ES2444710T3

ES2444710T3 - Uso de un anticuerpo específico para un polipéptido similar a IL-17

Info

Publication number: ES2444710T3
Application number: ES01952183.0T
Authority: ES
Inventors: Eugene Medlock; Richard Yeh; Scott M. Silbiger; Gary S. Elliot; Hung Q. Nguyen; Shuqian Jing
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 2000-06-22
Filing date: 2001-06-21
Publication date: 2014-02-26
Anticipated expiration: 2021-06-21
Also published as: WO2002008285A2; AU2001272968B2; EP1294765A2; CA2412626C; WO2002008285A3; AU2001272968C1; AR030236A1; US20020037524A1; AU7296801A; EP1294765B1; MXPA02012743A; JP2004504064A; CA2412626A1

Abstract

Uso de un anticuerpo antagonista específico para un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, o un fragmento de la misma que comprende 25, 50, 75, 100 ó 150 aminoácidos contiguos, para la preparación de un medicamento para tratar fibrosis quística, síndrome de enfermedad respiratoria aguda o enfisema.

Description

Uso de un anticuerpo especifico para un polipeptido similar a 1L-17

Campo de la invenci6n

La presente invencion se refiere a usos de anticuerpos especificos para polipeptidos similares a 1L-17.

Antecedentes de la invenci6n

Los avances tecnicos en la identificacion, clonacion, expresion y manipulacion de moleculas de acido nucleico y el desciframiento del genoma humano han acelerado enormemente el descubrimiento de productos terapeuticos novedosos. Tecnicas de secuenciacion de acidos nucleicos rapidas pueden generar ahora informacion de secuencia a velocidades sin precedentes y, acopladas con analisis computacionales, permiten el ensamblaje de secuencias solapantes en genomas completos y parciales asi como la identificacion de regiones que codifican para polipeptidos. Una comparacion de una secuencia de aminoacidos pronosticada frente a una compilacion de base de datos de secuencias de aminoacidos conocidas permite determinar el grado de homologia con secuencias identificadas previamente y/o puntos de referencia estructurales. La clonacion y expresion de una region que codifica para un polipeptido de una molecula de acido nucleico proporciona un producto polipeptidico para analisis estructurales y funcionales. La manipulacion de moleculas de acido nucleico y polipeptidos codificados puede conferir propiedades ventajosas a un producto para su uso como producto terapeutico.

A pesar de los avances tecnicos significativos en la investigacion del genoma a lo largo de la ultima decada, el potencial de desarrollo de productos terapeuticos novedosos basados en el genoma humano esta todavia en gran medida sin explotar. Muchos genes que codifican para productos terapeuticos polipeptidicos posiblemente beneficiosos o los que codifican para polipeptidos, que pueden actuar como quot;dianasquot; para moleculas terapeuticas, no se han identificado todavia.

Por consiguiente, es un objeto de la invencion identificar polipeptidos novedosos, y moleculas de acido nucleico que codifican para los mismos, que pueden tener beneficio de diagnostico o terapeutico.

Sumario de la invenci6n

La presente invencion se refiere a usos para anticuerpos contra polipeptidos similares a 1L-17 novedosos.

La invencion proporciona un uso de un anticuerpo antagonista especifico para un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2, o un fragmento de la misma que comprende 25, 50, 75, 100 o 150 aminoacidos contiguos, para la preparacion de un medicamento para tratar fibrosis quistica, sindrome de enfermedad respiratoria aguda o enfisema.

La invencion proporciona ademas un anticuerpo antagonista especifico para un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2, o un fragmento de la misma que comprende 25, 50, 75, 100 o 150 aminoacidos contiguos, para su uso en el tratamiento de fibrosis quistica, sindrome de enfermedad respiratoria aguda o enfisema.

La invencion proporciona ademas un uso de una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo antagonista especifico para un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2, o un fragmento de la misma que comprende 25, 50, 75, 100 o 150 aminoacidos contiguos, y un agente de formulacion farmaceuticamente aceptable, para la preparacion de un medicamento para tratar fibrosis quistica, sindrome de enfermedad respiratoria aguda o enfisema.

La invencion proporciona ademas una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo antagonista especifico para un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2, o un fragmento de la misma que comprende 25, 50, 75, 100 o 150 aminoacidos contiguos, y un agente de formulacion farmaceuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento de fibrosis quistica, sindrome de enfermedad respiratoria aguda o enfisema.

La presente solicitud da a conocer una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a): la secuencia de nucleotidos tal como se expone en SEQ 10 NO: 1, SEQ 10 NO: 3 o SEQ 10 NO: 9;

(b): una secuencia de nucleotidos que codifica para el polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10;

(c): una secuencia de nucleotidos que se hibrida en condiciones moderada o altamente rigurosas con el complemento de (a) o (b), en la que el polipeptido codificado tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10; y

(d): una secuencia de nucleotidos complementaria a cualquiera de (a) a (c).

La presente solicitud tambien da a conocer una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a): una secuencia de nucleotidos que codifica para un polipeptido que es al menos aproximadamente el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99 por ciento identico al polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10, en la que el polipeptido codificado tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10;

(b): una secuencia de nucleotidos que codifica para una variante alelica o variante de corte y empalme de la secuencia de nucleotidos tal como se expone en SEQ 10 NO: 1, SEQ 10 NO: 3 o SEQ 10 NO: 9, en la que el polipeptido codificado tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10;

(c): una secuencia de nucleotidos de SEQ 10 NO: 1, SEQ 10 NO: 3 o SEQ 10 NO: 9, (a) o (b) que codifica para un fragmento de polipeptido de al menos aproximadamente 25 residuos de aminoacido, en la que el polipeptido tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10;

(d): una secuencia de nucleotidos de SEQ 10 NO: 1, SEQ 10 NO: 3 o SEQ 10 NO: 9, o (a) -(c) que comprende un fragmento de al menos aproximadamente 16 nucleotidos;

(e): una secuencia de nucleotidos que se hibrida en condiciones moderada o altamente rigurosas con el complemento de cualquiera de (a) - (d), en la que el polipeptido codificado tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10; y

(f): una secuencia de nucleotidos complementaria a cualquiera de (a) - (d).

La presente solicitud da a conocer ademas una molecula de acido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleotidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a): una secuencia de nucleotidos que codifica para un polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10 con al menos una sustitucion de aminoacido conservativa, en la que el polipeptido codificado tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10;

(b): una secuencia de nucleotidos que codifica para un polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10 con al menos una insercion de aminoacido, en la que el polipeptido codificado tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10;

(c): una secuencia de nucleotidos que codifica para un polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10 con al menos una delecion de aminoacido, en la que el polipeptido codificado tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10;

(d): una secuencia de nucleotidos que codifica para un polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10 que tiene un truncamiento C-y/o N-terminal, en la que el polipeptido codificado tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10;

(e): una secuencia de nucleotidos que codifica para un polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10 con al menos una modificacion seleccionada del grupo que consiste en sustituciones de aminoacidos, inserciones de aminoacidos, deleciones de aminoacidos, truncamiento C-terminal y truncamiento Nterminal, en la que el polipeptido codificado tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10;

(f): una secuencia de nucleotidos de (a) - (e) que comprende un fragmento de al menos aproximadamente 16 nucleotidos;

(g): una secuencia de nucleotidos que se hibrida en condiciones moderada o altamente rigurosas con el complemento de cualquiera de (a) - (f), en la que el polipeptido codificado tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10; y

(h): una secuencia de nucleotidos complementaria a cualquiera de (a) - (e).

La presente solicitud tambien da a conocer un polipeptido aislado que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a): una secuencia de aminoacidos que comprende el polipeptido similar a 1L-17 humana madura contenido en SEQ 10 NO: 2, y que comprende ademas opcionalmente una metionina amino terminal; o una secuencia de aminoacidos que comprende el polipeptido similar a 1L-17 murina madura contenido en SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10;

(b): una secuencia de aminoacidos para un ortologo de SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10, en la que el polipeptido tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10

NO: 10;

(c): una secuencia de aminoacidos que es al menos aproximadamente el 70, el 75, el 80, el 85, el 90, el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99 por ciento identica a la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10, en la que el polipeptido tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2 SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10;

(d): un fragmento de la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10 que comprende al menos aproximadamente 25 residuos de aminoacido, en el que el polipeptido tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10;

(e): una secuencia de aminoacidos para una variante alelica o variante de corte y empalme de o bien la secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10, o bien al menos una de (a) - (c) en la que el polipeptido tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10.

La presente solicitud da a conocer ademas un polipeptido aislado que comprende la secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en:

(a): la secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10 con al menos una sustitucion de aminoacido conservativa, en la que el polipeptido tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10;

(b): la secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10 con al menos una insercion de aminoacido, en la que el polipeptido tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10;

(c): la secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10 con al menos una delecion de aminoacido, en la que el polipeptido tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10;

(d): la secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10 que tiene un truncamiento C- y/o N-terminal, en la que el polipeptido tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10; y

(e): la secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10, con al menos una modificacion seleccionada del grupo que consiste en sustituciones de aminoacidos, inserciones de aminoacidos, deleciones de aminoacidos, truncamiento C-terminal y truncamiento N-terminal, en la que el polipeptido tiene una actividad del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO:

10.

Tambien se dan a conocer polipeptidos de fusion que comprenden las secuencias de aminoacidos de (a) - (e) anteriores.

La presente solicitud tambien da a conocer un vector de expresion que comprende las moleculas de acido nucleico aisladas tal como se expone en el presente documento, celulas huesped recombinantes que comprenden moleculas de acido nucleico recombinantes tal como se expone en el presente documento y un metodo de produccion de un polipeptido similar a 1L-17 que comprende cultivar las celulas huesped y opcionalmente aislar el polipeptido asi producido.

Tambien se da a conocer un animal no humano transgenico que comprende una molecula de acido nucleico que codifica para un polipeptido similar a 1L-17. Las moleculas de acido nucleico de polipeptido similar a 1L-17 se introducen en el animal de una manera que permite la expresion y niveles aumentados del polipeptido similar a 1L17, lo que puede incluir niveles circulantes aumentados. El animal no humano transgenico es preferiblemente un mamifero.

Tambien se dan a conocer derivados de los polipeptidos similares a 1L-17 de la presente invencion.

Se dan a conocer analogos de los polipeptidos similares a 1L-17 en la presente solicitud que resultan de sustituciones de aminoacidos conservativas y/o no conservativas del polipeptido similar a 1L-17 de SEQ 10 NO: 2. Tales analogos incluyen un polipeptido similar a 1L-17 en el que, por ejemplo, el aminoacido en la posicion 67 de SEQ 10 NO: 2 es asparagina o glutamina, el aminoacido en la posicion 69 de SEQ 10 NO: 2 es lisina, glutamina, asparagina o arginina, el aminoacido en la posicion 94 de SEQ 10 NO: 2 es cisteina, serina o alanina, el aminoacido en la posicion 96 de SEQ 10 NO: 2 es cisteina, serina o alanina, el aminoacido en la posicion 101 de SEQ 10 NO: 2 es isoleucina, metionina, leucina, fenilalanina, alanina, norleucina o valina, el aminoacido en la posicion 104 de SEQ 10 NO: 2 es treonina o serina, el aminoacido en la posicion 129 de SEQ 10 NO: 2 es cisteina, alanina o serina, el aminoacido en la posicion 140 de SEQ 10 NO: 2 es cisteina, alanina o serina, el aminoacido en la posicion 152 de SEQ 10 NO: 2 es cisteina, alanina o serina.

Se contemplan especificamente analogos, fragmentos o variantes de polipeptido similar a 1L-17 que conservan la actividad de union al receptor o la actividad biologica de citocinas. Tambien se contemplan analogos, fragmentos o variantes de polipeptido similar a 1L-17 que se unen al receptor pero no pueden transducir una sefal.

Tambien se dan a conocer composiciones farmaceuticas que comprenden los nucleotidos, polipeptidos o agentes de union selectiva dados a conocer y uno o mas agentes de formulacion farmaceuticamente aceptables. Las composiciones farmaceuticas se usan para proporcionar cantidades terapeuticamente eficaces de los nucleotidos o polipeptidos dados a conocer. Tambien se dan a conocer metodos de uso de los polipeptidos y las moleculas de acido nucleico. La invencion se refiere a agentes de union selectiva para su uso en el tratamiento de determinadas enfermedades, siendo los agentes de union selectiva anticuerpos.

Los polipeptidos similares a 1L-17, anticuerpos y derivados de los mismos dados a conocer, otros agentes de union selectiva, moleculas pequefas y moleculas de acido nucleico (incluyendo acidos nucleicos antisentido) pueden usarse para tratar, prevenir, mejorar y/o detectar enfermedades y trastornos, incluyendo los mencionados en el presente documento. Por ejemplo, los polinucleotidos y polipeptidos similares a 1L-17 pueden tener actividad proinflamatoria y por tanto pueden desempefar un papel en estados patologicos relacionados con inflamacion. La expresion de polinucleotidos o polipeptidos similares a 1L-17 puede desempefar tambien un papel en la progresion del cancer. Por ejemplo, un polinucleotido y polipeptido similar a 1L-17 puede desempefar un papel en estados de linfoma y el aumento de la expresion de un polinucleotido o polipeptido similar a 1L-17 puede ser indicativo de un estado de prelinfoma. Puede ser deseable la disminucion de la actividad o los niveles de polipeptido similar a 1L-17 en estados patologicos inflamatorios cronicos o agudos, incluyendo enfermedades autoinmunitarias, y en estados patologicos de cancer, incluyendo estados de linfoma o prelinfoma. A la inversa, puede ser deseable el aumento de la actividad de polipeptido similar a 1L-17 en otros estados patologicos, tales como infeccion.

La presente solicitud tambien da a conocer un metodo para someter a ensayo moleculas de prueba para identificar una molecula de prueba que se une a un polipeptido similar a 1L-17. El metodo comprende poner en contacto un polipeptido similar a 1L-17 con una molecula de prueba para determinar el grado de union de la molecula de prueba al polipeptido. El metodo comprende ademas determinar si tales moleculas de prueba son agonistas o antagonistas de un polipeptido similar a 1L-17. La presente solicitud da a conocer ademas un metodo para someter a prueba el impacto de las moleculas sobre la expresion de un polipeptido similar a 1L-17 o sobre la actividad de un polipeptido similar a 1L-17.

Una realizacion da a conocer metodos de identificacion de inhibidores de una interaccion de un polipeptido similar a 1L-17 con un polipeptido de RB-2 o RB-3 de receptor de 1L-17. Estos metodos comprenden las etapas de detectar la union de un polipeptido similar a 1L-17 (tal como un polipeptido que comprende la secuencia de proteina madura expuesta en SEQ 10 NO: 2 o fragmentos, analogos o variantes de la misma que conservan la actividad de union a receptor) con un polipeptido RB-2 o RB-3 receptor de 1L-17 (tal como un polipeptido que comprende la region extracelular de SEQ 10 NO: 18 o 20, o fragmentos, analogos o variantes de la misma que conservan la actividad de union a ligando), en presencia y ausencia de un compuesto de prueba, e identificar el compuesto de prueba como inhibidor candidato cuando disminuye la union en presencia del compuesto. Los compuestos de prueba adecuados incluyen moleculas de acido nucleico, proteinas, peptidos, hidratos de carbono, lipidos, compuestos organicos e inorganicos, de los cuales pueden examinarse bibliotecas usando procedimientos de examen de alto rendimiento. La presente invencion proporciona anticuerpos antagonistas para su uso en el tratamiento de un estado patologico mediado por un polipeptido similar a 1L-17, siendo dicho estado fibrosis quistica, sindrome de enfermedad respiratoria aguda o enfisema. El anticuerpo antagonista puede administrarse a se une especificamente al polipeptido similar a 1L-17. La solicitud tambien da a conocer un metodo de inhibicion de la interaccion no deseada de polipeptido similar a 1L-17 con RB-2 o RB-3 receptor de 1L-7 que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula que puede unirse al polipeptido similar a 1L-17 o RB-2 o RB-3 receptor de 1L-17.

Estos inhibidores candidatos identificados incluyen agentes de union selectiva, fragmentos, analogos o variantes de polipeptidos similares a 1L-17 de la presente invencion y proteinas de fusion de los mismos. Se describen en detalle adicional en el presente documento estados patologicos mediados por polipeptido similar a 1L-17.

La solicitud tambien da a conocer un metodo de inhibicion de la interaccion no deseada de polipeptido similar a 1L-17 con RB-2 o RB-3 receptor de 1L-17 que comprende administrar una cantidad terapeuticamente eficaz de una molecula que puede unirse al polipeptido similar a 1L-17 o RB-2 o RB-3 receptor de 1L-17.

Tambien se dan a conocer metodos de regulacion de la expresion y modulacion (es decir, aumento o disminucion) de los niveles de un polipeptido similar a 1L-17. Un metodo comprende administrar a un animal una molecula acido nucleico que codifica para un polipeptido similar a 1L-17 o moleculas de acido nucleico antisentido (por ejemplo, que se unen especificamente a A0N o ARN que codifica para polipeptido similar a 1L-17 o secuencias reguladoras e inhiben la expresion de polipeptido similar a 1L-17). En otro metodo, puede administrarse una molecula de acido nucleico que comprende elementos que regulan o modulan la expresion de un polipeptido similar a 1L-17. Los ejemplos de estos metodos incluyen terapia genica, terapia celular y terapia antisentido tal como se describe adicionalmente en el presente documento. Aun otros metodos para disminuir los niveles o la actividad de un polipeptido similar a 1L-17 implican la administracion de un agente de union selectiva (tal como anticuerpos y derivados de los mismos incluyendo anticuerpos quimericos, humanizados o humanos o fragmentos de los mismos que se unen especificamente al polipeptido similar a 1L-17 o sus sitios de union a receptor) para antagonizar la actividad del polipeptido similar a 1L-17. Tambien se contempla la administracion de un analogo, fragmento o variante de 1L-17, incluyendo una proteina de fusion de la misma, que antagoniza la actividad de un polipeptido similar a 1L-17 nativo.

En otra descripcion, los polipeptidos similares a 1L-17 pueden usarse para identificar receptores de los mismos (quot;receptores de polipeptido similar a 1L-17quot;). Se han usado extensamente diversas formas de quot;clonacion de expresionquot; para clonar receptores para ligandos proteicos. Vease por ejemplo, H. Simonsen y H.F. Lodish, Trends in Pharmacological Sciences, 15:437-441 (1994), y Tartaglia et al., Cell, 83:1263-1271 (1995). El aislamiento del/de los receptor(es) de polipeptido similar a 1L-17 es util para identificar o desarrollar agonistas y antagonistas novedosos de la ruta de sefalizacion del polipeptido similar a 1L-17. Tales agonistas y antagonistas incluyen receptor(es) de polipeptido similar a 1L-17 soluble(s) (por ejemplo fragmentos que carecen de toda o parte de la(s) region/regiones transmembrana y/o citoplasmatica(s) o fragmentos de la(s) region/regiones extracelular(es) que conservan la actividad de union a ligando, analogos o variantes de los mismos y fusiones de los mismos con polipeptidos heterologos tales como dominios constantes de una inmunoglobulina o fragmentos o variantes de los mismos que conservan la capacidad para prolongar la semivida en circulacion), agentes de union selectiva anti-receptor de polipeptido similar a 1L-17 (tales como anticuerpos y derivados de los mismos incluyendo anticuerpos quimericos, humanizados o humanos o fragmentos de los mismos que se unen especificamente al polipeptido similar a receptor de 1L-17 o sus sitios de union a ligando), moleculas pequefas y oligonucleotidos antisentido (por ejemplo, que se unen especificamente a A0N o ARN que codifica para polipeptido similar a 1L-17 o secuencias reguladoras e inhiben la expresion de polipeptido similar a 1L-17), cualquiera de los cuales puede usarse para tratar una o mas de las enfermedades o trastornos, incluyendo los mencionados en el presente documento. Por ejemplo, pueden administrarse antagonistas de polipeptido similar a 1L-17 como producto terapeutico antiinflamatorio o usarse para tratar estados cancerosos o de linfoma.

Se han identificado en el ejemplo 8 dos receptores que se unen al polipeptido similar a 1L-17 dado a conocer y se indican como 1L-17RB-2 e 1L-17RB-3.

Sus secuencias de nucleotidos y aminoacidos se exponen en SEQ 10 NO: 17-18 (1L-17RB-2) y SEQ 10 NO: 19-20 (1L-17RB-3), respectivamente. El dominio transmembrana pronosticado abarca los residuos 293 a 313 de SEQ 10 NO: 18 y los residuos 351 a 371 de SEQ 10 NO: 20. El peptido sefal pronosticado abarca 14 residuos de SEQ 10 NO: 18 y 20. Por tanto, la secuencia extracelular pronosticada abarca los aminoacidos 14 a 292 de SEQ 10 NO: 18 y los aminoacidos 14 a 350 de SEQ 10 NO: 20.

En determinadas realizaciones, un agonista o antagonista de polipeptido similar a 1L-17 puede ser una proteina, un peptido, un hidrato de carbono, un lipido o una molecula de peso molecular pequefo que interacciona con un polipeptido similar a 1L-17 para regular su actividad.

Breve descripci6n de las figuras

La figura 1 representa una secuencia de acido nucleico (SEQ 10 NO: 1) que codifica para el polipeptido similar a 1L17 humana. Tambien se representa la secuencia de aminoacidos (SEQ 10 NO: 2) del polipeptido similar a 1L-17 humana. En esta figura, el peptido sefal pronosticado esta subrayado; se cree que los aminoacidos 1 a 16 comprenden la secuencia lider.

La figura 2A-2C representa una secuencia de acido nucleico (SEQ 10 NO: 3) que codifica para el polipeptido similar a 1L-17 de raton. Tambien se representa la secuencia de aminoacidos (SEQ 10 NO: 4) del polipeptido similar a 1L-17 de raton. En esta figura, el peptido sefal pronosticado esta subrayado; se cree que los aminoacidos 1 a 18 comprenden la secuencia lider. La figura 2B-2C tambien representa la secuencia de acido nucleico (SEQ 10 NO: 9) de una forma no secretada de A0Nc de polipeptido similar a 1L-17 de raton, y la correspondiente secuencia de aminoacidos de la misma (SEQ 10 NO: 10).

La figura 3A-3B representa un apilamiento de la secuencia de aminoacidos de polipeptido similar a 1L-17, h1L-17L, (SEQ 10 NO: 2), con la secuencia de aminoacidos de un miembro de la familia de 1L-17 humana conocida, h1L-17, (SEQ 10 NO: 5).

La figura 4 representa un apilamiento de la secuencia de aminoacidos de polipeptido similar a 1L-17, h1L-17L, (SEQ 10 NO: 2) con la secuencia de aminoacidos de un miembro de la familia de 1L-20 humana conocida, h1L-20, (SEQ 10 NO: 6).

La figura 5 representa un apilamiento de la secuencia de aminoacidos de polipeptido similar a 1L-17, h1L-17L, (SEQ 10 NO: 2) con la secuencia de aminoacidos de un miembro de la familia de 1L-17 humana conocida, h1L-17b (SEQ 10 NO: 7).

La figura 6A-6B representa un apilamiento de la secuencia de aminoacidos de polipeptido similar a 1L-17, h1L-17L, (SEQ 10 NO: 2) con la secuencia de aminoacidos de un miembro de la familia de 1L-17 humana conocida, h1L-17c, (SEQ 10 NO: 8).

La figura 7 representa una transferencia de tipo Northern que detecta la expresion del transgen que sobreexpresa polipeptido similar a 1L-17 en ratones fundadores transgenicos sometidos a necropsia (n.os 1, 16, 27, 29, 55, 61, 20, 52 y 66). Los ratones control (n.os 2, 17, 53 y 65) son compaferos de camada no transgenicos. El carril marcado quot;blquot; es un carril de blanco y el control positivo (+) era el A0Nc de polipeptido similar a 1L-17. La presencia de una banda de 0,54 kb es indicativa de expresion transgenica.

La figura 8 representa una transferencia de tipo Northern que detecta la expresion del transgen que sobreexpresa polipeptido similar a 1L-17 en ratones fundadores transgenicos hepatectomizados (n.os 10,11, 30, 31, 33, 37, 46, 67 y 68). Los ratones control (n.os 32, 35, 36 y 45) son compaferos de camada no transgenicos. El carril marcado quot;M1quot; representa el fragmento de microinyeccion que se cargo como control positivo. La presencia de una banda de 0,54 kb es indicativa de expresion transgenica.

La figura 9 representa secciones tefidas con hematoxilina y eosina (A, B, G-J), B220 (C, 0) y F4/80 (E, F) de ganglio linfatico (A-H) o medula osea (1, J) de ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 (B, 0, F, H) o ratones control no transgenicos (A, C, E, G). Los paneles A-F ilustran que el ganglio linfatico transgenico para polipeptido similar a 1L-17 estaba notablemente alargado con su arquitectura normal alterada debido a un infiltrado celular marcado (asterisco en el panel B) que contenia grandes numeros de celulas de linfocitos B positivas para B220 (panel 0) y algunos macrofagos que se tefian con F4/80. El panel H ilustra que este infiltrado celular tambien contenia numerosos eosinofilos (cabezas de flecha) asi como celulas gigantes inflamatorias multinucleadas (flechas).

La figura 10 representa secciones tefidas con hematoxilina y eosina (A, B; E-1) y B220 (C, 0) de ganglio linfatico, medula osea (A, B), bazo (C-F) y rifon (G-J) de ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 (B, 0, F, H, J) o ratones control no transgenicos (A, C, E, G, 1). El panel A ilustra hiperplasia mieloide eosinofilica marcada. El panel 0 ilustra hiperplasia linfoide con una predominancia de celulas B positivas para B220 (flechas) en el bazo de ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17, mientras que el panel F ilustra hiperplasia mieloide eosinofilica en la pulpa roja esplenica transgenica para polipeptido similar a 1L-17 en comparacion con la pulpa roja esplenica no transgenica (E). Los paneles H y J ilustran dilatacion pelvica renal (flecha en H) con una infiltracion inflamatoria eosinofilica marcada en la pelvis renal (pielonefritis, panel J).

La figura 11 representa un histograma de diagrama de barras que muestra un aumento significativo en los numeros absolutos de linfocitos B C019+ en la sangre periferica de 4 de 9 ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L17 en comparacion con los controles de compaferos de camada no transgenicos.

La figura 12 representa un histograma de diagrama de barras que muestra un aumento en los numeros absolutos de linfocitos B C019+ en los bazos de 5 de 10 ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 en comparacion con los controles de compaferos de camada no transgenicos.

La figura 13 representa un histograma de diagrama de barras que muestra una ligera disminucion en los numeros absolutos de linfocitos B C019+ en la medula osea de ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 en comparacion con los controles de compaferos de camada no transgenicos.

La figura 14 representa un histograma de diagrama de barras que muestra un aumento en los numeros absolutos de linfocitos T C04+ en la sangre periferica de 4 de 9 ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 en comparacion con los controles de compaferos de camada no transgenicos.

La figura 15 representa un histograma de diagrama de barras que muestra un aumento en los numeros absolutos de linfocitos T C04+ en los bazos de ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 en comparacion con los controles de compaferos de camada no transgenicos.

La figura 16 representa graficos de dispersion representativos de los cambios que se producen en los ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 frente a sus controles de compaferos de camada no transgenicos. Los dos graficos superiores marcados como quot;Aquot; son graficos de puntos de citometria de flujo de 2 colores en los que se representa el marcaje de C045R+ y polipeptido similar a 1L-17-Fc en sus respectivos ejes. El grafico control quot;Aquot; muestra una ausencia de celulas C045R+/polipeptido similar a 1L-17-Fc+ en la region R1 mientras que en el grafico transgenico quot;Aquot; esta poblacion estaba presente en la region R1 y representaba el 8% de la poblacion de granulocitos total. En el correspondiente grafico de dispersion directa frente a lateral (quot;Bquot; y quot;Cquot;) estas celulas se representan como puntos de color rosa. Esta poblacion estaba ausente en el grafico control quot;Bquot;.

La figura 17 representa graficos de dispersion representativos de los cambios que se producen en los ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 frente a sus controles de compaferos de camada no transgenicos. Los dos graficos superiores marcados como quot;Aquot; son graficos de puntos de citometria de flujo de 2 colores en los que se representa el marcaje de C04 y polipeptido similar a 1L-17-Fc en sus respectivos ejes. El grafico control quot;Aquot; muestra una ausencia de celulas C04+/polipeptido similar a 1L-17-Fc+ en la region R1, mientras que en el grafico transgenico quot;Aquot; esta poblacion estaba presente en la region R1 y representaba el 14% de la poblacion de granulocitos total. En los correspondientes graficos de dispersion directa frente a lateral (tamafo frente a granularidad), en los ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 (B) estas celulas se ubican justo por encima de la region en la que se encuentran normalmente los granulocitos (puntos de color rojo). Estas celulas estan ausentes en el grafico control quot;Bquot;. Ademas, para los ratones transgenicos (A), hay un surgimiento de una poblacion de celulas que no eran ni C04+ ni polipeptido similar a 1L-17-Fc+ (region R2) pero que tiene las propiedades de dispersion de los eosinofilos, localizandose a la izquierda de los granulocitos en el grafico de dispersion directa frente a lateral quot;Bquot; (puntos de color verde). Esta poblacion estaba ausente en el grafico control quot;Bquot;.

La figura 18 representa un histograma de diagrama de barras que muestra un aumento en los numeros absolutos de celulas similares a granulocitos rh1L-17 like-Fc+/C045R+ en la medula osea de 5 de 10 ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 en comparacion con los controles de compaferos de camada no transgenicos.

La figura 19 representa un histograma de diagrama de barras que muestra un aumento en los numeros absolutos de celulas similares a granulocitos rh1L-17 like-Fc+/C04+ en la medula osea de ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 en comparacion con los controles de compaferos de camada no transgenicos.

La figura 20 representa un ejemplo de un grafico de dispersion directa frente a lateral tipico (tamafo frente a granularidad). Las celulas en la compuerta pueden clasificarse para dar una poblacion purificada.

La figura 21A-21B representa perfiles de FACS de ratones transgenicos que sobreexpresan polipeptido similar a 1L17 y controles no transgenicos de expresion de C05, C034 y C04 en celulas de tejidos linfoides especificados. Los porcentajes incluian la referencia a poblaciones dobles positivas. Los numeros absolutos de celulas para poblaciones de eosinofilos C05+C019+, C034+C019+ y C04+ se representan como tanto por ciento de poblaciones (para linfocitos) y numero de celulas absoluto (eosinofilos).

Descripci6n detallada de la invenci6n

Los encabezamientos de seccion usados en el presente documento son solo para fines de organizacion.

0efiniciones

Los terminos quot;gen de polipeptido similar a 1L-17quot; o quot;molecula de acido nucleico de polipeptido similar a 1L-17quot; o quot;polinucleotidoquot; se refieren a una molecula de acido nucleico que comprende o consiste en una secuencia de nucleotidos tal como se expone en SEQ 10 NO: 1, SEQ 10 NO: 3 o SEQ 10 NO: 9, una secuencia de nucleotidos que codifica para el polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10, y moleculas de acido nucleico tal como se definen en el presente documento.

El termino quot;polipeptido similar a 1L-17quot; se refiere a un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10, y polipeptidos relacionados. Los polipeptidos relacionados incluyen: variantes alelicas de polipeptido similar a 1L-17, ortologos de polipeptido similar a 1L-17, variantes de corte y empalme de polipeptido similar a 1L-17, variantes de polipeptido similar a 1L-17 y derivados de polipeptido similar a 1L-17. Los polipeptidos similares a 1L-17 pueden ser polipeptidos maduros, tal como se definen en el presente documento, y pueden tener o no un residuo de metionina amino terminal, dependiendo del metodo mediante el que se preparan.

El termino quot;variante alelica de polipeptido similar a 1L-17quot; se refiere a una de las varias posibles formas alternativas que se producen de manera natural de un gen que ocupa un locus dado en un cromosoma de un organismo o una poblacion de organismos.

El termino quot;derivados de polipeptido similar a 1L-17quot; se refiere al polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10, variantes alelicas de polipeptido similar a 1L-17, ortologos de polipeptido similar a 1L-17, variantes de corte y empalme de polipeptido similar a 1L-17 o variantes de polipeptido similar a 1L-17, tal como se definen en el presente documento, que se han modificado quimicamente.

El termino quot;fragmento de polipeptido similar a 1L-17quot; se refiere a un polipeptido que comprende un truncamiento en el extremo amino terminal (con o sin una secuencia lider) y/o un truncamiento en el extremo carboxilo terminal del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10, variantes alelicas de polipeptido similar a 1L-17, ortologos de polipeptido similar a 1L-17, variantes de corte y empalme de polipeptido similar a 1L-17 y/o una variante de polipeptido similar a 1L-17 que tiene una o mas adiciones o sustituciones o deleciones internas de aminoacidos (en las que el polipeptido resultante tiene al menos seis (6) aminoacidos o mas de longitud) en comparacion con la secuencia de aminoacidos de polipeptido similar a 1L-17 expuesta en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10. Los fragmentos de polipeptido similar a 1L-17 pueden resultar de corte y empalme de ARN alternativo o de actividad proteasa in vivo. En realizaciones preferidas, los truncamientos comprenden aproximadamente 10 aminoacidos, o aproximadamente 20 aminoacidos, o aproximadamente 50 aminoacidos, o aproximadamente 75 aminoacidos, o aproximadamente 100 aminoacidos o mas de aproximadamente 100 aminoacidos. Los fragmentos de polipeptido asi producidos comprenderan aproximadamente 25 aminoacidos contiguos, o aproximadamente 50 aminoacidos, o aproximadamente 75 aminoacidos, o aproximadamente 100 aminoacidos, o aproximadamente 150 aminoacidos, o aproximadamente 200 aminoacidos. Tales fragmentos de polipeptido similar a 1L-17 pueden comprender opcionalmente un residuo de metionina amino terminal. Se apreciara que tales fragmentos pueden usarse, por ejemplo, para generar anticuerpos frente a polipeptidos similares a 1L-17.

El termino quot;polipeptido de fusion similar a 1L-17quot; se refiere a una fusion de uno o mas aminoacidos (tal como un peptido o polipeptido heterologo) en el extremo amino o carboxilo terminal del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10, variantes alelicas de polipeptido similar a 1L-17, ortologos de polipeptido similar a 1L-17, variantes de corte y empalme de polipeptido similar a 1L-17 o variantes de polipeptido similar a 1L-17 que tienen una o mas deleciones, sustituciones o adiciones internas de aminoacidos, en comparacion con la secuencia de aminoacidos de polipeptido similar a 1L-17 expuesta en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10.

El termino quot;ortologo de polipeptido similar a 1L-17quot; se refiere a un polipeptido de otra especie que corresponde a una secuencia de aminoacidos de polipeptido similar a 1L-17 tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10. Por ejemplo, polipeptidos similares a 1L-17 de raton y ser humano se consideran ortologos entre si.

El termino quot;variante de corte y empalme de polipeptido similar a 1L-17quot; se refiere a una molecula de acido nucleico, habitualmente ARN, que se genera mediante el procesamiento alternativo de secuencias de intrones en un transcrito de ARN de la secuencia de aminoacidos de polipeptido similar a 1L-17 tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10.

El termino quot;variantes de polipeptido similar a 1L-17quot; se refiere a polipeptidos similares a 1L-17 que comprenden secuencias de aminoacidos que tienen una o mas sustituciones, deleciones (tal como deleciones internas y/o fragmentos de polipeptido similar a 1L-17) y/o adiciones (tal como adiciones internas y/o polipeptidos de fusion similares a 1L-17) de secuencia de aminoacidos en comparacion con la secuencia de aminoacidos de polipeptido similar a 1L-17 expuesta en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10 (con o sin una secuencia lider). Pueden producirse variantes de manera natural (por ejemplo, variantes alelicas de polipeptido similar a 1L-17, ortologos de polipeptido similar a 1L-17 y variantes de corte y empalme de polipeptido similar a 1L-17) o pueden construirse artificialmente. Tales variantes de polipeptido similar a 1L-17 pueden prepararse a partir de las moleculas de acido nucleico correspondientes que tienen una secuencia de A0N que varia por consiguiente con respecto a la secuencia de A0N tal como se expone en SEQ 10 NO: 1, SEQ 10 NO: 3 o SEQ 10 NO: 9. En realizaciones preferidas, las variantes tienen desde 1 hasta 3, o desde 1 hasta 5, o desde 1 hasta 10, o desde 1 hasta 15, o desde 1 hasta 20, o desde 1 hasta 25, o desde 1 hasta 50, o desde 1 hasta 75, o desde 1 hasta 100, o mas de 100 sustituciones, inserciones, adiciones y/o deleciones de aminoacidos, pudiendo ser las sustituciones conservativas o no conservativas, o cualquier combinacion de las mismas.

El termino quot;antigenoquot; se refiere a una molecula o una parte de una molecula que pueden unirse mediante un agente de union selectiva, tal como un anticuerpo, y que puede usarse adicionalmente en un animal para producir anticuerpos que pueden unirse a un epitopo de cada antigeno. Un antigeno puede tener uno o mas epitopos.

El termino quot;polipeptidos similares a 1L-17 biologicamente activosquot; se refiere a polipeptidos similares a 1L-17 que tienen al menos una actividad caracteristica del polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10.

Los terminos quot;cantidad eficazquot; y quot;cantidad terapeuticamente eficazquot; se refieren cada uno a la cantidad de un polipeptido similar a 1L-17 o molecula de acido nucleico de polipeptido similar a 1L-17 usada para soportar un nivel observable de una o mas actividades biologicas de los polipeptidos similares a 1L-17 tal como se expone en el presente documento.

