JP2002530068A

JP2002530068A - 中枢神経系前駆細胞の低酸素培養

Info

Publication number: JP2002530068A
Application number: JP2000582534A
Authority: JP
Inventors: マリーセステ; ジョンドイル; バーバラジェイウォルド; ロンマッカイ; ロレンツストゥーダー
Original assignee: California Institute of Technology CalTech; US Government
Current assignee: California Institute of Technology CalTech; US Government
Priority date: 1998-11-18
Filing date: 1999-11-18
Publication date: 2002-09-17
Also published as: WO2000029549A3; WO2000029550A2; CA2351556A1; US6610540B1; US20040005704A1; AU1824600A; AU2154200A; EP1144591A2; WO2000029550A9; JP2002530067A; WO2000029550A3; EP1131406A2; WO2000029549A2

Abstract

(57)【要約】本発明は、細胞の生存、増殖、及び/又は細胞の分化を促進させる条件下での培養内細胞の育成に関する。本発明者らは、細胞培養法に従来用いられている環境酸素条件に比べて細胞を低酸素中で増殖した場合に増殖を促進させアポトーシスを減少させることを見出した。更に、本発明者らは、特定の運命への前駆細胞の分化が低酸素中で促進され、中脳前駆体を低酸素条件でエクスパンジョン及び分化させたときに非常に多くの数と割合のドーパミン作動性ニューロンが得られることを見出した。即ち、より生理的な酸素レベルでCNS前駆体の増殖及び分化が促進され、低酸素は特定のニューロンタイプのex vivo 生成を有効に補助する。これらの知見を利用する方法及び組成物が記載されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願本出願は、1998年１１月１８日付出願の米国特許出願番号09/195,569号一部継
続出願である。上記出願の文章全体は本明細書に引用に含まれるものとする。

【０００２】アメリカ合衆国政府は、本発明／アメリカ予防衛生研究所提供グラントＮｏ．
AR40780-8およびAR42671-05並びにDARPA/AFOSRグラントNo.F49620-98-10487の条
項に従う発明において権利を有するであろう。

【０００３】（発明の分野）本発明は培養における細胞の育成に関する。より具体的には、本発明は、低酸
素環境条件で細胞を育成させることによって、細胞の生存、細胞の増殖および／
または固有の経路による細胞の分化を高める方法および組成物に関する。

【０００４】（発明の背景）ドナー器官が決定的に不足する時代に、細胞移植を臨床領域に適用しようとす
る試みは差し迫った要請である（Neelakanta & Csete, 1996）。実際、細胞移植
および組織移植は、嚢胞性線維症（肺）、腎不全、退行性心疾患および神経変性
疾患を含む多様な疾患の治療的措置のための望ましい技術として今や充分に認知
されている。しかしながら、この技術は、好ましくかつ非常に要請の高い措置で
はあるが、この種の治療措置の主要な障害は、生命活性を有する分化した細胞の
利用可能な供給源の不足である。一般に分化した細胞は容易に培養でエクスパン
ジョン(expand)させることができない。したがって、生命活性を有する分化細胞
の数および／または入手可能性を高める方法が要求される。

【０００５】中枢神経系（CNS）（脳および脊髄）は極めて再生能力が低く、このことは多
数の神経変性疾患（例えばパーキンソン病）で実証されている。そのような疾患
は薬理学的措置（パーキンソン病の場合はＬ−ドーパ）を用いてある程度制御で
きるが、神経病理学的損傷および消耗性進行を元に戻すことはできない。細胞移
植は、そのような損傷の結果を単に治療するものとは反対に、神経病理学的損傷
を回復させるための有望な選択肢を提供する。

【０００６】培養CNS幹細胞は自己再生が可能で、マイトジェンを除いた後、稀突起神経膠
細胞、星状神経膠細胞およびニューロンを予測可能な割合で再生させる固有の能
力を有する（Johe et al.,1996)。この固有の分化能の培養時操作は、特定の分
化現象を維持したり、増幅させたりまたは減少させたりする複雑な因子群を特定
するために用いられた。そのような実験のほとんどは、局所的および遠隔的に作
用する成長因子および栄養性因子だけでなくCNS系列を規定する転写因子の主要
な役割を力説している（Johe et al.,1996, Panchinsion et al., 1998)。ドー
パミン作動性ニューロンおよびこれらの培養に由来する前駆細胞は、パーキンソ
ン病患者の細胞置換治療の有望な供給源として特に興味深い（概説：Olanow et
al., 1996)。

【０００７】理想的には、ex vivo培養条件は完全に忠実にin vivoの細胞環境を再現すべき
である。この考えは外移植片を用いて発生を研究する場合に特に妥当である。な
ぜならば、細胞の発育の選択および分化のための条件を特定できるからである。
CNS幹細胞の場合、特に生存、増殖およびドーパミン作動性ニューロンに至る細
胞を最大にすることがその後の細胞移植治療に必須である。したがって、そのよ
うな細胞の分化を理解し制御することは、移植または多様な条件に対するin viv
oでのCNS細胞の反応の研究で用いることができる、生命活性を有する有用な生成
物を提供するために重要である。

【０００８】胚の発生の場合、各組織および器官は巧みに組織化された発生によって成長す
る。その場合、比較的特殊化されていないまたは”未分化”の前駆細胞または幹
細胞が、最終的に特殊な分化した特性および機能をもつ子孫を生じる。成熟組織
および器官は多くのタイプの分化細胞を含み、各細胞タイプは特定の遺伝子サブ
セットを発現させる。この遺伝子サブセットは、細胞の固有の構造、特異的機能
並びに、環境シグナルおよび栄養素と相互反応し応答する能力を順次特定してい
く。これらの分子的、構造的および機能的能力および特性が細胞の表現型を構成
する。同様に、損傷または変性成人組織が修復および再生を受ける場合、局所の
O₂供給に変化が存在するとき、連携された細胞増殖および／または分化が惹起さ
れる。酸素レベルは、正常な血液供給が外傷または塞栓症的事例（心筋梗塞、卒
中など）によって減少または一過性に停止するような多くの再生例で特にいえる
ことである。

【０００９】したがって、臨床時条件設定では、ガスは器官の生存で主要な変数として十分
に認識され、酸素はもっとも重要なガスパラメーターである。実質的に全ての近
代的細胞培養は、５％CO₂および９５％空気を含むガス雰囲気中で３７℃で実施
される。このような条件は人体中心部の温度および生理的CO₂濃度にほぼ完全に
適合する。例えば、脳組織の平均CO₂は8kPa（60mmHg）または７％である（Hoffm
an et al., 1998）。しかしながら、注目すべきことには、標準的組織培養の酸
素は生理的組織レベルを反映せず、実際のところ明らかに酸素過剰である。

【００１０】平均海面では、（湿り気を付与されていない）部屋の空気は２１％のO₂を含み
、これは21.3kPa（160mmHg）の酸素分圧〔0.21(101.3kPa(760mmHg))〕に換算さ
れる。しかしながら、身体の平均酸素レベルはこのレベルよりはるかに低い。肺
胞空気は１４％の酸素を含み、動脈の酸素濃度は１２％で、静脈の酸素レベルは
5.3％で、組織細胞内の平均酸素濃度はわずかに３％である（Guyton, and Hall,
1996）。さらにまた、微小電極による組織酸素の直接測定によって、脳の部分
は全身の平均組織レベルよりも顕著に低い酸素レベルに通常曝されており、脳の
高い酸素利用を反映していることが明らかにされた。これらの研究は、毛細管密
度の局所的相違に起因する脳の平均酸素レベルにおける顕著な局部的変動（表１
）を明らかにした。成人における脳の平均組織酸素濃度は1.5％で（Silver & Er
ecinska, 1988）、ヒツジ胎児の平均酸素張度もまた1.6％と見積もられた（Koos
& Power, 1987）。

【００１１】

【表１】表１：微小電極で測定したラット脳組織の局部酸素分圧（以下の文献から引用：L. Silver, M. Erecinska, "Oxygen and ion concentra
tions in normoxic and hypoxic brain cells.", In Oxygen Transport to Tiss
ue XX, 7-15, edited by Hudetz & Bruley, Plenum Press, New York(1988)）

【００１２】したがって上記の考察から、標準的培養条件下では周囲酸素レベルは明らかに
酸素過剰で、完全に生理的範囲内ではない。このような細胞育成条件は、脳また
は他の身体領域に移植する細胞および組織を生成するため、またはin vivoで発
生している事象の正確なin vitroモデルを提供するためには不適切である。した
がって、治療目的および研究目的で使用できる分化細胞を製造する方法がなお必
要である。本発明は、そのような方法を提供することを目的とする。

【００１３】本発明は、より忠実に生理的酸素状態を模倣するために低酸素環境条件で細胞
を育成することを目的とする。そのような状態で細胞を育成することによってあ
る驚くべきかつ予期せぬ結果が得られた。これらの結果を利用し、本明細書でさ
らに詳細に開示する。より具体的には、本発明は、細胞の生存度、細胞の増殖お
よび／または固有の経路による細胞の分化を高めるためにそれぞれ別個に有用な
方法を開示する。

【００１４】ある実施態様では、本発明は、未分化の中枢神経系（CNS）細胞を低酸素環境
条件で培養することを含む細胞分化を高める方法を開示する。この場合、低酸素
環境条件は神経細胞の細胞分化を促進する。低酸素環境条件の定義は本明細書の
他の場所で極めて詳しく説明する。しかしながら、ある実施態様では、低酸素環
境条件は約0.25％から約18％酸素の周囲酸素条件を含む。他の実施態様では、周
囲酸素条件は、約0.5％から約15％酸素の周囲酸素条件を含む。さらに他の実施
態様では、低酸素環境条件は、約１％から約10％酸素の周囲酸素条件を含む。さ
らに他の実施態様では、低酸素環境条件は、約1.5％から約６％酸素の周囲酸素
条件を含む。もちろんのこと、これらは培養で使用可能な周囲酸素条件の代表的
範囲であって、一般にこのような範囲のいずれかに含まれるか、またはCNS細胞
の生理的酸素状態に類似するこれらの範囲のいずれの酸素状態も当業者は利用す
ることができることは理解されるところである。したがって当業者は、酸素培養
条件を0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、
7％、7.5％、8％、8.5％、9％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、
14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％に設定するか
、またはこれらのいずれかの数字の間の任意の他の酸素条件に設定することがで
きるであろう。

