JP4733521B2 - 造血成長因子での、神経状態を処置する方法 - Google Patents

造血成長因子での、神経状態を処置する方法 Download PDF

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Description

本発明は、顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）のような造血成長因子、および／またはエリスロポエチン（ＥＰＯ）を除いたＭＣＳＦのような他の造血因子を投与することによって、哺乳動物における神経状態を処置する方法に関する。本発明はまた、神経細胞の表面に見られるＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦレセプターに結合し、神経保護、神経増殖および／またはＳＴＡＴ遺伝子活性化活性を提供する化合物に関するスクリーニングの方法を提供する。
成長因子は、生存、増殖、成熟および発達神経細胞の増殖を調節することに本質的に関与するタンパク質である。たとえば、多数の成長因子の発現が、種々の脳損傷に応答して増加する。多くの因子が、内因性神経保護および神経分化誘導効果を示す（Ａｒｖｉｄｓｓｏｎ Ａ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００１；１０６：２７−４１、Ｌａｒｓｓｏｎ Ｅ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ １９９９；１９：１２２０−８、Ｍａｔｔｓｏｎ ＭＰ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ １９９４；１１：３−３３、Ｓｅｍｋｏｖａ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｒｅｖ １９９９；３０：１７６−８８を参照のこと）。これらの効果はまた、脳外傷および脳梗塞の後、インビトロおよびインビボでの外因性投与の後にも報告された（Ｓｅｍｋｏｖａ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１９９９；３０：１７６−８８、Ｆｉｓｈｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．１９９５；１５：９５３−９、Ｓｃｈａｂｉｔｚ ＷＲ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ ２００１；３２：１２２６−３３、Ｓｃｈａｂｉｔｚ ＷＲ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ ２０００；３１：２２１２−７を参照のこと）。高アフィニティ膜レセプターに結合した後、成長因子の効果が、細胞内シグナル伝達事象のカスケードによって仲介され（Ｋｅｒｎｉｅ ＳＧ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ ２０００；５７：６５４−７）、細胞を増殖および分化するように誘導し、または細胞生存に対する栄養的支持を提供する。
腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）およびインターロイキンと共に、２０ｋＤａのタンパク質である顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）は、成長因子のサイトカインファミリーの一員である。ＧＣＳＦは、好中球顆粒球の産出に関与する主要な成長因子である。
ＧＣＳＦは、ヘマトポイエチンレセプターのスーパー−ファミリーに属する、膜レセプター（ＧＣＳＦレセプター）の活性化を介して、その機能を発揮し、クラスＩサイトカインレセプターとも呼ばれる（ｄｅ Ｋｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ｔｏｕｗ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，１９９６，３，１８０−４）。
多数のリンホカイン類、造血成長因子類および成長ホルモン関連分子類のレセプターが、共通の結合ドメインを共有していると発見された。これらのレセプター類は、ヘマトポイエチンレセプター類と呼ばれており、相当するリガンドは、ヘマトポイエチンと呼ばれている。さらに、ヘマトポイエチン類は、２つの主要な構造群にさらに分けられ、すなわち大／長、および小／短ヘマトポイエチンに分けられる。大ヘマトポイエチンに対するレセプター複合体の部分である、個々のレセプター鎖の１つのサブセットは、その細胞外部分に共通の構造要素、すなわち免疫グロブリン様ドメイン、ヘマトポイエチン−レセプタードメインおよび３つのファイブロネクチン ＩＩＩ型ドメイン（２つはレプチンレセプター内）を含む。この亜群は、「レセプターのｇｐ１３０ファミリー」（Ｍｏｓｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９９６，２７１，３２６３５−４３）として
指定され、レプチンレセプター（ＬＰＴＲ）、顆粒球コロニー刺激因子レセプター（ＧＣＳＦＲ）、インターロイキン−６／−１１／ＬＩＦ／ＯＳＭ／ＣＮＴＦ共通ベータ鎖（ＧＰ１３０）、白血病阻害因子レセプター（ＬＩＦＲ）、オンコスタチン−Ｍレセプターベータ鎖（ＯＳＭＲ）、インターロイキン−１２レセプターベータ−１鎖（ＩＬ１２ＲＢ１）、インターロイキン−１２レセプターベータ−２鎖（ＩＬ１２ＲＢ２）が含まれる。これらのレセプター鎖は、同起源サイトカインへの結合に際し、ホモ重合化する（ＧＣＳＦＲ、ＧＰ１３０、ＬＰＴＲ）か、ヘテロ重合化する（ＬＩＦＲまたはＯＳＭＲとのＧＰ１３０、ＩＬ１２ＲＢ２とのＩＬ１２ＲＢ１）。さらに、プロサイトコンセンサスパターンがこのレセプターファミリーの特徴であり、これは、
Ｎ−ｘ（４）−Ｓ−ｘ（２８，３５）−［ＬＶＩＭ］−ｘ−Ｗ−ｘ（０，３）−Ｐ−ｘ（５，９）−［ＹＦ］−ｘ（１，２）−［ＶＩＬＭ］−ｘ−Ｗ（配列番号１）である。
ＧＣＳＦは、特定のＧＣＳＦレセプター（ＧＣＳＦＲ）に結合することを介して、好中球顆粒球系列にコミットした細胞の、増殖、生存および成熟を刺激する（Ｈａｒｔｕｎｇ
Ｔ，，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１９９８；５：２２１−５を参照のこと）。ＧＣＳＦＲ仲介シグナル伝達は、核へ転座させ、転写を調節する、シグナル伝達物（Ｓｉｇｎａｌ Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）および転写活性化因子（Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）（ＳＴＡＴ）タンパク質のファミリーを活性化する（Ｄａｒｎｅｌｌ ＪＥ Ｊｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７；２７７：１６３０−５）。ＧＣＳＦは一般的には、ヒトにおける異なる種類の好中球減少症の処置のために使用される。これは臨床利用のために許可された、数少ない成長因子の１つである。実際、化学治療（ＣＴ）−誘導血球減少を減少させるために使用されている（Ｖｉｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０，Ｎｏ．１，２００２：２４−３６）。ＧＣＳＦはまた、可能性のある補助薬として、乾癬疾患における臨床使用に関係してきた（Ｈｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ，Ｖｏｌ．１８５：１４９０−５０１，２００２）。ＧＣＳＦは、ある程度まで結晶化されると報告されてきており（欧州特許第３４４ ７９６号）、ＧＣＳＦの全構造は要約されてきたが、ただし全体的なレベルでのみである（Ｂａｚａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ １１：３５０−３５４（１９９０）、Ｐａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ８：１０７−１１０（１９８８））。
近年、ｂＦＧＦのような多数の成長因子、ならびに抗ＧＰ ＩＩｂ／ＩＩａおよびアブシジマブ（Ａｂｃｉｚｉｍａｂ）のような血小板接着ブロッカーなどの薬理学的に見込みのある物質が、臨床試験において、神経保護有効性に関して試験されてきた。残念なことに、これらのいずれもが、神経保護有効性を提供するとして普及はしなかった。とりわけ、ＮＭＤＡアンタゴニスト、遊離ラジカルスカベンジャーおよびグルタミン酸アンタゴニストが、失敗したか、重度の副作用を示した。増殖を引き起こさなかった抗−ＩＣＡＭのような物質またはグルタミン酸仲介ＮＯ−シンセターゼの阻害因子のリスト（Ｄｅ Ｋｅｙｓｅｒ．ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２２，５３５−４０）。
脳虚血におけるほとんどの研究、およびインビボでの薬理学的物質の試験は、研究下、薬物の即時効果およびパラダイム（すなわち、脳梗塞の誘導後２４時間の梗塞サイズ）にのみを考慮してきた。しかしながら、特定の物質の真の有効性のより有効なパラメータは、機能回復の長期間効果であり、これは、ヒト脳梗塞研究にても反映され、臨床スケール（たとえば、スカンジナビア脳梗塞スケール、ＮＩＨスケール、バルセルスケール）もまた、日々の生活活動を行う能力を反映する。局所性病変後最初の数日での回復は、浮腫の解決および虚血性周辺部の再潅流による可能性がある。急性期後の多くの機能的回復は、脳可塑性による可能性があり、脳の近接皮質領域が、すでに傷害を受けた領域によって達
成されていた機能を受け継いでいる（Ｃｈｅｎ Ｒ．，Ｃｏｈｅｎ ＬＧ，Ｈａｌｌｅｔｔ Ｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；１１１（４）：７６１−７３）。再組織化を説明するために提案された２つの主要な機構は、先に存在するが、機能的に不活性な結合の非マスク化、および側副萌芽のような新規の結合の増殖である（Ｃｈｅｎ Ｒ．Ｃｏｈｅｎ ＬＧ，Ｈａｌｌｅｔｔ Ｍ．２００２ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；１１１（４）：７６１−７３）。短期間可塑性変化は、刺激性シナプシスの阻害を取り除くことによって仲介され、これは、ＧＡＢＡ様阻害を減少させることによる可能性がある（Ｋａａｓ ＪＨ，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９１；１４：１３７−６７、Ｊｏｎｅｓ ＥＧ．Ｃｅｒｅｂ Ｃｏｒｔｅｘ，１９９３ Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；３（５）：３６１−７２）。長期間にわたりおこる可塑性変化は、長期増強作用（ＬＴＰ）のような潜在的シナプシスの非マスク化に加えて、機構に関与し、ＮＭＤＡレセプター活性化および細胞内カルシウム濃度の増加を必要とする（Ｈｅｓｓ ａｎｄ Ｄｏｎｏｇｈｕｅ，Ｊ Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．１９９４ ７１（６）：２５４３−７）。長期変化はまた、軸索再生、シナプス形態、数、大きさおよび型の変化を伴う萌芽に関与する（Ｋａａｓ ＪＨ．Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９１；１４：１３７−６７．，３：）。
脳梗塞は、死亡原因の第３位であり、西欧社会における障害の主な原因である。大きな社会経済的負担を示している。病因は、（主要な場合に）虚血性または出血性いずれかであり得る。虚血脳梗塞の原因は、しばしば塞栓性であるか、血栓性である。現在までに、主要な発作患者に対する効果的な処置は存在しない。臨床的に証明された薬物は、現在までのところ、組織プラスミノーゲン活性剤（ＴＰＡ）とアスピリンである。グルコースおよび酸素の欠乏による、即時梗塞中心における大規模な細胞死の後、梗塞領域が数日間で広がり、グルタミン酸励起毒性、アポトーシス機構およびフリーラジカルの産出のような第２の機構となる。
筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ、ルー・ゲーリック病、シャルコー病）は、１００．０００集団あたり０．４〜１．７６の年間発病率を持つ、神経変性疾病である（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，第６版，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ １０９０−１０９５）。一般的筋萎縮、進行性萎縮および骨格筋の弱化、痙攣および錐体路徴候、構音障害、嚥下障害および呼吸困難の典型的な兆候の、運動ニューロン疾患の、もっとも一般的な形態である。病変としては、原則的に、脊髄および脳幹下部の運動核の前核中の神経細胞の欠失からなるが、しかしまた、皮質中の第１次運動ニューロンも含みうる。家族歴での、スーパーオキシド−ジムスターゼ（ＳＯＤ１）変異体の役割が、非常に理解されてきており、これは、酸化ストレス仮説を誘発するけれども、この破壊的威力のある疾患の病因は、広くは知られていない。現在までに、ＳＯＤ１タンパク質における９０以上の変異が記述されてきており、ＡＬＳを引き起こしうる（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ａｎｄ Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ（２００１），Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２，８０６−１９）。また、この疾患における神経フィラメントの役割が示された。過剰なグルタミン酸刺激によって誘因される機構である、興奮性毒性がまた、重要な因子であり、ヒト患者におけるリルゾール（Ｒｉｌｕｚｏｌｅ）の有益な役割によって例示される。ＳＯＤ１変異体において、ほとんど納得出来るように示されたように、カスパーゼの活性化およびアポトーシスが、ＡＬＳにおける共通の最終経路であるようである（Ｉｓｈｉｇａｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，８２，５７６−８４．，Ｌｉ．ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８，３３５−９）。したがって、ＡＬＳも、他の神経変性疾患および脳梗塞において、作用している、同一の一般的な病原性パターン、たとえばグルタミン酸関与、酸化ストレスおよびプログラムされた細胞死となる。
パーキンソン病は、北アメリカでおよそ１００万人の患者がいる、もっとも頻度の高い
運動障害であり、６５歳以上の集団の約１パーセントが罹患している。疾患の核となる症状は、悪寒、身震いおよび運動不能である（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，第６版，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ １０９０−１０９５）。パーキンソン病の病因はわかっていない。しかしながら、ヒト脳病理解剖研究からの、そして動物モデルからの生化学的データの重要な主部によって、黒質における酸化ストレスの進行工程が指摘されており、これは、ドーパミン様神経変性を開始させうる。神経毒素、６−ヒドロキシドーパミンおよびＭＰＴＰ（Ｎ−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン）によって誘導されるような、酸化ストレスが、神経変性の工程を調査するために、動物モデルで使用されてきた。（たとえば、Ｌ−ＤＯＰＡ＋デカルボキシラーゼ阻害剤、ブロモクリプチン、ドーパミンアゴニストとしてのペルゴリド、およびトリヘキシフェニジル（アルタン）のような抗コリン薬剤のような）症候性治療が存在するけれども、本当に疾患の進行を停止させる、たとえば神経保護治療のような、原因治療に対する明らかな必要性が存在する。これらの動物モデルが、ラジカルスカベンジャー、鉄キレーター、ドーパミンアゴニスト、酸化窒素シンターゼ阻害剤、および特定のカルシウムチャネルアンタゴニストの効果を試験するために使用されてきた。アポトーシス機構は、動物モデルならびに患者において明らかに作用する（Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８，１０９１８−２３，Ｘｕ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，８，６００−６，Ｖｉｓｗａｎａｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２１，９５１９−２８，Ｈａｒｔｍａｎｎ．ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５８，３０８−１０）。酸化ストレスおよびアポトーシスの関与を伴う病因はまた、他の神経変性疾病および脳梗塞の中で、パーキンソン病でも見られる。
脳虚血は、脳血流（ＣＢＦ）に障害を与える様々な原因の結果でありえ、酸素およびグルコース両方の欠損を導きうる。一方で、外傷性脳傷害（ＴＢＩ）が、通常頭蓋破裂を引き起こし、血管と脳組織の剪断および引き裂きをともなう脳実質組織を厳しく分裂させる初期物理的衝撃に関与する。続いて、第２の傷害を引き起こす分子および細胞応答の活性化によって特徴づけられる事象のカスケードが誘発される。そのような第２傷害の進展は、多くの生化学的経路が関与する活発な工程である（Ｌｅｋｅｒ ａｎｄ Ｓｈｏｈａｍｉ （２００２），Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，３９，５５−７３）。周縁部虚血領域、および第２の外傷後傷害に曝露された領域における、第２細胞死を導く有害な経路間の多くの類似点が同定されてきた（たとえば、過剰なグルタミン酸放出、酸化窒素、活性酸素種、炎症およびアポトーシスによる興奮毒性（Ｌｅｋｅｒ ａｎｄ Ｓｈｏｈａｍｉ（２００２），Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．，３９，５５−７３））。さらに、初期の虚血性事象が、外傷性脳傷害の後に起こることが報告されており、このことは虚血の成分を、初期物理的障害に加える。
心臓血管疾患は、西欧先進国において、死亡の主要な原因である。米国において、１年あたりおよそ１００万人が死亡しており、その５０％が突発的であり、病院外でおこる（Ｚｈｅｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１０４，２１５８−６３）。心−肺蘇生（ＣＰＲ）が、年間１００，０００人の住民の４０〜９０人で起こり、自発性循環の回復（ＲＯＳＣ）は、これらの患者の２５〜５０％で起こる。しかしながら、ＲＯＳＣが成功する病院退院率は、たった２〜１０％である（Ｂｏｔｔｉｇｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｈｅａｒｔ，８２，６７４−９）。したがって、米国における年間の大多数の心臓停止犠牲者は、上手に処置されていない。ＣＰＲが成功した後の生存率の低さ、すなわち停止後病院内死亡率の主な理由は、持続的な脳障害である。心臓循環停止に続く脳障害は、低酸素ストレスに対する短時間の耐性、および特定の再潅流疾病両方に関連する（Ｓａｆａｒ（１９８６）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，７４，ＩＶ１３８−５３，Ｈｏｓｓｍａｎｎ（１９９３），Ｒｅｓｕｓｃｉｔａｔｉｏｎ，２６，２２５−３５）。まず、より多数の患者を、心臓循環停止の後に、血行力学的に安定化させることが
できるが、しかし、これらの多くが中枢神経系障害のために死亡する。心臓停止に続く脳傷害の個人的、社会的および経済的重大性はショッキングなことである。心臓停止および蘇生（「全身虚血および再潅流」）研究におけるもっとも重要な問題の１つはしたがって、大脳蘇生および停止後大脳障害である（Ｓａｆａｒ（１９８６），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，７４，ＩＶ１３８−５３，Ｓａｆａｒ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，３０，ｐ．１４０−４）。現在、任意の停止後処置方法による心臓停止の間の低酸素症によって引き起こされる、ニューロンに対する初期障害を減少させることは不可能である。主要な異常生理学の問題には、低酸素症と続く壊死、フリーラジカル形成および細胞カルシウム流束、興奮性アミノ酸、大脳微小循環再潅流疾病、およびプログラムされたニューロン死またはアポトーシスをともなう再潅流障害が含まれる（Ｓａｆａｒ（１９８６），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，７４，ＩＶ１３８−５３、Ｓａｆａｒ ｅｔ
ａｌ．（２００２），Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ，３０，１４０−４）。
心臓停止後の神経学的結果を改善するために、多くの臨床試験が行われてきたが、成功したものはない。（神経保護を増強するための）バルビツーレート類の治療的使用、または（虚血再潅流障害を減少させるための）カルシウムチャネルブロッカーの使用が試験された（Ｇｒｏｕｐ（１９８６），Ａｍ．Ｊ．Ｅｍｅｒｇ．Ｍｅｄ．，４，７２−８６、Ｇｒｏｕｐ（１９８６），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１４，３９７−４０３，Ｇｒｏｕｐ（１９９１），Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｃｌｉｎ．Ｔｒｉａｌｓ，１２，５２５−４５、Ｇｒｏｕｐ（１９９１），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．．３２４，１２２５−３１）。現在までに、臨床設定（大規模無作為制御臨床試験の結果が熱望されている中程度の低体温および血栓溶解の除去の可能性をともなう（Ｓａｆａｒ ｅｔ ａｌ（２００２），Ｃｉｒｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，３０，１４０−４））、心臓循環停止に続く神経学的結果を改善するための、特別な停止後処置の選択肢は存在しない。したがって、心臓停止の後の神経学的結果を改善するための革新的な治療が非常に重要である。
多発性硬化症は、中枢神経系の原型炎症自己免疫疾患であり、４００人に１人の寿命リスクであり、本質的に、若年成人における、神経学的身体障害のもっとも一般的な原因である。全世界で、約２００万〜５００万人の患者が、本疾患を患っている（Ｃｏｍｐｓｔｏｎ ａｎｄ Ｃｏｌｅ（２００２），Ｌａｎｃｅｔ，３５９，１２２１−３１）。全ての複合特性で、本疾病は、未だ同定されていない環境因子と、感受性遺伝子間の相互作用の結果である。また、これらの因子は、免疫系の関与、軸索およびグリアの急性炎症傷害、機能回復および構造的治療、炎症後グリオーシスおよび神経変性を含む、事象のカスケードを誘引する。これらの工程の連続的な関与が、回復をともなうエピソード、持続的欠損を残すエピソード、および第２進行によって特徴づけられる臨床コースの基盤となる。処置の目的は、頻度を減少させることであり、再発の永続的な効果を制限すること、症状を救済すること、疾患進展による身体障害を防止すること、および組織回復を促進することである。
うつは、悲壮感、活動への興味の欠失によって、およびエネルギーの減少によって特徴づけられる、一般的な精神疾病である。うつは、その感受性の程度による通常の起源の変化、疾病の症状および持続時間により区別される。自殺が、うつで一般的である１つであり、しばしば避けることのできない結果の１つである。うつエピソードが、高揚の悪化または短気と交互になる場合、躁うつ疾病として知られる。うつ疾病および統合失調症が、すべての自殺のうち６０％に関与する。うつの原因は様々である。逆境生活状態のような、心理社会的要因が、うつエピソードの開始および持続性に影響を与えうる。一般的および生物学的な要因もまた、一端を担いうる。
推定１億２１００万人が現在、うつを患っている。うつは、２０００年にて、ＹＬＤｓ（Ｙｅａｒｓ Ｌｉｖｅｄ ｗｉｔｈ Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ）によって測定されたよう
に、身体障害の第１原因であり、疾患の世界的負担（ＤＡＬＹｓ＝Ｄｉｓａｂｉｌｉｔｙ
Ａｄｊｕｓｔｅｄ Ｌｉｆｅ Ｙｅａｒｓ、早産児死亡率による、潜在的寿命欠失の年数と、身体障害のための、生産的寿命欠失の年数の合計）への第４位の寄与である。推定５．８％の男性および９．５％の女性が、ある歳に、うつエピソードを経験しうる。２０２０年までに、うつが、全ての年齢、両性に関して計算されたＤＡＬＹｓのランキングで、第２位の位置に達すると推定されている。発展地域で、うつは、疾患の負担のもっとも高いランキング原因でありうる。
今日、ほとんどのうつの患者に対する一次処置は、抗うつ医薬品、精神療法または両方の組み合わせからなる。抗うつ剤は、主要なうつエピソードの重症度の全範囲にわたって効果的である。現在、効果的な抗うつ治療は、セロトニン神経伝達の調整または微調節に非常に関連している。脳内のセロトニンのレベルを増加させる薬物が、もっとも強力な公知の抗うつ剤である（フルオキセチン、Ｐｒｏｚａｃ（登録商標）またはＦｌｕｃｔｉｎ（登録商標）など）。患者において、抗うつ効果を持つ、処置はまた、たとえば、リチウムのような薬理学的抗うつ剤、電気−けいれん治療および運動でもある。他の診療には、脆弱な個体、家族および群に対する援助ネットワークシステムを設定することも含まれる。うつの予防に関する証拠は確実ではなく、ただ数個の単独の研究が、うつの予防のために提案された診療が効果的であると示しているだけである。現存する薬物が、疾患の症状を緩和することを目的としており、主として本疾患を引き起こす基礎的な病態生理学的機構を解決はしない。したがって、新規の処置が、うつにおける新規に発見された因果関係の局面をとりわけ解決するのに、必要である。
統合失調症は、もっとも一般的な精神病の１つである。１００人集団あたり約１人（集団の１％）が、統合失調症を患っている。本疾病は、世界中、全ての人種および文化にわたって見られる。統合失調症は、平均では、男性の方が、女性よりもよりはやく統合失調症を促進するようには見えるが、男性および女性が同数で患っている。一般的に、男性は、２０代半ばで、統合失調症の最初の症状を示し、女性は、２０代後期で最初の症状を示す。統合失調症は、社会に対して途方もないコストであり、米国において、１年あたり、３２５億ドルと見積もられている。統合失調症は、多数の以下の症状、妄想、幻覚、解体型思考およびスピーチ、陰性症状（引きこもり、感情および表現の欠損、エネルギー、モチベーションおよび活動の減少）、緊張病によって特徴づけられる。統合失調症の主要な治療は、クロロプロマジン、ハロペリドール、オランザピン、クロザピン、チオリダジンなどのようなニューロプレプティクスに基づいている。しかしながら、ニューロプレティック処置は、しばしば、統合失調症のすべての症状を減少はさせない。さらに、抗精神病性処置は、錐体外路性終末欠陥症候群のような、重度の副作用を持ちうる。強力な遺伝的影響があるように見えるが、統合失調症の原因は明らかではない。最近、統合失調症が、神経変性疾患の少なくともいくつかの局面を持つことが明らかになってきた。とりわけ、ＭＲ研究によって、統合失調症における急速な皮質性灰白質欠損が明らかになった（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９８，１１６５０−５、Ｃａｎｎｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９９，３２２８−３３）。したがって、ＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦまたは他の造血因子のような、神経保護医薬品での統合失調症の処置が正当化される。
ヒトにおいて、認知キャパシティーを増加させる、および知能を促進させる方法に対する必要性が存在する。現代の理解における「知能（ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ）」は、純粋に論理的または語義キャパシティーに制限はされない。たとえば、Ｈｏｗａｒｄ Ｇａｒｄｎｅｒによる多重知能の説は、進化および人類学的展望から知能を評価し、運動神経、筋肉、芸術的、感情的キャパシティー、ならびに知能により一般的に関連し、ＩＱ試験によって測定される、言語的／論理的能力を含む、より広い視点を与える。知能のこの広
い意味はまた、創造性の領域に広がる。さらに、通常約４０歳にて始まり、アルツハイマー病の初期兆候とは異なる、ＡＲＭＬ（年齢関連記憶欠損）またはＭＣＩ（軽度の認知機能障害）またはＡＲＣＤ（年連関連認知衰弱）のような、ヒトで公知の非病理学的症状も存在する。
成人全範囲に渡り、神経細胞の生理学的欠損が存在し、１日あたり１００，０００ニューロンと推定されている。成人全範囲に渡り、脳の重さおよび容積の漸次的減少が存在する。この衰弱は、１０年あたりで約２％である。先に信頼されていたものとは反対に、衰弱は５０歳以後促進はせず、しかし、早期から、ほぼ同じ速度で続いている。この蓄積効果が一般的に、より高年齢まではっきりしないのである。
脳の大きさが縮小する一方で、均一には起こらない。特定の構造がより縮小する傾向にある。たとえば、記憶に関連する２つの構造物である、海馬および前頭葉がしばしばより小さくなる。このことは部分的には、ニューロンの欠損により、部分的には、ニューロンの萎縮による。多くの他の脳構造物が、大きさの欠損を受けない。精神処理の減速が、ニューロンの劣化（すなわち、ニューロンの欠損、縮小または連結の喪失いずれか）によって引き起こされうる。完全な機能ニューロンの枯渇によって、さもなければ単純または自動化されうる、精神的タスクを管理するための、ニューロンの追加のネットワークを強化することが必要となる。したがって、この工程が減速する。前頭葉の一部、前頭前野と呼ばれる部分が、思想および行動をモニタおよび制御することに関与する。この脳の領域で起こる萎縮は、多くの高齢な成人が経験する、言葉を見つける困難さを説明する。また車の鍵の置忘れや一般的な放心状態をも説明し得る。前頭葉および海馬両方の縮小は、記憶困難に関与すると考えられる。したがって、個体の認知能力を改善するため、または増強するための必要性も残っている。
以上の観点において、可塑性の増強、および機能的回復、または神経系における細胞死に関連する、精神病のような、神経および／または精神病状態を処置するための必要性が存在する。とりわけ、関連している神経細胞に神経保護を提供することによる、神経疾患を処置するための必要性が存在する。
したがって、本発明の１つの目的は、神経または精神状態を処置するために、ＧＭＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ誘導体、ＧＣＳＦ、ＧＣＳＦ誘導体、およびこれらの組み合わせのような造血因子、またはＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦまたは誘導体を分泌する細胞を、哺乳動物に投与することによって、哺乳動物における神経または精神状態を処置する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、ＧＭＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ誘導体、ＧＣＳＦ、ＧＣＳＦ誘導体およびこれらの組み合わせのような造血因子で、神経幹細胞組成物をコンディショニングすること、および続いて、神経状態の処置のために、哺乳動物に対して前記神経幹細胞を投与することによって、哺乳動物における神経状態を処置する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、神経細胞を化合物と接触させること、および化合物と接触させなかった細胞中のＳＴＡＴ活性化と比較して、ＳＴＡＴ活性化の増加を測定すること、および、たとえばＧＣＳＦ仲介ＳＴＡＴ活性化と比較した活性化を決定することによって、神経細胞上の顆粒球刺激因子レセプター（ＧＣＳＦＲ）に結合し、そして神経細胞中のＳＴＡＴを活性化する化合物を同定するための方法を提供することである。さらに、本方法によって得られた化合物、ならびにその化合物を神経状態を処置するために使用する方法が、本発明のさらなる目的である。
本発明の他の目的は、神経細胞を化合物と接触させること、および接触させなかった神経細胞中のＳＴＡＴ遺伝子活性化に比例するＳＴＡＴ活性化の増加を測定することによって、神経細胞上の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子レセプター（ＧＭＣＳＦＲ）に結合する、および／または神経細胞中でのＳＴＡＴ遺伝子発現を活性化する化合物を同定するための方法を提供することである。さらに、本方法によって得られた化合物、ならびにその化合物を神経状態を処置するために使用する方法が、本発明のさらなる目的である。
本発明の他の目的は、ＧＣＳＦレセプターを持つ神経細胞と化合物を接触させること、神経細胞に対する化合物の神経保護効果を測定すること、およびＧＣＳＦの効果に対して化合物の効果を比較することによって、神経保護活性が改善された、ＧＣＳＦレセプターアゴニストを同定するための方法を提供することである。さらに、本方法によって得られた化合物、ならびにその化合物を神経状態を処置するために使用する方法が、本発明のさらなる目的である。
本発明の他の目的は、ＧＭＣＳＦレセプターを持つ神経細胞と化合物を接触させること、神経細胞に対する化合物の神経保護効果を測定すること、およびＧＭＣＳＦの効果に対して化合物の効果を比較することによって、神経保護活性が改善されたＧＭＣＳＦレセプターアゴニストを同定するための方法を提供することである。さらに、本方法によって得られた化合物、ならびにその化合物を神経状態を処置するために使用する方法が、本発明のさらなる目的である。
本発明の他の目的は、ＧＣＳＦレセプターを持つ神経細胞と化合物を接触させること、ＧＣＳＦと接触させた第２神経細胞に対して神経細胞中のＳＴＡＴ遺伝子発現のレベルを比較することによって、ＧＣＳＦレセプターアゴニスト活性が改善された化合物を同定するための方法を提供することである。さらに、本方法によって得られた化合物、ならびにその化合物を、神経状態を処置するために使用する方法が、本発明のさらなる目的である。
本発明の他の目的は、ＧＭＣＳＦレセプターを持つ神経細胞と化合物を接触させること、ＧＭＣＳＦと接触させた第２神経細胞に対して、神経細胞中のＳＴＡＴ遺伝子発現のレベルを比較することによって、ＧＭＣＳＦレセプターアゴニスト活性が改善された、化合物を同定するための方法を提供することである。さらに、本方法によって得られた化合物、ならびにその化合物を、神経状態を処置するために使用する方法が、本発明のさらなる目的である。
本発明の他の目的は、細胞上に存在するＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦレセプターをアゴナイズすることによって、内因性神経細胞中での、ＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦ発現および／または放出を刺激する方法を提供することである。他の実施形態において、細胞を、ＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦの発現および／または放出を増加させる物質と接触させる。そのような方法は、神経細胞、たとえば神経細胞培養物中のＧＣＳＦおよび／またはＧＭＣＳＦの放出、または発現の増加を測定するアッセイ（たとえばＰＣＲおよび／またはＥＬＩＳＡアッセイ）を使用可能である。
本発明の他の目的は、神経状態を処置するために、ＧＭＣＳＦレセプター、ＧＣＳＦレセプター、または両方のレセプターをアゴナイズすることによって、哺乳動物における神経状態を処置する方法を提供することである。
本発明の他の目的は、哺乳動物に移植する前に、細胞内に、ＧＭＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ誘
導体、ＧＣＳＦ、ＧＣＳＦ誘導体、および／またはこれらの混合物をコードしている１つまたはそれ以上のポリヌクレオチドを導入することによって、哺乳動物内に移植した細胞の生存を増強する方法を提供することであって、これによって、細胞が、ポリヌクレオチドの導入前の細胞生存と比較して、細胞の生存を増強するのに十分な量で、造血因子を発現する。
本発明の他の目的は、成長因子を提供する前の培養物と比較して、神経細胞の培養物の生存率を増強するために、ＧＭＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ誘導体、ＧＣＳＦ、ＧＣＳＦ誘導体、および／またはこれらの組み合わせを提供することによって、神経細胞培養物の生存率を増強する方法を提供することである。そのような方法において、造血因子を、培養物の細胞と接触させるために使用可能であり、造血因子をコードする、および発現するポリヌクレオチドを用いて提供しうる。
ＧＣＳＦ
顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）は、よく知られた成長因子である。本明細書で記述した発明方法にて使用可能なＧＣＳＦは、全長コード配列、タンパク質配列、ならびに、公知であり、入手可能な種々の機能的変異体、突然変異タンパク質および類似体である。以下の議論において、これらは、ＧＣＳＦ誘導体と呼ぶ。
コードＤＮＡおよびタンパク質両方の構造が知られており、同様に、哺乳動物多能性顆粒球コロニー−刺激因子を組換え的に産出するための方法も知られている（国際公開公報８７／０１１３２号、米国特許第４，８１０，６４３号）。たとえば、Ｇ−ＣＳＦに相当するいくつかのアミノ酸配列を図１０、および配列表、すなわち配列番号：２８、２９、３０、３１、３２および３３で示している。
１つの実施形態において、本明細書で記述した全長ヒトＧＣＳＦアミノ酸配列と、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であるタンパク質を、本発明で使用できる（たとえば配列番号２８）他の実施形態において、使用可能なＧＣＳＦは、野生型全長ヒトＧＣＳＦコード配列に、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％および９７％の同一性を持つポリヌクレオチド、たとえば配列番号２８をコードするポリヌクレオチドによってコードされたものであり、これらのポリヌクレオチドは、野生型全長ヒトＧＣＳＦのコードポリヌクレオチド配列に対して、ストリンジェントな条件で、ハイブリダイズしうる。語句「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、他の配列と比べて検出可能に大きな程度（たとえば、少なくともバックグラウンドに対して２倍）まで、ポリヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズしうる条件に対する参照を含む。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、約１．５Ｍ以下のＮａイオン、典型的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）、温度が、短いプローブ（たとえば１０〜５０ヌクレオチド）で少なくとも約３０℃、長いプローブ（たとえば５０以上のヌクレオチド）で少なくとも約６０℃であるものであり、たとえば、高ストリンジェントな条件には、３７℃にて５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ中のハイブリダイゼーション、６０〜６５℃での０．１×ＳＳＣ中での洗浄が含まれる（Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２「ハイブリダイゼーションの原理と核酸プローブアッセイの戦略の概説（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ．）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）、
およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）を参照のこと）。アミノ酸およびポリヌクレオチド同一性、相同性および／または類似性は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いて決定可能である。
種々のＧＣＳＦ機能的変異体、突然変異体、および類似体には、機能的断片および変異体（たとえば、野生型タンパク質と構造的および生物学的に類似であり、少なくとも１つの生物学的に等価なドメインを含む）、ＧＣＳＦの化学誘導体（たとえば、ポリエチレングリコールのようなさらなる化学部位を含む、およびそのポリエチレングリコール誘導体、および／またはＬｅｎｏｇａｓｔｒｉｍ（商標）のような糖付加形態）、およびＧＣＳＦのペプチド類似体（たとえば、構造および／または機能において、ペプチドを模倣した低分子量化合物（たとえばＡｂｅｌｌ，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄ
Ｍｉｍｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ，Ｌｏｎｄｏｎ：ＪＡＩ
Ｐｒｅｓｓ（１９９７）；Ｇａｎｔｅ，Ｐｅｐｔｉｄｍｉｍｅｔｉｃａ−ｍａｓｓｇｅｓｃｈｎｅｉｄｅｒｔｅ Ｅｎｚｙｍｉｎｈｉｂｉｔｏｒｅｎ Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．１０６：１７８０−１８０２（１９９４）、およびＯｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：３０３９−３０４９（１９９３）を参照のこと）が含まれる）。