El termino quot;vector de expresionquot; se refiere a un vector que es adecuado para su uso en una celula huesped y contiene secuencias de acido nucleico que dirigen y/o controlan la expresion de secuencias de acido nucleico heterologas. La expresion incluye, pero no se limita a, procesos tales como transcripcion, traduccion y corte y empalme del ARN, si hay intrones presentes.

El termino quot;celula huespedquot; se usa para referirse a una celula que se ha transformado, o que puede transformarse con una secuencia de acido nucleico y entonces expresar un gen de interes seleccionado. El termino incluye la progenie de la celula antecesora, sea o no la progenie identica en morfologia o en constitucion genetica al antecesor original, siempre que este presente el gen seleccionado.

El termino quot;identidadquot; tal como se conoce en la tecnica se refiere a una relacion entre las secuencias de dos o mas moleculas de polipeptido o dos o mas moleculas de acido nucleico, tal como se determina comparando las secuencias. En la tecnica, quot;identidadquot; tambien significa el grado de parentesco de secuencia entre moleculas de acido nucleico o polipeptidos, como puede ser el caso, tal como se determina mediante la coincidencia entre hebras de dos o mas secuencias de nucleotidos o dos o mas secuencias de aminoacidos. La quot;identidadquot; mide el porcentaje de coincidencias identicas entre la mas pequefa de dos o mas secuencias con alineamientos de huecos (si hay alguno) tratado mediante un programa informatico o modelo matematico particular (es decir, quot;algoritmosquot;).

El termino quot;similitudquot; es un concepto relacionado pero, al contrario que la quot;identidadquot;, se refiere a una medida de similitud que incluye tanto coincidencias identicas como coincidencias de sustitucion conservativa. Si dos secuencias de polipeptidos tiene, por ejemplo, 10/20 aminoacidos identicos, y el resto son todos sustituciones no conservativas, entonces el porcentaje de identidad y similitud serian ambos del 50%. Si, en el mismo ejemplo, hay cinco posiciones mas en las que hay sustituciones conservativas, entonces el porcentaje de identidad sigue siendo del 50%, pero el porcentaje de similitud seria del 75% (15/20). Por tanto, en casos en los que haya sustituciones conservativas, el grado del porcentaje de similitud entre dos polipeptidos sera superior que el porcentaje de identidad entre esos dos polipeptidos.

El termino quot;molecula de acido nucleico aisladaquot; se refiere a una molecula de acido nucleico de la invencion que (1) se ha separado de al menos aproximadamente el 50 por ciento de las proteinas, los lipidos, los hidratos de carbono u otros materiales con los que se encuentra de manera natural cuando se aisla el A0N total de las celulas fuente, (2) no esta unida a toda o una parte de un polinucleotido al que la quot;molecula de acido nucleico aisladaquot; esta unida en la naturaleza, (3) esta operativamente unida a un polinucleotido al que no esta unida en la naturaleza, o (4) no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia de nucleotidos mas grande. Preferiblemente, la molecula de acido nucleico aislada de la presente invencion esta sustancialmente libre de cualquier otra molecula contaminante de acido nucleico u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que interferirian con su uso en la produccion de polipeptidos o su uso terapeutico, de diagnostico, profilactico o de investigacion.

El termino quot;polipeptido aisladoquot; se refiere a un polipeptido de la presente invencion que (1) se ha separado de al menos aproximadamente el 50 por ciento de los polinucleotidos, los lipidos, los hidratos de carbono u otros materiales con los que se encuentra de manera natural cuando se aisla de la celula fuente, (2) no esta unido (mediante interaccion covalente o no covalente) a todo o una parte de un polipeptido al que el quot;polipeptido aisladoquot; esta unido en la naturaleza, (3) esta operativamente unido (mediante interaccion covalente o no covalente) a un polipeptido al que no esta unido en la naturaleza, o (4) no se produce en la naturaleza. Preferiblemente, el polipeptido aislado esta sustancialmente libre de cualquier otro polipeptido contaminante u otros contaminantes que se encuentran en su entorno natural que interferirian con su uso terapeutico, de diagnostico, profilactico o de investigacion.

El termino quot;polipeptido similar a 1L-17 maduraquot; se refiere a un polipeptido similar a 1L-17 que carece de una secuencia lider. Un polipeptido similar a 1L-17 madura tambien puede incluir otras modificaciones tales como procesamiento proteolitico del extremo amino terminal (con o sin una secuencia lider) y/o el extremo carboxilo terminal, escision de un polipeptido mas pequefo a partir de un precursor mas grande, glicosilacion unida a N y/u O, y similares. Un polipeptido similar a 1L-17 humana madura a modo de ejemplo puede encontrarse dentro de la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2. Un polipeptido similar a 1L-17 de raton madura a modo de ejemplo puede encontrarse dentro de la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 4 y SEQ 10 NO: 10. Los terminos quot;secuencia de acido nucleicoquot; o quot;molecula de acido nucleicoquot; se refieren a secuencia de A0N o ARN. Los terminos abarcan moleculas formadas a partir de cualquiera de los analogos de bases conocidos de A0N y ARN tales como, pero sin limitarse a 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinil-citosina, pseudoisocitosina, 5(carboxihidroximetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-iso-penteniladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetil-guanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiamino-metil-2-tiouracilo, beta-0-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonil-metiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ester metilico del acido uracil-5oxiacetico, acido uracil-5-oxiacetico, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, ester metilico del acido N-uracil-5-oxiacetico, acido uracil-5-oxiacetico, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina y 2,6-diaminopurina.

El termino quot;que se produce de manera naturalquot; o quot;nativoquot; cuando se usan junto con materiales biologicos tales como moleculas de acido nucleico, polipeptidos, celulas huesped, y similares, se refiere a materiales que se encuentran en la naturaleza y no estan manipulados por el hombre. 0e manera similar, quot;que no se produce de manera naturalquot; o quot;no nativoquot; tal como se usa en el presente documento se refiere a un material que no se encuentra en la naturaleza

o que se ha modificado estructuralmente o sintetizado por el hombre.

El termino quot;operativamente unidoquot; se usa en el presente documento para referirse a un metodo de secuencias flanqueantes en el que las secuencias flanqueantes asi descritas estan configuradas o ensambladas para realizar su funcion habitual. Por tanto, una secuencia flanqueante operativamente unida a una secuencia codificante puede ser capaz de efectuar la replicacion, transcripcion y/o traduccion de la secuencia codificante. Por ejemplo, una secuencia codificante esta operativamente unida a un promotor cuando el promotor puede dirigir la transcripcion de esa secuencia codificante. Una secuencia flanqueante no necesita estar contigua a la secuencia codificante, siempre que funcione correctamente. Por tanto, por ejemplo, pueden estar presentes secuencias transcritas aun no traducidas intermedias entre una secuencia promotora y la secuencia codificante, y la secuencia promotora todavia puede considerarse quot;operativamente unidaquot; a la secuencia codificante.

Los terminos quot;portador farmaceuticamente aceptablequot; o quot;portador fisiologicamente aceptablequot; tal como se usan en el presente documento se refieren a uno o mas materiales de formulacion adecuados para lograr o potenciar la administracion del polipeptido similar a 1L-17, molecula de acido nucleico de polipeptido similar a 1L-17 o agente de union selectiva a polipeptido similar a 1L-17 como una composicion farmaceutica.

El termino quot;agente de union selectivaquot; se refiere a una molecula o moleculas que tienen especificidad para un polipeptido similar a 1L-17. Tal como se usan en el presente documento los terminos, quot;especificoquot; y quot;especificidadquot; se refieren a la capacidad de los agentes de union selectiva para unirse a polipeptidos similares a 1L-17 humana y para no unirse a polipeptidos no similares a 1L-17 humana.

Sin embargo, se apreciara que los agentes de union selectiva tambien pueden unirse a ortologos del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10, es decir, versiones interespecie de los mismos, tales como polipeptidos de raton y de rata.

El termino quot;transduccionquot; se usa para referirse a la transferencia de genes de una bacteria a otra, habitualmente mediante un fago. quot;Transduccionquot; tambien se refiere a la adquisicion y transferencia de secuencias celulares eucariotas por retrovirus.

El termino quot;transfeccionquot; se usa para referirse a la captacion de A0N foraneo o exogeno por una celula, y una celula se ha quot;transfectadoquot; cuando el A0N exogeno se ha introducido dentro de la membrana celular. Se conocen bien en la tecnica varias tecnicas de transfeccion y se dan a conocer en el presente documento. Veanse, por ejemplo, Graham et al., Virology, 52:456 (1973); Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York, (1989); 0avis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, (1986); y Chu et al., Gene, 13:197 (1981). Tales tecnicas pueden usarse para introducir uno o mas restos de A0N exogeno en celulas huesped adecuadas.

El termino quot;transformacionquot; tal como se usa en el presente documento se refiere a un cambio en las caracteristicas geneticas de una celula, y una celula se ha transformado cuando se ha modificado para contener nuevo A0N. Por ejemplo, una celula se transforma cuando se modifica geneticamente con respecto a su estado nativo. Tras la transfeccion o transduccion, el A0N transformante puede recombinarse con el de la celula integrandose fisicamente en un cromosoma de la celula, puede mantenerse de manera transitoria como un elemento episomal sin replicarse,

o puede replicarse independientemente como un plasmido. Se considera que una celula se ha transformado de manera estable cuando el A0N se replica con la division de la celula.

El termino quot;vectorquot; se usa para referirse a cualquier molecula (por ejemplo, acido nucleico, plasmido o virus) usada para transferir la informacion codificante a una celula huesped.

Parentesco de moleculas de acido nucleico y/o polipeptidos

Se entiende que las moleculas de acido nucleico relacionadas incluyen variantes alelicas o de corte y empalme de la molecula de acido nucleico de SEQ 10 NO: 1, SEQ 10 NO: 3 o SEQ 10 NO: 9, e incluyen secuencias que son complementarias a cualquiera de las secuencias de nucleotidos anteriores. Las moleculas de acido nucleico relacionadas tambien incluyen una secuencia de nucleotidos que codifica para un polipeptido que comprende o consiste esencialmente en una sustitucion, modificacion, adicion y/o delecion de uno o mas residuos de aminoacido en comparacion con el polipeptido en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10.

Los fragmentos incluyen moleculas que codifican para un polipeptido de al menos aproximadamente 25 residuos de aminoacido, o aproximadamente 50, o aproximadamente 75, o aproximadamente 100, o de mas de aproximadamente 100, residuos de aminoacido del polipeptido de SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10.

Ademas, las moleculas de acido nucleico de polipeptido similar a 1L-17 relacionadas incluyen las moleculas que comprenden secuencias de nucleotidos que se hibridan en condiciones moderada o altamente rigurosas tal como se definen en el presente documento con la secuencia completamente complementaria de la molecula de acido nucleico de SEQ 10 NO: 1, SEQ 10 NO: 3 o SEQ 10 NO: 9, o de una molecula que codifica para un polipeptido, polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos tal como se muestra en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10, o de un fragmento de acido nucleico tal como se define en el presente documento, o de un fragmento de acido nucleico que codifica para un polipeptido tal como se define en el presente documento. Pueden prepararse sondas de hibridacion usando las secuencias de polipeptido similar a 1L-17 proporcionadas en el presente documento para examinar bibliotecas de A0N genomico o sintetico, A0Nc, para determinar secuencias relacionadas. Se determinan facilmente regiones de la secuencia de A0N y/o de aminoacidos de polipeptido similar a 1L-17 que presentan identidad significativa con secuencias conocidas usando algoritmos de alineacion de secuencias tal como se describe en el presente documento, y esas regiones pueden usarse para disefar sondas para el examen.

El termino quot;condiciones altamente rigurosasquot; se refiere a las condiciones que se disefan para permitir la hibridacion de hebras de A0N cuyas secuencias son altamente complementarias, y para excluir la hibridacion de A0N apareados de manera erronea significativamente. La rigurosidad de la hibridacion se determina principalmente mediante la temperatura, fuerza ionica y la concentracion de agentes de desnaturalizacion tales como formamida. Ejemplos de quot;condiciones altamente rigurosasquot; para hibridacion y lavado son cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M a 65-68DC o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M y formamida al 50% a 42DC. Veanse Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2' ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) y Anderson et al., Nucleic Acid Hibridation: a practical approach, cap. 4, 1RL Press Limited, Oxford, 1nglaterra (1999).

Tambien pueden usarse condiciones mas rigurosas (tales como temperatura superior, fuerza ionica inferior, contenido en formamida superior u otro agente de desnaturalizacion); sin embargo, la tasa de hibridacion se vera afectada. Pueden incluirse otros agentes en los tampones de hibridacion y lavado con el fin de reducir la hibridacion no especifica y/o de fondo. Ejemplos son albumina serica bovina al 0,1%, polivinilpirrolidona al 0,1%, pirofosfato de sodio al 0,1%, dodecilsulfato de sodio al 0,1% (Na0odSO4 o S0S), Ficoll, solucion de 0enhardt, A0N de esperma de salmon sonicado (u otro A0N no complementario) y sulfato de dextrano, aunque tambien pueden usarse otros agentes adecuados. La concentracion y los tipos de estos aditivos pueden cambiarse sin afectar sustancialmente a la rigurosidad de las condiciones de hibridacion. Los experimentos de hibridacion se llevan a cabo habitualmente a pH 6,8-7,4; sin embargo, a condiciones de fuerza ionica tipicas, la tasa de hibridacion es casi independiente del pH. Vease Anderson et al., citado anteriormente.

Los factores que afectan a la estabilidad de un duplex de A0N incluyen la composicion de bases, la longitud y el grado de apareamiento erroneo de pares de bases. El experto en la tecnica puede ajustar las condiciones de hibridacion con el fin de adaptar estas variables y permitir que A0N de diferente parentesco de secuencia formen hibridos. La temperatura de fusion de un duplex de A0N perfectamente apareado puede estimarse mediante la siguiente ecuacion:

Tm (DC) = 81,5 + 16,6 (log[Na+]) + 0,41 (% de G+C) - 600/N -0,72 (% de formamida)

en la que N es la longitud del duplex formado, [Na+] es la concentracion molar del ion sodio en la disolucion de hibridacion o lavado, % de G+C es el porcentaje de bases (guanina+citosina) en el hibrido. Para hibridos apareados de manera imperfecta, la temperatura de fusion se reduce en aproximadamente 1DC por cada 1% de apareamiento erroneo.

El termino quot;condiciones moderadamente rigurosasquot; se refiere a condiciones en las que puede formarse un duplex de A0N con un mayor grado de apareamiento erroneo de pares de bases del que podria producirse en quot;condiciones altamente rigurosasquot;. Ejemplos de quot;condiciones moderadamente rigurosasquot; tipicas son cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M a 50-65DC o cloruro de sodio 0,015 M, citrato de sodio 0,0015 M y formamida al 20% a 3750DC. A modo de ejemplo, una condicion quot;moderadamente rigurosaquot; de 50DC en ion sodio 0,015 M permitira aproximadamente un apareamiento erroneo del 21%.

Los expertos en la tecnica apreciaran que no existe una distincion absoluta entre condiciones quot;altamentequot; y quot;moderadamentequot; rigurosas. Por ejemplo, a ion sodio 0,015 M (sin formamida), la temperatura de fusion de A0N largo perfectamente apareado es de aproximadamente 71DC. Con un lavado a 65DC (a la misma fuerza ionica), esto permitira aproximadamente un apareamiento erroneo del 6%. Para capturar secuencias relacionadas mas distantemente, un experto en la tecnica puede simplemente disminuir la temperatura o aumentar la fuerza ionica.

Se proporciona una buena estimacion de la temperatura de fusion en NaCl* 1 M para sondas oligonucleotidicas de hasta aproximadamente 20 nt mediante:

Tm = 2DC por par de bases A-T + 4DC por par de bases G-C

*La concentracion de ion sodio en sal citrato de sodio (SSC) 6X es 1 M. Vease Suggs et al., 0evelopmental Biology Using Purified Genes, pag. 683, Brown and Fox (eds.) (1981).

Condiciones de lavado de rigurosidad alta para oligonucleotidos son habitualmente a una temperatura de 0-5DC por debajo de la Tm del oligonucleotido en SSC 6X, S0S al 0,1%.

En otra realizacion, las moleculas de acido nucleico relacionadas comprenden o consisten en una secuencia de nucleotidos que es aproximadamente el 70 por ciento (70%) identica a la secuencia de nucleotidos tal como se muestra en SEQ 10 NO: 1, SEQ 10 NO: 3 o SEQ 10 NO: 9, o comprenden o consisten esencialmente en una secuencia de nucleotidos que codifica para un polipeptido que es aproximadamente el 70 por ciento (70%) identica al polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10. En realizaciones preferidas, las secuencias de nucleotidos son aproximadamente el 75 por ciento, o aproximadamente el 80 por ciento, o aproximadamente el 85 por ciento, o aproximadamente el 90 por ciento, o aproximadamente el 95, el 96, el 97, el 98 o el 99 por ciento identicas a la secuencia de nucleotidos tal como se muestra en SEQ 10 NO: 1, SEQ 10 NO: 3 o SEQ 10 NO: 9, o las secuencias de nucleotidos codifican para un polipeptido que es aproximadamente el 75 por ciento, o aproximadamente el 80 por ciento, o aproximadamente el 85 por ciento, o aproximadamente el 90 por ciento, o aproximadamente el 95, el 96, el 91, el 98 o el 99 por ciento identico a la secuencia de polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10.

Las diferencias en la secuencia de acido nucleico pueden dar como resultado modificaciones conservativas y/o no conservativas de la secuencia de aminoacidos en relacion con la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10.

Las modificaciones conservativas en la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10 (y las modificaciones correspondientes en los nucleotidos codificantes) produciran polipeptidos similares a 1L-17 que tienen caracteristicas funcionales y quimicas similares a las de un polipeptido similar a 1L-17 que se produce de manera natural. Por el contrario, pueden lograrse modificaciones sustanciales en las caracteristicas funcionales y/o quimicas de polipeptidos similares a 1L-17 seleccionando sustituciones en la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10 que difieren significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura de la estructura principal molecular en la zona de la sustitucion, por ejemplo, como una conformacion de lamina o de helice, (b) la carga o hidrofobicidad de la molecula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral.

Por ejemplo, una quot;sustitucion de aminoacido conservativaquot; puede implicar una sustitucion de un residuo de aminoacido nativo por un residuo no nativo de manera que hay poco o ningun efecto sobre la polaridad o carga del residuo de aminoacido en esa posicion. Ademas, cualquier residuo nativo en el polipeptido tambien puede sustituirse por alanina, tal como se ha descrito anteriormente para la quot;mutagenesis por exploracion de alaninaquot;.

Sustituciones de aminoacidos conservativas tambien abarcan residuos de aminoacido que no se producen de manera natural que se incorporan normalmente mediante sintesis quimica de peptidos en lugar de mediante sintesis en sistemas biologicos. Estos incluyen peptidomimeticos y otras formas revertidas o invertidas de restos de aminoacido.

Los residuos que se producen de manera natural pueden dividirse en clases basadas en propiedades de la cadena lateral comunes:

1) hidrofobos: norleucina, Met, Ala, Val, Leu, 1le;

2) hidrofilos neutros: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

3) acidos: Asp, Glu;

4) basicos: His, Lys, Arg;

5) residuos que influyen en la orientacion de la cadena: Gly, Pro; y

6) aromaticos: Trp, Tyr, Phe.

Por ejemplo, las sustituciones no conservativas pueden implicar el intercambio de un miembro de una de estas clases por un miembro de otra clase. Tales residuos sustituidos pueden introducirse en regiones del polipeptido similar a 1L-17 humana que son homologas con ortologos de polipeptido similar a 1L-17 no humana, o en las regiones no homologas de la molecula.

Para realizar tales cambios, puede considerarse el indice hidropatico de aminoacidos. A cada aminoacido se le ha asignado un indice hidropatico basandose en sus caracteristicas de hidrofobicidad y carga. Son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8); fenilalanina (+2,8); cisteina/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+1,8); glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptofano (-0,9); tirosina (-1,3); prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9); y arginina (-4,5).

Se entiende en la tecnica la importancia del indice hidropatico de aminoacidos para conferir funcion biologica interactiva en una proteina. Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131 (1982). Se sabe que determinados aminoacidos pueden sustituirse por otros aminoacidos que tienen una puntuacion o indice hidropatico similar y todavia conservan una actividad biologica similar. Para realizar cambios basandose en el indice hidropatico, se prefiere la sustitucion de aminoacidos cuyos indices hidropaticos estan dentro de ±2, se prefieren particularmente los que estan dentro de ±1 e incluso se prefieren mas particularmente los que estan dentro de ±0,5.

Tambien se entiende en la tecnica que la sustitucion de aminoacidos similares puede realizarse eficazmente basandose en la hidrofilicidad, particularmente cuando la proteina o el peptido equivalente biologicamente funcional creado de ese modo esta destinado para su uso en realizaciones inmunologicas, como en el presente caso. La mayor hidrofobicidad promedio local de una proteina, tal como se rige por la hidrofilicidad de sus aminoacidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad y antigenicidad, es decir, con una propiedad biologica de la proteina.

Los siguientes valores de hidrofilicidad se han asignado a estos residuos de aminoacido: arginina (+3,0); lisina (+3,0); aspartato (+3,0 ± 1); glutamato (+3,0 ± 1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0); treonina (-0,4); prolina (-0,5 ± 1); alanina (-0,5); histidina (-0,5); cisteina (-1,0); metionina (-1,3); valina (-1,5); leucina (-1,8); isoleucina (-1,8); tirosina (-2,3); fenilalanina (-2,5) y triptofano (-3,4). Para realizar cambios basandose en valores de hidrofilicidad similares, se prefiere la sustitucion de aminoacidos cuyos valores de hidrofilicidad estan dentro de ±2, se prefieren particularmente los que estan dentro de ±1, e incluso se prefieren mas particularmente los que estan dentro de ±0,5. Tambien pueden identificarse epitopos a partir de secuencias de aminoacidos primarias basandose en la hidrofilicidad. Estas regiones tambien se denominan quot;regiones de nucleo epitopicoquot;.

Los expertos en la tecnica pueden determinar sustituciones de aminoacidos deseadas (ya sean conservativas o no conservativas) en el momento en el que se deseen tales sustituciones. Por ejemplo, pueden usarse sustituciones de aminoacidos para identificar residuos importantes del polipeptido similar a 1L-17, o para aumentar o disminuir la afinidad de los polipeptidos similares a 1L-17 descritos en el presente documento.

Se exponen en la tabla 1 sustituciones de aminoacidos a modo de ejemplo.

Tabla 1 Sustituciones de aminoacidos

Residuos originales: Sustituciones a modo de ejemplo Sustituciones preferidas

Ala: Val, Leu, 1le Val

Arg: Lys, Gln, Asn Lys

Asn: Gln Gln

Asp: Glu Glu

Cys: Ser, Ala Ser

Gln: Asn Asn

Glu: Asp Asp

Gly: Pro, Ala Ala

His: Asn, Gln, Lys, Arg Arg

1le: Leu, Val, Met, Ala, Phe, Norleucina Leu

Leu: Norleucina, 1le Val, Met, Ala, Phe 1le

Lys: Arg, acido 1,4-diamino-butirico, Gln, Asn Arg

Met: Leu, Phe, 1le Leu

Phe: Leu, Val, 1le, Ala, Tyr Leu

Pro: Ala Gly

Ser: Thr, Ala, Cys Thr

Thr: Ser Ser

Trp: Tyr, Phe Tyr

Tyr: Trp, Phe, Thr, Ser Phe

Val: 1le, Met, Leu, Phe, Ala, Norleucina Leu

Un experto en la tecnica podra determinar variantes adecuadas del polipeptido tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10 usando tecnicas bien conocidas. Para identificar zonas adecuadas de la molecula 5 que pueden cambiarse sin destruir la actividad, un experto en la tecnica puede seleccionar como diana zonas que no se cree que sean importantes para la actividad. Por ejemplo, cuando se conocen polipeptidos similares con actividades similares de la misma especie o de otra especie, el experto en la tecnica puede comparar la secuencia de aminoacidos de un polipeptido similar a 1L-17 con tales polipeptidos similares. Con una comparacion de este tipo, pueden identificarse residuos y partes de las moleculas que se conservan entre polipeptidos similares. Se apreciara 10 que cambios en zonas de un polipeptido similar a 1L-17 que no se conservan en relacion con tales polipeptidos similares sera menos probable que afecten de manera adversa a la actividad biologica y/o a la estructura del polipeptido similar a 1L-17. El experto en la tecnica tambien sabra que, incluso en regiones relativamente conservadas, pueden sustituirse aminoacidos quimicamente similares por los residuos que se producen de manera natural manteniendo al mismo tiempo la actividad (sustituciones de residuos de aminoacido conservativas). Por

15 tanto, incluso zonas que pueden ser importantes para la actividad biologica o para la estructura pueden someterse a sustituciones conservativas de aminoacidos sin destruir la actividad biologica o sin afectar de manera adversa a la estructura del polipeptido.

Adicionalmente, un experto en la tecnica puede revisar estudios de estructura-funcion que identifican residuos en polipeptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. En vista de una comparacion de este tipo,

20 puede pronosticarse la importancia de los residuos de aminoacido en un polipeptido similar a 1L-17 que se corresponden con residuos de aminoacido que son importantes para la actividad o la estructura en polipeptidos similares. Un experto en la tecnica puede optar por sustituciones de aminoacidos quimicamente similares para tales residuos de aminoacido importantes pronosticados de polipeptidos similares a 1L-17.

Un experto en la tecnica tambien puede analizar la estructura tridimensional y la secuencia de aminoacidos en

25 relacion con esa estructura en polipeptidos similares. En vista de tal informacion, un experto en la tecnica puede pronosticar la alineacion de residuos de aminoacido de un polipeptido similar a 1L-17 con respecto a su estructura tridimensional. Un experto en la tecnica puede elegir no realizar cambios de radicales en residuos de aminoacido que se pronostica que estan en la superficie de la proteina, puesto que tales residuos pueden estar implicados en interacciones importantes con otras moleculas. Ademas, un experto en la tecnica puede generar variantes de prueba

30 que contienen una sustitucion de un unico aminoacido en cada residuo de aminoacido deseado. Entonces pueden seleccionarse las variantes usando ensayos de actividad conocidos por los expertos en la tecnica. Tales variantes podrian usarse para reunir informacion sobre variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubre que un cambio en un residuo de aminoacido particular dio como resultado actividad destruida, reducida de manera no deseada o inadecuada, se evitarian las variantes con un cambio de este tipo. En otras palabras, basandose en la informacion

35 reunida a partir de tales experimentos de rutina, un experto en la tecnica puede determinar facilmente los aminoacidos en los que deben evitarse sustituciones adicionales o bien solas o bien en combinacion con otras mutaciones.

Varias publicaciones cientificas se han dedicado a la prediccion de la estructura secundaria. Veanse Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4): 422-427 (1996), Chou et al., Biochemistry, 13 (2): 222-245 (1974); Chou et al., Biochemistry, 113 (2): 211-222 (1974); Chou et al., Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 47: 45-148 (1978); Chou et al., Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 y Chou et al., Biophys. J., 26: 367-384 (1979). Ademas, actualmente estan disponibles programas informaticos para ayudar en la prediccion de la estructura secundaria. Un metodo de prediccion de la estructura secundaria se basa en el modelado de homologia. Por ejemplo, dos polipeptidos o proteinas que tienen una identidad de secuencia de mas del 30%, o similitud mayor del 40% a menudo tienen topologias estructurales similares. El reciente aumento de la base de datos estructurales de proteinas (P0B) ha proporcionado una predictibilidad potenciada de la estructura secundaria, incluyendo el posible numero de pliegues dentro de la estructura de un polipeptido o una proteina. Vease Holm et al., Nucl. Acid. Res., 27 (1): 244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner et al., Curr. Op. Struct. Biol., 7(3): 369-376 (1997)) que hay un numero limitado de pliegues en una proteina o polipeptido dado y que una vez se ha resuelto un numero critico de estructuras, la prediccion estructural se volvera drasticamente mas precisa.

Metodos adicionales de prediccion de la estructura secundaria incluyen quot;reconocimiento de plegamientoquot; (Jones, 0., Curr. Opin. Struct. Biol., 7(3): 311-81 (1997); Sippl et al., Structure, 4(1): 15-19 (1996)), quot;analisis del perfilquot; (Bowie et al., Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov et al., Met. Enzym., 183: 146-159 (1990); Gribskov et al., Proc. Nat. Acad. Sci., 84 (13): 4355-4358 (1987)) y quot;vinculo evolutivoquot; (Vease Holm, citado anteriormente (1999), y Brenner, citado anteriormente (1997)).

Pueden determinarse analogos de polipeptido similar a 1L-17 de la invencion comprando la secuencia de aminoacidos de polipeptido similar a 1L-17 con miembros de la familia relacionados. Miembros de la familia relacionados con el polipeptido similar a 1L-17 a modo de ejemplo son 1L-17 humana (SEQ 10 NO: 5), 1L-20 humana (SEQ 10 NO: 6), 1L-17B humana (SEQ 10 NO: 7) e 1L-17C humana (SEQ 10 NO: 8). Esta comparacion puede lograrse usando un alineamiento Pileup ((isconsin GCG Program Package) o una comparacion equivalente (solapamiento) con multiples miembros de la familia dentro de regiones conservadas y no conservadas.

Tal como se muestra en la figura 5, la secuencia de aminoacidos pronosticada de polipeptido similar a 1L-17 humana (que representa los aminoacidos 37 a 160 de SEQ 10 NO: 2) se alinea con una 1L-17B humana conocida (SEQ 10 NO: 7). Pueden determinarse otros analogos de polipeptido similar a 1L-17 usando este y otros metodos conocidos por los expertos en la tecnica. Estas secuencias solapantes proporcionan orientacion para sustituciones de aminoacidos conservativas y no conservativas dando como resultado analogos de polipeptido similar a 1L-17 adicionales. Se apreciara que estas sustituciones de aminoacidos pueden consistir en aminoacidos que se producen de manera natural o que no se producen de manera natural. Por ejemplo, tal como se representa en la figura 5, la alineacion de los miembros de la familia relacionados indica que los posibles analogos de polipeptido similar a 1L-17 pueden tener el residuo Asn en la posicion 67 de SEQ 10 NO: 2 (posicion 101 en la figura 5) sustituido por un residuo de Gln, el residuo de Arg en la posicion 69 de SEQ 10 NO: 2 (posicion 103 en la figura 5) sustituido por un residuo de Lys, Gln o Asn y/o el residuo de Cys en la posicion 94 de SEQ 10 NO: 2 (posicion 128 en la figura 5) sustituido por un residuo de Ser o Ala. Ademas, los posibles analogos de polipeptido similar a 1L-17 pueden tener el residuo de Cys en la posicion 96 de SEQ 10 NO: 2 (posicion 130 en la figura 5) sustituido por un residuo de Ala o Ser, el residuo de Val en la posicion 101 de SEQ 10 NO: 2 (posicion 132 en la figura 5) sustituido por un residuo de He, Leu, Met, Phe, Ala o norleucina, el residuo de Thr en la posicion 104 de SEQ 10 NO: 2 (posicion 138 en la figura 5) sustituido por un residuo de Ser, el residuo de Cys en la posicion 129 de SEQ 10 NO: 2 (posicion 163 en la figura 5) sustituido por un residuo de Ser o Ala y/o el residuo de Cys en la posicion 140 de SEQ 10 NO: 2 (posicion 174 en la figura 5) sustituido por un residuo de Ser o Ala.

Las variantes de polipeptido similar a 1L-17 preferidas incluyen variantes de glicosilacion en el que el numero y/o tipo de sitio de glicosilacion se han alterado en comparacion con la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10. En una realizacion, las variantes de polipeptido similar a 1L-17 comprenden un numero mayor o menor de sitios de glicosilacion unidos a N que la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10. Un sitio de glicosilacion unido a N se caracteriza por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en la que el residuo de aminoacido designado como X puede ser cualquier residuo de aminoacido excepto prolina. La sustitucion de residuos de aminoacido para crear esta secuencia proporciona un posible nuevo sitio para la adicion de una cadena de hidrato de carbono unida a N. Alternativamente, las sustituciones que eliminan esta secuencia eliminaran una cadena de hidrato de carbono unida a N existente. Tambien se proporciona una redisposicion de cadenas de hidrato de carbono unidas a N en la que se eliminan uno o mas sitios de glicosilacion unidos a N (normalmente los que se producen de manera natural) y se crean uno mas sitios unidos a N nuevos. Las variantes de polipeptido similar a 1L-17 preferidas adicionales incluyen variantes de cisteina en las que se delecionan uno o mas residuos de cisteina de o se sustituyen por otro aminoacido (por ejemplo, serina) en comparacion con la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10. Las variantes de cisteina son utiles cuando deben volverse a plegar polipeptidos similares a 1L-17 en una conformacion biologicamente activa tal como tras el aislamiento de cuerpos de inclusion insolubles. Las variantes de cisteina generalmente tienen menos residuos cisteina que la proteina nativa, y normalmente tienen un numero par para minimizar las interacciones que resultan de cisteinas desapareadas.

Ademas, el polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10, o una variante de polipeptido similar a 1L-17 pueden fusionarse con un polipeptido homologo para formar un homodimero o con un polipeptido heterologo para formar un heterodimero. Los peptidos y polipeptidos heterologos incluyen, pero no se limitan a: un epitopo que permite la deteccion y/o el aislamiento de un polipeptido de fusion de polipeptido similar a 1L-17; una proteina receptora transmembrana o una parte de la misma, tal como un dominio extracelular, o un domino transmembrana e intracelular; un ligando o una parte del mismo que se une a una proteina receptora transmembrana; una enzima o una parte de la misma que es cataliticamente activa; un polipeptido o peptido que promueve la oligomerizacion, tal como un dominio de cremallera de leucinas; un polipeptido o peptido

5 que aumenta la estabilidad, tal como una region constante de inmunoglobulina; y un polipeptido que tiene una actividad terapeutica diferente del polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos tal como se expone en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: o SEQ 10 NO: 10, o una variante de polipeptido similar a 1L-17.

Pueden realizarse fusiones o bien en el extremo amino terminal o bien en el extremo carboxilo terminal del polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10 10, o una variante de polipeptido similar a 1L-17. Las fusiones pueden ser directas sin molecula de adaptador o ligador, o indirectas usando una molecula de adaptador o ligador. Una molecula de adaptador o ligador puede ser uno o mas residuos de aminoacido, normalmente desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 50 residuos de aminoacido. Una molecula de adaptador o ligador tambien puede disefarse con un sitio de escision para una endonucleasa de restriccion de A0N o para una proteasa para permitir la separacion de los restos fusionados. Se

15 apreciara que una vez construidos, los polipeptidos de fusion pueden derivatizarse segun los metodos descritos en el presente documento.

En una descripcion adicional, el polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2 o una variante de polipeptido similar a 1L-17 se fusiona con uno o mas dominios de una region de Fc de 1gG humana. Los anticuerpos comprenden dos partes funcionalmente independientes, un dominio variable conocido como quot;Fabquot;, que

20 se une a antigenos, y un dominio constante conocido como quot;Fcquot;, que esta implicado en funciones efectoras tales como activacion del complemento y ataque por celulas fagociticas. Un Fc tiene una semivida serica larga, mientras que un Fab es de semivida corta. Capon et al., Nature, 337:525-31 (1989). Cuando se construye junto con una proteina terapeutica, un dominio Fc puede proporcionar semivida mas larga o incorporar funciones tales como union a receptor de Fc, union a proteina A, fijacion del complemento y quiza incluso transferencia placentaria. Id.

25 La tabla 11 resume el uso de determinadas fusiones de Fc conocidas en la tecnica.

Tabla 11

Fusion de Fc con proteinas terapeuticas

Forma de Fc: Compafero de fusion 1mplicaciones terapeuticas Referencia

1gG1: extremo Nterminal de C03-L enfermedad de Hodgkin; linfoma anaplasico; leucemia de celulas T Patente estadounidense n.D 5.480.981

Fcy2 murino: 1L-10 antiinflamatoria; rechazo de trasplante Zheng et al. (1995) J. 1mmunol., 154: 5590-5600

1gG1: receptor de TNF choque septicemico Fisher et al. (1996), N. Engl. J. Med., 334: 1697-1702; Van Zee et al., (1996) J. 1mmunol., 156: 2221-2230

1gG, 1gA, 1gM o 1gE (excluyendo el primero dominio): receptor de TNF inflamacion, trastornos autoinmunitarios Patente estadounidense n.D 5.808.029, expedida el 15 de septiembre de 1998

1gG1: receptor de C04 S10A Capon et al. (1989), Nature 337: 525531

1gG1, 1gG3: extremo Nterminal de 1L-2 anticancerigeno, antiviral Harvill et al. (1995) 1mmunotech., 1: 95-105

1gG1: extremo Cterminal de OPG osteoartritis; densidad osea 0ocumento (O 97/23614, publicado el 3 de julio de 1997

1gG1: extremo-N terminal de leptina antiobesidad 0ocumento PCT/US 97/23183, presentado el 11 de diciembre de 1997

Cy1 de 1g humana: CTLA-4 trastornos autoinmunitarios Linsley (1991), J. Exp. Med., 174:561569

En un ejemplo, toda o una parte de las regiones de bisagra de 1gG humana, CH2 y CH3 pueden fusionarse o bien en el extremo N-terminal o bien en el extremo C-terminal de los polipeptidos similares a 1L-17 usando metodos 30 conocidos por el experto en la tecnica. El polipeptido de fusion similar a 1L-17 resultante puede purificarse mediante el uso de una columna de afinidad a proteina A. Se ha encontrado que los peptidos y las proteinas fusionadas a una region Fc presentan una semivida sustancialmente mayor in vivo que las equivalente no fusionadas. Ademas, una fusion a una region Fc permite la dimerizacion/multimerizacion del polipeptido de fusion. La region Fc puede ser una region Fc que se produce de manera natural, o puede alterarse para mejorar determinadas cualidades, tales como

35 cualidades terapeuticas, tiempo de circulacion, reducir la agregacion, etc.

