standen 3 Kontrollgruppen (1: Zellen ohne Gele, normales Zellkulturmedium, 2: Zellen ohne Gele, Zellkulturmedium mit 2,5 ng TGFßl, 3: Zellen ohne Gele, Zellkulturmedium mit 10 ng FGF-2) . Die Zellmorphologie wurde nach 3 und 14 Tagen photographisch dokumentiert. Das Zellwachstum wurde nach 3, 7 und 14 Tagen durch Auszählen in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Zellmorphologie und -proliferation veränderten sich in Versuchs- und Kontroll- gruppen durch Wachstumsfaktorzugabe. TGFß-1 behandelte Zel¬ len zeigten eine Vergrößerung der Zellkörper sowie Cluster- bildung nach 14 Tagen, während die Proliferation verlangsamt war. FGF-2 induzierte hingegen einen spindelförmigen Zelltyp mit erhöhter Proliferationsrate . Der beschriebene Versuch belegt, dass TGFßl als auch FGF-2 nach Einbindung und nachfolgender Freisetzung aus Hydrogelen ihre Bioaktivität beibehalten.
Beispiel 9 : Applikation des Biomaterials in den Wurzelkanal
Mit Wachstumsfaktoren beladenes Biomaterial wird mittels eines Spritzensystems in den Wurzelkanal eingebracht. Das Gel im Wurzelkanal dient als Leitschiene zur Regeneration, es sollen durch die rückgeführten Wachstumsfaktoren Zellen angelockt und im Gel zur Proliferation, Differenzierung und Gewebebildung gebracht werden. Des Weiteren bleiben auch an der Dentinoberfläche nach EDTA-Vorbehandlung Wachstumsfaktoren exponiert. Hierzu wurden Versuche mit den Wurzelkanal imitierenden
Dentinzylindern durchgeführt. In den Hohlraum der Zylinder wurde ein Gemisch aus Trägermaterial und dentalen Pul- pastammzellen eingebracht. Die Zylinder wurden für 4 Wochen bei immundefizienten Mäusen transplantiert und nach Explan- tation histologisch untersucht. Die Aufnahmen zeigen, dass sich im Dentinzylinder ein pulpaähnliches , vaskularisiertes Weichgewebe bildet. An der Grenzschicht zum vorbehandelten Dentin zeigen sich differenzierte Zellen. Im Gegensatz dazu sind bei alleiniger Vorbehandlung mit Natriumhypochlorit Resorptionsvorgänge am Dentin erkennbar. Die Daten sind in Figur 7 dargestellt. Figur 7 zeigt die Gewebebildung in Dentinzylindern nach Transplantation dentaler Pulpastamm- zellen. Natriumhypochlorit-behandeltes Dentin ist in der linken Spalte dargestellt. EDTA-behandeltes Dentin ist in der rechten Spalte dargestellt. Abbildungen (C) und (D) sind Darstellungen nach HE-Färbung. Abbildungen (E) und (F) sind Darstellungen nach Masson' s Trichrom-Färbung . Mittig im Zylinder ist Gewebebildung erkennbar (A,B) . NaOCl-
Vorbehandlung bedingt Resorptionsvorgänge und Abbau des Dentins an der Grenzschicht zu den Zellen (C) . EDTA- vorbehandeltes Dentin erlaubt eine enge Anlagerung der Zel¬ len ans Dentin (D) . Abbildung (E) zeigt eine deutlich er- kennbare Resorption des Dentins. Abbildung (F) zeigt, dass die dem Dentin anliegenden Zellen differenzieren und Zellfortsätze in die Dentintubuli strecken, analog der physio¬ logischerweise vorliegenden Situation im Dentin. Beispiel 10: Zellvitalität in Kollagen
Die Daten in Figur 4 zeigen steigende Zellvitalität durch zunehmende Zellzahlen von humanen dentalen Pulpastammzellen in dreidimensionalen Kollagen-Gelen über einen Versuchs- Zeitraum von 14 Tagen. Dargestellt sind Mittelwerte und Standardabweichungen aus 2 unabhängigen Versuchen (n=6) . Beispiel 11: Abbaugeschwindigkeit von EDTA mittels Eisen (III) -chlorid und UV-Licht
Hierzu wurde zunächst eine das Demineralisierungsmittel EDTA enthaltende Spüllösung mit Calciumchlorid und dem Pro¬ tein Albumin versetzt. Anschließend wurde Eisen (III)- chlorid zugegeben und die so entstandene Lösung mit der UV- Lampe aus Beispiel 5 bestrahlt. Zur Herstellung der Lösung wurden 5 ml 0,1 M EDTA-Lösung
(Merck); 4,5 ml 0,1 M PBS-Lösung (Phosphate Buffered Saline lx; pH 7,4; Th. Geyer); 5 ml 0,1 M CaCl2-Lösung; 0,5 ml 1 Gewichts-% BSA enthaltende Lösung (Albumin from Bovine Se¬ rum l,000g/100 ml HPLC-Wasser; Sigma-Aldrich; A7906) und 5 ml 0,1 M FeCl3-Lösung gemischt.