ＧＣＳＦ誘導体のさらなる例には、アルブミンとＧＣＳＦの融合タンパク質（Ａｌｂｕｇｒａｎｉｎ（商標））、または米国特許第６２６１２５０にて開示されたものののような他の融合改変物、ＰＥＧ−ＧＣＳＦ共役物および他のＰＥＧ化形態、国際公開公報００／４４７８５およびＶｉｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｖｌ．，Ｎｒ．１，２００２：２４−３６にて記述されたもの、ＧＣＳＦのノルロイシン類似体、米国特許第５，５９９，６９０号にて記述されたもの、国際公開公報９９／６１４４５、国際公開公報９９／６１４４６およびＴｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２８１，１９９８：２５７−２５９にて記述されたようなＧＣＳＦ類似体、米国特許第５，２１４，１３２号および第５，２１８，０９２号にて記述されたような、単一または多数のアミノ酸が改変、欠損または挿入された、ＧＣＳＦ突然変異タンパク質、米国特許第６，２６１，５５０号および第４，８１０，６４３号にて記述されたＧＣＳＦ誘導体、および他の配列断片、たとえばＬｅｒｉｄｉｓｔｉｍとの組み合わせでの、ＧＣＳＦの全配列または一部分を含む、キメラ分子、たとえば、Ｓｔｒｅｅｔｅｒ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２９，４１−５０，Ｍｏｎａｈａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２９，４１６−２４．，Ｈｏｏｄ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４０，１３５９８−６０６，Ｆａｒｅｓｅ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，１９，５１４−２１，Ｆａｒｅｓｅ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，１９，５２２−３３，Ｍａｃ Ｖｉｔｔｉｅ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ，９５，８３７−４５を参照のこと、が含まれる。さらに、ＧＣＳＦ誘導体には、米国特許第６，００４，５４８号にて記述されたような、（１７４アミノ酸種（配列番号３７）の、または１７５アミノ酸を持つものの、さらなるアミノ酸は、Ｎ−末端メチオニンである（配列番号３８））位置１７、３６、４２、６４および７４におけるシステインが、（セリンのような）他のアミノ酸に置換されたもの、第１（Ｎ−末端）位にアラニンを持つＧＣＳＦ、欧州特許第０ ３３５ ４２３号にて記述されたような、ＣＧＳＦ活性を持つ、ポリペプチド中の少なくとも１つのアミノ基の改変、欧州特許第０ ２７２ ７０３号にて記述されたような、タンパク質のＮ−末端領域中で、置換または欠失されたアミノ酸がある、ＧＣＳＦ誘導体、欧州特許第０ ４５９ ６３０号にて記述されたような、Ｓｅｒ17残基によって置換された、本来の配列の少なくともＣｙｓ17、およびＳｅｒ27残基によって置換された本来の配列の少なくともＡｓｐ27を持つような、天然に存在するＧＣＳＦの生物学的特性の少なくとも
１つ、および５ｍｇ／ｍｌにて、少なくとも３５％の溶液安定性を持つ、天然に存在するＧＣＳＦの誘導体、欧州特許第０ ４５９ ６３０号にて記述されたような、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなしで、組換え体宿主細胞内でのタンパク質の発現を増強するために、Ｎ−末端を改変した、ＧＣＳＦをコードしている改変ＤＮＡ配列、欧州特許第０ ２４３ １５３号にて記述されたような、酵母を用いる組換え産出における収率を増加させるための、少なくとも１つの酵母ＫＥＸ２プロテアーゼ処理部位を不活性化することによって改変した、ＧＣＳＦ、米国特許第４，９０４，５８４号にて記述されたような、リシン改変タンパク質、国際公開公報９０１２８７４号（米国特許第５，１６６，３２２号）で記述したようなタンパク質のシステイン改変バリアント、オーストラリア特許第ＡＵ−Ａ−１０９４８／９３２号にて記述したような、原核生物発現の後に、分子の折りたたみを助けるための目的での、ＧＣＳＦ分子のいずれかの末端へのアミノ酸の添加、オーストラリア特許第ＡＵ−Ｕ−７６３８０／９１号で記述されたような、ＧＣＳＦの位置５０〜５６での、配列Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ（配列番号１１）の、１７４アミノ酸（配列番号３７）による置換、ＧＣＳＦの位置５３〜５９の１７７アミノ酸（配列番号３９）での置換、および／または成熟ＧＣＳＦの位置４３、７９、１５６および１７０での４つのヒスチジン残基の少なくとも１つの、１７４アミノ酸（配列番号３７）での、または成熟ＧＣＳＦの位置４６、８２、１５９または１７３での、１７７アミノ酸（配列番号３９）での置換、英国特許第ＧＢ２ ２１３ ８２１号で記述したような、選択された領域のカセット変異導入を促進するために、制限部位を、および望む発現系への遺伝子の組み込みを促進するための隣接制限部位を組み込んだ、合成ＧＣＳＦコード核酸配列が含まれる。さらに、Ｇ−ＣＳＦ類似体の例には、配列番号６４および６５、および米国特許第６，６３２，４２６号で記述された他のもの、が含まれる。上記の内容は、参考文献にて本明細書に組み込まれている。
ＧＣＳＦの種々の機能的誘導体、変異体、突然変異タンパク質および／または類似体は、好ましくは、少なくとも２０％、好ましくは５０％、より好ましくは少なくとも７５％、および／またはもっとも好ましくは少なくとも９０％の、野生型の哺乳動物ＧＣＳＦ活性の生物学的活性を持ち、その生物学的活性の量は、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、およびこれらの間のすべての値および部分的な値が含まれる。さらに、ＧＣＳＦの種々の機能的誘導体、変異体、突然変異タンパク質および／または類似体はまた、野生型哺乳類動物ＧＣＳＦ活性と比較して１００％以上の生物学的活性を持ち、生物学的活性の量は、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、および少なくとも２００％を含む。
ＧＣＳＦの生物学的活性を測定するために、いくつかの公知のアッセイを、単独で、または組み合わせて利用可能である。ＧＣＳＦ機能を決定するための１つの例は、実施例１にて例示している。ＧＣＳＦ機能を決定するための他の方法が公知であり、齧歯類骨髄細胞を用いるコロニー形成アッセイ、Ｇ−ＣＳＦによって誘導される骨髄細胞の増殖の刺激、増殖に関してＧ−ＣＳＦに依存するか、またはＧＣＳＦに応答する細胞株での特定のバイオアッセイ（たとえばＡＭＬ−１９３、３２Ｄ、ＢａＦ３、ＧＮＦＳ−６０、ＨＬ−６０、Ｍ１、ＮＦＳ−６０、ＯＣＩ／ＡＭＬ１ａ、およびＷＥＨＩ−３Ｂ）が含まれる。これらおよび他のアッセイがＢｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ
３９：１９４−２０１（１９９２），Ｃｌｏｇｓｔｏｎ ＣＬ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ
Ｂｉｏｃｈｅｍ ２０２：３７５−８３（１９９２）、Ｈａｔｔｏｒｉ Ｋ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ７５：１２２８−３３（１９９０）、Ｋｕｗａｂａｒａ Ｔ ｅｔ ａｌ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏｄｙｎ １５：１２１−９（１９９２）、Ｍｏｔｏｊｉｍａ Ｈ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １１８：１８７−９２（１９８９）、Ｓａｌｌｅｒｆｏｒｓ
Ｂ ａｎｄ Ｏｌｏｆｓｓｏｎ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍ
ａｔｏｌｏｇｙ ４９：１９９−２０７（１９９２）、Ｓｈｏｒｔｅｒ ＳＣ ｅｔ ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７５：４６８−７４（１９９２）、Ｔａｎａｋａ Ｈ ａｎｄ Ｋａｎｅｋｏ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｏｂｉｏｄｙｎ．１５：３５９−６６（１９９２）、Ｔｉｅ Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １４９：１１５−２０（１９９２），Ｗａｔａｎａｂｅ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９５：３８−４４（１９９１）にて記載されている。
１つの実施形態において、ＧＣＳＦは改変または処方され、あるいは血液脳関門を通るか、または脳組織へのその分布係数をシフトさせる、その能力を増強するＧＣＳＦ類似体として存在する。そのような改変の例は、ＰＴＤまたはＴＡＴ配列の添加（Ｃａｏ ｅｔ
ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：５４２３−５４３１、Ｍｉ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：３３９−３４７、Ｍｏｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９：１１７３−１１７６、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８３：１１７３−１１８１）である。これらの配列はまた、変異形態で使用可能であり、タンパク質のアミノ−またはカルボキシ−末端にて、さらなるアミノ酸を追加可能である。また、ＧＣＳＦの調製物の静脈内適用へのブラジキニンの添加、または類似体物質の添加が、脳または脊髄へのその伝達を支持しうる（Ｅｍｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ４０：１０５−１２３、Ｓｉｅｇａｌ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ４１：１７１−１８６）。
ＧＭ−ＣＳＦ
顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）は、よく知られている成長因子である（たとえば、図１８、配列番号２５、２６および２７を参照のこと）。本明細書で記述した発明方法にて使用可能なＧＭＣＳＦは、全長コード配列、タンパク質配列、および公知であり、入手可能な種々の機能的変異体、突然変異タンパク質および類似体、たとえばＰＥＧ化形態またはアルブミン共役形態である。コードＤＮＡおよびタンパク質両方の構造が公知であり、同様に、哺乳動物多能性顆粒球マクロファージコロニー−刺激因子を組換え的に産出するための方法も知られている（米国特許第５，６４１，６６３号）。ＧＭＣＳＦレセプターも知られており、たとえば米国特許第５，６２９，２８３号にて記述されている。
１つの実施形態において、全長ヒトＧＭＣＳＦアミノ酸配列に、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であるタンパク質を、本発明にて使用可能である。他の実施形態において、使用可能なＧＭＣＳＦは、野生型全長ヒトＧＭＣＳＦコード配列に対して、少なくとも７０％、好ましくは８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％および９８％同一であるポリヌクレオチド配列によってコードされたものであり、たとえば、配列番号２５をコードするポリヌクレオチドであり、これらのポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、野生型全長ヒトＧＭＣＳＦのコードポリヌクレオチド配列に対してハイブリダイズする。語句「ストリンジェントな条件」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、他の配列と比べて検出可能に大きな程度（たとえば、少なくともバックグラウンドに対して２倍）まで、ポリヌクレオチドが、その標的配列にハイブリダイズしうる条件に対する参照を含む。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、約１．５Ｍ以下のＮａイオン、典型的には、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍ Ｎａイオン濃度（または他の塩）、温度が、短いプローブ（たとえば１０〜５０ヌクレオチド）で少なくとも約３０℃、長いプローブ（たとえば５０以上のヌクレオチド）で少なくとも約６０℃であるものであり、たとえば、高ストリンジェントな条件には、３７℃にて５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳ中のハイブリダイゼーション、６０〜６５℃での０．１×ＳＳＣ中での洗
浄が含まれる（Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２「ハイブリダイゼーションの原理と核酸プローブアッセイの戦略の概説（Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ．）」、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９３）、およびＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９５）を参照のこと）。アミノ酸およびポリヌクレオチド同一性、相同性および／または類似性は、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いて決定可能である。
ＧＭＣＳＦの種々の機能的誘導体、変異体、突然変異タンパク質および／または類似体は、好ましくは、少なくとも２０％、好ましくは５０％、より好ましくは少なくとも７５％、および／またはもっとも好ましくは少なくとも９０％の、野生型の哺乳動物ＧＭＣＳＦ活性の生物学的活性を持ち、生物学的活性の量は、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９５％、およびこれらの間のすべての値および部分的な値が含まれる。さらに、ＧＭＣＳＦの種々の機能的誘導体、変異体、突然変異タンパク質および／または類似体はまた、野生型の哺乳動物ＧＭＣＳＦ活性の１００％またはそれ以上の生物学的活性を持ち、生物学的活性の量は、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１２５％、少なくとも１５０％、および少なくとも２００％を含む。
本発明を実施するために、ニューロンを保護するその潜在力を保持し、また白血球における活性が減少し、それによって副作用の可能性が減少する、ＧＭＣＳＦの誘導体、より好ましくはＧＭＣＳＦ類似体が好ましい。ＧＭＣＳＦの誘導体、好ましくはＧＭＣＳＦ類似体は、実施例１７にて記述したような、インビトロ神経保護アッセイで試験可能である。このアッセイで陽性の神経保護効果を示している物質をさらに、その免疫−調節活性に関して試験可能である。
ＧＭＣＳＦの生物学的活性を測定するために、いくつかの公知のアッセイを、単独または組み合わせで使用可能である。これらのＧＭＣＳＦ機能には、その公知の免疫調節機能、および他の神経保護における役割に関連する１つまたはそれ以上の機能が含まれる。ＧＭＣＳＦ機能を測定するための他の方法には、たとえば、マクロファージ、好中球、好酸球巨核球を含むコロニーの発達によるコロニー形成アッセイ、増殖に関してＧＭ−ＣＳＦの存在に依存するか、またはこの因子に応答する細胞株での特定のバイオアッセイ（たとえば細胞株ＡＭＬ−１９３、Ｂ６ＳＵｔ−Ａ、ＢＡＣ１．２Ｆ５、ＢＣＬ１、Ｄａ、ＦＤＣＰ１、ＧＦ−Ｄ８、ＧＭ／ＳＯ、ＩＣ−２、ＭＯ７Ｅ、ＮＦＳ−６０、ＰＴ−１８、ＴＡＬＬ−１０３、ＴＦ−１、ＵＴ−７）でのものが含まれる。これらおよび他のアッセイが、Ｃｅｂｏｎ Ｊ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ ７２：１３４０−７（１９８８）、Ｋａｔｚｅｎ ＮＡ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗｏｒｋ ３：３６５−７２（１９９２）、Ｌｅｗｉｓ ＣＥ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２７：５１−９（１９９０）、Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ ＢＴ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ
２１：１３６６−７０（１９９３）、Ｏｅｚ Ｓ ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ １８：１１０８−１１（１９９０）、Ｒｏｎｃａｒｏｌｉ
Ｆ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５８：１９１−６（１９９３）、Ｓｅｌｌｅｒｆｏｒｓ Ｂ ａｎｄ Ｏｌｏｆｓ
ｓｏｎ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ４９：１９９−２０７（１９９２）、Ｚｅｎｋｅ Ｇ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ １２：１８５−２０６（１９９１）にて記述されている。
また、ＧＭＣＳＦの改変または処方、または血液脳関門を通るその能力を増強するか、または脳組織へのその分布係数をシフトする、類似体物質も好ましい。そのような改変の例は、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）またはＴＡＴ配列の添加（Ｃａｏ Ｇ． ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２２：５４２３−５４３１、Ｍｉ Ｚｅｔ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：３３９−３４７、Ｍｏｒｒｉｓ
ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １９：１１７３−１１７６、Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８３：１１７３−１１８１）である。これらの配列はまた、変異形態で使用可能であり、タンパク質のアミノ−またはカルボキシ−末端にて、さらなるアミノ酸を追加可能である。また、ＧＭＣＳＦの調製物の静脈内適用へのブラジキニンの添加、または類似体物質の添加が、脳または脊髄へのその伝達を支持しうる（Ｅｍｅｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ４０：１０５−１２３、Ｓｉｅｇａｌ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ ４１：１７１−１８６）。異なる好適な形態および誘導体の例は、サルガモスチム（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）、Ｐｒｏｋｉｎｅ（登録商標））、Ｌｅｕｃｏｔｒｏｐｉｎ（登録商標）またはモルグラモスチム（Ｌｅｕｃｏｍａｘ（登録商標））である。
ＧＭＣＳＦＲ ｍＲＮＡが、単離小神経膠細胞、星状細胞、乏突起膠細胞およびニューロン中で検出された（Ｓａｗａｄａ，ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，１６０，１３１−４）、Ｂａｌｄｗｉｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｂｌｏｏｄ，８２，３２７９−８２）。ＧＭＣＳＦが、星状細胞の増殖を刺激することが示された（Ｇｕｉｌｌｅｍｉｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｇｌｉａ，１６，７１−８０）。ＧＭＣＳＦはまた、小神経膠細胞からのインターロイキン６の放出を誘導する（Ｓｕｚｕｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，７１３，１９２−８）。最近、ある刊行物によって、インターロイキン１が、神経系細胞株ＮＴ２における、ＧＭＣＳＦタンパク質産出を増加することが示された（Ｄａｍｅ．ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｅｕｒ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｎｅｔｗ，１３，１２８−３３）。脳内のＧＭＣＳＦＲの存在が、胎児におけるＧＭＣＳＦレセプター発現に関する、システマティックな検索において、ヒト胎児からの物質にて見出された（Ｄａｍｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓ，４６，３５８−６６）。Ｄａｍｅ ｅｔ ａｌ．は、彼らの発見から、ＧＭＣＳＦが、胎児の神経発達において、役割を持ち得、成人脳内で、免疫学的監視において役割を果たすと結論づけた。重要なことは、彼らは、可能性のある疾患関連性、とりわけ、神経保護への関連を言及してはいない。ＧＭＣＳＦは、インビトロ（ＳＮ６．１０．２．２細胞株および培養マウス中隔ニューロン）でのコリンアセチルトランスフェラーゼ活性を増加させ、インビボで、扇状脳弓切断後、損傷ラットコリン性中隔ニューロンの生存を増加させる（Ｋａｍｅｇａｉ．ｅｔ ａｌ．（１９９０），Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，５３２，３２３−５．）（Ｋｏｎｉｓｈｉ．ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ，６０９，２９−３５）。重要なことに、この発見は、ニューロンの特定のサブタイプのみに関連し、他の神経系または神経細胞株に対しては、この著者らによっては一般化されなかった。かれらは、ＧＭＣＳＦの一般的な神経保護特性をこれらのデータから導いてはおらず、任意の可能性のある治療適用性に関しても言及していない。ＧＭＣＳＦは、進展糖付加最終産物（ＡＧＥｓ）の添加に際して、星状細胞にてアップレギュレートされる（Ｌｉ．ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｍｏｌ Ｍｅｄ，４，４６−６０）。ＧＭＣＳＦは、インビトロにて小神経膠細胞増殖を促進することが示されてきた（Ｌｅｅ．ｅｔ ａｌ．（１９９４），Ｇｌｉａ，１２，３０９−１８）。最近、ＧＭＣＳＦレベルが、アルツハイマー病の患者からの脳脊髄液（ｃｓｆ）中で上昇したことが発見された（Ｔａｒｋ
ｏｗｓｋｉ．ｅｔ ａｌ．（２００１），Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃａｎｄ，１０３，１６６−７４）。ＧＭＣＳＦはまた、脳梗塞患者のＣＳＦにて研究されてきた（Ｔａｒｋｏｗｓｋｉ、ｅｔ ａｌ．（１９９９）、Ｓｔｒｏｋｅ，３０，３２１−７．）。後の研究で、ＦＡＳリガンド、プロアポトーシスタンパク質のレベルが、２１〜２６日および３ヶ月以降で、脳梗塞患者の脳脊髄液中でのＧＭＣＳＦレベルと正比例する。しかしながら、脳梗塞患者でのこの発見の、治療的有用性を導く結論は存在せず、ＧＭＣＳＦの可能性ある神経保護の役割の言及はなかった。脳梗塞後のＧＭＣＳＦの放出それ自体が、多くの理由を持ちえ、機能的な予測は不可能である。ＧＭＣＳＦは、血液脳関門を通過する（ＭｃＬａｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｂｒａｉｎ，１２０，２０８３−９１）。この研究は、ＧＭＣＳＦの、神経学的疾患に対する治療適用性を示す目的で実施されたわけではなく、神経変性疾患または脳梗塞におけるＧＭＣＳＦの化の可能性ある有用性に関する文脈上の言及はない。
まとめると、文献中以上で言及した参考文献は、神経系におけるＧＭＣＳＦレセプターおよびリガンドの存在に関する証拠を提供したけれども、ＧＭＣＳＦの一般的な神経保護特性は示してはいない。これらの研究は、確かに、神経変性および脳梗塞のような虚血性疾病の処置のためのＧＭＣＳＦの利用を示唆してはいない。
他の造血成長因子
本発明の他の実施形態において、その治療的活性、好ましくはその神経保護活性を支持するＧＣＳＦおよび／またはＧＭＣＳＦ調製物の組み合わせを使用可能である。これらの組み合わせによって達成される効果は、蓄積性または超相加／相乗的であり得る。１つの実施形態において、種々のＧＣＳＦおよび／またはＧＭＣＳＦ誘導体が、互いに組み合わせて使用される。同様に、ＧＣＳＦおよび／またはＧＭＣＳＦを、強力な神経保護特性を仲介することが最近示されてきている、エリスロポイエチンおよびその誘導体のような、１つまたはそれ以上のさらなる造血因子との組み合わせで使用可能である（たとえばＢｒｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ（２０００）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９７：１０５２６−１０５３１、Ｃｅｒａｍｉ ｅｔ ａｌ（２００２）Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ １７：８−１２、Ｓｉｒｅｎ ＡＬ，Ｅｈｒｅｎｒｅｉｃｈ Ｈ（２００１）Ｅｕｒ Ａｒｃｈ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ２５１：１７９−１８４）。さらに、ＧＭＣＳＦおよび／またはＧＣＳＦは、たとえば、種々のコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦのような）、ＳＣＦ（幹細胞因子）、ＳＣＰＦ（幹細胞成長因子）、種々のインターロイキン（ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ１１、ＩＬ１２）、ＬＩＦ、ＴＧＦ−β、ＭＩＰ−１−α、ＴＮＦ−αおよびまた、多くの他の低分子量因子との組み合わせで使用可能である。
他の実施形態において、エリスロポイエチンをのぞく種々の造血成長因子を、ＧＭＣＳＦおよび／またはＧＣＳＦのない状態で、単独で使用しうる。他の実施形態において、たとえば、脳梗塞において、ＧＣＳＦおよび／またはＧＭＣＳＦを、血栓溶解性活性を持つ物質、たとえば、組織−プラスミノーゲン活性剤（ＴＰＡ）、ストレプトキナーゼ、ウロキナーゼおよび／またはＡｎｃｒｏｄと組み合わせ可能である。ＧＣＳＦおよび／またはＧＭＣＳＦはまた、アセチルサリチル酸（アスピリン（Ａｓｐｉｒｉｎ））またはヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ）のいずれかと、メラトニン（Ｍｅｌａｔｏｎｉｎ）と、および／またはアポトーシスシグナルを干渉する物質（たとえばカスパーゼの阻害剤）とも混合可能である。また、とりわけ、しかし限定はしないが、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の処置において、ＧＣＳＦおよび／またはＧＭＣＳＦと、リルゾール（Ｒｉｌｕｚｏｌｅ）（Ｒｉｌｕｔｅｋ（登録商標））、ビタミンＥ、Ｑ１０のようなビタミン類、または抗酸化物質との組み合わせが可能である。パーキンソン病の処置のために、トリヘキシフェニジル（Ｔｒｉｈｅｘｙｐｈｅｎｉｄｙｌ）、セレギリン（Ｓｅｌｅｇｉｌｉｎｅ）、Ｌ−ＤＯＰＡ、ペルゴリド（Ｐｅｒｇｏｌｉｄｅ）などのような、パーキンソン病の治療で使用さ
れる公知の薬剤と、ＧＣＳＦおよび／またはＧＭＣＳＦの組み合わせを利用してよい。たとえば、Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦのような、造血成長因子と組み合わせてよい他の物質には、ｂＦＧＦ、抗−ＧＰＩＩｂ／ＩＩａ、抗−ＩＣＡＭ、酸化窒素阻害剤、血栓溶解剤、ロタマス阻害剤、カルシニューリン阻害剤およびシクロスポリンが含まれる。さらに、神経変性疾病を処置する時に、神経伝達物質レベルに影響を与える１つまたはそれ異境の薬剤の投与が含まれうる。さらに、認知状態を処置する時に、１つまたはそれ以上のコリン剤、カテコールアミン取り込み阻害剤なども投与しうる。
既存の抗うつ剤との組み合わせもまた、たとえば個体におけるうつを処置するために有利である場合に、使用しうる。抗うつ剤の非限定例には、ＳＳＲＩ類（選択的セロトニン取込み阻害剤）、Ｐａｘｉｌ（パロキセチン）、Ｐｒｏｚａｃ（フルオキセチン）、Ｚｏｌｏｆｔ（セルトラリン）、Ｃｅｌｅｘａ（シタロプラム）、Ｌｅｘａｐｒｏ（エスシタロプラム オキサレート）、Ｌｕｖｏｘ（フルボキサミン）、ＭＯＡＩ類（モノアミンオキシダーゼ阻害剤）、Ｎａｒｄｉｌ（フェネルジン）、Ｐａｒｎａｔｅ（トラニルシプロミン）、ＴＣＡ類（三環抗うつ剤）、Ａｄａｐｉｎ（デキセピン）、Ａｎａｆｒａｎｉｌ（クロミピラミン）、Ｅｌａｖｉｌ（アミトリプチリン）、Ｅｎｄｅｐ（アミトリプチリン）、Ｌｕｄｉｏｍｉｌ（マプロチリン）、Ｎｏｒｐｒａｍｉｎ（デシプラミン）、Ｐａｍｅｌｏｒ（ノルトリプチリン）、Ｐｅｒｔｏｆｒａｎｅ（デシプラミン）、Ｓｉｎｅｑｕａｎ（ドキセピン）、Ｓｕｒｍｏｎｔｉｌ（トリミプラミン）、Ｔｏｆｒａｎｉｌ（イミプラミン）、Ｖｉｖａｃｔｉｌ（プロトリプチリン）、または他の薬剤型、Ｅｆｆｅｘｏｒ（ベンラファキシン）、Ｃｙｍｂａｌｔａ（デュロキサチン）、Ｄｅｓｙｒｅｌ（トラゾドン）、Ｂｕｓｐａｒ（ブスピロン）、Ｅｄｒｏｎａｘ、Ｖｅｓｔｒａ（レボキセチン）、Ｒｅｍｅｒｏｎ（ミルタザピン）、Ｓｅｒｚｏｎｅ（ネファゾドン）、Ｗｅｌｌｂｕｔｒｉｎ（ブプロピオン）が含まれる。
神経状態
本発明にしたがって処置されるべき神経状態は、一般的に３つの種類、すなわち虚血または低酸素症機構を伴う疾患、神経変性疾患（Ａｄａｍｓ ｅｔ ａｌ，「神経学の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）」、１９９７，第６版，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ１０４８ｆｆを参照のこと）、および神経細胞死に関する神経および精神疾患、に分類可能である。本発明にしたがって処置されるべき他の神経状態にはまた、認知能力の増強、および膠芽細胞腫、星状細胞種、髄膜腫および神経鞘腫のような、神経腫瘍の処置も含まれる。
虚血性または低酸素機構を伴う疾患は、さらに、一般疾患と脳虚血にさらに分類可能である。このような虚血または低酸素機構が関与する一般疾患の例には、心筋梗塞、心不全、心臓麻痺、うつ血性心不全、心筋炎、心膜炎、心膜心筋炎、冠状動脈性心臓病（冠状動脈の狭窄）、狭心症、先天性心臓病、ショック、四肢の虚血、腎臓動脈狭窄、糖尿病性網膜症、マラリア関連血栓症、人工心臓弁、アネミアス、ハイパースプレニック症候群、気腫、肺線維症、および肺浮腫が含まれる。脳虚血疾患の例には、脳梗塞（ならびに出血性脳梗塞）、大脳細小血管障害（小血管疾患）、イントラパルタル脳虚血、心停止または再潅流中／後の脳虚血、手術中の問題による脳虚血、頸動脈手術中の脳虚血、脳への血液供給動脈の狭窄による慢性脳虚血、膿瘻網膜症または大脳静脈の血栓、大脳静脈先天性異常および糖尿病性網膜症が含まれる。
神経変性疾患の例には、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病、ハンチントン病、ウィルソン病、多重システム萎縮症、アルツハイマー病、ピック病、レヴィー小体疾患、ハレルフォルデン−スパッツ症候群、捻転性筋緊張異常症、遺伝性運動感覚性（ＨＭＳＮ）、ゲルストマン−ストラウスラー−シャンカー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、マシャド−ジョセフ病、フリードライヒ失調症、非フリードライヒ失調症、ギレス デ
ラ トゥレット シンドローム、家族性麻痺、オリーブ橋小脳委縮症、腫瘍随伴性大脳症候群、遺伝性痙性対麻痺、遺伝性視神経委縮症（Ｌｅｂｅｒ）、網膜色素変性症、スタルガルト病、およびキーンズ−セイアー症候群が含まれる。
神経細胞死に関連する神経および精神疾患の例には、敗血症性ショック、大脳内出血、くも膜下出血、多発脳梗塞性痴呆、（脈管炎、多発性硬化症、ギラン−バレー症候群のような）炎症疾患、（脊髄外傷および脳外傷のような）神経外傷、末梢神経障害、多発神経障害、てんかん、統合失調症、うつ、代謝性脳症、中枢神経系の感染（ウイルス性、細菌性、真菌性）が含まれる。
「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、疾患または状態の進展を、遅くさせる、干渉する、止めるまたは停止させることを意味し、すべての疾患症状および兆候の完全な排除を必要とはしない。「予防する（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」は、神経疾患の予防が含まれ、ここで「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」は、疾患または状態の完全な防止を、限定はしないが含む、疾患または状態の兆候または症状の開始時間または重症度の、任意の程度の阻害であると理解される。
脊髄中の大運動ニューロン上で、ＧＣＳＦレセプター、およびＧＭＣＳＦレセプターの強力な発現が見られ（図４ｉ〜１）、ＧＣＳＦは、局所性脳虚血にて影響を持ち（図１を参照のこと）、ここで、グルタミン酸関与、酸化ストレスおよびプログラムされた細胞死のような、同様の基本的病因機構が、ＡＬＳおよび他の神経変性疾患のように有効であり、慢性的に与えたときにヒトで良く耐性であるので、ＧＣＳＦはとりわけ、ＡＬＳのような慢性状態での長期治療に好適である（Ｏｚｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１８，３５５８−８５）。したがって、本発明の１つの実施形態において、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦのような造血成長因子単独、または互いの組み合わせ、および／または１つまたはそれ以上のさらなる因子との組み合わせが、ＡＬＳを処置するために使用可能である。
酸化ストレスおよびアポトーシスの関与のような、パーキンソン病と関連する病態生理学がまた、他の神経変死疾病および脳梗塞の中で、パーキンソン病を認識する。ＧＣＳＦは、細胞株ＰＣ１２中のＨ2Ｏ2−誘引細胞死において、強く神経保護的である（図１ｂ）。ＰＣ１２細胞は、たとえば機能的ドーパミントランスポーターの存在（Ｍａｒｕｙａｍａ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ａｒｃｈ Ｔｏｘｉｃｏｌ，７５，２０９−１３）のような、ドーパミン性細胞の特長を示し、たとえばＭＰＴＰ代謝物ＭＰＰ＋による毒性のような、パーキンソン病の重要な局面の、インビトロモデルとして使用される（Ｂａｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，３２１，８１−４）。Ｈ2Ｏ2は、明らかにＰＣ１２細胞中のパーキンソン病のいくつかの観点をモデル化する、ＰＣ１２細胞に対する有害な刺激物である。たとえば、Ｈ2Ｏ2は、ＭＰＴＰ−誘引細胞内事象の介在物の１つである（Ｆａｂｒｅ ｅｔ ａｌ．１９９９ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ５５（４）：３２５−３１）。ドーパミン性ニューロンにおけるＭＰＴＰ−およびＨ2Ｏ2−仲介細胞死に関与する、細胞事象およびシグナル伝達機構のカスケードにおいて、明らかな重なり合いが存在する（Ｃｈｕｎ．ＨＳ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ２００１ Ｆｅｂ；７６（４）：１０１０−２１、Ｌａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９３ Ｆｅｂ ２４；４５（４）：９２７−３３）。Ｈ2Ｏ2は、酸化ストレスおよびアポトーシスを導く、活性酸素種（ＲＯＳ）を産出することによって働く。酸化ラジカルによる傷害は、パーキンソン病における主要な病理生理学事象の１つであり（Ｂｏｎｎｅｔ ａｎｄ Ｈｏｕｅｔｏ（１９９９），Ｂｉｏｍｅｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ，５３，１１７−２１．、Ｂｅａｌ（２００１）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２，３２５−３４）、および抗酸化治療が、患者において効果的である（Ｂｅａｌ（２００２），Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｒｅｓ，３６，４５５−６
０．、Ｓｈｕｌｔｓ．ｅｔ ａｌ．（２００２），Ａｒｃｈ Ｎｅｕｒｏｌ，５９，１５４１−５０）。したがって、Ｈ2Ｏ2におけるＧＣＳＦの効果により、ＰＣ１２細胞中で細胞死が誘引され、酸化ストレスおよびアポトーシスの重要な病理生理学機構のモデルが、パーキンソン病（ＰＤ）における効果を予測する。驚くべきことに、パーキンソン病によって影響を受ける領域、黒質（ＳＮ）、とりわけ黒質緻密部（ＳＮＣ）（図４ｍ−ｏを参照のこと）のＧＣＳＦレセプターの発現が実証された。細胞モデルでの効果、レセプターのインビボ局在、病理生理学的機構の、脳虚血との重なり（酸化ラジカル／アポトーシス）により、ＧＣＳＦおよび／または他の成長因子、たとえばＧＭＣＳＦが、パーキンソン病を処置するために使用可能であるという、説得力のある証拠が提供される。齧歯類モデルでの効果試験が、実施例５にて例示したように実施可能である。したがって、本発明の他の実施形態において、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦのような造血成長因子単独、互いの組み合わせ、および／または１つまたはそれ以上のさらなる因子との組み合わせが、パーキンソン病を処置するために使用可能である。
本発明者らは、本明細書に含まれる議論によって、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦが、神経発生を増強する、および虚血傷害の後の行動結果を改善する能力を持つことを示した。神経発生は、神経ネットワークの可塑性の増強を導きえ、ニューロンの漸進的な欠損を置換可能である、１つの機構である。したがって、本発明の１つの実施形態は、本明細書での投与議論にしたがって、１つまたはそれ以上の本明細書で記述したような組成物を個体に投与することによって、ある程度のレベルの認知欠損を患っている、示している、および／または考えられている個体に対して、認知能力の増強、改善または増加を提供することである。他の実施形態において、認知増強はまた、非病的状態である個体、たとえば、認知障害を持っていない個体にでさえ、利益を与える。認知能力、したがって増強の決定は、当業者によって公知である。認知能力の増加または増強が測定される場合、同様の試験、たとえば同一の原則、パラメータなどを使用して、本発明の組成物の投与前、および投与後（およびいくつかの実施形態での投与の間にも測定可能である）を比較する。
さらに、認知増強における、本発明にしたがった組成物の使用は、知的能力における病的でない衰弱の増強に制限されず、また、知的能力の正常な、生理学的レパートリー、たとえば記憶増強、細かい神経運動、および／または論理的能力の増強を促進するために適用も可能である。
うつは、悲しみ、活動における興味の欠失、エネルギーの減少によって特徴づけられる。他の症状には、信認低下および自発性の低下、不正犯罪、死および自殺思想、集中力低下、および睡眠と食欲障害が含まれる。種々の身体症状も存在しうる。うつの感覚は、とりわけ、人生における挫折を経験した後に、一般的であるけれども、うつ疾病は、症状が閾値に達し、少なくとも２週間そのままである場合にのみ診断される。うつは、軽度から非常に重度まで、その重症度において、いろいろでありうる。
発生率は、中年においてもっとも高いけれども、うつは、人生の任意の段階で個体に影響を与えうる。しかしながら、成人および若年成人期の間、うつの認知度が増加する（Ｌｅｗｉｎｓｏｈｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｊ Ａｂｎｏｒｍ Ｐｓｙｃｈｏｌ，１０２，１１０−２０）。うつは本質的には、突発性再発性疾病であり、それぞれのエピソードは、通常数ヶ月から数年間存続し、この間が通常の期間である。しかしながら、約２０％の場合、とりわけ、適切な処置が不可能である場合、うつは、緩和のない慢性コースとなり（Ｔｈｏｒｎｉｃｒｏｆｔ ａｎｄ Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ （１９９３），Ｐｓｙｃｈｏｌ Ｍｅｄ，２３，１０２３−３２）、第１エピソードから回復した患者の再発率は、２年以内で３５％前後であり、１２年の時点で約６０％である。再発率は、４５歳以上の患者でより高い。うつ疾病のとりわけ悲惨な結果の１つが自殺である。１５〜２０％前後のうつ患者は、自殺に身を投じて人生を終わらせる。自殺は、うつの一般的で、避け
ることが可能な結果の１つとして残っている。まとめると、うつは、一般的な精神障害であり、非常に高いレベルの疾患負担を導き、来る２０年にわたり、上昇傾向を示すと予想されている。
うつ病は、たえず患者に悪影響を与えうる（単極）か、二極特性を持ちうる（躁うつ病または双極性うつ病）。双極性うつ病は、過剰なエネルギーおよび上機嫌の「高」から、全くの絶望および無気力の「低」までの、極端な気分変動によって特徴づけられる。躁うつ病はしばしば、リチウムで処置し、これは気分変動を平らにする。
うつ病は、季節性情動障害（Ｓｅａｓｏｎａｌ Ａｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒ）（ＳＡＤ）でありうる。これは、一般的に、冬の近づきと一致するうつ病の１つの型であり、９月に始まり、一日が長くなり、より日光が多くなる春まで残る。
うつ病は、生まれてから約２週間から２年までで起こりうる出産後うつ病でありうる。
うつ病の重症度を分類するために行われてきた試み（たとえば、Ａｂｄｅｌ−Ｋｈａｌｅｋ（２００３），Ｐｓｙｃｈｏｌ Ｒｅｐ，９３，５４４−６０）が、小児および成人うつ病のプロファイルを定義するために、以下の８つの基本的な要因、すなわち、悲観（Ｐｅｓｓｉｍｉｓｍ）、弱い集中力（Ｗｅａｋ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）、睡眠障害（Ｓｌｅｅｐ Ｐｒｏｂｌｅｍｓ）、無快感症（Ａｎｈｅｄｏｎｉａ）、無気力（Ｆａｔｉｇｕｅ）、孤独感（Ｌｏｎｅｌｉｎｅｓｓ）、低自発性（Ｌｏｗ Ｓｅｌｆ−ｅｓｔｅｅｍ）、および全身苦情（Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｏｍｐｌａｉｎｔｓ）を同定した。
うつ病は、（関連した全身疾患無しでの）突発性疾患として起こりえ、または全身疾病、とりわけ多数の神経変性疾病の精神症状でありうる。うつ疾病（ＤＤｓ）は、多発性硬化症、脳梗塞、痴呆、偏頭痛、パーキンソン病およびてんかんのような、神経疾病の頻繁におこる精神科併存疾患である。これらの神経疾病におけるＤＤｓの臨床的な発現は、突発性気分疾病のものと同一である。神経変性疾病はしばしば、疾患の初期表現として、「古典的な」精神症状を示す。神経変性疾病の文脈におけるうつ病の症状は、うつ病のみとは異なりうる。症状としてうつを持つ、以下のいくつかの神経変性疾病が列挙される。
１．多発性硬化症
２．外傷脳傷害：うつ病はまた、外傷脳傷害（ＴＢＩ）の患者に影響を与える。３０％〜３８％の間のＴＢＩの患者が、うつであると分類されうる（Ｓｅｅｌ ａｎｄ Ｋｒｅｕｚｅｒ ０３）。
３．脳梗塞：およそ３０％の脳梗塞患者が、臨床的にうつである（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ８６）
４．痴呆およびアルツハイマー病
５．偏頭痛