Puede calcularse facilmente la identidad y la similitud de polipeptidos y moleculas de acido nucleico relacionadas mediante metodos conocidos. Tales metodos incluyen, pero no se limitan a, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nueva York (1988); Biocomputing: 1nformatics and Genome Projects, Smith, 0.(., ed., Academic Press, Nueva York (1993); Computer Analysis of Sequence 0ata, Part 1, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., ed., Humana Press, Nueva Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y 0evereux, J., ed., M. Stockton Press, Nueva York (1991); y Carillo et al., S1AM J. Applied Math., 48:1073 (1988) .

Los metodos preferidos para determinar la identidad y/o similitud se disefan para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias sometidas a prueba. Los metodos para determinar la identidad y similitud se describen en programas informaticos publicamente disponibles. Los metodos de programas informaticos preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programa GCG, incluyendo GAP (0evereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of (isconsin, Madison, (1, BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). El programa BLASTX esta publicamente disponible del Centro Nacional de 1nformacion Biotecnologica (quot;National Center for Biotechnology Informationquot;) (NCB1) y otras fuentes {BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/N1H Betesda, M0 20894; Altschul et al., citado anteriormente (1990)). Tambien puede usarse el algoritmo de Smith (aterman bien conocido para determinar la identidad.

0eterminados esquemas de alineacion para alinear dos secuencias de aminoacidos pueden dar como resultado la coincidencia de solo una region corta de las dos secuencias, y esta pequefa region alineada puede tener identidad de secuencia muy alta incluso aunque no haya una relacion significativa entre las dos secuencias de longitud completa. Por consiguiente, en una realizacion preferida, el metodo de alineacion seleccionado (programa GAP) dara como resultado una alineacion que abarca al menos 50 aminoacidos contiguos del polipeptido diana.

Por ejemplo, usando el algoritmo informatico GAP (Genetics Computer Group, University of (isconsin, Madison, (1), se alinean dos polipeptidos para los que va a determinarse el porcentaje de identidad de secuencia para la coincidencia optima de sus aminoacidos respectivos (el quot;tramo apareadoquot;, tal como se determina mediante el algoritmo). Se usan una penalizacion por apertura de huecos (que se calcula como 3X la diagonal promedio; la quot;diagonal promedioquot; es el promedio de la diagonal de la matriz de comparacion que esta usandose; la quot;diagonalquot; es la puntuacion o el numero asignado a cada coincidencia de aminoacido perfecta por la matriz de comparacion particular) y una penalizacion por extension de huecos (que habitualmente es 1/10 veces la penalizacion por apertura de huecos), asi como una matriz de comparacion tal como PAM 250 o BLOSUM 62 junto con el algoritmo. El algoritmo tambien usa una matriz de comparacion convencional (vease 0ayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, 5(3) (1978) para la matriz de comparacion PAM 250; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89:10915-10919 (1992) para la matriz de comparacion BLOSUM 62).

Los parametros preferidos para una comparacion de secuencias de polipeptidos incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol., 48:443-453 (1970);

Matriz de comparacion: BLOSUM 62 de Henikoff et al., citado anteriormente (1992);

Penalizacion por hueco: 12

Penalizacion por longitud de hueco: 4

Umbral de similitud: 0

El programa GAP es util con los parametros anteriores. Los parametros mencionados anteriormente son los parametros por defecto para las comparaciones de polipeptidos (junto con sin penalizacion para los huecos de los extremos) usando el algoritmo GAP.

Los parametros preferidos para las comparaciones de secuencias de moleculas de acido nucleico incluyen los siguientes:

Algoritmo: Needleman et al., citado anteriormente (1970);

Matriz de comparacion: coincidencias = +10, no coincidencia = 0

Penalizacion por hueco: 50

Penalizacion por longitud de hueco: 3

El programa GAP tambien es util con los parametros anteriores. Los parametros mencionados anteriormente son los parametros por defecto para comparaciones de moleculas de acido nucleico.

Pueden usarse otros algoritmos, penalizaciones por apertura de huecos, penalizaciones por extension de huecos, matrices de comparacion, umbrales de similitud, etc., a modo de ejemplo, incluyendo los expuestos en el manual del programa, paquete (isconsin, version 9, septiembre de 1997. Las elecciones particulares que van a realizarse resultaran evidentes para los expertos en la tecnica y dependeran de la comparacion especifica que va a realizarse, tal como A0N con A0N, proteina con proteina, proteina con A0N; y adicionalmente, si la comparacion es entre pares dados de secuencias (en cuyo caso se prefieren generalmente GAP o BestFit) o entre una secuencia y una gran base de datos de secuencias (en cuyo caso se prefieren FASTA o BLASTA).

Sintesis

Los expertos en la tecnica apreciaran que las moleculas de acido nucleico y polipeptido descritas en el presente documento pueden producirse mediante medios recombinantes y otros.

Moleculas de acido nucleico

Las moleculas de acido nucleico codifican para un polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de un polipeptido similar a 1L-17 y pueden obtenerse facilmente en una variedad de maneras incluyendo, sin limitacion, sintesis quimica, A0Nc o examen de biblioteca genomica, examen de biblioteca de expresion y/o amplificacion mediante PCR de A0Nc.

Los metodos de A0N recombinante usados en el presente documento son generalmente los expuestos en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), y/o Ausubel et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers 1nc. y (iley and Sons, NY (1994). La presente solicitud da a conocer moleculas de acido nucleico tal como se describen en el presente documento y metodos para obtener tales moleculas.

Cuando se ha identificado un gen que codifica para la secuencia de aminoacidos de un polipeptido similar a 1L-17 de una especie, puede usarse todo o una parte de ese gen como sonda para identificar ortologos o genes relacionados de la misma especie. Las sondas o cebadores pueden usarse para examinar bibliotecas de A0Nc de diversas fuentes de tejido que se cree que expresan el polipeptido similar a 1L-17. Ademas, parte o toda de una molecula de acido nucleico que tiene la secuencia tal como se expone en SEQ 10 NO: 1, SEQ 10 NO: 3 o SEQ 10 NO: 9 puede usarse para examinar una biblioteca genomica para identificar y aislar un gen que codifica para la secuencia de aminoacidos de un polipeptido similar a 1L-17. Normalmente, se emplearan condiciones de rigurosidad moderada o alta para examinar, para minimizar el numero de falsos positivos obtenidos a partir del examen.

Las moleculas de acido nucleico que codifican para la secuencia de aminoacidos de polipeptidos similares a 1L-17 tambien pueden identificarse mediante la clonacion de expresion que emplea la deteccion de clones positivos basandose en una propiedad de la proteina expresada. Normalmente, se examinan bibliotecas de acido nucleico mediante la union de un anticuerpo u otro compafero de union (por ejemplo, receptor o ligando) para proteinas clonadas que se expresan y presentan sobre la superficie de una celula huesped. El anticuerpo o compafero de union se modifica con un marcador detectable para identificar las celulas que expresan el clon deseado.

Pueden seguirse tecnicas de expresion recombinante realizadas segun las descripciones expuestas a continuacion para producir estos polinucleotidos y para expresar los polipeptidos codificados. Por ejemplo, insertando una secuencia de acido nucleico que codifica para la secuencia de aminoacidos de un polipeptido similar a 1L-17 en un vector apropiado, un experto en la tecnica puede producir facilmente grandes cantidades de la secuencia de nucleotidos deseada. Entonces, las secuencias pueden usarse para generar sondas de deteccion o cebadores de amplificacion. Alternativamente, puede insertarse un polinucleotido que codifica para la secuencia de aminoacidos de un polipeptido similar a 1L-17 en un vector de expresion. 1ntroduciendo el vector de expresion en un huesped apropiado, puede producirse el polipeptido similar a 1L-17 codificado en grandes cantidades.

Otro metodo para obtener una secuencia de acido nucleico adecuada es la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). En este metodo, se prepara A0Nc a partir de poli(A)+ARN o ARN total usando la enzima transcriptasa inversa. 0os cebadores, normalmente complementarios para dos regiones separadas de A0Nc (oligonucleotidos) que codifican para la secuencia de aminoacidos de un polipeptido similar a 1L-17, se afaden entonces al A0Nc junto con una polimerasa tal como Taq polimerasa, y la polimerasa amplifica la region de A0Nc entre los dos cebadores.

Otros medios de preparacion de una molecula de acido nucleico que codifica para la secuencia de aminoacidos de un polipeptido similar a 1L-17 es sintesis quimica usando metodos bien conocidos por el experto en la tecnica, tal como los descritos por Engels et al., Angew. Chem. 1ntl. Ed., 28:716-734 (1989). Estos metodos incluyen, entre otros, los metodos de fosfotriester, fosforamidita y H-fosfonato para la sintesis de acido nucleico. Un metodo preferido para tal sintesis quimica es sintesis soportada por polimero usando quimica de fosforamidita convencional. Normalmente, el A0N que codifica para la secuencia de aminoacidos de un polipeptido similar a 1L-17 tendra varios cientos de nucleotidos de longitud. Pueden sintetizarse acidos nucleicos mayores de aproximadamente 100 nucleotidos como varios fragmentos usando estos metodos. Entonces, los fragmentos pueden ligarse entre si formando la secuencia de nucleotidos de secuencia completa de un polipeptido similar a 1L-17. Habitualmente, el fragmento de A0N que codifica para el extremo amino terminal del polipeptido tendra un ATG, que codifica para un residuo de metionina. Esta metionina puede estar o no presente en la forma madura del polipeptido similar a 1L-17, dependiendo de si el polipeptido producido en la celula huesped esta disefado para secretarse a partir de esa celula. Tambien pueden usarse otros metodos conocidos por el experto en la tecnica.

En determinadas realizaciones, las variantes de acido nucleico contienen codones que se han alterado para la expresion optima de un polipeptido similar a 1L-17 en una celula huesped dada. Las alteraciones de codon particulares dependeran del/de los polipeptido(s) similar(es) a 1L-17 y la/las celula(s) huesped seleccionada(s) para la expresion. Tal quot;optimizacion de codonesquot; puede llevarse a cabo mediante una variedad de metodos, por ejemplo, seleccionando codones que se prefieren para su uso en genes altamente expresados en una celula huesped dada. Pueden usarse algoritmos informaticos que incorporan tablas de frecuencia de codones tales como quot;Ecohigh.codquot; para determinar la preferencia de codones de genes bacterianos altamente expresados y se proporcionan por el University of (isconsin Package version 9.0, Genetics Computer Group, Madison, (1. Otras tablas de frecuencia de codones utiles incluyen quot;Celegans�high.codquot;, quot;Celegans�low.codquot;, quot;0rosophila�high.codquot;, quot;Human�high.codquot;, quot;Maize�high.codquot; y quot;Yeast�high.codquot; .

Vectores y celulas huesped

Una molecula de acido nucleico que codifica para la secuencia de aminoacidos de un polipeptido similar a 1L-17 puede insertarse en un vector de expresion apropiado usando tecnicas de ligamiento habituales. El vector se selecciona normalmente para que sea funcional en la celula huesped particular empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la celula huesped de modo que puede producirse la amplificacion del gen y/o la expresion del gen). Una molecula de acido nucleico que codifica para la secuencia de aminoacidos de un polipeptido similar a 1L-17 puede amplificarse/expresarse en celulas huesped procariotas, de levadura, de insecto (sistemas de baculovirus) y/o eucariotas. La seleccion de la celula huesped dependera en parte de si un polipeptido similar a 1L-17 va a modificarse postraduccionalmente (por ejemplo, glicosilarse y/o fosforilarse). Si es asi, son preferibles celulas huesped de levadura, de insecto o de mamifero. Para una revision de vectores de expresion, vease Met. Enz., vol. 185, 0.V. Goeddel, ed., Academic Press 1nc., San 0iego, CA (1990).

Normalmente, los vectores de expresion usados en cualquiera de las celulas huesped contendran secuencias para el mantenimiento del plasmido y para la clonacion y la expresion de secuencias de nucleotidos exogenas. Tales secuencias, denominadas conjuntamente quot;secuencias flanqueantesquot; en determinadas realizaciones, incluiran normalmente una o mas de las siguientes secuencias de nucleotidos: un promotor, una o mas secuencias potenciadoras, un origen de replicacion, una secuencia de terminacion transcripcional, una secuencia de intron completa que contiene un sitio de corte y empalme donador y aceptor, una secuencia que codifica para una secuencia lider para la secrecion del polipeptido, un sitio de union a ribosomas, una secuencia de poliadenilacion, una region de poliligador para insertar el acido nucleico que codifica para el polipeptido que va a expresarse y un elemento de marcador seleccionable. Cada una de estas secuencias se comenta a continuacion.

Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia que codifica para una quot;etiquetaquot;, es decir, una molecula de oligonucleotido ubicada en el extremo 5' o 3' de la secuencia que codifica para polipeptido similar a 1L-17; la secuencia de oligonucleotido codifica para poliHis (tal como hexaHis), u otra quot;etiquetaquot; tal como FLAG, HA (hemaglutinina de virus influenza) o myc para las que existen anticuerpos disponibles comercialmente. Esta etiqueta se fusiona normalmente con el polipeptido tras la expresion del polipeptido, y puede servir como medio para la purificacion por afinidad del polipeptido similar a 1L-17 de la celula huesped. La purificacion por afinidad puede lograrse, por ejemplo, mediante cromatografia en columna usando anticuerpos contra la etiqueta como una matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta puede eliminarse posteriormente del polipeptido similar a 1L-17 purificado mediante diversos medios tales como el uso de determinadas peptidasas para la escision.

Las secuencias flanqueantes pueden ser homologas (es decir, de la misma especie y/o cepa que la celula huesped), heterologas (es decir, de una especie distinta de la especie o cepa de la celula huesped), hibridas (es decir, una combinacion de secuencias flanqueantes de mas de una fuente) o sinteticas, o las secuencias flanqueantes pueden ser secuencias nativas que normalmente funcionan regulando la expresion de polipeptido similar a 1L-17. Como tal, la fuente de una secuencia flanqueante puede ser cualquier organismo procariota o eucariota, cualquier organismo vertebrado o invertebrado o cualquier vegetal, siempre que la secuencia flanqueante sea funcional en, y pueda activarse por, la maquinaria de la celula huesped.

Las secuencias flanqueantes utiles en los vectores de esta invencion pueden obtenerse mediante cualquiera de varios metodos bien conocidos en la tecnica. Normalmente, las secuencias flanqueantes utiles en el presente documento distintas de las secuencias flanqueantes del gen de polipeptido similar a 1L-17 se habran identificado previamente mediante mapeo y/o mediante digestion con endonucleasas de restriccion y por tanto pueden aislarse de la fuente de tejido apropiada usando las endonucleasas de restriccion apropiadas. En algunos casos, puede conocerse la secuencia de nucleotidos completa de una secuencia flanqueante. En este caso, la secuencia flanqueante puede sintetizarse usando los metodos descritos en el presente documento para la sintesis o la clonacion de acido nucleico.

Cuando se conoce toda o solo una parte de la secuencia flanqueante, puede obtenerse usando PCR y/o mediante examen de una biblioteca genomica con fragmentos de secuencia flanqueante y/u oligonucleotido adecuados de la misma o de otra especie. Cuando no se conoce la secuencia flanqueante, puede aislarse un fragmento de A0N que contiene una secuencia flanqueante a partir de un trozo mas grande de A0N que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificante o incluso otro gen o genes. El aislamiento puede lograrse mediante digestion con endonucleasas de restriccion para producir el fragmento de A0N apropiado seguido por aislamiento usando purificacion en gel de agarosa, cromatografia en columna Qiagen� (Chatsworth, CA), u otros metodos conocidos por el experto en la tecnica. La seleccion de enzimas adecuadas para lograr este fin resultara facilmente evidente para un experto habitual en la tecnica.

Un origen de replicacion es normalmente una parte de los vectores de expresion procariotas adquiridos comercialmente, y el origen ayuda en la amplificacion del vector en una celula huesped. La amplificacion del vector hasta un determinado numero de copias puede ser importante, en algunos casos, para la expresion optima de un polipeptido similar a 1L-17. Si el vector de eleccion no contiene un origen de sitio de replicacion, puede sintetizarse quimicamente uno basandose en una secuencia conocida, y ligarse en el vector. Por ejemplo, el origen de replicacion del plasmido pBR322 (n.D de producto 303-3s, New England Biolabs, Beverly, MA) es adecuado para la mayoria de bacterias Gram-negativas, y diversos origenes (por ejemplo, SV40, polioma, adenovirus, virus de la estomatitis vesicular (VSV) o virus del papiloma tales como VPH o VPB) son utiles para clonar vectores en celulas de mamifero. Generalmente, el componente de origen de replicacion no es necesario para vectores de expresion de mamifero (por ejemplo, a menudo el origen de SV40 se usa solo debido a que contiene el promotor temprano).

Una secuencia de terminacion de la transcripcion se ubica normalmente en 3' del extremo de una region que codifica para polipeptido y sirve para terminar la transcripcion. Habitualmente, una secuencia de terminacion de la transcripcion en celulas procariotas es un fragmento rico en G-C seguido por una secuencia de poli T. Aunque la secuencia se clona facilmente a partir de una biblioteca o incluso se adquiere comercialmente como parte de un vector, tambien puede sintetizarse facilmente usando metodos para la sintesis de acidos nucleicos tales como los descritos en el presente documento.

Un elemento de gen marcador seleccionable codifica para una proteina necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una celula huesped hecha crecer en un medio de cultivo selectivo. Los genes de marcador de seleccion tipicos codifican para proteinas que (a) confieren resistencia a antibioticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, tetraciclina o kanamicina para celulas huesped procariotas, (b) complementan deficiencias auxotroficas de la celula; o (c) suministran nutrientes criticos no disponibles a partir de medios complejos. Marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia a kanamicina, el gen de resistencia a ampicilina y el gen de resistencia a tetraciclina. Tambien puede usarse un gen de resistencia a neomicina para la seleccion en celulas huesped procariotas y eucariotas.

Pueden usarse otros genes de seleccion para amplificar el gen que va a expresarse. La amplificacion es el proceso en el que los genes que se demandan mas para la produccion de una proteina critica para el crecimiento se repiten en tandem dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de celulas recombinantes. Los ejemplos de marcadores seleccionables adecuados para celulas de mamifero incluyen dihidrofolato reductasa (0HFR) y timidina cinasa. Los transformantes de celulas de mamifero se colocan bajo presion de seleccion a la que solo los transformantes estan excepcionalmente adaptados para sobrevivir en virtud del gen de seleccion presente en el vector. La presion de seleccion se impone cultivando las celulas transformadas en condiciones en las que la concentracion del agente de seleccion en el medio se cambia sucesivamente, conduciendo de ese modo a la amplificacion tanto del gen de seleccion como del A0N que codifica para un polipeptido similar a 1L-17. Como resultado, se sintetizan cantidades aumentadas de polipeptido similar a 1L-17 a partir del A0N amplificado.

Habitualmente, es necesario un sitio de union a ribosomas para la iniciacion de la traduccion de ARNm y se caracteriza por una secuencia de Shine-0algarno (procariotas) o una secuencia de Kozak (eucariotas). El elemento se ubica normalmente en 3' con respecto al promotor y en 5' con respecto a la secuencia codificante de un polipeptido similar a 1L-17 que va a expresarse. La secuencia de Shine-0algarno varia pero normalmente es una polipurina (es decir, que tiene un alto contenido en A-G). Se han identificado muchas secuencias de Shine-0algarno, cada una de la cuales puede sintetizarse facilmente usando metodos expuestos en el presente documento y usarse en un vector procariota.

Una secuencia lider, o sefal, puede usarse para dirigir un polipeptido similar a 1L-17 fuera de la celula huesped. Normalmente, se situa una secuencia de nucleotidos que codifica para la secuencia sefal en la region codificante de una molecula de acido nucleico de polipeptido similar a 1L-17, o directamente en el extremo 5' de una region que codifica para polipeptido similar a 1L-17. Se han identificado muchas secuencias sefal, y puede usarse cualquiera de las que son funcionales en la celula huesped seleccionada conjuntamente con una molecula de acido nucleico de polipeptido similar a 1L-17. Por tanto, una secuencia sefal puede ser homologa (que se produce de manera natural)

o heterologa para un A0Nc o gen de polipeptido similar a 1L-17. Adicionalmente, una secuencia sefal puede sintetizarse quimicamente usando metodos descritos en el presente documento. En la mayoria de los casos, la secrecion de un polipeptido similar a 1L-17 a partir de la celula huesped por medio de la presencia de un peptido sefal dara como resultado la eliminacion del peptido sefal del polipeptido similar a 1L-17 secretado. La secuencia sefal puede ser un componente del vector, o puede ser una parte de una molecula de acido nucleico de polipeptido similar a 1L-17 que se inserta en el vector.

1ncluido dentro del alcance de esta descripcion esta el uso de o bien una secuencia de nucleotidos que codifica para una secuencia sefal de polipeptido similar a 1L-17 nativa unida a una region que codifica para polipeptido similar a 1L-17 o bien una secuencia de nucleotidos que codifica para una secuencia sefal heterologa unida a una region que codifica para polipeptido similar a 1L-17. La secuencia sefal heterologa seleccionada debe ser una que se reconozca y se procese, es decir, se escinda por una peptidasa de sefal, por la celula huesped. Para celulas huesped procariotas que no reconocen ni procesan la secuencia sefal de polipeptido similar a 1L-17 nativa, se sustituye la secuencia sefal por una secuencia sefal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa o lideres de enterotoxina 11 termoestables. Para la secrecion en levaduras, la secuencia sefal de polipeptido similar a 1L-17 nativa puede sustituirse por los lideres de invertasa, factor alfa o fosfatasa acida de levaduras. En la expresion de celulas de mamifero, la secuencia sefal nativa es satisfactoria, aunque pueden ser adecuadas otras secuencias sefal de mamiferos.

En algunos casos, tales como en los que se desea la glicosilacion en un sistema de expresion de celulas huesped eucariotas, pueden manipularse las diversas secuencias previas para mejorar la glicosilacion o el rendimiento. Por ejemplo, puede alterarse el sitio de escision de peptidasas de un peptido sefal particular, o afadirse secuencias previas, lo que tambien puede afectar a la glicosilacion. El producto de proteina final puede tener, en la posicion -1 (en relacion con el primer aminoacido de la proteina madura), uno o mas aminoacidos adicionales que inciden en la expresion que pueden no haberse eliminado totalmente. Por ejemplo, el producto de proteina final puede tener uno o dos residuos de aminoacido encontrados en el sitio de escision de peptidasa, unidos al extremo N-terminal. Alternativamente, el uso de algunos sitios de escision enzimaticos pueden dar como resultado una forma ligeramente truncada del polipeptido similar a 1L-17 deseado, si la enzima corta en tal zona dentro del polipeptido maduro.

En muchos casos, la transcripcion de una molecula de acido nucleico aumenta por la presencia de uno o mas intrones en el vector; esto es particularmente cierto cuando se produce un polipeptido en celulas huesped eucariotas, especialmente celulas huesped de mamifero. Los intrones usados pueden producirse de manera natural dentro del gen de polipeptido similar a 1L-17, especialmente cuando el gen usado es una secuencia genomica de longitud completa o un fragmento de la misma. Cuando el intron no se produce de manera natural dentro del gen (como para la mayoria de los A0Nc), el/los intron/intrones pueden obtenerse a partir de otra fuente. La posicion del intron con respecto a las secuencias flanqueantes y el gen de polipeptido similar a 1L-17 generalmente es importante, ya que el intron debe transcribirse para que sea eficaz. Por tanto, cuando esta transcribiendose una molecula A0Nc de polipeptido similar a 1L-17, la posicion preferida para el intron es en 3' con respecto al sitio de inicio de la transcripcion y en 5' con respecto a la secuencia de terminacion de la transcripcion de poliA. Preferiblemente, el intron o los intrones se ubicaran en un lado o en el otro (es decir, en 5' o 3') del A0Nc de modo que no interrumpa la secuencia codificante. Cualquier intron de cualquier fuente, incluyendo organismos virales, procariotas y eucariotas (vegetales o animales), puede usarse para poner en practica esta invencion, siempre que sea compatible con la/las celula(s) huesped en la/las que va a insertarse. Tambien se incluyen en el presente documento intrones sinteticos. Opcionalmente, puede usarse mas de un intron en el vector.

Los vectores de expresion y clonacion dados a conocer en el presente documento contendran cada uno normalmente un promotor que se reconoce por el organismo huesped y se une operativamente a la molecula que codifica para un polipeptido similar a 1L-17. Los promotores son secuencias no transcritas ubicadas en el sentido de 5' (5') del codon de iniciacion de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente de 100 a 1000 pb) que controlan la transcripcion del gen estructural. Los promotores se agrupan convencionalmente en una de dos clases, promotores inducibles y promotores constitutivos. Los promotores inducibles inician niveles aumentados de transcripcion de A0N bajo su control en respuesta a algun cambio en las condiciones de cultivo, tales como la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio de temperatura. Los promotores constitutivos, por otro lado, inician una produccion de producto genico continua; es decir, hay poco o ningun control sobre la expresion genica. Se conoce bien un gran numero de promotores, reconocidos por una variedad de posibles celulas huesped. Un promotor adecuado se une operativamente al A0N que codifica para un polipeptido similar a 1L-17 eliminando el promotor del A0N fuente mediante digestion con enzimas de restriccion e insertando la secuencia promotora deseada en el vector. La secuencia promotora del gen de polipeptido similar a 1L-17 nativa puede usarse para dirigir la amplificacion y/o la expresion de una molecula de acido nucleico de polipeptido similar a 1L-17. Sin embargo, se prefiere un promotor heterologo, si permite mayor transcripcion y rendimientos superiores de la proteina expresada en comparacion con el promotor nativo, y si es compatible con el sistema de celula huesped que se ha seleccionado para su uso.

Los promotores adecuados para su uso con huespedes procariotas incluyen los sistemas de promotor de betalactamasa y lactosa; fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptofano (trp); y promotores hibridos tales como el promotor tac. Tambien son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Sus secuencias se han publicado, permitiendo de ese modo a un experto en la tecnica ligarlas con la/las secuencia(s) de A0N deseada(s), usando ligadores o adaptadores segun sea necesario para suministrar cualquier sitio de restriccion util.

En la tecnica tambien se conocen bien promotores adecuados para su uso con huespedes de levadura. Ventajosamente, se usan potenciadores de levadura con promotores de levadura. Se conocen bien promotores adecuados para su uso con celulas huesped de mamifero e incluyen, pero no se limitan a, los obtenidos a partir de los genomas de virus tales como poliomavirus, virus de la viruela aviar, adenovirus (tales como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus (CMV), un retrovirus, virus de la hepatitis B y lo mas preferiblemente virus de simio 40 (SV40). Otros promotores de mamifero adecuados incluyen promotores de mamifero heterologos, por ejemplo, promotores de choque termico y el promotor de actina.

Los promotores adicionales que pueden ser de interes en el control de la transcripcion del gen de polipeptido similar a 1L-17 incluyen, pero no se limitan a: la region promotora temprana de SV40 (Bernoist y Chambon, Nature, 290:304310, (1981)), el promotor de CMV, el promotor contenido en la repeticion terminal larga en 3' del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., Cell, 22:787-797, (1980)); el promotor de timidina cinasa de herpes ((agner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:144-145, (1981)), las secuencias reguladoras del gen de metalotionina (Brinster et al., Nature, 296:39-42, (1982)), vectores de expresion procariotas tales como el promotor de beta-lactamasa (Villa-Kamaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75:3727-3731, (1978)) o el promotor tac (0eBoer, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25, (1983)). Tambien son de interes las siguientes regiones de control de la transcripcion animales, que presentan especificidad de tejido y se han utilizado en animales transgenicos: la region de control del gen de elastasa 1 que es activa en celulas acinares pancreaticas [Swift et al., Cell, 38:639-646, (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 50:399-409, (1986); Mac0onald, Hepatology, 7:425-515 (1987)]; la region de control del gen de insulina que es activa en celulas beta pancreaticas (Hanahan, Nature, 315:115-122, (1985)); la region de control del gen de inmunoglobulina que activa en celulas linfoides (Grosschedl et al., Cell, 38:647-658 (1984)); Adames et al., Nature, 318:533-538, (1985)); (Alexander et al., Mol. Cell. Biol., 7:1436-1444, (1987)); la region de control del virus de tumor mamario de raton que es activa en celulas testiculares, de mama, linfoides y mastocitos (Leder et al., Cell, 45:485-495, (1986)); la region de control del gen de albumina que es activa en el higado (Pinkert et al., Genes y 0evel., 1:268-276, (1987) ); la region de control del gen de alfafetoproteina que es activa en el higado (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol., 5:1639-1648, (1985)); Hammer et al., Science, 235:53-58, (1987)); la region de control del gen de alfa 1-antitripsina que es activa en el higado (Kelsey et al., Genes y 0evel., 1:161-171, (1987)); la region de control del gen de betaglobina que es activa en celulas mieloides [Mogram et al., Nature, 315:338-340, (1985); Kollias et al., Cell, 46:89-94, (1986)]; la region de control del gen de la proteina basica de la mielina que es activa en los oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al., Cell, 48:703-712, (1987)); la region de control del gen de la cadena ligera 2 de miosina que es activa en el musculo esqueletico (Sani, Nature, 314:283-286, (1985)); y la region de control del gen de hormona liberadora de gonadotropina que es activa en el hipotalamo (Mason et al., Science, 234:1372-1378, (1986)).

Puede insertarse una secuencia potenciadora en el vector para aumentar la transcripcion de un A0N que codifica para un polipeptido similar a 1L-17 tal como se da a conocer en el presente documento por eucariotas superiores. Los potenciadores son elementos de 0NA de actuacion en cis, habitualmente de aproximadamente 10-300 pb de longitud, que actuan sobre el promotor para aumentar la transcripcion. Los potenciadores son relativamente independientes de la orientacion y la posicion. Se han encontrado en 5' y 3' con respecto a la unidad de transcripcion. Se conocen varias secuencias potenciadoras disponibles de genes de mamifero (por ejemplo, globina, elastasa, albumina, alfa-feto-proteina e insulina). Sin embargo, normalmente se usara un potenciador de un virus. El potenciador de SV40, el potenciador de promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma y potenciadores de adenovirus son elementos de potenciacion a modo de ejemplo para la activacion de promotores eucariotas. A pesar de que un potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector en una posicion en 5' o 3' con respecto a una molecula de acido nucleico de polipeptido similar a 1L-17, normalmente se ubica en un sitio en 5' desde el promotor.

Los vectores de expresion dados a conocer en el presente documento pueden construirse a partir de un vector de inicio tal como un vector disponible comercialmente. Tales vectores pueden o no contener todas las secuencias flanqueantes deseadas. Cuando una o mas de las secuencias flanqueantes deseadas no estan ya presentes en el vector, pueden obtenerse individualmente y ligarse en el vector. El experto en la tecnica conoce bien los metodos usados para obtener cada una de las secuencias flanqueantes.

Vectores preferidos para poner en practica esta descripcion son los que son compatibles con celulas huesped bacterianas, de insecto y de mamifero. Tales vectores incluyen, entre otros, pCR11, pCR3 y pc0NA3.1 (1nvitrogen Company, Carlsbad, CA), pBS11 (Stratagene Company, La Jolla, CA), pET15D (Novagen, Madison, (1), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBac11; 1nvitrogen), p0SR-alfa (publicacion PCT n.D (O 90/14363) y pFastBac0ual (Gibco/BRL, Grand 1sland, NY).

Los vectores adecuados adicionales incluyen, pero no se limitan a, cosmidos, plasmidos o virus modificados, pero se apreciara que el sistema de vectores debe ser compatible con la celula huesped seleccionada. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, plasmidos tales como derivados de plasmido Bluescript� (un fagemido basado en ColEl de alto numero de copias, Stratagene Cloning Systems 1nc., La Jolla CA), plasmidos de clonacion por PCR disefados para clonar productos de PCR amplificados mediante Taq (por ejemplo, kit TOPOT TA Cloning�, derivados de plasmido PCR2.1�, 1nvitrogen, Carlsbad, CA), y vectores de mamifero, levadura o virus tales como un sistema de expresion de baculovirus (derivados de plasmido pBacPAK, Clontech, Palo Alto, CA).

Tras haberse construido el vector y haberse insertado una molecula de acido nucleico que codifica para un polipeptido similar a 1L-17, en el sitio apropiado del vector, puede insertarse el vector completado en una celula huesped adecuada para la amplificacion y/o expresion del polipeptido. La transformacion de un vector de expresion para un polipeptido similar a 1L-17 en una celula huesped seleccionada puede lograrse mediante metodos bien conocidos tales como transfeccion, infeccion, cloruro de calcio, electroporacion, microinyeccion, lipofeccion o el metodo 0EAE-dextrano u otras tecnicas conocidas. El metodo seleccionado sera en parte una funcion del tipo de celula huesped que va a usarse. El experto en la tecnica conoce bien estos metodos y otros metodos adecuados y se exponen, por ejemplo, en Sambrook et al., citado anteriormente.

Las celulas huesped pueden ser celulas huesped procariotas (tales como E. coli) o celulas huesped eucariotas (tales como celulas de levadura, de un insecto o de vertebrado). La celula huesped, cuando se cultiva en condiciones apropiadas, sintetiza un polipeptido similar a 1L-17 que puede recogerse posteriormente del medio de cultivo (si la celula huesped lo secreta al medio) o directamente de la celula huesped que lo produce (si no se secreta). La seleccion de una celula huesped apropiada dependera de diversos factores, tales como niveles de expresion deseados, modificaciones de polipeptidos que son deseables o necesarias para la actividad (tales como glicosilacion

o fosforilacion) y facilidad de plegamiento para dar una molecula biologicamente activa.

En la tecnica se conocen varias celulas huesped adecuadas y muchas estan disponibles de la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (quot;American Type Culture Collection') (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 201102209. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, celulas de mamifero, tales como celulas de ovario de hamster chino (CHO) (n.D de la ATCC CCL61); celulas CHO 0HFR (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:4216-4220 (1980)); celulas 293 o 293T de rifon embrionario humano (HEK) (n.D de la ATCC CRL1573); o celulas 3T3 (n.D de la ATCC CCL92). En la tecnica se conocen la seleccion de celulas huesped de mamifero adecuadas y metodos para transformacion, cultivo, amplificacion, examen, produccion de producto y purificacion. Otras lineas celulares de mamifero adecuadas son las lineas celulares COS-1 (n.D de la ATCC CRL1650) y COS-7 (n.D de la ATCC CRL1651) de mono, y la linea celular CV-1 (n.D de la ATCC CCL70). Las celulas huesped de mamifero adicionales a modo de ejemplo incluyen lineas celulares de primate y lineas celulares de roedor, incluyendo lineas celulares transformadas. Celulas diploides normales, cepas de celulas derivadas a partir de cultivo in vitro de tejido primario, asi como explantes primarios, tambien son adecuadas. Las celulas candidatas pueden ser deficientes genotipicamente en el gen de seleccion, o pueden contener un gen de seleccion de actuacion dominante. Otras lineas celulares de mamifero adecuadas incluyen, pero no se limitan a, celulas N2A de neuroblastoma de raton, HeLa, celulas L-929 de raton, lineas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o N1H, lineas celulares de hamster BHK o HaK, que estan disponibles de la ATCC. Cada una de estas lineas celulares las conocen y estan disponibles para los expertos en la tecnica de expresion de proteinas.

Celulas bacterianas son utiles de manera similar como celulas huesped adecuadas para la presente invencion. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli (por ejemplo, HB101, (n.D de la ATCC 33694) 0H5a, 0H10 y MC1061 (n.D de la ATCC 53338)) se conocen bien como celulas huesped en el campo de la biotecnologia. En este metodo tambien pueden emplearse diversas cepas de B. subtilis, Pseudomonas spp., otros Bacillus spp., Streptomyces spp., y similares.

Muchas cepas de celulas de levadura conocidas por los expertos en la tecnica tambien estan disponibles como celulas huesped para la expresion de los polipeptidos de la presente invencion. Las celulas de levadura preferidas incluyen, por ejemplo, Saccharomyces cerivisae y Pichia pastoris.

Adicionalmente, cuando se desee, pueden utilizarse sistemas de celulas de insectos en los metodos de la presente invencion. Tales sistemas se describen por ejemplo en Kitts et al., Biotechniques, 14:810-817 (1993); Lucklow, Curr. Opin. Biotechnol., 4:564-572 (1993); y Lucklow et al., J. Virol., 67:4566-4579 (1993). Celulas de insecto preferidas son Sf-9 y Hi5 (1nvitrogen, Carlsbad, CA).

Tambien pueden usarse animales transgenicos para expresar polipeptidos similares a 1L-17 glicosilados. Por ejemplo, puede usarse un animal que produce leche transgenico (una vaca o cabra, por ejemplo) y obtener el presente polipeptido glicosilado en la leche del animal. Tambien pueden usarse vegetales para producir polipeptidos similares a 1L-17; sin embargo, en general, la glicosilacion que se produce en vegetales es diferente de la que se produce en celulas de mamifero, y puede dar como resultado un producto glicosilado que no es adecuado para su uso terapeutico en seres humanos.