【００１５】開示される方法で用いられる細胞はCNS研究のために日常的に用いられるいず
れの細胞でもよい。したがって、細胞は初代組織培養細胞でも細胞株に由来する
ものでもよい。細胞は胎児細胞でも成人の細胞でもよい。個々の実施態様では、
細胞は、中枢神経系幹細胞、脊髄由来前駆細胞、神経膠細胞、星状神経膠細胞、
ニューロン幹細胞、中枢神経系神経冠由来細胞、ニューロン前駆細胞、ニューロ
ン細胞、肝細胞、および骨髄由来細胞から成る群から選択できるであろう。好ま
しい実施態様では、外側神経節前駆細胞、皮質前駆細胞、星状神経膠細胞または
神経芽細胞であろう。本方法は、分化の量、レベルまたは程度を決定することを含むであろう。当業
者は、細胞の分化を測定するために用いられる技術に精通しているであろう。分
化は、分化に固有の表現型を細胞でモニターすることによって測定できる。例え
ば、分化固有表現型は、メッセージレベル、タンパク質レベル、細胞内分布、機
能アッセイ、または形態変化をモニターすることによって測定できる。

【００１６】メッセージレベルの測定に用いることができる技術には種々の技術があり、PC
R（登録商標）、in situハイブリダイゼーション、ＲＮＡ分解酵素保護アッセイ
、または単一細胞PCR（登録商標）が含まれるが、ただしこれらに限定されない
。個々の実施態様では、本発明は、ネスチン、チロシンヒドロキシラーゼ、GAPD
H;BDNF;GDNF;FGFR3;En1;FGF8;SHH;Ptx3;NuRR1;VEGF;EPO;HIFLαまたはVHLのメッ
セージレベルをモニターできる。もちろんのこと、これらはCNS細胞のための代
表的分化マーカーまたは酸素に対する細胞反応マーカーであり、当業者は、煩雑
な実験を実施することなく本明細書に特に記載したマーカーに代わって別の同様
なマーカーを代用することができる。他の実施態様では、タンパク質レベルが、
例えば抗体染色、ＨＰＬＣ、ウェスタンブロッティングまたは免疫沈澱を用いて
モニターされる。より具体的な実施態様では、モニターされるタンパク質レベル
は、ネスチン、チロシンヒドロキシラーゼ、ドーパミンβ−ヒドロキシラーゼま
たはドーパミントランスポーターのレベルである。機能アッセイは、典型的には
選択したCNS細胞の特定の機能をモニターするアッセイであろう。特に有用な機
能アッセイは、ドーパミン産生速度をモニターするものであろう。

【００１７】本発明の好ましい特徴は、２０％酸素インキュベーターの条件で育成した同様
な細胞集団と比較したとき、低酸素条件ではドーパミン作動性ニューロンが豊富
な細胞集団が産生されるということである。別の好ましい実施態様では、２０％
酸素インキュベーターの条件で育成した同様な細胞集団と比較したとき、低酸素
条件はセロトニン作動性ニューロンが豊富な細胞集団を産生する。さらに別の実
施態様では、２０％酸素インキュベーターの条件で育成した同様な細胞集団と比
較したとき、低酸素条件はGABA作動性ニューロンが極めて少ない細胞集団を産生
する。さらにまた、本発明のある方法では、低酸素条件は、２０％酸素インキュ
ベーターの条件で育成した同様な細胞集団と比較したとき、グルタミン酸作動性
ニューロンが極めて少ない細胞集団を産生する。

【００１８】好ましい実施態様では、本方法は、ニューロン増殖刺激物質、マイトジェン、
サイトカイン、神経保護因子または抗アポトーシス剤の存在下で細胞を育成する
ことを含む。本発明者らは、２０％O₂に対し低酸素での培養の結果、EPO発現が
顕著に増加することを見出した。ある実施態様では、分化表現型は、低酸素環境
条件から２０％酸素培養状態へ細胞を移した後も維持される。ある実施態様では
、細胞は、２０％酸素培養状態に移す前に数世代低酸素環境条件で育成すること
ができる。他の実施態様では、細胞は低酸素環境条件で連続して維持することが
できる。本発明の別の特徴では、低酸素環境条件で細胞を育成することを含む、培養CN
S細胞のアポトーシスを抑制する方法が提供される。

【００１９】さらに別の実施態様では、細胞を低酸素環境条件で育成することを含む培養CN
S細胞のエクスパンジョン(expansion)を増強する方法が提供される。この場合、
２０％酸素インキュベーターの条件で細胞を育成した場合と比較して細胞は低酸
素環境条件でエクスパンジョンの強化を示す。さらに別の実施態様では、本発明はさらに、低酸素環境中でCNS細胞を育成す
ることを含む、培養細胞の増殖を高める方法を提供する。この場合、２０％酸素
インキュベーターの条件で細胞を育成させた場合と比較して低酸素環境条件での
育成は細胞分裂を高める。さらにまた、CNS細胞集団を得て、それら細胞を低酸素環境条件で育成するこ
とを含む、神経変性疾患に対抗して使用される細胞を調製する方法が提供される
。この場合、低酸素環境条件は神経変性疾患で重要な遺伝子の発現を高める。あ
る実施態様では、前記神経変性疾患はパーキンソン病で、前記遺伝子はチロシン
ヒドロキシラーゼ（TH）である。

【００２０】本方法はさらに、ドーパミン生合成タンパク質をコードする第一のポリヌクレ
オチドと、前記タンパク質の発現に適した条件下で細胞と接触させることを含み
、この場合、前記ポリヌクレオチドは前記細胞で活性を有するプロモーターの転
写制御下にある。さらに、本方法は、ドーパミン放出タンパク質をコードする第
一のポリヌクレオチドと、前記タンパク質の発現に適した条件下で細胞を接触さ
せることを含み、この場合、前記ポリヌクレオチドは前記細胞で活性を有するプ
ロモーターの転写制御下にある。さらにまた、ドーパミン放出タンパク質をコー
ドする第二のポリヌクレオチドと、前記タンパク質の発現に適した条件下で細胞
と接触させることを含む方法もまた提供され、この場合、前記ポリヌクレオチド
は前記細胞で活性を有するプロモーターの転写制御下にある。他の実施態様では
、ドーパミン生合成タンパク質をコードする第二のポリヌクレオチドと、前記タ
ンパク質の発現に適した条件下で細胞と接触させることが含まれ、この場合、前
記ポリヌクレオチドは前記細胞で活性を有するプロモーターの転写制御下にある
。

【００２１】より具体的な実施態様では、ドーパミン生合成タンパク質は、TH；Ｌ−アミノ
酸デカルボキシラーゼ（AADC）、エリスロポイエチン、またはドーパミン生合成
に直接または間接的に関与する任意の他のタンパク質であろう。ドーパミン放出
タンパク質は濾胞性モノアミントランスポーター（VMAT）で、これはＶＭＡＴ１
またはＶＭＡＴ２であろう。ある実施態様では、第一および第二のポリヌクレオ
チドは異なるプロモーターの制御下にある。前記プロモーターは、使用される細
胞で機能を有する、当業者に既知の任意のプロモーターである。例えば、プロモ
ーターは、CMVIE、SV40IE、β−アクチン、THプロモーター、AADCプロモーターお
よびネスチンプロモーターであろう。第一およに第二のポリヌクレオチドは各々
ポリアデニル化シグナルに共有結合によって連結されているであろう。

【００２２】さらにまた本方法にしたがって製造される細胞も本発明に包含される。本方法
は、出発CNS細胞を得て、前記細胞を分化ニューロン細胞を産生する低酸素環境
条件で細胞を育成することを含む。ある実施態様では、前記出発細胞はネスチン
陽性細胞である。より具体的には、低酸素環境条件は、従来の培養条件よりもよ
り迅速により大量にネスチン陰性分化細胞を産生する。ある実施態様では、低酸
素環境条件はTH陽性細胞を産生する。他の実施態様では、細胞はさらに外因性遺
伝子をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含み、この場合前記ポ
リヌクレオチドはプロモーターに機能的に連結されている。

【００２３】本発明の別の特徴では患者のパーキンソン病を治療する方法が提供される。本
方法は、前記患者に移植するために適した細胞を入手し、前記細胞を低酸素環境
条件で育成し、さらに低酸素環境条件で育成した細胞を前記患者に移植すること
を含み、この場合、２０％酸素インキュベーターの状態で育成させた同様な細胞
と比較したとき、移植細胞は患者でのドーパミン産生能力が増強されている。あ
る実施態様では、細胞は、前記患者から得られ、ドーパミン産生を増加させるタ
ンパク質を発現するポリヌクレオチドで形質導入され、低酸素環境条件で処理ま
たはエクスパンジョンされる。他の好ましい実施態様では、細胞は患者以外の供
給源に由来するCNS細胞である。好ましい実施態様では、細胞は、ドーパミン産
生を増加させるタンパク質を発現するポリヌクレオチドで形質転換され、低酸素
条件で処理またはエクスパンジョンされる。

【００２４】本発明の他の目的、特色および利点は以下の詳細な説明によって明らかとなろ
う。しかしながら、詳細な説明および個々の実施例は本発明の好ましい実施態様
を示すが、当業者には本発明の範囲内で多様な変更および改変が本詳細な説明に
基づいて可能であるのでそれらは単に説明として提示される。

【００２５】細胞移植療法が広くかつ一般的に用いられるようになるためには、適切に分化
した生命活性を有する細胞が入手できることが必要である。好ましくは、これら
の細胞は、凍結保存しても表現型の完全性が低下しない十分な復元力を有する必
要がある。細胞を周囲大気O₂レベル（以下では従来のO₂状態または２０％O₂培養
状態と呼ぶ）で成育させる高インキュベーター酸素レベルはそのような細胞の産
生を促進しない。これらの細胞はしばしば、役に立つほど十分な数では生存せず
増殖せずまたは分化しない。従来の培養でこれらの細胞を増殖させた場合、移植
での使用はいうまでもなく、最良の場合でもin vitroのモデルアッセイ実験にも
不適切な細胞しか得られない。

【００２６】本発明は、分化し生命活性を有し凍結保存に耐える細胞を製造するための方法
および組成物を提供することを目的とし、さらに、in vivoでの条件設定でその
ような細胞がどのような生化学的動態を有するかについての正確な指標を提供す
る。したがって、本方法は、性状決定実験を実施するためにin vitroで用いるか
、または疾患、外傷による損傷、虚血または薬剤誘発損傷によって障害された細
胞のための置換治療としてin vivoで用いることができる細胞を提供するであろ
う。さらに、本方法は、移植にも用いることができる未分化の前駆細胞の生存の
強化をもたらすことは特記されるべきである（これら未分化の細胞は適切な環境
状態に置かれたとき適切な分化経路をたどるであろう）。