６．パーキンソン病：うつ症状が、およそ半数のＰＤ患者でおこり、ＰＤ患者にとって、機能障害の有意な原因である。ＰＤにおけるうつが、単なる、社会心理的ストレスおよび不能に対する応答というよりも、根本的な神経構造変性に対する二次的なものであるということを示唆しているという累積証拠が存在する。うつの発生は、中枢セロトニン機能の変化、および特定の皮質および皮質下経路の神経変性と相関する。したがって、ＰＤにおける合併うつ病の理解によって、躁うつ病の神経構造的基礎に対する理解が加わる。
７．てんかん：てんかんは、社会的、職務上および心理学的機能に複雑な影響を持つ、慢性な状態である。いくつかの精神疾病が、一般的な集団と比較して、てんかんの患者で、有病率の増加を示した。うつ病は、もっとも一般的な精神併存疾患であるが、懸念および他の診断は、広く調査されてきてはいない。しかしながら、てんかんにおいて、うつ疾病は、突発性うつ病のものとはことなる臨床特徴をもって良く存在し、Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ
Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ−第４版に含まれる原則に合致しない可能性がある。いくつかの研究によって、うつ病または心理学的苦痛が、発作、頻度および重症度、職業または運転状況さえ含む、健康に関する生活の質のもっとも強力な予測物でありうることが示された（Ｇｉｌｌｉａｍ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｂｅｈａｖ，４ Ｓｕｐｐｌ ４，２６−３０）。てんかんをともなう臨床的うつの人々は、より高いレベルの知覚重症度が報告され、発作、ならびに同様の型の発作を経験しているうつではない人々よりも、前発作回復に関してより大きな問題に悩んでいることが報告されている。発病活性のレポートにおけるうつ症状の広範囲な影響によって、てんかんの人々が、うつに関して選別されるべきであることが示唆される。これらのデータは、てんかんの人々におけるうつを検出し、処置することの重要性を強調している（Ｇｉｌｌｉａｍ，Ｈｅｃｉｍｏｖｉｃ，ａｎｄ Ｓｈｅｌｉｎｅ（２００３），Ｅｐｉｌｅｐｓｙ Ｂｅｈａｖ，４ Ｓｕｐｐｌ ４，２６−３０）。
８．ハンチントン病：ハンチントン病（ＨＤ）は、個人の運動制御、認知および感情安定性における悪化として明らかな神経変性プロセスである。感情の不安定性は、性格変化、不安および興奮性のような、種々の症状を通して影響を受ける。認知低下により、ハンチントン病（ＨＤ）における運動症状がおこる。うつ病は、ＨＤで一般的であり、また、認知障害にも関連してきた。ＤＮＡ変異長を用いることによって計算される、うつの気分および疾患の開始までの推定時間は、両方が、ワーキング記憶性能の明らかな予測物であった。発見は、ＨＤに対する個体の発症前診断での、既存の研究と一致し、貢献しており、認知衰退（すなわちうつ気分）への潜在的に治療可能な寄与を同定している（Ｎｅｈｌ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１３，３４２−６）。うつはまた、本明細書には列記していない、他の全身性疾患に関連して発症しうる。
最近、うつ病が、脳構造における神経変性事象に、そして、海馬構造における正確な成体神経発生の可能性のある障害に関連することを暗示する、うつ病の病因に対して、新しい刺激的な進展があった。したがって、本明細書で記述したような、（内因性成体神経幹細胞の刺激を含む）その抗アポトーシス活性および再生後活性両方を持つ、たとえばＧ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦのような造血成長因子処置を、うつ病を処置するために使用しうる。
以下で、うつ病の神経変性コンセプトに関連した調査を記述している（Ｋｅｍｐｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ（２００３），Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，５４，４９９−５０３によって概説される）。
うつ患者の形態的変化の研究によって、灰白色変化を含む、海馬の構造的変化が示された（Ｓｈｅｌｉｎｅ（２０００），Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，４８，７９１−８００）。早期開始再発うつ病、神経疾病に関連した後期人生うつ病、および双極性疾病の研究によって、神経構造回路内の構造的脳変化が明らかになった。この回路は、大脳辺縁系線状体淡蒼球視床管と呼ばれており、広範囲に相互連結している構造からなる。感情疾患の三次元磁気共鳴イメージング研究において、この管を含む多くの構造が、容量欠損または構造異常を持つことが明らかになった。うつ病における容量欠損を説明するために提案された機構には、神経毒性が原因の神経欠損、神経発生の減少および可塑性欠損が含まれる。これらの局面は、すべて、ＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦの活性によって処置可能である。１つの好ましい仮説は、成人海馬神経発生における混乱である（Ｋｅｍｐｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｋｒｏｎｅｎｂｒｅｇ（２００３），Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，５４，４９９−５０３、Ｊａｃｏｂｓ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，５，２６２−９、Ｊａｃｏｂｓ（２００２）、Ｂｒａｉｎ Ｂｅｈａｖ Ｉｍｍｕｎ，１６，６０２−９）。うつ病および他の気分疾病はしたがって、「幹細胞疾病」である。最近の研究によって、どのように成人海馬神経発生が調整されるのか、という新
しい局面が持ち上がった。成人神経発生を強く抑制する因子の１つはストレスであり、おそらく、グルココルチコイド放出の増加のためである（Ｊａｃｏｂｓ，Ｐｒａａｇ ａｎｄ Ｇａｇｅ（２０００），Ｍｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，５，２６２−９）。
成人海馬神経発生は、Ａｌｔｍａｎ ａｎｄ Ｄａｓによって１９６５年にまず記述され、いくつかの再発見があった。この現象における広い興味が、成体カナリアの脳での、活性相関神経発生における報告によって、１９８０年代初期にまず火付け役となった。トリチウム化チミジンおよびオートラジオグラフィー技術の、より面倒な使用の代わりに、共焦点レーザー走査顕微鏡との組み合わせでのブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）での、脳内の増殖細胞のマーキングによって、成人神経発生に対する、より直接的な定量アプローチが可能になった。新規細胞生存のサブセットが、顆粒球細胞層内に遊走し、ニューロン内で分化する。これらは、顆粒球細胞層内の全ての他の顆粒球細胞がそうであるように、苔状線維管にそった領域ＣＡ３に対する軸索投射を確立し、周囲のより古い細胞から可視的に区別可能になる。
慢性抗うつ処置が、成人神経発生における減少を軽減するという発見は、以上で概説した仮説を補強する（Ｂｅｎｎｉｎｇｈｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｎｅｕｒａｌ Ｔｒａｎｓｍ，１０９，９４７−６２、Ｄｒｅｍｅｎｃｏｖ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｐｒｏｇ Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，２７，７２９−３９、Ｄ’Ｓａ ａｎｄ Ｄｕｍａｎ（２００２），Ｂｉｐｏｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄ，４，１８３−９４、Ｄｕｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ，２９９，４０１−７、Ｄｕｍａｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｂｉｏｌ Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ，４６，１１８１−９１）。
したがって、本発明の他の実施形態において、たとえばＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦのような造血成長因子、単独、互いの組み合わせ、本明細書で記述したさらなる因子との組み合わせが、たとえば、うつの傾向がある、またはうつ症状が発達することが予想される患者に投与することによって、うつ病を処置するため、および／または予防的うつ治療を提供するために使用可能である。
１つの実施形態において、うつ病は、たとえばＰＥＧ化形態（ＰＥＧｆｉｌｇｒａｓｔｉｍ）、アルブミン共役形態（アルブグラニン）のような、本明細書以上で記述したような、より長期の血漿半減期を持つＧＣＳＦおよび／またはＧＭＣＳＦの処方で処置可能である。処置は、突発性うつ病に限定はされず、症候性うつ病、および併存疾患としてのうつ病に対しても使用される。他の実施形態において、処置は、毎週の皮下注入を提供可能であり、脳内のＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦレセプターの経口利用可能アゴニストとの組み合わせでありうる。処置用量は、本明細書以上で記述したようでありえ、１つの実施形態においては、１日あたり、０．１〜１０００μｇ／ｋｇ体重ＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦでありうる。同様に変化した遺伝子転写をともなう、虚血コアおよび外傷の部位の周りの、同様の神経化学的環境によって、危険な機構の干渉を目的とする、同様の神経保護戦略が、脳虚血および外傷性脳傷害にて効果的であるべきである、ということが示唆される。両方の型の傷におけるそのような治療の目標は、これらの経路間のバランスが、最終的に、リスクにおける組織の運命を決定しうるので、毒性経路の活性化を最小化すること、および内因性神経保護機構の活性を増強することである。実際、実験脳梗塞のモデルで効果的であるとわかったほとんどの神経保護保護剤がまた、実験的外傷脳傷害（ＴＢＩ）のモデルでも効果的である。
脳虚血および外傷性脳傷害において活性な、一般的な病理学的および保護的プロセス、ならびに神経保護戦略に対する一般的な応答の観点から、ＧＣＳＦ治療が、外傷性脳傷害にて効果的であり得ることが示唆される。外傷性脳傷害の条件下で、ＧＣＳＦを実験した
１つの研究が存在した（Ｈｅａｒｄ．ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，２６，７４８−５４）。しかしながら、本研究は、ＧＣＳＦ（フィルグラスチム）の神経保護効果に照準を定めたのではなく、単に感染パラメータを減少させること（本研究の主要評価項目、絶対的好中球数の増加、フィルグラスチムの安全性、および院内感染（シュードモニア、バクテリア、および尿路感染）の頻度）に照準を定めた。この研究での死亡率の改善はなかった。臨床安全性の観点において、本研究により、ＧＣＳＦ投与がＴＢＩに対して安全であることが示され、本発明にしたがった神経保護のためのＧＣＳＦ処置の安全実行可能性を確認した。したがって、本発明の他の実施例において、たとえばＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦのような造血成長因子、単独、互いの組み合わせで、および／または、１つまたはそれ以上のさらなる因子との組み合わせが、たとえば、傷害を持つ患者における神経細胞を保護する予防的方法を提供することによって、脳虚血および外傷性脳傷害を処置するために使用可能である。
心不全および再潅流による脳虚血において有効である、基礎病態生理学的機構が、血管の閉塞による脳虚血下でおこるものと同等であるので（実施例１を参照のこと）、ＧＣＳＦ治療がまた、神経保護のための心臓問題の状況下でも効果的でありうる。したがって、本発明の他の実施形態において、たとえばＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦのような造血成長因子、単独、互いの組み合わせで、および／または、１つまたはそれ以上のさらなる因子との組み合わせが、たとえば、心臓問題／疾患の結果としての虚血を処置するため、および／または予防的神経保護治療を提供するために使用可能である。治療は、緊急再潅流が開始されるや否や開始可能である。あるいは、心臓問題に関する公知のリスク群（前心筋梗塞、高血液コレステロールレベル、高血圧、糖尿病、喫煙）に属している患者において、たとえばＧＣＳＦのような造血成長因子での予防的連続治療もまた、たとえば因子（類）の徐放形態を用いて、実施可能である。
同様に、これらの上記考慮を、脳虚血が続く手術を受けている多くの群の患者に適用する。とりわけ、心臓手術（Ｈｏｇｕｅ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１００，６４２−７）、および脳へ供給する大血管上の手術（たとえば頸動脈血管内膜切除術）は、これらに関連する神経合併症のリスクが高い。１９８２年に、トロント大学の脳神経外科始動ユニットにおいて実施された３５８の頸動脈血管内膜切除術の客観的、遡及的概説によって、３．９％の周術期脳梗塞率、および１．５％の死亡率が示された。ほとんど（８２％）の手術脳合併症が、手術直後の期間（２４時間）でおこった。高い遅延脳梗塞の発生率が、ほとんどの周術期脳梗塞が、血行動態的であるよりも、塞栓性であることを示唆している。５〜６％の疾病率と死亡率合計が、頸動脈血管内膜切除術にて予測されるべきである（Ｇｒｏｕｐ（１９８６），Ｓｔｒｏｋｅ，１７，８４８−５２）。これらおよび他のデータは、これらの手順での予防的神経保護治療に対する、明確な必要性を示している。したがって、本発明の他の実施形態において、たとえばＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦのような造血成長因子、単独、互いの組み合わせで、および／または、１つまたはそれ以上のさらなる因子との組み合わせが、外科的に誘導された脳虚血の結果としての虚血を処置するため、および／または予防的な神経保護治療を提供するために、使用可能である。１つの実施形態において、処置は、主要な外科手順の前に、リスクのある患者で開始する。
本発明の他の実施形態において、たとえばＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦのような造血成長因子、単独、互いの組み合わせで、および／または、１つまたはそれ以上のさらなる因子との組み合わせが、多発性硬化症（ＭＳ）を処置するため、および／または多発性硬化症患者における、予防的神経保護治療を提供するために使用可能である。この方法は、乏突起膠細胞上のＧＣＳＦレセプターの存在に基づいたものであり、ＭＳの初期標的細胞上のＧＣＳＦの直接の効果を支持する。さらに、ＧＣＳＦレセプターは、神経細胞およびその突起上に存在し、この疾患の後期段階で妥協され、身体障害の永続と相関しうる（Ｃｉｄ
．ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ，１９３，１０３−９）。実際、神経変性機構が、多発性硬化症の身体障害の観点に関して、もっとも重要であることが明らかであるので、最近、免疫調節から神経保護までの、多発性硬化症に対する治療コンセプトのパラダイムシフトがおこっている（Ｂｏ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｍｕｌｔ
Ｓｃｌｅｒ，９，３２３−３１，Ｂｊａｒｔｍａｒ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ Ｓｃｉ，２０６，１６５−７１，Ｗｕｊｅｋ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ，６１，２３−３２，Ｂｊａｒｔｍａｒ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５７，１２４８−５２、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）、Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，５０，３８９−４００、Ｂｊａｒｔｍａｒ ａｎｄ Ｔｒａｐｐ（２００１），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ，１４，２７１−８、Ｂｊａｒｔｍａｒ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，４８，８９３−９０１、Ｂｊａｒｔｍａｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｊ
Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ，２８，３８３−９５、Ｔｒａｐｐ，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｌ，１２，２９５−３０２、Ｔｒａｐｐ，ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３３８，２７８−８５、Ｎｅｕｈａｕｓ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｓｃｉ，２４，１３１−８、Ｐｒｙｃｅ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｂｒａｉｎ，１２６，２１９１−２０２、Ｗａｕｂａｎｔ（２００３），Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｅｍｅｒｇ Ｄｒｕｇｓ，８，１４５−６１、Ｇｒａｕｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，１３，５５４−７３、Ｇｏｌｄｅ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｅｕｒ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，１８，２５２７−３７）。白質変化に関して正常に見える領域でさえ、神経変性の兆候を示す。したがって、軸索病変および神経変性が、多発性硬化症における重要な治療標的である。本発明で示しているように、ニューロンにおけるその抗アポトーシス活性を持つＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦ、および（神経発生および可塑性を増強することによる）そのプロ再生潜在力が、本明細書で記述した組成物が、多発性硬化症の処置のための新規治療として使用可能であることを支持している。
さらに、多発性硬化症における病態生理学的機構は、たとえば酸化窒素の関与（Ｓｍｉｔｈ．ｅｔ ａｌ．（２００１），Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，４９，４７０−６）、およびグルタミン酸興奮毒性の関与（Ｐｉｔｔ．ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｎａｔ Ｍｅｄ，６，６７−７０）のような、脳虚血での重要な機構と重なり合う。この条件を考慮に入れると、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦのような造血成長因子が、多発性硬化症および炎症脳疾病のための新規の治療選択肢である。
本発明の他の実施形態は、統合失調症の神経保護的処置に関する。ここ数年、統合失調症における進行性灰白色欠損の驚くべき証拠がでてきた。この証拠は、新規の磁気共鳴イメージング技術によってまず提供された。統合失調症における神経変性プロセスは、分子レベルでは理解されてはいないが、ＧＣＳＦおよび／またはＧＭＣＳＦでの統合失調症における神経保護処置は、本疾患に対する新規のアプローチである。
初代ニューロンの保護における、ＧＣＳＦのような造血成長因子の効果を試験するために、ニューロンを、以下のように調製可能である。１０〜１２のラット皮質を、Ｅ１８ステージの胚から調製可能である（１８日胚）。組織を、ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋｓバランス塩溶液、Ｂｉｏ Ｗｉｔｈａｋｋｅｒ）中のトリプシン［１０ｍｇ／ｍｌ］／ＥＤＴＡ／ＤＮａｓｅ［５ｍｇ／ｍｌ］（ロッシュ ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分離可能である。消化を、四部分培地（神経基礎（Ｎｕｅｏｂａｓａｌ）培地＋１ｍｌ ５０× Ｂ−２７補助剤（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））＋０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン＋２５μＭ グルタミン酸）を用いて停止可能であり、８００ｇにて５分間、室温にて遠心可能である。沈殿物を、５ｍｌの培地中に溶解させ、細胞数を計数することによって（ノイバウ
エルスライド）決定可能である。細胞を、ポリ−Ｌ−リシンでコート可能なカバースリップ上、２４−ウェル−プレートのウェルあたり２５００００細胞の密度でプレート可能である。ついでこれらのニューロンを、保護刺激（ＧＣＳＦ）および有害刺激（グルタミン酸、１００μＭ）の組み合わせで処理可能である。ＧＣＳＦを、グルタミン酸での培養液の処置の３０分前に適用する。対照群は、ＧＣＳＦなし（食塩水のみ）またはグルタミン酸なしのいずれかで処理する。２４時間後、神経細胞死を、供給者の推奨にしたがって、ＬＤＨアッセイ（ロッシュ ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて決定可能である。あるいは、細胞死を誘導するとしられているの他の有害な刺激、たとえばＮＭＤＡおよびグリシン、３−ニトロプロピオン酸（３−ＮＰＡ）、Ｈ2Ｏ2、スタウロスポリン、低酸素症／グルコース欠乏、カリウム回収、ＭＰＰ＋、インターロイキン−１ベータ、ＴＮＦα、ＦＡＳリガンドまたは細胞およびニューロンに対して有害であると知られている他のもの、を使用可能である。細胞死または相対的細胞生存を査定するために、異なるアッセイ、たとえば細胞死ＥＬＩＳＡ（ロッシュ ダイアグノスティックス）、ヨウ化アネキシン／プロピジウム染色と、続くレーザー走査サイトメトリー解析（Ｋａｍｅｎｔｓｋｙ （２００１），Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，６３，５１−８７）、コンピュサイト（Ｃｏｍｐｕｃｙｔｅ），Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、ＤＡＰＩまたはＨＯＥＣＨＳＴ３３３４２染色に続くアポトーシス特徴を持つ細胞核の計数（濃縮、断片化）、開裂特異的抗体での免疫染色後、活性化カスパーゼ３に対して陽性な細胞の計数（たとえばプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）カスパーゼ３抗体）、または細胞溶解物中のカスパーゼ３活性に関するアッセイ（たとえば、ＡｐｏＯｎｅ Ａｓｓａｙ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウエスタンブロット、エリサス（Ｅｌｉｓａｓ））、または細胞生存またはアポトーシス特徴を測定するため好適な任意の他のアッセイを使用可能である。あるいは、他の細胞、たとえば、分化ＰＣ１２細胞、ＨＮ３３細胞、ＳＨＳＹ５細胞、初代海馬ニューロン、初代運動ニューロン、初代感覚グリア細胞、初代中脳培養液、神経幹細胞、分化ＥＳ細胞、または本技術分野で公知の他のニューロン様細胞、または１つまたはそれ以上の神経表現系を示している細胞を使用可能である。本明細書で例示した時間および濃度は、変化してもよく、たとえば、ＧＣＳＦは、刺激と同時に、または刺激の前または後に適用可能である。種々の濃度のＧＣＳＦも利用可能であり、たとえば０．１〜１００μｇ／ｍｌを使用可能である。原則として、本アッセイは、脳切片培養液中での使用に適合可能である。脳外傷のモデル（制御皮質性衝撃）において、ＧＣＳＦのような造血成長因子の効果を試験するために、以下を実施可能である。実験プロトコールは、地域倫理委員会によって承認されうる。体重２８０〜３２０ｇの、２０匹のオスＷｉｓｔａｒラット（チャールズ リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、無作為に以下の群に割り付けた。Ａ（対照群、ｎ＝１０、外傷性脳障害（ＴＢＩ）、ＴＢＩ開始３０分から９０分間、２ｍｌ生理食塩水０．９％で処理）、Ｂ（ＧＣＳＦ群、ｎ＝１０、９０分間虚血、２ｍｌ生理食塩水０．９％中に溶解した、組換え体Ｇ−ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）、アムジェン（Ａｍｇｅｎ）、Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、６０μｇ／ｋｇ体重で、ＴＢＩ開始３０分から９０分間処置）、Ｃ（疑似手術ＧＣＳＦ−処置対照群、ｎ＝１０、疑似手術、２ｍｌ生理食塩水０．９％中に溶解した、組換え体Ｇ−ＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）、アムジェン（Ａｍｇｅｎ）、Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ、６０μｇ／ｋｇ体重で、ＴＢＩ開始３０分から９０分間処置）。
動物を、１００ｍｇ／ｋｇ体重 ケタミンヒドロクロライド（ＷＤＴ、Ｇａｒｂｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の腹腔内注射によって麻酔をかけることができる。麻酔は、必要ならば５０ｍｇ／ｋｇ体重で維持可能である。ＰＥ−５０ポリエチレンチューブを、平均動脈血圧、血液ガス、血中赤血球容積、白血球数および血液グルコースレベルの連続モニタリングのために、右大腿動脈内に挿入可能である。右大腿静脈を、処置注入のために、ＰＥ−５０チューブによってカニューレ挿入可能である。実験の間、直腸温度をモニタし、温
度制御加熱パッド（ホア メディカル インステゥルメンツ（Ｆｏｈｒ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、３７℃に維持可能である。
ＴＢＩのために、ついで皮膚を、プローブの周辺で切断し、頭蓋骨を露出させ、洗浄可能である。ＴＢＩを、間接的衝撃での、重量ドロップ器具を用いて負わせることが可能であり、微量透析と互換するように改変可能である（２．０ｍｍ直径のテフロン(登録商標）（Ｔｅｆｌｏｎ）ポイントを備えるＰＶＣシリンダー上への、４０ｃｍから落下させた１５０ｇ重量）。疑似手術対象を、外傷なしで、ＴＢＩを受けたラットに対して、同様に調整可能である。
すべての動物において、結果を、死亡率、ならびに神経重症度スコア（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｖｅｒｉｔｙ Ｓｃｏｒｅ（ＮＳＳ））によって測定し、実験群に対してブラインドである、調査員によって外傷性脳障害後、１週間、毎日実施可能である。神経機能を、０〜１６のスケールで格付け可能である（正常スコア０、最大欠損スコア１６）。ＮＳＳは、運動、感覚および反射試験の混合であり、ビームバランス試験を含む。傷害の重症度スコアにおいて、１スコアポイントは、試験を実施不可能であるか、または試験した反射の欠損に関して与えられ、したがって、スコアが高ければ高いほど、傷害がより重症である。
ＴＢＩの１週間後、ラットを、ケタミン１５０ｍｇ／ｋｇ体重で麻酔し、頭部除去可能である。脳を取り出し、２４時間、０．１ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液中、４％パラホルムアルデヒドで固定可能である。パラフィン−包埋、１μｍ厚切片を切断し、Ｈ＆Ｅ染色、Ｎｉｓｓｌ染色および免疫組織学的解析のために使用可能である。
免疫組織学的研究を、ミエロペリオキシダーゼ（ＤＡＫＯ、ＵＳＡ）およびＧ−ＣＳＦＲ（サンタ クルズ バイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．），ＵＳＡ）に対する抗血清で実施可能である。抗血清は、それぞれ、単離ヒトタンパク質（抗−ミエロペルオキシダーゼ）で、またはマウス由来のＧ−ＣＳＦＲのカルボキシ末端のマッピング合成ペプチドで免疫化したウサギ中で産出されうる。抗原回復のために、Ｇ−ＣＳＦＲ免疫組織化学のために提供された切片を、１０ｍＭクエン酸緩衝液中で、９９℃にて２０分間熱しうる。ついで切片を、正常ブタ血清（リン酸緩衝生理食塩水中１０％）中で、３０分間、ついで１次抗血清中、４℃にて一晩インキュベート可能である。１次抗体を、１：１５０（ミエロペルオキシダーゼ）、１：４００（Ｇ−ＣＳＦ）希釈可能である。免疫応答を、アビジン ビオチン複合法によって視覚化可能である（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ、ベクター ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ＵＳＡ）。切片を、０．０２％過酸化水素を含む０．０２％ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）中で現像可能である。反応産物を、０．０２％塩化コバルトおよび硫酸アンモニウムニッケルの添加によって増強可能である。ＴＢＩ後の神経生存は、Ｇ−ＣＳＦ処理動物および対照の海馬中、顕微鏡（倍率×４０）下で、ニューロンを定量することによって測定可能である。好中球顆粒球（ＮＧ）の浸潤を、４点スケール（０＝ＭＰＯ陰性、１＝低ＭＰＯ発現、２＝中程度ＭＰＯ発現、３＝強ＭＰＯ発現）にて、半定量的に測定可能である。
統計学的解析
値は、平均値±ＳＤで示している。すべてのデータを取り込んだ後、無作為化コードを開示可能である。ＡＮＯＶＡおよび続くポスト ホック フィッシャー保護最小有意差検定を用いて、生理学的パラメータのような、連続変数における差違の統計学的有意性を決定可能である。神経障害と免疫組織化学的データの比較のために、ｔ−検定を使用可能である。マンホイットニーＵ検定を、死亡率およびＭＰＯ免疫組織化学のような、非パラメトリックデータに関して実施可能である。ｐ値＜０．０５が、統計学的に有意であると考
慮される。
ＧＭＣＳＦおよびＧＣＳＦのような造血因子の効果、神経細胞上の同族レセプターに対するアゴニスト効果に基づき、本発明の他の実施形態は、がん細胞上のＧＭＣＳＦおよび／またはＧＣＳＦに対してアンタゴニストとして働くことによって、脳腫瘍または他の神経がんを処置することである。
神経幹細胞
最近、神経疾患を処置するための、新規神経細胞を形成すること（神経発生）の重要性が認識されてきた。多くの他の組織とは異なり、成熟脳は、再生能力が限られており、その異常な程度の細胞特異化により、残っている健康な組織が、障害を受けた脳の機能を担う程度が制限されている。しかしながら、大脳ニューロンは、成人脳に存続する前駆細胞に由来し、よって成人脳における内因性の神経前駆体の刺激が、治療的な可能性を持ちうる。
神経発生は、側脳室の吻側室下領域（ＳＶＺ）および歯状回（ＤＧ）の顆粒下領域（ＳＧＺ）を含む、成人脳の別々の領域で発生する。神経発生は、とりわけ特定の神経パラダイムの後に、成体動物にて起こる（たとえば、脳虚血（Ｊｉｎ．ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９８，４７１０−５、Ｊｉａｎｇ．ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｓｔｒｏｋｅ，３２，１２０１−７、Ｋｅｅ．ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．，１３６，３１３−２０、Ｐｅｒｆｉｌｉｅｖａ．ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．，２１，２１１−７））。神経発生はまた、ヒトでも示されてきており（Ｅｒｉｋｓｓｏｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｎａｔ Ｍｅｄ，４，１３１３−７）、実際、機能性ニューロンを導く（ｖａｎ Ｐｒａａｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ，４１５，１０３０−４）。とりわけ、歯状回の顆粒下領域、および門が、成人期の間、新規ニューロンを発生する能力を持つ（Ｇａｇｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｊ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，３６，２４９−６６）。ＧＣＳＦレセプターがこの領域で発現することが特筆すべきである（図４ａ、ｄ）。ＧＣＳＦ処置後の機能結果の改善を示す驚くべきデータ（図８）、およびＧＣＳＦが他の系にて、幹細胞因子であるという事実（造血）とともに、ＧＣＳＦがその活性の一部分を発揮し、とりわけ、少なくとも歯状回中の成人幹細胞上でその刺激機能を介して観察された（図８）長期効果を発揮することが予想される。
このことは、ラットからの歯状回を取り囲む海馬領域から単離された、成体神経幹細胞上のＧＣＳＦレセプターの存在を示すことによって、本明細書中で確認されている（図１２および１３）。神経発生における重要性によって、神経変性疾患のすべての面、およびニューロンが死亡するすべての条件での、ＧＣＳＦ処置の適用可能性および有用性に関する他の理由が提供される。神経状態の処置のために、脳内の内因性幹細胞上で働くことと対照的に、ＧＣＳＦは、幹細胞のインビトロ取り扱い、たとえば分化および増殖に適用可能である。ヒトにおける幹細胞治療は現在、多数の疾患、とりわけパーキンソン病および脳梗塞に対して探求されてきている。培養中の幹細胞を、特定の神経細胞、たとえばパーキンソン病の処置のために、ドーパミン細胞へ分化させることが望ましい。ついで、新規環境に分化した、もしくは適合させた細胞を、有機体へ、異なる経路を介して投与する。たとえばパーキンソン病で、幹細胞が、黒質中のドーパミン性ニューロンの欠損に対する代用として、脳内に直接注射された（「置換治療（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ）」）（Ａｒｅｎａｓ（２００２），Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ，５７，７９５−８０８、Ｂａｒｋｅｒ（２００２），Ｍｏｖ．Ｄｉｓｏｒｄ．，１７，２３３−４１）。
したがって、本発明の１つの実施形態は、造血成長因子およびその誘導体を用いる、哺
乳動物内への移植の前に、神経幹細胞の増殖および分化、または前コンディショニング神経幹細胞を刺激することである。本方法のさらなる実施形態は、本明細書で記述したような神経疾患を処置するための方法、好ましくは、神経幹細胞が個体に投与される時に、神経保護効果を提供する方法において、これらの神経幹細胞を使用することである。
１つの実施形態において、幹細胞は、静脈内または動脈内で投与可能である。たとえば、脳虚血または外傷脳障害において、静脈内に注射された骨髄間質細胞が、脳内の領域を標的とすることが示された（Ｍａｈｍｏｏｄ．ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，４９，１１９６−２０３、議論１２０３−４、Ｌｕ．ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ．Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ，１８，８１３−９、Ｌｕ．ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｃｅｌｌ Ｔｅａｎｓｐｌａｎｔ，１１，２７５−８１、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５９，５１４−２３）。したがって、幹細胞は、ＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦ、または他の造血因子によってインビトロで処理し、ついで、本明細書で記述した任意の疾患の患者に、異なる経路を介して注射しうる。
本発明の１つの実施形態において、移植された幹細胞は、分泌される因子を発現し、近隣の細胞の生存を増強し、または成体内因性幹細胞の増殖および／または分化の増加を導くように、遺伝的に改変される。たとえば、幹細胞は、安定してＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、および／または１つまたはそれ以上のさらなる造血因子を発現するように遺伝的に改変され、ついで、局所環境に対して、ＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦ、または他の造血因子を常に分泌するように、中枢神経系に伝達されうる。
幹細胞を、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、および／または他の造血因子レセプターアゴニストで処理可能である。使用出来る幹細胞には、不死化幹細胞（たとえば不死化したがん遺伝子）、ニューロスフィア、胚幹細胞（ＥＳ）−由来神経細胞が含まれるが（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ（２００２），Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２５，３８１−４０７）、脊髄間質細胞、または臍帯細胞のような細胞も含まれうる（Ｌｕ．ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１１，２７５−８１、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，５９，５１４−２３）。種々の型の幹細胞の移植が、パーキンソン病（Ｉｓａｃｓｏｎ（２００２），Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ Ｂｕｌｌ，５７，８３９−４６）および脳梗塞（Ｋｏｎｄｚｉｏｌｋａ．ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｃｌｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，９，２２５−３０）を含む、種々の神経疾患で、治療的可能性がある。
幹細胞、たとえば、ヒト神経幹細胞を、移植の前に、コンディショニングするための因子で処理可能である。これらの調整因子の１つの例が、成長因子である。調整の１つの例が、望む細胞、たとえばニューロンの方向への分化である（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ．ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｂｒａｉｎ Ｐａｔｈｏｌ，９，４９９−５１３）。幹細胞上のＧＣＳＦレセプターの存在によって、これらの細胞を調整するためのこのレセプターに対するアゴニストの重要性が示唆される。成人神経幹細胞を、異なる濃度のＧＣＳＦ、または他のＧＣＳＦレセプターアゴニストで処理可能であり、定量的ＰＣＲアプローチによって、たとえば、神経幹細胞のマーカー（ネスチン）と比較した、神経マーカー（Ｍａｐ２、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、ニューロフィラメント、ＮｅｕＮ）の比を定量することによって、増加した分化潜在力に関してアッセイ可能である。処置の後に比が増加したならば、それは、神経系統への幹細胞の分化の増加の信号である。好適な濃度および時間ウインドウを使用して、神経疾患に対する、移植前の幹細胞を処置可能である。
本発明の他の実施形態において、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、これらの誘導体、ならびにＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦレセプターアゴニストを、たとえば神経幹細胞のような神経細胞の培養を促進するために使用可能である。本方法において、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、これ
らの誘導体、ならびにＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦレセプターアゴニストを、細胞を加える前に、培地中に加え、前混合可能であり、細胞が培養されている培地中に加えることも可能である。本方法の他の実施形態において、トランスフェクトしたときに、細胞内でそれぞれの因子を発現する、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、これらの誘導体をコードしているポリヌクレオチドを、神経細胞にトランスフェクトする。
投与／処方／用量
Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよび他の因子、誘導体、遺伝子およびそれらの組み合わせを、限定はしないが、液体溶液または懸濁液、錠剤、ピル、粉末、座薬、多重性マイクロカプセルまたはマイクロベシクル、リポソームおよび注射可能溶液または注入可能溶液を含む、種々の用量形態で投与しうる。好ましい形態は、投与の方法および治療適用に依存する。
組成物は、液体、スラリー、または使用する前に無菌注射可能溶媒中に溶解可能である無菌固体でありうる。非経口投与は、好ましくは静脈内投与である。この注射は、シリンジまたは同様の方法を介してでありうる。これは、医薬的に許容可能な担体を含みうる。あるいは、たとえばＧ−ＣＳＦを含む、組成物を、好適な用量で、粘膜経路で、および液体形態で、投与しうる。経口投与に関しては、たとえばＧ−ＣＳＦを含む組成物を、好適な担体と共に、液体、または固体形態で投与可能である。
処置すべき哺乳動物は、たとえばモルモット、イヌ、ネコ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、ヒツジ、サルまたはチンパンジーであり得る。１つの実施形態において、哺乳動物はヒトである。同様に、１つの実施形態において、治療または予防のために使用されるＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦのような造血因子は、ヒト因子であるか、またはヒト供給源から由来されるものである。