Produccion de polipeptidos

Pueden cultivarse celulas huesped que comprenden un vector de expresion de polipeptido similar a 1L-17 usando medios convencionales bien conocidos por el experto en la tecnica. Los medios contendran habitualmente todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia de las celulas. Los medios adecuados para cultivar celulas de E. coli incluyen, por ejemplo, caldo Luria (LB) y/o caldo Terrific (TB). Los medios adecuados para cultivar celulas eucariotas incluyen medio Roswell Park Memorial 1nstitute 1640 (RPM1 1640), medio esencial minimo (MEM) y/o medio de Eagle modificado por 0ulbecco (0MEM), todos los cuales pueden complementarse con suero y/o factores de crecimiento tal como se indique por la linea celular particular que esta cultivandose. Un medio adecuado para cultivos de insecto es el medio de Grace complementado con Yeastolate, hidrolizado de lactoalbumina y/o suero de ternero fetal, segun sea necesario.

Normalmente, se afade un antibiotico u otro compuesto util para el crecimiento selectivo de celulas transformadas como complemento a los medios. El compuesto que va a usarse estara dictado por el elemento marcador seleccionable presente en el plasmido con el que se transformo la celula huesped. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es resistencia a kanamicina, el compuesto afadido al medio de cultivo sera kanamicina. Otros compuestos para el crecimiento selectivo incluyen ampicilina, tetraciclina y neomicina.

La cantidad de un polipeptido similar a 1L-17 producida por una celula huesped puede evaluarse usando metodos convencionales conocidos en la tecnica. Tales metodos incluyen, sin limitacion, analisis de inmunotransferencia de tipo (estern, electroforesis en gel de S0S-poliacrilamida, electroforesis en gel no desnaturalizante, separacion mediante HPLC, inmunoprecipitacion y/o ensayos de actividad tales como ensayos de desplazamiento en gel de union a A0N.

Si se ha disefado un polipeptido similar a 1L-17 para que se secrete a partir de las celulas huesped, la mayoria del polipeptido puede encontrarse en el medio de cultivo celular. Sin embargo, si el polipeptido similar a 1L-17 no se secreta a partir de las celulas huesped, estara presente en el citoplasma y/o el nucleo (para celulas huesped eucariotas) o en el citosol (para celulas huesped bacterianas).

Para un polipeptido similar a 1L-17 situado en el citoplasma y/o el nucleo de la celula huesped (para celulas huesped eucariotas) o en el citosol (para celulas huesped bacterianas), puede extraerse el material intracelular (incluyendo cuerpos de inclusion para bacterias Gram-negativas) de la celula huesped usando cualquier tecnica convencional conocida por el experto en la tecnica. Por ejemplo, las celulas huesped pueden lisarse para liberar el contenido del periplasma/citoplasma mediante prensa francesa, homogeneizacion y/o sonicacion seguido por centrifugacion.

Si un polipeptido similar a 1L-17 ha formado cuerpos de inclusion en el citosol, los cuerpos de inclusion a menudo pueden unirse a las membranas celulares interna y/o externa y por tanto se encontraran principalmente en el material precipitado tras la centrifugacion. Entonces, el material precipitado puede tratarse a pH extremos o con un agente caotropico tal como un detergente, guanidina, derivados de guanidina, urea o derivados de urea en presencia de un agente reductor tal como ditiotreitol a pH alcalino o triscarboxietilfosfina a pH acido para liberar, separar y solubilizar los cuerpos de inclusion. El polipeptido similar a 1L-17 ahora en su forma soluble puede analizarse entonces usando electroforesis en gel, inmunoprecipitacion o similares. Si se desea aislar el polipeptido similar a 1L17, el aislamiento puede lograrse usando metodos convencionales tales como los descritos en el presente documento y en Marston et al., Met. Enz., 182:264-275 (1990).

En algunos casos, un polipeptido similar a 1L-17 puede no ser biologicamente activo tras su aislamiento. Pueden usarse diversos metodos para quot;replegarquot; o convertir el polipeptido en su estructura terciaria y generar enlaces disulfuro para restaurar la actividad biologica. Tales metodos incluyen exponer el polipeptido solubilizado a un pH habitualmente por encima de 7 y en presencia de una concentracion particular de un caotropo. La seleccion del caotropo es muy similar a las elecciones usadas para la solubilizacion del cuerpo de inclusion, pero habitualmente el caotropo se usa a una concentracion inferior y no es necesariamente el mismo que los caotropos usados para la solubilizacion. En la mayoria de los casos la disolucion de replegamiento/oxidacion tambien contendran un agente reductor o el agente reductor mas su forma oxidada en una razon especifica para generar un potencial redox particular que permita que se produzca la transposicion de disulfuros en la formacion del/de los puente(s) de cisteina de la proteina. Algunas de las parejas redox usadas comunmente incluyen cisteina/cistamina, glutation (GSH)/ditiobis-GSH, cloruro cuprico, ditiotreitol (0TT)/ditiano-0TT y 2-2-mercaptoetanol (bME)/ditio-b(ME). Puede usarse un codisolvente para aumentar la eficacia del replegamiento, y los reactivos mas comunes usados para este fin incluyen glicerol, polietilenglicol de diversos pesos moleculares, arginina y similares.

Si no se forman cuerpos de inclusion en un grado significativo tras la expresion de un polipeptido similar a 1L-17, entonces el polipeptido se encontrara principalmente en el sobrenadante tras la centrifugacion del homogeneizado celular. El polipeptido puede aislarse adicionalmente a partir del sobrenadante usando metodos tales como los descritos en el presente documento.

La purificacion de un polipeptido similar a 1L-17 a partir de la disolucion puede lograrse usando una variedad de tecnicas. Si el polipeptido se ha sintetizado de manera que contiene una etiqueta tal como hexahistidina (polipeptido similar a 1L-17/hexaHis) u otro peptido similar tal como FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) o myc (1nvitrogen, Carlsbad, CA) en su extremo o bien carboxilo o bien amino terminal, puede purificarse en un procedimiento de una etapa haciendo pasar la disolucion a traves una columna de afinidad en la que la matriz de la columna tiene una gran afinidad por la etiqueta.

Por ejemplo, la polihistidina se une con gran afinidad y especificidad a niquel; por tanto puede usarse una columna de afinidad de niquel (tal como las columnas de niquel de Qiagen�) para la purificacion de polipeptido similar a 1L17/poliHis. Vease por ejemplo, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, seccion 10.11.8, John (iley & Sons, Nueva York (1993).

Adicionalmente, el polipeptido similar a 1L-17 puede purificarse mediante el uso de un anticuerpo monoclonal que puede reconocer especificamente y unirse al polipeptido similar a 1L-17.

Por tanto, los procedimientos adecuados para la purificacion incluyen, sin limitacion, cromatografia de afinidad, cromatografia de inmunoafinidad, cromatografia de intercambio ionico, cromatografia de tamiz molecular, cromatografia de liquidos de alta resolucion (HPLC), electroforesis (incluyendo electroforesis en gel nativa) seguida por elucion del gel e isoelectroenfoque preparativo (maquina/tecnica quot;1soprimequot;, Hoefer Scientific, San Francisco, CA). En algunos casos, pueden combinarse dos o mas tecnicas de purificacion para lograr un aumento de la pureza.

Tambien pueden prepararse polipeptidos similares a 1L-17 mediante metodos de sintesis quimica (tal como sintesis peptidica en fase solida) usando tecnicas conocidas en la tecnica, tal como las expuestas por Merrifield et al., J. Am.

Chem. Soc, 85:2149 (1963), Houghten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5132 (1985), y Stewart y Young, quot;Solid Phase Peptide Synthesisquot;, Pierce Chemical Co., Rockford, 1L (1984). Tales polipeptidos pueden sintetizarse con o sin una metionina en el extremo amino terminal. Los polipeptidos similares a 1L-17 sintetizados quimicamente pueden oxidarse usando metodos expuestos en estas referencias para formar puentes disulfuro. Se espera que los polipeptidos similares a 1L-17 sintetizados quimicamente tengan actividad biologica comparable a los polipeptidos similares a 1L-17 correspondientes producidos de manera recombinante o purificados a partir de fuentes naturales, y por tanto puedan usarse de manera intercambiable con un polipeptido similar a 1L-17 recombinante o natural.

Otros medios de obtencion de un polipeptido similar a 1L-17 son mediante purificacion a partir de muestras biologicas tales como tejidos y/o fluidos de la fuente en los que el polipeptido similar a 1L-17 se encuentra de manera natural. Tal purificacion puede realizarse usando metodos para la purificacion proteica tal como se describe en el presente documento. La presencia del polipeptido similar a 1L-17 durante la purificacion puede monitorizarse, por ejemplo, usando un anticuerpo preparado contra el polipeptido similar a 1L-17 producido de manera recombinante o fragmentos peptidicos del mismo.

En la tecnica se conocen varios metodos adicionales para producir acidos nucleicos y polipeptidos, y los metodos pueden usarse para producir polipeptidos que tienen especificidad para polipeptido similar a 1L-17. Vease por ejemplo, Roberts et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:12297-12303 (1997), que describen la produccion de proteinas de fusion entre un ARNm y su peptido codificado. Vease tambien Roberts, R., Curr. Opin. Chem. Biol., 3:268-273 (1999). Adicionalmente, la patente estadounidense n.D 5.824.469 describe metodos de obtencion de oligonucleotidos que pueden llevar a cabo una funcion biologica especifica. El procedimiento implica generar un conjunto heterogeneo de oligonucleotidos, teniendo cada uno una secuencia aleatorizada en 5', una secuencia preseleccionada central y una secuencia aleatorizada en 3'. El conjunto heterogeneo resultante se introduce en una poblacion de celulas que no presentan la funcion biologica deseada. Entonces se examinan las subpoblaciones de las celulas para determinar las que presentan una funcion biologica predeterminada. A partir de esa subpoblacion, se aislan oligonucleotidos que pueden llevar a cabo la funcion biologica deseada.

Las patentes estadounidenses n.os 5.763.192, 5.814.476, 5.723.323 y 5.817.483 describen procedimientos para producir peptidos o polipeptidos. Esto se realiza produciendo genes estocasticos o fragmentos de los mismos, e introduciendo entonces estos genes en celulas huesped que producen una o mas proteinas codificadas por los genes estocasticos. Entonces se examinan las celulas huesped para identificar los clones que producen peptidos o polipeptidos que tienen la actividad deseada.

Otro metodo para producir peptidos o polipeptidos se describe en el documento PCT/US98/20094 ((O99/15650) presentado por Athersys, 1nc. Conocido como quot;activacion al azar de la expresion genica para el descubrimiento de genesquot; (quot;Random Activation of Gene Expression for Gene Discoveryquot;) (RAGE-G0), el procedimiento implica la activacion de la expresion o sobreexpresion genica endogena de un gen mediante metodos de recombinacion in situ. Por ejemplo, la expresion de un gen endogeno se activa o aumenta integrando una secuencia reguladora en la celula diana que puede activar la expresion del gen mediante recombinacion no homologa o ilegitima. En primer lugar el A0N diana se somete a radiacion y se inserta un promotor genetico. El promotor finalmente localiza una rotura al principio de un gen, iniciando la transcripcion del gen. Esto da como resultado la expresion del peptido o polipeptido deseado.

Se apreciara que estos metodos tambien pueden usarse para crear bibliotecas de expresion de proteinas similares a 1L-17 exhaustivas, que pueden usarse posteriormente para el examen fenotipico de alto rendimiento en una variedad de ensayos, tales como ensayos bioquimicos, ensayos celulares y ensayos de organismo completo (por ejemplo, vegetal, raton, etc.).

0erivados quimicos

El experto en la tecnica puede preparar derivados quimicamente modificados de los polipeptidos similares a 1L-17, segun las descripciones expuestas a continuacion en el presente documento. Los derivados de polipeptido similar a 1L-17 se modifican de una manera que es diferente o bien en el tipo o bien en la ubicacion de las moleculas unidas de manera natural al polipeptido. Los derivados pueden incluir moleculas formadas mediante la delecion de uno o mas grupos quimicos unidos de manera natural. El polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10, o una variante de polipeptido similar a 1L-17, puede modificarse mediante la union covalente de uno o mas polimeros. Por ejemplo, el polimero seleccionado es normalmente soluble en agua de modo que la proteina a la que se une no precipita en un entorno acuoso, tal como un entorno fisiologico. Se incluye dentro del alcance de polimeros adecuados una mezcla de polimeros. Preferiblemente, para uso terapeutico de la preparacion de producto final, el polimero sera farmaceuticamente aceptable.

Cada uno de los polimeros puede ser de cualquier peso molecular y puede ser ramificado o no ramificado. Cada uno de los polimeros tiene normalmente un peso molecular promedio de entre aproximadamente de 2 k0a y aproximadamente 100 k0a (indicando el termino quot;aproximadamentequot; que en preparaciones de un polimero soluble en agua, algunos moleculas pesaran mas, algunas menos, que el peso molecular establecido). El peso molecular promedio de cada polimero es preferiblemente de entre aproximadamente 5 k0a, aproximadamente 50 k0a, mas preferiblemente de entre aproximadamente 12 k0a y aproximadamente 40 k0a y lo mas preferiblemente de entre aproximadamente de 20 k0a y aproximadamente 35 k0a.

Los polimeros solubles en agua adecuados o mezclas de los mismos incluyen, pero no se limitan a, hidratos de carbono unidos a N o a O; azucares; fosfatos; polietilenglicol (PEG) (incluyendo las formas de PEG que se han usado para derivatizar proteinas, incluyendo mono-alcoxi o ariloxi (C1-C10)-polietilenglicol); monometoxipolietilenglicol; dextrano (tal como dextrano de bajo peso molecular de, por ejemplo, aproximadamente 6 k0a); celulosa; u otros polimeros a base de hidratos de carbono, poli-(N-vinilpirrolidona)-polietilenglicol, homopolimeros de propilenglicol, un copolimero de oxido de polipropileno/oxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) y poli(alcohol vinilico). La presente invencion tambien abarca moleculas de reticulacion bifuncionales que pueden usarse para preparar multimeros unidos de manera covalente del polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2 o una variante de polipeptido similar a 1L-17.

En general, la derivatizacion quimica puede realizarse en cualquier condicion adecuada usada para hacer reaccionar una proteina con una molecula de polimero activada. Los metodos para preparar derivados quimicos de polipeptidos comprenderan generalmente las etapas de (a) hacer reaccionar el polipeptido con la molecula de polimero activada (tal como un derivado de aldehido o ester reactivo de la molecula de polimero) en condiciones mediante las cuales el polipeptido que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2, SEQ 10 NO: 4 o SEQ 10 NO: 10, o una variante de polipeptido similar a 1L-17 se une a una o mas moleculas de polimero, y (b) obtener el/los producto(s) de reaccion. Las condiciones de reaccion optimas se determinaran basandose en parametros conocidos y el resultado deseado. Por ejemplo, cuanto mayor es la razon de moleculas de polimero:proteina, mayor es el porcentaje de molecula de polimero unida. En una realizacion, el derivado de polipeptido similar a 1L-17 puede tener un resto de molecula de polimero individual en el extremo amino terminal (vease por ejemplo, la patente estadounidense n.D 5.234.784).

La pegilacion del polipeptido puede llevarse a cabo especificamente mediante cualquiera de las reacciones de pegilacion conocidas en la tecnica, tal como se describe por ejemplo en las siguiente referencias: Francis et al., Focus on Growth Factors, 3:4-10 (1992); documentos EP 0154316; EP 0401384 y patente estadounidense n.D

4.179.337. Por ejemplo, la pegilacion puede llevarse a cabo por medio de una reaccion de acilacion o una reaccion de alquilacion con una molecula de polietilenglicol reactiva (o un polimero soluble en agua reactivo analogo) tal como se describe en el presente documento. Para las reacciones de acilacion, el/los polimero(s) seleccionado(s) debe(n) tener un unico grupo ester reactivo. Para la alquilacion reductora, el/los polimero(s) seleccionado(s) debe(n) tener un unico grupo aldehido reactivo. Un aldehido reactivo es, por ejemplo, propionaldehido de polietilenglicol, que es estable en agua, o derivados de mono-alcoxilo o ariloxilo (C1-C10) de los mismos (vease la patente estadounidense n.D 5.252.714).

En otra realizacion, los polipeptidos similares a 1L-17 pueden acoplarse quimicamente a biotina, y entonces se permite que las moleculas de biotina/polipeptido similar a 1L-17 que se conjugan se unan a avidina, dando como resultado moleculas de avidina/biotina/polipeptido similar a 1L-17 tetravalentes. Los polipeptidos similares a 1L-17 tambien pueden acoplarse covalentemente a dinitrofenol (0NP) o trinitrofenol (TNP) y precipitarse los conjugados resultantes con 1gM anti-0NP o anti-TNP para formar conjugados decamericos con una valencia de 10.

Generalmente, los estados que pueden aliviarse o modularse mediante la administracion de los presentes derivados de polipeptido similar a 1L-17 incluyen los descritos en el presente documento para polipeptidos similares a 1L-17. Sin embargo, los derivados de polipeptido similar a 1L-17 dados a conocer en el presente documento pueden tener actividades adicionales, actividad biologica potenciada o reducida, u otras caracteristicas, tales como semivida aumentada o disminuida, en comparacion con las moleculas no derivatizadas.

Animales no humanos modificados por ingenieria genetica

Adicionalmente, dentro del alcance de la presente descripcion se incluyen animales no humanos tales como ratones, ratas u otros roedores, conejos, cabras u ovejas, u otros animales de granja, en los que el gen (o genes) que codifica(n) para el polipeptido similar a 1L-17 nativo se ha (se han) alterado (quot;desactivadoquot;) de manera que el nivel de expresion de este gen o genes disminuye significativamente o se suprime completamente. Tales animales pueden prepararse usando tecnicas y metodos tales como los descritos en la patente estadounidense n.D 5.557.032.

La presente descripcion incluye ademas animales no humanos tales como ratones, ratas u otros roedores, conejos, cabras, ovejas u otros animales de granja, en los que o bien la forma nativa del/de los gen(es) de polipeptido similar a 1L-17 para ese animal o bien un/unos gen(es) de polipeptido similar a 1L-17 heterologo(s) se sobreexpresa(n) por el animal, creando asi un animal quot;transgenicoquot;. Tales animales transgenicos pueden prepararse usando metodos bien conocidos tales como los descritos en la patente estadounidense n.D 5.489.743 y la solicitud PCT n.D (O 94/28122.

La presente descripcion incluye ademas animales no humanos en los que el promotor para uno o mas de los polipeptidos similares a 1L-17 de la presente descripcion esta o bien activado o bien inactivado (por ejemplo, usando metodos de recombinacion homologa) para alterar el nivel de expresion de uno o mas de los polipeptidos similares a 1L-17 nativos.

Estos animales no humanos pueden usarse para la seleccion de candidatos farmacologicos. En tal seleccion, puede medirse el impacto de un candidato farmacologico sobre el animal; por ejemplo, los candidatos farmacologicos pueden disminuir o aumentar la expresion del gen de polipeptido similar a 1L-17. En determinadas realizaciones, la cantidad de polipeptido similar a 1L-17 que se introduce puede medirse tras la exposicion del animal al candidato farmacologico. Adicionalmente, en determinadas realizaciones, puede detectarse el impacto real del candidato farmacologico sobre el animal. Por ejemplo, la sobreexpresion de un gen particular puede dar como resultado, o estar asociado con, una enfermedad o un estado patologico. En tales casos, puede someterse a prueba la capacidad de un candidato farmacologico para disminuir la expresion del gen o su capacidad para prevenir o inhibir un estado patologico. En otros ejemplos, la produccion de un producto metabolico particular tal como un fragmento de un polipeptido puede dar como resultado, o estar asociado con, una enfermedad o un estado patologico. En tales casos, puede someterse a prueba la capacidad de un candidato farmacologico para disminuir la produccion de un producto metabolico de este tipo o su capacidad para prevenir o inhibir un estado patologico.

Microalineamiento

Se apreciara que puede utilizarse la tecnologia de microalineamiento de A0N segun la presente descripcion. Los microalineamientos de A0N son alineamientos de alta densidad, en miniatura de acidos nucleicos colocados sobre un soporte solido, tal como vidrio. Cada celula o elemento dentro del alineamiento tiene numerosas copias de una unica especie de A0N que actua como diana para la hibridacion para su ARNm relacionado. En la obtencion del perfil de expresion usando tecnologia de microalineamientos de A0N, en primer lugar se extrae ARNm de una celula

o muestra de tejido y entonces se convierte enzimaticamente en A0Nc marcado fluorescentemente. Este material se hibrida con el microalineamiento y se elimina el A0Nc no unido mediante lavado. La expresion de genes diferenciados representados en el alineamiento se visualiza entonces cuantificando la cantidad de A0Nc marcado que se une especificamente a cada A0N diana. 0e esta manera, puede cuantificarse la expresion de miles de genes con un alto rendimiento, de manera paralela a partir de una unica muestra de material biologico.

Esta obtencion del perfil de expresion de alto rendimiento tiene una amplia gama de aplicaciones con respecto a las moleculas de polipeptido similar a 1L-17 de la invencion, incluyendo pero sin limitarse a: la identificacion y validacion de genes relacionados con enfermedad de polipeptido similar a 1L-17 como dianas para productos terapeuticos; toxicologia molecular de moleculas de polipeptido similar a 1L-17 e inhibidores de las mismas; estratificacion de poblaciones y generacion de marcadores sustitutos para ensayos clinicos; y la potenciacion del descubrimiento de farmacos de molecula pequefa relacionados con polipeptido similar a 1L-17 ayudando en la identificacion de compuestos selectivos en examenes de alto rendimiento (HTS).

Agentes de union selectiva

Tal como se usa en el presente documento, el termino quot;agente de union selectivaquot; se refiere a una molecula que tiene especificidad para uno o mas polipeptidos similares a 1L-17. Los agentes de union selectiva adecuados incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos y derivados de los mismos, polipeptidos y moleculas pequefas. Pueden prepararse agentes de union selectiva adecuados usando metodos conocidos en la tecnica. Un agente de union selectiva a polipeptido similar a 1L-17 a modo de ejemplo de la presente invencion puede unirse a una determinada parte del polipeptido similar a 1L-17 inhibiendo de ese modo la union del polipeptido al/a los receptor(es) de polipeptido similar a 1L-17.

Agentes de union selectiva tales como anticuerpos y fragmentos de anticuerpo que se unen a polipeptidos similares a 1L-17 estan dentro del alcance de la presente descripcion. Los anticuerpos pueden ser policlonales incluyendo policlonales monoespecificos, monoclonales (AcM), recombinantes, quimericos, humanizados tales como injertados con C0R, humanos, de cadena sencilla y/o biespecificos, asi como fragmentos, variantes o derivados de los mismos. Los fragmentos de anticuerpos incluyen las partes del anticuerpo que se unen a un epitopo en el polipeptido similar a 1L-17. Los ejemplos de tales fragmentos incluyen fragmentos Fab y F(ab') generados mediante escision enzimatica de anticuerpos de longitud completa. Otros fragmentos de union incluyen los generados mediante tecnicas de 0NA recombinante, tales como la expresion de plasmidos recombinantes que contienen secuencias de acido nucleico que codifican para regiones variables de anticuerpo.

Se producen generalmente anticuerpos policlonales dirigidos hacia un polipeptido similar a 1L-17 en animales (por ejemplo, conejos o ratones) mediante multiples inyecciones subcutaneas o intraperitoneales de polipeptido similar a 1L-17 y un adyuvante. Puede ser util conjugar un polipeptido similar a 1L-17 con una proteina portadora que es inmunogenica en la especie que va a inmunizarse, tal como hemocianina de lapa californiana, suero, albumina, tiroglobulina bovina o inhibidor de tripsina de soja. Ademas, se usan agentes de agregacion tales como alumbre para potenciar la respuesta inmunitaria. Tras la inmunizacion, se extrae sangre de los animales y se somete a ensayo el suero para determinar el titulo de anticuerpos anti-polipeptido similar a 1L-17.

Se producen anticuerpos monoclonales dirigidos hacia un polipeptido similar a 1L-17 usando cualquier metodo que proporcione la produccion de moleculas de anticuerpo por lineas celulares continuas en cultivo. Los ejemplos de metodos adecuados para preparar anticuerpos monoclonales incluyen los metodos de hibridoma de Kohler et al., Nature, 256:495-497 (1975) y el metodo de hibridoma de celulas B humanas, Kozbor, J. 1mmunol., 133:3001 (1984) y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pags. 51-63 (Marcel 0ekker, 1nc., Nueva York, 1987). La invencion tambien proporciona lineas celulares de hibridoma que producen anticuerpos monoclonales reactivos con polipeptidos similares a 1L-17.

Los anticuerpos monoclonales dados a conocer en el presente documento pueden modificarse para su uso como productos terapeuticos. Una realizacion es un anticuerpo quot;quimericoquot; en el que una parte de la cadena pesada y/o ligera es identica a u homologa a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de una especie particular

o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es/son identica(s) a u homologa(s) a una secuencia correspondiente en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo. Tambien se incluyen fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten la actividad biologica deseada. Vease la patente estadounidense n.D 4.816.567 y Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1985).

En otra realizacion, un anticuerpo monoclonal de la invencion es un anticuerpo quot;humanizadoquot;. En la tecnica se conocen bien metodos para humanizar anticuerpos no humanos (veanse las patentes estadounidense n.os 5.585.089 y 5.693.762). Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o mas residuos de aminoacido introducidos en el a partir de una fuente que no es humana. La humanizacion puede realizarse, por ejemplo, usando metodos descritos en la tecnica (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), sustituyendo al menos una parte de una region determinante de complementariedad (C0R) de roedor por las regiones correspondientes de un anticuerpo humano.

La presente descripcion tambien abarca anticuerpos humanos que se unen a polipeptidos similares a 1L-17. Usando animales transgenicos (por ejemplo, ratones) que pueden producir un repertorio de anticuerpos humanos en ausencia de produccion de inmunoglobulina endogena, tales anticuerpos se producen mediante inmunizacion con un antigeno de polipeptido similar a 1L-17 (es decir, que tiene al menos 6 aminoacidos contiguos), conjugado opcionalmente con un portador. Veanse, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993) y Bruggermann et al., Year in 1mmunol., 7:33 (1993). En un metodo, tales animales transgenicos se producen incapacitando los loci endogenos que codifican para las cadenas de inmunoglobulina pesadas y ligeras en los mismos, e insertando loci que codifican para proteinas de cadena pesada y ligera humanas en el genoma de los mismos. Entonces, los animales parcialmente modificados, que son los que tienen menos que el complemento completo de modificaciones, se cruzan para obtener un animal que tiene todas las modificaciones del sistema inmunitario deseadas. Cuando se administra un inmunogeno, estos animales transgenicos producen anticuerpos con secuencias de aminoacidos humanas (en vez de, por ejemplo, murinas), incluyendo regiones variables que son inmunospecificas para estos antigenos. Veanse las solicitudes PCT n.os PCT/US96/05928 y PCT/US93/06926. Se describen metodos adicionales en la patente estadounidense n.D 5.545.807, las solicitudes PCT n.os PCT/US91/245, PCT/GB89/01207 y en los documentos EP 546073B1 y EP 546073A1. Tambien pueden producirse anticuerpos humanos mediante la expresion de A0N recombinante en celulas huesped o mediante la expresion en celulas de hibridoma tal como se describe en el presente documento.

En una realizacion alternativa, pueden producirse anticuerpos humanos a partir de bibliotecas de presentacion en fago (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227:381 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)). Estos procedimientos imitan la seleccion inmunitaria a traves de la presentacion de repertorios de anticuerpo sobre la superficie de bacteriofagos filamentosos, y la seleccion posterior de fago mediante su union a un antigeno de eleccion. Una de tales tecnicas se describe en la solicitud PCT n.D PCT/US98/17364, que describe el aislamiento de anticuerpos agonistas de alta afinidad y funcionales para receptores de MPL y msk usando un enfoque de este tipo.

Se producen normalmente anticuerpos quimericos, injertados con C0R y humanizados mediante metodos recombinantes. Los acidos nucleicos que codifican para los anticuerpos se introducen en celulas huesped y se expresan usando materiales y procedimientos descritos en el presente documento. En una realizacion preferida, los anticuerpos se producen en celulas huesped de mamifero, tales como celulas CHO. Pueden producirse anticuerpos monoclonales (por ejemplo, humanos) mediante la expresion de A0N recombinante en celulas huesped o mediante la expresion en celulas de hibridoma tal como se describe en el presente documento.

Los anticuerpos anti-polipeptido similar a 1L-17 de la descripcion pueden emplearse en cualquier metodo de ensayo conocido, tal como ensayos de union competitiva, ensayos de tipo sandwich directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitacion (Sola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pags. 147-158 (CRC Press, 1nc., 1987)) para la deteccion y cuantificacion de polipeptidos similares a 1L-17. Los anticuerpos se uniran a polipeptidos similares a 1L-17 con una afinidad que es apropiada para el metodo de ensayo que esta empleandose.

Para aplicaciones de diagnostico, en determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-polipeptido similar a 1L-17 pueden marcarse con un resto detectable. El resto detectable puede ser uno cualquiera que pueda producir, o bien directa o bien indirectamente, una sefal detectable. Por ejemplo, el resto detectable puede ser un radioisotopo, tal como 3H, 14C, 32P, 35S o 1251; un compuesto fluorescente o quimioluminiscente, tal como isotiocianato de fluoresceina, rodamina o luciferina; o una enzima, tal como fosfatasa alcalina, 1-galactosidasa o peroxidasa del rabano (Bayer et al., Met. Enz., 184:138-163 (1990)).

Los ensayos de union competitiva se basan en la capacidad de un patron marcado (por ejemplo, un polipeptido similar a 1L-17 o una parte inmunologicamente reactiva del mismo) para competir con el analito de muestra de prueba (un polipeptido similar a 1L-17) por la union con una cantidad limitada de anticuerpo anti-polipeptido similar a 1L-17. La cantidad de un polipeptido similar a 1L-17 en la muestra de prueba es inversamente proporcional a la cantidad de patron que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinacion de la cantidad de patron que se une, normalmente se insolubilizan los anticuerpos antes o despues de la competicion, de manera que el patron y el analito que estan unidos a los anticuerpos pueden separarse convenientemente del patron y del analito que permanecen sin unirse.

Normalmente, los ensayos de tipo sandwich implican el uso de dos anticuerpos, pudiendo unirse cada uno a una parte inmunogenica diferente, o epitopo, de la proteina que va a detectarse y/o cuantificarse. En un ensayo de tipo sandwich, al analito de muestra de prueba se une normalmente un primer anticuerpo que esta inmovilizado sobre un soporte solido, y despues de eso se une un segundo anticuerpo al analito, formando asi un complejo de tres partes insoluble. Vease, por ejemplo, la patente estadounidense n.D 4.376.110. El segundo anticuerpo puede estar marcado por si mismo con un resto detectable (ensayos de tipo sandwich directos) o puede medirse usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina que esta marcado con un resto detectable (ensayos de tipo sandwich indirectos). Por ejemplo, un tipo de ensayo de tipo sandwich es un ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (EL1SA), en cuyo caso el resto detectable es una enzima.

Los agentes de union selectiva, incluyendo anticuerpos anti-polipeptido similar a 1L-17, tambien son utiles para la obtencion de imagenes in vivo. Un anticuerpo marcado con un resto detectable puede administrase a un animal, preferiblemente en el torrente sanguineo, y se somete a ensayo la presencia y la ubicacion del anticuerpo marcado en el huesped. El anticuerpo puede marcarse con cualquier resto que pueda detectarse en un animal, ya sea mediante resonancia magnetica nuclear, radiologia u otro medio de deteccion conocido en la tecnica.

Los agentes de union selectiva dados a conocer en el presente documento, incluyendo anticuerpos, pueden usarse como productos terapeuticos. Estos agentes terapeuticos son generalmente agonistas o antagonistas porque o bien potencian o bien reducen, respectivamente, al menos una de las actividades biologicas de un polipeptido similar a 1L-17, incluyendo la actividad proinflamatoria de polipeptido similar a 1L-17. En una realizacion, anticuerpos antagonistas usados segun la invencion son anticuerpos o fragmentos de union de los mismos que pueden unirse especificamente a un polipeptido similar a 1L-17 y que pueden inhibir o eliminar la actividad funcional de un polipeptido similar a 1L-17 in vivo o in vitro. En realizaciones preferidas, el agente de union selectiva, por ejemplo, un anticuerpo antagonista, inhibira la actividad funcional de un polipeptido similar a 1L-17 en al menos aproximadamente el 50%, y preferiblemente en al menos aproximadamente el 80%. En otra descripcion, el agente de union selectiva puede ser un anticuerpo que puede interaccionar con un compafero de union de polipeptido similar a 1L-17 (un ligando o receptor) inhibiendo o eliminando de ese modo la actividad de un polipeptido similar a 1L-17 in vitro o in vivo. Se identifican mediante ensayos de seleccion bien conocidos en la tecnica agentes de union selectiva, incluyendo anticuerpos anti-polipeptido similar a 1L-17 agonistas y antagonistas.

Tambien se da a conocer un kit que comprende agentes de union selectiva a polipeptido similar a 1L-17 (tal como anticuerpos) y otros reactivos utiles para detectar los niveles de polipeptido similar a 1L-17 en muestras biologicas. Tales reactivos pueden incluir un marcador detectable, suero bloqueantes, muestras control positivas y negativas, y reactivos de deteccion.

Los polipeptidos similares a 1L-17 tal como se dan a conocer en el presente documento pueden usarse para clonar receptores de polipeptido similar a 1L-17, usando una estrategia de clonacion de expresion. Puede usarse polipeptido similar a 1L-17 radiomarcado (125-yodo) o polipeptido similar a 1L-17 etiquetado por afinidad/actividad (tal como una fusion de Fc o una fusion de fosfatasa alcalina) en ensayos de union para identificar un tipo de celula o linea celular o tejido que expresa receptor(es) de polipeptido similar a 1L-17. El ARN aislado de tales celulas o tejidos puede convertirse en A0Nc, clonarse en un vector de expresion de mamifero y transfectarse en celulas de mamifero (tales como celulas COS o 293) para crear una biblioteca de expresion. Entonces puede usarse polipeptido similar a 1L-17 radiomarcado o etiquetado como un ligando de afinidad para identificar y aislar de esta biblioteca el subconjunto de celulas que expresan el/los receptor(es) de polipeptido similar a 1L-17 sobre su superficie. Entonces puede aislarse A0N a partir de estas celulas y transfectarse en celulas de mamifero para crear una biblioteca de expresion secundaria en la que la fraccion de celulas que expresan receptor(es) de polipeptido similar a 1L-17 es muchas veces superior que en la biblioteca original. Este procedimiento de enriquecimiento puede repetirse de manera iterativa hasta que se aisla un unico clon recombinante que contiene un receptor de polipeptido similar a 1L

17. El aislamiento del/de los receptor(es) de polipeptido similar a 1L-17 es util para identificar o desarrollar agonistas y antagonistas novedosos de la ruta de sefalizacion del polipeptido similar a 1L-17. Tales agonistas y antagonistas incluyen receptor(es) de polipeptido similar a 1L-17 soluble(s), anticuerpos anti-receptor de polipeptido similar a 1L17, moleculas pequefas, proteinas, peptidos, hidratos de carbono, lipidos u oligonucleotidos antisentido, y pueden usarse para tratar, prevenir o diagnosticar una o mas enfermedades o trastornos, incluyendo los descritos en el presente documento.

Ensayos para detectar otros moduladores de la actividad de polipeptido similar a 1L-17

En algunas situaciones, puede ser deseable identificar moleculas que son moduladores, es decir, agonistas o antagonistas, de la actividad de polipeptido similar a 1L-17. Pueden identificarse moleculas naturales o sinteticas que modulan el polipeptido similar a 1L-17 usando uno o mas ensayos de seleccion, tales como los descritos en el presente documento. Tales moleculas pueden administrarse o bien de una manera ex vivo, o de una manera in vivo mediante inyeccion, o bien mediante administracion oral, dispositivo de implantacion o similares.

quot;Molecula(s) de pruebaquot; se refiere a la(s) molecula(s) que se evalua(n) para determinar su capacidad para modular (es decir, aumentar o disminuir) la actividad de un polipeptido similar a 1L-17. Lo mas comunmente, una molecula de prueba interaccionara directamente con un polipeptido similar a 1L-17. Sin embargo, tambien se contempla que una molecula de prueba tambien puede modular la actividad de polipeptido similar a 1L-17 indirectamente, tal como afectando a la expresion del gen de polipeptido similar a 1L-17 o uniendose a un compafero de union de polipeptido similar a 1L-17 (por ejemplo, receptor o ligando). En una realizacion, una molecula de prueba se unira a un polipeptido similar a 1L-17 con una constante de afinidad de al menos aproximadamente 10-6 M, preferiblemente de aproximadamente 10-8 M, mas preferiblemente de aproximadamente 10-9 M e incluso mas preferiblemente de aproximadamente 10-10 M.

La presente invencion abarca metodos para identificar compuestos que interaccionan con polipeptidos similares a 1L

17. En determinadas realizaciones, se incuba un polipeptido similar a 1L-17 con una molecula de prueba en condiciones que permiten la interaccion de la molecula de prueba con un polipeptido similar a 1L-17, y puede medirse el grado de la interaccion. La(s) molecula(s) de prueba puede(n) seleccionarse en una forma sustancialmente pura o en una mezcla en bruto.