Zur Bestimmung der Abbaugeschwindigkeit des EDTAs wurden 0,5 ml der hergestellten Lösung in einen mit einem Filterpapier bestückten PE-Beutel mit Zip-Verschluss (40 mm x 60 mm, DMG-Art.-Nr. 101207) gegeben. Nach dem Verschließen des Beutels erfolgt die Bestrahlung mit UV-Licht (254 nm, UV- Handlampe; Abstand Geräteunterkante - PE-Beutel: 17 mm) für 15, 30, 60, 90 und 120 min. Nach dem Ende einer Bestrahlung wurde das Filterpapier aus dem PE-Beutel entnommen und zweimal mit je 10 ml HPLC- Wasser (Baker 4218) abgespült. Diese Spüllösungen wurden in einen 100 ml-Messkolben gegeben. Die im PE-Beutel verbliebene restliche Probe wurde ebenfalls in den 100 ml- Messkolben überführt und der PE-Beutel zweimal mit je 5 ml HPLC-Wasser gespült. Auch diese Spüllösungen wurden in den Messkolben überführt. Der Messkolben wurde bis zur Messmarke aufgefüllt und eine Probe per HPLC (Waters Alliance 2695 mit UV-Detektor Waters 2998) untersucht (HPLC-Methode : Application-No . 119780 „Complexing Agents acc. to DIN
38413-8" aus der Applikationsdatenbank der Fa. Macherey Nagel, Düren mit folgenden Abweichungen: HPLC-Säule:
EC125/4 NUCLEODUR 100-5 C18 ec, Säulentemperatur: 30 °C, Injektionsvolumen: 20 μΐ, UV-Detektionswellenlänge : 256 nm) . Als Startwert (100 %) dient eine Lösung von 500 μΐ 0,1 M EDTA-Lösung (Merck, Darmstadt) in 100,0 ml HPLC-Wasser. Der EDTA-Abbau wurde als Doppelbestimmung (mit je zwei PE- Beuteln pro Bestrahlungszeitraum) bestimmt.
Das EDTA war nach 30 min zu 90 % abgebaut. Nach weiteren 60 min war der Abbau nahezu vollständig. Beispiel 12: Abbaugeschwindigkeit von EDTA mittels UV-Licht
Eine Lösung entsprechend Beispiel 11, der jedoch statt 5 ml der FeC13- und 5 ml der CaC12-Lösung 10 ml HPLC-Wasser zugesetzt wurden und die nach dem in Beispiel 11 beschriebe- nen Verfahren untersucht wurde, zeigte nach 15 min keinen Abbau, nach 30 min waren 20 und nach 90 min weniger als 40 % des EDTAs abgebaut.
Beispiel 13 : Abbaugeschwindigkeit von EDTA mittels FeCl3
Die EDTA-Konzentration einer Lösung entsprechend Beispiel 11 wurde über einen Zeitraum von 120 min untersucht, wobei die Lösung lediglich unter Laborbedingungen gelagert wurde. Das EDTA wurde nicht abgebaut. Beispiel 14: Abbaugeschwindigkeit von EDTA mittels FeCl3, UV-Licht und Ionentauscher
Beispiel 11 wurde wiederholt mit dem Unterschied, dass statt des Filterpapiers ein Ionenaustauscherpapierstreifen (35 mm x 57 mm, Schleicher&Schuell 5891 Schwarzband asche¬ frei, Ch.-Bez. DU0901-1 bzw. Whatman Grade DE81 Cat.No. 3658-915, Lot No . F1646846) im PE-Beutel enthalten war. Der EDTA-Gehalt sank nur anfänglich schneller als im Beispiel 11. Er betrug nach 15 Minuten 30 %.
Beispiel 15: Bestimmung des Proteinabbaus Nach dem Ende der Bestrahlung (siehe Beispiel 11) wurde aus den PE-Beuteln jeweils eine Probe entnommen, die kühl in Braunglas-Vials gelagert wurde (Kühlschrank) .