【００２７】本発明は特に、大気より低い／生理的酸素レベルの培養条件を用いてニューロ
ン細胞集団を培養しこれを濃縮することを含む。この細胞集団は、特定のニュー
ロン表現型を発現させるためにエクスパンジョンおよび／または分化させた細胞
を含む。細胞分化の増加とは、原始的な未分化状態から特定の細胞表現型（ドー
パミン作動性表現型；GABA作動性表現型；セロトニン作動性表現型など）が発現
されている細胞へと細胞プロセスが変換されるようなものである。特に、低O₂状
態での成育はドーパミン作動性およびセロチン作動性ニューロン集団の濃縮をも
たらし、一方、GABA作動性およびグルタミン酸作動性ニューロンは比較的減少す
るようである。これらの濃縮された集団を、例えばセルソーティングのような方
法によってさらに濃縮することができる。

【００２８】あるいは、本方法によって生じる分化の増加は、(未分化状態にとどまるもの
と対照的に)分化に向かう細胞の相対百分率が低酸素では増加するものであろう
。しかしながら、多能細胞系統を低酸素保温状態下でin vitroでインキュベーシ
ョンすることによって、細胞集団の分化の方向を操作または曲げることができる
であろう。したがって、分化経路はガスの影響下で変化するので、集団内の１つ
のタイプの細胞の数および百分率が増加または減少するように制御するために酸
素が用いられる。生理的または低酸素レベルによるCNS細胞の濃縮は、したがっ
て以下を含む１つまたは２つ以上のメカニズムの結果であろう：（１）CNS細胞
の絶対数の増加、（２）CNS細胞の選択的生存による濃縮、（３）それらの選択
的増殖によるCNSの濃縮、（４）特定の分化経路の増加。

【００２９】 CNS細胞数の増加はいずれも、より多くの細胞をより大きな新しい組織の再生
に利用できるということで重要である。たとえ数の増加がなくとも、総細胞数の
制限が妥当である場合、または混入する非CNS前駆細胞の影響が所望の出現に対
して若しくは物質を充分に特定することに関して陰性であるとき、濃縮は重要で
ある。CNS細胞の生存の強化はいずれも（細胞数の増加がなくとも）、または細
胞タイプの濃縮はいずれも、培養が必要とされる設定では有用である（すなわち
、細胞療法の施術前に組織を取り扱うために、または細胞をその間生存させてお
かねばならない他の一切の操作（例えば遺伝子トランスフェクション、薬剤処置
、または細胞タイプ分けもしくは他の付加的操作による濃縮）を可能にするため
に）。

【００３０】本発明のある実施態様は、大気より低い培養状態でCNS細胞（または実際のと
ころ任意の多能幹細胞）を成育させることによってアポトーシス性および非アポ
トーシス性細胞死レベルが減少することを示す。細胞の生存増加は、おそらくア
ポトーシスの抑制および非アポトーシス細胞死の抑制の両方によるものであろう
。アポトーシスまたはプログラムされた細胞死は周知の現象で、当業者によく知
られた技術によって測定できる。

【００３１】本発明の方法の具体的かつ新規な側面は、そのような方法が全て低酸素環境培
養育成条件を使用することである。「低酸素環境条件」とは、本発明では大気酸
素より低い一切の培養条件をいう。従って、具体的な実施態様において、低O₂環
境条件は約0.5％〜約18％として定義される。理想的には、培養酸素条件は、特
定の細胞が、in vivoでより良好に見られるような正常な生理学的酸素条件に可
能な限り近く維持される。明らかに、このことは細胞に使用されるそれらの条件
は特定の細胞の起源領域に依存するであろうことを意味するであろう。例えば、
歯槽起源の細胞は約14％O₂で増殖することを好むかもしれない；動脈系供給源か
らの細胞は約12％の酸素濃度を好むであろう；一方、脳のある種の領域からの細
胞は約1.5％という低い酸素濃度を好むかもしれない。

【００３２】したがって低酸素環境条件は、CNS細胞の分化を促進し、培養細胞のアポトー
シスを抑制し、細胞のエクスパンジョンを増強し、あるいはそのような細胞を移
植で使用しやすくするために用いられるであろう。そのような方法および組成物
は以下でさらに詳細に説明する。

【００３３】定義この章では、本発明のいっそうの理解を進めるために本発明で使用される用語
の定義を示す。 ”幹細胞”は、比較的未分化の細胞であって、誘導して増殖させすることがで
き、その後１つまたは２つ以上の成熟細胞タイプに分化するが、一方、親の発生
潜在能力もまた保持する子孫を産生することができる。多くの生物学的事例では
、幹細胞はまた、２つ以上の別の細胞タイプの子孫を産生できるので”多能”で
あるが、しかしながらこのことは”幹細胞”の要件ではない。自己再生は幹細胞
定義におけるまた別の古典的不可欠要素で、本明細書で用いられるとおり本質的
要件である。理論的には自己再生は２つの主要なメカニズムのどちらかによって
生じるであろう。幹細胞は非対称的に分裂し、１つの娘細胞は幹細胞状態を保持
し、他方の娘細胞は異なる他の固有の機能および表現型を発現することがある。
あるいは、集団中の幹細胞のいくつかは対称的に２つの幹細胞に分裂することが
でき、したがって集団内で全体としていくつかの幹細胞を維持することができる
が、一方、集団内の他の細胞は分化子孫のみを産生する。形式的には、幹細胞と
して開始する細胞は分化表現型に向かって進化していくが、その後”復帰”して
幹細胞表現型を再度発現することが可能である。

【００３４】 ”前駆細胞”は、より原始的な細胞表現型を有する（すなわち発生経路または
進化において完全に分化した細胞よりもより初期の段階にある）。しばしば、前
駆細胞は顕著なまたは極めて高い増殖能を有する。前駆細胞はまた、細胞が発生
し分化する環境および発生経路に応じて複数の別個の分化細胞タイプまたはただ
１つの分化細胞タイプを生じる。幹細胞と同様に、前駆細胞として始まる細胞は
分化表現型に向かって変化をとげるが、”復帰”して前駆細胞表現型を再発現す
ることがある。

【００３５】 ”分化”は発生過程を指し、その過程によって細胞は固有の表現型を身につけ
る（すなわち、他の細胞タイプから区別される１つまたは２つ以上の特性または
機能を獲得する）。ほとんどの場合、分化表現型は、ある発生経路の成熟終末点
にある細胞表現型を指す。多くの組織（ただし全てではない）では、分化の過程
は細胞サイクルから退出することと連携しており、このような事例では、細胞は
、それらが分化したとき増殖能を失うかまたは増殖能は極めて制限される。

【００３６】「大気より低い(subatmospheric)」条件とは、海面レベルにおいて、約20％よ
りも低い、好ましくは約15％よりも低い、より好ましくは約10％よりも低い一切
の酸素条件を意味する。本明細書において、用語「大気より低い」は上で定義し
た「低酸素条件」と互換的に使用される。「大気O₂条件」とは、空気中に見出される条件、すなわち、20-21％O₂である
。本明細書において、この用語は「通常のO₂条件」と互換的に使用される。なぜ
なら、通常の組織培養インキュベーターは大気O₂条件に維持されているからであ
る。「生理学的」酸素レベルとは、健康な組織および器官に通常見いだされる酸素
レベル範囲である。それらのレベルは、組織の型（表１）に依存する。しかしな
がら、この割合は全ての組織において15％より低く、ほとんどの組織で８％より
も低いことに注意する必要がある。従って、生理学的酸素レベルは測定する身体
の領域に依存して、約15％〜約1.5％の範囲であり得る。「低酸素症」は、酸素の正常な生理学的レベルが細胞または組織に供給されな
い場合に起こる。「酸素正常状態」とは、問題としている特定の細胞型、細胞状
態または組織にとって正常な生理学的酸素レベルをいう。「低酸素条件」は細胞
低酸素症を導く条件を言う。これらの条件は細胞型および、組織または器官にお
ける細胞の具体的な構造また位置、およびその細胞の代謝的状態に依存する。重
要な点は、過去25年間の細胞生物学研究の殆どにおいて、20-21％の環境大気酸
素レベルが「酸素正常状態」と呼ばれ、かつ実験的に採用されてきたが、この過
程は生理学的には誤っているということである。こうした歴史的いきさつの中で
、多くの細胞培養の文献は環境大気よりも低い酸素の条件を常に「低酸素」と読
んでいるが、しかしこの用法も生理学的には誤りである。「アシドーシス」とは、pHが正常は生理的レベルより低いことを言う。細胞の「濃縮（enriching）」とは、一つの型の細胞の収率（画分）が出発培
養物または調製物中の細胞の画分に対して増加していることを言う。

【００３７】 ”増殖”は、細胞の分裂による集団内の細胞の数の増加（成育）を指す。細胞
増殖は、一般に環境（成長因子および他のマイトジェンを含む）に対する反応に
おける多数のシグナルトランスダクション経路の協調的活性化から生じると理解
されている。細胞増殖はまた、細胞増殖を阻止するかまたは負の影響を与える細
胞内もしくは細胞外シグナルの作用から開放されることによって促進される。 ”再生”は、疾患または外傷後の細胞集団、器官または組織の再増殖を意味す
る。本明細書で用いられる他の用語は、別に記載がなければ当業者によって一般的
に割り当てられた意味を有する。

【００３８】中枢神経系細胞前述のように、本発明の特定の利点は、神経変性障害を軽減するために使用す
ることができるような生存可能な細胞又は組織を生じるためにこれを使用するこ
とができることである。このような細胞又は組織は移植時に、移植片と称される
。移植用細胞は、卒中、脳及び脊髄の損傷、アルツハイマー病、ハンチントン病
及びその他の神経変性障害のためのヒト又は動物の神経；てんかんのための中隔
及びGABA作動性細胞；パーキンソン病の治療のための腹側(ventral)中脳又は他
のCNSドーパミン作動性細胞；並びに、神経系疾患のため、又は特定の精神障害
までもの栄養因子分泌細胞を含むが、これらに限定されるものではない。移植片
として使用される細胞は、初代組織から又は特定の細胞株さえからも由来するこ
とができる。更に、本願明細書を通じて言及されたあらゆる細胞型は、成熟細胞
であるか又は胎児起源のものであることは理解されなければならない。