因子を単独または組み合わせいずれかで使用する場合に、神経疾患を処置する方法における使用のための、治療的に効果的な量の造血因子は、神経保護効果となる量で使用されるべきである。そのような量は、因子あたり、または組み合わせとして、約１００ｎｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、年齢、種、性別および個々の患者に基づく他の因子に基づいて決定可能である。たとえば、本方法で使用のためのＧＣＳＦの量は、約５〜約６０μｇ／ｋｇであり、ＧＭＣＳＦは、約５〜約７５０μｇ／ｋｇ体重である。因子を組み合わせで投与する場合、投与前に前混合してよく、同時に投与して良く、または連続して単独で投与してよい。
本明細書で記述したような神経状態を処置するある実施形態において、より高い用量のＧ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦが特に有用であり得、たとえば少なくとも１ｍｇ、少なくとも２ｍｇ、または少なくとも３ｍｇを使用可能であり、約１〜３ｍｇの範囲が好ましい。これらのより高い用量は、現在利用可能なパッケージングユニットを使用することによってでは、成人患者に対して都合良く実行可能ではない。したがって、１つの実施形態において、本発明は、とりわけ、本明細書での記述にしたがった神経保護の目的のために、たとえば静脈内または皮下で、投与しうる、２０〜２５０μｇ／ｋｇ体重の範囲での用量に関して、パッケージを提供する。高投与量組成物の伝達に有用なパッケージされたユニットの例には、たとえば、１．０ｍｌまたは２．０ｍｌの充填容量で、０．７５〜２５ｍｇ Ｇ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦを含む、使い捨てバイアルおよび前充填シリンジが含まれる。好ましい実施形態において、パッケージされたユニットはまた、そこに含まれる組成物（群）の伝達に関して、標識上または別の印刷されたものでの、取扱説明書も含みうる。
好ましいのはまた、患者の体重にしたがった、それぞれ個々の患者のために、実際およ
び迅速な用量を可能にする、ｋｇ／体重で調整したＧ−ＣＳＦおよび／またはＧＭ−ＣＳＦ投与のための前充填シリンジである。これらのパッケージングユニットは、緊急状態、たとえば、患者を、傷害の後に非常に迅速に処理しなければならない、脳梗塞の場合のような、緊急の場合に非常に有用である。したがって、本発明の他の実施形態は、傷害がおこった後短時間で、本明細書に記述したような１つまたはそれ以上の組成物の投与によって、たとえば、脳梗塞または他の神経外傷事象を受けている患者において、神経保護を提供することである。他の実施形態において、前充填シリンジのような、本明細書で記述した組成物はまた、特に傷害後短時間にのみ限定することなしに、傷害の後いつでも、投与／使用してもよい。
本実施形態の文脈で使用されるところの、「傷害後短時間（ａ ｓｈｏｒｔ ｔｉｍｅ
ａｆｔｅｒ ｉｎｊｕｒｙ）」は、傷害の発生、または傷害の原因である事象後、約１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、３０分間以内または約１時間までを意味する。組成物は、医療従事者、またはある場合は、適切な用量の因子（類）を含むパッケージングユニットにアクセスする、非医療従事者によって投与されうる。救急隊員、看護婦、医者などのような、医療従事者の場合、投与は、患者が、病院（または他の医学的機関）へ輸送される間、救急車内または他の乗り物内、または救急室のような病院内で、たとえば脳梗塞のような、神経外傷を受けた場所で実施されうる。理論に限定はせずに、傷害後短時間内での、Ｇ−ＣＳＧおよび／またはＧＭ−ＣＳＧ含有組成物のような、１つまたはそれ以上の造血因子の投与が、より大きな神経保護効果を達成しうる。
他の実施形態において、本発明はまた、埋め込みミニ−ポンプ、好ましくは皮下に埋め込まれた、徐放および一定長期間適用にとりわけ好適な器具を提供する（たとえば、Ｅｄｉｔｈ Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ、（Ｅｄ．）、Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ ｖｏｌ．２，ｐｐ．８９６−９２０，１９９９に記載されるような）。そのようなポンプは、インスリン治療で有用であることが知られている。そのようなポンプの例には、アニマス（Ａｎｉｍａｓ）、ダナ ダイアベケア（Ｄａｎａ Ｄｉａｂｅｃａｒｅ）、デルテック コズム（Ｄｅｌｔｅｃ Ｃｏｚｍ）、ディセトロニック スイスランド（Ｄｉｓｅｔｒｏｎｉｃ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、メドトロニック（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）、およびニプロ アミーゴ（Ｎｉｐｒｏ Ａｍｉｇｏ）によって製造／販売されているもの、ならびにたとえば、関連内容が、本明細書にて、参考文献によって組み込まれている、米国特許第５４７４５５２号、第６５５８３４５号、第６１２２５３６号、第５４９２５３４号および第６５５１２７６号にて記述されたものが含まれる。
本発明はまた、Ｇ−ＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦの内因性血清レベルを測定し、これに基づき、年齢および体重を考慮に入れて、適切な薬物量を計算し、注入する（たとえば、Ｒｅｎａｒｄ Ｅ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００２ Ｄｅｃ；２（６）：７０８−１６で記述されたような）器具も提供する。これは、たとえば、以上で記述したミニ−ポンプを用いることによる、長期基準、または短期基準で行われうる。そのような器具の例は、インスリン治療に関して、会社メドトロニックミニメット（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ ＭｉｎｉＭｅｄ、１８０００ Ｄｅｖｏｎｓｈｉｒｅ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ，ＣＡ ９１３２５−１２１９）によって作製される。ＧＣＳＦまたはＧＭＣＡＦ血清レベルの測定の方法は、たとえば、その関連の記述が、参考文献によって本明細書にて組み込まれている、米国特許第６，６３０，３５８号、第６，５３７，７４９号、第６，４７５，８０９号にて記述されたような、タンパク質チップまたはアレイを用いて実施可能である。
ポンプを用いた薬物送達および／またはＧＣＳＦおよび／またはＧＣＣＳＦの血清レベル検出と連結した薬物送達の上記実施形態は、慢性神経変性疾患、たとえば、パーキンソ
ン病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＣ）、痴呆などの処置のために、とりわけ有用でありうる。
投与経路には、たとえば、経口、皮下、経皮、皮内、直腸内、膣内、筋肉内、静脈内、動脈内、脳への直接注射および非経口を含む、典型的な経路が含まれうる。さらに、いくつかの例で、肺投与、たとえば肺スプレーおよび他の呼吸用形態が有用であり得る。
肺スプレーに加えて、鼻腔内（ＩＮ）送達（たとえば鼻腔スプレーによって）が、神経／精神状態に対する、本発明の組成物の送達の好ましい適用様式である。鼻腔内送達は、タンパク質およびペプチドの適用様式として利用するために非常に好適であり、とりわけ長期間の処置のための使用に非常によい。ペプチドまたはタンパク質を脳に適用するための、鼻腔内送達（鼻腔スプレー）が、（Ｌｙｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｔｒｏｖａｓ（２００２），Ｂｏｎｅ，３０，７１Ｓ−７４Ｓ、Ｄｈｉｌｌｏ ａｎｄ Ｂｌｏｏｍ（２００１），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，１，６５１−５、Ｔｈｏｒｎｅ ａｎｄ
Ｆｒｅｙ（２００１），Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｆｍａｃｏｋｉｎｅｔ，４０，９０７−４６、Ｔｉｒｕｃｈｅｒａｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ，１，４９−６６、Ｊｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ，５３，４０５−９、Ｌｅｍｅｒｅ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ Ａｇｉｎｇ，２３，９９１−１０００、Ｌａｗｒｅｎｃｅ（２００２），Ｌａｎｃｅｔ，３５９，１６７４、Ｌｉｕ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，３０８，９１−４）にて見られる。鼻腔内適用に関して、ＧＣＳＦ／ＧＭＣＳＦおよび本明細書で記述したような組成物を、鼻腔内皮の浸潤を増加させる、または鼻腔血管を広げる薬物のような、血管へ送達する、潅流を増加させる、などの溶媒、界面活性剤および物質と組み合わせることができる。
投与形態に基づいて、関連する相対的薬物動態学の考慮をした上で、用量をさらに改変可能であり、たとえば、脳への直接注射のために、用量はより低く、および、用量を、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦまたはその誘導体の局所アベイラビリティーに基づいて、絶対用量にて特定化可能である（たとえば５μｇ総用量）。好ましくは、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦおよび他の造血因子およびこれらの誘導体を、静脈内、皮下、または浸透圧ポンプで実施しうる直接大脳注射によって、投与する。
他の実施形態において、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦおよび他の造血因子およびこれらの誘導体は、これらの因子をコードしている、１つまたはそれ以上の核酸を投与することによって、個体に提供可能である。コード配列核酸は、好ましくは、ウイルスベクターのような、組換え体ベクターの形態で投与される。好適なベクターおよび発現制御配列、ならびにベクター構造の選択は公知である。たとえば、ウイルスベクターの例には、アデノウイルス（Ａｃｓａｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．７（２）：１２９−１４０（１９９６）、Ｑｕａｎｔｉｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９（７）：２５８１−２５８４（１９９２）、およびＲａｇｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６１（６４１３）；６４７−６５０（１９９３））、アデノ関連ウイルスベクター（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９（５）：４７０−４７５（１９９８））、レトロウイルスベクター（Ｆｅｄｅｒｉｃｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０（５）：４４８−４５３（１９９９））、単純ヘルペス（Ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ）ウイルスベクター（Ｌａｔｃｈｍａｎ，Ｇｅｎｅ ２６４（１）：１−９（２００１））、レンチウイルスベクター、Ｓｉｎｄｂｉｓウイルスベクター、またはセムリキ森林熱ウイルスベクターが含まれる。好適なベクターはまた、たとえばウイルスエピトープのような、神経細胞に接着しうるタンパク質を含むリポソームであり、ＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦをコードしている核酸、またはタンパク質またはオリゴヌクレオチドいずれかを含む。そのような伝達系の例は、ＨＶＪ−リポソー
ムである（Ｋａｎｅｄａ．ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，６，２１９−２６、Ｋａｎｅｄａ（１９９９），Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ，１６，１１９−２２）。好ましくは、タンパク質またはポリペプチドをコードしており、発現している、単離および精製核酸は、神経細胞での発現のために好適であるプロモーターに、動作可能に連結している。これら、および他の好適なベクターは、Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ７：３３−４０（２００１）、Ｓｏｍｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １：９１−９９（２０００）、およびｖａｎ Ｄｅｕｔｅｋｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ８：１３５−１４８（１９９８）で概説されている。
単離および精製核酸に対する、動作可能な結合のために好適なプロモーターが、本技術分野で公知である。好ましくは、ポリペプチドをコードしている単離および精製核酸は、筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター（Ｊａｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．６：２８５５−２８６４（１９８６））、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、テトラサイクリン／ドキソサイクリン−調節可能プロモーター（Ｇｏｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８９：５５４７−５５５１（１９９２））からなる群より選択されるプロモーターに動作可能に連結する。
一般的に、本発明のベクターの効果的な伝達を達成するために、投与経路の観点から、接触させるおよその細胞に基づいて、接触させる細胞あたりで約１〜約５，０００コピーのベクターを使用し、各細胞あたり約３〜約３００ｐｆｕが入ることがより好ましい。これらのウイルス量は、インビトロまたはインビボいずれかでの要求および使用にしたがって変化可能である。実際の用量およびスケジュールはまた、組成物を、他の組成物、たとえば医薬組成物との組み合わせで投与するのかどうかに依存して、または薬物動態学、薬物体内動態、および代謝の個々の違いに依存しても変化しうる。同様に、量は、細胞の特定の型、またはベクターを伝達させる方法に依存して、インビトロ適用で変化しうる。
以上で記述したタンパク質またはその誘導体、物質または核酸は、本技術分野で利用可能な標準の手順にしたがって、医療目的のために処方可能であり、たとえば、医薬的に許容可能な担体（または賦形剤）を加えることができる。担体または賦形剤は、活性成分に対する賦形剤または培地として利用可能である固体、半固体または液体物質であり得る。適切な形態および投与経路は、選択した製品の特別な特徴、処置すべき疾患または状態、疾病または状態の段階、および他の関連環境に基づいて選択可能である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．（１９９０））。医薬的に許容可能な担体または賦形剤の割合および性質は、選択した物質の溶解性および化学的特性、選択した投与経路および標準の医薬的実施によって決定される。医薬調製物は、経口、非経口または局所使用に適合してよく、錠剤、カプセル、座薬、溶液、懸濁液などの形態で、患者に投与しうる。効果的である成長因子、その誘導体、本発明のその配列をコードしている核酸は、安定性、結晶化の利便性、溶解性の増加などの目的で、酸添加塩または塩基添加塩のような、医薬的に許容可能な塩として処方および投与可能である。
いくつかの神経学的疾患、とりわけ虚血性疾患において、治療の開始を遅らせないことが、効果的な治療のため、重要である。好ましい実施形態において、本発明は、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦ、またはその誘導体、またはＳＴＡＴタンパク質を活性化する物質、またはＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦレセプターに対するアゴニストを、血管の閉塞後、または神経学的症状の開始、またはあるいは、虚血性事象の開始が検出された後、２４時間以内、好ましくは１０時間以内、もっとも好ましくは３〜６時間以内に投与される方法に関する。ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦがまた、長期機能改善に関して有効な効果を持つので、処置は、虚血損傷の可能性もある後、ある時間（たとえば損傷から１日〜７日）の時点で開始す
る。処置を、本発明者らの長期間の皮質性梗塞モデルにおいて、見られる機能的改善と同様に、患者の機能的回復を改善するための方法として、虚血事象の後、数日間および数週間続けてよい（図８を参照のこと）。処置は、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦまたは関連因子の安定状態底レベルに達するまで、一日あたり数用量（例えば短い静脈内注入）からなってよい。処置はまた、安定血清レベルを保証するために、記述した物質の連続的なゆっくりとした注入（たとえば潅流ユニットによって）も含んで良い。
パーキンソン病、または筋委縮性側索硬化症のような慢性神経変性プロセスの場合、処置には、ＧＣＳＦまたは関連因子の一日用量、または好ましくは、徐放処方、またはさらに安定なＧＣＳＦまたは関連因子の誘導体である可能性がある。
神経細胞上のＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦレセプターに結合する、神経保護物質に関するスクリーニング
本発明を実施するために、ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦの誘導体（たとえばＧＣＳＦ−またはＧＭＣＳＦ−類似物）、および／またはニューロンを保護するためのその潜在力を維持し、また、白血球における活性が減少し、それによって可能性ある副作用が減少する、他の造血因子が好ましい。したがって、本発明の１つの実施形態は、神経細胞上のＧＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦレセプターに結合し、本明細書で記述したような、ＧＭ−ＣＳＦまたはＧＣＳＦで観察された神経保護効果を刺激する、化合物に対して選別することである。
ＧＣＳＦの誘導体、たとえばＧＣＳＦ−類似体を、実施例１０で例示したような、インビトロ神経保護アッセイで試験可能である。本神経保護アッセイは、たとえば（ｉ）インターロイキン−１、酸素欠乏、Ａ４ペプチド、ＦＡＳリガンドのような他の傷害刺激、または（ｉｉ）たとえばＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞またはＰＣ１２細胞のようなニューロン様細胞などの、他の細胞、または（ｉｉｉ）ＤＮＡ−断片化、核濃縮、共トランスフェクトベータ−ガラクトシダーゼの活性、カスパーゼの蛍光発生基質の検出などのような、細胞生存または細胞死に関する他の読み出しに関して適合することによって、試験の基本原理を変化しないで、改変可能である。すべてのこれらの多数の適合は公知であり、また、ハイスループット系で使用してよい。ハイスループットスクリーニング技術は、大規模で、細胞の迅速な処理を規定するために、一般的に使用される。本アッセイで、陽性の神経保護効果を示している物質をさらに、たとえばＴｉａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８１，２５７−２５９で記述されたように、その顆粒球形成活性に関してさらに試験可能である。ＧＣＳＦ誘導体の選択は、好ましくは、公知のＧＣＳＦの形態によって誘発されるその効果との、試験物質によって誘発されるこれら２つの効果の比較に基づく。同様に、ＧＭＣＳＦの誘導体、たとえばＧＭＣＳＦ−類似体を、ＧＣＳＦに関して記述したように、インビトロ神経保護アッセイにて試験可能である。
さらなる神経保護物質を、試験物質へのこれらの細胞の曝露の後に、神経または神経様細胞（たとえば、ＰＣ１２、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ、ｈＮＴ、ＮＴ２、ｈｎ３３）中のＳＡＴＡ−３およびＳＴＡＴ−５を含む、ＳＴＡＴ−タンパク質のような、活性化転写因子の存在を測定することによって得ることが出来る。したがって、本発明の他の実施形態において、特定の物質または化合物の、ＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦレセプターに対するアゴニストとして働く能力を、本明細書にて記述したようなニューロン様細胞中の、ＳＴＡＴタンパク質、たとえばＳＴＡＴ３および／またはＳＴＡＴ５の活性化によって、そして、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）またはＴａｑｍａｎ（商標）解析による定量的ＰＣＲのような、従来の遺伝子発現アッセイを用いて、査定可能である。
活性化ＳＴＡＴタンパク質はリン酸化され（ｐＳＴＡＴ）、ウエスタンブロット、または免疫組織化学研究、またはＥＬＩＳＡにて、市販されているｐＳＴＡＴ−特異的抗体（サンタ クルズ バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ
ｇｙ））によって検出可能である。
あるいは、ＳＴＡＴ活性を、ルシフェラーゼ、ＳＥＡＰ（分泌アルカリホスファターゼ）、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、または他の一般的な遺伝子発現レポーターのような、レポーター遺伝子に連結した、ＳＴＡＴ−応答性プロモーター要素（たとえば、多重合化ＳＴＡＴ−３またはＳＴＡＴ−５結合要素のような、多重合化ＳＴＡＴ−結合要素）を含む、レポーター構築物を用いて測定可能である。細胞に、レポーター構築物をトランスフェクトした後、細胞を試験物質と接触させ、レポーター発現の量を同定可能である。ＳＴＡＴ活性を測定するこの方法は、ハイスループットフォーマットに適合可能である。
典型的なレポーターアッセイは、たとえば、市販されているアッセイ系（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのマーキュリー パスウェイ プロファイリング システム（Ｍｅｒｃｕｒｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ）、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのパス ディテクト−システム（Ｐａｔｈ Ｄｅｔｅｃｔ−Ｓｙｓｔｅｍ））を用いて実施可能である。実施可能なプロトコールの例は以下のようである。
細胞を、多ウェルプレート、たとえば９６ウェルプレート中、ウェルあたり２０．０００細胞培養する。細胞を撒いた２日後、培養培地を、血清を含まない培地（ウェルあたり４０μｌ）に変更し、細胞を、各細胞型を参照した最適条件下で、ＳＴＡＴ−結合要素およびレポータータンパク質（ＳＴＡＴ−３＿ホタル−ルシフェラーゼプラスミド、５０ｎｇ／ウェル）をコードしているレポータープラスミド、およびトランスフェクション対照プラスミド（レニラ−ルシフェラーゼ発現プラスミド、１０〜２０ｎｇ／ウェル）をトランスフェクト可能である（たとえば、推奨されたように、ＰＣ−１２細胞を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ２０００（商標）、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いるリポフェクションによってトランスフェクト可能である）。トランスフェクション４８〜７２時間後、アッセイを実施可能である。細胞を、広範囲の濃度をカバーすべき、多数の濃度にて、試験物質で刺激する。刺激の五分以内に開始する多数のアッセイ時間点を選択すべきである。ルシフェラーゼアッセイを用いる場合、読み出しはルミノメーター（Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）、プレートフォーマット（ベルソルド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）、Ｇｅｒｍａｎｙ）でアッセイし、レニラおよびホタルルシフェラーゼの活性を段階的に測定可能である。２つのルシフェラーゼ−活性の検出を、市販されている検出キット（デュアル ルシフェラーゼ レポーター アッセイ キット、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ルシフェラーゼ レポーター アッセイ キット、クロンテック（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ））を使用して実施する。ついでホタルルシフェラーゼの値を、レニラルシフェラーゼの値に対して標準化し、レポーター遺伝子の相対誘導を計算可能である。
スクリーニング法の他の例において、神経細胞上のＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦレセプターにおけるアゴニスト活性を使用し、測定可能である。たとえば、リガンド結合におけるホモ二量体化を、蛍光共鳴伝達エネルギー測定（ＦＲＥＴまたはＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー伝達）（Ｓｉｅｇｅｌ ＲＭ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ ＳＴＫＥ（２０００）２０００（３８）、Ｌ１、Ｘｕ Ｙ ｅｔ ａｌ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ（１９９９）９６（１）；１５１−６）、またはたとえば二重スイッチ系（第ＤＥ１０２１１０６３．８号）、β−ガラクトシダーゼレポーター系（Ｒｏｓｓｉ Ｆ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９７）９４（１６）：８４０５−１０）、またはスプリット−ユビキチン系（国際公開公報９５４２９１９５号、米国特許第５，５８５，２４５号、またはＪｏｈｎｓｓｏｎ，Ｎ．ａｎｄ Ｖａｒｓｈａｖｓｋｙ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ（１９９４）９１（２２）：１０３４０−４）のような、二量体化事象に関するレポーター系を用いることによって
アッセイ可能である。
さらに他に、ＧＣＳＦおよび／またはＧＭＣＳＦの脳−内因性レベルを含む、神経細胞上のＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦに結合する、神経保護物質に関するスクリーニングが、本発明で提供される。本明細書で記述され、以下の実施例で実証されるように、ＧＣＳＦならびにＧＭＣＳＦは、驚くべきことに、脳−内因性リガンドとして発見された。これらのリガンドは、脳の種々の虚血性状態によって誘導された。したがって、これらは、脳−内因性神経保護系の部分として働く。神経保護が、有効な治療原理であるような広範囲な状態に対して有効である、血液−脳関門を通過する、外因性に追加したＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦと同様に、ＧＣＳＦ／ＧＭＣＳＦの脳−内因性レベルを増加させる薬物が、これらの状態に対して有効である。
そのような物質を同定するためのスクリーニング系は、培養中の細胞、たとえば神経細胞、初代細胞または、ＰＣ１２細胞、ＳＨＳＹ５−細胞などのようなニューロン様不死化細胞へ、物質（たとえば大小分子ライブラリー）を加えること、およびＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦのレベルを測定すること、の基本方法で設定可能である。
ＧＣＳＦ／ＧＭＣＳＦのレベルを測定することは、（ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、および当業者に公知の他の技術によって）タンパク質自体をアッセイすることによって、（定量的ＰＣＲ、ノザンブロッティング、ＲＮＡｓｅ保護アッセイ、ＲＮＡドット−ブロッティング、および当業者に公知の他の技術のような）これらのタンパク質をコードしているｍＲＮＡをアッセイすることによって、またはＧＣＳＦ／ＧＭＣＳＦに対する遺伝子の調節因子の活性をアッセイすることによって、実施可能である。好ましくは、調節因子の活性は、プロモーター、エンハンサー、および／または（ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、または簡単にアッセイ可能な他のレポーティング遺伝子のような）ｃＤＮＡｓコードレポーターに共役したイントロン要素由来のＤＮＡ断片からなるレポーター構築物によってアッセイ可能である。これらのレポーター構築物は、安定または一過性いずれかで、細胞内にトランスフェクト可能である。
細胞を、生理学的状態下に置くか、またはさらに、（低酸素／グルコース欠乏、ＮＯドナー、グルタミン酸過剰およびその他のような）有害な刺激に曝露し、試験するそれぞれの物質の共存添加の影響を観察しうる。
同定した物質をさらに、この物質を動物に与え、脳内のＧＣＳＦ／ＧＭＣＳＦの含量を測定することによって、さらに評価可能である（たとえば定量的ＰＣＲによって）。
他の実施形態において、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦに対するレセプターの発現レベルを増加させることは、リガンドに対する細胞の応答性の増加のために有用であり得る。したがって、以上で概説したスクリーニングアッセイをまた、レセプター発現での増加に関して選別するために適合可能である。
本発明を一般的に記述すると、さらなる理解が、例示の目的のみのために、本明細書で提供され、他に特定しない限り制限の意味はない、ある特定の例に対する参考文献によって得ることが出来る。
（実施例）
本発明で実施される実験によって、ＧＣＳＦが、インビトロにて神経保護的であること、およびＧＣＳＦが、一過性局所性脳虚血の後、有意な閉塞減少効果を示すことが立証される。梗塞の末梢、および対局側のニューロンが、ＧＣＳＦレセプターに対する指標である、抗ＧＣＳＦＲ−抗体の特異的結合を示す。ニューロン上のＧＣＳＦＲの存在は新規で
あり、ウエスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、脳の詳細な免疫組織化学によって、および培養初代ニューロンにおけるＰＣＲおよび免疫組織化学によって、確認された。さらに、ＳＴＡＴ３の核転位によって判断されるような、ＳＴＡＴ３活性化が、対照と比較したときに、ＧＣＳＦ処置動物の周縁部のニューロンで有意に増加し、このことは、ＧＣＳＦＲ／ＳＴＡＴが活性の機構を仲介したことを示している。インビボ虚血実験（中大脳動脈閉塞、ＭＣＡＯ）において、両群を比較したときには、レーザードップラー計測（ｌｄｆ）によって測定したように、大脳血管流束には影響がなかった。ＭＣＡＯ実験の間、両群間で生理学的パラメータと体重減少に有意な差はなかった。死亡率は、ＭＣＡＯ実験において、対照と比較して、ＧＣＳＦで処理した動物で有意に改善された。好中球計測（ＮＧＣ）は、対照群に比較して、ＧＣＳＦ処置動物にて、２４時間後に有意に増加した。虚血半球への、好中球顆粒球（ＮＧｓ）の浸潤の測定として、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）−染色は、ＧＣＳＦ処置動物および対照間で、有意な差はなかった。
本実験で使用した静脈内送達ＧＣＳＦ（６０μｇ／ｋｇ／体重）の用量は、他の実験条件で使用した用量と同程度であった。以前に初期パイロットプロジェクトにて、安全性が試験され、有意な副作用は観察されなかった。この用量（６０μｇ／ｋｇ／体重）は、ヒト骨髄異形成および他の疾患の処置のために許可された用量より６倍高く、ラットモデルでは、明らかな副作用は見られなかった。
ＧＣＳＦで達成された５０％の梗塞減少効果は、全身適用後の、ｂＦＧＦまたはＩＧＦのような他の成長因子のものと同程度である（Ｆｉｓｈｅｒ Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｒｅｂ．Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ．，１９９５；１５：９５３−９、Ｓｃｈａｂｉｔｚ ＷＲ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ ２００１；３２：１２２６−３３）。グルコース欠乏および続く細胞のＣａ2+過剰負荷での興奮毒性ならびにアポトーシス、活性酸素種、および要求の増加（たとえば拡延性うつ病のような）に対するエネルギー貯蓄の減少が、虚血に続く神経細胞死の主な原因であるようである（Ｌｅｅ ＪＭ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９９；３９９（Ｓｕｐｐｌ）：Ａ７−１４）。実施例で示されたように、ＧＣＳＦは、インビボで、神経様細胞（ＮＧＦ−分化ＰＣ１２細胞）を、Ｈ2Ｏ2誘導細胞死より保護する。Ｈ2Ｏ2は、活性酸素種（ＲＯＳ）の産出によって酸化ストレスを誘発し、細胞死を誘引する。哺乳動物におけるＨ2Ｏ2−仲介細胞ストレスは、細胞表現系、用量、時間経過、および関与するシグナル伝達に関して、良く特性化されている。多数の研究における、Ｈ2Ｏ2の広範囲な利用によって、細胞におけるＨ2Ｏ2の効果として、アポトーシス機構が支持される（たとえば、ＦＡＳＥＢ Ｊ．２００２ Ｊａｎ；１６（１）：１１１−３、Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２００１；８２（３）：４３７−４４を参照のこと）。たとえば、プロ−アポトーシスキナーゼＡＳＫ１およびＦａｓＬｉｇａｎｄの役割が、Ｈ2Ｏ2−仲介細胞死で、もっともらしく立証された（Ｔｏｂｉｕｍｅ Ｋ．ＥＭＢＯ Ｒｅｐ ２００１ Ｍａｒ、２（３）：２２２−８、Ｋｗｏｎ．Ｄ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．２００１ Ｆｅｂ １；１１３（１）：１−９、Ｆａｃｃｈｉｎｅｔｔｉ，Ｆ．，Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｒｅｓ．２００２ Ｊｕｌ １５；６９（２）：１７８−８８）。したがって、ＧＣＳＦが、脳虚血にて誘引されるアポトーシス機構を干渉する可能性がある。ＧＣＳＦの作用は、おそらく、高親和性レセプターＧＣＳＦＲへ結合することによって仲介される。このレセプターとの相互作用が、Ｊａｎｕｓファミリーキナーゼ（ＪＡＫ）およびＳＴＡＴを活性化する（Ｄａｒｎｅｌｌ ＪＥ Ｊｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９７；２７７：１６３０−５）。ＪＡＫは、リガンド誘導レセプター二量体化にて活性となる、非レセプター型チロシンタンパク質キナーゼである。ＪＡＫのＧＣＳＦ誘導活性化により、保存チロシン残基上で、ＳＴＡＴがリン酸化され、ＳＴＡＴ二量体化が誘導される（Ｏｕｅｌｌｅ ＦＷ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９４；１４：４３３５−４１）。さらに、ＳＴＡＴｓは、核へ転位し、続いて遺伝子発現を調整する（Ｓｈｕａｉ Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ １９９３；３６６：５８０−３、Ｓｈｕａｉ Ｋ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０００；１９：２６
３８−４４）。ＳＴＡＴ３は、ＧＣＳＦＲによって活性化される主要なＳＴＡＴタンパク質である（Ｓｈｕａｉ Ｋ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０００；１９：２６３８−４４）。ＳＴＡＴ３は、ｂｃｌ−２を活性化することによって、抗アポトーシス機能を仲介し、ｃ−ｍｙｃ遺伝子をアップレギュレートすることによって、顆粒球の増殖および分化を誘導する（Ｆｕｋａｄａ Ｔ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ １９９６；５：４４９−６０、Ｓｈｉｍｏｚａｋｉ Ｋ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７；２７２：２５１８４−９）。免疫組織化学、ＲＴ−ＰＣＲおよびウエスタン−ブロットを用いることによって本明細書で示したように、ＧＣＳＦＲは、造血細胞だけでなく、ニューロン、グリア細胞、神経様細胞および神経幹細胞上でも存在する。さらに、周縁部のニューロンでのＧＣＳＦ誘導ＳＴＡＴ３アップレギュレーションが、ＢＤＮＦまたはｂＦＧＦに関して示されたように、ｂｃｌ−２アップレギュレーションのような抗アポトーシス効果を仲介し（Ｓｃｈａｂｉｔｚ
ＷＲ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ ２００１；３２：１２２６−３３）、生存するために、ニューロンの栄養支持を供給する。梗塞の周辺部でのＳＴＡＴ３の濃密な核標識は、すでに脳虚血の後の活性化マイクログリアに関して示された、細胞質から核へのＳＴＡＴ３の膜レセプター仲介転位を反映しうる（Ｐｌａｎａｓ ＡＭ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９６；８：２６１２−８）。ＧＣＳＦは、エフェクター機能の放出および増強、および好中球顆粒球（ＮＧＣ）のアポトーシス性細胞死を遅延させることによる、寿命の延長、全ての種類の感染に対する防御の体の第一線を刺激することが知られている（Ｈａｒｔｕｎｇ Ｔ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９８；５：２２１−５）。好中球は、微小血管を閉塞させ、続く白血球の浸潤が、タンパク質分解酵素、酸素フリーラジカル、インターロイキンおよびＴＮＦ−αの放出を誘因し、これは脳虚血後の閉塞サイズおよび結果を悪化させることが知られている効果である（Ｄｅｌ Ｚｏｐｐｏ ＧＪ，Ｓｔｒｏｋｅ １９９１；２２：１２７６−８３、Ｊｅａｎ ＷＣ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ １９９８；４３：１３８２−９６、Ｍａｔｓｕｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１９９４；６５６：３４４−５２）。一方、ＧＣＳＦは、有意な抗炎症効果を持ち、ＧＣＳＦは、末梢感染のモデルで、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−６およびＩＬ−８を減少させ、ＩＬ−１βレセプター−アンタゴニストを上昇させる（Ｇｏｒｇｅｎ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １９９２；１４９：９１８−２４、Ｈｅａｒｄ ＳＯ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１９９９；２７：１０１９−２１、Ｈｅａｒｄ ＳＯ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１９９８；２６：７４８−５４、Ｈｅｂｅｒｔ ＪＣ．ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｓｕｒｇ．１９９０；１２５：１０７５−８、Ｌｕｎｄｂｌａｄ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．１９９６；２４：８２０−６、Ｓｑｕａｄｒｉｔｏ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９７；１２０：３３３−９）。ＧＣＳＦは、健康なボランティアにて、インビトロおよびインビボでＴＮＦ−α放出を減少させ、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−８およびＩＬ−１βに対するアゴニストのレベルを上昇させる（Ｈａｒｔｕｎｇ Ｔ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｈｅｍａｔｏｌ １９９８；５：２２１−５、Ｇｏｒｇｅｎ Ｉ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２；１４９：９１８−２４、Ｈｅａｒｄ ＳＯ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １９９９；２７：１０１９−２１）。さらに、肺および回腸での好中球浸潤の減少が、ＧＣＳＦ投与および小腸の再潅流１５分後の、内臓虚血および再潅流のモデルで観察された（Ｓｑｕａｄｒｉｔｏ Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ １９９７；１２０：３３３−９）。これらの発見と一致して、総好中球顆粒球（ＮＧＣ）がＧＣＳＦ処置の後に増加するけれども、虚血半球への好中球浸潤の増加は、見られなかった。
成長因子、とりわけｂＦＧＦの他の可能性のある作用機構には、脳血管流束における効果が含まれる。ｂＦＧＦ処置は、全身低血圧を促進させず、したがって、周縁領域への血流を増加させる用量でさえ、虚血部周辺で、側枝を拡張する（Ｔａｎａｋａ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ １９９５；２６：２１５４−８、ディスカッション２１５８−９
）。しかしながら、本明細書で示すように、ＧＣＳＦ処置は、ＬＤＦによって測定したように、対照群と比較して、全身血圧を下げず、脳血流を変化させなかった。
光血栓ベンガルローズモデルにおいて、虚血後静脈内ＧＣＳＦ処置が、光血栓脳梗塞後６週で、神経運動機能結果を明らかに改善し、このことはさらに、成長因子が、インビボで、外傷脳障害後の回復および再生を誘導するという仮説を支持する。２つの他の化合物、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）および骨形成タンパク質−１（ＯＰ−１）が、局所性脳虚血の後、感覚運動機能を改善し、神経萌芽を誘導することが、以前に報告された（Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９９７；９４：８１７９−８４、Ｋａｗａｍａｔａ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ １９９８；９：１４４１−５、Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２０００；３９：８６０−５）。これらの研究のほとんどで、成長因子は、臨床的に適切ではない、脳室内へ投与された。ただＲａｍｉｒｅｚ ｅｔ ａｌ．（Ｒａｍｉｒｅｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，１０，１２０１−４）のみが、ｂＦＧＦの静脈内投与が、障害誘導海馬萌芽を支持することを報告したが、その著者らは、機能結果測定を研究しなかった。本明細書で提示されている結果によって、ＧＣＳＦ投与の臨床的に適切な用量プロトコールによって、脳虚血後の機能的回復が誘導されることが示される。可塑性の増強に関する能力は、虚血性脳傷害にあきらかに制限はされておらず、パーキンソン病、筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のような神経変性疾患、トリヌクレオチド繰り返し疾患、救急蘇生またはｉｎｔｒａｐａｒｔａｌ問題による脳虚血に対しても有用であり、おそらくまた、アルツハイマー病のような痴呆に、そして、統合失調症の神経変性の局面に対しても有用である。