En determinadas realizaciones, un agonista o antagonista de polipeptido similar a 1L-17 puede ser una proteina, un peptido, un hidrato de carbono, un lipido o una molecula de peso molecular pequefo que interacciona con el polipeptido similar a 1L-17 regulando su actividad. Las moleculas que regulan la expresion de polipeptido similar a 1L17 incluyen acidos nucleicos que son complementarios a acidos nucleicos que codifican para un polipeptido similar a 1L-17, o son complementarios a secuencias de acido nucleico que dirigen o controlan la expresion de polipeptido similar a 1L-17, y que actuan como reguladores antisentido de la expresion.

Una vez que se ha identificado que un conjunto de moleculas de prueba interacciona con un polipeptido similar a 1L17, las moleculas pueden evaluarse adicionalmente para determinar su capacidad para aumentar o disminuir la actividad del polipeptido similar a 1L-17. La medicion de la interaccion de moleculas de prueba con polipeptidos similares a 1L-17 puede llevarse a cabo en varios formatos, incluyendo ensayos de union basados en celulas, ensayos de union a membranas, ensayos en fase de disolucion e inmunoensayos. En general, las moleculas de prueba se incuban con un polipeptido similar a 1L-17 durante un periodo de tiempo especificado y se determina la actividad del polipeptido similar a 1L-17 mediante uno o mas ensayos para medir la actividad biologica.

La interaccion de moleculas de prueba con polipeptidos similares a 1L-17 tambien puede someterse a ensayo directamente usando anticuerpos policlonales o monoclonales en un inmunoensayo. Alternativamente, pueden usarse formas modificadas de polipeptidos similares a 1L-17 que contienen etiquetas de epitopo tal como se describen en el presente documento en inmunoensayos.

En el caso de que los polipeptidos similares a 1L-17 presenten actividad biologica a traves de una interaccion con un compafero de union (por ejemplo, un receptor o un ligando), puede usarse una variedad de ensayos in vitro para medir la union de un polipeptido similar a 1L-17 al compafero de union correspondiente (tal como un agente de union selectiva, receptor o ligando). Estos ensayos pueden usarse para seleccionar moleculas de prueba segun su capacidad para aumentar o disminuir la velocidad y/o el grado de union de un polipeptido similar a 1L-17 a su compafero de union. En un ensayo, se inmoviliza un polipeptido similar a 1L-17 en los pocillos de una placa de microtitulacion. Entonces se afaden el compafero de union de polipeptido similar a 1L-17 radiomarcado (por ejemplo, compafero de union de polipeptido similar a 1L-17 yodado) y la(s) molecula(s) de prueba o bien de una vez (en cualquier orden) o bien simultaneamente a los pocillos. Tras la incubacion, los pocillos pueden lavarse y contarse (usando un contador de centelleo) para medir la radioactividad para determinar el grado con el que el compafero de union se une al polipeptido similar a 1L-17. Normalmente, las moleculas se someteran a prueba a lo largo de un intervalo de concentraciones, y puede usarse una serie de pocillos de control que carecen de uno o mas elementos de los ensayos de prueba para determinar la exactitud en la evaluacion de los resultados. Una alternativa a este metodo implica invertir las quot;posicionesquot; de las proteinas, es decir, inmovilizar el compafero de union de polipeptido similar a 1L-17 en los pocillos de la placa de microtitulacion, incubar con la molecula de prueba y el polipeptido similar a 1L-17 radiomarcado y determinar el grado de union de polipeptido similar a 1L-17. Vease, por ejemplo, el capitulo 18, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds., John (iley & Sons, Nueva York, NY (1995).

Como una alternativa al radiomarcaje, puede conjugarse un polipeptido similar a 1L-17 o su compafero de union con biotina y entonces puede detectarse la presencia de proteina biotinilada usando estreptavidina unida a una enzima, tal como peroxidasa del rabano (HRP) o fosfatasa alcalina (AP), que puede detectarse colorimetricamente o mediante etiquetado fluorescente de estreptavidina. Tambien puede usarse un anticuerpo dirigido frente a un polipeptido similar a 1L-17 o frente a una pareja de union de polipeptido similar a 1L-17 y conjugado con biotina y puede detectarse tras la incubacion con estreptavidina unida a enzima unida a AP o HRP.

Tambien puede inmovilizarse un polipeptido similar a 1L-17 o un compafero de union de polipeptido similar a 1L-17 mediante union a perlas de agarosa, perlas acrilicas u otros tipos de tales sustratos de fase solida inerte. El complejo de sustrato-proteina puede colocarse en una disolucion que contiene la proteina complementaria y el compuesto de prueba. Tras la incubacion, las perlas pueden precipitarse mediante centrifugacion, y la cantidad de union entre un polipeptido similar a 1L-17 y su compafero de union puede evaluarse usando los metodos descritos en el presente documento. Alternativamente, el complejo de sustrato-proteina puede inmovilizarse en una columna, y la molecula de prueba y la proteina complementaria se hacen pasar a traves de la columna. Entonces puede evaluarse la formacion de un complejo entre un polipeptido similar a 1L-17 y su pareja de union usando cualquiera de las tecnicas expuestas en el presente documento, es decir, radiomarcaje, union a anticuerpos o similares.

Otro ensayo in vitro que es util para identificar una molecula de prueba que aumenta o disminuye la formacion de un complejo entre un polipeptido similar a 1L-17 y un compafero de union de polipeptido similar a 1L-17 es un sistema de detector de resonancia de plasmones superficiales tal como el sistema de ensayo B1Acore (Pharmacia, Piscataway, NJ). El sistema B1Acore puede llevarse a cabo usando el protocolo del fabricante. Este ensayo implica esencialmente la union covalente de o bien polipeptido similar a 1L-17 o bien un compafero de union de polipeptido similar a 1L-17 a un chip sensor recubierto con dextrano que se ubica en un detector. Entonces, el compuesto de prueba y la otra proteina complementaria pueden inyectarse, o bien simultanea o bien secuencialmente, en la camara que contiene el chip sensor. La cantidad de proteina complementaria que se une puede evaluarse basandose en el cambio en la masa molecular que esta asociada fisicamente con el lado recubierto con dextrano del chip sensor; el cambio en la masa molecular puede medirse mediante el sistema de detector.

En algunos casos, puede ser deseable evaluar dos o mas compuestos de prueba juntos para determinar su capacidad de aumentar o disminuir la formacion de un complejo entre un polipeptido similar a 1L-17 y un compafero de union de polipeptido similar a 1L-17. En estos casos, los ensayos expuestos en el presente documento pueden modificarse facilmente afadiendo tal(es) compuesto(s) de prueba adicional(es) o bien simultaneamente con o bien posteriormente al primer compuesto de prueba. El resto de las etapas en el ensayo son tal como se expone en el presente documento.

Pueden usarse ensayos in vitro tales como los descritos en el presente documento ventajosamente para examinar grandes numeros de compuestos para determinar los efectos sobre la formacion de complejos mediante un polipeptido similar a 1L-17 y un compafero de union de polipeptido a 1L-17. Los ensayos pueden automatizarse para examinar compuestos generados en las bibliotecas de presentacion en fago, de peptidos sinteticos y de sintesis quimica.

Los compuestos que aumentan o disminuyen la formacion de un complejo entre un polipeptido similar a 1L-17 y un compafero de union de polipeptido a 1L-17 tambien pueden examinarse en cultivos celulares usando celulas y lineas celulares que expresan o bien polipeptido similar a 1L-17 o bien compafero de union de polipeptido similar a 1L-17. Pueden obtenerse celulas y lineas celulares a partir de cualquier mamifero, pero preferiblemente seran de fuentes de ser humano u otro primate, caninas o de roedores. La union de un polipeptido similar a 1L-17 a celulas que expresan el compafero de union de polipeptido similar a 1L-17 en la superficie se evalua en presencia o ausencia de moleculas de prueba, y el grado de union puede determinarse mediante, por ejemplo, citometria de flujo usando un anticuerpo biotinilado frente a un compafero de union de polipeptido a 1L-17. Pueden usarse ventajosamente ensayos de cultivo celular para evaluar adicionalmente compuestos que puntuan positivos en ensayos de union a proteinas descritos en el presente documento.

Tambien pueden usarse cultivos celulares para examinar el impacto de un candidato farmacologico. Por ejemplo, los candidatos farmacologicos pueden disminuir o aumentar la expresion del gen de polipeptido similar a 1L-17. En determinadas realizaciones, la cantidad de polipeptido similar a 1L-17 que se produce puede medirse tras la exposicion del cultivo celular al candidato farmacologico. En determinadas realizaciones, puede detectarse el impacto real del candidato farmacologico sobre el cultivo celular. Por ejemplo, la sobreexpresion de un gen particular puede tener un impacto particular sobre el cultivo celular. En tales casos, puede someterse a prueba la capacidad de un candidato farmacologico para aumentar o disminuir la expresion del gen o su capacidad para prevenir o inhibir un impacto particular sobre el cultivo celular. En otros ejemplos, la produccion de un producto metabolico particular tal como un fragmento de un polipeptido puede dar como resultado, o estar asociado con, una enfermedad o un estado patologico. En tales casos, puede someterse a prueba la capacidad de un candidato farmacologico para disminuir la produccion de un producto metabolico de este tipo en un cultivo celular.

1nhibidores de P-38

Cuando se desea la intervencion entre el estimulo extracelular y la secrecion de 1L-1 y/o TNFa a partir de una celula, esto puede lograrse bloqueando la transduccion de sefales a traves de la inhibicion de una cinasa que se encuentra en la ruta de sefalizacion. Esto puede lograrse por ejemplo a traves de la inhibicion de quot;P-38quot; (tambien denominada quot;RKquot; o quot;SAPK-2quot;, Lee et al., Nature, 372:739 (1994)), una serina/treonina (ser/thr) cinasa conocida. Vease Han et al., Biochimica Biophysica Acta, 1265: 224-227 (1995). Se ha mostrado una relacion lineal para la eficacia en un ensayo de union competitiva a P-38, y el mismo inhibidor que reduce la secrecion de 1L-1 de monocitos tras la estimulacion con LPS. Tras la estimulacion con LPS de monocitos, se ha mostrado que los niveles de ARN mensajero para TNFa aumentan 100 veces, pero los niveles de proteina de TNFa aumentaron 10.000 veces. Por tanto, se produce una amplificacion considerable de la sefalizacion de TNF al nivel de la traduccion. Parece que la inhibicion de P-38 reduce la eficacia de la traduccion, y se han encontrado pruebas adicionales de que TNFa esta bajo control traduccional en los experimentos de delecion de Beutler et al. y Lee, en los que se eliminan segmentos de ARNm no traducidos en 3' (UTR en 3') dando como resultado alta eficacia de la traduccion para TNFa. Notablemente, los inhibidores de P-38 no tienen un efecto sobre el nivel de TNFa (es decir, eficacia de la traduccion) cuando se delecionaron los segmentos apropiados de ARNm de TNFa.

Se ha encontrado que niveles elevados de TNFa y/o 1L-1 pueden contribuir a la aparicion, etiologia o exacerbacion de varios estados patologicos, incluyendo, pero sin limitarse a: artritis reumatoide; osteoartritis; espondilitis reumatoide; artritis gotosa; enfermedad inflamatoria del intestino; sindrome de dificultad respiratoria del adulto (AR0S); psoriasis; enfermedad de Crohn; rinitis alergica; colitis ulcerosa; anafilaxis; dermatitis por contacto; asma; terapia antiviral incluyendo los virus sensibles a la inhibicion con TNFa (V1H-1, V1H-2, V1H-3), citomegalovirus (CMV), influenza, adenovirus, y los virus del herpes incluyendo VHS-1, VHS-2, y herpes zoster; degeneracion muscular; caquexia; sindrome de Reiter; diabetes tipo 11; enfermedades de resorcion osea; reaccion de injerto contra huesped; lesion por isquemia-reperfusion; aterosclerosis; traumatismo craneoencefalico; enfermedad de Alzheimer; esclerosis multiple; malaria cerebral; septicemia; choque septicemico; sindrome de choque toxico; fiebre y mialgias debidas a infeccion.

Se han descrito compuestos de imidazol, pirrol, piridina, pirimidina y similares sustituidos para su uso en el tratamiento de enfermedades mediadas por citocinas mediante la inhibicion de citocinas proinflamatorias, tales como 1L-1, 1L-6, 1L-8 y TNF. Se han descrito imidazoles sustituidos para su uso en el tratamiento de enfermedades mediadas por citocinas en la patente estadounidense n.D 5.593.992; los documentos (O 93/14081; (O 97/18626; (O 96/21452;(O 96/21654; (O 96/40143;(O 97/05878; (O 97/05878.

Se han descrito imidazoles sustituidos para su uso en el tratamiento de inflamacion en la patente estadounidense n.D

3.929.807. Se han descrito compuestos de pirrol sustituidos para su uso en el tratamiento de enfermedades mediadas por citocinas en los documentos (O 97/05877; (O 97/05878; (O 97/16426; (O 97/16441; y (O 97/16442. Se han descrito compuestos de pirrol condensados con arilo y heteroarilo sustituidos para su uso en el tratamiento de enfermedades mediadas por citocinas en el documento (O 98/22457. Se han descrito compuestos de piridina, pirimidina, pirimidinona y piridazina sustituidos para su uso en el tratamiento de enfermedades mediadas por citocinas en los documentos (O 98/24780; (O 98/24782; (O 99/24404; y (O 99/32448.

1nternalizacion de proteinas

La secuencia de proteina tat (de V1H) puede usarse para internalizar proteinas en una celula. Vease por ejemplo, Falwell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:664-668 (1994). Por ejemplo, se ha descrito que una secuencia de 11 aminoacidos (YGRKKRRQRRR; SEQ 10 NO: 13) de la proteina tat de V1H (denominada quot;dominio de transduccion de proteinaquot;, o TAT P0T) media el suministro a traves de la membrana citoplasmatica y la membrana nuclear de una celula. Veanse Schwarze et al., Science, 285:1569-1572 (1999); y Nagahara et al., Nature Medicine, 4:1449-1452 (1998). En estos procedimientos, se preparan constructos de F1TC (F1TC-GGGGYGRKKRRQRRR; SEQ 10 NO: 14) que se unen a las celulas tal como se observa mediante analisis de clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS) y estos constructos penetran en los tejidos tras administracion i.p. A continuacion, se construyen proteinas de fusion tat-bga1. Las celulas tratadas con este constructo demuestran actividad b-gal. Tras la inyeccion, se ha encontrado que varios tejidos, incluyendo tejido hepatico, renal, pulmonar, cardiaco y cerebral, demuestran expresion usando estos procedimientos. Se cree que estas construcciones experimentaron cierto grado de desplegamiento con el fin de entrar en la celula; como tal, puede requerirse replegamiento tras entrar en la celula.

Por tanto, se apreciara que la secuencia de proteina tat puede usarse para internalizar una proteina o polipeptido deseado en una celula. Por ejemplo, usando la secuencia de proteina tat, puede administrarse intracelularmente un antagonista de polipeptido similar a 1L-17 (tal como agente de union selectiva, molecula pequefa, receptor soluble u oligonucleotido antisentido anti-polipeptido similar a 1L-17) para inhibir la actividad de una molecula similar a 1L-17. Tal como se usa en el presente documento, El termino quot;molecula similar a 1L-17quot; se refiere tanto a moleculas de acido nucleico de polipeptido similar a 1L-17 como a polipeptidos similares a 1L-17 tal como se definen en el presente documento. Cuando se desee, la propia proteina similar a 1L-17 tambien puede administrarse internamente a una celula usando estos procedimientos. Vease tambien, Strauss, E., quot;1ntroducing Proteins 1nto the Body's Cellsquot;, Science, 285:1466-1467 (1999).

Usos terapeuticos

Se ha encontrado expresion del polipeptido similar a 1L-17 humana en los siguientes tipos de celulas: testiculos, prostata, glandula mamaria, ganglio linfatico y femur. Se ha encontrado expresion del polipeptido similar a 1L-17 de raton en los siguientes tipos de celulas: celulas T y celulas embrionarias.

Una lista no exclusiva de enfermedades agudas y cronicas que pueden tratarse, diagnosticarse, mejorarse o prevenirse con los acidos nucleicos, polipeptidos, y agonistas y antagonistas de polipeptido similar a 1L-17 de la presente descripcion incluye:

•: El diagnostico y/o el tratamiento de enfermedades que implican disfuncion del sistema inmunitario. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, artritis reumatoide, artritis psoriasica, artritis inflamatoria, osteoartritis, enfermedad articular inflamatoria, enfermedad autoinmunitaria incluyendo vasculitis autoinmunitaria, esclerosis multiple, lupus, diabetes (por ejemplo, diabetes de insulina), enfermedad inflamatoria del intestino, rechazo de trasplante, enfermedad de injerto contra huesped y estados inflamatorios que resultan de tension,

distension, dafo del cartilago, traumatismo, cirugia ortopedica, infeccion u otros procesos patologicos. Otras enfermedades influidas por la disfuncion del sistema inmunitario se abarcan dentro del alcance de la descripcion, incluyendo pero sin limitarse a, alergias. Los acidos nucleicos, polipeptidos, y agonistas y antagonistas de polipeptido similar a 1L-17 de la invencion tambien pueden usarse para inhibir la proliferacion de celulas T, para inhibir la activacion de celulas T, y/o para inhibir la proliferacion de celulas B y/o la secrecion de inmunoglobulina.

•: El diagnostico y/o el tratamiento de enfermedades que implican infeccion. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, lepra, infecciones virales tales como hepatitis o V1H, infeccion bacteriana tal como enfermedades asociadas a Clostridium, incluyendo diarrea asociada a Clostridium, tuberculosis pulmonar, enfermedad febril aguda de bacterias tal como o virus, fiebre, respuesta de fase aguda del higado, septicemia, choque septicemico. Otras enfermedades que implican infeccion se abarcan dentro del alcance de la descripcion.

•: El diagnostico y/o el tratamiento de enfermedades que implican trastornos del peso. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a obesidad, anorexia, caquexia, incluyendo caquexia inducida por S10A, miopatias (por ejemplo, metabolismo de proteinas musculares, tal como en septicemia) e hipoglucemia. Otras enfermedades que implican trastornos del peso se abarcan dentro del alcance de la descripcion.

•: El diagnostico y/o el tratamiento de enfermedades que implican disfuncion neuronal. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a enfermedad de Alzheimer, de Parkinson, neurotoxicidad (por ejemplo, como la inducida por V1H), ELA, lesion cerebral, estres, depresion, nocicepcion y otros dolores (incluyendo dolor relacionado con cancer), hiperalgesia, epilepsia, alteracion del aprendizaje y trastornos de la memoria, alteraciones del suefo y neuropatias perifericas y centrales. Otros trastornos neurologicos se abarcan dentro del alcance de la descripcion.

•: El diagnostico y/o el tratamiento de enfermedades que implican el pulmon. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, lesion pulmonar aguda o cronica incluyendo enfermedad pulmonar intersticial, sindrome de enfermedad respiratoria aguda, hipertension pulmonar, enfisema, fibrosis quistica, fibrosis pulmonar y asma. Otras enfermedades del pulmon se abarcan dentro del alcance de la descripcion.

•: El diagnostico y/o el tratamiento de enfermedades que implican la piel. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, psoriasis, eccema y cicatrizacion de heridas. Otras enfermedades de la piel se abarcan dentro del alcance de la descripcion.

•: El diagnostico y/o el tratamiento de enfermedades que implican el rifon. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, glomerulonefritis aguda y cronica. Otras enfermedades del rifon se abarcan dentro del alcance de la descripcion.

•: El diagnostico y/o el tratamiento de enfermedades que implican los huesos. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, osteoporosis, osteopetrosis, osteogenesis imperfecta, enfermedad de Paget, enfermedad periodontal, enfermedad de la articulacion mandibular temporal e hipercalcemia. Otras enfermedades de los huesos se abarcan dentro del alcance de la descripcion.

•: El diagnostico y/o el tratamiento de enfermedades que implican el sistema vascular. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a hemorragia o accidente cerebrovascular, choque hemorragico, isquemia, incluyendo isquemia cardiaca e isquemia cerebral (por ejemplo, lesion cerebral como resultado de traumatismo, epilepsia, hemorragia o accidente cerebrovascular, cada uno de los cuales puede conducir a neurodegeneracion), aterosclerosis, insuficiencia cardiaca congestiva; reestenosis, lesion por reperfusion y angiogenesis. Otras enfermedades del sistema vascular se abarcan dentro del alcance de la descripcion.

•: El diagnostico y/o el tratamiento de celulas tumorales. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, linfomas, sarcoma de huesos, leucemia mielogena aguda y cronica (LMA y LMC) incluyendo leucemias mielomonociticas (LMA M4) y otras leucemias, mieloma multiple, cancer de pulmon, de mama, metastasis tumoral y efectos secundarios de la terapia de radiacion. Otras enfermedades que implican celulas tumorales se abarcan dentro del alcance de la descripcion.

•: El diagnostico y/o el tratamiento de trastornos del sistema reproductor. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, esterilidad, aborto espontaneo, parto prematuro y endometriosis. Otras enfermedades que implican el sistema reproductor se abarcan dentro del alcance de la descripcion.

•: El diagnostico y/o el tratamiento de trastornos oculares. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen, pero no se limitan a, enfermedad ocular inflamatoria, que puede estar asociada con, por ejemplo, trasplante de cornea; degeneracion de la retina, ceguera, degeneracion macular, glaucoma, uveitis y neuropatia de la retina. Otras enfermedades oculares se abarcan dentro del alcance de la descripcion.

•: El diagnostico y/o el tratamiento de enfermedades que implican inflamacion. Los ejemplos de tales enfermedades incluyen pero no se limitan a los descritos en el presente documento.

Se ha encontrado tambien que los presentes acidos nucleicos de polipeptido similar a 1L-17, polipeptidos y agonistas dados a conocer en el presente documento pueden aumentar la celularidad de medula osea y bazo, los eosinofilos, las celulas formadoras de colonias (CFC) y la produccion de linfocitos. Los presentes polipeptidos y acidos nucleicos de polipeptido similar a 1L-17 modulan por tanto el crecimiento de celulas hematopoyeticas, incluyendo la estimulacion de la proliferacion y/o diferenciacion de al menos 1 progenitor temprano o multipotente asignado a al menos 1 linaje de granulocitos y/o megacariocitos. A la inversa, los antagonistas de polipeptido similar a 1L-17 pueden disminuir los niveles y/o la produccion de estas celulas.

Ademas, los agonistas, polipeptidos y acidos nucleicos de polipeptido similar a 1L-17 dados a conocer en el presente documento tienen actividad proinflamatoria. Los polipeptidos similares a 1L-17 inducen la produccion de citocinas proinflamatorias tales como TNF-a, 1L-la, 1L-l1 e 1L-6.

Adicionalmente, los antagonistas, agonistas, polipeptidos y acidos nucleicos de polipeptido similar a 1L-17 dados a conocer en el presente documento pueden usarse para estimular la hematopoyesis y produccion de neutrofilos, granulocitos o plaquetas, y por tanto son utiles para pacientes que se someten a quimioterapia. Los antagonistas, agonistas, polipeptidos y acidos nucleicos de polipeptido similar a 1L-17 dados a conocer en el presente documento pueden usarse tambien para tratar infecciones virales o bacterianas, enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario, anemia, leucemia, trombocitopenia, uremia, enfermedad de Von (illebrand, disfuncion cardiovascular postoperatoria, tratamiento de insuficiencia de medula osea relacionada con S10A (sindrome de inmunodeficiencia adquirida) y enfermedades inflamatorias del sistema gastrointestinal, las articulaciones y los pulmones.

Otras enfermedades que pueden tratarse usando agentes dentro del alcance de la presente descripcion incluyen pancreatitis aguda, sindrome de fatiga cronica, fibromialgia y enfermedad de Kawasaki (MLNS).

Otras enfermedades asociadas con niveles no deseados de uno o mas de 1L-1, 1L-1ra, el ligando del presente polipeptido similar a 1L-17 y/o el presente polipeptido similar a 1L-17 por si mismo se abarcan dentro del alcance de la presente descripcion. Los niveles no deseados incluyen niveles excesivos y/o inferiores a los normales de 1L-1, 1L1ra, el/los receptor(es) del presente polipeptido similar a 1L-17 y/o los polipeptidos similares a 1L-17 descritos en el presente documento.

Los inhibidores de 1L-1 incluyen cualquier proteina que pueda prevenir especificamente la activacion de receptores celulares para 1L-1, lo que puede resultar de cualquiera de varios mecanismos. Tales mecanismos incluyen la regulacion por disminucion de la produccion de 1L-1, union a 1L-1 libre, interferencia con la union de 1L-1 a su receptor, interferencia con la formacion del complejo de receptor de 1L-1 (es decir, asociacion del receptor de 1L-1 con la proteina accesoria del receptor de 1L-1) o interferencia con la modulacion de la sefalizacion de 1L-1 tras la union a su receptor. Las clases de inhibidores de interleucina-1 incluyen:

•: antagonistas de receptores de interleucina-1 tales como 1L-1ra, tal como se describen en el presente documento;

•: anticuerpos monoclonales anti-receptor de 1L-1 (por ejemplo, documento EP 623674);

•: proteinas de union a 1L-1 tales como receptores de 1L-1 solubles (por ejemplo, patente estadounidense n.D 5.492.888, patente estadounidense n.D 5.488.032 y patente estadounidense n.D 5.464.937, patente estadounidense

n.D 5.319.071 y patente estadounidense n.D 5.180.812;

•: anticuerpos monoclonales anti-1L-1 (por ejemplo, documentos (O 9501997, (O 9402627, (O 9006371, patente estadounidense n.D 4.935.343, documentos EP 364778, EP 267611 y EP 220063;

•: proteinas accesorias de receptores de 1L-1 y anticuerpos frente a las mismas (por ejemplo, documento (O 96/23067);

•: inhibidores de enzima convertidora de interleucina-11 (1CE) o caspasa 1, que puede usarse para inhibir la produccion y secrecion de 1L-1 beta;

•: inhibidores de proteasa de interleucina-11;

• otros compuestos y proteinas que bloquean la sintesis in vivo o la liberacion extracelular de 1L-1.

Se dan a conocer inhibidores de 1L-1 a modo de ejemplo en las siguientes referencias:

patentes estadounidenses n.os 5747444; 5359032; 5608035; 5843905; 5359032; 5866576; 5869660; 5869315; 5872095; 5955480;

solicitudes de patente internacional ((O) 98/21957, 96/09323, 91/17184, 96/40907, 98/32733, 98/42325, 98/44940, 98/47892, 98/56377, 99/03837, 99/06426, 99/06042, 91/17249, 98/32733, 98/17661, 97/08174, 95/34326, 99/36426 y 99/36415;

solicitudes de patente europea (EP) 534978 y 894795; y solicitud de patente francesa FR 2762514.

El antagonista de receptor de interleucina-1 (1L-1ra) es una proteina humana que actua como inhibidor natural de interleucina-1. Se describen antagonistas de receptores preferidos (incluyendo 1L-1ra y variantes y derivados del mismo), asi como metodos de preparacion y uso de los mismos, en la patente estadounidense n.D 5.075.222; los documentos (O 91/08285; (O 91/17184; AU 9173636; (O 92/16221; (O 93/21946; (O94/06457; (O 94/21275; FR 2706772; (O 94/21235; 0E 4219626, (O 94/20517; (O 96/22793; (O 97/28828; y (O 99/36541. Las proteinas incluyen antagonistas de receptores de 1L-1 glicosilados asi como no glicosilados.

Especificamente, se dan a conocer tres formas a modo de ejemplo de 1L-1ra y variantes del mismo y se describen en la patente 5.075.222. La primera de estas, denominada quot;1L-1iquot; en la patente 5.075.222, se caracteriza como una molecula de 22-23 k0 en S0S-PAGE con un punto isoelectrico aproximado de 4,8, que eluye de una columna MonoQ FPLC a aproximadamente NaCl 52 mM en tampon Tris, pH 7,6. La segunda, 1L-1ra1, se caracteriza como una proteina de 22-23 k0, que eluye de una columna MonoQ a NaCl 48 mM. Tanto 1L-1raa como 1L-1ra1 estan glicosiladas. La tercera, 1L-1rax, se caracteriza como una proteina de 20 k0, que eluye de una columna MonoQ a NaCl 48 mM, y no esta glicosilada. La patente estadounidense n.D 5.075.222 tambien da a conocer metodos para aislar los genes responsables de la codificacion de los inhibidores, clonar el gen en vectores y tipos de celulas adecuados y expresar el gen para producir los inhibidores.

Los expertos en la tecnica reconoceran que pueden hacerse muchas combinaciones de deleciones, inserciones y sustituciones (individual o colectivamente quot;variante(s)quot; en el presente documento) dentro de las secuencias de aminoacidos de 1L-1ra, siempre que la molecula resultante sea biologicamente activa (por ejemplo, posee la capacidad para afectar a una o mas de las enfermedades y trastornos tales como los mencionados en el presente documento.)

Tal como se contempla por la presente invencion, puede administrarse un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17 (incluyendo, pero sin limitarse a, agentes de union selectiva anti-polipeptido similar a 1L-17 [tales como anticuerpos], receptores de polipeptido similar a 1L-17 [tales como receptores de polipeptido similar a 1L-17 solubles], moleculas pequefas y oligonucleotidos antisentido como coadyuvante a otra terapia y tambien con otras composiciones farmaceuticas adecuadas para la indicacion que esta tratandose. Un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o el propio receptor de un polipeptido similar a 1L-17, y cualquiera de una o mas terapias adicionales o formulaciones farmaceuticas pueden administrarse por separado, secuencialmente o simultaneamente.

En una realizacion especifica, la presente descripcion se refiere al uso de un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 en combinacion (tratamiento previo, tratamiento posterior o tratamiento simultaneo) con cualquiera de uno o mas inhibidores de TNF para el tratamiento o la prevencion de las enfermedades y trastornos mencionados en el presente documento.

Tales inhibidores de TNF incluyen compuestos y proteinas que bloquean la sintesis in vivo o la liberacion extracelular de TNF. En una realizacion especifica, la presente descripcion se refiere al uso de un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 en combinacion (tratamiento previo, tratamiento posterior o tratamiento simultaneo) con cualquiera de uno o mas de los siguientes inhibidores de TNF: proteinas de union a TNF (receptor de TNF soluble de tipo 1 y receptor de TNF soluble de tipo 11 (quot;sTNFRquot;), tal como se definen en el presente documento), anticuerpos anti-TNF, factor estimulante de las colonias de granulocitos; talidomida; BN 50730; tenidap; E 5531; tiapafant PCA 4248; nimesulida; panavir; rolipram; RP 73401; peptido T; M0L 201.449A; clorhidrato de (1R,3S)-cis-1-[9-(2,6-diaminopurinil)]-3-hidroxi-4-ciclopenteno; (1R,3R)trans-1-(9-(2,6-diamino)purina]-3-acetoxiciclopentano; clorhidrato de (1R,3R)-trans-1-[9-adenil)-3-azidociclopentano y (1R,3R)-trans-1-(6-hidroxi-purin-9-il)-3-azidociclo-pentano. Se dan a conocer en la tecnica proteinas de union a TNF (documentos EP 308 378, EP 422 339, GB 2 218 101, EP 393 438, (O 90/13575, EP 398 327, EP 412 486, (O 91/03553, EP 418 014, JP 127,800/1991, EP 433 900, patente estadounidense n.D. 5.136.021, documentos GB 2 246 569, EP 464 533, (O 92/01002, (O 92/13095, (O 92/16221, EP 512 528, EP 526 905, (O 93/07863, EP 568 928, (O 93/21946, (O 93/19777, EP 417 563, (O94/06476 y solicitud internacional PCT n.D PCT/US97/12244).

Por ejemplo, los documentos EP 393 438 y EP 422 339 ensefan las secuencias de acido nucleico y aminoacidos de un receptor de TNF soluble de tipo 1 (tambien conocido como quot;sTNFR-1quot; o quot;inhibidor de TNF de 30 k0aquot;) y un receptor de TNF soluble de tipo 11 (tambien conocido como quot;sTNFR-11quot; o quot;inhibidor de TNF de 40 k0aquot;), denominados conjuntamente quot;sTNFRquot;, asi como formas modificadas de los mismos (por ejemplo, fragmentos, derivados funcionales y variantes). Los documentos EP 393 438 y EP 422 339 tambien dan a conocer metodos para aislar los genes responsables de la codificacion de los inhibidores, la clonacion del gen en vectores y tipos de celulas adecuados y la expresion del gen para producir los inhibidores. Adicionalmente, tambien se han dado a conocer formas polivalentes (es decir, moleculas que comprenden mas de un resto activo) de sTNFR-1 y sTNFR-11. En una realizacion, la forma polivalente puede construirse acoplando quimicamente al menos un inhibidor de TNF y otro resto con cualquier ligador clinicamente aceptable, por ejemplo polietilenglicol (documentos (O 92/16221 y (O 95/34326), mediante un ligador peptidico (Neve et al. (1996), Cytokine, 8 (5): 365-370, mediante acoplamiento quimico a biotina y luego union a avidina (documento (O 91/03553) y, finalmente, combinando moleculas de anticuerpos quimericos (patente estadounidense 5.116.964, documentos (O 89/09622, (O 91/16437 y EP 315062).

Los anticuerpos anti-TNF incluyen anticuerpo Fab MAK 195F (Holler et al. (1993), 1st 1nternational Symposium on Cytokines in Bone Marrow Transplantation, 147); anticuerpo monoclonal anti-TNF C0P 571 (Rankin et al. (1995), British Journal of Rheumatology, 34:334-342); anticuerpo monoclonal anti-factor de necrosis tumoral murino BAY X 1351 (Kieft et al. (1995), 7th European Congress of Clinical Microbiology and 1nfectious 0iseases, pagina 9); anticuerpo monoclonal anti-TNF CenTNF cA2 (Elliott et al. (1994), Lancet, 344:1125-1127 y Elliott et al. (1994), Lancet, 344:1105-1110).

En una realizacion especifica, la presente descripcion se refiere al uso de agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 en combinacion (tratamiento previo, tratamiento posterior o tratamiento simultaneo) con antigeno fas humano secretado o soluble o versiones recombinantes del mismo (documento (O 96/20206 y Mountz et al., J. 1mmunology, 155:4829-4837; y documento EP 510 691. El documento (O 96/20206 da a conocer antigeno fas humano secretado (nativo y recombinante, incluyendo una proteina de fusion de 1g), metodos para aislar los genes responsables de la codificacion del antigeno fas humano recombinante soluble, metodos para clonar el gen en vectores y tipos de celulas adecuados y metodos para expresar el gen para producir los inhibidores. El documento EP 510 691 ensefa A0N que codifican para antigeno fas humano, incluyendo antigeno fas soluble, vectores que expresan dichos A0N y transformantes transfectados con el vector. Cuando se administran por via parenteral, las dosis de una proteina de fusion de antigeno fas secretado o soluble son cada una generalmente de desde aproximadamente 1 microgramo/kg hasta aproximadamente 100 microgramos/kg.

El tratamiento actual de las enfermedades y trastornos mencionados en el presente documento, incluyendo inflamacion aguda y cronica tal como enfermedades reumaticas, incluye comunmente el uso de farmacos de primera linea para el control del dolor y la inflamacion; estos farmacos se clasifican como farmacos antiinflamatorios no esteroideos (A1NE). Los tratamientos secundarios incluyen corticosteroides, farmacos antirreumaticos de accion lenta (FARAL) o farmacos modificadores de la enfermedad (ME). Puede encontrarse informacion referente a los siguientes compuestos en The Merck Manual of 0iagnosis and Therapy, decimosexta edicion, Merck, Sharp & 0ohme Research Laboratories, Merck & Co., Rahway, NJ (1992) y en Pharmaprojects, PJB Publications Ltd.

En una realizacion especifica, la presente descripcion se refiere al uso de un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 y cualquiera de uno o mas A1NE para el tratamiento de las enfermedades y trastornos mencionados en el presente documento, incluyendo inflamacion aguda y cronica tal como enfermedades reumaticas; y enfermedad de injerto contra huesped. Los A1NE deben su accion antiinflamatoria, al menos en parte, a la inhibicion de la sintesis de prostaglandinas (Goodman y Gilman en quot;The Pharmacological Basis of Therapeuticsquot;, MacMillan 7' edicion (1985)). Los A1NE pueden caracterizarse en al menos nueve grupos: (1) derivados de acido salicilico; (2) derivados de acido propionico; (3) derivados de acido acetico; (4) derivados de acido fenamico; (5) derivados de acido carboxilico; (6) derivados de acido butirico; (7) oxicams; (8) pirazoles y (9) pirazolonas.

En otra realizacion especifica, la presente descripcion se refiere al uso de un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 en combinacion (tratamiento previo, tratamiento posterior o tratamiento simultaneo) con cualquiera de uno o mas derivados de acido salicilico, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Tales derivados de acido salicilico, esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos comprenden: acetaminosalol, aloxiprina, aspirina, benorilato, bromosaligenina, acetilsalicilato de calcio, trisalicilato de colina y magnesio, salicilato de magnesio, salicilato de colina, diflusinal, etersalato, fendosal, acido gentisico, salicilato de glicol, salicilato de imidazol, acetilsalicilato de lisina, mesalamina, salicilato de morfolina, salicilato de 1-naftilo, olsalazina, parsalmida, acetilsalicilato de fenilo, salicilato de fenilo, salacetamida, acido O-acetico de salicilamida, salsalato, salicilato de sodio y sulfasalazina. Tambien se pretende que derivados de acido salicilico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares esten abarcados por este grupo.