【００３９】本発明は、神経疾患の治療のために、増殖及び分化する分化した神経幹細胞を
生じるであろう。未分化の神経前駆細胞は、ニューロン及びグリア細胞を生じる
神経芽細胞及びグリア芽細胞に分化する。発生時に、神経管に由来する細胞は、
CNSのニューロン及びグリア細胞を生じる。発生時に存在する特定の因子、例え
ば神経成長因子(NGF)は、神経細胞の増殖を促進する。神経幹細胞及び前駆細胞
を単離及び培養する方法は、当業者には周知である(Hazel及びMuller、1997年；
米国特許第5,750,376号)。適切な神経細胞は適切な固形組織から得ることができ
、それらには、哺乳動物の成体、新生児、胎児性または胚性組織が含まれる。マ
ウス、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ラット、ウサギおよび霊長類（ヒトを
含む）を含むどんな哺乳動物も本発明に使用することができる。適当な固形組織
の具体的な例は、脳組織に由来したニューロン又は中枢神経の支持細胞、生殖細
胞又は胚性幹細胞を含む。

【００４０】 Hazel及びMullerは、胎仔及び成体の両ラット脳に由来するラット脳神経上皮
幹細胞の単離、培養、及び分化の方法を説明している。簡単に述べると、神経前
駆細胞を胎仔ラットの中枢神経系の望ましい領域から切り出し、単細胞浮遊液へ
と分離し、かつ組織培養皿上のマイトジェン塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)を
含有する培地中に播種した。最初に、分化したニューロンの多くが死滅する。そ
の後増殖中の細胞が緩衝溶液中に収集される。継代された細胞は、多能性前駆細
胞について比較的均質である。ニューロン及びグリア細胞への分化を誘導するた
めに、bFGF含有培地を取り除き、bFGF非含有培地と交換する。

【００４１】このような幹細胞単離から出発するプロトコールにおいては、幹細胞プールを
濃縮しかつより多数の細胞への分化を増強するために、大気中よりも低い培養条
件を用いることができる。より分化した脳細胞において特定の遺伝子産物をアッ
プレギュレートするためには、最初に播種しかつ分裂した後には、大気中よりも
低い／生理的培養条件も使用することができる。大気中よりも低い／生理的培養
条件は、移植のための全集団の機能を増強するために、プロセスを通じて使用す
ることもできる。

【００４２】神経幹細胞由来物の検出は、抗体染色により決定することができる。例えば、
中枢神経系多能性幹細胞は、中間径フィラメントであるネスチンの高レベル発現
により印がつけられる(Hazel及びMuller、1997)。分化したニューロンは抗体TUJ
1により(O’Rourkeら、1997)、オリゴデンドロサイトはGalCにより(Bosioら、19
96)、及びアストロサイトはGFAP抗体により(Rutkaら、1997)印をつけられる。

【００４３】本発明の方法は、異種遺伝子を含む神経細胞を作出するために使用することが
できる。異種遺伝子を含む神経起源の細胞を作出しかつこのような細胞を使用す
る方法は、米国特許第5,750,376号に開示されている(これは本明細書に引用によ
り組入れられるものとする)。

【００４４】培養条件初代培養物を作出するための適当な培地及び条件は、当該技術分野において周
知であり、かつ細胞型に応じて決まる。例えば骨格筋、骨、ニューロン、皮膚、
肝及び胚性幹細胞は全て、それらの具体的内容物が異なる培地において増殖され
る。更にひとつの細胞型のための培地は、実験室毎及び施設毎に著しく異なるこ
とができる。一般的原則として、培養の目標が細胞分裂を維持することである場
合は、培地に血清が比較的多量に(10〜20容量％)添加される。特異的精製された
成長因子又は複数の成長因子のカクテルも添加されるか、もしくは時には血清の
代わりに使用される。一般的原則として、培養の目標が分化を補強するためであ
る場合は、一般にマイトジェンを伴う血清に限定される(血清約1〜2容量％)。分
化を促進する及び／又は細胞周期の停止を促進する特異的因子又はホルモンも使
用することができる。

【００４５】特異的細胞表現型の選択、特異的細胞型の生育及び増殖、又は特異的細胞型の
分化への重大な付随物として、培養時の細胞の増殖及び分化のいずれかの時点で
、生理的酸素及び大気より低い酸素の条件を用いることができる。一般に、生理
的又は低酸素レベルの培養は、強力な緩衝剤の培地(Hepesなど)への添加、頻繁
な培地の交換及びCO₂濃度の変化のような、培養物のアシドーシスを制限する方
法により達成される。

【００４６】細胞は、様々な手段を用い低酸素条件に晒すことができる。特化された実験施
設は、酸素レベルが指定された隔離室全体で制御される完全に封じ込められた環
境を有することができる。このような特定の領域においては、低酸素レベルが間
断なく、細胞の単離、増殖及び分化を通じて維持され得る。このような特殊な領
域を有する実験室は非常に少ない。更に生理的又は低酸素培養条件は、予め定め
られた混合ガスでフラシュされた市販のチャンバー(例えば、Billups-Rothenber
g、サンディエゴ、CAから入手できる)を用いて維持することもできる。補助的に
、細胞を供給する前に、同じ混合ガスで培地をフラッシュすることができる。一
般に、これらの比較的小さい封じ込めユニットを用いる細胞供給及び継代の間に
生理的又は低酸素条件を維持することは可能ではなく、かつそのため、これらの
操作の時間は、できる限り短縮されなければならない。適当な湿度、温度、及び
二酸化炭素が提供されるならば、あらゆる密閉されたユニットを、生理的酸素又
は低い酸素レベルでの培養に用いることができる。

【００４７】酸素に加えて、培養のためのその他の気体は、典型的には約5％二酸化炭素で
あり、かつ残余は窒素であるが、任意に変動量の酸化窒素(3ppm程度の低濃度か
ら開始)、一酸化炭素並びに不活性及び生体活性の両方のその他の気体を含有す
ることができる。二酸化炭素濃度は、典型的には前述のように約5％の範囲であ
るが、これは2〜10％を変動することができる。酸化窒素及び一酸化炭素の両方
が典型的には非常に少量(すなわちppmの範囲)で投与され、これは経験又は文献
から決定される。

【００４８】いずれか所定の細胞型又はいずれか特定の望ましい結果にとって最適な生理的
又は低酸素レベル条件は、変動するであろう。当業者は、二酸化炭素が一定に維
持され、かつ酸素レベル(残余ガスとしての窒素と共に) が変動するような酸素
用量反応曲線を作成することにより、適当な大気より低い条件を決定することが
できる。例えば、CNS細胞のエクスパンジョンに関する最適酸素環境培養条件を
決定するためには、ある酸素システムから培養を確立するであろう。いくつかの
分化した細胞、その他の発生系統又は経路の細胞、更にはCNS細胞からなる最初
の培養物が、混合される。様々な酸素レベル(例えば、1％、2％、5％、10％及び
15％)に曝露された後のCNS細胞の数及び機能は、そのシステムに適した方法によ
り評価される。一部では、分子マーカーの一群を、細胞集団を迅速に同定するた
めに利用できる。別の場合は増殖アッセイと組合せた単独のマーカーが適してお
り、その他の場合は増殖アッセイ単独が適している。一部の場合、前述のアッセ
イの全て又は一部は、推定された幹細胞の分化能を辿るバイオアッセイと組合せ
られる。全般的に、幹細胞及び／又は前駆細胞の酸素レベルに対する反応を決定
するために使用される正確なアッセイは、試験されたシステムの性質、更にはそ
のシステムに特異的な利用できるマーカー及び技術に応じて決まる。

【００４９】生理的又は低酸素条件のタイミングも、酸素用量反応曲線の一部である。一部
の細胞は、単離の間又は単離直後に酸素に多かれ少なかれ感受性であることがで
きる一方で、一部の細胞は培養物中のいずれかの時点以降のみ反応することがで
きる。生理的又は低酸素条件のタイミングは、絶対的及び培養物の他の操作との
関係において、最適酸素培養条件を評価する一部である。更に、その他の気体の
有糸分裂促進作用は、生理的又は低酸素条件により相乗され得る。様々な遺伝子
調節ネットワークは、培養の様々な相の間に低／生理的酸素培養により誘導され
得る。細胞のエクスパンジョン時の低酸素は、分化時の低酸素により誘導される
ものとは異なる遺伝子発現を誘導することができる。

【００５０】これらの細胞は、典型的には低酸素レベル条件に、その他の細胞型と比較して
前駆細胞／幹細胞の集団を豊富にするのに十分な時間晒される。典型的には、こ
れは1時間以上、好ましくは3時間以上、より好ましくは6時間以上、及び最も好
ましくは12時間以上であり、かつ継続することができる。培養時の温度は、典型
的には体芯温度(core body temperature)を反映しているか又は約37℃であるが
、約32℃及び約40℃の間を変動することができる。別の重要な実施態様は、単純
に細胞絶対数の増大を達成するか又は細胞の生存を促進することができる。低又は生理的酸素培養条件への最初の曝露後に、望ましい結果に応じて、細胞
を、これらの条件において維持するか、又は正常な実験室酸素条件に戻すことが
できる。

【００５１】 CNS細胞の単離のための初期培地、これらの細胞の増殖培地、及びこれらの細
胞の分化培地は、同じ又は異なって良いことは理解される。全ては、低又は生理
的酸素レベル培養と組合せて使用することができる。この培地は、様々な成長因
子、サイトカイン、血清などを補充することができる。適当な成長因子の例は、
塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)、血管内皮成長因子(VEGF)、上皮成長因子(EGF
)、トランスフォーミング成長因子(TGFα及びTGFβ)、血小板由来成長因子(PDGF
s)、肝細胞成長因子(HGF)、インスリン様成長因子(IGF)、インスリン、エリスロ
ポイエチン(EPO)、及びコロニー刺激因子(CSF)がある。適当なホルモン培地添加
物の例は、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、又はデキサメタゾ
ンのようなグルココルチコイドである。サイトカイン培地添加物の例は、インタ
ーフェロン、インターロイキン、又は腫瘍壊死因子α(TNFα)である。酸素レベ
ルは添加物に対する細胞応答、添加物の有効期間又はそれらの生体活性に影響を
及ぼすその他の性質を変更し得るので、当業者は、添加物及び培地成分を様々な
酸素レベルで試験するであろう。加えて、細胞が生育している表面には、細胞の
生存、生育及び／又は分化に寄与する様々な基質を置くことができる。これらの
基質は、ラミニン、ポリ-L-リシン、ポリ-D-リシン、ポリオルニチン及びフィブ
ロネクチンを含むが、これらに限定されるものではない。