脳虚血における実験のための方法の概説
虚血を、ラットにて、中大脳動脈の縫合梗塞モデル（９０分）を用いることによって誘導した。虚血の誘導の３０分後、動物（ｎ＝１２／群）に、９０分間静脈内に、６０μｇ／ｋｇ体重のＧＣＳＦ、または賦形剤を与えた。梗塞容量を、虚血２４時間後、ＴＴＣ（２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム クロライド）−染色に基づいて計算した。ＧＣＳＦＲの発現を、免疫組織化学によって研究し、ＲＴ−ＰＣＴおよび免疫ブロッティングによって確認した。ＳＴＡＴ３の発現を、免疫組織化学によって研究した。機能回復におけるＧＣＳＦの効力を、ベンガルローズ光血栓モデルで研究した。
統計解析
本研究で示した値は、平均値±ＳＥＭである。全てのデータを得た後、無作為コードを開示した。ＡＮＯＶＡおよび続く後知恵フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）保護最小有意差検定またはボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）の補正を使用して、インビトロデータおよび生理学的パラメータ、および試験バッテリーにおける機能結果に関する差違の統計学的有意性を決定した。ｔ−検定を解剖梗塞容量、ＭＰＯおよびＳＴＡＴ３免疫組織化学の比較のために使用した。Ｃｈｉ−Ｓｑｕａｒｅ検定を、死亡率データに関して実施した。ｐ値＜０．０５が統計学的に有意と判断された。
結果
ＧＣＳＦは、梗塞容量を、１３１，９６ｍｍ3±１１２，７ｍｍ3対対照群２７８，９ｍｍ3±９１．５６ｍｍ3（ｐ＜０．０５）まで減少させた。免疫組織化学、ウエスタンブロッティングおよびＲＴ−ＰＣＲによって、ニューロンおよびグリア細胞内でのＧＣＳＦレセプターの存在が明らかになった。ＧＣＳＦは、対照と比較して、梗塞の周辺部で、ＳＴＡＴ３を有意に活性化した（ｐ＜０．０５）。ＧＣＳＦは、ベンガルローズ光血栓のモデルでの虚血の後の機能的回復を改善することに効果的である。
したがって、ＧＣＳＦが、細胞培養中、および局所性脳虚血後、有意な神経保護効果を
持つことが示された。この効果は、ＧＣＳＦＲとの相互作用およびＳＴＡＴ３の活性化によって仲介されるとみられる。
局所性脳虚血
局所性脳虚血誘導のための手順（ＭＣＡＯ、中大脳動脈閉塞）
実験プロトコールは、地域倫理委員会によって承認された。体重２８０〜３２０ｇの２４匹の雄Ｗｉｓｔａｒラット（チャールズ リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、無作為に以下の群に割り当てた。Ａ（対照群，ｎ＝１２、９０分間虚血、２ｍｌ生理食塩水０．９％にて、血管閉塞の最初の３０分から９０分間処理）、Ｂ（ＧＣＳＦ群、ｎ＝１２、９０分間虚血、血管閉塞の最初の３０分から９０分間、２ｍｌ食塩水０．９％中に溶解した、６０μｇ／ｋｇ体重の組換え体ヒトＧＣＳＦ、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）、アムジェン（Ａｍｇｅｎ）、Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓで処理。または他の供給源からの任意のＧＣＳＦまたは誘導体または処方（たとえばロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）からのＬｅｎｏｇａｓｔｒｉｍ（商標）、または中外（Ｃｈｕｇａｉ）からのＧｒａｎｏｃｙｔｅ（商標）、またはＨＧＳによるＡｌｂｕｇｒａｎｉｎ（商標）、またはロッシュ／アムジェンからのＮｅｕｌａｓｔａ（商標））を本明細書で使用可能である。
ついで動物を、１００ｍｇ／ｋｇ体重ケタミンヒドロクロライド（ＷＤＴ、Ｇａｒｂｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の腹腔内注射によって麻酔した。麻酔を、必要ならば、５０ｍｇ／ｋｇ体重で維持した。ＰＥ−５０ポリエチレンチューブを、平均動脈血圧、血液ガス、ヘマトクリット値、白血球数、および血液グルコース濃度の連続モニタリングのために、右大腿動脈内に挿入した。処置注入のために、右大腿静脈に、ＰＥ−５０チューブをカテーテル挿入した。実験の間、直腸温度をモニタし、温度制御加温パッド（ホア メディカル インストゥルメンツ（Ｆｏｈｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって３７℃に維持した。一過性局所性脳虚血を、Ｚｅａ Ｌｏｎｇａ ｅｔ ａｌ．（Ｓｔｒｏｋｅ １９８９；２０：８４−９１）によって詳細に記述されたような、縫合梗塞モデルを用いて誘導した。簡単に記すと、右総頸動脈および右外部頚動脈を、中線首切開にて曝露した。シリコーン（バイヤー（Ｂａｙｅｒ），Ｇｅｒｍａｎｙ）でコートした４−０単一フィラメントナイロン縫合（エチコン（Ｅｔｈｉｃｏｎ）、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、総頚動脈中の動脈切断を介して挿入し、穏やかに、内部頚動脈内に進め、系頸動脈分岐部からおよそ１７ｍｍに配置した。この技術を用いて、縫合の先端で、近接前方脳動脈、ＭＣＡの由来、および後方交通動脈を一方的に閉塞した。ＭＣＡの領域での大きな梗塞が一般的に産出される。再潅流を、血管閉塞９０分後に、閉塞フィラメントの除去によって実施した。疑似手術動物も、以上で記述したものと同様の実験手順を施したが、ただし、ナイロンフィラメントは、総頚動脈下まで進めず、梗塞は発生しない。手術の後、カテーテルを取り除き、動物を麻酔から回復させ、適宜えさおよび水を与えた。
局所的脳血流の測定
レーザー−ドップラー計測（ＬＤＦ）（Ｐｅｒｉｆｌｕｘ ４００１ Ｍａｓｔｅｒ、ペリメドＡＢ（Ｐｅｒｉｍｅｄ ＡＢ）、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、ＭＣＡの閉塞前、間および後の、脳血流（ＣＢＦ）をモニタした。動物を定位固定フレームに配置した後、動物の頭蓋骨を曝露し、直径１．５ｍｍの穴を、ブレグマに対して右側４ｍｍ側面、２ｍｍ尾側上に、顕微鏡下でドリルであけた。硬膜はそのままにし、ＬＤＦプローブ（１．４ｍｍ直径）をギザギザ穴内にいれた。ＣＢＦモニタリングに関して選択した領域が、ラットでのＭＣＡ閉塞モデルの虚血性周辺部に相当する。
梗塞容量計算
ＭＣＡ閉塞２４時間後、ラットを、ケタミン１５０ｍｇ／ｋｇ体重で麻酔し、頭部を切断した。脳を刻み、２ｍｍの厚さの５冠状スライスに切断し、２，３，５−トリフェニルテトラゾリウム クロライド（ＴＴＣ）の２％溶液中、３７℃にて３０分間、インキュベートし、１０％緩衝ホルマリン溶液中に浸して固定した。ＴＴＣ−染色切片を、電荷共役器具カメラ（ＥＤＨ−１０００ＨＲ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｃａｍｅｒａ、エレクトリム社（Ｅｌｅｃｔｒｉｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｗｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）を用いて撮影した。割付をしらない調査員が、コンピュータ化イメージ解析器（Ｂｉｏ
Ｓｃａｎ Ｏｐｔｉｍａｓ、エドモンズ（Ｅｄｍｏｎｄｓ）、ＷＡ）にて、梗塞サイズを測定した。脳浮腫の効果を補正するために、訂正梗塞容量は、先に詳細に記述されたように計算した。訂正梗塞容量は、左半球領域−（右半球領域−梗塞面積）に等しい（Ｓｃｈａｂｉｔｚ ＷＲ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｒｏｋｅ ２００１；３２：１２２６−３３）。梗塞容量は、対側半球の割合として示した。
虚血実験
ＧＣＳＦは、局所性脳虚血後、強力な脳保護効果を達成した。腹腔内ＧＣＳＦ処置動物での平均梗塞容量は１３１，９６ｍｍ3±１１２，７ｍｍ3であり、一方、対照群では、２７８．９ｍｍ3±９１．５６ｍｍ3であり、また全半球の９．９６±８．３１％（ｎ＝１２）対２２．７±６．６９％であった（ｐ＜０．０５、図１）。
ＧＣＳＦ処置は、死亡率を有意に減少させた。対照群で４匹の動物、ＧＣＳＦ処置群で１匹が、２４時間再潅流期間に死亡した（ｐ＜０．０５）。すべての動物の直腸温度、ｐＨ、ｐＣＯ2、ｐＯ2、ヘマトクリット値（ｈｃｔ）、血液グルコース、心拍数、平均動脈圧および体重に関して、対照およびＧＣＳＦ処置群にて統計学的な差はなかった（表１）。末梢血の白血球数が、対照と比較して、ＧＣＳＦ処置動物にて、虚血後２４時間で、有意に増加した（ｐ＜０．０５、表１）。
Figure 0004733521
ＬＤＦ−モニタリングによっては、２つの処置群間で、統計学的差は示されなかった（データは示していない）。
局所性脳虚血に関する免疫組織化学
使用した免疫組織化学法
ＳＴＡＴ３活性化（図６）および梗塞脳におけるＧＣＳＦＲ分布の形態学的解析、および好中球顆粒球の数のために、ＧＣＳＦ処置動物および対照の２−ｍｍ厚脳スライスを、２４時間、０．１ｍｏｌ／ｌのリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒド中で浸潤固定した（各群ｎ＝５）。パラフィン−包埋後、１−μｍ厚の切片を切断し、Ｈ＆Ｅ染色、Ｎｉｓｓｌ染色および免疫組織化学的解析のために使用した。
免疫組織化学的研究を、ミエロペルオキシダーゼ（ＤＡＫＯ、カルピンテリア（Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ），ＣＡ、ＵＳＡ）、グリア繊維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（ＤＡＫＯ、カルピンテリア、ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧＣＳＦＲ（サンタ クルズ バイオテクノロジーズ社（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．），Ｓａｎｔ
Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＳＴＡＴ３（サンタ クルズ バイオテクノロジーズ社，Ｓａｎｔ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）に対する抗血清を用いて実施した。抗原回復のために、ＧＣＳＦＲおよびＳＴＡＴ３免疫組織化学のために提供された切片を、９９℃にて、１０ｍＭ クエン酸緩衝液中で２０分間熱した。ついで切片を、通常のブタ血清（リン酸緩衝生理食塩水中１０％）中で、３０分間インキュベートし、ついで１次抗血清中で、４℃一晩インキュベートした。１次抗体は、１：１５０（ミエロペルオキシダーゼ）、１：４００（ＧＦＡＰ）、１：４００（ＧＣＳＦＲ）、および１：１００（ＳＴＡＴ３）にそれぞれ希釈した。免疫活性は、アビジンビオチン複合法（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ、ベクター ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＵＳＡ）にて視覚化した。切片を、０．０２％過酸化水素にて、０．０２％ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）中で現像した。反応産物を、０．０２％塩化コバルトおよび硫酸ニッケルアンモニウムを添加することで増強した。対照スライドのサブセットにて、それぞれのペプチドでのＧＣＳＦＲ抗血清の前吸着によっては、免疫染色されなかった（示していない）。１次抗血清を省略した場合、免疫染色はいずれも産出されなかった（示していない）。
好中球顆粒球（ＮＧ）の浸潤を、梗塞半球あたりのＮＧｓを計数することで定量的に測定した。ＳＴＡＴ３タンパク質発現を、頭頂葉皮質の梗塞のｖｉｎｃｉｎｉｔｙでの２つの重なり合った領域ロストロ尾側、および相当する対側で定量した（倍率×４００）。このために、核転位したニューロンを計数し、全てのニューロンからのＳＴＡＴ３陽性ニューロンの割合を得た。
局所性脳虚血における免疫組織化学実験の結果
ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）染色により、両群の非虚血半球における好中球顆粒球（ＮＧｓ）は検出されなかった。ＭＰＯ染色は、虚血半球における定量ＭＰＯ陽性細胞に基づいて、ＧＣＳＦ処置動物および対照で有意な差はなかった（１４±１７．６対１４．３±１２．５、ｎ．ｓ．）。
ＧＦＡＰ免疫応答性（ＩＲ）が、非拘束半球の皮質、線状体および灰白色にわたる、分散星状突起にて存在した。未処置およびＧＣＳＦ処置ラット両方で、皮質性梗塞周辺領域にて、ＧＦＡＰ染色のパターンおよび強度に差は検出されなかった。とりわけ、ＧＦＡＰ
ＩＲは、皮質周縁部、またプラセボ群、さらにＧＣＳＦ群で増加しなかった（示していない）。梗塞コア内で、散在性ＧＦＡＰ免疫活性星状細胞が観察された（示していない）。
免疫組織化学的に、ＧＣＳＦＲに対する染色が、未処置およびＧＣＳＦ処置動物両方で、散在皮質ニューロンおよび神経突起で検出された（示していない）。グリア細胞もまた、ＧＣＳＦ−Ｒ抗体で染色された（示していない）。梗塞コアにて、ＧＣＳＦ−Ｒ免疫活
性細胞は見られなかった。２つの実験群間で、ＧＣＳＦ−Ｒ ＩＲのパターンおよび強度の差は見られなかった。
ＳＴＡＴ３ ＩＲが、プラセボおよびＧＣＳＦ処置ラット両方の、未梗塞半球内の、ニューロンおよびグリア細胞の散在核にて見られた。細胞質染色も、２，３の散在ニューロンで見られた。ＳＴＡＴ３タンパク質発現が、未処置対照と比較して、梗塞の周縁部で、ＧＣＳＦ処置後に増加した（３４．４±７．０５対１３．７±４．４；ｐ＜０．０００３）（図６、７）。対側では差がなかった（１６．２±６．９対１３．３±６．９、ｎ．ｓ．）。
局所性脳虚血に関するウエスタンブロットおよびＰＣＲ
ウエスタンブロット（図３）
免疫ブロッティングのために、脳組織（２時間の一過性虚血）を、２０容量（ｗ／ｖ）の均質化緩衝液（３２０ｍＭ スクロース、０．１ｍＭ フェニルメチルスルホニル フルオリド、および２μｇ／ｍｌ ペプスタチン）中、４℃にて溶解した。ホモジネートを９，２００Ｇ、４℃にて１５分間遠心した。ペレットを１／１０の均質化容量に再懸濁させた後、タンパク質決定（Ｂｉｏ−Ｒａｄタンパク質−アッセイ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のための一部をわけ、試料を酸化窒素中ですぐに凍結させ、−７０℃に保存した。レーンあたり１５μｇのタンパク質を、４Ｍ尿素を含む８％ＳＤＳポリアクリルアミドゲルにのせ、標準の条件で電気泳動した。タンパク質を、半乾ブロッティングによって、電気的にＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（商標）膜（ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．），Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に写した。ＴＢＳＴ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ塩基、ｐＨ７．６、１３７ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０）中の３％脱脂粉乳による、室温（ＲＴ）での１時間のブロッキングの後、膜を、１次ＧＣＳＦＲ抗体（１：５００）とともに、一晩、４℃にてインキュベートした。ＴＢＳＴ中での洗浄後、膜を、ＲＴにて１時間、適切なセイヨウワサビペルオキシダーゼ−共役2次抗体の１：２，０００希釈とともにインキュベートした。免疫活性バンドを、増強化学発光（アマシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｌ．）、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて、直線範囲で視覚化した。
皮質抽出物での免疫ブロッティング実験（図３）にて、ＧＣＳＦ−Ｒ抗血清が、およそ１３０ｋＤのタンパク質バンドを検出し、これは、推定分子量と等しい（Ｆｕｋｕｎａｇａ Ｒ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ １９９０；２６５：１４００８−１５）。さらに、より小さな分子量の２、３のバンドがみられ、おそらく、分解産物を示している。ＧＣＳＦＲ抗血清の、それぞれのペプチドとの前吸着後には、バンドは消えた（図３）。
脳内のＧＣＳＦレセプターに対するＰＣＲ（図２Ａ）
ラットを深く麻酔にかけ、心臓を通して潅流させた後、脳をすぐに解剖した。ＲＮＡを、取扱説明書にしたがって、ＲＮＡ−クリーンキット（ＡＧＳ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、脳より抽出した。計１０μｇのＲＮＡを、ＭＭＬＶ逆転写酵素およびランダムヘキサマーで、逆転写した。ＰＣＲのために、マウスＧＣＳＦＲのエキソン５と７からの以下のプライマーを使用した。センス、５’−ＣＣＣ ＣＴＣ ＡＡＡ
ＣＣＴ ＡＴＣ ＣＴＧ ＣＣＴ Ｃ−３’（配列番号５）およびアンチセンス５’−ＴＣＣ ＡＧＧ ＣＡＧ ＡＧＡ ＴＣＡ ＧＣＧ ＡＡＴ Ｇ−３’（配列番号６）（Ａｓｈｉｈａｒａ Ｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ １９９７；１７１：３４３−５６）。ＰＣＲは、以下のプロトコールにしたがって実施した。３分間９４℃、１分間９４℃、１分間５８℃および１分間７２℃（４０サイクル）。産物を２％アガロースゲル上で解析した。
マウスＧＣＳＦＲに特異的なＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＧＣＳＦ−Ｒ ｍＲＮＡを脳組織中で検出した（図２Ａ）。ＰＣＲ産物は、５６７ｂｐの予測サイズであった。同定は、ＰＣＲ産物の配列決定によって確認した（図２）。
ＡＬＳモデルにおけるＧＣＳＦ効果
ＡＬＳマウスモデルにおける生存試験
先の実験により、ＡＬＳのＳＯＤ１マウスモデルが、ヒトにおける治療の成功を予想するものであることが示された（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ａｎｄ Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ（２００１），Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ，２，８０６−１９）。そのような解析での主要評価項目は、運動兆候の開始であり、死亡率である。たとえば、運動兆候の開始は、２０ｒｐｍのスピードで、７分間、マウスが回転したままいられない最初の日と定義可能である（Ｌｉ ｅｔ ａｌ（２０００），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８，３３５−９）。死亡率は、死亡の日、またはマウスが犠牲死されるべきほど障害が重症である日としてスコアする（例えば、無気力および正常に戻ることが不可能）。追加パラメータは、グリップ力試験による運動強度の測定、骨髄中の運動ニューロンの数、神経厚（たとえば、座骨神経、横隔神経）、および骨髄運動ニューロン中のアポトーシス染色の存在によって決定される。ＧＣＳＦは、先に決めた用量、たとえば６０ｕｇ／ｋｇ体重／日で、脳室内へ、浸透圧ポンプを介して注入可能である。あるいは、ＧＣＳＦは、６０ｕｇ／ｋｇ体重／日の用量、またはそれ以上の用量で、静脈内、または腹腔内注射で与える。あるいは、ＣＧＳＦの徐放形態、たとえばＰＥＧ処方（上記を参照のこと）、またはアルブミン処方（上記を参照のこと）、または他の徐放形態のようなものを投与する。あるいは、他の供給源（他の製造会社（たとえば、ロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）からのＬＥＮＯＧＡＳＴＲＩＭ（商標）、中外製薬（Ｃｈｕｇａｉ Ｐｈａｒｍａ、Ｃｏ．Ｌｔｄ）からのＧＲＡＮＯＣＹＴＥ（商標）、ヒューマン ゲノム サイエンセス（Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）からのＡＬＢＵＧＲＡＮＩＮ（商標）、またはロッシュ／アムジェン（Ｒｏｃｈｅ／Ａｍｇｅｎ）からのＮＥＵＬＡＳＴＡ（商標））のＧＣＳＦ処置または誘導体または処方を使用する。処置はＳＯＤ１ Ｇ９３Ａ変異体の後期発症前段階で、６０日目に開始する。未処理家族性ＡＬＳマウスにおいて、運動欠陥が、１２〜１４週齢で見られ、麻痺は、２０週齢前には観察されなかった。生存予測は１４０〜１７０日である。効果的な処置によって、１５％以上まで、対照群に比べて生存が延長されるべきである（Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ ａｎｄ Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ （２００１），Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２，８０６−１９）。処置のための対照群として、賦形剤およびｚＶＡＤｆｍｋ（本モデルで効果を示した、強力なカスパーゼ阻害剤）両方の処置動物を使用しうる。各群は、１０動物をそれぞれ含む。
パーキンソンモデルにおけるＧＣＳＦ効果
パーキンソン病の種々の齧歯類モデルが利用可能であり、ＧＣＳＦの効果研究に好適である（Ｇｒｕｎｂｌａｔｔ．ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｊ Ｎｅｕｒｏｌ，２４７ Ｓｕｐｐｌ ２，ＩＩ９５−１０２）。１つの良く特性化されているモデルは、１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）の使用である。４投与のＭＰＴＰ−ＨＣｌ（投与あたり１５ｍｇ／ｋｇ）を、２時間の間隔で、腹腔内注射を介して、８週齢オスマウス（ｎ＝２０）に与えることが出来る。疑似処置動物には生理食塩水を与えた。ＭＰＴＰ処置、および最後のＭＰＴＰ処置７日後に、ＧＣＳＦの毎日投与（静脈内、６０ｕｇ／ｋｇ体重）両方を与えた２０匹の動物を犠牲死させた。この時点まで、マウスを、両方の運動パラメータ（回転パフォーマンス、自由な移動運動）に関して解析する。各１０匹のマウスの脳を、免疫組織化学のために処理し、チロシンハイドロキシラーゼまたはドーパミントランスポーターに関して陽性である、黒質中のニューロン
の総数（市販されている抗体を使用して）、アポトーシス−陽性ニューロンの数（ＴＵＮＥＬ染色、カスパーゼ−３染色）をアッセイする。ＭＰＴＰ処置後、残っているドーパミン性ニューロンを、ＭＰＴＰ＋ＧＣＳＦを受けた動物、および疑似群と比較する。
各群残りの１０動物を、生理食塩水で心臓を介して潅流し、犠牲死させ、線条体を解剖した。この線条体を、氷上で均質化し、ドーパミン含量を、電気化学検出をともなうＨＰＬＣによって測定した。これらの群の比較により、黒質中の細胞欠損による、ドーパミン欠落の良好な測定が提供される。
この実験はまた、ＭＰＴＰの異なる投与計画（すなわち、４０ｍｇ／ｋｇ体重一回、３０ｍｇ／ｋｇ体重２回など）を用いて実施可能である。
ＧＣＳＦは、光血栓脳虚血後の感覚−運動機能を改善する（図８）
実験群
実験プロトコールは、地域倫理委員会によって承認された。体重２８０〜３２０ｇのオスＷｉｓｔａｒラット（チャールズ リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、無作為に以下の群に割り当てた。Ａ（対照群，ｎ＝６）、虚血、０．５ｍｌ生理食塩水０．９％にて、虚血１時間後に開始し、静脈内ボーラス注入として処理。Ｂ（ＧＣＳＦ群、ｎ＝６）、虚血１時間後に開始し、０．５ｍｌ食塩水０．９％中に溶解した５μｇ ＧＣＳＦ（アムジェン（Ａｍｇｅｎ））で、静脈内ボーラス注入として処理。あるいは、他の供給源からの任意のＧＣＳＦまたは誘導体または処方（他の製造会社（たとえばロッシュ（Ｒｏｃｈｅ）からのＬｅｎｏｇａｓｔｒｉｍ（商標）、または中外（Ｃｈｕｇａｉ）からのＧｒａｎｏｃｙｔｅ（商標）、またはＨＧＳによるＡｌｂｕｇｒａｎｉｎ（商標）、またはロッシュ／アムジェンからのＮｅｕｌａｓｔａ（商標））を本明細書で使用可能である。１〜５日の時点で続く尾静脈を介した繰り返し静脈内ボーラス注入。Ｃ（疑似手術群、ｎ＝６）、疑似手術、虚血なし、０．５ｍｌ生理食塩水０．９％にて、虚血１時間後に開始し、静脈内ボーラス注入として処理。
光血栓による局所性脳虚血
動物を、１００ｍｇ／ｋｇ体重のケタミンヒドロクロライド（ＷＤＴ、Ｇａｒｂｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の筋肉内注射によって麻酔した。麻酔を、必要ならば、５０ｍｇ／ｋｇ体重で維持した。ＰＥ−５０ポリエチレンチューブを、平均動脈血圧、血液ガスの連続モニタリングのために、右大腿動脈内に挿入した。処置注入のために、右大腿静脈を、ＰＥ−５０チューブによってカテーテル挿入した。実験の間、直腸温度をモニタし、温度制御加温パッド（ホア メディカル インストゥルメンツ（Ｆｏｈｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって３７℃に維持した。
光血栓虚血を、Ｗａｔｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｗａｔｓｏｎ ＢＤ，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ
ＷＤ，Ｂｕｓｔｏ Ｒ，Ｗａｃｈｔｅｌ ＭＳ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ ＭＤ．「光化学的開始血栓による、再現可能脳梗塞の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｂｒａｉｎ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｂｙ ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ
ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．）」Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．１９８５；１７：４９７−５０４）の方法にしたがって、右ラット頭頂葉皮質にて誘導した。動物を、ケタミンヒドロクロライドにて麻酔し、定位固定フレームに配置し、皮膚表面の曝露のために頭皮を切開した。照明のために、１．５−ｍｍ絞りを持つ、繊維−光学束を、ブレグマに対して頭蓋骨４ｍｍ後部および中線から４ｍｍ側面上に、定位配置した。頭蓋骨を、冷、白色ビーム（１５０Ｗ）で２０分間照明した。照明の最初の二分間、色素ローズベンガル（０．１３３ｍＬ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｍＬ生理食塩水）を静脈注射した。疑似手術動物も、ローズベンガルの注入と照明以外、上記と同様の実験手順を施した。手術後
、カテーテルを取り除き、動物を麻酔から回復させ、適宜えさと水を与えた。
行動試験
全ての動物で、行動試験のバッテリーを、実験群に関して知らない調査員によって、虚血前、ベースラインおよび虚血後２、３、４、５および６週後に実施した。ロータロッド試験のために、ラットを、加速ロータロッドシリンダーにおき、動物がロータロッド上に残っていた時間を測定した（Ｈａｍｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ １９９４ Ａｐｒ；１１（２）：１８７−９６、Ｃｈｅｎ Ｊ．Ｌｉ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｚｈａｎｇ Ｚ，Ｌｕ Ｄ，Ｌｕ Ｍ，Ｃｈｏｐｐ Ｍ．「ラットにおける脳虚血後の、骨髄間質細胞の静脈内投与の治療利点（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｂｅｎｅｆｉｔ ｏｆ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ Ａｆｔｅｒ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ Ｒａｔｓ．）」Ｓｔｒｏｋｅ．２００１；３２：１００５）。速度を、５分以内に、４ｒｐｍから４０ｒｐｍまでゆっくり増加させた。動物が横木から落ちるか、器具に捕まるか、横木上を歩くことを試みることなく２連続回転のあいだ回転する場合に、試験を終えた。時間の任意制限を、トレーニング中、ならびに試験手順中、ロータロッドシリンダー上で、５００秒にてラットに対して設定した。動物を、虚血３日前に試験した。器具上平均期間（秒）を、手術の一日前に、３回のロータロッド測定で記録した。運動試験データは、内部ベースライン対照（手術前）と比較して、ロータロッド上の平均期間（３試験）の割合として表す。
接着−除去試験に関して、体知覚欠損を、虚血前および後両方で測定した（Ｓｃｈａｌｌｅｒｔ Ｔ，Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ ＤＡ，Ｈｕｍｍ ＪＬ，Ｃｏｃｋ ＲＲ．「機能の回復における使用依存構造的事象（Ｕｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ
ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．）」Ａｄｖ Ｎｅｕｒｏｌ．１９９７；７３：２２９−２３８、Ｃｈｅｎ Ｊ．Ｌｉ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｚｈａｎｇ Ｚ，Ｌｕ Ｄ，Ｌｕ Ｍ，Ｃｈｏｐｐ Ｍ．「ラットにおける脳虚血後の、骨髄間質細胞の静脈内投与の治療利点（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｂｅｎｅｆｉｔ ｏｆ
Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ Ａｆｔｅｒ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｉｓｃｈｅｍｉａ
ｉｎ Ｒａｔｓ．）」Ｓｔｒｏｋｅ．２００１；３２：１００５）。全てのラットを、試験環境に慣れされた。最初の試験で、（等しい大きさの、１１３．１ｍｍ2）接着−支持紙ドットの２つの小さな部分を、各四肢の手首上の末梢−放射状領域を占領している両側触覚刺激として使用した。ついでラットをケージに戻した。それぞれの刺激が、四肢から取り除かれるまでの時間を、各前足に関して、一日あたり５回の試験で記録した。個々の試験は少なくとも５分間隔てた。手術の前に、動物を３日間訓練した。ラットが、１０秒以内にドットを除去可能であったらば、虚血に供した。
神経重症度スコア（ＮＳＳ）を、Ｃｈｅｎ Ｊ．Ｌｉ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｚｈａｎｇ
Ｚ，Ｌｕ Ｄ，Ｌｕ Ｍ，Ｃｈｏｐｐ Ｍ．「ラットにおける脳虚血後の、骨髄間質細胞の静脈内投与の治療利点（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｂｅｎｅｆｉｔ ｏｆ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ Ａｆｔｅｒ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ Ｒａｔｓ．）」Ｓｔｒｏｋｅ．２００１；３２：１００５、およびＳｃｈａｌｌｅｒｔ Ｔ，Ｋｏｚｌｏｗｓｋｉ ＤＡ，Ｈｕｍｍ ＪＬ，Ｃｏｃｋｅ ＲＲ．「機能の回復における使用依存構造的事象（Ｕｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎ．）」Ａｄｖ Ｎｅｕｒｏｌ．１９９７；７３：２２９−２３８にしたがって改変した。神経機能を、０〜１６のスコアで格付けした（正常スコア、０；最大欠損スコア、１６）。ＮＳＳは、運動、知覚、反射およびバランス試験の合成物である（Ｃｈｅｎ Ｊ．Ｌｉ Ｙ，Ｗａｎｇ Ｌ，Ｚｈａｎ
ｇ Ｚ，Ｌｕ Ｄ，Ｌｕ Ｍ，Ｃｈｏｐｐ Ｍ．「ラットにおける脳虚血後の、骨髄間質細胞の静脈内投与の治療利点（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｂｅｎｅｆｉｔ ｏｆ Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｏｎｅ Ｍａｒｒｏｗ Ｓｔｒｏｍａｌ Ｃｅｌｌｓ Ａｆｔｅｒ Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｉｓｃｈｅｍｉａ ｉｎ Ｒａｔｓ．）」Ｓｔｒｏｋｅ．２００１；３２：１００５、Ｇｅｒｍａｎｏ ＡＦ，Ｄｉｘｏｎ ＣＥ，ｄ’Ａｖｅｌｌａ Ｄ，Ｈａｙｅｓ ＲＬ，Ｔｏｍａｓｅｌｌｏ Ｆ．「ラットにおける、実験的くも膜下出血に続く行動欠損（Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ ｄｅｆｉｃｉｔｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｓｕｂａｒａｃｈｎｏｉｄ
ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔ．）」、Ｊ Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ．１９９４；１１：３４５−３５３）。傷害の重症度スコアにて、１スコア点を、試験を実施不可能である、または試験した反射の欠如に与え、したがって、より高いスコアが、傷害がより重度である。
結果
すべての動物に関して、直腸温度、ｐＨ、ｐＣＯ2、ｐＯ2、ヘマトクリット（ｈｃｔ）値、血液グルコース、心拍数、平均動脈圧、体重および死亡率について、群間で統計学的差はなかった（データは示さない）。
ＧＣＳＦ処置動物における機能回復は、すべての他の群と比較して、長期間、あきらかによかった。ＧＣＳＦ処置動物は、対照群と比較して、実験の間、Ｂｅａｍ−Ｂａｌａｎｃｅを含む、有意により低いＮＳＳスコアを持ち（ｐ＜０．００１、図８ｂ）、結果として、対照と比べて、有意によいロータロッドパフォーマンスとなった（Ｐ＜０．０５、図８ａ）。接着テープ除去によって測定するような体知覚機能もまた、対照と比較して、長時間、対側側前足において、ならびに６週の時点で同側前足において、ＧＣＳＦ処置動物にてよりよかった（図８ｃ、ｄを参照のこと）。
ＧＣＳＦレセプターは、脳虚血の光血栓モデルにてアップレギュレートされる
ＲＮＡを、標準のプロトコール（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ（１９８７），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６２，１５６−１５９）にしたがって単離し、続いて、傷害側に対して、同側および対側、ラット皮質周縁部試料より、Ｑｉａｇｅｎ
ＲＮｅａｓｙ（商標）ミニキットで精製した（組織試料の局在に関して、図９ａを参照のこと、ここで３対４）。ｃＤＮＡを、オリゴｄＴプライマー、標準の条件を用いたスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を用いて、１μｇのトータルＲＮＡより合成した。定量的ＰＣＲを、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）システム（ロッシュ ダイアグノスティクス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＤＮＡ二本鎖のＳＹＢＲグリーン染色にて実施した。サイクル条件は以下のようであった。５分間９５℃、５秒間９５℃、７秒間６６℃、３０秒間７２℃、９秒間８４℃、５５サイクル。融解曲線を、以下のパラメータで実施した。９５℃から５０℃まで冷却、０．２℃／秒にて９９℃まで傾斜。以下のプライマー対を使用した。「ラットＧＣＳＦＲ−ｆｒａｇ−３２ｓ」ＣＣＡＴＴＧＴＣＣＡＴＣＴＴＧＧＧＧＡＴＣ（配列番号７）、および「ラットＧＣＳＦＲ−ｆｒａｇ−２６５ａｓ」ＣＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＴＧＴＴＣＣＡＴＧ（配列番号８）。Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ＰＣＲを、製造業者（ロッシュ ダイアグノシス）の推奨にしたがって、ＳＹＢＲグリーンマスターミックスを用いて実施した。産物と特異性を、融解点解析およびアガロースゲル電気泳動によって確認した。試料のｃＤＮＡ含量を、Ｃｙｃｌｏｐｈｏｌｉｎの発現レベルに対して標準化した（プライマー「ｃｙｃ５」ＡＣＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＧＡＣ（配列番号９）、「ａｃｙｃ３００」ＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧ（配列番号１０））。相対的調整レベルを、シクロフィリンに対する標準化の後に導き、疑似手術動物と比較した。図９ｂは、対側における４８時間後のＧＣＳＦＲのアップ
レギュレーションを示しており、エラーバーは、標準偏差を示し、これらは、３倍連続希釈ｃＤＮＡ−試料から計算し、測定の信頼性を反映している。
ＧＣＳＦレセプターは、初代培養中の神経細胞上に存在する：免疫細胞化学
ニューロンの調製
１０〜１２個の皮質を、ステージＥ１８（１８日胚齢）の胚より調製した。組織をＨＢＳＳ（ハンクスバランス塩溶液、バイオ ウイズアッカー（Ｂｉｏ Ｗｉｔｈａｋｋｅｒ））中のトリプシン［１０ｍｇ／ｍｌ］／ＥＤＴＡ／ＤＮａｓｅ［５ｍｇ／ｍｌ］（ロッシュ ダイアグノスティクス）を用いて分離した。消化を４部分培地（神経基礎培地＋１ｍｌ ５０×Ｂ−２７補助剤（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））＋０．５ｍＭ Ｌ−グルタミン＋２５μＭ グルタミン酸）を用いて停止し、室温にて５分間、８００ｇで遠心した。ペレットを、５ｍｌ培地中に溶解し、細胞数を、計数によって決定した（ノイバウエルスライド）。細胞を、ポリ−Ｌ−リシンでコートしたカバースリップ上の２４−ウェル−プレートのウェルあたり２５００００細胞の密度でプレートした。
免疫細胞化学
調製の１４日後、ニューロンをＰＢＳ（ギブコ）（３７℃）で洗浄し、氷上で１０分間、２％パラホルムアルデヒドにて固定した。ついで細胞を、ＰＢＳ（４℃）で洗浄し、４℃で保存した。細胞を、ＰＢＳ中５０ｍＭグリシン中で、１０分間インキュベートして、ついでＰＢＳで洗浄した。細胞を、ＰＢＳ中０，２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（シグマ）を用いて氷上で浸潤性とし、室温にてブロッキング溶液（ＰＢＳ中０，２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、４％ 正常ヤギ血清（ＮＧＳ）（ジャクソン イムノリサーチ ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））と共にインキュベートした。マウスＧＣＳＦＲのＣ−末端に対する１次抗体（ウサギ−抗−ＣＧＳＦ−レセプター−抗体、Ｍ−２０、ｓｃ−６９４、サンタ クルズ バイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）を、１：８００（０，１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／２％ ＮＧＳ中）の希釈にて使用し、４℃にて一晩インキュベートした。ついで細胞を１％ ＮＧＳ／ＰＢＳで洗浄し、室温にて、2次抗体（抗ウサギＦＩＴＣ、１：４００；ジアノバ）と共に３０分間インキュベートした。ついで細胞を１％ ＮＧＳ／ＰＢＳで軽く洗浄し、核の対比染色のために、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３３４２（モレキュラー プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）（ＰＢＳ中１：１００００）で染色した。最後に、カバースリップを、１％ ＮＧＳ／ＰＢＳで簡単に二回、ＰＢＳで二回、そして、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．６中で１０分１回洗浄した。カバースリップを、Ａｑｕａｍｏｕｎｔ（ポリサイエンス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ））を用いて埋包した。
オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ＩＸ８１顕微鏡、および「Ａｎａｌｙｓｉｓ」ソフトウェアパッケージ（ソフト イメージング システムズ（Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて、デジタル写真をとった。
ＧＣＳＦレセプターは、神経幹細胞上に存在する：ＰＣＲおよび免疫細胞化学（図１２、１３）；ＧＣＳＦレセプターは、ＰＣ１２細胞上に存在する：ＰＣＲ（図２Ｂ）
神経幹細胞の産出
神経幹細胞を、記述されたように、４〜６週齢のオスＷｉｓｔａｒラットの公知の自発的神経発生の脳領域、すなわち海馬、嗅球および脳室下領域から単離した（Ｒａｙ Ｊ ｅｔ ａｌ（１９９３），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：３６０２−６）。プロトコールは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ａ．によって承認された、動物の使用におけるポリシーに準拠し
、ドイツ法の要求をみたす。簡単に記すと、動物を、１％（ｖ／ｖ）イソフラン、７０％