En una realizacion especifica adicional, la presente descripcion se refiere al uso de un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 en combinacion (tratamiento previo, tratamiento posterior o tratamiento simultaneo) con cualquiera de uno o mas derivados de acido propionico, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de acido propionico, esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos comprenden: alminoprofeno, benoxaprofeno, acido bucloxico, carprofeno, dexindoprofeno, fenoprofeno, flunoxaprofeno, fluprofeno, flurbiprofeno, furcloprofeno, ibuprofeno, ibuprofeno aluminio, ibuproxam, indoprofeno, isoprofeno, ketoprofeno, loxoprofeno, miroprofeno, naproxeno, naproxeno sodico, oxaprozina, piketoprofeno, pimeprofeno, pirprofeno, pranoprofeno, acido protizinico, piridoxiprofeno, suprofeno, acido tiaprofenico y tioxaprofeno. Tambien se pretende que derivados de acido propionico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares esten abarcados por este grupo.

Aun en otra realizacion especifica, la presente descripcion se refiere al uso de un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 en combinacion (tratamiento previo, tratamiento posterior o tratamiento simultaneo) con cualquiera de uno o mas derivados de acido acetico, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de acido acetico, esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos comprenden: acemetacina, alclofenaco, amfenaco, bufexamaco, cinmetacina, clopiraco, delmetacina, diclofenaco potasico, diclofenaco sodico, etodolaco, felbinaco, fenclofenaco, fencloraco, acido fenclozico, fentiazaco, furofenaco, glucametacina, ibufenaco, indometacina, isofezolaco, isoxepaco, lonazolaco, acido etiazinico, oxametacina, oxpinaco, pimetacina, proglumetacina, sulindaco, talmetacina, tiaramida, tiopinaco, tolmetina, tolmetina sodica, zidometacina y zomepiraco. Tambien se pretende que derivados de acido acetico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares esten abarcados por este grupo.

En otra realizacion especifica, la presente descripcion se refiere al uso de un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 en combinacion (tratamiento previo, tratamiento posterior o tratamiento simultaneo) con cualquiera de uno o mas derivados de acido fenamico, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de acido fenamico, esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos comprenden: acido enfenamico, etofenamato, acido flufenamico, isonixina, acido meclofenamico, meclofenamato sodico, acido medofenamico, acido mefenamico, acido niflumico, talniflumato, terofenamato, acido tolfenamico y ufenamato. Tambien se pretende que derivados de acido fenamico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares esten abarcados por este grupo.

En una realizacion especifica adicional, la presente descripcion se refiere al uso de un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 en combinacion (tratamiento previo, tratamiento posterior o tratamiento simultaneo) con cualquiera de uno o mas derivados de acido carboxilico, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de acido carboxilico, esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos que pueden usarse comprenden: clidanaco, diflunisal, flufenisal, inoridina, ketorolaco y tinoridina. Tambien se pretende que derivados de acido carboxilico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares esten abarcados por este grupo.

Aun en otra realizacion especifica, la presente descripcion se refiere al uso de un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 en combinacion (tratamiento previo, tratamiento posterior o tratamiento simultaneo) con cualquiera de uno o mas derivados de acido butirico, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los derivados de acido butirico, esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos comprenden: bumadizona, butibufeno, fenbufeno y xenbucina. Tambien se pretende que derivados de acido butirico estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares esten abarcados por este grupo.

En otra realizacion especifica, la presente descripcion se refiere al uso de un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 en combinacion (tratamiento previo, tratamiento posterior o tratamiento simultaneo) con cualquiera de uno o mas oxicams, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los oxicams, esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos comprenden: droxicam, enolicam, isoxicam, piroxicam, sudoxicam, tenoxicam y 4-hidroxil1,2-benzotiazina-1,1-dioxido-4-(N-fenil)-carboxamida. Tambien se pretende que oxicams estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares esten abarcados por este grupo.

Todavia en otra realizacion especifica, la presente descripcion se refiere al uso de un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 en combinacion (tratamiento previo, tratamiento posterior o tratamiento simultaneo) con cualquiera de uno o mas pirazoles, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Los pirazoles, esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos que pueden usarse comprenden: difenamizol y epirizol. Tambien se pretende que pirazoles estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares esten abarcados por este grupo.

En una realizacion especifica adicional, la presente descripcion se refiere al uso de un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 en combinacion (tratamiento previo, tratamiento posterior o tratamiento simultaneo) con cualquiera de una o mas pirazolonas, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos. Las pirazolonas, esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos que pueden usarse comprenden: apazona, azapropazona, benzpiperilona, feprazona, mofebutazona, morazona, oxifenbutazona, fenilbutazona, pipebuzona, propilfenazona, ramifenazona, suxibuzona y tiazolinobutazona. Tambien se pretende que pirazolonas estructuralmente relacionadas que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares esten abarcados por este grupo.

En otra realizacion especifica, la presente descripcion se refiere al uso de un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 en combinacion (tratamiento previo, tratamiento posterior o tratamiento simultaneo) con cualquiera de uno o mas de los siguientes A1NE: acido s-acetamidocaproico, S-adenosilmetionina, acido 3-amino-4-hidroxibutirico, amixetrina, anitrazafeno, antrafenina, bendazaco, lisinato de bendazaco, bencidamina, beprozina, broperamol, bucolomo, bufezolaco, ciprocuazona, cloximato, dazidamina, deboxamet, detomidina, difenpiramida, difenpiramida, difisalamina, ditazol, emorfazona, mesilato de fanetizol, fenflumizol, floctafenina, flumizol, flunixina, fluprocuazona, fopirtolina, fosfosal, guaimesal, guaiazoleno, isonixina, lefetamina HCl, leflunomida, lofemizol, lotifazol, clonixinato de lisina, meseclazona, nabumetona, nictindol, nimesulida, orgoteina, orpanoxina, oxaceprol, oxapadol, paranilina, perisoxal, citrato de perisoxal, pifoxima, piproxeno, pirazolaco, pirfenidona, procuazona, proxazol, tielavina B, tiflamizol, timegadina, tolectina, tolpadol, triptamida y los designados por el numero de codigo de compafias tal como 480156S, AA861, A01590, AFP802, AFP860, A177B, AP504, AU8001, BPPC, B(540C, CH1NO1N 127, CN100, EB382, EL508, F1044, FK-506, GV3658, 1TF182, KCNTE16090, KME4, LA2851, MR714, MR897, MY309, ON03144, PR823, PV102, PV108, R830, RS2131, SCR152, SH440, S1R133, SPAS510, SQ27239, ST281, SY6001, TA60, TA1-901 (acido 4-benzoil-1indancarboxilico), TVX2706, U60257, UR2301 y (Y41770. Tambien se pretende que A1NE estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares a los A1NE esten abarcados por este grupo.

Todavia en otra realizacion especifica, la presente descripcion se refiere al uso de un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 en combinacion (tratamiento previo, tratamiento posterior o tratamiento simultaneo) con cualquiera de uno o mas corticosteroides, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de las enfermedades y trastornos mencionados en el presente documento, incluyendo inflamacion aguda y cronica tal como enfermedades reumaticas, enfermedad de injerto contra huesped y esclerosis multiple. Los corticosteroides, esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos incluyen hidrocortisona y compuestos que se derivan de hidrocortisona, tales como 21-acetoxipregnenolona, alclomerasona, algestona, amcinonida, beclometasona, betametasona, valerato de betametasona, budesonida, cloroprednisona, clobetasol, propionato de clobetasol, clobetasona, butirato de clobetasona, clocortolona, cloprednol, corticosterona, cortisona, cortivazol, deflazacort, desonida, desoximerasona, dexametasona, diflorasona, diflucortolona, difluprednato, enoxolona, fluazacort, flucloronida, flumetasona, pivalato de flumetasona, acetonido de flucinolona, flunisolida, fluocinonida, acetonido de fluorocinolona, fluocortina butilo, fluocortolona, hexanoato de fluocortolona, valerato de diflucortolona, fluorometolona, acetato de fluperolona, acetato de fluprednideno, fluprednisolona, flurandenolida, formocortal, halcinonida, halometasona, acetato de halopredona, hidrocortamato, hidrocortisona, acetato de hidrocortisona, butirato de hidrocortisona, fosfato de hidrocortisona, succinato 21-sodico de hidrocortisona, tebutato de hidrocortisona, mazipredona, medrisona, meprednisona, metilprednisolona, furoato de mometasona, parametasona, prednicarbato, prednisolona, 21-diedriaminoacetato de prednisolona, fosfato sodico de prednisolona, succinato sodico de prednisolona, 21-m-sulfobenzoato sodico de prednisolona, 21-estearoglicolato sodico de prednisolona, tebutato de prednisolona, 21-trimetilacetato de prednisolona, prednisona, prednival, prednilideno, 21dietilaminoacetato de prednilideno, tixocortol, triamcinolona, acetonido de triamcinolona, benetonido de triamcinolona y hexacetonido de triamcinolona. Tambien se pretende que corticosteroides estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares esten abarcados por este grupo.

En otra realizacion especifica, la presente descripcion se refiere al uso de un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 en combinacion (tratamiento previo, tratamiento posterior o tratamiento simultaneo) con cualquiera de uno o mas farmacos antirreumaticos de accion lenta (FARAL)

o farmacos antirreumaticos modificadores de la enfermedad (FARME), esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de las enfermedades y trastornos mencionados en el presente documento, incluyendo inflamacion aguda y cronica tal como enfermedades reumaticas, enfermedad de injerto contra huesped y esclerosis multiple. Los FARAL o FARME, esteres de profarmacos y sales farmaceuticamente aceptables de los mismos comprenden: alocupreida sodica, auranofina, aurotioglucosa, aurotioglicanida, azatioprina, brequinar sodico, bucilamina, 3-aurotio-2-propanol-1-sulfonato de calcio, clorambucilo, cloroquina, clobuzarit, cuproxolina, ciclofosfamida, ciclosporina, dapsona, 15-desoxiespergualina, diacereina, glucosamina, sales de oro (por ejemplo, sal de oro de cicloquina, tiomalato sodico de oro, tiosulfato sodico de oro), hidroxicloroquina, sulfato de hidroxicloroquina, hidroxiurea, kebuzona, levamisol, lobenzarit, melitina, 6mercaptopurina, metotrexato, mizoribina, micofenolato de mofetilo, mioral, mostaza de nitrogeno, 0-penicilamina, piridinolimidazoles tales como SKNF86002 y SB203580, rapamicina, tioles, timopoyetina y vincristina. Tambien se pretende que FARAL o FARME estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares esten abarcados por este grupo.

En otra realizacion especifica, la presente descripcion se refiere al uso de un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 en combinacion (tratamiento previo, tratamiento posterior o tratamiento simultaneo) con cualquiera de uno o mas inhibidores de COX2, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de las enfermedades y trastornos mencionados en el presente documento, incluyendo inflamacion aguda y cronica. Los ejemplos de inhibidores de COX2, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos incluyen, por ejemplo, celecoxib. Tambien se pretende que inhibidores de COX2 estructuralmente relacionados que tienen propiedades analgesicas y antiinflamatorias similares esten abarcados por este grupo.

Todavia en otra realizacion especifica, la presente descripcion se refiere al uso de un agonista o antagonista del polipeptido similar a 1L-17, y/o un receptor de polipeptido similar a 1L-17 en combinacion (tratamiento previo, tratamiento posterior o tratamiento simultaneo) con cualquiera de uno o mas antimicrobianos, esteres de profarmacos o sales farmaceuticamente aceptables de los mismos para el tratamiento de las enfermedades y trastornos mencionados en el presente documento, incluyendo inflamacion aguda y cronica. Los antimicrobianos incluyen, por ejemplo, las amplias clases de penicilinas, cefalosporinas y otras beta-lactamas, aminoglicosidos, azoles, quinolonas, macrolidos, rifamicinas, tetraciclinas, sulfonamidas, lincosamidas y polimixinas. Las penicilinas incluyen, pero no se limitan a penicilina G, penicilina V, meticilina, nafcilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, floxacilina, ampicilina, ampicilina/sulbactam, amoxicilina, amoxicilina/clavulanato, hetacilina, ciclacilina, bacampicilina, carbenicilina, carbenicilina indanilo, ticarcilina, ticarcilina/clavulanato, azlocilina, mezlocilina, peperacilina y mecilinam. Las cefalosporinas y otras beta-lactamas incluyen, pero no se limitan a cefalotina, cefapirina, cefalexina, cefradina, cefazolina, cefadroxilo, cefaclor, cefamandol, cefotetan, cefoxitina, cefuroxima, cefonicid, ceforadina, cefixima, cefotaxima, moxalactama, ceftizoxima, cetriaxona, cefoperazona, ceftazidima, imipenem y aztreonam. Los aminoglicosidos incluyen, pero no se limitan a estreptomicina, gentamicina, tobramicina, amikacina, netilmicina, kanamicina y neomicina. Los azoles incluyen, pero no se limitan a fluconazol. Las quinolonas incluyen, pero no se limitan a acido nalidixico, norfloxacino, enoxacino, ciprofloxacino, ofloxacino, esparfloxacino y temafloxacino. Los macrolidos incluyen, pero no se limitan a eritromicina, espiramicina y azitromicina. Las rifamicinas incluyen, pero no se limitan a rifampina. Las tetraciclinas incluyen, pero no se limitan a espiciclina, clortetraciclina, clomociclina, demeclociclina, desoxiciclina, guameciclina, limeciclina, meclociclina, metaciclina, minociclina, oxitetraciclina, penimepiciclina, pipaciclina, rolitetraciclina, sanciclina, senociclina y tetraciclina. Las sulfonamidas incluyen, pero no se limitan a sulfanilamida, sulfametoxazol, sulfacetamida, sulfadiazina, sulfisoxazol y cotrimoxazol (trimetoprim/sulfametoxazol). Las lincosamidas incluyen, pero no se limitan a clindamicina y lincomicina. Las polimixinas (polipeptidos) incluyen, pero no se limitan a polimixina B y colistina.

Composiciones de polipeptido similar a 1L-17 y administracion

Estan dentro del alcance de la presente descripcion composiciones terapeuticas. Tales composiciones farmaceuticas de polipeptido similar a 1L-17 pueden comprender una cantidad terapeuticamente eficaz de un polipeptido similar a 1L-17 o una molecula de acido nucleico de polipeptido similar a 1L-17 en mezcla con un agente de formulacion farmaceutica o fisiologicamente aceptable para idoneidad con el modo de administracion. Las composiciones farmaceuticas pueden comprender una cantidad terapeuticamente eficaz de uno o mas agentes de union selectiva a polipeptido similar a 1L-17 en mezcla con un agente de formulacion farmaceutica o fisiologicamente aceptable para idoneidad con el modo de administracion.

Los materiales de formulacion aceptables son preferiblemente no toxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas.

La composicion farmaceutica puede contener materiales de formulacion para modificar, mantener o conservar, por ejemplo, el pH, la osmolaridad, la viscosidad, la claridad, el color, la isotonicidad, el olor, la esterilidad, la estabilidad, la velocidad de disolucion o liberacion, la adsorcion o penetracion de la composicion. Los materiales de formulacion adecuados incluyen, pero no se limitan a, aminoacidos (tales como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina); antimicrobianos; antioxidantes (tales como acido ascorbico, sulfito de sodio o hidrogenosulfito de sodio); tampones (tales como borato, bicarbonato, Tris-HCl, citratos, fosfatos u otros acidos organicos); agentes de carga (tales como manitol o glicina); agentes quelantes (tales como acido etilendiaminotetraacetico (E0TA)); agentes complejantes (tales como cafeina, polivinilpirrolidona, beta-ciclodextrina o hidroxipropil-beta-ciclodextrina); cargas; monosacaridos; disacaridos; y otros hidratos de carbono (tales como glucosa, manosa o dextrinas); proteinas (tales como albumina serica, gelatina o inmunoglobulinas); agentes colorantes, aromatizantes y de dilucion; agentes emulsionantes; polimeros hidrofilos (tales como polivinilpirrolidona); polipeptidos de bajo peso molecular; contraiones formadores de sal (tales como sodio); conservantes (tales como cloruro de benzalconio, acido benzoico, acido salicilico, timerosal, alcohol fenetilico, metilparabeno, propilparabeno, clorhexidina, acido sorbico o peroxido de hidrogeno); disolventes (tales como glicerina, propilenglicol o polietilenglicol); alcoholes de azucar (tales como manitol o sorbitol); agentes de suspension; tensioactivos o agentes humectantes (tales como Pluronic, PEG, esteres de sorbitano, polisorbatos tales como polisorbato 20, polisorbato 80, triton, trometamina, lecitina, colesterol, tiloxapal); agentes potenciadores de la estabilidad (tal como sacarosa o sorbitol); agentes potenciadores de la tonicidad (tales como haluros de metales alcalinos, preferiblemente cloruro de sodio o potasio, manitol, sorbitol); vehiculos de administracion; diluyentes; excipientes y/o adyuvantes farmaceuticos. (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18' Edicion, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company (1990).

La composicion farmaceutica optima la determinara un experto en la tecnica dependiendo de, por ejemplo, la via de administracion prevista, el formato de administracion y la dosificacion deseada. Vease, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, citado anteriormente. Tales composiciones pueden influir en el estado fisico, la estabilidad, la velocidad de liberacion in vivo y la velocidad de aclaramiento in vivo de la molecula de polipeptido similar a 1L-17.

El vehiculo o portador primario en una composicion farmaceutica puede ser de naturaleza o bien acuosa o bien no acuosa. Por ejemplo, un vehiculo o portador adecuado puede ser agua para inyeccion, solucion salina fisiologica liquido cefalorraquideo artificial, posiblemente complementado con otros materiales comunes en composiciones para administracion parenteral. Solucion salina tamponada neutra o solucion salina mezclada con albumina serica son vehiculos a modo de ejemplo adicionales. Otras composiciones farmaceuticas a modo de ejemplo comprenden tampon Tris de aproximadamente pH 7,0-8,5, o tampon acetato de aproximadamente pH 4,0-5,5, que puede incluir ademas sorbitol o un sustituto adecuado para el mismo. En una realizacion de la presente invencion, pueden prepararse composiciones de polipeptido similar a 1L-17 para su almacenamiento mezclando la composicion seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con agentes de formulacion opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, citado anteriormente) en forma de una torta liofilizada o una disolucion acuosa. Ademas, el producto de polipeptido similar a 1L-17 puede formularse como un producto liofilizado usando excipientes apropiados tales como sacarosa.

Las composiciones farmaceuticas de polipeptido similar a 1L-17 pueden seleccionarse para administracion parenteral. Alternativamente, las composiciones pueden seleccionarse para inhalacion o para administracion a traves del tubo digestivo, tal como por via oral. La preparacion de tales composiciones farmaceuticamente aceptables esta dentro del conocimiento de la tecnica.

Los componentes de formulacion estan presentes en concentraciones que son aceptables para el sitio de administracion. Por ejemplo, se usan tampones para mantener la composicion a pH fisiologico o a un pH ligeramente inferior, normalmente dentro de un intervalo de pH de desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8.

Cuando se contempla la administracion parenteral, las composiciones terapeuticas para su uso en esta invencion pueden estar en forma de una disolucion acuosa aceptable por via parenteral, libre de pirogenos que comprende la molecula de polipeptido similar a 1L-17 deseada en un vehiculo farmaceuticamente aceptable. Un vehiculo particularmente adecuado para inyeccion parenteral es agua destilada esteril en la que se formula una molecula de polipeptido similar a 1L-17 como una disolucion isotonica, esteril, apropiadamente conservada. Aun otra preparacion puede implicar la formulacion de la molecula deseada con un agente, tal como microesferas inyectables, particulas bioerosionables, compuestos polimericos (tales como poli(acido lactico) o poli(acido glicolico)), perlas o liposomas, que proporciona la liberacion controlada o sostenida del producto que puede administrarse entonces mediante una inyeccion de deposito. Tambien puede usarse acido hialuronico, y este puede tener el efecto de promover una duracion sostenida en la circulacion. Otros medios adecuados para la introduccion de la molecula deseada incluyen dispositivos de administracion de farmacos implantables.

En una realizacion, puede formularse una composicion farmaceutica para inhalacion. Por ejemplo, puede formularse una molecula de polipeptido similar a 1L-17 como un polvo seco para inhalacion. Tambien pueden formularse disoluciones de inhalacion de polipeptido similar a 1L-17 o molecula de acido nucleico de polipeptido similar a 1L-17 con un propelente para administracion en aerosol. Aun en otra realizacion, pueden nebulizarse disoluciones. Se describe adicionalmente la administracion pulmonar en la solicitud PCT n.D PCT/US94/001875, que describe la administracion pulmonar de proteinas quimicamente modificadas.

Tambien se contempla que determinadas formulaciones puedan administrarse por via oral. En una realizacion de la presente invencion, pueden formularse moleculas de polipeptido similar a 1L-17 que se administran de este modo con o sin los portadores usados habitualmente en la composicion de formas farmaceuticas solidas tales como comprimidos y capsulas. Por ejemplo, puede disefarse una capsula para que libere la parte activa de la formulacion en el punto en el tracto gastrointestinal en el que se maximiza la biodisponibilidad y se minimiza la degradacion presistemica. Pueden incluirse agentes adicionales para facilitar la absorcion de la molecula de polipeptido similar a 1L-17. Tambien pueden emplearse diluyentes, aromatizantes, ceras de bajo punto de fusion, aceites vegetales, lubricantes, agentes de suspension, agentes de disgregacion de comprimidos y aglutinantes.

Otra composicion farmaceutica puede implicar una cantidad eficaz de moleculas de polipeptido similar a 1L-17 en una mezcla con excipientes no toxicos que son adecuados para la fabricacion de comprimidos. 0isolviendo los comprimidos en agua esteril, u otro vehiculo apropiado, pueden prepararse disoluciones en forma de dosis unitaria. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio o bicarbonato, lactosa o fosfato de calcio; o agentes de union, tales como almidon, gelatina o goma arabiga; o agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, acido estearico o talco.

Resultaran evidentes composiciones farmaceuticas de polipeptido similar a 1L-17 adicionales para los expertos en la tecnica, incluyendo formulaciones que implican polipeptidos similares a 1L-17 en formulaciones de administracion sostenida o controlada. Los expertos en la tecnica tambien conocen tecnicas para formular una variedad de otros medios de administracion sostenida o controlada, tales como portadores de liposomas, microparticulas bioerosionables o perlas porosas e inyecciones de deposito. Vease por ejemplo, la solicitud PCT n.D PCT/US93/00829 que describe la liberacion controlada de microparticulas polimericas porosas para la administracion de composiciones farmaceuticas. Los ejemplos adicionales de preparaciones de liberacion sostenida incluyen matrices polimericas semipermeables en forma de articulos conformados, por ejemplo peliculas o microcapsulas. Las matrices de liberacion sostenida pueden incluir poliesteres, hidrogeles, polilactidas (patente estadounidense n.D 3.773.919 y documento EP 058.481), copolimeros de acido L-glutamico y L-glutamato de gamma-etilo (Sidman et al., Biopolymers, 22:547-556 (1983)), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 (1982)), acetato de etilenvinilo (Langer et al., citado anteriormente) o poli(acido 0(-)-3-hidroxibutirico) (documento EP 133.988). Las composiciones de liberacion sostenida pueden incluir tambien liposomas, que pueden prepararse mediante cualquiera de varios metodos conocidos en la tecnica. Vease por ejemplo, Eppstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985); documentos EP 036.676; EP 088.046 y EP 143.949.

La composicion farmaceutica de polipeptido similar a 1L-17 que va a usarse para administracion in vivo normalmente debe ser esteril. Esto puede lograrse mediante filtracion a traves de membranas de filtracion esteriles. Cuando la composicion esta liofilizada, la esterilizacion usando este metodo puede realizarse o bien antes de o bien tras la liofilizacion y reconstitucion. La composicion para administracion parenteral puede almacenarse en forma liofilizada o en una disolucion. Ademas, las composiciones parenterales se colocan generalmente en un recipiente que tiene un orificio de acceso esteril, por ejemplo, un vial o bolsa de disolucion intravenosa que tiene un tapon perforable mediante una aguja de inyeccion hipodermica.

Una vez que se ha formulado la composicion farmaceutica, puede almacenarse en viales esteriles como una disolucion, suspension, gel, emulsion, solido o como un polvo deshidratado o liofilizado. Tales formulaciones pueden almacenarse o bien en una forma lista para usar o bien en una forma (por ejemplo, liofilizada) que requiere reconstitucion antes de su administracion.

En una realizacion especifica, la presente descripcion se refiere a kits para producir una unidad de administracion de dosis individual. Los kits pueden contener cada uno tanto un primer recipiente que tiene una proteina secada como un segundo recipiente que tiene una formulacion acuosa. Tambien se incluyen dentro del alcance de esta invencion kits que contienen jeringas precargadas de una unica y de multiples camaras (por ejemplo, jeringas de liquido y liojeringas).

La cantidad eficaz de una composicion farmaceutica de polipeptido similar a 1L-17 que va a emplearse terapeuticamente dependera, por ejemplo, del contexto terapeutico y los objetivos. Un experto en la tecnica apreciara que los niveles de dosificacion apropiados para el tratamiento variaran por tanto dependiendo, en parte, de la molecula administrada, la indicacion para la que esta usandose la molecula de polipeptido similar a 1L-17, la via de administracion y el tamafo (peso corporal, superficie corporal o tamafo de organo) y estado (la edad y salud general) del paciente. Por consiguiente, el medico puede titular la dosificacion y modificar la via de administracion para obtener el efecto terapeutico optimo. Una dosificacion tipica puede oscilar entre aproximadamente 0,1 !g/kg y hasta aproximadamente 100 mg/kg o mas, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. En otras realizaciones, la dosificacion puede oscilar entre 0,1 !g/kg y hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 1 !g/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg; o 5 !g/kg hasta aproximadamente 100 mg/kg.

La frecuencia de dosificacion dependera de los parametros farmacocineticos de la molecula de polipeptido similar a 1L-17 en la formulacion usada. Normalmente, un medico administrara la composicion hasta que se alcanza una dosificacion que logra el efecto deseado. La composicion puede administrase por tanto como una unica dosis, o como dos o mas dosis (que pueden contener o no la misma cantidad de la molecula deseada) a lo largo del tiempo,

o como una infusion continua mediante un cateter o dispositivo de implante. Los expertos habituales en la tecnica realizan rutinariamente un refinamiento adicional de la dosificacion apropiada y esta dentro del ambito de las tareas realizadas rutinariamente por los mismos. Pueden determinarse dosificaciones apropiadas a traves del uso de datos de respuesta a la dosis apropiados.

La via de administracion de la composicion farmaceutica concuerda con metodos conocidos, por ejemplo, por via oral, a traves de inyeccion mediante las vias intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, intraportal o intralesional; mediante sistemas de liberacion sostenida o mediante dispositivos de implante. Cuando se desee, las composiciones pueden administrarse mediante inyeccion en bolo o de manera continua mediante infusion, o mediante un dispositivo de implante.

Alternativa o adicionalmente, la composicion puede administrarse localmente mediante el implante de una membrana, esponja u otro material apropiado sobre el que se ha absorbido o encapsulado la molecula deseada.

Cuando se usa un dispositivo de implante, el dispositivo puede implantarse en cualquier tejido u organo adecuado, y la administracion de la molecula deseada puede ser mediante difusion, bolo de liberacion temporal o administracion continua.

En algunos casos, puede ser deseable usar composiciones farmaceuticas de polipeptido similar a 1L-17 de una manera ex vivo. En tales casos, las celulas, los tejidos o los organos que se han extraido del paciente se exponen a composiciones farmaceuticas de polipeptido similar a 1L-17 tras lo cual las celulas, los tejidos y/o los organos se implantan posteriormente de nuevo en el paciente.

En otros casos, puede administrarse un polipeptido similar a 1L-17 implantando determinadas celulas que se han modificado por ingenieria genetica, usando metodos tales como los descritos en el presente documento, para expresar y secretar el polipeptido. Tales celulas pueden ser celulas animales o humanas, y pueden ser autologas, heterologas o xenogenicas. Opcionalmente, las celulas pueden inmortalizarse. Con el fin de disminuir la posibilidad de una respuesta inmunologica, las celulas pueden encapsularse para evitar la infiltracion de tejidos circundantes. Los materiales de encapsulacion son normalmente membranas o envolturas polimericas semipermeables, biocompatibles que permiten la liberacion del/de los producto(s) proteico(s) pero impiden la destruccion de las celulas por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.

Realizaciones adicionales de la presente descripcion se refieren a celulas y metodos (por ejemplo, recombinacion homologa y/u otros metodos de produccion recombinante) para tanto la produccion in vitro de polipeptidos terapeuticos como para la produccion y administracion de polipeptidos terapeuticos mediante terapia genica o terapia celular. Pueden usarse recombinacion homologa y otros metodos de recombinacion para modificar una celula que contiene un gen de polipeptido similar a 1L-17 silencioso transcripcionalmente, o un gen subexpresado, y de ese modo producir una celula que expresa cantidades terapeuticamente eficaces de polipeptidos similares a 1L

17.

La recombinacion homologa es una tecnica originalmente desarrollada para seleccionar como diana genes para inducir o corregir mutaciones en genes activos transcripcionalmente (Kucherlapati, Prog. in Nucl. Acid Res. & Mol. Biol., 36:301 (1989)). La tecnica basica se desarrollo como un metodo para introducir mutaciones especificas en regiones especificas del genoma de mamiferos (Thomas et al., Cell, 44:419-428 (1986); Thomas y Capecchi, Cell, 51:503-512 (1987); 0oetschman et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85:8583-8587 (1988)) o para corregir mutaciones especificas dentro de genes defectuosos (0oetschman et al., Nature, 330:576-578 (1987)). Se describen tecnicas de recombinacion homologa a modo de ejemplo en la patente estadounidense n.D 5.272.071 (documento EP 9193051, publicacion EP n.D 505500 y documento PCT/US90/07642, publicacion internacional n.D (O 91/09955).

A traves de recombinacion homologa, la secuencia de A0N que va a insertarse en el genoma puede dirigirse a una region especifica del gen de interes uniendola a A0N de direccionamiento. El A0N de direccionamiento es una secuencia de nucleotidos que es complementaria (homologa) a una region del A0N genomico. Se ponen en contacto pequefos trozos de A0N de direccionamiento que son complementarios a una region especifica del genoma con la hebra original durante el proceso de replicacion del A0N. Es una propiedad general del A0N que se ha insertado en una celula que se hibride y, por tanto, se recombine con otros trozos de A0N endogeno a traves de regiones homologas compartidas. Si esta hebra complementaria se une a un oligonucleotido que contiene una mutacion o una secuencia diferente o un nucleotido adicional, se incorpora tambien en la hebra recien sintetizada como resultado de la recombinacion. Como resultado de la funcion de correccion de lectura, es posible que la nueva secuencia de A0N sirva como molde. Por tanto, el A0N transferido se incorpora en el genoma.

Unidas a estos trozos de A0N de direccionamiento hay regiones de A0N que pueden interaccionar con o controlar la expresion de un polipeptido similar a 1L-17, por ejemplo, secuencias flanqueantes. Por ejemplo, se inserta un elemento promotor/potenciador, un supresor o un elemento modulador de la transcripcion exogeno en el genoma de la celula huesped prevista en proximidad y orientacion suficientes para influir en la transcripcion de A0N que codifica para el polipeptido similar a 1L-17 deseado. El elemento de control controla una parte del A0N presente en el genoma de la celula huesped. Por tanto, puede lograrse la expresion del polipeptido similar a 1L-17 deseado no mediante transfeccion de A0N que codifica para el propio gen de polipeptido similar a 1L-17, sino mas bien mediante el uso de A0N de direccionamiento (que contiene regiones de homologia con el gen endogeno de interes), acoplado con segmentos reguladores de A0N que proporcionan a la secuencia genica endogena sefales reconocibles para la transcripcion de un gen de polipeptido similar a 1L-17.

En un metodo a modo de ejemplo, la expresion de un gen seleccionado como diana deseado en una celula (es decir, un gen celular endogeno deseado) se altera mediante recombinacion homologa en el genoma celular en un sitio preseleccionado mediante la introduccion de A0N que incluye al menos una secuencia reguladora, un exon y un sitio donador de corte y empalme. Estos componentes se introducen en el A0N cromosomico (genomico) de una manera tal que esto, en efecto, da como resultado la produccion de una nueva unidad de transcripcion (en la que la secuencia reguladora, el exon y el sitio donador de corte y empalme presentes en el constructo de A0N estan operativamente unidos al gen endogeno). Como resultado de la introduccion de estos componentes en el A0N cromosomico, se altera la expresion del gen endogeno deseado.

La expresion genica alterada, tal como se describe en el presente documento, abarca activar (o hacer que se exprese) un gen que normalmente es silencioso (no se expresa) en la celula tal como se obtiene, asi como aumentar la expresion de un gen que no se expresa a niveles fisiologicamente significativos en la celula tal como se obtiene. Las realizaciones abarcan ademas cambiar el patron de regulacion o induccion de manera que sea diferente del patron de regulacion o induccion que se produce en la celula tal como se obtiene, y reducir (incluyendo eliminar) la expresion de un gen que se expresa en la celula tal como se obtiene.

Un metodo mediante el que puede usarse recombinacion homologa para aumentar, o provocar, la produccion de polipeptido similar a 1L-17 a partir del gen de polipeptido de similar 1L-17 endogeno de una celula implica usar en primer lugar recombinacion homologa para colocar una secuencia de recombinacion a partir de un sistema de recombinacion especifico de sitio (por ejemplo, Cre/loxP, FLP/FRT) (vease, Sauer, Current Opinion 1n Biotechnology, 5:521-527 (1994) y Sauer, Methods 1n Enzymology, 225:890-900 (1993)) en el sentido de 5' de (es decir, en 5' con respecto a) la region que codifica para polipeptido similar a 1L-17 genomica endogena. Se introdujo un plasmido que contenia un sitio de recombinacion homologo para el sitio que se coloco justo en el sentido de 5' de la region que codifica para polipeptido similar a 1L-17 genomica en la linea celular modificada junto con la enzima recombinasa apropiada. Esta enzima recombinasa hace que el plasmido se integre, mediante el sitio de recombinacion del plasmido, en el sitio de recombinacion ubicado justo en el sentido de 5' de la region que codifica para polipeptido similar a 1L-17 genomica en la linea celular (Baubonis y Sauer, Nucleic Acids Res., 21:2025-2029, 1993 y O'Gorman et al., Science, 251:1351-1355 (1991)). Cualquier secuencia flanqueante que se sepa que aumenta la transcripcion (por ejemplo, potenciador/promotor, intron o potenciador de la traduccion), si se situa apropiadamente en este plasmido, se integraria de una manera tal que se crea una unidad transcripcional nueva o modificada, dando como resultado una produccion de polipeptido similar a 1L-17 de novo o aumentada a partir del gen de polipeptido similar a 1L-17 endogeno de la celula.

Un metodo adicional para usar la linea celular en la que se ha colocado la secuencia de recombinacion especifica de sitio justo en el sentido de 5' de la region que codifica para polipeptido similar a 1L-17 genomica endogena es usar recombinacion homologa para introducir un segundo sitio de recombinacion en otra parte en el genoma de la linea celular. Entonces se introduce la enzima recombinasa apropiada en la linea celular con dos sitios de recombinacion, provocando un acontecimiento de recombinacion (delecion, inversion o translocacion) (Sauer, Current Opinion 1n Biotechnology, citado anteriormente (1994) y Sauer, Methods in Enzymology, citado anteriormente, (1993)) que crearia una unidad transcripcional nueva o modificada dando como resultado una produccion de polipeptido similar a 1L-17 de novo o aumentada a partir del gen de polipeptido similar a 1L-17 endogeno de la celula.

Un enfoque adicional para aumentar, o provocar, la expresion de polipeptido similar a 1L-17 a partir del gen de polipeptido similar a 1L-17 endogeno de una celula implica aumentar, o provocar, la expresion de un gen o genes (por ejemplo, factores de transcripcion) y/o disminuir la expresion de un gen o genes (por ejemplo, represores transcripcionales) de una manera que da como resultado la produccion de polipeptido similar a 1L-17 de novo o aumentada a partir del gen de polipeptido similar a 1L-17 endogeno de la celula. Este metodo incluye la introduccion de un polipeptido que no se produce de manera natural (por ejemplo, un polipeptido que comprende un dominio de union a A0N especifico de sitio fusionado a un dominio de factor transcripcional) en la celula de manera que resulta una produccion polipeptido similar a 1L-17 de novo o aumentada a partir del gen de polipeptido similar a 1L-17 endogeno de la celula.

La presente descripcion se refiere ademas a constructos de A0N utiles en el metodo de alteracion de la expresion de un gen diana. En determinadas realizaciones, los constructos de A0N a modo de ejemplo comprenden: (a) una o mas secuencias de direccionamiento; (b) una secuencia reguladora; (c) un exon y (d) un sitio donador de corte y empalme desapareado. La secuencia de direccionamiento en el constructo de A0N dirige la integracion de los elementos (a) -(d) en un gen diana en una celula de manera que los elementos (b) -(d) se unen operativamente a secuencias del gen diana endogeno. En otra realizacion, los constructos de A0N comprenden: (a) una o mas secuencias de direccionamiento, (b) una secuencia reguladora, (c) un exon, (d) un sitio donador de corte y empalme,

(e) un intron y (f) un sitio aceptor de corte y empalme, dirigiendo la secuencia de direccionamiento la integracion de los elementos (a) -(f) de manera que los elementos de (b) - (f) se unen operativamente al gen endogeno. La secuencia de direccionamiento es homologa para el sitio preseleccionado en el A0N cromosomico celular con el que va a producirse la recombinacion homologa. En el constructo, el exon esta generalmente en 3' de la secuencia reguladora y el sitio donador de corte y empalme esta en 3' del exon.