【００５２】生育及び分化の促進のための更なる因子本願明細書に記したように、本発明はCNS細胞の生存、分化及び表現型の完全
性を増大する方法を提供する。この方法は一般に、in vitroにおけるこれらの細
胞の生理的酸素パラメータ内での生育に関する。現時点で、このような細胞の生
存を増加することがあるその他の因子を指摘している文献は豊富である。これら
の因子のいくつかを本発明の育成条件と組合せて使用することが有用であろうと
考えられている。

【００５３】この関心の多くは、栄養因子の発見に焦点が当てられている。これらの因子は
、移植により調製されたドーパミン作動性細胞の生存を増大し；線条へ移植され
た胚性ニューロンの移植後のin situ生存を維持し；移植片の容積を増すことに
加え、これにより、in vitro及びin vivoの両方において作用することが示され
ているような尾状核及び被殻のより大きい部分を再−神経支配することができる
。

【００５４】 NGF、bFGF、EGF、IGF I及びII、TGFβ1-3、PDGF、脳由来の成長因子(BDNF)、
神経節由来の成長因子(GDNF)、ニューロトロフィン(NT)-3、NT-4、及び毛様体神
経栄養因子(CNTF)のような栄養因子(Engele及びBohn、1996；Mayerら、1993a及
び1993b；Knuselら、1990、1991；Poulsenら、1994；Nikkhahら、1993；Othberg
ら、1995；Hymanら、1991)が研究され、かつin vitroにおいて顕著な作用を有す
ることが示されている。

【００５５】霊長類におけるMPTP及び6-OHDA病巣は、神経変性障害のあるモデルである。こ
のような病巣の作用は、移植術前の細胞浮遊液へのNGF又はbFGFの添加により、
霊長類及びラットにおいて逆行することができることが示されている(Gashら199
6)。更にこれらの因子は、細胞浮遊液に移植術前に添加した場合に、移植片の生
存を増大することも示されている(Chenら、1996；Dunnett及びBjorkland、1994)
。追加の試験は、NGFによりレトロウイルスを使って誘導された神経前駆細胞(CI
NP)細胞株(Martinez-Serranoら、1995)、及びBDNFにより誘導されたアストロサ
イト(Yoshimotoら、1995)に由来した移植されたニューロンにおいて移植片生存
率の上昇を示した。GDNFは、移植片生存を増大し、繊維の伸長を増大させかつラ
ット線条における6-ヒドロキシドーパミン病巣の後の行動作用を緩和することが
示されている(Sauerら、1994；Bowenkampら、1995；Rosenbladら、1996；Olson
、1996)。従ってin vitro又はin vivoのいずれかにおいてCNS細胞の生存を延長するよう
なこれら及び他の因子は、本発明において説明された増殖及び維持の条件下で使
用することが考察されている。

【００５６】 EPO による大気O₂での分化の誘導別の実施態様において、ドーパミン作動性分化に対する低酸素の作用を模倣す
るためにEPOを使用することができる。すなわち、大気酸素レベルでのEPOは、幹
細胞、CNS前駆細胞、又はそれらの子孫の分化を促進し、ドーパミン作動性細胞
を作出するために使用される。中脳前駆細胞は、特に好ましい。この実施態様に
おいて使用されるEFOの量は、ドーパミン作動性細胞を少なくとも約10％以上、
好ましくは20％、より好ましくは50％作出するのに十分な量である。好ましくは
、飽和濃度のEPOが増殖相、分化相又は両相の間に培養物に添加される。この培
養物はEPOと、少なくとも約1日以上、好ましくは2日、より好ましくは5日間接触
される。例えばCNS前駆細胞の培養物は、増殖相の間は5％CO₂、20％O₂ (平衡N2)
を含有する大気内で5日間、飽和濃度のEPOで培養され、かつ引き続き分化相の間
は3日間10％EPOで培養することができる。この大気は、20％O₂を含有することが
好ましいが、より低いO₂濃度も使用することができる。

【００５７】移植法実験室及び臨床での研究は、CNSへの細胞移植が、パーキンソン病のような神
経変性障害の重要な別の治療モダリティとなり得る可能性があることを示してい
る(Wictorinら、1990；Lindvallら、1990；Sanbergら、1994；Bjorklund及びSte
nevi、1985；Freemanら、1994)。一部の症例において、移植された神経組織は生
存し、かつレシピエントすなわち宿主のCNSとの結合を形成する(Wictorinら、19
90)。宿主にうまく受け入れられた場合は、移植された細胞及び／又は組織は、
前記障害に関連した行動上の欠陥を改善することが示されている(Sanbergら、19
94)。この種の治療が成功するための必須の工程は、移植のために利用できる十
分生存可能な細胞を獲得することである。本明細書に記載する生理学的／大気よ
り低い培養条件は移植のために有用なCNS細胞の特定の集団を分化させるため、
および、種々の培養系から由来する入手可能なCNS細胞数のエクスパンジョンに
使用することができる。

【００５８】前述の細胞培養に加えて、胎児神経組織が、神経移植の別の重要な給源である
(Lindvallら、1990；Bjorklund、1992；Isacsonら、1986；Sanbergら、1994)。
別の生存可能な移植片の給源は、副腎細胞並びに神経成長因子及び栄養因子を分
泌する様々な細胞型を含む。神経変性障害に関する再生治療プロトコールのよう
な神経組織移植の分野が、多くの注目を浴びており、その結果臨床試験が進行し
ている。今日までこの分野の主要な問題点は、十分に生存可能な細胞を得る能力
が欠けていることであった。本発明は、それらの神経変性疾患のための適当な移
植片としての利用能を失うことを防ぐような状態で、このような組織を維持する
方法を提供する。

【００５９】現在は、細胞移植術の方法は、当業者には周知である(米国特許第5,762,926号
；米国特許第5,650,148号；米国特許第5,082,670号)。神経移植又は移植術は、
中枢神経系又は脳室腔又は宿主脳表面の硬膜下への細胞の移植に関っている。移
植が成功する条件は以下を含む：1)インプラントの生存率；2)移植部位への移植
片の維持；及び、3)移植部位での最低量の病理学的反応。

【００６０】例えば胚性脳組織のような様々な神経組織の宿主脳への移植法は、Neural Gra
fting in the Mammalian CNS、Bjorklund及びStenevi編集(1985年)、Das, 第3章
、23〜30頁；Freed、第4章、31〜40頁；Steneviら、第5章、41〜50頁；Brundin
ら、第6章、51〜60頁；Davidら、第7章、61〜70頁；Seiger、第8章、71〜77頁(1
985年)に記されており、これは本願明細書引用により組入れられている。これら
の手法は、移植時に脳実質(brain parenchyma)へ対置するために、実質内移植(i
ntraparenchymal transplantation)、すなわち宿主脳内の組織の注射又は沈着に
より達成される(脳外側又は実質外への移植と比較して)宿主内への移植を含む(D
as、前掲)。

【００６１】実質内移植のふたつの主な手法は以下のものである：1)ドナー細胞の宿主脳実
質内への注入、又は2)宿主脳実質を露出するための手術手技による腔の形成、そ
の後の腔への移植片の沈着(Das、前掲)。両方法共、移植時に移植片と宿主脳組
織の間に実質の付着を提供し、かつ両方法共移植片と宿主脳組織の間の解剖学的
一体化を促進する。これは、移植片が宿主脳の一体化された部分でありかつ宿主
生命を生存させることが必要であるならば重要である。

【００６２】あるいは、この移植片は、脳室内、例えば大脳室内、又は硬膜下、すなわち介
在軟膜(intervening pia mater)又はクモ膜及び軟膜により宿主脳実質から隔て
られた宿主脳の表面に配置することができる。脳室への移植術は、ドナー細胞の
注入によるか、又はその後移植片の転置を防ぐために脳室内に移植される固形組
織の栓(plug)を形成するための3％コラーゲンのような基質内で細胞を増殖する
ことにより達成することができる。硬膜下移植術のためには、硬膜にスリットを
形成した後、脳表面の周りに細胞が注入される。宿主脳の選択された領域への注
入は、ドリルで穴あけしかつ微量注入器の針を挿入することができるように硬膜
を穿刺することにより行うことができる。微量注入器は、脳定位固定装置に装着
されることが好ましく、かつ針を脳又は脊髄の所望の位置に配置するために3次
元定位固定性座標が選択される。ドナー細胞は、被殻、基底核、海馬皮質、脳の線条又は尾状領域、更には脊髄
に導入することもできる。

【００６３】移植のためには、細胞浮遊液を、注射器で吸引し、かつ麻酔をかけた移植レシ
ピエントへ投与する。この手法を用いて、複数回の注入を行うことができる。ド
ナー組織の年齢、すなわち発達段階は、移植術後の細胞生存の成功に影響を及ぼ
すことがある。従って細胞浮遊液の手法は、ドナー細胞の脳又は脊髄のいずれかの予め定めら
れた部位への移植術を可能にし、これは比較的非外傷性であり、同じ細胞浮遊液
を用いるいくつかの異なる部位又は同一部位への同時に多回移植術を可能にし、
かつ異なる解剖学的領域由来の細胞の混合物を可能にする。多回移植術は、細胞
型の混合物、及び／又は細胞に挿入される導入遺伝子の混合物からなる。好まし
くは、1回の移植術当たり約10⁴〜約10⁸個の細胞が導入される。

【００６４】脊髄への移植術について好ましい腔への移植に関しては、例えば脳を覆う骨の
除去及びゲルフォームのような材料による出血の停止により、組織がCNSの外面
に密接した領域から除去され、移植腔を形成する(Steneviら、Brain Res.、114:
1-20(1976))。吸引を用いて腔を形成することができる。その後移植片が、腔内
に配置される。細胞の注入又は固形組織インプラントを用いて、1回より多い移
植を、同じ腔に行うことができる。

【００６５】外傷を受けた脳へのドナー細胞の移植は、例えば移植術を試みる前に、損傷部
位を浄化しかつ出血を停止しなければならないといった、様々な手技が必要であ
ろう。加えて、ドナー細胞は、外傷を受けた脳の病理学的環境内で移植片の単離
を防ぐために宿主脳のあらゆる病巣又は腔を満たすのに十分な増殖能を有さなけ
ればならない。