Ｎ２Ｏ、２９％酸素で麻酔し、頭部切断により犠牲死させた。脳を取り出し、５０ｍＬの、４．５ｇ／Ｌグルコースを含む氷冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（ＤＰＢＳ／Ｇｌｃ）中で洗浄した。６匹の動物から海馬、嗅球および脳室下領域を切断し、１０ｍＬ ＤＰＢＳ／Ｇｌｃ中で洗浄し、１６００×ｇ、４℃にて５分間遠心した。上清を除去した後、組織を、はさみおよびメスで均質化した。組織断片を、８００ｇにて５分間、ＤＰＢＳ／Ｇｌｃ培地で洗浄し、３つのペレットを、ハンクスバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）中の０．０１％（ｗ／ｖ）パパイン、０．１％（ｗ／ｖ）ディスパーゼＩＩ（天然プロテアーゼ）、０．０１％（ｗ／ｖ）ＤＮａｓｅＩ、および１２．４ｍＭ硫酸マグネシウム中に再懸濁させた。組織を、プラスチックピペットチップで粉砕し、室温にて４０分間インキュベートしたが、ただし、１０分おきに、溶液を良く混合した。懸濁液を、４℃にて８００×ｇ、５分間、遠心し、ペレットを、２ｍＬ Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬ ペニシリンおよび１００ユニット／ｍＬ ストレプトマイシンを含む、１０ｍＬ ＤＭＥＭ−ＨａｍのＦ−１２培地中で３回洗浄した。ついで、細胞ペレットを、Ｂ２７（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬ ペニシリンおよび１００ユニット／ｍＬ ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＥ−２、および２μｇ／ｍＬ ヘパリンを含む１ｍＬの神経基礎培地中に再懸濁させた。細胞を、２５，０００〜１００，０００細胞／ｍＬの濃度で、６ウェルディッシュ中、無菌状態下でプレートした。ディッシュを、５％ ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。細胞培養培地を１週間に１回交換し、ここで、約三分の二の培地が置換された（Ｒａｙ Ｊ ｅｔ ａｌ（１９９３），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：３６０２−６）。
ＲＴ−ＰＣＲプロトコール
ＲＮＡを、製造業者の推奨（ＲＮｅａｓｙキット、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））にしたがって、凍結ストックから融解した後、培地中で３週間増殖させた、海馬幹細胞（図１２）から、標準のプロトコールにしたがって単離した。ｃＤＮＡを、標準の条件を用いて、オリゴｄＴプライマー、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を用いて合成した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、プライマー対「ラットＧＣＳＦＲ−ｆｒａｇ−８ｓ」ＧＣＧＧＧＣＡＡＡＴＣＡＧＧＡＴＣＴＣＡＣ（配列番号２）および「ラットＧＣＳＦＲ−ｆｒａｇ−２８７ａｓ」ＣＧＡＡＧＣＴＣＡＧＣＴＴＧＡＴＣＣＡＧＧ（配列番号３）を用いて、以下のサイクリング条件で実施した。３分間９４℃、３０秒間９４℃、３０秒間６０℃、１分間７２℃、３２サイクル。プライマーは、ＴＢＬＡＳＴＸ検索によって、ラットゲノムデータベースから同定した、ラットＧＣＳＦＲの断片より由来した（図１１を参照のこと）。反応条件：２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００ｕＭ
ｄＮＴＰ、２００ｎＭ各プライマー、１ユニット Ｔａｑポリメラーゼ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））／２５μｌ。ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲル上で分離した。特定のＰＣＲ産物の長さは、２７９ｂｐであり、以下の配列であった（配列番号４）（プライマー配列は下線部）。
ｇｃｇｇｇｃａａａｔｃａｇｇａｔｃｔｃａｃｃｃｃｃｃａｔｔｇｔｃｃａｔｃｔｔｇｇｇｇａｔｃｃｔｇｔｃｃｔｇｇｃｃｔｃｃｔｇｃａｃｃａｔｃａｇｃｃｃａａａｃｔｇｃａｇｃａａａｃｔｇｇａｃｃｇａｃａｇｃｃａａａｇａｔｃｃｔａｔｇｇａｇａｃｔｇｃａａｇａｔｇａａｃｃａａａｃｃａｇｃｃｔｇｇｇｇａｃａｇａｃａｇｃａｔｃａｃｃｔｇｃｃｔｇａｃｇｇｇｔｃｃｃａｇｇａｇｔｃｃａｔｃａｔｃａｃｔｃｔｇｃｃｔｃａｔｃｔｇａａｃｔａｃａｃｔｃａｇｇｃｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｔｇｃｔｔｇｇｔｇｃｃａｔｇｇａａｃａａｃａｇｃｔｔｃｃａｇｇｔｃｃｔｇｇａｔｃａａｇｃｔｇａｇｃｔｔｃｇ
ＰＣ１２細胞上のＰＣＲのために（図２Ｂ）、以上のプロトコールにしたがった。
脳球の免疫細胞化学
神経幹細胞からなる脳球を、ガラススライド上にピペットし、カバースリップを細胞上に乗せ、スライドを、少なくとも３０分間、−８０℃においた。カバースリップを取り除き、すぐに０．１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．４中の４％ＰＦＡ(パラホルムアルデヒド)中においた。細胞を２０分間固定した。細胞を、１％ ＦＣＳおよび０．０２％ＮａＮ3を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で、３×５分間洗浄した。細胞を、０．５％ＴＸ−１００を含むＰＢＳ中で１０分間、透過性とした。抗原を、１％ＦＣＳおよび０．０２％ＮａＮ3を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で６０分間ブロックした。細胞を、ＰＢＳ中０．００１ｍｇ／ｍｌの濃度で、核色素ＤＡＰＩにて、１２分間染色した。ついで細胞を、１％ＦＣＳおよび０．０２％ＮａＮ3を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で、２×５分間洗浄した。１次抗体を、１％ＦＣＳおよび０．０２％ＮａＮ3を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中に希釈し、それぞれ抗−Ｇ−ＧＳＦ １：１０００、抗−Ｇ−ＣＳＦ−Ｒ １：１０００、抗ＧＭ−ＣＳＦ−Ｒ １：１０００（サンタ クルズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ））の濃度にて、２時間適用した。細胞を、１％ＦＣＳおよび０．０２％ＮａＮ3を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で３×５分間洗浄した。ついで、2次抗体（ヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ＦＩＴＣ、（ＤＡＫＯ））を、濃度１：３０にて、１％ＦＣＳおよび０．０２％ＮａＮ3を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で６０分間適用した。細胞を、１％ＦＣＳおよび０．０２％ＮａＮ3を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）中で、３×５分間洗浄した。細胞を最終的に、Ａｑｕａｍｏｕｎｔおよびカバースリップでマウントした。
ＧＭＣＳＦＲαは、脳血栓の光血栓モデルにおいて、アップレギュレートされる（ＲＭＤＤによる発見）
実験プロトコールは、地域倫理委員会で承認された。体重２８０〜３２０ｇのオスＷｉｓｔａｒラット（チャールズ リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、以下の処置に割り当てた。ａ）種々の時間点での虚血（６時間、４８時間および２１日）、ｂ）疑似手術、虚血なし、相当する時間点（６時間、４８時間および２１日）、各時間点および処置に対してｎ＝２。
光血栓による局所性脳虚血
動物を、１００ｍｇ／ｋｇ体重 ケタミンヒドロクロライド（ＷＤＴ、Ｇａｒｂｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の筋肉内注射によって麻酔した。麻酔を、必要ならば、５０ｍｇ／ｋｇ体重で維持した。ＰＥ−５０ポリエチレンチューブを、平均動脈血圧および血液ガスの連続モニタリングのために、右大腿動脈内に挿入した。右大腿静脈を、処置注入のために、ＰＥ−５０チューブによってカニューレ挿入した。実験の間、直腸温度をモニタし、温度制御加熱パッド（ホア メディカル インステゥルメンツ（Ｆｏｈｒ Ｍｅｄｉｃａｌ
Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、３７℃に維持した。
光血栓虚血を、Ｗａｔｓｏｎら（Ｗａｔｓｏｎ ＢＤ，Ｄｉｅｔｒｉｃｈ ＷＤ，Ｂｕｓｔｏ Ｒ，Ｗａｃｈｔｅｌ ＭＳ，Ｇｉｎｓｂｅｒｇ ＭＤ．「光化学的開始血栓による、再現可能脳梗塞の誘導（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ ｂｒａｉｎ ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ ｂｙ ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｉｔｉａｔｅｄ ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．）」Ａｎｎ Ｎｅｕｒｏｌ．１９８５；１７：４９７−５０４）の方法にしたがって、右ラット頭頂葉皮質にて誘導した。動物を、ケタミンヒドロクロライドにて麻酔し、定位固定フレームに配置し、皮膚表面の曝露のために頭皮を切開した。照明のために、１．５−ｍｍ絞りを持つ、繊維−光学束を、ブレグマに対して頭蓋骨４ｍｍ後部および中線から４ｍｍ側面上に、定位配置した。頭蓋骨を、冷、白色ビーム（１５０Ｗ）で２０分間照明した。照明の最初の二分間、色素ローズベンガル（０．１３３ｍＬ／ｋｇ体重、１０ｍｇ／ｍＬ生理食塩水）を静脈注射した。疑似施術動物も、ローズベンガルの注入と照明以外、以上で記述したのと同様の実験手順を施した。手術後、カテーテルを取り除き、動物を麻酔から回復させ、適宜えさと水を与えた。動物を、種
々の時間点（それぞれ虚血および疑似手術後６時間、４８時間および２１日）にしたがって、殺し、また、同側および対側両方での周縁皮質の調製は、当業者に公知である。
ＲＮＡ単離およびＲＭＤＤ
ＲＮＡを、傷害側の同側および対側の、ラット皮質周縁部試料から、標準のプロトコール（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８７）、１６２，１５６−９）、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮｅａｓｙミニキット精製にしたがって単離した（組織試料の局在に関して図１３ａを参照のこと。ここで３対４）。ｃＤＮＡ合成を、欧州特許第０７４３３６７Ａ２号および米国特許第５，８７６，９３２号にて記述されたように、ＲＭＤＤ（制限仲介ディファレンシャルディスプレイ）−プロトコールにしたがって、１μｇのトータルＲＮＡより実施した。第１鎖および第２鎖合成につづき、ＭｂｏＩ消化、アダプターライゲーションを実施した。プライマー組み合わせのサブセットでの２つのＰＣＲ反応を実施した。続いて、ＰＣＲ反応物を、変性ゲル上にのせ、ナイロン膜（ＧＡＴＣ バイオテック社（ＧＡＴＣ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＧ）、Ｋｏｎｓｔａｎｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上にブロットした。ビオチン−標識バンドを、一般的なストレプトアビジン−ペルオキシダーゼ反応で視覚化した。皮質周縁部からのＰＣＲ試料を以下の順番に、ゲルにのせた。同側：ネイティブ（未処理）、疑似６時間、疑似４８時間、疑似２１日ならびに６時間、４８時間および２１日光血栓、対側：疑似６時間、疑似４８時間、疑似２１日ならびに６時間、４８時間および２１日光血栓。同側および対側領域において、異なる強度を持つバンドをナイロン膜から切り出し、続くＰＣＲの再増幅を実施した。増幅した産物を、ｐＣＲ−ＢｌｕｎｔＩＩ−ＴＯＰＯベクター（インビトロジェン ＧｍｂＨ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＧｍｂＨ）、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）内にクローン化し、Ｔ７およびＭ１３ｒｅｖプライマー（ＡＢＩ３７００）で配列決定した。得られた配列を、ＥＭＢＬ−データベースと比較した。同側および対側皮質周縁部両方にて、４８時間後にアップレギュレートされた配列を同定した（図１４）。同定したＥＳＴ−配列を、ＥＳＴ−データベース内のＢＬＡＳＴＮ−検索で伸長させ、スクリーニングプログラム（ＢＬＡＳＴ、ＴＢＬＡＳＴＮ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，２５，３３８９−４０２．））を用いることによって、マウスＧＭ−ＣＳＦＲαをコードしているマウス相同配列を、ＥＳＴ−およびゲノムデータベース（ｅｎｓｅｍｂｌ；ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）にて同定した。
得られたラット配列を確かめるために、Ｓｈｅｐａｒｄ（（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：３１８３−３１８５）のＰＣＲクローニング法で、ラットｃＤＮＡライブラリーにて、スクリーンを実施した。この方法は、プラスミドライブラリーから誘導したｃＤＮＡ分子の、ビオチン共役オリゴヌクレオチド配列へのハイブリッド形成に基づいている。ストレプトアビジン−共役磁気ビーズでのプラスミド抽出に続いて、診断ＰＣＲおよび、単一クローンを回復するまで、得られたプラスミドのトランスフォーメーションに続く２倍増幅によって、結果を確かめた。以下のプライマー組み合わせを使用した。
５’ｂｌｏｃｋ−２．ｃｌｂ４−４−４：ＣＧＧＧＡＴＣＣＧＧＧＡＣＣＧＣＧＴＡＴＣＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＣＧＴＧＴＣＡＡ（配列番号１２）
２５ｂｉｏ−２．ｃｌｂ４−４−４：ＣＴＣＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧ（配列番号１３）
３’ｂｌｏｃｋ−２．ｃｌｂ４−４−４：ＣＴＧＣＧＧＣＣＣＴＡＧＡＣＣＡＣＧＣＣＣＡＣＣＧＣＴＣＣＣＣＧＴＧＡＣＧＴＣＧ（配列番号１４）
（ＯＲＦを、単一クローンに関して決定し、配列を、配列番号４０として示した。相当するアミノ酸配列は、配列番号４１として示した。
ＧＭＣＳＦレセプターαは、脳虚血の光血栓モデルにてアップレギュレートされる（定量的ＰＣＲによる確認）
ＲＮＡを、傷害側の同側および対側の、ラット皮質周縁部試料から、標準のプロトコール（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８７）、１６２，１５６−９）、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮｅａｓｙミニキット精製）にしたがって単離した（組織試料の局在に関して図１３ａを参照のこと。ここで３対４）。ｃＤＮＡを、オリゴｄＴプライマー、標準の条件を用いたスーパースクリプトＩＩ逆転写酵素（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を用いて、１μｇのトータルＲＮＡより合成した。定量的ＰＣＲを、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒシステム（ロッシュ ダイアグノスティクス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ＤＮＡ二本鎖のＳＹＢＲグリーン染色にて実施した。サイクル条件は以下のようであった。５分間９５℃、５秒間９５℃、７秒間６２℃、３０秒間７２℃、９秒間８０℃、５０サイクル。融解曲線を、以下のパラメータで実施した。９５℃から５０℃まで冷却、０．２℃／秒にて９９℃まで傾斜。以下のプライマー対を使用した。「ラットＢＲ４−４ｓ９６」ＡＣＧＴＣＧＴＴＧＧＣＴＣＡＧＴＴＡＴＧＴＣ（配列番号１５）および「ラットＢＲ４−４ａｓ２７２」ＡＴＴＴＡＴＧＴＣＡＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧ（配列番号１６）。Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（商標） ＰＣＲを、ＳＹＢＲグリーンマスターミックスを用いて、製造業者の推奨（ロッシュ ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）にしたがって実施した。産物の特異性を、融解点解析およびアガロースゲル電気泳動によって確認した。試料のｃＤＮＡ含量を、シクロフィリンの発現レベルに対して標準化した（プライマー：「ｃｙｃ５」ＡＣＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＧＡＣ（配列番号１７）、「ａｃｙｃ３００」ＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧ（配列番号１８）。相対調整レベルを、サイクロフィリンに対する標準化の後に導き、疑似手術動物と比較した。図１４は、同側および対側における４８時間後の、ＧＭＣＳＦＲαのアップレギュレーションを示している。光血栓の誘導２１日後には、有意な調整は検出されない（図１４ｂ）。エラーバーは、標準偏差を示しており、これらは、３倍連続希釈ｃＤＮＡ−試料から計算され、測定の信頼性を反映している。
ＧＭＣＳＦ−レセプターαは、初代皮質培養中の神経細胞上に存在する：ニューロンの調製
１０〜１２個の皮質を、ステージＥ１８（１８日胚）の胚より調製した。組織をＨＢＳＳ（ハンクスバランス塩溶液、バイオ ウイズアッカー（Ｂｉｏ Ｗｉｔｈａｋｋｅｒ））中のトリプシン［１０ｍｇ／ｍｌ］／ＥＤＴＡ／ＤＮａｓｅ［５ｍｇ／ｍｌ］（ロッシュ ダイアグノスティクス）を用いて分離した。消化を四部分培地（神経基礎培地＋１ｍｌ ５０×Ｂ−２７補助剤（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））＋０．５ｍＭ
Ｌ−グルタミン＋２５μＭ グルタミン酸）を用いて停止し、室温にて５分間、８００×ｇで遠心した。ペレットを、５ｍｌ培地中に溶解し、細胞数を、計数によって決定した（ノイバウエルスライド）。細胞を、ポリ−Ｌ−リシンでコートしたカバースリップ上の２４−ウェル−プレートのウェルあたり２５００００細胞の密度でプレートした。
免疫細胞化学
調製の１週間後、ニューロンをＰＢＳ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））（３７℃）で洗浄し、氷上で１０分間、２％パラホルムアルデヒドにて固定した。ついで細胞を、ＰＢＳ（４℃）で洗浄し、細胞を、ＰＢＳ中５０ｍＭグリシン中で、１０分間インキュベートして、ついでＰＢＳで洗浄した。細胞を、ＰＢＳ中０，２％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（シグマ）を用いて氷上で透過性とし、室温にてブロッキング溶液（ＰＢＳ中０，２％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、４％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）（ジャクソン イムノリサーチ ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））と共にインキュベートした。マウスＧＭＣＳＦＲのＣ−末端に対する１次抗体（ウサギ−
抗−ＧＭ−ＣＳＦ−レセプター−抗体、Ｍ−２０、ｓｃ−６９１、ＳａｎｔａＣｒｕｚ）を、１：３００（０，１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００／２％ ＮＧＳ中）の希釈にて使用し、４℃にて一晩インキュベートした。ついで細胞を１％ ＮＧＳ／ＰＢＳで洗浄し、室温にて、2次抗体（抗ウサギＦＩＴＣ、１：４００；ジアノバ（ｄｉａｎｏｖａ））と共に３０分間インキュベートした。細胞を１％ ＮＧＳ／ＰＢＳで簡便に洗浄し、核の対比染色のために、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３３４２（モレキュラー プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））（ＰＢＳ中１：１００００）で染色した。最後に、カバースリップを、１％ ＮＧＳ／ＰＢＳで簡単に二回、ＰＢＳで二回、そして、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ７．６中で１０分１回洗浄した。カバースリップを、Ａｑｕａｍｏｕｎｔ（ポリサイエンス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ））を用いて埋包した。
オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ＩＸ８１顕微鏡、および「Ａｎａｌｙｓｉｓ」ソフトウェアパッケージ（ソフト イメージング システムズ（Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて、デジタル写真をとった。
ＧＭＣＳＦレセプターは、神経幹細胞上に存在する：神経幹細胞の産出（図１３）
神経幹細胞を、記述されたように、４〜６週齢のオスＷｉｓｔａｒラットの公知の自発的神経発生の脳領域、すなわち海馬、嗅球および脳室下領域から単離した（Ｒａｙ Ｊ ｅｔ ａｌ（１９９３），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：３６０２−６）。プロトコールは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｕ．Ｓ．Ａ．によって承認された、動物の使用におけるポリシーに準拠し、ドイツ法の要求をみたす。簡単に記すと、動物を、１％（ｖ／ｖ）イソフラン、７０％
Ｎ２Ｏ、２９％酸素で麻酔し、頭部切断により犠牲死させた。脳を取り出し、５０ｍＬの、４．５ｇ／Ｌグルコースを含む氷冷ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）（ＤＰＢＳ／Ｇｌｃ）中で洗浄した。６匹の動物から海馬、嗅球および脳室下領域を切断し、１０ｍＬ ＤＰＢＳ／Ｇｌｃ中で洗浄し、１６００×ｇ、４℃にて５分間遠心した。上清を除去した後、組織を、はさみおよびメスで均質化した。組織断片を、８００ｇにて５分間、ＤＰＢＳ／Ｇｌｃ培地で洗浄し、３つのペレットを、ハンクスバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）中の０．０１％（ｗ／ｖ）パパイン、０．１％（ｗ／ｖ）ディスパーゼＩＩ（天然プロテアーゼ）、０．０１％（ｗ／ｖ）ＤＮａｓｅＩ、および１２．４ｍＭ硫酸マグネシウム中に再懸濁させた。組織を、プラスチックピペットチップで粉砕し、室温にて４０分間インキュベートしたが、ただし、１０分おきに、溶液を良く混合した。懸濁液を、４℃にて８００×ｇ、５分間、遠心し、ペレットを、２ｍＬ Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬ ペニシリンおよび１００ユニット／ｍＬ ストレプトマイシンを含む、１０ｍＬ ＤＭＥＭ−ＨａｍのＦ−１２培地中で３回洗浄した。ついで、細胞ペレットを、Ｂ２７（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、１００ユニット／ｍＬ ペニシリンおよび１００ユニット／ｍＬ ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬ ＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＥ−２、および２μｇ／ｍＬ ヘパリンを含む１ｍＬの神経基礎培地中に再懸濁させた。細胞を、２５，０００〜１００，０００細胞／ｍＬの濃度で、６ウェルディッシュ中、無菌状態下でプレートした。ディッシュを、５％ ＣＯ２中３７℃でインキュベートした。細胞培養培地を１週間に１回交換し、ここで、約三分の二の培地が置換された（Ｒａｙ Ｊ ｅｔ ａｌ（１９９３），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９０：３６０２−６）。
ＲＴ−ＰＣＲプロトコール
ＲＮＡを、製造業者の推奨（ＲＮｅａｓｙキット、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））にしたがって、凍結ストックから融解した後、培地中で３週間増殖させた、海馬幹細胞から標準のプロトコールにしたがって単離した。ｃＤＮＡを、標準の条件を用いて、オリゴｄＴプ
ライマー、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩ逆転写酵素（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を用いて合成した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、プライマー対「ラットＢＲ４−４ｓ９６」ＡＣＧＴＣＧＴＴＧＧＣＴＣＡＧＴＴＡＴＧＴＣ（配列番号１９）および「ラットＢＲ４−４ａｓ２７２」ＡＴＴＴＡＴＧＴＣＡＧＡＧＡＴＧＧＡＧＧＡＴＧＧ（配列番号２０）を用いて、以下のサイクリング条件で実施した。３分間９４℃、３０秒間９４℃、３０秒間６０℃、１分間７２℃、３２サイクル。反応条件：２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２００ｕＭ
ｄＮＴＰ、２００ｎＭ各プライマー、１ユニット Ｔａｑポリメラーゼ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））／２５μｌ。ＰＣＲ産物を、１．５％アガロースゲル上で分離した。特定のＰＣＲ産物の長さは、１７６ｂｐであり、以下の配列であった（プライマー配列は下線部）。
ＡＣＧＴＣＧＴＴＧＧＣＴＣＡＧＴＴＡＴＧＴＣＡＧＡＣＡＧＧＡＡＡＴＣＴＣＡＣＣＡＴＣＣＣＡＣＡＡＴＧＡＴＴＧＡＣＡＧＣＴＣＴＣＡＣＡＧＧＧＡＡＴＣＣＣＧＣＣＴＣＣＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＡＴＴＧＡＣＡＴＣＡＣＧＧＡＣＡＧＧＡＡＴＡＣＣＣＧＣＣＣＣＴＧＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＣＡＧＧＴＣＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＣＡＴＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＣＡＴＡＡＡＴ （配列番号２１）
血液脳関門を介した、ＧＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦの血清半減期および通過の決定のためのアッセイ
ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦが、血液−脳関門を通過するかどうかを知ることが望ましい。ＧＣＳＦ／ＧＭ−ＣＳＦを、脳組織内のケモカインの検出のために、非常に高感度のアビジン−ビオチン相互作用の利用を可能にするために、ビオチン化する。Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ、アムジェン（Ａｍｇｅｎ））を、ビオチン−ＸＸ−ＳＥ（モレキュラープローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）Ｂ１６０６）を用いてビオチン化した。Ｇ−ＣＳＦを、２５０ｍＭソルビトールおよび０．００４％ Ｔｗｅｅｎ−８０にて、２０ｍＭ 炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８中に希釈し、ビオチン−ＸＸ−ＳＥを加えた。室温にて１時間後、トリス−緩衝液ｐＨ８を、５０ｍＭ濃度まで加えて、未反応標識試薬をクエンチした。試料を、ＴＬＡ１１０ローター（ベックマン インストゥルメンツ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））中、４５０００ｒｐｍにて３０分間遠心して、凝集物を除去した。
７．５μｇビオチン化Ｇ−ＣＳＦを、時間ゼロにて、マウスに腹腔内に注射した（２５０ｍＭソルビトールおよび０．００４％Ｔｗｅｅｎ−８０を含む２００μｌ ２０ｍＭ 炭酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８中）。マウスを、示した時間にて、クロロアルデヒドにて麻酔し、血液試料（およそ２００μｌ）を、右心腔より抜いた。ＥＤＴＡを５ｍＭまで加え、試料を、１０００ｇにて１０分間遠心して、血清を得た。４×試料緩衝液を血清に加え、タンパク質を、５分間９５℃で熱することで変性させ、２０μｌをミニゲルに適用した。タンパク質をニトロセルロースにうつし、ブロッキングし、ＴＢＳＴ中のＳｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＨＲＰ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））とともにインキュベートした。洗浄の後、シグナルを、ピアス スーパーシグナル（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ）化学ルミネセンス試薬を用いて検出した。
ＥＬＩＳＡ解析のために、血清試料を、アッセイ緩衝液中で１：２０に希釈し、アッセイを、取扱説明書にしたがって実施した（ＩＢＬ、Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
本アッセイを、血液−脳−関門を介したＧＣＳＦの転位を決定するために、脳脊髄液（ｃｓｆ）または脳ホモジネートに適合可能である。
ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦの神経保護作用のアッセイ（図１ｂ）
ＧＣＳＦ／ＧＭＣＳＦの神経保護作用を、ＮＧＦ−処理ＰＣ１２細胞上で、インビトロにて決定した。ＰＣ１２細胞を、４０．０００細胞／ウェルの密度にて、ポリ−ｌ−リシン（０．０１％最終濃度）にてコートした９６ウェルプレートにまいた。細胞を、１０００ｍｇグルコース／ｌおよび１０％ ＨＳ（ウマ血清）、５％ ＦＣＳ（胎児ウシ血清）、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地中で維持した。ついで細胞に、取扱説明書にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（登録商標）トランスフェクション試薬（ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））（０．２ｕｇ ＤＮＡ／ウェル）を用いて、ｐＳＶ４０−ＲＬ（レニラルシフェラーゼ遺伝子をコードしている）をトランスフェクトした。トランスフェクトの直後、ＮＧＦ（神経成長因子）を、４０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えて、ＰＣ１２細胞の分化を誘導した。処置後の２４時間の時点で、ＰＣ１２細胞は、伸長した突起を持つ神経様形態に発達する。ついで細胞を、種々の濃度にてＨ2Ｏ2で（図１ｂ）、および種々の濃度（１〜１００ｎｇ／ｍｇ）にてＧＣＳＦで処理した。ＥＰＯを、０．０１Ｕ／ｍｌ〜１Ｕ／ｍｌの濃度で、インビトロにて公知の神経保護強度を持つ（Ｃｅｒａｍｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２）、Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１７，８−１２．、Ｋａｗａｋａｍｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６，３９４６９−７５．、Ｓｉｎｏｒ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ（２０００），Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，２９０，２１３−５．、Ｃｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ、２２，５０３−１４．）物質に対する陽性対照として加えた。２４時間後、培地上清を捨て、細胞を、受動溶解緩衝液（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて溶解した。ついでレニラルシフェラーゼ活性を、ルミノメーター（ミトラス（Ｍｉｔｈｒａｓ）、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）にて記録し、この記録は、相対光ユニットとして表す。このアッセイにより、検出可能なルシフェラーゼの量として、細胞生存が測定される。したがって、相対光ユニットが高ければ高いほど、より多くの細胞が生存したことになる。本アッセイにて、ＧＣＳＦは、ＰＣ１２細胞の用量依存神経保護を示し、これは、エリスロポイエチンよりも強力である。
ＧＣＳＦレセプターは、神経疾患に関して重要な種々の脳領域で発現している（図４）：ＧＭＣＳＦは、種々の重要な脳領域で発現している（図１９）
正常マウス脳におけるＧＣＳＦレセプターの分布を体系的に査定するために、Ｃ５７／ｂ１６マウス（２〜３ヶ月齢）を、Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）およびＫｅｔａｎｅｓｔ（登録商標）の腹腔内注射を用いて麻酔した。ついでマウスを、２０ｍｌハンクスバランス塩溶液（ＨＢＳＳ）、つづいて２０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で、心臓を通して潅流した。脳を切除し、２％ＰＦＡ溶液中で一晩保存した。パラフィン包埋組織を刻み（２μｍ）、前処理スライド（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）上にマウントし、一晩風乾し、続いて脱パラフィンした。マイクロ波処置（クエン酸緩衝液、５００Ｗ、１０分間）後、抗−ＧＣＳＦＲ抗体（１：４００）を適用し、組織を、湿室中、室温にて１時間インキュベートした。抗体標識を、製造業者の推奨（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）にしたがって、一般的なＡＢＣ技術、および色原体としてＤＡＢを用いて視覚化した。陰性対照は、１次抗体が、完全に除外される同様の処理セクション、ならびに好適な正常血清（ディアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ）、Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用するセクションを含む。ＧＣＳＦ−Ｒの局在は、ＣＡ３領域中のニューロンの主要染色（図４ａ、ｂ）、ＣＡ３とＣＡ２領域間のはっきりとした境界（図４ｃ、矢印）を持つ、海馬（図４ａ〜ｄ）にてみられた。ＧＣＳＦ−Ｒは、体細胞全体に分布し、ニューロンの突起でも分布する（図４ｂ、矢印）。レセプターは、歯状回の門および基底細胞層に存在する（図４ｄ、矢印）。ＧＣＳＦ−レセプターがまた、皮質領域、例として梨状皮質（図４ｅ）、および鼻周囲皮質（ｆ）でも検出される。小脳において、プルキンエ細胞が標識された（図４ｇ、矢印）。また、嗅球中の大きな僧帽細胞のいくつかが、ＧＣＳＦ−Ｒ陽性である（図４ｈ、矢印）。強力な染色が
、脊髄における前柱によって示され（図４ｉ、ｊ）、より高い倍率によって、大運動ニューロンが、ＧＣＳＦ−Ｒ陽性と同定される（図４ｋ、ｌ）。神経突起が強く標識されたことを考慮すべきである。中脳にて、黒質中のニューロンが、ＧＣＳＦ−Ｒ陽性を示している（図４ｍ、ｎ、ｏ）。ニューロンとは別に、白質管中の乏突起膠細胞が、たとえば、前方交連中で染色される（図４、ｐ、矢印）。
同様の例を、ＧＭＣＳＦＲの局在に関して適用する（図１９）。ここで、染色が、海馬、皮質、小脳、および脈絡叢にて見られた。現在まで、中脳および脊髄は試験していない。
ＧＣＳＦ、ＧＭＣＳＦの神経保護作用に関するアッセイ（図１ｂ、図２３）
ＧＣＳＦ／ＧＭＣＳＦの神経保護作用を、ＮＧＦ−処置ＰＣ１２細胞上で、インビトロにて決定した。ＰＣ１２細胞を、４０，０００細胞／ウェルの密度にて、ポリ−ｌ−リシン（０．０１％最終濃度）でコートした９６ウェルプレートに撒いた。細胞を、１０００ｍｇグルコース／ｌおよび１０％ＨＳ（ウマ血清）、５％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地中で維持した。ついで細胞に、取扱説明書にしたがって、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（登録商標）トランスフェクション試薬（ギブコＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ））（０．２ｕｇ ＤＮＡ／ウェル）を用いて、ｐＳＶ４０−ＲＬ（レニラルシフェラーゼ遺伝子をコードしている）をトランスフェクトした。トランスフェクトの直後、ＮＧＦ（神経成長因子）を、４０ｎｇ／ｍｌの濃度で加えて、ＰＣ１２細胞の分化を誘導した。処置後の２４時間の時点で、ＰＣ１２細胞は、伸長した突起を持つ神経様形態に発達する。ついで細胞を、種々の濃度にてＨ2Ｏ2で（図１ｂ、図２３）ならびに種々の濃度（１〜１００ｎｇ／ｍｇ）にてＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦで処理した。ＥＰＯを、０．０１Ｕ／ｍｌ〜１Ｕ／ｍｌ（図１ｂ）または０．５Ｕ／ｍｌ（図２３）の濃度で、インビトロにて公知の神経保護強度を持つ（Ｃｅｒａｍｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２）、Ｎｅｐｈｒｏｌ Ｄｉａｌ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１７，８−１２．、Ｋａｗａｋａｍｉ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７６，３９４６９−７５．、Ｓｉｎｏｒ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ（２０００），Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｌｅｔｔ，２９０，２１３−５．、Ｃｈｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ、２２，５０３−１４．）物質に対する陽性対照として加えた。２４時間後、培地上清を捨て、細胞を、受動溶解緩衝液（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ））を用いて溶解した。ついでレニラルシフェラーゼ活性を、ルミノメーター（ミトラス（Ｍｉｔｈｒａｓ）、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）にて記録し、この記録は、相対光ユニットとして表す。このアッセイにより、検出可能なルシフェラーゼの量として、細胞生存が測定される。したがって、相対光ユニットが高ければ高いほど、より多くの細胞が生存したことになる。本アッセイにて、ＧＣＳＦは、ＧＭＣＳＦと同様にＰＣ１２細胞の用量依存神経保護が示され、これは、エリスロポイエチンよりも強力である。
血栓梗塞脳虚血
実験プロトコールは、地域倫理委員会で承認された。体重２８０〜３２０ｇの４０匹のオスＷｉｓｔａｒラット（チャールズ リバー（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）、Ｇｅｒｍａｎｙ）を、以下の処置に割り当てた。Ａ）血栓血管梗塞１時間後、１０ｍｇ ｒｔ−ＰＡ／ｋｇ体重での１時間の早期血栓、Ｂ）血栓血管梗塞３時間後、１０ｍｇ ｒｔ−ＰＡ／ｋｇ体重での１時間の後期血栓、Ｃ）血栓なし。ただし、血栓虚血３０分後に開始し、９０分間、２ｍｌ 生理食塩水０．９％中、６０μｇ／ｋｇ体重の組換え体Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）、アムジェン（Ａｍｇｅｎ）、Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）での処理、Ｄ）血栓血管梗塞３時間後、１０ｍｇ ｒｔ−Ｐ
Ａ／ｋｇ体重で、１時間の後期血栓と組み合わせた、血栓虚血３０分後に開始し、９０分間、２ｍｌ 生理食塩水０．９％中、６０μｇ／ｋｇ体重の組換え体Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）、アムジェン（Ａｍｇｅｎ）、Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）での処理。
動物を、１００ｍｇ／ｋｇ体重 ケタミンヒドロクロライド（ＷＤＴ、Ｇａｒｂｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の腹腔内注射によって麻酔した。麻酔を、必要ならば、５０ｍｇ／ｋｇ体重で維持した。ＰＥ−５０ポリエチレンチューブを、平均動脈血圧、血液ガス、ヘマトクリット値、白血球数および血液グルコースレベルの連続モニタリングのために、右大腿動脈内に挿入可能である。右大腿静脈を、処置注入のために、ＰＥ−５０チューブによってカニューレ挿入可能である。実験の間、直腸温度をモニタし、温度制御加熱パッド（ホア メディカル インステゥルメンツ（Ｆｏｈｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって、３７℃に維持可能である。
血栓塞栓性脳梗塞を、Ｂｕｓｃｈ ｅｔ ａｌ（Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ １９９７ Ｄｅｃ ５；７７８（１）：１６−２４）によって記述された、改変方法にしたがって誘導しうる。簡単に記すと、右総頸動脈（ＣＣＡ）、内頸動脈（ＩＣＡ）および外頸動脈（ＥＣＡ）を、首の中線切開を介して曝露させうる。さらに解剖して、翼口蓋動脈（ＰＰＡ）の起源を同定した。ＥＣＡおよびＰＰＡを、６−０シルク縫合によって、恒久的に結紮する。ＣＣＡは、塞栓の時間、一時的にのみ結紮する。カテーテルをその結紮の近接ＥＣＡ内に挿入し、１２個の赤血球凝血塊（それぞれ直径で０．３５ｍｍ、長さ３ｍｍ）を注入し、結果として、右中大脳動脈（ＭＣＡ）の塞栓となる。
梗塞発生を、拡散−、潅流−およびＴ２−加重イメージングを用いることによって、１、２、４および２４時間の時点で、ＭＲ−イメージングによってモニタ可能である。全ての動物において、結果は、死亡率、および虚血後２４時間、５つの点スケールに基づく神経結果によって測定しうる。虚血２４時間後、ラットを、ケタミン１５０ｍｇ／ｋｇ体重で麻酔し、頭部を切断した。脳を取り出し、２４時間、０．１ｍｏｌ／ｌリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドにて固定した。パラフィン包埋後、１−μｍ−厚切片を切断し、ＴＴＣ、Ｈ＆ＥおよびＮｉｓｓｌ染色および免疫組織化学解析のために使用した。
統計学的解析