Si se conoce la secuencia de un gen particular, tal como la secuencia de acido nucleico de polipeptido similar a 1L-17 presentada en el presente documento, puede sintetizarse un trozo de A0N que es complementario a una region seleccionada del gen u obtenerse de otra forma, tal como mediante restriccion apropiada del A0N nativo en sitios de reconocimiento especificos que delimitan la region de interes. Este trozo sirve como secuencia(s) de direccionamiento tras su insercion en la celula y se hibridara con su region homologa dentro del genoma. Si esta hibridacion se produce durante la replicacion del A0N, este trozo de A0N, y cualquier secuencia adicional unida al mismo, actuara como fragmento de Okazaki y se incorporara en la hebra de A0N hija recien sintetizada. La presente descripcion, por tanto, incluye nucleotidos que codifican para un polipeptido similar a 1L-17, nucleotidos que pueden usarse como secuencias de direccionamiento.

Tambien se contempla terapia celular de polipeptido similar a 1L-17, por ejemplo, la implantacion de celulas que producen polipeptidos similares a 1L-17. Esta realizacion implica implantar celulas que pueden sintetizar y secretar una forma biologicamente activa de polipeptido similar a 1L-17. Tales celulas que producen polipeptido similar a 1L-17 pueden ser celulas que son productores naturales de polipeptidos similares a 1L-17 o pueden ser celulas recombinantes cuya capacidad para producir polipeptidos similares a 1L-17 se ha aumentado mediante transformacion con un gen que codifica para el polipeptido similar a 1L-17 deseado o con un gen que aumenta la expresion de polipeptido similar a 1L-17. Puede lograrse una modificacion de este tipo por medio de un vector adecuado para suministrar el gen asi como promover su expresion y secrecion. Con el fin de minimizar una posible reaccion inmunologica en pacientes a los que se les esta administrando un polipeptido similar a 1L-17, tal como puede producirse con la administracion de un polipeptido de una especie foranea, se prefiere que las celulas naturales que producen polipeptido similar a 1L-17 sean de origen humano y produzcan polipeptido similar a 1L-17 humana. Asimismo, se prefiere que las celulas recombinantes que producen polipeptido similar a 1L-17 esten transformadas con un vector de expresion que contiene un gen que codifica para un polipeptido similar a 1L-17 humana.

Pueden encapsularse las celulas implantadas para evitar la infiltracion del tejido circundante. Pueden implantarse celulas animales humanas o no humanas en pacientes en membranas o envolturas semipermeables, biocompatibles que permiten la liberacion de polipeptido similar a 1L-17 pero que impiden la destruccion de las celulas por el sistema inmunitario del paciente o por otros factores perjudiciales del tejido circundante. Alternativamente, las propias celulas del paciente, transformadas para producir polipeptidos similares a 1L-17 ex vivo, pueden implantarse directamente en el paciente sin tal encapsulacion.

En la tecnica se conocen tecnicas para la encapsulacion de celulas vivas, y puede lograrse rutinariamente la preparacion de las celulas encapsuladas y su implantacion en pacientes. Por ejemplo, Baetge et al. (documentos (O 95/05452 y PCT/US94/09299) describen capsulas de membrana que contienen celulas modificadas por ingenieria genetica para la administracion eficaz de moleculas biologicamente activas. Las capsulas son biocompatibles y pueden recuperarse facilmente. Las capsulas encapsulan celulas transfectadas con moleculas de A0N recombinante que comprenden secuencias de A0N que codifican para moleculas biologicamente activas operativamente unidas a promotores que no se someten a regulacion por disminucion in vivo tras su implantacion en un huesped mamifero. Los dispositivos proporcionan la administracion de las moleculas a partir de celulas vivas a sitios especificos dentro de un receptor. Ademas, veanse las patentes estadounidenses n.os 4.892.538, 5.011.472 y

5.106.627. Se describe un sistema para la encapsulacion de celulas vivas en la solicitud PCT n.D PCT/US91/00157 de Aebischer et al. Veanse tambien la solicitud PCT n.D PCT/US91/00155 de Aebischer et al.; (inn et al., Exper. Neurol., 113:322-329 (1991), Aebischer et al., Exper. Neurol., 111:269-275 (1991); y Tresco et al., ASA1O, 38:17-23 (1992).

Tambien se preve el suministro de terapia genica in vivo e in vitro de polipeptidos similares a 1L-17. Un ejemplo de una tecnica de terapia genica es usar el gen de polipeptido similar a 1L-17 (o bien A0N genomico, A0Nc y/o bien A0N sintetico) que codifica para un polipeptido similar a 1L-17 que puede estar operativamente unido a un promotor constitutivo o inducible para formar un quot;constructo de A0N de terapia genicaquot;. El promotor puede ser homologo o heterologo para el gen de polipeptido similar a 1L-17 endogeno, siempre que sea activo en la celula o tipo de celula en el que se insertara el constructo. Otros componentes del constructo de A0N de terapia genica pueden incluir opcionalmente moleculas de A0N disefadas para integracion especifica de sitio (por ejemplo, secuencias endogenas utiles para recombinacion homologa); promotor, potenciador(es) o silenciador(es) especifico(s) de tejido; moleculas de A0N que pueden proporcionar una ventaja selectiva con respecto a la celula antecesora; moleculas de A0N utiles como marcadores para identificar celulas transformadas; sistemas de seleccion negativa; agentes de union especificos de celula (como, por ejemplo, para direccionamiento celular); factores de internalizacion especificos de celula; y factores de transcripcion para potenciar la expresion por un vector, asi como factores para permitir la fabricacion del vector.

Entonces, puede introducirse un constructo de A0N de terapia genica en celulas (o bien ex vivo o bien in vivo) usando vectores virales o no virales. Un medio para introducir el constructo de A0N de terapia genica es por medio de vectores virales tal como se describe en el presente documento. 0eterminados vectores, tales como vectores retrovirales, suministraran el constructo de A0N al A0N cromosomico de las celulas, y el gen puede integrarse en el A0N cromosomico. Otros vectores funcionaran como episomas, y el constructo de A0N de terapia genica permanecera en el citoplasma.

Aun en otras realizaciones, pueden incluirse elementos reguladores para la expresion controlada del gen de polipeptido similar a 1L-17 en la celula diana. Tales elementos se activan en respuesta a un efector apropiado. 0e este modo, puede expresarse un polipeptido terapeutico cuando se desee. Un medio de control convencional implica el uso de dimerizadores o rapalogos de molecula pequefa (tal como se describe en los documentos (O 9641865 (documento PCT/US96/099486); (O 9731898 (documento PCT/US97/03137) y (O 9731899 (documento PCT/US95/03157)) usados para dimerizar proteinas quimericas que contienen un dominio de union de molecula pequefa y un dominio que puede iniciar un proceso biologico, tales como una proteina de union a A0N o una proteina de activacion transcripcional. La dimerizacion de las proteinas puede usarse para iniciar la transcripcion del transgen.

Una tecnologia de regulacion alternativa usa un metodo de almacenamiento de proteinas expresadas a partir del gen de interes dentro de la celula como un agregado o una agrupacion. El gen de interes se expresa como una proteina de fusion que incluye un dominio de agregacion condicional que da como resultado la retencion de la proteina agregada en el reticulo endoplasmatico. Las proteinas almacenadas son estables e inactivas dentro de la celula. Sin embargo, las proteinas pueden liberarse administrando un farmaco (por ejemplo, ligando de molecula pequefa) que elimina el dominio de agregacion condicional y de ese modo separa especificamente los agregados o las agrupaciones de modo que las proteinas pueden secretarse de la celula. Vease Science 287:816-817 y 826-830 (2000).

Otros interruptores genicos o medios de control adecuados incluyen, pero no se limitan a, los siguientes sistemas. Se usa mifepristona (RU486) como antagonista de progesterona. La union de un dominio de union a ligando del receptor de progesterona al antagonista de progesterona activa la transcripcion formando un dimero de dos factores de transcripcion que entonces pasan al nucleo para unirse al A0N. El dominio de union a ligando se modifica para eliminar la capacidad del receptor para unirse al ligando natural. El sistema de receptor de hormona esteroide se describe adicionalmente en los documentos U.S. 5.364.91; (O 9640911 y (O 9710337.

Aun otro sistema de control usa ecdisona (una hormona esteroide de la mosca de la fruta) que se une a y activa un receptor de ecdisona (receptor citoplasmatico). El receptor se transloca entonces al nucleo uniendose a un elemento de respuesta de A0N especifico (promotor del gen sensible a ecdisona). El receptor de ecdisona incluye un dominio de transactivacion/dominio de union a A0N/dominio de union a ligando para iniciar la transcripcion. El sistema de ecdisona se describe adicionalmente en los documentos U.S. 5.514.578; (O 9738117; (O 9637609 y (O9303162.

Otro medio de control usa un transactivador controlable por tetraciclina positivo. Este sistema implica un dominio de union a A0N de proteina represora tet (cambios de aminoacidos R-4 de tet mutados que dan como resultado una proteina transactivadora regulada por tetraciclina inversa, es decir, se une a un operador tet en presencia de tetraciclina) unido a un polipeptido que activa la transcripcion. Tales sistemas se describen en las patentes estadounidenses n.os 5.464.758; 5.650.298 y 5.654.168.

Se describen constructos de acido nucleico y sistemas de control de la expresion adicionales en las patentes estadounidenses n.os 5.741.679 y 5.834.186, concedidas a 1nnovir Laboratories 1nc.

Puede lograrse la terapia genica in vivo introduciendo el gen que codifica para un polipeptido similar a 1L-17 en celulas mediante inyeccion local de una molecula de acido nucleico de polipeptido similar a 1L-17 o mediante otros vectores de suministro virales o no virales apropiados (Hefti, Neurobiology, 25:1418-1435 (1994)). Por ejemplo, puede contenerse una molecula de acido nucleico que codifica para un polipeptido similar a 1L-17 en un vector de virus adenoasociado (VAA) para su suministro a las celulas seleccionadas como diana (por ejemplo, Johnson, publicacion internacional n.D (O 95/34670 y solicitud internacional n.D PCT/US95/07178). El genoma de VAA recombinante contiene normalmente repeticiones terminales invertidas de VAA que flanquean una secuencia de A0N que codifica para un polipeptido similar a 1L-17 operativamente unido a secuencias de poliadenilacion y promotoras funcionales.

Los vectores virales adecuados alternativos incluyen, pero no se limitan a, vectores de retrovirus, adenovirus, virus del herpes simple, lentivirus, virus de la hepatitis, parvovirus, papovavirus, virus de la viruela, alfavirus, coronavirus, rabdovirus, paramixovirus y virus del papiloma. La patente estadounidense n.D 5.672.344 describe un sistema de transferencia genica mediada por virus in vivo que implica un vector de VHS-1 neurotrofico recombinante. La patente estadounidense n.D 5.399.346 proporciona ejemplos de un procedimiento para proporcionar a un paciente una proteina terapeutica mediante la administracion de celulas humanas que se han tratado in vitro para insertar un segmento de A0N que codifica para una proteina terapeutica. Se describen materiales y metodos adicionales para la puesta en practica de tecnicas de terapia genica en la patente estadounidense n.D 5.631.236 que implica vectores adenovirales; la patente estadounidense n.D 5.672.510 que implica vectores retrovirales; y el documento U.S.

5.635.399 que implica vectores retrovirales que expresan citocinas.

Los metodos de suministro no virales incluyen, pero no se limitan a, transferencia mediada por liposomas, suministro de A0N desnudo (inyeccion directa), transferencia mediada por receptor (complejo de ligando-A0N), electroporacion, precipitacion con fosfato de calcio y bombardeo con microparticulas (por ejemplo, pistola genica). Los materiales y metodos de terapia genica tambien pueden incluir el uso de promotores inducibles, promotorespotenciadores especificos de tejido, secuencias de A0N disefadas para integracion especifica de sitio, secuencias de A0N que pueden proporcionar una ventaja selectiva con respecto a la celula antecesora, marcadores para identificar celulas transformadas, sistemas de seleccion negativa y sistemas de control de la expresion (medidas de seguridad), agentes de union especificos de celula (para seleccionar como diana celulas), factores de internalizacion especificos de celula y factores de transcripcion para potenciar la expresion por un vector asi como metodos de fabricacion del vector. Tales materiales y metodos adicionales para la puesta en practica de tecnicas de terapia genica se describen en la patente estadounidense n.D 4.970.154 que implica tecnicas de electroporacion; el documento (O96/40958 que implica ligandos nucleares; la patente estadounidense n.D 5.679.559 que describe un sistema que contiene lipoproteinas para el suministro de genes; la patente estadounidense n.D 5.676.954 que implica portadores de liposomas; la patente estadounidense n.D 5.593.875 referente a metodos para la transfeccion mediante fosfato de calcio; y la patente estadounidense n.D 4.945.050 en la que se propulsan particulas biologicamente activas a celulas a una velocidad mediante la cual las particulas penetran en la superficie de las celulas y se incorporan en el interior de las celulas.

Tambien se contempla que la terapia celular o terapia genica de polipeptido similar a 1L-17 pueda incluir ademas el suministro de uno o mas polipeptidos adicionales en la(s) misma(s) o diferente(s) celula(s). Tales celulas pueden introducirse por separado en el paciente, o las celulas pueden contenerse en un unico dispositivo implantable, tal como la membrana de encapsulacion descrita anteriormente, o las celulas pueden modificarse por separado por medio de vectores virales.

Un medio para aumentar la expresion de un polipeptido similar a 1L-17 endogeno en una celula mediante terapia genica es insertar uno o mas elementos potenciadores en el promotor del polipeptido similar a 1L-17, en el que el/los elemento(s) potenciador(es) puede(n) servir para aumentar la actividad transcripcional del gen de polipeptido similar a 1L-17. El/los elemento(s) potenciador(es) usado(s) se seleccionara(n) basandose en el tejido en el que se desea activar el/los gen(es); se seleccionara(n) elemento(s) potenciador(es) que se sabe que confieren activacion del promotor en ese tejido. Por ejemplo, si un gen que codifica para un polipeptido similar a 1L-17 va a quot;activarsequot; en celulas T, puede usarse el elemento potenciador del promotor lck. En este caso, la parte funcional del elemento transcripcional que va a afadirse puede insertarse en un fragmento de A0N que contiene el promotor del polipeptido similar a 1L-17 (y opcionalmente, insertarse en un vector y/o secuencia(s) flanqueante(s) en 5' y/o 3', etc.) usando tecnicas de clonacion convencionales. Este constructo, conocido como quot;constructo de recombinacion homologaquot;, puede introducirse entonces en las celulas deseadas o bien ex vivo o bien in vivo.

Tambien puede usarse terapia genica para disminuir la expresion del polipeptido similar a 1L-17 modificando la secuencia de nucleotidos del/de los promotor(es) endogeno(s). Tal modificacion se logra normalmente mediante metodos de recombinacion homologa. Por ejemplo, puede modificarse por ingenieria genetica una molecula de A0N que contiene todo o una parte del promotor del/de los gen(es) de polipeptido similar a 1L-17 seleccionado para su inactivacion para eliminar y/o reemplazar trozos del promotor que regulan la transcripcion. Por ejemplo, puede delecionarse la caja TATA y/o el sitio de union de un activador transcripcional del promotor usando tecnicas de biologia molecular convencionales; tal delecion puede inhibir la actividad del promotor reprimiendo de ese modo la transcripcion del correspondiente gen de polipeptido similar a 1L-17. La delecion de la caja TATA o el sitio de union de un activador de la transcripcion en el promotor puede lograrse generando un constructo de A0N que comprende todo o la parte relevante del/de los promotor(es) de polipeptido similar a 1L-17 (de la misma especie o una especie relacionada que el/los gen(es) de polipeptido similar a 1L-17 que va(n) a regularse) en el que uno o mas de la caja TATA y/o los nucleotidos del sitio de union de un activador transcripcional se mutan mediante sustitucion, delecion y/o insercion de uno o mas nucleotidos. Como resultado, la caja TATA y/o el sitio de union del activador tienen una actividad disminuida o se vuelven completamente inactivos. El constructo contendra normalmente al menos aproximadamente 500 bases de A0N que corresponden a las secuencias de A0N en 5' y 3' nativo (endogeno) adyacentes al segmento de promotor que se ha modificado. El constructo puede introducirse en las celulas apropiadas (o bien ex vivo o bien in vivo) o bien directamente o bien mediante un vector viral tal como se describe en el presente documento. Normalmente, la integracion del constructo en el A0N genomico de las celulas sera mediante recombinacion homologa, en la que las secuencias de A0N en 5' y 3' en el constructo de promotor pueden servir para ayudar a integrar la region promotora modificada mediante hibridacion con el A0N cromosomico endogeno.

Usos adicionales de polipeptidos y acidos nucleicos de polipeptido similar a 1L-17

Pueden usarse moleculas de acido nucleico tal como se da a conocer en el presente documento (incluyendo las que no codifican por si mismas para polipeptidos biologicamente activos) para mapear las ubicaciones del gen de polipeptido similar a 1L-17 y genes relacionados en cromosomas. El mapeo puede realizarse mediante tecnicas conocidas en la tecnica, tales como amplificacion por PCR e hibridacion in situ.

Moleculas de acido nucleico de polipeptido similar a 1L-17 (incluyendo las que no codifican por si mismas para polipeptidos biologicamente activos), pueden ser utiles como sondas de hibridacion en ensayos de diagnostico para someter a prueba, o bien cualitativamente o bien cuantitativamente, la presencia de un A0N de polipeptido similar a 1L-17 o ARN correspondiente en muestras de fluido corporal o tejido de mamifero.

Los polipeptidos similares a 1L-17 pueden usarse (simultanea o secuencialmente) en combinacion con una o mas citocinas, factores de crecimiento, antibioticos, antiinflamatorios y/o agentes quimioterapicos segun sea apropiado para la indicacion que este tratandose.

Pueden emplearse tambien otros metodos cuando es deseable inhibir la actividad de uno o mas polipeptidos similares a 1L-17. Tal inhibicion puede efectuarse mediante moleculas de acido nucleico que son complementarias a y que se hibridan con secuencias de control de la expresion (formacion de triple helice) o con ARNm de polipeptido similar a 1L-17. Por ejemplo, pueden introducirse en la celula moleculas de ARN o A0N antisentido, que tienen una secuencia que es complementaria a al menos una parte del/de los gen(es) de polipeptido similar a 1L-17 seleccionado(s). Pueden disefarse sondas antisentido mediante tecnicas disponibles usando la secuencia del polipeptido similar a 1L-17 dada a conocer en el presente documento. Normalmente, cada molecula antisentido de ese tipo sera complementaria al sitio de iniciacion (extremo 5') de cada gen de polipeptido similar a 1L-17 seleccionado. Cuando la molecula antisentido se hibrida entonces con el correspondiente ARNm de polipeptido similar a 1L-17, se impide o se reduce la traduccion de este ARNm. Los inhibidores antisentido proporcionan informacion referente a la disminucion o ausencia de un polipeptido similar a 1L-17 en una celula u organismo.

Alternativamente, puede emplearse terapia genica para crear un inhibidor dominante-negativo de uno o mas polipeptidos similares a 1L-17. En esta situacion, puede prepararse el A0N que codifica para un polipeptido mutante de cada polipeptido similar a 1L-17 seleccionado e introducirse en las celulas de un paciente usando metodos o bien virales o bien no virales tal como se describe en el presente documento. Cada mutante de este tipo se disefa normalmente para competir con el polipeptido endogeno en su papel biologico.

Ademas, puede usarse un polipeptido similar a 1L-17, ya sea biologicamente activo o no, como inmunogeno, es decir, el polipeptido contiene al menos un epitopo frente al que pueden generarse anticuerpos. Pueden usarse agentes de union selectiva que se unen a un polipeptido similar a 1L-17 (tal como se describe en el presente documento) para fines de diagnostico in vivo e in vitro, incluyendo pero sin limitarse a, su uso en forma marcada para detectar la presencia de polipeptido similar a 1L-17 en una muestra de celulas o fluido corporal. Los anticuerpos pueden usarse tambien para prevenir, tratar o diagnosticar varias enfermedades y trastornos, incluyendo los mencionados en el presente documento. Los anticuerpos pueden unirse a un polipeptido similar a 1L-17 para disminuir o bloquear al menos una actividad caracteristica de un polipeptido similar a 1L-17, o pueden unirse a un polipeptido para aumentar al menos una actividad caracteristica de un polipeptido similar a 1L-17 (incluyendo mediante el aumento de la farmacocinetica del polipeptido similar a 1L-17).

Los siguientes ejemplos son para fines de ilustracion.

EJEMPLO 1

Clonacion de 1L17E humano

Se realizo una busqueda del perfil de la familia de 1L-8 de la base de datos dbEST de Amgen y Genbank, dando como resultado la identificacion del EST de raton, zmgb-ai430337. (Smith et al. (1994), Cell, 76: 959-62; Luethy et al. (1994), Protein Science, 3: 139-46). La homologia global entre la secuencia de aminoacidos pronosticada de zmgbai430337 y la 1L-8 humana era baja; sin embargo, la conservacion de cisteinas y otros residuos clave sugeria que zmgb-ai430337 era un miembro novedoso de la familia de 1L-17. Se obtuvo el clon correspondiente a la secuencia EST de raton del N1H 1.M.A.G.E. Consortium through Research Genetics (una compafia de 1nvitrogen; Huntsville, AL) y se secuencio completamente. Una busqueda BLAST revelo que la secuencia EST de raton correspondia a regiones de la secuencia del clon BAC de GenBank CNS0000B, que es una secuencia de A0N genomico derivada del cromosoma humano 14. Busquedas BLAST adicionales tambien revelaron coincidencias con secuencias genomicas humanas de Celera. La similitud con las secuencias tanto de GenBank como de Celera sugeria que era un homologo humano para el miembro de la familia de 1L-17 de raton novedoso identificado.

Se disefaron dos cebadores de PCR basados en la secuencia genomica humana para examinar diversas bibliotecas de A0Nc (Clontech) para detectar el A0Nc relacionado con 1L-17. El cebador directo, designado 2392-73 tiene la secuencia AGA GTC CTG TAG GGC CAG TGA AGA TGG (SEQ 10 NO: 15). El cebador inverso, designado 2374-88, tiene la secuencia TAC AGC CTG CGC TCC AGG CAG TAG CC (SEQ 10 NO: 16). Este examen indico que los testiculos humanos eran la fuente mas abundante entre las muestras de A0Nc examinadas.

Con el fin de obtener un clon de A0Nc humano de longitud completa, se obtuvo la biblioteca de A0Nc de testiculos humanos Rapid Screen (LTS-1001) de Origene Technologies 1nc. (Rockville, M0). La biblioteca de A0Nc de Origene estaba en el vector pCMV6-XL4. Se usaron condiciones de PCR convencionales para todo el examen de la biblioteca de A0Nc. Segun las especificaciones del producto de Origene, la biblioteca contenia 500.000 clones alineados en una placa primaria de 96 pocillos. Cada pocillo de la placa primaria contenia por tanto aproximadamente 5.000 clones. El pocillo 3B de la placa primaria era positivo. Se adquirio la subplaca secundaria correspondiente al pocillo positivo 3B en la placa primaria de Origene. El examen posterior demostro que el numero de pocillo 55 en la subplaca secundaria 3B era positivo.

La subplaca secundaria de Origene contenia disoluciones madre en glicerol de E. coli amplificada a partir de 50 clones originales. Se sembraron en placa diluciones en serie del numero de pocillo positivo 55 a densidades de 1:10,

1:100 y 1:1.000 en placas LB Amp. Se recogieron individualmente colonias (96) de las placas LB Amp y se usaron para el examen por PCR con los cebadores 2392-73 y 2374-88 (descritos anteriormente). Se identificaron cuatro colonias positivas usando este procedimiento. Se designaron las colonias positivas como clon 70, 78, 85 y 89. Se prepararon los A0N de plasmido correspondientes a estas colonias y se secuenciaron usando una combinacion de cebadores de vector y cebadores especificos de gen. Se secuencio completamente el clon 89 y se secuenciaron los otros clones en los extremos y en la secuencia codificante. Los datos revelaron que los cuatro clones tenian secuencias codificantes identicas.

El A0Nc de polipeptido similar a 1L-17 humana (clon Origene-89) tiene 3987 pb de longitud y se expone como SEQ 10 NO: 1. Este A0Nc codifica para un marco de lectura abierto de 161 aminoacidos con un peptido sefal pronosticado de 16 aminoacidos y una proteina madura pronosticada de 145 aminoacidos (SEQ 10 NO: 2). Una busqueda FASTA de la base de datos SwissProt con la secuencia de proteina de polipeptido similar a 1L-17 pronosticada indico que SEQ 10 NO: 2 presentaba un 25,0% de identidad dentro de un solapamiento de 160 aminoacidos con 1L-17, un 36,7% de identidad dentro de un solapamiento de 90 aminoacidos con 1L-20, un 35,6% de identidad dentro de un solapamiento de 90 aminoacidos con 1L-17B y un 34,5% de identidad dentro de un solapamiento de 171 aminoacidos con 1L-17C. 0e manera similar a otros miembros de la familia de 1L-17, se pronostica que el polipeptido similar a 1L-17 humana novedoso (tambien denominado 1L-17E en el presente documento) es una proteina secretada y se pronostica que es una citocina.

EJEMPLO 2

Ratones transgenicos que sobreexpresan polinucleotidos de polipeptido similar a 1L-17

A. Preparacion del transgen.

Se ligo la region codificante de A0Nc de polipeptido similar a 1L-17 humana (SEQ 10 NO: 1) con una secuencia de Kozak alterada, CCACC, inmediatamente en el sentido de 5' del ATG iniciador, en un vector de expresion especifico de higado. El vector de expresion consistia en un fragmento de A0N de 774 pb que contenia la region de control de hepatocitos (HCR) de la region intergenica C-l/C-1' de apolipoproteina humana (apo) en el cromosoma 19 (Simonet et al., J. Biol. Chem., 268:8221-8229, 1993). El vector tambien contenia un trozo de A0N continuo de 1450 pb que consistia en la secuencia flanqueante en 5' del gen de apoE humana, el primer exon, el primer intron y una parte del segundo exon del gen de apoE (Simonet et al., J. Clin. 1nvest., 94:1310-1319, 1994). Se ubico una sefal de poliadenilacion de SV40 en el sentido de 3' de los sitios de insercion de A0Nc. Se verifico la integridad del A0Nc mediante secuenciacion usando metodos convencionales conocidos en la tecnica.

B. Preparacion y analisis de ratones transgenicos.

Se purifico el plasmido resultante (indicado en el presente documento como ApoE-h1L-17) y se aislo el inserto transgenico para la microinyeccion. Se inyectaron embriones de una unica celula de ratones con cruzamiento B0F1 x B0F1 esencialmente tal como se describe en Brinster et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4438-4442, 1985). Se cultivaron los embriones durante la noche en un incubador a 37DC y un 5% de CO2. Posteriormente, se transfirieron de 15 a 20 embriones de 2 celulas a los oviductos de trece ratones hembra C01 pseudoprefadas. Se identificaron las crias transgenicas mediante examen por PCR con cebadores que amplifican un fragmento de 368 pb del primer intron de apoE humana a partir de A0N preparado a partir de biopsias de oreja tal como se describe en Simonet et al. (J. Clin. 1nvest., 94:1310-1319, 1994).

EJEMPLO 3

Analisis mediante necropsia de los ratones transgenicos.

A las 8-10 semanas de edad, se sometieron a necropsia 10 ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 y cinco compaferos de camada no transgenicos. Se congelaron inmediatamente muestras de higado de los ratones en nitrogeno liquido en el momento de la necropsia. Se aislaron los ARN de cada muestra usando el kit de ARN Perfect (Eppendorf) segun las instrucciones del fabricante y se analizaron mediante analisis de transferencia de tipo Northern.

Se genero la transferencia de tipo Northern procesando 10 !g de ARN diluido en colorante de carga de ARN 1x (Sigma) en un gel de formaldehido-agarosa al 1%. Se desnaturalizo el gel en NaOH 50 mM y NaCl 150 y 55 mM. Posteriormente, se neutralizo el gel en Tris-HCl 0,1 M (pH 7,0) y NaCl 150 mM y se sometio a transferencia sobre una membrana 0uralon segun las instrucciones del fabricante (Stratagene). Se estudio con sonda la transferencia de tipo Northern con un A0Nc de polipeptido similar a 1L-17 humana marcado con 32P generado mediante el sistema Rediprime (Amersham). Se llevo a cabo la hibridacion en disolucion Express Hyb y entonces se lavo segun las instrucciones del fabricante. Se expuso la transferencia hibridada a pelicula de rayos X (Kodak) durante 72 horas a -80DC y luego se revelo.

El analisis de transferencia de tipo Northern indicaba que los ratones fundadores transgenicos tenian una expresion aumentada del ARN de polipeptido similar a 1L-17 en comparacion con los compaferos de camada no transgenicos. 0e los 10 ratones sometidos a prueba, los indicados como n.os 29, 52, 55, 61 y 66 tenian el nivel mas alto de expresion de ARN de polipeptido similar a 1L-17. (Vease la figura 7)

B. Analisis de la expresion en los fundadores restantes

Se obtuvieron los higados de los ratones fundadores transgenicos restantes junto con ratones control, mediante hepatectomia parcial. Se anestesiaron los ratones mediante isoflurano y se hizo una pequefa incision transversal por debajo de la apofisis xifoides del esternon para exponer el higado. Se coloco una sutura alrededor del lobulo del higado seleccionado para la extirpacion en el punto de union. Se ligo el lobulo del higado y se retiro cortando por debajo de la ligadura y se congelo inmediatamente en nitrogeno liquido. Se comprobo el raton para detectar hemorragia y se cerro la incision cutanea con 1-2 pinzas automaticas (grapas cutaneas). Se llevo a cabo el aislamiento del ARN del higado y el analisis de transferencia de tipo Northern tal como se describio anteriormente. Se expuso la transferencia hibridada a pelicula de rayos X (Kodak) durante 24 horas a -80DC y luego se revelo.

El analisis de transferencia de tipo Northern en los fundadores restantes indico que estos ratones expresaban niveles superiores de ARN de polipeptido similar a 1L-17 en el higado en comparacion con compaferos de camada no transgenicos. Los ratones indicados como n.os 11, 30, 33, 46 y 68 expresaban los niveles mas altos de ARN de 1L-17. (Vease la figura 8).

EJEMPLO 4

Analisis patologico de ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17

5 A. Necropsia

En este estudio, se analizaron patologicamente siete ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17, de 6-8 semanas de edad asi como cinco compaferos de camada no transgenicos de 6-8 semanas de edad (dos machos y tres hembras) para determinar un posible fenotipo de polipeptido similar a 1L-17. Los ratones n.os 29, 52, 61 y 66 eran fuertemente positivos para la expresion hepatica de ARNm de polipeptido similar a 1L-17, mientras que los 10 ratones n.os 1, 16 y 55 eran debilmente positivos. Los cinco ratones control no transgenicos (n.os 2, 17, 28, 53 y 65) eran negativos. En la necropsia, se pesaron los ratones, se extrajo sangre para hematologia y quimica serica, y se pesaron el higado, el bazo, el rifon, el corazon y el timo. Se recogieron secciones de higado, bazo, pulmon, cerebro, corazon, rifon, glandula suprarrenal, estomago, intestino delgado, pancreas, ciego, colon, ganglio linfatico mesenterico, piel, glandula mamaria, traquea, esofago, tiroides, paratiroides, glandula salival, vejiga urinaria, ovario

15 o testiculo, utero o vesicula seminal, musculo esqueletico, hueso y medula osea para el analisis histologico.

B. Histologia

Se fijaron secciones de higado, bazo, pulmon, cerebro, corazon, rifon, glandula suprarrenal, estomago, intestino delgado, pancreas, ciego, colon, ganglio linfatico mesenterico, piel, glandula mamaria, traquea, esofago, tiroides, paratiroides, glandula salival, vejiga urinaria, ovario o testiculo, utero o vesicula seminal, musculo esqueletico, hueso

20 y medula osea de los ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 y no transgenicos durante la noche en formalina de zinc tamponada neutra al 10% (Anatech, Battle Creek, Michigan), se incrustaron en parafina, se cortaron a 3 !m y se tiferon con hematoxilina y eosina (H&E) para el examen histologico de rutina.

C. 1nmunohistoquimica

Se realizo tincion inmunohistoquimica sobre secciones incrustadas en parafina de 4 !m de grosor usando un

25 sistema de tincion histoquimica 0PC Mark 5 automatizado (0iagnostic Products Corp, Randolph, NJ). Se bloquearon secciones de tejido desparafinizadas con CAS BLOCK (Zymed Laboratories, San Francisco, CA), se incubaron con un anticuerpo monoclonal de rata anti-raton dirigido contra macrofagos (F4/80, Serotec 1nc., Raleigh, NC) o un anticuerpo monoclonal de rata anti-C045R/B220 de raton dirigido contra todos los tipos de celulas B (PharMingen, San 0iego, CA). Se detecto el anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario de conejo anti-inmunoglobulina

30 de rata biotinilado (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Entonces se extinguieron las secciones con peroxido de hidrogeno al 3% y se hicieron reaccionar con complejo terciario de avidina-biotina (Vector Laboratories). Se visualizo la reaccion de tincion con diaminobencidina (0AB, 0ako Carpinteria, CA) y se contratiferon las secciones con hematoxilina.

0. Hallazgos de patologia macroscopica

35 Los ganglios linfaticos mesentericos de los cuatro ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 de alta expresion (n.os 29, 52, 61 y 66) mas uno de los ratones de baja expresion (n.D 55) tenian un tamafo notablemente aumentado. 0e manera similar, los bazos de estos cinco ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 estaban alargados y presentaban un aumento significativo en el peso (1,08 ± 0,27 0E en % de peso corporal frente a 0,37 ± 0,12 0E en % de peso corporal en ratones control no transgenicos, p=0,0007). Los ganglios linfaticos

40 mesentericos y los bazos de los otros dos ratones transgenicos de baja expresion (n.os 1 y 16) parecian normales. Se muestra en la tabla 1 los datos de peso de organos sin procesar y se resumen en la tabla 3 diferencias significativas.

Tabla 1 Pesos de organos sin procesar para ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 frente a ratones no transgenicos

Grupo Sexo PCT Higado % de Bazo % de Corazon % de PC PC PC

No transgenico 2 F 21,8 0,923 4,23 0,070 0,32 0,121 0,56 17 F 20,5 0,912 4,45 0,089 0,43 0,112 0,55 28 F 22,5 1,125 5 0,123 0,55 0,127 0,56 53 M 25,8 1,315 5,1 0,076 0,29 0,140 0,54 65 M 29 1,45 5 0,082 0,28 0,169 0,58

Media: 4,76 0,37 0,56

0es. est.: 0,39 0,12 0,01

Transgenico

49

para 1L17

1: F 31,9 1,406 4,41 0,118 0,37 0,151 0,47

16: F 22,5 1,121 4,98 0,085 0,38 0,115 0,51

29: F 24,4 1,439 5,90 0,333 1,36 0,123 0,5

52: M 25,6 1,583 6,18 0,223 0,87 0,129 0,5

55: F 19,1 1,181 6,18 0,196 1,03 0,122 0,64

61: F 24,5 1,401 5,72 0,190 0,78 0,118 0,48

66: M 25 1,47 5,88 0,338 1,35 0,162 0,65

Media: 5,61 0,88 0,54

0es. est.: 0,67 0,41 0,08

Grupo

No: Corazon % de Rifones % de Timos % de PC

transgenico: PC PC

2: F 21,8 0,121 0,56 0,351 1,61 0,061 0,28

17: F 20,5 0,112 0,55 0,273 1,33 0,048 0,23

28: F 22,5 0,127 0,56 0,398 1,77 0,058 0,26

53: M 25,8 0,140 0,54 0,423 1,64 0,031 0,12

65: M 29 0,169 0,58 0,523 1,8 0,055 0,19

Media: 0,56 1,63 0,22

0es. est.: 0,01 0,19 0,06

Transgenico

para

polipeptido

similar a 1L

17

1: F 31,9 0,151 0,47 0,433 1,36 0,071 0,22

16: F 22,5 0,115 0,51 0,350 1,56 0,061 0,27

29: F 24,4 0,123 0,5 0,861 3,53 0,061 0,25

52: M 25,6 0,129 0,5 0,356 1,39 0,074 0,29

55: F 19,1 0,122 0,64 0,388 2,03 0,04 0,21

61: F 24,5 0,118 0,48 0,372 1,52 0,059 0,24

66: M 25 0,162 0,65 0,433 1,73 0,026 0,1

Media: 0,54 1,87 0,23

0es. est.: 0,08 0,76 0,06

E. Hallazgos de hematologia

Cuatro de los cinco ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 con bazos y ganglios linfaticos mesentericos alargados (la sangre de los ratones n.os 29, 52, 55, 61 y 66 coagulo y no pudo evaluarse) tenian aumentos de moderados a marcados en leucocitos totales, neutrofilos, linfocitos, eosinofilos y celulas no tefidas grandes (posiblemente linfocitos granulares grandes). El recuento de leucocitos totales medio para estos cuatro ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 era de 11,93 x 103 (± 4,47 x 103 0E) mientras que los ratones control no transgenicos tenian un recuento de leucocitos totales medio de 3,09 x 103 (± 0,79 x 103 0E, p=0,003). El recuento de neutrofilos medio en estos cuatro ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 era de 2,29 x 103 (± 0,67 x 103 0E) frente a 0,92 x 103 (± 0,53 x 103 0E ) en ratones control no transgenicos, p=0,032. Estos cuatro ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 tenian un recuento de linfocitos medio de 6,76 x 103 (± 2,32 x 103) frente a 1,99 x 103 (± 0,38 x 103 0E) en ratones control no transgenicos, p=0,0025, un recuento de eosinofilos medio de 1,35 X 103 (± 0,96 x 103 0E) frente a 0,03 X 103 (± 0,01 X 103 0E) en ratones control no transgenicos, p=0,017, y un recuento de celulas no tefidas grandes medio de 1,41 x 103 (± 1,11 x 103 0E) frente a 0,10 x 103 (± 0,05 x 103 0E) en ratones control no transgenicos, p=0,031. 0os de los ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 (n.os 55 y 66) tenian tambien una anemia leve caracterizada por una ligera disminucion en el numero de globulos rojos, hemoglobina y hematocrito asi como recuentos de plaquetas ligeramente elevados. Se muestran en la tabla 2 los datos de hematologia sin procesar y se resumen en la tabla 3 diferencias significativas.