【００６６】細胞表現型の測定特定の実施態様において、細胞の分化又は他の修飾が生じているかどうかを決
定するために、大気より低い酸素条件において生育している細胞の表現型を追跡
することが必要なことがある。これを行うために、メッセージレベル、タンパク
質レベル、細胞下局在、機能アッセイ又は形態学的変化の追跡を含む、様々な方
法が使用される。メッセージレベルを追跡する方法は、PCR（登録商標）(米国特
許第5,364,790号；米国特許第4,800,159号；米国特許第4,683,195号)、In Situ
ハイブリダイゼーション(米国特許第4,888,278号；米国特許第4,886,741号；米
国特許第5,506,098号；米国特許第5,225,326号；米国特許第5,521,061号；米国
特許第5,538,869号；米国特許第5,665,540号)、RNAseプロテクションアッセイ、
及び単細胞PCR（登録商標）がある。タンパク質レベルを追跡する方法は、抗体
染色、HPLC、ウェスタンブロット又は免疫沈降法を使用することができる。これ
らの技術は、全て当業者には周知である。

【００６７】迅速な遺伝子検出及び配列決定技術の利点と組合せた2種の細胞型又は集団に
おいて示差的に発現された遺伝子を検出できるということを、酸素濃度の変動下
で培養された細胞における遺伝子発現を比較するために使用することができる。ディファレンシャルディスプレイ法を用いて、2種の比較的類似した細胞型間
で、又はある状態から別の状態への細胞の逐次的な変化時に、表現型の差異に寄
与する遺伝子を解明する。例えば、ディファレンシャルディスプレイ技法を用い
、Kocherら(1995)は、正常な腎実質と比較して腎細胞癌腫においてアップレギュ
レーションされた遺伝子を選択した。この方法により、Kocherら(1995)は、正常
上皮細胞集団において発現されることは稀な、癌腫の大半の悪性上皮細胞におい
て発現され、かつ結腸、乳及び肺起源の癌腫において著しく過剰発現される遺伝
子(DD96)を単離することができた。同様の技法を用いて、通常条件、対、低酸素
レベル条件でインキュベーションした細胞における遺伝子発現を比較することが
できる。次にある集団においてその他よりもアップレギュレーションされた遺伝
子をプローブとして用い、他の細胞集団又は異なる培養条件下(すなわち、該遺
伝子発現に影響を及ぼし得る化合物又は環境刺激が存在する)での同じ細胞集団
における遺伝子の発現をスクリーニングする。

【００６８】 Kangら(1998)は、豊富又は稀有に示差的に発現された遺伝子の両方の迅速かつ
効率的な同定及びクローニングを可能にする、相互引き算式(reciprocal subtra
ction)ディファレンシャルRNAディスプレイ(RSDD)法を開発した。この技術は、
アデノウイルスで形質転換されたげっ歯類細胞が激しい形質転換状態を展開する
際のような、癌の進行時に生じた遺伝子発現の変動を分析するために使用された
(Kangら、1998)。この方法は、進行の関数としての発現及び進行の関数としての
抑制された発現を示した既知及び未知の配列の同定及びクローニングをもたらし
た(Kangら、1998)。このRSDD技術を使用して、室内大気条件、対、大気より低い
条件において、細胞の維持、増殖および／または前駆細胞又は幹細胞からの完全
に分化した細胞へ分化時の際の、細胞間の遺伝子発現を比較することができる。

【００６９】ディファレンシャルディスプレイ法を、迅速なDNA配列決定及び検出法と組合
せて用いることができ、これにより比較的短時間に非常に多くの遺伝子をスクリ
ーニングまたは配列決定する能力を可能にする。米国特許第5,800,992号は、ア
レイ内の相補的ポリヌクレオチドを用いて、2種の細胞型の間で複数の遺伝子の
示差的発現を検出する方法を提供している。このような技術は、ポリヌクレオチ
ドが基板上に付着されているのが、コンピュータのマイクロプロセッサーチップ
に似ているので、通常「DNAチップ」技術と称されている。更に、DNAチップを用
いて遺伝子を配列決定する方法も記されている。

【００７０】加えて同様の技術が米国特許第5,834,181号にも開示されており、これは1個の
ヌクレオチド置換のような遺伝子の小さい変化を検出するために同様の技術を使
用し、そのため細胞表現型の変化に繋がる遺伝子における突然変異の検出が可能
である。単一細胞逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)法も、通常本発明において育
成された細胞表現型の追跡に有用であろう。このような技術は、例えばCornelis
on及びWold(1997)に説明されている。

【００７１】 Comelison及びWoldの単細胞RT-PCR技術は、一度に多数の遺伝子の発現を決定
することを可能にし、並びに骨格筋衛星細胞を同定しかつ本発明の低／生理的酸
素条件下でインキュベーションした場合のそれらの活性化状態を決定するために
使用することができる。

【００７２】通常使用される別の検出法は、RNAse保護アッセイであり、ここでは放射標識
されたRNAプローブが、個体から得た総細胞RNAのような、被験RNA集団とRNAプロ
ーブの相補的セグメントと被験RNAがハイブリダイズするような条件下で混合さ
れる。その後、この混合物にRNAseが添加され、未保護(ハイブリダイズしていな
い)、1本鎖プローブ及び被験RNAを破壊する。全ての1本鎖RNAが破壊された場合
、保護されたRNAの短い断片のみが残留し、これは被験RNAの特定のRNA組成物を
診断するために電気泳動により分析することができる。保護された2本鎖RNA断片
は、分析の前に変性され、検出可能な、標識された1本鎖RNAプローブ断片として
利用することができる。

【００７３】疾患モデル一旦特定の細胞セットが作成されたならば、当然、これらの細胞が疾患モデル
に適用できるかどうかテストすることが必要であろう。パーキンソン病及び他の
神経変性疾患の動物モデルが現在当業者に周知である。

【００７４】例えばパーキンソン病ラットモデルは、生理食塩水-アスコルビン酸6-ヒドロ
キシ-ドーパミン(6-OHDA)を内側前脳束に一側性注入を行うことにより作出する
ことができる。これは、最終的にパーキンソン挙動を模倣する病巣を形成する。
形成された病巣の完全性は、アポモルヒネ又はアンフェタミンのいずれかにより
誘導される回旋行動を監視することにより可能である(Ungerstedt及びArbuthnot
t、1970)。1分間に7回転より多い率で回転する動物は(Schmidtら、1982)、適当
な病巣を有すると推定することができる(アポモルヒネ投与後の少なくとも7回の
反対側性回転／分、及びアンフェタミン投与後の病巣側に向かう少なくとも7回
の同側性回転／分)。

【００７５】このようなモデルを用いて、ベースライン時の回旋行動を確立することができ
る。その後、本発明で増殖した細胞を、前述のラットモデルに移植することがで
きる。何らかの回旋行動の減少は、適当な治療的価値のある細胞移植の指標とな
るであろう。

【００７６】遺伝子の置換／増強の用途場合により、本発明の方法を用いて得られたCNS細胞を操作し、所望の遺伝子
産物を発現することができる。遺伝子治療を使用するため、遺伝子産物を置換す
るため、組織の再生を促進するため、疾患を治療するため、もしくは患者への移
植後の細胞の生存を改善する(すなわち拒絶反応の防止)ために、細胞を修飾する
ことができる。この実施態様において、CNS細胞は、エクスパンジョン及び分化の前に、トラ
ンスフェクションされる。細胞のトランスフェクション技法は当該技術分野にお
いて公知である。

【００７７】当業者は、トランスフェクションされた細胞に、又はより間接的にはレシピエ
ント患者／動物に、有益な特性を運ぶであろう多数の遺伝子を構想することがで
きるであろう。加えられた遺伝子は、実施態様に応じて、最終的にレシピエント
細胞及びその子孫全てにおいて維持されてもよく、又は単に一過性に維持される
のみでもよい。例えば、チロシンヒドロキシラーゼ、又はVMAT1もしくはVMAT2の
ようなモノアミン輸送体をコードしている遺伝子を、特定のCNS細胞にトランス
フェクションし、パーキンソン病対象への移植術に適した適当な治療的細胞を提
供することができる。使用することができるその他の遺伝子には、GABA-デカル
ボキシラーゼ、エンケファリン、ドーパデカルボキシラーゼ(AADC)、毛様体神経
栄養因子(CNTF)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、ニューロトロピン(NT)-3、NT-4、
及び塩基性繊維芽細胞成長因子(bFGF)が含まれる。

【００７８】一部の状況において、細胞を1種よりも多い遺伝子でトランスフェクションす
ることが望ましいことがある。勿論、前述の治療的遺伝子はひとつの例であり、
かつ当業者は、遺伝子の発現及び／又は機能の異常に起因したいずれかの神経変
性障害は、遺伝子の置換及び／又は増大により治療することができることを理解
するであろう。このような障害及びそれに関連した遺伝子は、当業者には周知で
ある。一部の状況においては、遺伝子産物を分泌させることが望ましい。このような
場合、遺伝子産物は、該タンパク質の分泌を促進する分泌シグナル配列を含むこ
とが好ましい。

【００７９】本願明細書において使用されたウイルスベクターは、アデノウイルス(米国特
許第5,824,544号；米国特許第5,707,618号；米国特許第5,693,509号；米国特許
第5,670,488号；米国特許第5,585,362号；これらは各々本願明細書に参照として
組入れられている)、レトロウイルス(米国特許第5,888,502号；米国特許第5,830
,725号；米国特許第5,770,414号；米国特許第5,686,278号；米国特許第4,861,71
9号、これらは各々本願明細書に参照として組入れられている)、アデノ随伴ウイ
ルス(米国特許第5,474,935号；米国特許第5,139,941号；米国特許第5,622,856号
；米国特許第5,658,776号；米国特許第5,773,289号；米国特許第5,789,390号；
米国特許第5,834,441号；米国特許第5,863,541号；米国特許第5,252,521号；米
国特許第5,252,479号；これらは各々本願明細書に参照として組入れられている)
、アデノウイルス−アデノ随伴ウイルスハイブリッド(米国特許第5,856,152号、
これは本願明細書に参照として組入れられている)、レンチウイルスベクター、
ワクシニアウイルス又はヘルペスウイルス(米国特許第5,879,934号；米国特許第
5,849,571号；米国特許第5,830,727号；米国特許第5,661,033号；米国特許第5,3
28,688号；これらは各々本願明細書に引用により組入れられている)ベクターで
あることができる。