値は、平均値±ＳＤである。全てのデータを取得した後、無作為コードを開示した。ＡＮＯＶＡおよび続くｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｆｉｓｈｅｒ保護最小有意差検定を使用して、生理学的パラメータおよび梗塞量のような連続変数における差の統計学的有意性を決定する。Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を、死亡率のような非パラメトリックデータに関して実施する。ｐ値＜０．０５を、統計学的に有意であると考える。
Ｇ−ＣＳＦは、齧歯類脳梗塞モデル、中大脳動脈梗塞（ＭＣＡＯ）において、広い時間ウインドで投与された場合に、効果的である
図２４は、虚血開始１２０分後に適用したときに、ラットＭＣＡＯモデルでの、梗塞量における、静脈内に適用したＧ−ＣＳＦの効果を示している。実験は、実施例１で記述したように実施し、ただし、麻酔は、吸入麻酔（１％ハロタン、３０％Ｏ2および７０％ Ｎ2Ｏ）で誘導した。またここで、６０μｇ Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）、アムジェン（ＡＭＧＥＮ））／ｋｇラット体重の用量を使用した。有意な保護が、ＴＴＣ−染色によって、梗塞量と比較したときに見られた（図２５を参照のこと）。手術は、実施例１のような他の組の調査員によって実施され、これは、他の研究室のセットアップで効果的であることを示している。本実施例はさらに、脳梗塞および神経系の他の虚血性疾病のための処置として、Ｇ−ＣＳＦの有用性を示している。
ＧＣＳＦおよびそのレセプターの脳内での共局在化
使用した免疫組織化学法
パラフィン包埋組織の切片（２μｍ）を、キシロールでの２×５分、１００％エタノールでの２×２分間、ついで、９６％〜７０％までのエタノール減少濃度での処置によって脱パラフィン化した。最後に切片を、蒸留水で洗浄し、マイクロ波で処理した（６００Ｗにて１５分間 クエン酸緩衝液）。その後、切片を、蒸留水で洗浄し、抗原を、０．２％
ＢＳＡを含む１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中で、３×５ｍｍでブロックした。０．２％ ＢＳＡを含む１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中で希釈したＧＣＳＦ−レセプター抗血清（ＳＣ６９４、サンタ クルズ バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ，ＵＳＡ、１：１００）を、湿室中にて１時間、室温でインキュベートした。ついで切片を、０．２％ ＢＳＡを含む１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）にて、３×２分間洗浄した。ついで2次抗体（ヤギ抗−ウサギＦａｂ−ＦＩＴＣ、デアノバ（ｄｉａｎｏｖａ）、１：５０）を、０．２％ＢＳＡを含む１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中、４℃にて一晩適用した。切片を１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中０．２％ＢＳＡで３×２分洗浄した後、１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中０．２％ＢＳＡ中で、１：１００に希釈したＧＣＳＦ抗血清（ＳＣ１３１０２、サンタ クルズ バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ，ＵＳＡ）を、室温にて１時間適用した。切片を、先に記述したように、３回洗浄し、０．２％ＢＳＡを含む１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中、１：２００に希釈した、ビオチン化ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（ベクター ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＵＳＡ）とともに、３０分間インキュベートした。切片を洗浄した後再び、ＴＲＩＴＣ−共役ストレプトアビジン（デアノバ、１：２００）を、室温にて１．５時間適用した。ついで切片を、１×ＴＢＳにて３×２分間洗浄し、１×ＴＢＳ中、１：１０ ０００に希釈した核色素ＤＡＰＩで１０分間染色した。最後に、切片を、１×ＴＢＳにて３×２分間洗浄し、蛍光に関するマウンティング培地（ベクタシールド（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ），ベクター ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＵＳＡ）でマウントした。写真をオリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ＩＸ８１顕微鏡、および「Ａｎａｌｙｓｉｓ」ソフトウェアパッケージ（ソフト イメージング システムズ（Ｓｏｆｔ
Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にてデジタルで撮影した。
全ての二重蛍光実験を、平行単一染色によって制御し、第２チャンネルにおける、蛍光持ち越しがないことを確認した。第２の対照群として、すべての二重蛍光染色を、2次抗体に関するスイッチ発色団で実施した。
結果
ＧＣＳＦレセプター（図２５ａ、ｄ、ｇ）は、海馬（図２５ａ〜ｃ歯状回、ｄ−ｆ門）および皮質（図２５ｇ〜ｉ）両方で、そのリガンド（図２５ｂ、ｅ、ｈ）と共局在を示す。同様のニューロンが、レセプターおよびリガンド両方を発現するという驚くべき発見によって、ＧＣＳＦのオートクリンシグナル伝達機構が示唆されており、これは、神経系の新規内因性神経保護系を支持する。
脳中でのＧＣＳＦレセプターおよびＧＭＣＳＦレセプターの共局在化
免疫組織化学法
免疫組織化学を、実施例２０に記述したように実施した。切片のＧＣＳＦＲ抗血清と、ヤギ抗−ウサギＦａｂ−ＦＩＴＣとのインキュベーションの後、切片を、１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中の０．２％ ＢＳＡで、３×２分間洗浄した。その後、ＧＭＣＳＦＲ抗血清
（ＳＣ６９０、サンタ クルズ バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ，ＵＳＡ；１：１００）を、室温にて１時間適用した。ビオチン化ヤギ抗−ウサギＩｇＧ（ベクター ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ＵＳＡ）およびＴＲＩＴＣ−共役ストレプトアビジン（ジアノバ、１：２００）とのインキュベーションを含む、以下の手順を、実施例２で、ＧＣＳＦ検出に関して記述したように実施した。
全ての二重蛍光実験を、平行単一染色によって制御し、第２チャンネルにおける、蛍光持ち越しがないことを確認した。第２の対照群として、すべての二重蛍光染色を、2次抗体に関するスイッチ発色団で実施した。
結果
ＧＣＳＦレセプター（図２６ａ、ｄ、ｇ）およびＧＭＣＳＦレセプター（図２６ｂ、ｅ、ｈ）は、海馬および皮質（図２６ｃ、ｆ、ｉ）両方で、同様のニューロン上で発現している。図２６は、海馬の歯状回（ａ〜ｃ）および門（ｄ〜ｆ）にて、ならびに皮質（ｇ〜ｉ）にて、ニューロン上の両方のレセプターの共発現を示している。この発見によってさらに、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦが、神経状態を処置することに関連して使用可能であること、および、造血因子の神経保護特性が、組み合わせ適用によって増強可能でありうるという主張を例証している。
ニューロン内でのｓｔｓｔ３を活性化することによって、ＧＣＳＦは、抗アポトーシス性に働く
結果
初代培養ニューロンは、作用の機構を分析するためのツールである。したがって本発明者らは、Ｇ−ＣＳＦレセプターが培養中２１日後、海馬または皮質ニューロン上で発現しうるかどうかを確認した。実際、本発明者らは、ＰＣＲ（先の実施例）および免疫細胞化学によって、皮質ならびにほとんどの海馬ニューロン上両方での発現を確認した。脳梗塞病態生理学でのもっとも重要な機構の１つは、神経細胞死の遅延である（Ｃｈｏｉ（１９９６），Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ，６，６６７−７２、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｎａｔ Ｍｅｄ，５，５５４−９、Ｍａｔｔｓｏｎ（２０００），Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１，１２０−９）。したがって本発明者らは、Ｇ−ＣＳＦが、ニューロンにおけるアポトーシスカスケードを干渉しうると予想した。Ｇ−ＣＳＦレセプターを発現することが見出された、初代神経培養において、脳虚血の間の関連事象である、酸化窒素に対する曝露によって、ＰＡＲＰ−開裂によって証明されたように、プログラムされた細胞死において、用量依存的増加が導かれる（示していない）。５０ｎｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦでの処置により、図２７で例示されたように、ＮＯＲ３処置の後のアポトーシス細胞死が劇的に減少した。造血系列の細胞にて、ＧＭ−ＣＳＦレセプターは、ヤヌス（Ｊａｎｕｓ）キナーゼ２（ＪＡＫ２）およびシグナル伝達物質および転写活性化（ｓｔａｔ）タンパク質（Ｊａｋ−ｓｔａｔ経路）を介して、その抗アポトーシスシグナルを伝達する（たとえば（Ｅｐｌｉｎｇ−Ｂｕｒｎｅｔｔｅ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１６６，７４８６−９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．（２００３），Ｉｎｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ，７７，６０−７０））。本発明者らは、ｓｔａｔ１またはｓｔａｔ５のリン酸化による活性化を検出出来なかったが（図２７、パートＩＩＩ）、ｓｔａｔ３は、他の細胞型における、ＪＡＫ−ｓｔａｔ速度論の時間依存様式典型的に（図２７、パートＩＶ）、Ｇ−ＣＳＦの添加によって、強力にリン酸化された（図２７、パートＶ、Ｋｕｒｏｋｉ，Ｍ．＆ Ｏ’Ｆｌａｈｅｒｔｙ，Ｊ．Ｔ．「細胞外シグナル調節タンパク質キナーゼ（ＥＲＫ）−依存性およびＥＲＫ−非依存性経路は、遊走性因子およびサイトカイン類によって刺激された、ヒト好中球にて、セリン−７２７におけるＳＴＡＴ３を標的とする（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ
ｓｉｇｎａｌ−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ（ＥＲＫ）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｎｄ ＥＲＫ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｐａｔｈｗａｙｓ ｔａｒｇｅｔ ＳＴＳＴ３ ｏｎ ｓｅｒｉｎｅ−７２７ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｔｒｉｏｐｈｉｌｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ．）」Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３４１（Ｐｔ３），６９１−６（１９９９）より取り、適合した。）。阻害剤ＡＧ４９０によるＪＡＫ２／ｓｔａｔ３連結の阻害が、Ｇ−ＣＳＦの存在下で、シグナルの劇的な減少を導くので（図Ｘ）、Ｇ−ＣＳＦの、培養培地への添加によって誘因されるｓｔａｔ３ ｔｙｒ７０５リン酸化は、Ｇ−ＣＳＦレセプター／ＪＡＫ２経路を介して、特異的に仲介された。Ｓｔａｔ３活性化によって、ｂｃｌファミリーの抗アポトーシスタンパク質の誘導を導く（Ｙｏｓｈｉｄａ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ，１９６，６４１−５３、Ｓａｋａｉ ａｎｄ Ｋｒａｆｔ（１９９７），Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７２，１２３５０−８、Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｌｅｕｋｅｍｉａ，１３，７３５−８）。Ｇ−ＣＳＦの神経培養物への添加によって、脳虚血の間、ニューロンにおける強力な抗アポトーシスタンパク質である、Ｂｃｌ−Ｘ１およびＢｃｌ−２両方の時間依存増加が導かれる（図２７、パートＶＩ）。興味深いことに、最近の報告によって、神経障害後、運動ニューロンのために必須の生存タンパク質として、ｓｔａｔ３が示唆されている（Ｓｃｈｗｅｉｚｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，１５６，２８７−９７）。したがって、Ｇ−ＣＳＦは、ｓｔａｔ５およびＮＦ−κＢ活性化に関与するＥＰＯの提案された抗アポトーシス機構とは違って働くようである（Ｄｉｇｉｃａｙｌｉｏｇｌｕ ａｎｄ Ｌｉｐｔｏｎ（２００１），Ｎａｔｕｒｅ，４１２，６４１−７）。
方法
ラットからの初代皮質ニューロンを以下のように産出した。１０〜１２個の皮質を、ラット胚Ｅ１８から切断した。組織を、ＨＢＳＳ（バイオ ホワイタッカー（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔａｋｋｅｒ）、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中の１０ｍｇ／ｍｌトリプシン、５ｍｇ／ｍｌ ＥＤＴＡ／ＤＮａｓｅ（ロッシュ ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて分解した。消化を、１× Ｂ−２７補助剤（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む、四部分神経基礎培地を用いて停止した。遠心後、ペレットを、５ｍｌ培地中に溶解し、細胞を、ポリ−Ｌ−リシンでコートしたガラスカバースリップ上の２４ウェルプレートのウェルあたり、２５０，０００細胞の密度で、プレートした。培地は典型的には、５０ｍｌ神経基礎培地（ライフ テクノロジーズ（ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１ｍｌ補助剤Ｂ２７（ライフ テクノロジーズ）、５μｌ ｂＦＧＦ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、１９μｇを１００μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ７中に溶解した）および５０μｌ ペニシリン／ストレプトマイシン（ライフ テクノロジーズ）を含む。
ＳＴＡＴ１、ｐＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ５、ｐＳＴＡＴ５、ＧＣＳＦＲ、ＰＡＲＰ、開裂ＰＡＲＰ、カスパーゼ３、開裂カスパーゼ３、Ｂｃｌ２およびＢｃｌ ｘｌの検出を、ウエスタンブロッティングによって実施した。簡単に記すと、ニューロンを、示したように、１５０ｍＭ ＮＯＲ−３（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ），Ｓｅｅｌｚｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、および５０ｎｇ／ｍｌ Ｇ−ＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ，アムジェン（Ａｍｇｅｎ）、Ｔｈｏｕｓａｎｄ Ｏａｋｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で、２４時間処理した。細胞を、プレートよりかき取り、８００ｒｐｍにて５分間沈殿させ、２．５ｍｇ／ｍｌペプスタチン（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｓｅｅｌｚｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびアプロチニン（１：１０００、シグマ−アルドリッチ）を含む氷冷ＰＢＳ中で洗浄した。ペレットを、（１０μｌ １０×ＰＢＳ、７９，５μｌ Ｈ２Ｏ、１０μｌ １０％ＳＤＳ、０．５μｌ １００ｍＭ ＭｇＣｌ2、０．１μｌアプロチニン、０．１μｌロイペプチン、０．１μｌペプスタチン、０．１μｌ ＰＭ
ＳＦ、０．１μｌベンゾナーゼ（ロッシュ ダイアグノスティックス、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を含む）１００μｌ ベンゾナーゼ溶液を加えて再懸濁させた。可溶化の後、１容量のＰＢＳを加え、タンパク質濃度を決定した（ＢＣＡ−Ｔｅｓｔ、ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）。９５℃にて５分間変性させた後、１００μｇを、８％〜１２％ ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で流した。タンパク質を、半乾燥ブロッティングチャンバー（ワットマン バイオメトラ（Ｗｈａｔｍａｎ Ｂｉｏｍｅｔｒａ），Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、ニトロセルロース膜（Ｐｒｏｔａｎ ＢＡ７９，シュレヒヤー＆シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ），Ｄａｓｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にうつした。ブロットを、ＰＢＳ／０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０中の５％ミルク粉末でブロックし、ＰＢＳ／０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄し、それぞれの１次抗体（抗−開裂ＰＡＲＰ−抗体、細胞シグナル伝達、１：１０００；抗ＰＡＲＰ、細胞シグナル伝達、１：１０００；抗開裂カスパーゼ３、細胞シグナル伝達、１：２００；抗カスパーゼ３、細胞シグナル伝達、１：２００；抗Ｂｃｌ２、ＢＤ トランスダクション ラボラトリーズ（ＢＤ Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、１：５００；抗Ｂｃｌ Ｘ１、ＢＤ トランスダクション ラボラトリーズ、１：５００；抗ｐＳＴＡＴ３ｔｙｒ、細胞シグナル伝達、１：５００；抗ＳＴＡＴ３、細胞シグナル伝達、１：５００；抗ＧＣＳＦＲ、サンタ クルズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、１：２００；抗ｐＳＴＡＴ５、細胞シグナル伝達、１：５００；抗ｓｔａｔ５、細胞シグナル伝達、１：２００；抗ｐＳＴＡＴ１、細胞シグナル伝達、１：５００）と共に、４℃にて一晩インキュベートした。洗浄後、ブロットを、それぞれ2次抗体（抗ウサギ、または抗マウス抗血清ＨＲＰ−共役、ジアノバ（Ｄｉａｎｏｖａ），Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ １：４０００）と、室温にて１時間インキュベートした。シグナルを、スーパーシグナル化学ルミネセンス系（ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ），Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を用いて検出し、Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ−ＥＣＬ（アマシャム ファルマシア バイオテック（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）に曝露した。ＰＡＲＰ開裂を、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標） ＩｍａｇｅＪ ｖ１．２９（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて、走査性オートラジオグラフ上で定量した。
ＧＣＳＦおよびそのレセプターが、脳虚血によって誘導される
脳虚血のＭＣＡＯモデル
局所性脳虚血（ＭＣＡＯ、中大脳動脈梗塞）を誘導するための手順を、実施例１に記述したように実施した。
広範囲虚血モデル
虚血／再潅流のために無作為化した動物における実験手順を、先に詳細に記述された（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ，２０，１４２５−３６）ように実施した。簡単に記すと、ラットを麻酔し（抱水クロラール）、経口挿管し、機械的に換気した（実験を通して、ＰａCO2 ３５〜４０ｍｍＨｇ、ＰａCO2 ９５〜１１０ｍｍＨｇ）。両方の総頸動脈（ＣＣＡ）を曝露し、左側に、血液採取、およびＭＡＢＰの連続モニタリングのために、ポリエチレンチューブ（ＰＥ−５０）をカテーテル挿入した（Ｓｉｒｅｃｕｓｔ ３１０，シーメンズ（Ｓｉｅｍｅｎｓ）、Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）。右側に、ナイロン糸を、後に一過性脳虚血を誘導するために使用すべき、ＣＣＡの周辺に緩く縛った。動物の頭を、ＥＥＧおよびＣＢＦ測定のために、定位フレーム中に固定した（詳細に関しては、（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋ，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｎｏｇａ，Ａｓｔｈｅｉｍｅｒ，Ｇｏｔｚ，Ｋｏｒｎｅｒ，Ｈｅｉｍａｎｎ，Ｗｅｌｓｃｈｏｆ ａｎｄ Ｋｅｍｐｓｋｉ（２０００），Ｊ Ｃｅｒｅｂ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ Ｍｅｔａｂ，２０，１４２５−３６）を参照のこと）。
頭蓋冠を、正中切開によって曝露し、塩化銀ピンＥＥＧ電極を維持するように設計された２つの陥没がつくられる（高速歯科用ドリル、Ｐｒａｘｉｎｏｓ ａｎｄ Ｗａｔｓｏｎ（１９８６）脳アトラスにしたがって、左体知覚皮質および前頭洞上に位置する）。右半球にわたり、約２４ｍｍ2の頭蓋骨を、薄骨薄層（１．３〜５．３ｍｍ右に対する側面、および１．５〜７．５ｍｍブレグマから頭部）を残して除去する。コンピュータ駆動マイクロマニピュレーターによって制御したレーザードップラー−フロープローブ（波長：７８０μｍ、ＢＰＭ ４０３Ａ、ＴＳＩ社（ＴＳＩ Ｉｎｃ。）、Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ，ＵＳＡ）を使用して、「スキャニング技術」（Ｓｏｅｈｌｅ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｃｈｉｒ Ｓｕｐｐｌ，７６，１８１−４）を用いて、３０局所における、局所脳血流（ｒＣＢＦ）を決定した。対局側（３．３〜５．３ｍｍ左に対する側面、５．０〜７．０ｍｍブレグマから頭部）において、より小さな（４ｍｍ2）ウィンドウを、静止レーザードップラー−フロープローブ（波長７８０μｍ、ＢＰＭ２、バサメディセス社（Ｂａｓａｍｅｄｉｃｅｓ Ｉｎｃ．）、Ｓｔ．Ｐａｕｌ，ＭＮ，ＵＳＡ）を用いて、局所脳血流（ｌＣＢＦ）を測定するために設定した。温度プローブを、右側頭筋、左耳介結節、および直腸中６ｃｍの深さで、先に記述されたように（（Ｂｒａｍｂｒｉｎｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ Ｍｅｔｈｏｄｓ，９２，１１１−２２））配置した。コア温度（温度制御加熱ブランケット）および側頭筋温度（近梗塞心臓放熱体）は、実験手順を通して、３７．５±０．１℃に制御する。動物の下体部分を、気密チャンバー内においた。これによって、電気的に制御された吸引ポンプによる低気圧を確立可能になり、これによって制御した形で、動物の動脈血圧（血液貯留）が減少する（「低気圧低血圧（ｈｙｐｏｂａｒｉｃ ｈｙｐｏｔｅｎｓｉｏｎ）」）。手術後安定化期間の３０分後、一過性広範囲脳虚血を、血管を梗塞するために、右頸動脈の周りの、定義した重量まで、付着したナイロン糸を引っ張ることで開始し（動脈厚は、左頸動脈に配置したカテーテルによって測定した）、ＭＡＢＰは、低比重低血圧技術を用いて、同時に３５ｍｍＨｇまで減少した。脳虚血を、連続ｌＣＢＦ、ｒＣＢＦおよびＥＥＧ測定によって確認した。広範囲脳虚血の１５分後、糸を切断し、吸引を終了して、再潅流を可能とした。回復９０分後に、ＣＣＡカテーテルを取り除き、切開を閉じ、動物を、換気装置から離した。抜管（再潅流の１１０分付近）において、および安定した生存兆候の存在下、ラットをケージに戻し、加熱ブランケットを用いて、熱欠損を防止した。
定量的ＰＣＲ
ＲＮＡを、標準のプロトコール（（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ ａｎｄ Ｓａｃｃｈｉ（１９８７），Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，１６２，１５６−９）にしたがい、つづいてキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮｅａｓｙ（商標）ミニキット精製で単離した。組織試料を、それぞれ、広範囲脳虚血、および局所性脳虚血の種々の時間点での、障害側への同側および対側から、全ラット脳より得た。ｃＤＮＡを、標準の条件を用いて、オリゴｄＴプライマー、ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を用いて、１０μｇトータルＲＮＡより合成した。定量的ＰＣＲを、ＤＮＡ二本鎖のＳＹＢＲグリーン染色で、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）システム（ロッシュ ダイアゴノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。サイクル状態は以下のようであった。ＧＣＳＦＲ：５分間９５℃、５秒間９５℃、１０秒間６６℃、３０秒間７２℃、１０秒間８４℃、５０サイクル。ＧＣＳＦ、５分間９５℃、５秒間９５℃、１０秒間６４℃、３０秒間７２℃、１０秒間８８℃、５０サイクル。融解曲線を以下のパラメータで実施した。９５℃から５０℃まで冷却、０．２℃／秒にて９９℃まで傾斜。以下のプライマー対を使用した。「ラットＧＣＳＦＲ−ｆｒａｇ−３２ｓ」ＣＣＡ ＴＴＧ ＴＣＣ ＡＴＣ ＴＴＧ ＧＧＧ ＡＴＣ（配列番号４２）、「ラットＧＣＳＦＲ−ｆｒａｇ−２６５ａｓ」ＣＣＴ ＧＧＡ ＡＧＣ ＴＧＴ ＴＧＴ ＴＣＣ ＡＴＧ（配列番号４３）、「ラットＧＣＳＦ−３４５ｓ」ＣＡＣ ＡＧＣ ＧＧＧ ＣＴＣ ＴＴＣ ＣＴＣ ＴＡＣ ＣＡＡ（配列番号４４）、および「ラットＧＣＳＦ−８６２ａｓ」ＡＧＣ ＡＧＣ ＧＧＣ ＡＧＧ ＡＡＴ ＣＡＡ ＴＡＣ
ＴＣＧ（配列番号４５）。Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ＰＣＲを、製造業者（ロッシュ ダイアグノシス）の推奨にしたがって、ＳＹＢＲグリーンマスターミックスを用いて実施した。産物と特異性を、融解点解析およびアガロースゲル電気泳動によって確認した。試料のｃＤＮＡ含量を、Ｃｙｃｌｐｏｐｈｏｌｉｎの発現レベルに対して標準化した（プライマー「ｃｙｃ５」ＡＣＣＣＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＴＴＣＧＡＣ（配列番号４６）、「ａｃｙｃ３００」ＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧ（配列番号４７））。シクロフィリンに対する標準化より由来した相対的調整レベルを、疑似手術動物と比較した。エラーバーは、標準偏差を示し、これらは、３倍連続希釈ｃＤＮＡ−試料から計算し、測定の信頼性を反映している。
図２８（パートＩおよびＩＩ）Ａは、同側および対側上の局所性虚血２時間および６時間後の、ＧＣＳＦの非常に強力なアップレギュレーションを示しており、一方レセプターは６時間後に中程度に減少した（図２８Ｂ）。
ＧＣＳＦの発現の誘導は、ＭＣＡＯモデルに特異的ではないが、しかしまた、広範囲虚血ではより少ない程度までわずかに見られた（図２８Ｃ）。この発見は、Ｇ−ＣＳＦがたしかに、脳−内因性神経保護リガンドであること、およびＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦでの処置が、神経保護の内因性原理を利用するという仮説を支持する。
ＧＣＳＦおよびレセプターは、皮質高梗塞の周縁部領域でアップレギュレートされる
方法
光血栓皮質虚血の虚血性モデルを、以上の実施例で記述したように構築した。
免疫組織化学：パラフィン包埋組織（２μｍ）の切片を、脱パラフィン化し、マイクロ波処理した（５００Ｗにてクエン酸緩衝液、１０分間）。その後、切片を、湿室中で、ＧＣＳＦまたはＧＣＳＦ−レセプター抗血清（ＳＣ１３１０２またはＳＣ６９４、サンタ クルズ バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ；１：５００）とともに、１時間、室温にてインキュベートした。染色を、色原体としてＤＡＢ（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）で、ＡＢＣ技術を用いて視覚化した。陰性対照を、１次抗血清の削除によって実施した。
結果
光血栓虚血の誘導につづき６時間、レセプターおよびリガンド両方に関して、図２９中矢印によって示したように、初代虚血障害の周辺の領域（「周縁部」）におけるニューロンの染色の増強の、明らかな証拠が存在した。この発見は、本発明者らが、神経系の新規の内因性神経保護系をカバーしていなかったという原理を明確に示している。また、周縁領域のＧＣＳＦの作用の第１機構が、実際おそらくほとんど抗アポトーシスであることを明確に示している。
海馬におけるＧＣＳＦＲおよびダブルエコルチンの共局在化
使用した免疫組織化学法
実験を、実施例２１で記述したように実施した。ＧＣＳＦ抗血清の代わりに、１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中０．２％ ＢＳＡ中、１：２００で希釈したモルモット抗ダブルエコルチン（ＤＣＸ）ポリクローナル抗体（ケミコン インターナショナル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、Ｇｅｒｍａｎｙ）を適用した。１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中０．２％ ＢＳＡ中での、３×２分間の切片の洗浄の後、０．２％ＢＳＡを含む、１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中、１：２００に希釈したビオチン化ヤギ抗−モルモットＩ
ｇＧ（ベクター ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ＵＳＡ）とともに３０分間インキュベートした。切片の洗浄後、ＴＲＩＴＣ−共役ストレプトアビジン（ジアノバ、１：２００）を、実施例２１で記述したプロトコールにしたがって、室温にて１．５時間適用した。
結果
図３０は、海馬の歯状回（ａ〜ｆ）および門（ｇ〜ｉ）中のニューロン上の、ＧＣＳＦレセプター（ａ、ｄ、ｇ）およびダブルエコルチン（ｂ、ｅ、ｈ）の発現を示している。Ｇ−ＣＳＦレセプターおよび早期神経マーカーダブルエコルチン（Ｊｉｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９８，４７１０−５）両方の発現の重なり（図３０ｃ、ｆ、ｉ）が、神経分化の早期段階におけるＧ−ＣＳＦの機能的役割に関係していると見なされる。
ＧＣＳＦが、成体神経幹細胞の神経分化を誘導する
神経幹細胞（ＮＳＣ）の産出
ラットからの成体神経幹細胞の産出を、実施例９で記述したように実施した。
脳室下領域（ＳＶＺ）から由来した３９ＤＩＶ培養神経球を、以下のＧＣＳＦ濃度、それぞれ１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌおよび５００ｎｇ／ｍｌで１回刺激した。組換え体ヒトＧＣＳＦ（Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）、アムジェン（Ａｍｇｅｎ），Ｅｕｒｏｐｅ Ｂ．Ｖ．，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）の添加４日後に、細胞を回収し、ＲＮＡを単離した。未処理細胞を対照として利用した。
定量的ＰＣＲ
ＧＣＳＦ処理および未処理のＳＶＺの神経球のＲＮＡを、製造業者プロトコールにしたがって、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキットを用いて単離した。ｃＤＮＡを、オリゴｄＴプライマー、標準条件を用いるｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を用いて、２μｇ全ＲＮＡより合成した。定量ＰＣＲを、ＤＮＡ二本鎖のＳＹＢＲグリーン染色にて、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ系（ロッシュ ダイアゴノスティクス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。サイクル条件は以下のようであった。
ＮｅｓｔｉｎおよびＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）：３分間９５℃、５秒間９５℃、１０秒間５８℃、３０秒間７２℃；１０秒間８１℃、５０サイクル。ベータＩＩＩ−チューブリン：３分間９５℃、５秒間９５℃、１０秒間６５℃、３０秒間７２℃；１０秒間８７℃、５０サイクル、ＰＬＰ：３分間９５℃、５秒間９５℃、１０秒間６２℃、３０秒間７２℃；１０秒間８４℃、５０サイクル、ＧＦＡＰ：３分間９５℃、５秒間９５℃、１０秒間６０℃、３０秒間７２℃；１０秒間８１℃、５０サイクル。融解曲線を、以下のパラメータを用いて決定した。９５℃から５０℃まで冷却、０．２℃／秒にて９９℃まで傾斜。以下のプライマー対を使用した。「ラットネスチン−プラス」ＡＧＧ ＡＡＧ ＡＡＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＡＧ ＡＣ（配列番号４８）、「ラットネスチン−マイナス」ＴＴＣ ＡＣＣ ＴＧＣ ＴＴＧ ＧＧＣ ＴＣＴ ＡＴ（配列番号４９）、「ラットＮＳＥ−プラス」ＧＧＣ ＡＡＧ ＧＡＴ ＧＣＣ ＡＣＴ ＡＡＴ ＧＴ（配列番号５０）、「ラットＮＳＥ−マイナス」ＡＧＧ ＧＴＣ ＡＧＣ ＡＧＧ ＡＧＡ ＣＴＴ ＧＡ（配列番号５１）、「ラットベータＩＩＩ−ｔｕｂ−７１６ｓ」ＣＣＡ ＣＣＴ ＡＣＧ ＧＧＧ ＡＣＣ ＴＣＡ ＡＣＣ ＡＣ（配列番号５２）、「ラットベータＩＩＩ−ｔｕｂ−１０２２ａｓ」ＧＡＣ ＡＴＧ ＣＧＣ ＣＣＡ ＣＧＧ ＡＡＧ ＡＣＧ（配列番号５３）、「ラットＰＬＰ−５１８ｓ」ＴＣＡ ＴＴＣ ＴＴＴ ＧＧＡ ＧＣＧ
ＧＧＴ ＧＴＧ（配列番号５４）、「ラットＰＬＰ−９２７ａｓ」ＴＡＡ ＧＧＡ Ｃ
ＧＧ ＣＡＡ ＡＧＴ ＴＧＴ ＡＡＧ ＴＧＧ（配列番号５５）、「ラットＧＦＡＰ３’−１１２３ｓ」ＣＣＴ ＴＴＣ ＴＴＡ ＴＧＣ ＡＴＧ ＴＡＣ ＧＧＡ Ｇ（配列番号５６）、「ラットＧＦＡＰ３’−１２４５ａｓ」ＧＴＡ ＣＡＣ ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＡ ＧＧＣ ＡＣＴ Ｃ（配列番号５７）。Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲを、製造業者（ロッシュ ダイアゴノスティクス）の推奨にしたがって、ＳＹＢＲグリーンマスターミックスを用いて実施した。産物の特異性を、融解点解析およびアガロースゲル電気泳動によって確かめた。試料のｃＤＮＡ含量を、シクロフィリンの発現レベルに対して標準化した（プライマー：「ｃｙｃ５」ＡＣＣ ＣＣＡ ＣＣＧ ＴＧＴ ＴＣＴ ＴＣＧ
ＡＣ（配列番号５８）、「ａｃｙｃ３００」ＣＡＴ ＴＴＧ ＣＣＡ ＴＧＧ ＡＣＡ
ＡＧＡ ＴＧ（配列番号５９））。シクロフィリンに対する標準化から由来した相対的調節レベルおよび非処理細胞に対する比較。図３１は、ＧＣＳＦ処置４日後の神経マーカーである、ＮＳＥおよびベータＩＩＩ−チューブリンの強力で、濃度依存的なアップレギュレーションを示している。ＰＬＰおよびＧＦＡＰは、ＧＣＳＦ−濃度の依存性において中程度に調節される。エラーバーは、標準偏差を示しており、３倍連続希釈ｃＤＮＡ−試料から計算し、測定の信頼性を反映している。
脳中のＧＭＣＳＦおよびそのレセプターの共局在化
使用した免疫組織化学法
切片を、Ｘｙｌｏｌにて２×５分間、１００％エタノール、ついで９６％以上から７０％までのエタノールの下降濃度にて２×２分間処理することによって脱パラフィン化した。最後に切片を、蒸留水で洗浄し、マイクロ波処理した（６００Ｗにてクエン酸緩衝液、１５分間）。その後、切片を、蒸留水にて洗浄し、抗原を、０．２％ＢＳＡを含む１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中で、３×５分間ブロックした。０．２％ＢＳＡを含む１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中で希釈した、ＧＭＣＳＦレセプター抗血清（ＳＣ６９０、サンタ クルズ
バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ，ＵＳＡ、１：１００）を、湿室中で、１時間、室温にてインキュベートした。ついで切片を、０．２％ＢＳＡを含む１×ＴＢＡ（ｐＨ７．４）にて、３×２分間洗浄した。ついで、2次抗体（ヤギ抗ウサギＦａｂ−ＦＩＴＣ、ジアノバ、１：５０）を、０．２％ＢＳＡを含む１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中で、４℃にて一晩適用した。１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中０．２％ＢＳＡでの３×２分の切片の洗浄後、１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中０．２％ＢＳＡ中１：１００希釈したＧＭＣＳＦ抗血清（ＳＣ１３１０１；サンタ クルズ バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ，ＵＳＡ）を室温にて１時間適用した。切片を、記述したように３回洗浄し、０．２％ＢＳＡを含む１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中１：２００に希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ベクター ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ），ＵＳＡ）とともに３０分間のインキュベートした。再び切片を洗浄した後、ＴＲＩＴＣ−共役ストレプトアビジン（ジアノバ、１：２００）を、室温にて１．５時間適用した。ついで、切片を、１×ＴＢＳにて３×２分間洗浄し、１×ＴＢＳ中１：１００００に希釈した、核色素ＤＡＰＩで１０分間染色した。最後に、切片を、１×ＴＢＳにて３×２分間洗浄し、蛍光に関するマウント培地にてマウントした（Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ、ベクター ラボラトリーズ、ＵＳＡ）。オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）ＩＸ８１顕微鏡、および「Ａｎａｌｙｓｉｓ」ソフトウェアパッケージ（ソフト イメージング システムズ（Ｓｏｆｔ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）、Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にて、デジタル写真を撮影した。
すべての二重蛍光実験を、並行単独染色によって制御し、第２チャンネルにおける、任意の蛍光キャリー−オーバーが存在しないことに関して確認した。第２の対照群として、すべての二重蛍光染色を、2次抗体に対するスイッチ発色団で実施した。
結果
ＧＭＣＳＦレセプター（図３２ａ、ｄ、ｇ）およびＧＭＣＳＦ（図３２ｂ、ｅ、ｈ）は、歯状回（図３２ａ〜ｃ）、門（図３２ｄ〜ｆ）および皮質（図３２ｇ〜ｉ）で、ニューロン上に共局在化する。これらのデータは、ＧＭＣＳＦがオートクリンリガンドであるという概念を支持する。
ＧＭＣＳＦおよびそのレセプターは脳虚血によってアップレギュレートされる
脳虚血のＭＣＡＯモデル
局所性脳虚血（ＭＣＡＯ、中大脳動脈梗塞）を誘導するための手順を、実施例１で記述したように実施した。
広範囲虚血モデル
手術調製および一過性脳虚血を、以前に記述したように実施した。
定量的ＰＣＲ
ＲＮＡ単離およびｃＤＮＡ合成を、以前に記述したプロトコールにしたがって実施した。サイクル状態は以下のようである。ＧＭＣＳＦＲ：５分間９５℃、５秒間９５℃、１０秒間６２℃、３０秒間７２℃；１０秒間８０℃、５０サイクル。ＧＭＣＳＦ：５分間９５℃、５秒間９５℃、１０秒間６０℃、３０秒間７２℃；１０秒間８１℃、５０サイクル。融解曲線を、以下のパラメータで実施した。９５℃から５０℃まで冷却、０．２℃／秒にて９９℃まで傾斜。以下のプライマー対を使用した。ラットＧＭＣＳＦＲ「ＢＲ４−４ｓ９６」ＡＣＧ ＴＣＧ ＴＴＧ ＧＣＴ ＣＡＧ ＴＴＡ ＴＧＴ Ｃ（配列番号６０）および「ＢＲ４−４ａｓ２７２」ＡＴＴ ＴＡＴ ＧＴＣ ＡＧＡ ＧＡＴ ＧＧＡ ＧＧＡ ＴＧＧ（配列番号６１）。「ラットＧＭＣＳＦ−７２３ｓ」ＧＧＡ ＧＣＴ ＣＴＡ ＡＧＣ ＴＴＣ ＴＡＧ ＴＡＣ（配列番号６２）および「ラットＧＭＣＳＦ−９０８ａｓ」ＧＧＣ ＴＣＡ ＡＴＧ ＴＧＡ ＴＴＴ ＣＴＴ ＧＧＧ（配列番号６３）。Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ（登録商標）ＰＣＲを、製造業者（ロッシュ ダイアグノシス）の推奨にしたがって、ＳＹＢＲグリーンマスターミックスを用いて実施した。融解点解析およびアガロースゲル電気泳動によって、産物の特異性を確かめた。試料のｃＤＮＡ含量を、シクロフィリンの発現レベルに対して標準化した（プライマー：「ｃｙｃ５」ＡＣＣ
ＣＣＡ ＣＣＧ ＴＧＴ ＴＣＴ ＴＣＧ ＡＣ（配列番号５８）、「ａｃｙｃ３００」ＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＡＴＧ（配列番号５９））。相対調整レベルを、サイクロフィリンに対する標準化の後に導き、疑似手術動物と比較した。エラーバーは、標準偏差を示しており、これらは、３倍連続希釈ｃＮＤＡ−試料から計算され、測定の信頼性を反映している。