Tabla 2 0atos de hematologia sin procesar para ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 frente a ratones no transgenicos

Grupo: (BC RBC HGB HCT PLT MPV Neut. Linf. Mono. Eos. Baso. LUC

No

trans

genico

2: 2,52 9,39 13,9 48,9 1179 5,0 0,69 1,64 0,02 0,03 0,01 0,13

17: 3,48 10,12 15,1 50,9 938 5,1 0,72 2,63 0,02 0,04 0,01 0,06

28: 2,45 9,51 14,8 49,5 1013 5,7 0,37 2,00 0,02 0,01 0,01 0,05

53: 2,70 10,67 16,1 55,9 1353 5,0 0,61 1,88 0,04 0,04 0,01 0,11

65: 4,30 11,55 17,8 61,4 1362 4,5 2,20 1,81 0,11 0,02 0,01 0,16

Media: 3,09 10,25 15,5 53,3 1169 5,1 0,92 1,99 0,04 0,03 0,01 0,10

0es.

est.: 0,79 0,89 1,5 5,3 193 0,4 0,73 0,38 0,04 0,01 0,00 0,05

Trans

genico

para

poli

peptido

similar a

1L-17

1: 2,80 10,80 16,3 56,8 1113 5,2 0,69 1,91 0,03 0,02 0,01 0,14

16: 3,49. 10,29 15,8 54,7 1134 4,8 1,30 2,01 0,05 0,04 0,01 0,07

29: Sin muestra

52: 13,32 8,81 12,5 45,8 977 6,3 3,25 6,61 0,17 2,12 0,04 1,13

55: 16,89 7,89 12,0 36,6 2758 5,4 1,84 9,80 0,09 2,14 0,04 2,99

61: 11,32 9,18 14,1 50,0 1102 5,2 2,66 6,47 0,08 0,96 0,03 1,12

66: 6,19 6,24 7,8 31,7 2195 4,4 1,42 4,16 0,05 0,16 0,01 0,40

Media: 9,00 8,87 13,1 45,9 1547 5,2 1,86 5,16 0,08 0,91 0,02 0,98

0E: 5,71 1,66 3,1 10,0 744 0,6 0,94 3,06 0,05 1,01 0,02 1,09

Tabla 3 0atos de resumen para diferencias significativas en pesos de organos y valores de CBC entre ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 y ratones no transgenicos

Peso del bazo como % del: Ratones transgenicos para HEAGP (n=4 o 5*) Ratones no transgenicos (n=5) Valor de p (prueba de la t)

peso corporal: 1,08 ± 0,27 0E* 0,37 ± 0,12 0E 0,007

Leucocitos totales ((BC): 11,93 x 103 ± 4,47 x 103 0E 3,09 x 103 ± 0,79 x 103 0E 0,003

Neutrofilos: 2,29 x 103 ± 0,67 x 103 0E 0,92 x 103 ± 0,53 x 103 0E 0,032

Linfocitos: 6,76 x 103 ±2,32 x 103 0E 1,99 x 103 ± 0,38 x 103 0E 0,0025

Eosinofilos: 1,99 x 103 ± 0,38 x 103 0E 0,03 x 103 ± 0,01 x 103 0E 0,017

Celulas no tefidas grandes (LUC, posiblemente linfocitos granulares grandes): 1,41 x 103 ± 1,11 x 103 0E 0,10 x 103 ± 0,05 x 103 0E 0,031

F. Hallazgos histopatologicos

Se examinaron secciones tefidas con hematoxilina y eosina de higado, bazo, pulmon, cerebro, corazon, rifon,

5 glandula suprarrenal, estomago, intestino delgado, pancreas, ciego, colon, ganglio linfatico mesenterico, piel, glandula mamaria, traquea, esofago, tiroides, paratiroides, glandula salival, vejiga urinaria, ovario o testiculo, utero o vesicula seminal, musculo esqueletico, hueso y medula osea de siete ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 y cinco compaferos de camada control no transgenicos. Se examinaron tambien secciones de ganglio linfatico y bazo inmunotefidas con B220 (especifico para todas las celulas B) y F4/80 (especifico para macrofagos) de todos

10 los ratones. Cinco de los ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 (n.os 29, 52, 55, 61 y 66) tenian hallazgos histologicos similares caracterizados por linfadenopatia mesenterica marcada, hiperplasia linfoide esplenica e hiperplasia mieloide eosinofilica de la pulpa roja, e hiperplasia eosinofilica de la medula osea. El hallazgo histologico mas sorprendente era la linfadenopatia mesenterica, que se caracterizaba por un alargamiento ganglionar masivo con perdida de la arquitectura ganglionar normal y expansion medular por una poblacion mixta de

15 celulas inflamatorias que contenia un gran numero de eosinofilos, celulas B reactivas (tefidas con B220) y celulas plasmaticas, macrofagos (tefidos con F4/80) y celulas gigantes inflamatorias multinucleadas (vease la figura 9). Estos cinco ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 tambien presentaban hiperplasia mieloide eosinofilica de la medula osea marcada (figura 10B) asi como hiperplasia linfoide de celulas B esplenica de moderada a marcada e hiperplasia mieloide eosinofilica de la pulpa roja (figura 10F). Ademas, uno de los ratones

20 transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 (n.D 29) tambien presentaba pielonefritis eosinofilica y supurativa cronica, marcada con dilatacion pelvica renal en un rifon y pielitis eosinofilica y supurativa cronica moderada en el otro rifon (figura 10J), mientras que otro raton transgenico para polipeptido similar a 1L-17 (n.D 55) presentaba cistitis urinaria eosinofilica y supurativa cronica, grave con pielitis eosinofilica y supurativa cronica bilateral leve. Por ultimo, cuatro de los ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 (n.os 29, 55, 61 y 66) presentaban colitis y/o ileitis

25 eosinofilica y linfoplasmacitica de minima a leve.

G. Resumen de hallazgos fenotipicos en ratones transgenicos que sobreexpresan polipeptido similar a 1L-17 humana

Cinco de los ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 (n.os 29, 52, 55, 61 y 66) tenian un fenotipo similar, caracterizado por una leucocitosis con elevaciones marcadas en eosinofilos, linfocitos y celulas no tefidas grandes 30 que pueden ser linfocitos granulares grandes, una linfadenopatia marcada con un componente eosinofilico marcado,

hiperplasia mieloide eosinofilica de la medula osea e hiperplasia linfoide de celulas B esplenica e hiperplasia mieloide eosinofilica. 0os de los ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 (n.os 55 y 66) tambien presentaban trombocitosis y anemia leve. Ademas, los ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 n.os 55 y 29 presentaban inflamacion eosinofilica y superlativa de sus rifones y/o vejiga urinaria. Por ultimo, cuatro de los ratones transgenicos para polipeptido similar a 1L-17 (n.os 29, 55, 61 y 66) tenian colitis y/o ileitis eosinofilica y linfoplasmacitica de minima a leve. Todos estos hallazgos sugieren que la proteina de polipeptido similar a 1L-17 desempefa un papel en la inflamacion y mielopoyesis, particularmente en el desarrollo, la estimulacion y/o el reclutamiento de eosinofilos y linfocitos B.

EJEMPLO 5

Fenotipo transgenico de ratones que sobreexpresan polipeptido similar a 1L-17

Se realizo el analisis del fenotipo en 10 ratones transgenicos y 5 compaferos de camada no transgenicos. Se obtuvieron un femur, sangre periferica (obtenida mediante puncion cardiaca) y media seccion longitudinal del bazo de cada raton transgenico y su control de compafero de camada. Cinco de los ratones transgenicos analizados (n.os 29, 52, 55, 61 y 66) presentaban cambios fenotipicos.

Para analizar el fenotipo de los ratones transgenicos, se cuantificaron las poblaciones hematopoyeticas principales incluyendo celulas T activadas. Ademas, se cuantifico la expresion especifica de tejido y linaje del receptor de polipeptido similar a 1L-17, 1L-17RB, tal como se describe en el ejemplo 6 en el presente documento.

Se designo el siguiente panel de anticuerpos para realizar las mediciones identificadas anteriormente con clasificacion celular activada por fluorescencia (FACS). Se uso anticuerpo frente a C04-PE para detectar celulas T auxiliares. C069 es un marcador de activacion temprana y se uso anticuerpo frente a C069-F1TC para detectar todas las celulas activadas. Se uso anticuerpo frente a C03-F1TC para detectar todas las celulas T. Se uso anticuerpo frente a C08-PE para detectar celulas T citoliticas. Se uso anticuerpo frente a C014-F1TC para detectar celulas del linaje de monocitos. Se uso anticuerpo frente a C019-PE para detectar celulas del linaje B (preB para celula B positiva para inmunoglobulina de la superficie madura). Se uso anticuerpo frente a GR-1-F1TC para detectar granulocitos. Se uso anticuerpo frente a NK1.1-PE para detectar celulas citoliticas naturales. Se detecto el patron de expresion del receptor de citocina similar a 1L-17 (1L17RB) mediante union de la proteina de fusion Fc-polipeptido similar a 1L-17 recombinante y se revelo con anticuerpos anti-ser humano-F1TC apropiados. Se uso anticuerpo frente a C045R-PE para detectar celulas B. Se uso anticuerpo frente a C011-PE para detectar celulas dendriticas. Se uso anticuerpo frente a C05 como posible indicador de leucemia/linfoma cuando se expresa conjuntamente con C019. Se uso tambien anticuerpo frente a C034 como posible indicador de leucemia/linfoma cuando se expresa conjuntamente con C019. (Tal como se describe en el ejemplo 10). Se obtuvieron todos los anticuerpos de B0-Pharmingen, San 0iego, CA.

Se sacrificaron los ratones transgenicos y los compaferos de camada no transgenicos y se diseccionaron los femures y los bazos. Se hizo una suspension celular de la medula osea femoral y el bazo, se lavo dos veces y se resuspendio en PBS/BSA al 0,5%. Se cuantifico el numero de celulas de cada suspension celular con un contador Coulter Z1 de Coulter usando una apertura de 100 !m y un parametro de umbral inferior de 4 !m. Se afadio una alicuota de 10 !l de cada suspension celular a 10 ml de tampon 1soton que contenia 3 gotas de Zapoglobin (para lisar los globulos rojos) y se contaron. Se incubaron las suspensiones celulares con Fc-block (C0 16/32) durante 15 minutos a 4DC. Posteriormente, se afadieron 1x106 celulas (suspendidas en PBS/BSA al 0,5%) a cada pocillo que contenia anticuerpo en una placa de 96 pocillos.

Ademas, se obtuvieron muestras de sangre periferica de los ratones transgenicos y los compaferos de camada no transgenicos mediante puncion cardiaca y se realizo el analisis de CBC. Posteriormente, se dividio la sangre restante por igual entre 8 pocillos que contenian los anticuerpos en una placa de 96 pocillos.

Se incubaron las suspensiones celulares y las muestras de sangre en presencia de los anticuerpos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se lavaron las celulas dos veces y se lisaron con tampon de lisis de FACS (200 !l/pocillo; Becton 0ickinson) durante 15 minutos a temperatura ambiente con el fin de eliminar los globulos rojos. Tras lisar, se lavaron las celulas y se resuspendieron en 400 !l de tampon de FACS y se analizaron mediante citometria de flujo.

En los 5 ratones transgenicos que presentaban un fenotipo (n.os 29, 52, 55, 61 y 66), habia un aumento sorprendente en celulas C019+ (celulas B) en la sangre periferica. Tal como se muestra en la figura 11, el numero absoluto de celulas C019+ aumento hasta 5 veces en comparacion con los controles. Ademas, habia un aumento de 2-4 veces en el numero absoluto de celulas C019+ en el bazo tal como se muestra en la figura 12. En la medula osea femoral, habia una ligera disminucion en celulas C019+ (figura 13). La tincion para C045r seguia una tendencia similar. La sangre periferica y los bazos aislados de los ratones transgenicos tambien presentaban un aumento de 2-3 veces en el numero absoluto de celulas T auxiliares (linfocitos T C04+). (Veanse las figuras 14 y 15; respectivamente).

Los ratones transgenicos tenian una aparicion constante de una poblacion de celulas grande (por ejemplo, un 33% de granulocitos) que tenian propiedades de dispersion de luz similares a las de eosinofilos (figuras 16 y 17). Ademas, las celulas no expresan el marcador granulocitico. Habia tambien una aparicion constante de una poblacion mas pequefa pero distinta de celulas similares a granulocitos (por ejemplo, un 8-17% de granulocitos) que expresan el 1L-17RB en sangre y medula osea. (Veanse las figuras 18 y 19). Basandose en correlaciones con los puntos de dispersion, los ratones transgenicos parecen tener el siguiente fenotipo de multiples linajes: C04+, C045R+, C011C+ y son grandes y granulares.

Este analisis indico que dentro de los ratones transgenicos habia un surgimiento claro de una poblacion similar a eosinofilos en la medula osea femoral y sangre periferica. Tal como se muestra en la figura 20, el perfil de dispersion de estas celulas se asemeja estrechamente a un ejemplo de quot;libro de textoquot; de las propiedades de dispersion directa frente a lateral (tamafo frente a granularidad) de los eosinofilos.

Habia tambien un aumento importante en el numero absoluto (y porcentaje compartimental) de celulas B C019+ circulantes y esplenicas. Aunque los linfocitos C019+ no eran positivos para el marcador de activacion C069+, su aumento en numero absoluto en la periferia y la ligera disminucion en la medula osea parecen indicar una migracion a los tejidos perifericos en los que esta teniendo lugar la proliferacion.

La aparicion de un fenotipo de multiples linajes en sangre y medula osea parece indicar un fenotipo similar a linfoma. Estos resultados se describen adicionalmente en el ejemplo 10. Ademas, puesto que 1L-17RB parece estar regulado por incremento en estas celulas, parece indicar que esta poblacion puede ser reactiva frente a la omnipresencia de proteina de polipeptido similar a 1L-17. Junto con el hecho de que hay una clara eosinofilia en estos ratones, el fenotipo de multiples linajes se ajusta estrechamente a la descripcion de una leucemia mielomonocitica aguda (LMA M4) (Campena & Behm, J. 1mmunol. Met. 234:59-75, 2000).

EJEMPLO 6

Proteina de fusion Fc-polipeptido similar a 1L-17 humana recombinante:

Se disefo por ingenieria genetica un peptido sefal de Epogen (EpoSP) fusionado en marco a la proteina madura pronosticada del polipeptido similar a 1L-17 humana (SEQ 10 NO: 2) que se fusiono en marco con la region constante de cadena pesada (Fc) de 1gG1 para preparar una proteina de polipeptido similar a 1L-17 humana madura recombinante. Se inserto el A0N de EpoSP que codifica para la secuencia de aminoacidos MGVHECPA(L(LLLSLLSLPLGLPVLG (SEQ 10 NO: 11) en el vector de expresion pCEP4 (1nvitrogen) entre una secuencia de Kozak consenso (CCACC) en su extremo 5' y un sitio Ascl en su extremo 3'. Ademas, se inserto el A0N de Fc que codifica para la secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ 10 NO: 12 y un sitio de restriccion Not1 en el extremo 5' de la secuencia en el extremo 3' del EpoSP (SEQ 10 NO: 11). Se inserto una timidina inmediatamente tras el sitio de restriccion Notl con el fin de mantener el marco codificante igual. El vector resultante que contiene el EpoSP y la Fc en pCEP4 se denomina vector pCEP4-EpoSP-Fc.

Se genero mediante PCR un fragmento de A0N, que contenia un sitio de restriccion Ascl en el extremo 5' y un sitio de restriccion Notl en el extremo 3', que codifica para la proteina de polipeptido similar a 1L-17 humana madura (SEQ 10 NO: 2) sin el codon de terminacion. La proteina de polipeptido similar a 1L-17 humana madura comienza en el numero de aminoacido 17 (aa17) con la metionina de partida como aminoacido numero uno. Se inserto el sitio Ascl, que contiene una timidina, inmediatamente antes del codon que contiene el residuo 17 con el fin de mantener el marco codificante igual. Se ligo direccionalmente el fragmento de polipeptido similar a 1L-17 humana en el vector de expresion pCEP4-EpoSP-Fc usando los sitios de restriccion Ascl y Notl y se denomino pCEP4-EpoSP-hu1L-17 like-Fc. Se confirmo la integridad del A0N y los sitios de union mediante secuenciacion del A0N usando metodos convencionales conocidos en la tecnica.

Se transfecto transitoriamente el plasmido pCEP4-EpoSP-hu1L-17 like-Fc en celulas 293/EBNA humanas usando Superfect (Qiagen) segun las instrucciones del fabricante. Se recogio el medio condicionado libre de suero de las celulas 72 horas tras la transfeccion. Se aislo la proteina de fusion Fc-polipeptido similar a 1L-17 humana recombinante, que se pronostica que tiene la secuencia de aminoacidos APS ubicada en el extremo amino-terminal de la proteina madura, mediante cromatografia de afinidad usando una columna de proteina G HiTrap (Amersham Pharmacia). Entonces se dializo la proteina de fusion Fc-polipeptido similar a 1L-17 humana recombinante frente a tampon PBS durante 72 horas a 4DC usando una membrana Spectra/Pore con un M(CO de 10.000 (Spectrum Laboratories). Posteriormente, se sometio a electroforesis la proteina de fusion Fc-polipeptido similar a 1L-17 humana recombinante sobre un gel de acrilamida al 10% (Novex) y se tifo con azul de Coomassie. Se exploro el gel tefido con un densitometro para determinar el porcentaje de representacion de la banda de proteina de interes. Se uso reactivo de ensayo de proteinas Lowry modificado (Pierce) para determinar la concentracion de proteina total segun las instrucciones del fabricante. Entonces, se calculo la cantidad de proteina de fusion Fc-polipeptido similar a 1L-17 humana multiplicando el porcentaje de proteina de fusion Fc-polipeptido similar a 1L-17 por la concentracion de proteina total.

EJEMPLO 7

Proteina de fusion Fc-receptor B de 1L-17 humana recombinante: Se clonaron polipeptidos de receptor B de 1L-17 tal como se describe en la solicitud de patente estadounidense con numero de serie 09/723.232 presentada el 27 de noviembre de 2000, cuya descripcion se incorpora en el presente documento como referencia en su totalidad. Para preparar proteinas de fusion Fc-receptor B de 1L-17 (1L-17RB-Fc), se fusiono el dominio extracelular del polipeptido similar a receptor de 1L-17 humana (aminoacido n.D 1-292 para 1L-17RB-2, aminoacido n.D 1-350 para 1L-17RB-3 de SEQ 10 NO: 18 y 20, respectivamente) con la region constante de cadena pesada (Fc) de 1gG1 humana. Se ligo direccionalmente el fragmento de A0N que codifica para Fc humana (secuencia de aminoacidos expuesta en SEQ 10 NO: 12) con un sitio de restriccion Notl en su extremo 5' y un sitio de restriccion Xho1 en su extremo 3' en el vector pCEP4 usando los sitios Notl y Xhol. El vector resultante que contiene la secuencia que codifica para Fc en pCEP4 se denomina vector pCEP4-Fc. Se generaron mediante PCR fragmentos de A0N que codifican para el dominio extracelular del 1L-17RB-2 o 1L-17RB-3 humano (SEQ 10 NO: 18 y 20 respectivamente), con un sitio de restriccion Hind 111 y una secuencia de Kozak (CCACC) en su extremo 5' y un sitio de restriccion Notl en su extremo 3'. Se ligaron direccionalmente estos fragmentos de A0N en el vector de expresion pCEP4-Fc usando los sitios de restriccion Hind 111 y Notl y se denominaron pCEP4-hu1L-17RB-2 like-Fc o pCEP4-hu1L-17RB-3 like-Fc. Se confirmo la identidad del A0N y los sitios de union mediante secuenciacion del A0N usando metodos convencionales conocidos en la tecnica.

Se transfectaron transitoriamente el plasmido pCEP4-hu1L-17RB-2 like-Fc o el plasmido pCEP4-hu1L-17RB-3 like-Fc (tambien denominados H1L-17RB-2-Fc y H1L17RB-3-FC, respectivamente, y depositados el 14 de marzo de 2001 en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110, EE.UU. con los numeros de registro �� y ��, respectivamente) en celulas 293/EBNA humanas usando Superfect (Qiagen) segun las instrucciones del fabricante. Se recogio el medio condicionado libre de suero de las celulas 72 horas tras la transfeccion. Se aislaron las proteinas de fusion Fc-1L-polipeptido similar a 17RB humano recombinante, que se pronostica que tienen la secuencia de aminoacidos APS ubicada en el extremo amino-terminal de la proteina madura, mediante cromatografia de afinidad usando una columna de proteina G HiTrap (Amersham Pharmacia). Las secuencias de aminoacidos de las proteinas de fusion resultantes se exponen en SEQ 10 NO: 21 y 22.

Se dializaron las proteinas de fusion Fc-polipeptido similar a 1L-17RB humano recombinante frente a tampon PBS durante 72 horas a 4DC usando una membrana Spectra/Pore con un M(CO de 10.000 (Spectrum Laboratories). Posteriormente, se sometieron a electroforesis las proteinas de fusion Fc-polipeptido similar a 1L-17RB humano recombinante sobre un gel de acrilamida al 10% (Novex) y se tifo con azul de Coomassie. Se exploro el gel tefido con un densitometro para determinar el porcentaje de representacion de la banda de proteina de interes. Se uso reactivo de ensayo de proteinas Lowry modificado (Pierce) para determinar la concentracion de proteina total segun las instrucciones del fabricante. Entonces, se calculo la cantidad de proteina de fusion Fc polipeptido similar a receptor de 1L-17 humano multiplicando el porcentaje de proteinas de fusion Fc-polipeptido similar a 1L-17RB por la concentracion de proteina total.

Las proteinas de fusion de 1L-17RB tambien pueden generarse con un peptido sefal de Epogen (MGVHECPA(LLLLSLLSLPLGLPVLG (SEQ 10 NO: 11) fusionado en marco en la proteina madura pronosticada en lugar de la fusion con el dominio extracelular nativo tal como se describio anteriormente.

EJEMPLO 8

El polipeptido similar a 1L-17 se une al receptor B de 1L-17

Para determinar si el polipeptido similar a 1L-17 es un ligando para polipeptidos de receptor B de 1L-17 (1L-17RB) (SEQ 10 NO: 18 y 20), se realizaron ensayos de union competitiva con la linea celular de linfoblastos B humanos GM3104A que se ha mostrado que expresa 1L-17RB mediante analisis de transferencia de tipo Northern y RT-PCR. Se recogio el medio condicionado de las celulas 293E transfectadas para expresar la proteina de fusion Fcpolipeptido similar a 1L-17 (descrito anteriormente en el ejemplo 6), se concentro y se uso para el ensayo de union. Se determino la especificidad de la union al ligando mediante competicion con receptores bloqueantes solubles, o bien 1L-17RB-2 o bien 1L-17RB-3. Se purifico la proteina de fusion Fc-1L-17R (que contenia la parte extracelular del receptor de 1L-17) del medio condicionado recogido de las celulas 293E transfectadas. Se concentro (5x) el medio condicionado de las celulas 293E transfectadas con 1L-17RB-2-FC o 1L-17-RB-3-Fc (depositados en la ATCC el 14 de marzo del 2001 con los numeros de registro �� y �� respectivamente) tal como se describio anteriormente en el ejemplo 7 con un instrumento Centracon de punto de corte de 3 Kd de Amicon (n.D 4203) y tambien se uso para bloquear.

Antes del ensayo de union, se afadieron 0,5 ml de proteina de fusion Fc-polipeptido similar a 1L-17 que contenia medio condicionado (1x) en viales que contenian cada uno 0,5 ml de medio condicionado 5x de 1L-17RB-2-Fc, 1L17RB-3-Fc o 0,5 ml de proteina 1L-17R-Fc 5 !g/ml en RPM1 1640. Se incubo cada vial sobre hielo durante 2 horas con el fin de bloquear previamente los sitios de union no especifica.

Posteriormente, se incubaron celulas GM3104A (1x106 celulas por muestra) con 1 ml de FBS al 8%/PBS, a 4DC durante 1 hora. Entonces se lavaron las celulas con BSA al 0,5%/PBS y se incubaron con 1 ml de medio condicionado control, medio condicionado que contenia Fc-polipeptido similar a 1L-17 o medio condicionado complementado con receptor bloqueante (1L-17RB-2 o 1L-17RB-3) durante 2 horas a 4DC con agitacion suave. Tras la incubacion, se lavaron las celulas 3 veces con 1 ml de BSA al 0,5%/PBS enfriado con hielo.

Se tifo cada muestra de celulas con 2 !g/100 !l de anticuerpo de cabra anti-1gG-Fc humano-F1TC (Chemicon, AP113F) diluido en BSA al 0,5%/PBS. Se incubaron las celulas sobre hielo durante 1 hora y se lavaron 3 veces con 1 ml de BSA al 0,5%/PBS enfriado con hielo. Posteriormente, se detecto la union al ligando con analisis de clasificador celular activado por fluorescencia usando FACScan (Becton 0ickinson). Este analisis indico que la

5 proteina de fusion Fc-polipeptido similar a 1L-17 se unia a celulas GM3104A. Esta union se inhibia por 1L-17RB-2 e 1L-17RB-3 pero no 1L-17 R.

EJEMPLO 9

El polipeptido similar a 1L-17 induce la expresion de citocinas proinflamatorias

Se recogio el medio condicionado de celulas 293E que expresan o bien la proteina de fusion Fc-polipeptido similar a

10 1L-17, 1L-17B-Fc, 1L-17C-Fc o bien 1L-17C-Fc, para usarlo como ligando en el ensayo. Entonces se concentro el medio condicionado que contenia 1L-17C-Fc, 1L-170-Fc e 1L-17 like-Fc (15x) usando un instrumento Centracon de punto de corte de 3 Kd (Amicon, n.D 4032), y se reconstituyo hasta medio 1x afadiendo FBS al 20%/medio 1640 nuevo.

Se cultivaron celulas de linfoblastos T humanos (GM3104A, 1x106 celulas/muestra) en medio condicionado

15 concentrado reconstituido que contenia cada ligando de 1L-17 (polipeptido similar a 1L-17, 1L-17B, 1L-17 C, 1L-170 y Fc humana). Tras la incubacion durante 18 horas a 37DC y un 5% de CO2, se recogio el medio y se midio la cantidad de 1L-la, 1L-l1, 1L-6, 1FN-y, G-CSF y TNF-a liberada al medio con el kit de inmunoensayo Quantikine apropiado (R&0 Systems) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados se resumen en la tabla 4. La proteina de fusion Fc-polipeptido similar a 1L-17 indujo la liberacion de TNF-a, 1L-la e 1L-6 en un grado mucho mayor que los otros

20 ligandos de 1L-17 sometidos a prueba. No se detecto induccion de 1L-l1, 1FN-y y G-CSF para cualquiera de los ligandos.

Tabla 4

Ligando: TNF-a (pg/ml) 1L-1a (pg/ml) 1L-6 (pg/ml)

MC simulado: 190 6 157,6

Fc humana: 210 8 199

1L-17B: 180 11 138

1L-17C: 170 8 152

1L-170: 180 22 155

Polipeptido similar a 1L-17: 460 25 362

EJEMPLO 10

1nmunofenotipado de la generacion F1 de ratones transgenicos que sobreexpresan polipeptido similar a 1L-17

Se analizo el inmunofenotipo de los ratones transgenicos que sobreexpresan el polipeptido similar a 1L-17 usando

25 analisis de FACS. Se midieron las poblaciones de C05 en linfocitos C019+ y C034 en linfocitos C019+ en los ganglios linfaticos de ratones transgenicos y control no transgenicos. Ademas, tambien se midio la expresion de C04 expresion en eosinofilos en la medula osea de ratones transgenicos y no transgenicos.

Se llevo a cabo analisis de FACS de los perfiles de expresion de C05, C034 y C04 en celulas de los tejidos linfoides especificados aislados de ratones transgenicos que sobreexpresan polipeptido similar a 1L-17 (8-10 semanas) y 30 controles no transgenicos, en suspensiones celulares tal como se describe en el ejemplo 4. Se incubaron las celulas (1x106) con 1 !g/106 celulas de anticuerpos conjugados contra los siguientes marcadores de superficie de raton: C05-F1TC, C034-F1TC, C019-PE y C04-Cychrome. Se obtuvieron todos los anticuerpos de B0-Pharmingen (San 0iego, CA). Se realizaron los procedimientos de tincion tal como se describio anteriormente (vease el ejemplo 4) y se leyo en un instrumento FACScan (Beckman). Se midio el nivel de expresion de marcadores en compuertas de o

35 bien linfocitos o bien eosinofilos (Eos) en graficos de dispersion. (Vease la figura 21). Los porcentajes incluian la referencia a poblaciones dobles positivas.

Se representan en la tabla 5 los numeros absolutos de celulas para C05+/C019+, C034+/C019+ y C04+Eos. Para medir los linfocitos, se realizo la separacion mediante FACS de los linfocitos y se muestran los datos como el porcentaje del numero absoluto de linfocitos. Para medir los eosinofilos, se realizo la separacion mediante FACS de

40 todos los tipos de celulas y por tanto se muestran los datos como el porcentaje del numero total de celulas.

TABLA 5

Linfocitos: Porcentaje del numero absoluto de linfocitos No transgenico Transgenico Aumento en veces

C05+C019+ganglio linfatico: 0,97% 43,11% aumento � 100 veces

C034+C019+ganglio linfatico: 1,39% 46,49% aumento �90 veces

Eosinofilos: Porcentaje de celulas totales No transgenico Transgenico Aumento en veces

C04+Eos medula osea: 0,67% 15,14% aumento �50 veces

Tal como se muestra en la tabla 5 anterior, los ratones transgenicos que sobreexpresan polipeptido similar a 1L-17 F1 revelaron poblaciones linfociticas y eosinofilicas que expresan marcadores hematopoyeticos que se han identificado en numerosas leucemias. Especificamente, los linfocitos C019+ en el ganglio linfatico de los ratones transgenicos expresaban los marcadores C05 y C034 que no se expresan en los ratones control. La expresion de tanto C05 como C034 presenta un aumento de aproximadamente 100 veces con respecto a los controles (tabla 5). Se ha identificado la regulacion por incremento de C05 y C019 en leucemia cronica de celulas B (LCC-B), mientras que no se ha notificado la regulacion por incremento de C034 para leucemia mieloide aguda (LMA) {vease, Xia et al., Cytometry 42: 114-7, 2000; Caldwell y Lascombe, Evaluation of Peripheral Blood Lymphocytosis, Academic 1nformation Systems, 1nc., 2000; Neuber et al., 0ermatology 192: 110-5, 1996).

Ademas, se encontro expresion de C04 en eosinofilos en la medula osea en los ratones transgenicos, con un aumento del 15% con respecto a los controles, lo que dio como resultado un aumento de 50 veces en los numeros absolutos de eosinofilos que expresan C04. Esta expresion de C04 aberrante en eosinofilos se ha notificado en pacientes con leucemia de celulas T adultos, con eosinofilos C04+ y HLA-0R+ superiores que los grupos control (Sakamoto et al., 1ntl. Archives of Allergy and 1mmunology. 1ll (supl. 1): 26-8, 1996). A partir de estos patrones de expresion, parece que el ganglio linfatico en la generacion F1 de ratones transgenicos que sobreexpresan polipeptido similar a 1L-17 porta sintomas tempranos de estados preleucemicos. La salud de estos ratones puede deteriorarse a medida que envejecen, desarrollando cualquiera de estas posibles leucemias que pueden estar en estadios tempranos en estos ratones.

Estos resultados sugieren que polinucleotidos y polipeptidos similares a 1L-17 pueden ser utiles en el diagnostico, el tratamiento y la prevencion de linfomas incluyendo linfoma no Hodgkin y enfermedad de Hodgkin; leucemias mielogenas agudas (LMA y LMC) incluyendo leucemia premielocitica (LMA M3), leucemia mielomonocitica (LMA M4), eritroleucemia (LMA M6) y leucemia megacariocitica (LMA M7); leucemia linfocitica aguda incluyendo leucemia linfoblastica aguda; leucemia linfocitica cronica; leucemia de celulas pilosas; y mieloma multiple.

�ista de secuencias

�110� Amgen, 1nc.

�120� Moleculas similares a 1L-17 y usos de las mismas

�130� 01017/37128B

�140� �141�

�150� 09/810.384 �151�

�150� 60/266.159 �151�

�150� 60/213.125 �151�

�160� 22

�170� Patent1n ver. 2.0

�210� 1 �211� 644 �212� A0N �213� �omo sapiens

�220� �221� C0S �222� (159) .. (641)

�400� 1 �210� 2 �211� 161 �212� PRT �213� �omo sapiens

�400� 2

�210� 3 �211� 1013 5 �212� A0N �213� �us musculus

�220� �221� C0S 10 �222� (1) .. (507)

�400� 3

�210� 4 �211� 169 �212� PRT �213� �us musculus

�400� 4

10 �210� 5

�211� 155

�212� PRT

�213� �omo sapiens

15 �400� 5 �210� 6 �211� 117 �212� PRT �213� �omo sapiens

�400� 6

�210� 7

�211� 117

�212� PRT

�213� �omo sapiens

15 �400� 7 �210� 8 �211� 197 �212� PRT �213� �omo sapiens

�400� 8 �210� 9

5 �211� 1496

�212� A0N

�213� �us musculus

�220� 10 �221� C0S

�222� (511) .. (987)

�400� 9

�400� 10 �210� 11

5 �211� 27 �212� PRT �213� Secuencia artificial

�220� 10 �223� 0escripcion de secuencia artificial: Peptido sefal de Epogen

�400� 11

15 �210� 12

�211� 233

�212� PRT

�213� Secuencia artificial

20 �220�

�223� 0escripcion de secuencia artificial: Peptido de fragmento Fc �400� 12

�210� 13

5 �211� 11 �212� PRT �213� Secuencia artificial

�220� 10 �223� 0escripcion de secuencia artificial: Peptido de proteina TAT de V1H

�400� 13

�210� 14 �211� 19 �212� PRT

5 �213� Secuencia artificial

�220� �223� 0escripcion de secuencia artificial: Peptido de proteina TAT de V1H

10 �400� 14

�210� 15

�211� 18 15 �212� A0N

�213� Secuencia artificial

�220�

�223� 0escripcion de secuencia artificial: Cebador de PCR 20

�400� 15

�210� 16

25 �211� 26 �212� A0N �213� Secuencia artificial

�220� 30 �223� 0escripcion de secuencia artificial: Cebador de PCR

�400� 16

35 �210� 17 �211� 1841 �212� A0N �213� �omo sapiens

40 �220� �221� C0S �222� (50) .. (1555)

�400� 17

�400� 18

�220� �221� C0S 10 �222� (50) .. (1729)

�400� 19

�400� 20

�400� 21

�400� 22

Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso de un anticuerpo antagonista especifico para un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2, o un fragmento de la misma que comprende 25, 50, 75, 100 o 150 aminoacidos contiguos, para la preparacion de un medicamento para tratar fibrosis quistica, sindrome de

5 enfermedad respiratoria aguda o enfisema.
2.

Anticuerpo antagonista especifico para un polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2, o un fragmento de la misma que comprende 25, 50, 75, 100 o 150 aminoacidos contiguos, para su uso en el tratamiento de fibrosis quistica, sindrome de enfermedad respiratoria aguda o enfisema.
3.

Uso de una composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo antagonista especifico para un

10 polipeptido que consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2, o un fragmento de la misma que comprende 25, 50, 75, 100 o 150 aminoacidos contiguos, y un agente de formulacion farmaceuticamente aceptable, para la preparacion de un medicamento para tratar fibrosis quistica, sindrome de enfermedad respiratoria aguda o enfisema.
4. Composicion farmaceutica que comprende un anticuerpo antagonista especifico para un polipeptido que

15 consiste en la secuencia de aminoacidos de SEQ 10 NO: 2, o un fragmento de la misma que comprende 25, 50, 75, 100 o 150 aminoacidos contiguos, y un agente de formulacion farmaceuticamente aceptable, para su uso en el tratamiento de fibrosis quistica, sindrome de enfermedad respiratoria aguda o enfisema.

de raton

Apilamiento de la secuencia de aminoacidos de polipeptido similar a 1L-17 humana, h1L-17L (SEQ 10 NO :2) con una secuencia conocida de aminoacidos de 1L-17 humana, miembro de la familia h1L-17b (SEQ 10 NO:7)

Figura 9

Figura 10