【００８０】非ウイルスベクターによる発現構築物の送達も考察されている。このような送
達は、微量注入法(米国特許第5,612,205号)、電気穿孔法(米国特許第5,507,724
号；米国特許第5,869,326号；米国特許第5,824,547号；米国特許第5,789,213号
；米国特許第5,749,847号；米国特許第5,019,034号；Tur-Kaspaら、1986；Potte
rら、1984)、リン酸カルシウム共沈降法(Graham及びVan Der Eb、1973；Chen及
びOkayama、1987；Rippeら、1990)、DEAEデキストラン誘導法(Gopal、1985)、受
容体が媒介した導入法(Wu及びWu、1987；Wu及びWu、1988)、リポソーム媒介した
導入法(米国特許第5,631,018号；米国特許第5,620,689号；米国特許第5,861,314
号；米国特許第5,855,910号；米国特許第5,851,818号；米国特許第5,827,703号
、米国特許第5,785:987号；Nicolau及びSene、1982；Fraleyら、1979)、デンド
リマー法(米国特許第5,795,581号；米国特許第5,714,166号；米国特許第5,661,0
25号)、剥き出しのDNA注入法(Harland及びWeintraub、1985)、及びパーティクル
ボンバードメント法(米国特許第5,836,905号；米国特許第5,120,657号；Yangら
、1990)がある。

【００８１】所望の遺伝子は、通常それ自身のプロモーター又は外来プロモーターに機能的
に連結され、これらはいずれの場合も遺伝子産物の転写を媒介する。プロモータ
ーは、制限された又は全般的な組織型の発現を起動するそれらの能力を基に、又
はそれらが促進する発現レベルか、もしくはこれらが添加された化学物質、薬物
又はホルモンといかに反応するかを基に選択される。特に考察されたプロモータ
ーは、CMV IE、SV40 IE、β-アクチン、コラーゲンプロモーター、THプロモータ
ー、AADCプロモーター及びネスチンプロモーターを含むが、これらに限定される
ものではない。

【００８２】遺伝子の発現を変更するその他の遺伝子調節配列は、同時トランスフェクショ
ンすることができる。いくつかの実施態様において、宿主細胞DNAは、プロモー
ター及び／又は追加の調節配列を提供することができる。エンハンサー又は高レベルの発現を生じるシステムのような発現を増強する他の
エレメントも、同じく含むことができる。

【００８３】哺乳類細胞における遺伝子ターゲティング法は、当業者に周知である(米国特
許第5,830,698号；第5,789,215号；第5,721,367号及び第5,612,205号)。「遺伝
子ターゲティング」は、細胞の染色体に位置する遺伝子の全体又は一部が、異種
ヌクレオチド断片により置換されることを意味する。この断片は、主に該遺伝子
に対する特異的突然変異を伴う標的化された遺伝子配列を含むことができるか、
又は第二の遺伝子を含むことができる。第二の遺伝子は、プロモーターに機能的
に連結されるか、又は転写に関して該細胞のゲノム内に含まれたプロモーターに
依存的である。好ましい実施態様において、第二の遺伝子は、該遺伝子を欠いて
いる細胞に対して毒性のある化合物に対する耐性を細胞に付与する。このような
遺伝子は、典型的には抗生物質耐性遺伝子と称される。その後この遺伝子を含む
細胞は、毒性化合物の存在する中での該細胞の培養により選択される。

【００８４】その他の細胞型の用途前述の考察の大半はCNS細胞の育成及び培養に焦点を合わせているが、本発明
の技術は、その他の種類の細胞の増殖にとっても有用であることは理解されなけ
ればならない。このように、本願明細書において提供された技術は、移植治療に
おいて常用されるあらゆる細胞の増殖に有用であることが意図されている。例え
ば、このような細胞は、糖尿病のための島細胞；筋ジストロフィーのための筋原
細胞；肝疾患のための肝細胞；創傷治癒及び／又は火傷のための皮膚移植片、並
びに造血系及び遺伝子疾患のための骨髄又は幹細胞であることができる。加えて
、1998年11月18日に出願された米国特許出願第09/195,569号(これは本明細書に
参照として組入れられている)の開示は、本発明と組合せることが有用な別の例
を提供するであろう。

【００８５】実施例下記実施例は、本発明の好ましい実施態様を明らかにするために含まれている
。当業者には、本発明者により発見された代表的技術を辿るこれらの実施例に記
された技術は、本発明の実践において良好に機能し、従ってその実践のための好
ましい態様を構成するために考察することができる。しかし当業者は、本発明の
開示に関して、明らかにされた具体的な実施態様において、多くの変更を行うこ
とができること、及び本発明の精神及び範囲を逸脱することなく同様又は類似の
結果を得ることを理解しなければならない。

【００８６】実施例１材料及び方法 CNS幹細胞の培養動物を、NIHガイドラインに準じ、飼育及び処置した。ラット胚の外側神経節
隆起(E14)又は中脳(E12)から切除した細胞を機械的に分離し、予めポリオルニチ
ン／フィブロネクチンで被覆したプラスチック製24-ウェルプレート(Costar社)
又は12mmガラスカバースリップ(Carolina Biologicals社)上に播種し、かつbFGF
を伴う規定培地で増殖した(Studerら、1998；Joheら、1996)。概してbFGFは、培
養の4〜6日後に培地から取り除いた。プラスチック製48-ウェルプレート(Costar
社)において、クローンアッセイを行った。一部の試験において、組換えヒト(rh
)EPO、rhVEGF₁₆₅又は組換えマウス(m)FGF8b、又はそれらの中和抗体(全てR&D Sy
stems社から入手)を、下記の濃度で培養物に添加した：EPO 0.5U/ml、EPO中和抗
体10μg/ml、FGF8 250ng/ml、FGF8b中和抗体5μg/ml、VEGF 50ng/ml、VEGF中和
抗体0.5μg/ml。EPOについての用量反応決定を、0.05U/ml、0.5U/ml、5U/ml及び
15U/mlで行い；抗-EPOについて、10μg/ml及び100μg/mlで行った。全ての実験
の結果は、少なくとも2つの独立した培養シリーズにより確認した。

【００８７】低酸素培養培養物を加湿した携帯単離用チャンバー(Bi1lups-Rothenberg社、デルマール
、CA) に配置し、毎日ガス混合物(1％O₂、5％CO₂ + 94％N2)をフラッシュした。
周囲大気中の正確なO₂レベルは、チャンバーフラッシュの長さによって決まり(1
5L/分での90秒のフラッシュは6％O₂を達成し、6分間のフラッシュは1.5％O₂を達
成した)、これはO₂−感受性電極システム(OS2000、Animus社、フレーザー、PA)
が利用できるようになるまでは標準化されなかった。従って、「低いO₂」条件は
、環境O₂ 3±2％の範囲を表しており、これはほぼ正常な脳組織レベルである(表
1)。温度37℃に維持するために、チャンバー全体を、インキュベーターの中に収
容した。

【００８８】 BrdU取り込み及びTUNEL分析ブロモデオキシウリジン(10μM)を、固定直前に、正確に60分間培養物に添加
した。抗-BrdU染色を、製造業者のプロトコールに従い行った(Amersham Life Sc
iences社)。製造業者のプロトコールに従いTUNEL反応(Boehringer-Mannheim社)
を行った。TUNEL＋細胞を、FITC標識物のペルオキシダーゼ転換後に、金属増強
したDAB反応(Pierce社)により可視化した。

【００８９】免疫組織化学細胞は、4％パラホルムアルデヒド+0.15％ピクリン酸／PBSで固定した。標準
の免疫組織化学的プロトコールに従った。下記の抗体を用いた：幹細胞／前駆細
胞の特徴決定：ネスチンポリクローナル抗体#130 1:500 (Martha Marvin & Ron
McKay社)、PSA-NCAM、En1及びFP4(全てモノクローナル抗体1:2、Developmental
Studies Hybridoma Bank、Tom Jesselより提供)。幹細胞分化：β-チューブリン
タイプIII(Tuj1)モノクローナル抗体1:500及びポリクローナル抗体1:500(両方共
BabCO社)、O4モノクローナル抗体1:5 (Boehringer-Mannheim社)、ガラクトセレ
ブロシド(GalC)モノクローナル抗体1:50 (Boehringer-Mannheim社)、グリア繊維
酸性タンパク質(GFAP) 1:100 (ICN Biochemicals社)。ニューロンサブタイプの
分化：チロシンヒドロキシラーゼ(TH)ポリクローナル抗体1:200〜1:500 (PelFre
eze社、ロジャー、AK)又はモノクローナル抗体1:2000 (Sigma社)、GABAポリクロ
ーナル抗体1:500 (Sigma社)、グルタミン酸1:500 (Sigma社)、ドーパミンβ-ヒ
ドロキシラーゼ(DBH) 1:100 (Protos Biotech社)。適当な蛍光-標識した(Jackso
n Immunoresearch社)又はビオチン化した(Vector Laboratories社)二次抗体、そ
の後の金属-増強したDAB反応(Pierce社)を用いて可視化した。

【００９０】細胞計測及び統計学的手法細胞計数及び定量化には、フラクショネーター技術を用いる均一なランダム試
料採取法を用いた(Gundersenら、1988)。統計学的比較は、2群より多くが関連し
た場合、事後Dunnett検定によるANOVAを用いて行った。データが正規分布してい
ない場合は、非-パラメトリック検定(Mann-Whitney U)を用い、低O₂対20％O₂の
結果を比較した。データは、平均±SEMで表した。

【００９１】ドーパミン含量の逆相-HPLC決定培地、HBSS、及びHBSS＋56mM KClの培養上清を、オルトリン酸及びメタ重亜硫
酸塩で安定化し、かつ分析まで-80℃で保存した。安定化、アルミニウム吸着、
平衡化、及びドーパミン溶離は、これまでに説明されている(Studerら、1998；S
tuderら、1996)。結果は、変動する流量及び感度で、ドーパミン標準品に対して
標準化した。

【００９２】ウェスタンブロット細胞ペレットを、-80℃で貯蔵した。ペレットは、プロテアーゼインンヒビタ
ー(Complete、Boehringer-Mannheim社)が入った、20mM Hepes、pH7.6、20％グリ
セロール、10mM NaCl、1.5mM MgCl2、0.2mM EDTA、0.1％トリトン-X-100中に溶
解し、ホモジナイズし、かつ氷上で1時間インキュベーションした。遠心後、上
清タンパク質濃度を、BCA (Pierce社)によりアッセイした。ウェスタン法のため
には、TBST中の5％ミルクでブロックし、一次TH抗体(Pel-Freeze社、ロジャース
、AK)を1:500で使用し、かつ二次抗体は、HRP-複合ヤギ抗-ウサギ抗体(Pierce社
)1:5000であった。シグナルは、SuperSignal (Pierce社)で検出した。