対側および同側における局所性虚血２時間および６時間後、ＧＭＣＳＦの非常に強力なアップレギュレーションが、図３３Ａで示されている。ＧＭＣＳＦの誘導が、より小さな程度であるが、広範囲虚血でも示されうる（図３３Ｂ）。ＧＭＣＳＦレセプターでさえ、広範囲虚血６時間後、わずかにアップレギュレートされる（図３３Ｃ）。これらのデータは、ＧＭＣＳＦが、内因性神経保護機構の一部であるという仮説を支持する。
海馬におけるＧＣＳＦＲとダブルコルチンの共局在化発現
使用した免疫組織化学法
発現を、以前に記述したように実施した。ＧＭＣＳＦ抗血清の代わりに、１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中０．２％ ＢＳＡ中で１：２００に希釈した、モルモット抗ダブルコルチン（ＤＣＸ）ポリクローナル抗体（ケミコン インターナショナル（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、Ｇｅｒｍａｎｙ）を適用した。１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４
）中０．２％ ＢＳＡで、切片を３×２分間洗浄した後、０．２％ ＢＳＡを含む１×ＴＢＳ（ｐＨ７．４）中で１：２００希釈した、ビオチン化ヤギ抗モルモットＩｇＧ（ベクター ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ＵＳＡ）とともに、３０分間インキュベートした。再び切片を洗浄した後、ＴＲＩＴＣ−共役ストレプトアビジン（ジアノバ、１：２００）を、以前に記述したプロトコールにしたがって、室温にて１．５時間適用した。
結果
図３４は、海馬の歯状回（ａ〜ｃ）および門（ｄ〜ｉ）中のニューロン上での、ＧＭＣＳＦレセプター（ａ、ｄ、ｇ）およびダブルコルチン（ｂ、ｅ、ｈ）の発現を示している。Ｇ−ＣＳＦレセプターおよび早期神経マーカーダブルコルチン（Ｊｉｎ，Ｍｉｎａｍｉ，Ｌａｎ，Ｍａｏ，Ｂａｔｔｅｕｒ，Ｓｉｍｏｎ ａｎｄ Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ（２００１），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９８，４７１０−５）の発現の重複（図３４ｃ、ｆ、ｉ）が、神経分化の早期段階におけるＧＭＣＳＦの機能的な役割を示唆し、脳梗塞、パーキンソン病、ＡＬＳおよび多くの他のもののような、神経発生に影響を与えることが、治療標的であり得る、すべての神経変性疾患に対するＧＭＣＳＦの適用性を強調する。
ＧＭＣＳＦは、成体神経幹細胞の神経分化を誘導する
神経幹細胞の産出
ラットからの成体神経幹細胞の産出を、実施例９で記述したように実施した。細胞を、８００×ｇにて５分間、細胞を遠心し、上清を取り除き、１×ＰＢＳにて１回洗浄することによって、２〜３週間ごと継代した。１ｍｌ アクターゼ（シグマ（Ｓｉｇｍａ））中の再懸濁および３７℃にて１５分間のインキュベーションの後、細胞を計数し、６ウェルプレート中のウェルあたり１．５〜２．０×１０5細胞の密度でプレートした。海馬由来の神経幹細胞を、第４継代の後、１０ｎｇ／ｍｌ ＧＭＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ（登録商標）、Ｂｅｒｌｅｘ，Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ Ｇｅｒｍａｎｙ）にて刺激し、３日後、ＲＮＡ単離のために回収した。未処理細胞を対照として利用した。
定量的ＰＣＲ
ＧＭＣＳＦ処理および未処理のＳＶＺの神経球のＲＮＡを、製造業者プロトコールにしたがって、Ｑｉａｇｅｎ ＲＮｅａｓｙミニキットを用いて単離した。ｃＤＮＡを、オリゴｄＴプライマー、標準条件を用いるｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を用いて、５μｇ全ＲＮＡより合成した。定量ＰＣＲを、ＤＮＡ二本鎖のＳＹＢＲグリーン染色にて、Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ系（ロッシュ ダイアゴノスティクス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて実施した。ベータＩＩＩ−チューブリン、ＮＳＥ、ＰＬＰおよびＧＦＡＰのために使用したＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ＰＣＲの実行、サイクル条件およびプライマー対は以前に記述した。シクロフィリンに対する標準化から由来した相対的調節レベルおよび非処理細胞に対する比較。図３５Ａにて、神経幹細胞の分化能力、および分化した細胞の特異的マーカー発現を、略図的に例示している。１０ｎｇ／ｍｌ ＧＭＣＳＦでの神経幹細胞の処置は、結果として、ベータＩＩＩ−チューブリンの発現の有意な増加（ｎ＝３、ｐ＜０．０５、両側ｔ−検定）となり、成熟ニューロンのためのマーカーである、小さな程度のＮＳＥとなる（図３５Ｂ）。ＰＬＰおよびＧＦＡＰの発現レベルでは、変化は観察されなかった。本実施例は、神経発生の調整に対するＧＭＣＳＦの適用性を強調する。これは、分化ニューロンのインビトロ発生、ならびに内因性幹細胞へ影響を与えること、および広範囲のヒト疾患、とりわけ神経変性疾患への適応性両方に有用である。
Ｇ−ＣＳＦは、血液−脳−関門（ＢＢＢ）を通過する
文献で入手可能なほとんどのデータは、Ｇ−ＣＳＦおよび関連するサイトカインの血清レベルに関する情報を含む。しかしながら、神経疾病の治療におけるＧ−ＣＳＦの効果的な使用に関する１つの重要なパラメータは、血管−脳−関門（ＢＢＢ）を介したタンパク質の通過である。この疑問は、多くのタンパク質性薬剤が、血液とニューロン間のこの天然の境界を通過出来ないと知られているために、特に興味があるものである。他方、エリスロポイエチンおよびまた、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を含むいくつかのタンパク質が、ＢＢＢを通過可能であり、ＣＮＳ中のニューロンにて効果的であることが示された（ＭｃＬａｙ，ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｂｒａｉｎ，１２０，２０８３−９１．、Ｂｒｉｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ
Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，９７，１０５２６−３１）。
Ｇ−ＣＳＦが、血液−脳関門を通過可能であることを証明するために、本発明者らは、ラット脳内の注入Ｇ−ＣＳＦの出現を試験した。したがって、本発明者らは、非常に感度の高いヨウ化アッセイを適用した。対照として、Ｇ−ＣＳＦおよびＢＳＡを、Ｉｏｄｏｇｅｎ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、Ｔａｕｆｋｉｒｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）法によって、131Ｉ（アマシャム バイオサイエンセス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で放射標識し、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（アマシャム バイオサイエンセス、Ｆｒｅｉｂｕｒｇ Ｇｅｒｍａｎｙ）カラム上で精製した。精製したタンパク質が、サイズ排除クロマトグラフィーによって解析したときに、正確な分子量の単独のピークとして、未標識の標準化合物とともに共溶出された。放射標識したタンパク質を、メスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０〜３００ｇ）の尾静脈を介して注射した。競合取り込み研究のために、冷タンパク質を、標識した化合物と混合して、共注入した。解剖の前に短く、ラットを、Ｒｏｍｐｕｎ／Ｋｅｔａｎｅｓｔにて麻酔し、下腹大動脈（注入後１、４および２４時間）を介して１００ｍｌ生理食塩水で潅流し、血液を取り除いた。全脳および血液を解剖し、乾燥ブロットし、測量した。血液を遠心して、血清を得た。放射活性を、注射物の試料とともに、γ−カウンター（ＬＢ
９５１Ｇ、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で測定し、％ＩＤ／組織のｇを計算した。この結果は、Ｇ−ＣＳＦが脳に存在し、アルブミンと比較して、血液脳関門の通過が、時間にわたり、４〜５の因子によって増加したことを示していた。放射標識Ｇ−ＣＳＦの注射後２４時間でとった試料が、１および４時間と比較して、レベルの増加を示している（図３６）。これらの観察によって、血液中に静脈内投与されたＧ−ＣＳＦが、ＢＢＢを通過し、ＣＮＳ−ニューロン上の特異的レセプターをまず活性化可能であることが示される。
血清および脳中の放射標識Ｇ−ＣＳＦの量を測定し、脳／血清の比を、時間に対してプロットした。対照として、ウシ血清アルブミンを使用した。脳組織の血液汚染を避けるために、ラットを、解剖の前に、１００ｍｌの生理食塩水で潅流した。
ＧＭ−ＣＳＦは、血液−脳−関門（ＢＢＢ）を通過する
ＧＭ−ＣＳＦが、血液−脳−関門を通過可能であることを示すために、本発明者らは、Ｇ−ＣＳＦに関して、実施例３１で記述したように、ヨウ化ＧＭ−ＣＳＦでラットに注射した。実験によって、同様の結果が得られ、静脈内投与後のラット脳内のＧＭ−ＣＳＦおよびアルブミンの存在の比較によって、ＧＭ−ＣＳＦレベル（脳対血清比）が、アルブミンよりも３〜４倍高いことが示されている。データが、ＧＭ−ＣＳＦが、血液−脳−関門を通過可能であることを示している（図３７）。
図３７で、血清および脳中の放射標識ＧＭ−ＣＳＦの量を測定し、脳／血清の比を時間に対してプロットした。対照として、ウシ血清アルブミンを使用した。脳組織の血液汚染
を避けるために、解剖の前に、１００ｍｌの生理食塩水でラットを潅流した。
筋萎縮側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｌａｔｅｒａｌ Ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（ＡＬＳ））の処置のためのＧ−ＣＳＦ
Ｇ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦが、２つの方向、第１に、ＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦ両方のレセプターおよびリガンド両方が、脊髄の前角における大運動ニューロン中に発現すること、第２に、Ｇ−ＣＳＦが、アポトーシスカスケードに拮抗することによって部分的に働くことの証明、から由来して、ＡＬＳの処置に有用であるという考えは、ＡＬＳにて作用するアポトーシス機構に関する証拠に関して、非常に魅力的である（Ｌｉ，ｅｔ ａ；．（２０００），Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８８，３３５−９）。ＡＬＳに関して、もっとも一般的に使用されるマウスモデルは、家族性ヒトＡＬＳに関連すると示されてきているＳＯＤ１遺伝子における変異を持つ、トランスジェニックマウスである。これらのうちもっともよく使用されるのは、ＳＯＤ１（Ｇ９３Ａ）トランスジェニック系列である。典型的に、これらのマウスは、生存期間が短く、運動脆弱性の進行兆候を示し、これは行動試験（たとえば、グリップ強度試験、回転試験）によって簡単に査定可能である。治療的効果に関する多数の試験を、これらのマウスで実施し、リルゾール（Ｒｉｌｕｚｏｌｅ）、ミノサイクリン（Ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ）、カルニチン（Ｃａｒｎｉｔｉｎｅ）などのような物質に対して、生存延長活性を示した。ヒトにて唯一承認された薬剤であるＲｉｌｕｚｏｌｅがこれらのマウスで保護効果をもち、一方、ヒト試験にて失敗したＢＤＮＦが持っていないので、これらのマウスは、臨床的予測関連性を持つ。したがって、本発明者らは、Ｇ−ＣＳＦが、ＡＬＳのＳＯＤ１−トランスジェニックマウスモデルにおいて、寿命予測を延長するかどうか、または機能的結果を延長するかどうか、試験した。ＳＯＤ１および野生型マウスに、皮下に、１０μｇ／ｋｇ体重 Ｇ−ＣＳＦまたは賦形剤を、生後６０日より開始して投与し、時間を追ってモニタした。結果は、Ｇ−ＣＳＦ処置群にて、より長い寿命予測の明らかな傾向（図３８Ａ）、および長期にわたって、いくつかの測定点で有意に達した、運動機能（グリップ強度試験（図３８Ｂ）の改善を示唆した。さらに、処置群での体重の増加の傾向があった。
図３８Ａ：ＳＯＤ１−ｔｇマウスに、生後６０日より開始して、１０μｇ／ｋｇ体重を注射した。Ｇ−ＣＳＦ処置ＳＯＤ１−ｔｇマウスにおいて、寿命予測の延長の明らかな傾向がある（黒線対点線）。いくつかの点で、この差が、有意に達した。
図３８Ｂ：ＳＯＤ１−ｔｇマウスに、生後６０日より開始して、１０μｇ／ｋｇ体重を注射した。グリップ強度試験によって、Ｇ−ＣＳＦ処置ＳＯＤ１−ｔｇマウスにおいて、運動強度の改善が示される（白四角対白三角）。いくつかの点で、この差が、有意に達した。
パーキンソン病（ＰＤ）の齧歯類モデルにおけるＧＣＳＦの効果
ＭＰＴＰモデル：
パーキンソン病（ＰＤ）のもっとも特性化されたモデルが、神経毒素１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）を用いることによって開発されてきた。パーキンソンモデルにおけるＧＣＳＦの効果を研究するために、本発明者らは、８週齢オスマウスにて、ＭＰＴＰを投与した。マウスの各群（ｎ＝１５）に、繰り返しＭＰＴＰ−ＨＣｌまたは生理食塩水の腹腔内注射（３０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｌ／ｋｇの濃度にて、５連続日間、１日一回）、および緩衝液、ＧＣＳＦ（０．０３ｍｇ／ｋｇ／；５ｍｌ／ｋｇ）またはミノサイクリン（４５ｍｇ／ｋｇ；５ｍｌ／ｋｇ）の繰り返し皮下（２２連続日間、１日一回）投与を実施した。ＧＣＳＦの最初の適用は、ＭＰＴＰ（または、グループ０への生理食塩水）の後すぐに実施する一方で、両方の化合物が相互作用す
る可能性があるので、ミノサイクリンは、その３０分後に投与した。各群のすべての動物を２２日の時点で犠牲死させた。この時点まで、マウスを、自発運動（ＲｏｔａＲｏｄの加速）および体重両方に関して解析し、毎日測定した。さらに、各脳を、線状体および側坐核における、ドーパミン、３，４−ジヒドロフェニル酢酸（ＤＯＰＡＣ）およびホモバニリン酸（ＨＶＡ）の濃度を測定するために、電気化学的検出をともなうＨＰＬＣ解析にかけた。
しかしながら、このようなモデルでの神経保護薬剤の活性に関する、もっとも重要で、直接的なパラメータは、毒素後に生存しているニューロンの数である。したがって、チロシンハイドロキシラーゼ（ＴＨ）免疫組織化学およびＴＨ−陽性ニューロンの立体的定量を、各動物の中脳切片にて実施した（Ｔｒｉａｒｈｏｕ，ｅｔ ａｌ．（１９８８），Ｊ
Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ，１７，２２１−３２）。
結果は、ＧＣＳＦ処置群に関する体重の増加の経過を示唆した（データは示していない）。さらに、自発運動の改善が、ロータロッドの加速における試験の後に観察された（データは示していない）。マウスにおけるＭＰＴＰ誘導パーキンソンでの最近の研究により、これらの動物で、ミノサイクリンが、黒質線条体ドーパミン性神経変性を防止することが示された（Ｄｕ，ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ
ＵＳＡ，９８，１４６６９−７４）。本発明者らの研究にて、本発明者らは、そのデータを評価するために、ミノサイクリンを、神経保護化合物参照として選択した。５連続日にわたるＭＰＴＰでの亜急性処置によって、黒質緻密部内のチロシンヒドラーゼ（ＴＨ）−陽性ニューロンが有意に減少した（図３９Ａ）。ＧＣＳＦおよびミノサイクリンでの処置によって、ＴＨ−陽性ニューロンの黒質レベルの減少に対抗する、ほぼ同様の効果が示された（図３９Ｂ）。さらに、ＧＣＳＦおよびミノサイクリンは、ドーパミンの線条体レベル（図３９Ｂ）およびその代謝物を考慮に入れる場合に、ほぼ同様の臨床的効果を示した。
パーキンソン病のモデルにおけるＧＭＣＳＦの効果
ＭＰＴＰモデル
ＧＣＳＦに関して記述したように、パーキンソンモデルにおけるＧＭＣＳＦの効果を、以下の研究にて、確かめた（先の実施例を参照のこと）
マウスの各群（ｎ＝１５）に、繰り返しＭＰＴＰ−ＨＣｌまたは生理食塩水の腹腔内注射（３０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｌ／ｋｇの濃度にて、５連続日間、１日一回）、および緩衝液、ＧＭＣＳＦ（０．０３ｍｇ／ｋｇ／；５ｍｌ／ｋｇ）またはミノサイクリン（４５ｍｇ／ｋｇ；５ｍｌ／ｋｇ）の繰り返し皮下（２２連続日間、１日一回）投与を実施した。ＧＣＳＦの最初の適用は、ＭＰＴＰ（または、グループ０への生理食塩水）の後すぐに実施する一方で、両方の化合物が相互作用する可能性があるので、ミノサイクリンは、その３０分後に投与した。各群のすべての動物を２２日の時点で犠牲死させた。
体重増加の改善および回転加速を伴う自発運動の改善が、ＧＭＣＳＦの適用後に観察され、これはＧＣＳＦによってスコアされた結果と同様である（データは示していない）。したがって、ＧＭＣＳＦの治療的効果は、ＴＨ−陽性ニューロンの黒質レベルを考慮に入れると、ＧＣＳＦと比較してよりよい（図３９Ｂ）。線条体ドーパミンレベルおよびその代謝物の減少は、ＧＣＳＦと同等に、ＧＭＣＳＦの投与の後に、対抗可能である（データは示していない）。
ラットにおけるパーキンソン病に関する、６−ハイドロキシドパミン（６ＯＨＤＡ）モデルにおけるＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦの効果
以上で例示したように、ＧＣＳＦならびにＧＭＣＳＦは、マウスにおけるＭＰＴＰモデルにおいて、強力な神経保護特性をもった。これは、ＭＰＴＰが、ヒトにおけるＰＤを引き起こすその能力のために、探索された毒素であるために、ヒトパーキンソン病に対する適用性のため非常に強力な証明である。
パーキンソン病に関する造血因子の効果を研究するための、１つのさらなるモデルは、６−ＯＨＤＡモデルである。このモデルは、黒質内、または線条体内への直接の６ＯＨＤＡの注入に基づいている。薬物は、ドーパミン性ニューロン中に選択的に蓄積し、これらの細胞のアポトーシスを導く。ラットにおいて、６ＯＨＤＡは、片側傷害を産出するために、主に使用されてきた、効果的な神経毒素である。ドーパミン枯渇の程度は、アンフェタミンまたはアポモルフィンに対する応答での、回転運動を実験することによって査定可能である（Ｕｎｇｅｒｓｔｅｄｔ １９７１）。簡単で、良い定量可能運動欠損が、このモデルの主要な利点を構成する。運動パラメータに加えて、免疫組織化学の後のチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）陽性ニューロンの線条体レベル、およびＨＰＬＣ解析の後のドーパミンとその代謝物のレベルもまた測定可能である。６ＯＨＤＡを、ＰＤラットモデルにおけるＧＣＳＦおよびＧＭＣＳＦの効果を確認するために使用可能である。成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重２５０ｇ）を、黒質内または線条体内で、２μｌの６ＯＨＤＡ中８μｇの１定位注射の後、片側傷害とする。異なる用量のＧＣＳＦ（０．０３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇまたはその他）を、２週間、傷害の後すぐに、毎日皮下に投与可能である。処置動物の他の群には、線条体内、または黒質内ＧＣＳＦまたはＧＭＣＳＦ（３００μｇ／ｋｇ）の単一用量を、６ＯＨＤＡの注射後すぐに与える。ＭＰＴＰモデル研究に関してと同様に、ミノサイクリンを、神経保護参照化合物として使用可能である（皮下、１日一回４５ｍｇ／ｋｇ）。疑似動物および緩衝液で処置した傷害動物を、対照群として使用した。傷害２週間後、動物を、回転運動試験にかけた。ラットにアポモルヒネを皮下注射し、ボールケージにいれ、１時間間隔での対側回転の数を記録する。各動物群の回転の数を、標準統計検定を用いて比較する。運動試験の後、動物を殺し、ＴＨ−陽性ニューロンの総数をアッセイするための免疫化学のため、およびドーパミンレベルの測定のためのＨＰＬＣのために処理する。
ＧＭＣＳＦは、ｓｔａｔ３経路を活性化することによって、ニューロンにおいて、抗アポトーシス的に働く
すでに以上（実施例２２）で例示したように、ＧＣＳＦは、初代ニューロンにおけるアポトーシスを阻害することによって、強力な活性を持った。本発明者らは、ＧＭＣＳＦがまた、強力な抗アポトーシス活性機構を持つであろうと予測した。したがって、実施例２２にて例示したのと同様の型の実験を、ＧＭＣＳＦに対して実施した。ここで、ニューロンに適用した濃度は、５０ｎｇ ＧＭＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ、イムネックス（Ｉｍｍｕｎｅｘ））／ｍｌ培地であった。
図４０、パートＩは、ＧＭＣＳＦが、とりわけ、アポトーシスの兆候として現れている、ＰＡＲＰ開裂を阻害することを示している。細胞死は、ＮＯ−ドナーＮＯＲ−３を用いることによって、初代ニューロンで誘導した。
図４０、パートＩＩは、タンパク質自体が、ニューロンに発現してはいるが、ＧＭＣＳＦが、ＳＴＡＴ１（「ｐＳＴＡＴ１」）、またはＳＴＡＴ５（「ｐＳＴＡＴ５」）のリン酸化の増加を導かないことを示している。
図４０、パートＩＩＩＡは、ＧＭＣＳＦが、ＧＭＣＳＦ刺激に続く５分の時点で、最大である、ＳＴＡＴ３の時間依存活性を導くことを示している。６０分の時点で、ｐＳＴＡＴ３のレベルは、最初のレベルにおち、これは、造血系の細胞から知られている応答速度
論である。Ｂ．３つの依存性実験の定量。Ｃ．リン酸化によるＳＴＡＴ３の活性化は、ＪＡＫ２阻害剤ＡＧ４９０によって阻害可能である。ＧＭＣＳＦ投与５分後、ｐＳＴＡＴ３のレベルは、阻害剤の存在下で、非常に異なる。
図４０、パートＩＶは、ＧＭＣＳＦが、ｓｔａｔ３標的遺伝子Ｂｃｌ２およびＢｃｌＸＩの発現を強力に誘導することを示している。これらの遺伝子は、抗アポトーシスであると知られている。
本実験によって、１）ＧＭＣＳＦが、ニューロン上で抗アポトーシス的に働くこと、２）これはｓｔａｔ３経路によって仲介されること、が示されている。したがって、これはまた、ニューロンにおけるｓｔｓｔ３経路を、ｇｃｓｆまたはｇｍｃｓｆの新規類似体を含む、新規神経保護薬物を発見するための、スクリーニングツールとして使用する可能性を示している。
ＧＭＣＳＦは、齧歯類脳虚血モデルでの梗塞容量を減少する
本発明者らは、ラットにおける脳虚血の、もっとも許容されたモデル、中大脳動脈梗塞モデル（ＭＣＡＯ）においてＧＭＣＳＦでの実験を実施した。
原則として、本実験は、実施例１および１９で例示したように実施した。簡単に記すと、オスＷｉｓｔａｒラットを、吸入麻酔（ハロタン／Ｎ2Ｏ／Ｏ2）を用いて麻酔した。頸動脈を曝露し、コーティングしたナイロンフィラメントを総頸動脈内に挿入し、血流をブロックするまでＭＣＡへ進めた。フィラメントの正確な位置を、レーザードップラー計測によってモニタした。９０分梗塞後、フィラメントを取り除いて、再潅流を可能とした。ＧＭＣＳＦ（Ｌｅｕｋｉｎｅ、イムネックス（Ｉｍｍｕｎｅｘ））を、虚血の開始後３０分または３時間の時点いずれかで、注入ポンプによって、およそ２０分間の期間にわたり、静脈内カテーテル（大腿骨静脈）を介して、ラットに、２５０μｇ／ｋｇ体重の用量で適用した。梗塞容量を、コンピュータに基づく容積計、ＴＴＣ−染色の標準法で、２４時間後決定した。
図４１は、早期の時点（図４１、パートＩ）、および３時間の後期時間ウインドウの時点（図４１、パートＩＩ）両方で、ＧＭＣＳＦ−処置動物における梗塞容量の有意な減少が存在することを示している。
このことは、一般的に神経変性疾病、およびとりわけ脳梗塞処置に対する、ＧＭＣＳＦの適用性を例示している。
特許、特許明細書および発行物を含む、本明細書で引用された全ての参考文献が、参考文献としてその全てが本明細書に組み込まれている。
あきらかに、本発明の多数の改変および変化が、以上の技術に関して可能である。したがって、付随する特許請求の範囲の目的の範囲内で、本発明を、特に本明細書で記述したようなものとは異なって実施させうることが理解されるべきである。
インビボおよびインビトロにおける、ＧＣＳＦによる効果的な神経保護を示している。Ａ，ＴＴＣ−染色によって測定したような、局所性脳虚血（フィラメントモデル；中大脳動脈梗塞、ＭＣＡＯ）後のＧＣＳＦの神経保護の程度。ｙ−軸の値は、全半球の梗塞の割合に比例する（データは、平均値±ＳＤ、Ｔ−検定、ｐ＜０．０５）。Ｂ、ＮＧＦ−処理ＰＣ１２細胞における、Ｈ2Ｏ2（０ｕＭ、４００ｕＭ、７５０ｕＭ）による酸化ストレス上昇下での、細胞生存アッセイ。ＧＣＳＦ処置によって、細胞生存において、劇的な増加がおこる。比較にて、公知の神経保護物質である、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）での細胞の処置後の細胞生存を与える。Ｙ−軸：相対的（Ｒｅｌ．）細胞生存（ルシフェラーゼ活性の光ユニット）。 図２Ａは、マウスＧＣＳＦＲに特異的なＲＴ−ＰＣＲを示している。ＧＣＳＦ−Ｒ ＲＮＡを、予想サイズ５６７ｂｐにて、脳組織内で検出した。同一性を、ＰＣＲ産物の配列を決定することによって確認した。 ＧＣＳＦ−Ｒの代表的免疫ブロット。ＧＣＳＦ−Ｒ抗血清を用いて、約１３０ｋＤａのバンドが、ラット皮質の組織で検出可能である（レーン１）。低分子量のさらなるバンドはほぼ、分解産物を反映する。それぞれのペプチドでの抗血清の前吸着の後、バンドは検出されない（レーン２）。 マウスでの異なる脳領域におけるＧＣＳＦ−レセプターの分布を示している免疫組織化学（パラフィン切片、２μｍ）。ａ〜ｄ：海馬におけるＧＣＳＦ−Ｒの局在性。抗体が、ＣＡ３およびＣＡ２領域の間のはっきりとした境界を持ち（ｃ、矢印）、ＣＡ３領域におけるニューロンを、大部分染色する（ａ、ｂ）ことを考慮すること。ＧＣＳＦ−Ｒは、体細胞ならびにニューロンの突起にわたり分布する（ｂ、矢印）。門および歯状回の基底細胞層にて、レセプターが存在することを考慮すること（ｄ、矢印）。ＧＣＳＦ−レセプターがまた、皮質領域、例として、梨状皮質（ｅ）および鼻周囲皮質（ｆ）でも検出された。小脳にて、プルキンエ細胞が標識される（ｇ、矢印）。また、嗅球中の僧帽細胞のいくつかがＧＣＳＦ−Ｒ陽性である（ｈ、矢印）。強力な染色が、脊髄中の前柱によって示され（ｉ、ｊ）、より高い程度で、ＧＣＳＦ−Ｒ陽性として、大きな運動ニューロンが同定される（ｋ、ｌ）。神経突起が、強く標識されることを考慮のこと。中脳において、黒質中のニューロンが、ＧＣＳＦ−Ｒ陽性を示す（ｍ）。とりわけ、黒質緻密部（ＳＮＣ）中の全てのニューロンが標識される（ｍ中矢印、およびｎ）。また、黒質緻密部において、いくつかのニューロンがＧＣＳＦ−Ｒを発現する（ｏ）。ニューロン以外で、白質管中の乏突起膠細胞が、たとえば、前交連にて染色される（ｐ、矢印）。驚くべきことに、ＧＣＳＦリガンド（抗体ｓｃ１３１０２、サンタ クルズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ））の染色が、そのレセプター（抗体ｓｃ６９４、サンタ クルズ）の発現と共局在化している（図４ｑ〜ｕ）。このことは、有害刺激に対する、ニューロンの保護測定として、オートクライン機構に関して主張している。海馬において、同様の部分体特異性が、ＧＣＳＦリガンドに関して観察される（ｑ：ＧＣＳＦＲ、ｒ：ＧＣＳＦ、部分体ＣＡ２〜３、ｃａ３およびｃａ２標識間の境界を示している矢印は、その部分体を示唆している）。この特異性は、虚血障害に対するこれらの領域の感受性における公知の差と一致し、また、ＧＣＳＦ系の神経保護機能に関して主張している。また、歯状回において、門および顆粒下領域における発現の同様の興味深いパターンが観察され（図４ｓ、ＧＣＳＦレセプター、図４ｔ、ＧＣＳＦ、顆粒下領域における１つのニューロンをさしている矢印、標識：ｓ：サブ顆粒領域、ｈ：歯状回の門）、神経発生に関するＧＣＳＦ系の重要性を明確に示し、神経球上のレセプターおよびリガンドの発現とよく平行する（図１３を参照のこと）。興味深いことに、ＧＣＳＦはまた、そのレセプターも発現している（図４ ｉ〜ｌ）、骨髄の大運動ニューロンにも発現する（図４ｕ）。 皮質（ａ、ｂ）、および海馬培養ニューロン（ｃ、ｄ）上での、ＧＣＳＦＲに関する染色を示している。レセプターは、体細胞およびニューロンの突起両方で存在する。スライド上のすべのニューロンが標識化されたわけではない。それぞれのペプチドでの抗体のプレインキュベーション、または１次抗体の脱落によっては、特異的な染色にはならなかった（示していない）。 ＳＴＳＴ３に対する抗体で得られた、免疫組織化学の結果を示している。ＳＴＡＴ３免疫組織化学。多数の神経核が、プラセボ処置動物の皮質梗塞周辺領域と比較して（ａ、矢印；左：梗塞；右：周縁部；本来の倍率 ×２００）、ＧＣＳＦ処置ラットの皮質周縁部で陽性に染色される（ｂ、矢印）。 ＳＴＳＴ３に対する抗体で得られた、免疫組織化学の結果を示している。梗塞の周辺（ＩＬ）での影響を受けない対側（ＣＬ）および同側中の皮質ニューロンを、ＣＧＳＦ処理動物および対照で定量した。ＳＴＡＴ３の核転位したニューロンを計数することによって定量したように、ＧＣＳＦ−処置群で、梗塞に隣接したニューロンにおけるＳＴＡＴ３の有意な活性化が存在した（＊ｐ＜０．０５、ｔ−検定）。 脳虚血の光血栓ベンガルローズモデルにおけるＧＣＳＦ処理の効果を示している。Ａ、回転パフォーマンス。Ｂ、ビームバランスを含む、神経スコア。Ｃ、Ｄ、同側（Ｃ）、ならびに対側（Ｄ）上で測定した、接着テープ除去試験。凡例：虚血：虚血ラットの群、未処理、虚血＋ＧＣＳＦ：ＧＣＳＦで処理した虚血ラットの群、疑似＋ＧＣＳＦ：疑似手術動物、ＧＣＳＦで処置、疑似：疑似手術動物、未処理。Ｌ：左足上でのテープ−除去試験、Ｒ：右足上でのテープ除去試験。おそらく、テープが同側である場合に有意な運動欠損によって引き起こされ、そしてテープが対側である場合に有意な感覚欠損によって引き起こされる、テープ除去試験における両側で、効果が存在することを考慮すること（Ｃ、Ｄ）。 虚血までの、対側における光血栓の誘導４８時間後、ベンガル−ローズモデル中でのＧＣＳＦ−Ｒｅｓｅｐｔｏｒのアップレギュレーションを示している。Ａ、ラット脳の冠状部のスキーム、組織試料３および４を、疑似手術ラットからの同様の試料と比較して、ＣＧＳＦレセプターｍＲＮＡの定量に使用した。Ｂ、皮質周縁部試料におけるＧＣＳＦレセプターｍＲＮＡの定量（Ａからの試料３および４）。同側上での虚血誘導６時間後の時点での初期アップレギュレーションに続き、梗塞４８時間の時点で、対側上でのアップレギュレーションがおこる。この同側アップレギュレーションはまた、ＧＭＣＳＦレセプターでも見られた（以下を参照のこと）。 ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（配列番号２８〜３３）（ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いた、異なる種からのＧＣＳＦのアライメントを示している。 ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（配列番号３４〜３６）（ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）を用いた、マウスおよびヒトからのＧＣＳＦレセプター、およびラットの断片のアライメントを示している。 ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ＰＣＲ）による、成体神経幹細胞（ｎｓｃ）上のＧＣＳＦレセプターの存在を示している。アガロースゲルが示されている。レーン１：サイズマーカー、レーン２：神経幹細胞（ｎｓｃ）からのＰＣＲ産物、ラットＧＣＳＦＲ−特異的バンド（２７９ｂｐ）が見られる。レーン３：陰性対照。 神経幹細胞上のＧＣＳＦ−ＲｅｃｅｐｔｏｒおよびＧＣＳＦの存在を示している。Ａ、全細胞の可視化のための神経球のＤＡＰＩ染色。Ｂ、ＧＣＳＦレセプターに対する抗体で染色された、同様の神経球。Ｃ、Ｄ ＤＡＰＩ（Ｃ）およびＧＣＳＦに対する抗体（Ｄ）で染色された神経球。 マウスへの腹腔内投与後の、ビオチン化ＧＣＳＦの急速な取り込みを示している。Ａ、７．５ｕｇ ＧＣＳＦ／マウスの注射後１、２、４、６、２０、２８時間で犠牲死させたマウスからの血清のウエスタンブロット。Ｂ、腹腔内注射後の血清ＧＣＳＦのＥＬＩＳＡ。２時間の時点で、血清ピークレベルを持つ腹膜からのＧＣＳＦの急速な取り込みが存在し、これは、この投与経路の適用性を示している。 虚血の同側および対側上での、光血栓の誘導（ベンガルローズモデル）後、アップレギュレートされたｍＲＮＡとしての、ＧＭＣＳＦ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒの同定を示している。Ａは、マウス脳の略図的冠状切片を示し、対象の領域を、灰色でマークしている。Ｂは、ＧＭＣＳＦ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒの転写が、調節されているとして同定された、ＲＭＤＤ−ゲルの切片を示している。レーンは、マウス脳のＲＮＡ試料上のＲＴ−ＰＣＲ産物を示している。試料は、脳梗塞後の異なる時間点での、皮質周縁部から取った（それぞれ、Ａ中３および４）。 ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ−Ｓｙｓｔｅｍを適用することによる、定量的ＲＴ−ＰＣＲによる、４８時間の時点での、ベンガル−ローズモデル中の、ＧＭＣＳＦ−Ｒｅｃｅｐｔｏｒのアップレギュレーションの確認を示している。試料を、光血栓の誘導６時間、４８時間および２１時間の時点でとり、誘導レベルを、疑似手術動物と比較した。同側半球上で、ＧＭＣＳＦレセプターのアップレギュレーションは、皮質虚血後早期に最大となり、２１日目までに安定に下降する。相当する対側皮質試料において、アップレギュレーションは、梗塞後２日の時点で、もっとも明確にみられ、２１日目の時点でまだ、中程度にアップレギュレートされる。対側上のこの調節パターンは、ＧＣＳＦレセプターと似ている（上記を参照のこと）。 ヒト、マウスからのＧＭＣＳＦレセプター、およびアップレギュレートされた転写物として同定されたラットからの配列のアライメントを示している（配列番号２２、２３および２４）（ＣｌｕｓｔａｌＷ アルゴリズム、ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）。この相同性より、同定された配列が、ラットＧＭＣＳＦレセプターであると結論づけられる。 ヒト、マウスおよびラットからのＧＭＣＳＦのアライメントを示している（配列番号２５、２６および２７）（ＣｌｕｓｔａｌＷ アルゴリズム、ＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）。 マウス（パラフィン切片、２μｍ）中の異なる脳領域における、ＧＭＣＳＦ−レセプターα（ａ〜ｄ）およびＧＭＣＳＦ（ｅ〜ｇ）の分布を示している免疫組織化学。ａ：小脳において、プルキンエ細胞が標識される（矢印）。ｂ〜ｄ：海馬における、ＧＭＣＳＦ−Ｒαの局在。歯状回の門におけるレセプターの存在に考慮すること（ｂ、矢印）。抗体は、ＣＡ３とＣＡ２領域の間の明確な境界（ｃ、矢印）を持って、ＣＡ３領域中のニューロン（ｃ）を大部分染色する。ＧＭＣＳＦ−Ｒαは、体細胞（ＣＡ３）、ならびにニューロンの突起（ＣＡ２）にわたって分布している。ＧＭＣＳＦ−レセプターはまた、内嗅皮質（ｄ）でも検出された。ＧＭＣＳＦは、ＧＭＣＳＦ-レセプター-αとの比較において、類似の分布を示す。ＧＭＣＳＦ抗体が、プルキンエ細胞（ｅ、矢印）、ＣＡ３およびＣＡ２領域間の明確な境界（ｆ、矢印）をもって、ＣＡ３領域中のニューロン（ｆ）、および内嗅皮質中のニューロン（ｇ）も染色することに留意すること。図１９ｈ〜ｍ：ＧＭＣＳＦレセプターおよびそのリガンドの、ニューロンにおける驚くべき共局在化がここで示される。ｈ、海馬部分体ＣＡ３中のニューロン中のＧＭＣＳＦレセプター（抗体ｓｃ６９０、サンタ クルズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ））の局在化が、隣接ＣＡ２領域に対する明確な発現境界をさす。ｉ、ＧＭＣＳＦリガンド（抗体 ｓｃ１３１０１）は、同一の部分体特異的発現を示し、矢印は、ＣＡ３領域における１つのニューロンをさす。ｊ、歯状回の門および顆粒下領域におけるＧＭＣＳＦレセプターの発現。矢印は、顆粒下領域中のニューロンを示している。ｋ、この領域での、ＧＭＣＳＦリガンドの発現。ここで、リガンドは、そのレセプターと比較して、わずかに異なる発現を示している。ＣＡ３領域に明確な発現があるが（矢印）、歯状回ではほとんどない。ｌ、ｍ：脊髄の大運動ニューロン中のＧＭＣＳＦレセプター（ｌ）およびリガンド（ｍ）の発現。この驚くべき発現は、運動ニューロン疾患、とりわけ筋萎縮側索硬化症（ＡＬＳ）に対する、ＧＭＣＳＦ系の治療適用性に関する、明らかな示唆である。 皮質神経培養上のＧＭＣＳＦＲαに関する染色を示している。レセプターは、体細胞およびニューロンの突起両方で存在している（核エピトープＮｅｕＮに対する抗体、およびシナプトフィシンに対する抗体で二重染色して確認した。図では示していない）。それぞれのペプチドとの抗体のプレインキュベーション、または１次抗体の脱落によっては、特異的染色とならなかった（示していない）。 成体神経幹細胞（ｎｓｃ）上、およびＰＣ１２細胞（ＰＣ１２）上での、ＲＴ−ＰＣＲによる、ＧＭＣＳＦ−レセプターαの存在を示している。アガロースゲルが示されている。レーン１：サイズマーカー（Ｍ）、レーン２：神経幹細胞（ｎｓｃ）上のＰＣＲ、レーン３：ＰＣ１２細胞上のＰＣＲ（ＰＣ１２）、レーン４：陰性対照（ｎｅｇ）。ラットＧＭ−ＣＳＦＲα特異的バンド（１７６ｂｐ）が、レーン２および３で見られる。 免疫組織化学による、成体神経幹細胞（ｎｓｃ）上の、ＧＭＣＳＦ−レセプターαの存在を示している。ＤＡＰＩ（Ａ、全ての細胞核を染色）、およびＧＭＣＳＦレセプターに対して特異的な抗体（Ｂ）で染色された１つの神経系を示している（倍率１０×）。 インビトロでのＧＭＣＳＦによる効果的な神経保護を示している。Ｈ2Ｏ2（０ｕＭ、４００ｕＭ、７５０ｕＭ）による酸化ストレス増加下での、ＮＧＦ−処置ＰＣ１２細胞中の細胞生存アッセイ。ＧＭＣＳＦ処置は、細胞生存に劇的な増加をもたらす。比較にて、公知の神経保護物質である、エリスロポイエチン（ＥＰＯ；０．５Ｕ／ｍｌ）での細胞の処置後の細胞生存を与える。Ｙ−軸：相対的細胞生存（ルシフェラーゼ活性の光ユニット）。 Ｇ−ＣＳＦ投与なし（対照）と比較して、虚血開始１２０分後に適用した場合、ラットＭＣＡＯモデルでの、梗塞における、静脈内適用Ｇ−ＣＳＦの効果を示している。 Ｇ−ＣＳＧレセプターおよびＧ−ＣＳＦに関する、海馬および皮質のＴＴＣ−染色を示している。本データは、ＧＣＳＦレセプター（ａ、ｄ、ｇ）が、海馬（ａ〜ｃ歯状回、ｄ〜ｆ 門）および皮質（ｇ〜ｉ）中両方で、そのリガンド（ｂ、ｅ、ｈ）と、共局在化を示すことを示している。 海馬の歯状回（ａ〜ｃ）および門（ｄ〜ｆ）、ならびに皮質（ｇ〜ｉ）におけるニューロン上での、Ｇ−ＣＳＦレセプターおよびＧＭ−ＣＳＦレセプター両方の共発現を示している。ＧＣＳＦレセプター（ａ、ｄ、ｇ）およびＧＭＣＳＦレセプター（ｂ、ｅ、ｆ）は、海馬および皮質（ｃ、ｆ、ｉ）両方における同一のニューロン上で発現する。 ニューロン中のｓｔａｔ３を活性化することによって、Ｇ−ＣＳＦが、抗アポトーシス性に働くことを示している。 パートＩおよびＩＩ。Ａは、同側および対側上の虚血２時間および６時間後、ＧＣＳＦの非常に強力なアップレギュレーションを示しており、一方レセプターは、６時間後に、中程度に調整される（Ｂ）。ＧＣＳＦの誘導発現は、ＭＣＡＯモデル特異的ではないが、より小さな程度であるが広範囲虚血でも見出される（Ｃ）。 梗塞の周縁部での、Ｇ−ＣＳＦおよびそのレセプターを示す（ベンガル ローズ）。 海馬の歯状回（ａ〜ｆ）および門（ｇ〜ｉ）中のニューロンにおける、ＧＣＳＦレセプター（ａ、ｄ、ｇ）およびダブルコルチン（ｂ、ｅ、ｈ）の発現を示している。 ＧＣＳＦ処置４日後の、神経マーカーＮＳＥおよびベータＩＩＩ−チューブリンの強力で、濃度依存のアップレギュレーションを示している。ＰＬＰおよびＧＦＡＰは、ＧＣＳＦ−濃度依存性で、中程度調節される。エラーバーは、標準偏差を示し、これらは、３倍連続希釈ｃＤＮＡ−試料から計算し、測定の信頼性を反映している。 脳内の、ＧＭＣＳＦおよびそのレセプターの共局在化を示している。ＧＭＣＳＦレセプター（ａ、ｄ、ｇ）およびＧＭＣＳＦ（ｂ、ｅ、ｈ）が、歯状回（ａ〜ｃ）および門（ｄ〜ｆ）、および皮質（ｇ〜ｉ）中のニューロン上で共局在している。 ＧＭＣＳＦおよびそのレセプターが、脳虚血によってアップレギュレートされることを示している。 海馬の歯状回（ａ〜ｃ）および門（ｄ〜ｉ）中のニューロンにおける、ＧＭＣＳＦレセプター（ａ、ｄ、ｇ）およびダブルコルチン（ｂ、ｅ、ｈ）の発現を示している。 神経幹細胞の分化潜在力、および分化細胞の特異的マーカー発現を示しており、１０ｎｇ／ｍｌ ＧＭＣＳＦでの神経幹細胞の処理によって、結果、ベータＩＩＩ−チューブリンの有意に誘導された発現（ｎ＝３、ｐ＜０．０５、両側ｔ−検定）となり、成熟ニューロンに関するマーカーである、ＮＳＥの少ない程度まで（Ｂ）。 Ｇ−ＣＳＦが、血液−脳−関門（ＢＢＢ）を通過することを示している。 ＧＭ−ＣＳＦが、血液−脳−関門（ＢＢＢ）を通過することを示している。 筋萎縮側索硬化症（ＡＬＳ）の処置のための、Ｇ−ＣＳＦの効果を示している。 パーキンソン病（ＰＤ）の齧歯類モデルにおけるＧＣＳＦの効果を示している。 ＧＭＣＳＦが、ｓｔａｔ３経路を活性化することによって、ニューロンにおいて、抗アポトーシス的に働くことを示している。パートＩは、ＧＭＣＡＦが、アポトーシスの兆候として特異的に発生する、ＰＡＲＰ開裂を阻害することを示している。細胞死を、ＮＯ−ドナーＮＯＲ−３を用いることによって、初代ニューロン中で誘導した。パートＩＩは、タンパク質それ自体が、ニューロン内で発現しているにもかかわらず、ＧＭＣＳＦが、ＳＴＡＴ１（「ｐＳＴＡＴ１」）またはＳＴＡＴ５（「ｐＳＴＳＴ５」）のリン酸化の増加を引き起こさないことを示している。パートＩＩＩＡは、ＧＭＣＳＦが、ＳＴＳＴ３の時間依存的活性化を導くことを示しており、ＧＭＣＳＦ刺激につづき５分の時点で、最大となる。Ｂ、３つの独立した実験の定量化。Ｃ、リン酸化によるＳＴＳＴ３の活性化が、ＪＡＫ２阻害剤ＡＧ４９０によって阻害可能である。パートＩＶは、ＧＭＣＳＦが、ｓｔａｔ３標的遺伝子、Ｂｃｌ２およびＢｃｌＸ１の発現を、強く誘導することを示している。これらの遺伝子は、抗アポトーシスであるとして公知である。 早期の時点（パートＩ）および３時間の後期ウインドウの時点（パートＩＩ）両方で、ＧＭＣＳＦ−処置動物における梗塞容量の有意な減少が存在することを示している。

Claims (2)

  1. Ｇ−ＣＳＦまたは配列番号２８に示されるヒトＧ−ＣＳＦと少なくとも９０％の配列同一性を有する機能的変異体を有効成分として含む、筋委縮性側索硬化症治療薬。
  2. Ｇ−ＣＳＦがヒトＧ−ＣＳＦである、請求項１に記載の筋委縮性側索硬化症治療薬。
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