Zur Protein-Bestimmung nach Bradford wurden 780 μΐ 0,1 M PBS-Lösung (Phosphate Buffered Saline lx; pH 7,4; Th. Gey¬ er) , 20 μΐ der entnommenen Probe und 200 μΐ Bradford- Reagenz ( Sigma-Aldrich B6916, Lot SLBB8733V) in einer PMMA- Einmalküvette gemischt. Nach 15-minütigem Stehen bei Labortemperatur wurden die Extinktionen der Mischungen im Spekt- rophotometer bei 595 nm (Thermo Evolution 600) bestimmt. Abbauprodukte des EDTAs wurden von der Methode nicht er- fasst. Es erfolgten jeweils Doppelbestimmungen. Zusätzlich wurde eine Kalibrationsgerade aufgenommen (0,9 bis 115 μg BSA) .
Die Proteinkonzentration sank dabei nach 30 min auf 80 %, nach 90 min auf 65 %.

Claims

Patentansprüche
Ein in vitro Verfahren zur Herstellung eines wachs- tumsfaktorbeladenen, zur Verwendung bei der Geweberegeneration geeigneten Biomaterials, umfassend die fol genden Schritte: a) Bereitstellen einer einem tierischen oder menschlichen Körper entnommenen Spüllösung für Hartgewe be, wobei die Spüllösung mindestens ein Deminera- lisierungsmittel für Hartgewebe und ein durch Kon takt der Spüllösung mit dem Hartgewebe aus dem Hartgewebe gewonnenes Wachstumsfaktorgemisch ent¬ hält; b) Bereitstellen von Gerüstmaterial; c) Beladen des Gerüstmaterials mit mindestens einem Wachstumsfaktor durch Inkontaktbringen der Spüllö sung mit dem Gerüstmaterial.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Gerüstmaterial in Schritt c) mit einem Wachs tumsfaktorgemisch beladen wird, wobei dessen Wachstumsfaktorkomponenten vorzugsweise den Wachstumsfaktorkomponenten im Wachstumsfaktorgemisch der Spüllösung entsprechen und/oder dass in Schritt c) das Bela den des Gerüstmaterials durch Mischen der Spüllösung mit dem Gerüstmaterial erfolgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Spüllösung vor dem Beladen des Gerüstmaterials zur Verwendung mit dem Gerüstmate¬ rial aufbereitet wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufbereitung die Sterilisation der Spüllösung und/oder die Inaktivierung von Toxinen in der Spüllösung und/oder die Entfernung von Toxinen aus der Spüllösung und/oder die Zugabe von einem oder mehreren Hilfsstoffen zu der Spüllösung umfasst.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Aufbereitung der Spüllösung die Zugabe von mindestens einer pharmazeutisch wirksamen Substanz und/oder die Zugabe von mindestens einem Vermittler, welcher die Bindung mindestens eines Wachstumsfaktors an das Gerüstmaterial bewirkt oder unterstützt, um¬ fasst; wobei die pharmazeutisch wirksame Substanz vorzugsweise ein Antibiotikum ist und/oder wobei der Vermittler vorzugsweise Heparin ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, i) dass das bereitgestellte Gerüstmaterial ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus synthetischen Polymeren, natürlichen Biomaterialien und Kombinationen der Vorgenannten; wobei das bereitgestellte Ge¬ rüstmaterial vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus selbstorga¬ nisierenden Peptiden (SAP) , Polyethern, Polymilchsäure, Polyglykolsäure (PGA) , Copolymeren von Polymilchsäure mit Po- lyethern (PLGA) , Poly-s-Caprolacton
(PCL) , Polyurethanen, Kollagen, Fibrin, Polysacchariden und Kombinationen der Vorgenannten; wobei das bereitgestellte Gerüstmaterial besonders bevorzugt ausge wählt ist aus der Gruppe bestehend aus selbstorganisierenden Peptiden (SAP) , Kollagen, Fibrin und Kombinationen der Vorgenannten; und/oder j) dass das mindestens eine Demineralisie- rungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Säuren, Salzbildnern und
Chelatbildnern; wobei das mindestens eine Demineralisierungsmittel vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EDTA (Ethylendiamintetraeesigsäure bzw. Ethylendiamintetraacetat ) , EGTA
(Ethylenglycol-bis (aminoethylether) - N, , Ν' , N' -tetraessigsäure bzw. Ethylenglycol-bis (aminoethylether) - N, N, Ν' , N' tetraacetat ) und Zitronensäure bzw. Citrat.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Deminerali- sierungsmittel EDTA ist und dass die Aufbereitung der Spüllösung den Abbau von EDTA und/oder die teilweise oder vollständige Entfernung von EDTA und/oder dessen Abbauprodukten aus der Spüllösung umfasst; wobei der Abbau von EDTA und/oder die teilweise oder vollständi- ge Entfernung von EDTA und/oder dessen Abbauprodukten aus der Spüllösung vorzugsweise zu Beginn der Aufbe¬ reitung erfolgt bevor weitere Aufbereitungsschritte durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Spüllösung einen pH-Wert von größer 4, vorzugsweise einen pH-Wert von größer 5, aufweist und/oder dass es sich bei dem Hartgewebe um Zahnhartgewebe handelt.
Kit zur Herstellung eines wachstumsfaktorbeladenen Biomaterials zur Verwendung bei der Geweberegeneration, umfassend a) Gerüstmaterial und b) eine Spüllösung zum Spülen von menschlichem oder tierischem Hartgewebe, die mindestens ein Demine- ralisierungsmittel für Hartgewebe enthält.
10. Kit nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Demineralisierungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Säuren, Salzbildnern und Chelatbildnern; wobei das mindestens eine Demine¬ ralisierungsmittel bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus EDTA (Ethylendiamintetraeesigsäu- re bzw. Ethylendiamintetraacetat ) , EGTA (Ethylengly- col-bis (aminoethylether) -Ν,Ν,Ν' ,Ν' -tetraessigsäure bzw. Ethylenglycol-bis (aminoethylether) -
N, N, Ν' , N' tetraacetat ) und Zitronensäure bzw. Citrat.
11. Kit nach einem der Ansprüche 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des mindestens ei¬ nen Demineralisierungsmittels in der Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe mindestens 5 Gew.-%, weiter vorzugsweise mindestens 10 Gew.-%, weiter vorzugsweise 10 Gew.-% bis 20 Gew.-%, besonders bevorzugt 10 Gew.-% bis 17 Gew.-%, ganz besonders bevorzugt 17 Gew.-% beträgt und/oder dass die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe einen pH-Wert von größer 4, vorzugsweise einen pH-Wert von größer 5, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 4 bis 10, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 9, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 8, weiter vorzugsweise einen pH-Wert von 6,5 bis 7,5, besonders bevorzugt einen pH-Wert von 7 aufweist.
12. Kit nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet,
) dass das mindestens eine Demineralisierungsmittel Zitronensäure bzw. Citrat ist und die Spüllösung zum Spülen von Hartgewebe einen pH-Wert von grö¬ ßer 4, vorzugsweise einen pH-Wert von 5 bis 7, weiter vorzugsweise von 4,5 bis 6,5 aufweist oder b) dass das mindestens eine Demineralisierungsmittel EDTA ist und die Spüllösung zum Spülen von Hart- gewebe einen pH-Wert von mindestens 6, vorzugs¬ weise einen pH-Wert von mindestens 7, weiter vor¬ zugsweise einen pH-Wert von 7 bis 9 aufweist.
Kit nach einem der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Gerüstmaterial ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus synthetischen Polymeren, natürlichen Biomaterialien und Kombinationen der Vorgenannten; wobei das Gerüstmaterial bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus selbstorganisierenden Peptiden (SAP) , Polyethern, Polymilchsäure, Polygly- kolsäure (PGA) , Copolymeren von Polymilchsäure mit Po¬ lyethern (PLGA) , Poly-s-Caprolacton (PCL) , Polyurethanen, Kollagen, Fibrin, Polysacchariden und Kombinationen der Vorgenannten; wobei das Gerüstmaterial besonders bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus selbstorganisierenden Peptiden (SAP) , Kollagen, Fibrin und Kombinationen der Vorgenannten.
Kit nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Gerüstmaterial aufweist: i. adhäsive Gruppen, an die Vermittler für
Wachstumsfaktoren und/oder Wachstumsfaktoren reversibel gebunden werden können und/oder ii. im Körper abbaubare Gruppen, wobei die Gruppen gemäß den Merkmalen i) und/oder ii) vorzugsweise Aminosäuresequenzen sind. Kit nach einem der Ansprüche 9 bis 14, ferner umfas¬ send mindestens eine Komponente ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Mitteln zur Entfernung von EDTA aus einer Lösung, Vermittlern, welche die Bindung mindestens eines Wachstumsfaktors an das Gerüstmaterial bewirken oder unterstützen, und einer Vorrichtung zur Applikation der Spüllösung; wobei die Mittel zur Entfernung von EDTA aus einer Lösung bevorzugt Eisen (III) -Salze und/oder Anionentauscherharze umfassen; wobei ein bevorzugter Vermittler Heparin ist; wobei die Vorrichtung zur Applikation der Spüllösung vorzugsweise eine Spritze und eine Kanüle, besonders be¬ vorzugt eine stumpfe Endo-Kanüle umfasst.
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