【００９３】 RTPCR（登録商標）培養物を、PBSで1回洗浄し、その後2ml(6cm皿1枚当たり) Trizol (Life Techn
ologies社)で可溶化し、その後-80℃で保存した。製造業者(Gibco Life Technol
ogies社)の推奨に従い、RNA抽出を行った。ひとつの条件につき10μgのRNA逆転
写に、Superscriptキット(Gibco Life Technologies社)を用いた。PCR条件は、
直線状の増幅範囲を決定するように、MgCl濃度及びサイクル数を変更し最適化し
た。増幅産物は、サイズ別に同定し、かつDNA配列決定により確定した。親切に
もTHは、Vera Vikodem、NIDDK、30サイクル、56℃、300bpにより提供された。他
の産物については、プライマー配列、サイクル数及びアニーリング温度を、表2
に示した。

【００９４】

【表２】表２．PCRのためのプライマー配列、サイクル数およびアニーリング温度

【００９５】

【表３】表２．つづき

【００９６】

【表４】表２．つづき

【００９７】実施例２結果：低O₂は線条及び中脳前駆細胞のエクスパンジョンを増大させる CNS前駆細胞由来物として広く使用されているE14ラットの線条を、低O₂中で培
養し、bFGFの存在下で広範な播種密度にわたって、20％O₂培養物よりも平均2〜3
倍多い細胞を得た。(塩基性FGFは、発生時の脳の多くの領域から得られる幹細胞
にマイトジェンとして作用する。bFGFの除去は、ニューロン、アストロサイト及
びオリゴデンドロサイトへの分化を開始する。)(図1)。同様の結果が、E12中脳
前駆細胞においても得られた。全ての結果について、データは、少なくとも2回
の個別の一連の培養により証明された。

【００９８】細胞増殖及び細胞死に対する作用低O₂中で得られた増大した細胞が、増大した増殖、低下した細胞死、又はこれ
ら両方に起因するものかどうかを検証するために、前駆細胞を、固定直前に複数
の時点でブロモデオキシウリジン(BrdU)で1時間パルスすると、前駆細胞は増殖
又は分化した。中脳及び線条の両前駆細胞は、低O₂中で育成した場合に通常の培
養と比べて増大したBrdU標識指標を示した。低O₂中は、bFGFの存在下及び細胞分
化、その後の中脳前駆細胞からマイトジェンが取り除かれた時には、BrdU標識指
標は増大した(図2)。線条前駆細胞へのBrdU取り込み率は同様のパターンを示し
た。｛エクスパンジョン2日目：低O₂中で18±6％、対、20％O₂中で11±6％(n=24
、p < 0.05)。エクスパンジョン6日目：低O₂中で30±8％、対、20％O₂中で22±5
％(n=24、p < 0.05)。分化4日目(in vitro 10日目)：低O₂中で12±5％、対、20
％O₂中で3±3％(n=24、p < 0.05)。｝。

【００９９】この明らかな低O₂培養での細胞増殖の増加に加えて、前駆細胞は恐らく20％O₂ 中で増殖したCNS前駆細胞よりも少ないアポトーシスを受けたであろう。中脳及
び線条の両前駆細胞は、エクスパンジョン時及びbFGF除去後の両方で TUNEL-陽
性細胞の割合の顕著な低下を示した。中脳前駆細胞に関するTUNELデータを図3に
示した。従って、減少したアポトーシス及び増大した細胞増殖の両方が、エクス
パンジョン終了時の細胞収量の上昇に寄与する。細胞死は、O₂レベルの低下によ
り分化相時に減少するが完全に排除されるわけではない。

【０１００】細胞系列及びクローン増殖低O₂中の培養がいかに分化経路の選択及び分化の速度論に影響を及ぼすかを特
徴付けるために、一連の分子マーカーを、形態学的評価と共に使用した。中間径
フィラメントネスチンの免疫反応性を用いて、CNS幹細胞及び前駆細胞をより分
化した子孫から区別した(Lendahlら、1990)。bFGF除去の6日後、エクスパンジョ
ンした前駆細胞に由来するネスチン-陽性細胞の割合は、低O₂培養物で、20％O₂
培養物と比べ著しく減少しており、このことは、分化が低O₂中で加速されたこと
を示唆している(図4A及び図6)。提唱された明確なニューロン前駆細胞のマーカ
ーであるNCAMのシアル酸置換型(PSA-NCAM) (Mayerら、1997)は、逆に、低O₂中培
養物の分化を低下した(図6)。より分化された表現型への進行が加速されるとい
う考えは、低O₂中でのニューロン性及びグリア性のマーカーのより早期の出現に
より裏付けられた。ニューロンはβ-チューブリンIII(Tuj1)染色により評価し、
アストロサイトはグリア繊維酸性タンパク質(GFAP)で、オリゴデンドロサイト前
駆細胞はO4で、及びオリゴデンドロサイトはGalCガラクトセレブロシド染色によ
り評価した(図4)。bFGF除去の5日後、低O₂中に維持された線条培養物は、46％の
Tuj1-陽性細胞を含んだのに対して、20％O₂中では34％であり(n=12、p <0.05)；
GFAP+は6％であるのに対し、20％O₂中では2％であり(n=12、p < 0.05)；かつ、G
al-C+は4％であるのに対し、20％O₂中では5％であった(p=n.s.)。低酸素中に維
持された中脳培養物においては、Tuj1+は73％であるのに対し、20％O₂中では63
％であり(n=l2、p< 0.06)；GFAP+細胞はいずれの酸素条件でも検出されず；O4+
は1％であるのに対し、20％O₂中では0％であった(n=12、p <0.01) (図4B)。

【０１０１】クローン密度に対するO₂の作用を調べるために、中脳前駆細胞を最初にbFGF中20
％O₂中で6日間エクスパンジョンし、密度が1〜5個細胞／ウェルになるよう再度
播種し、その後低又は20％O₂中のいずれかで維持した。20日後、20ng/mL bFGFを
取り除いた。典型的な多系分化反応を伴うクローン性培養物が、低O₂及び20％O₂ 条件の両方で観察された。図4Cは、典型的ネスチン+クローン(左パネル)及びマ
イトジェン除去後4日間ニューロン分化したクローン性に誘導された細胞(右パネ
ル)を示している。予想される幹細胞のように、3種全ての系列は、低酸素条件で
増殖したクローンで示された。しかし、クローン形成の効率は、低O₂条件が3倍
高く、平均クローンサイズも、20％O₂中の<50個細胞より、低O₂中の50〜500個細
胞と増加した(図4D、図4E)。

【０１０２】実施例３結果：ニューロンサブタイプの分化先の結果は、低酸素条件が幹細胞の増殖及びニューロン及びグリア細胞への分
化を支持することを確立した。本発明者らの以前の研究は、ネスチン-陽性中脳
前駆細胞が機能的ドーパミン作動性ニューロンへ分化することを示した(Studer
ら、1998)。次に、この特異的ニューロンの運命が低O₂により影響を受けるかど
うかを決定した。低酸素中での中脳前駆細胞は、THを発現しているニューロンの
絶対数及び画分の両方で際だった増加を示した(図5A、図5B)。低O₂中において、
実質的には全てのニューロンがTH+であるような多くのニューロン細胞集塊が認
められた。平均で、低O₂中で生成されたニューロン(Tuj1染色により印付け)の56
％が、TH+であるのに対し、従来の培養物中では18％であった(n=l2、p <0.001)
。低O₂培養物中で増大したTH-免疫反応性は、ウェスタンブロットにおける増大
したTHタンパク質含量に相関していた(図5C)。更にTH-陽性ニューロンの機能的
ドーパミン作動性の能力を逆相HPLCにより評価したところ、これは、低O₂、対、
20％O₂培養物において顕著に増大したドーパミンレベルを示した(図5D)：馴化培
地(condition medium)(24時間)は、5倍のドーパミンの増加を示した(n=5、p<0.0
１)。HBSS中の基本的放出は、2〜3倍の増加を示し(n=5、p <0.05)、かつ放出の
惹起は3倍の増加をもたらした(n=5、p < 0.05)。これらの結果は、機能的ドーパ
ミン作動性ニューロンの分化には低酸素が好ましいことを確認している。

【０１０３】中脳前駆細胞は、ドーパミン作動性の運命に加えて、いくつかの異なる神経伝
達物質表現型を伴うニューロンを生じる(Studerら、1998)。興味深いことに、セ
ロトニン作動性ニューロンの割合も、20％O₂中の1.2±0.3％に対し、低O₂中で3.
2±1.2％と増大した(n=12、p <0.05、図6)。他方で、GABA+及びグルタミン酸+ニ
ューロンは、低O₂中でより少ないように生じた(図6：GABA+細胞は、低O₂中で6.6
±1.8％、対、20％O₂中で10.4±1.5％、n=12、p < 0.05；グルタミン酸+細胞は
、低O₂中で12.8％±3.8％、対、20％O₂中で23.6±4.0％(n=12、p <0.01)。GABA
とTHの二重標識は検出されず、これはTHの免疫反応性が分化したドーパミン作動
性ニューロンに対応しており、かつGABA作動性ニューロンの発生時に認められる
一過性の発生的現象ではないことを示している(Maxら、1996)。更に、TH-陽性ニ
ューロンは、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼで染色されなかったので、ノルア
ドレナリン作動性の表現型は運命づけられていない。

【０１０４】低O₂は、腹側(ventral)ニューロン表現型であるドーパミン作動性及びセロト
ニン作動性ニューロンの両方の分化を促進したので(Yamadaら、1991；Hynesら、
1995；Yeら、1998)、これらの変化は、底板細胞の増加に関連していることが決
定された。免疫組織化学的に、低O₂中でのFP4+細胞のエクスパンジョンされたゾ
ーンが明らかにされた(図6)。より際立った特徴は、低O₂中で転写因子エングレ
イルド-1(En1)(engrailed-1)を発現しているニューロン出現の増大である(図6)
。エングレイルド-1は、通常の中脳発生に重要であり(Joyner、1996；Danelian
及びMcMabon、1996；Wurstら、1994)、かつドーパミン作動性ニューロンの運命
の制御に関連している(Simoneら、1998)。

【０１０５】低酸素条件が、培養システムの増殖又は分化相の間に作用することにより、ド
ーパミン作動性の分化を増強するかどうかを確立することは重要である。中脳前
駆細胞を5日間、低又は20％O₂中のいずれかでエクスパンジョンした。その後各
群を低又は20％O₂のいずれかでの分化について再分した。低O₂中でエクスパンジ
ョンされたが20％O₂中で分化された前駆細胞は、38±6％のTH-ニューロンを生じ
、これは全て低O₂中で維持されたもの(41±7％、n=12、p = n.s.)と類似してい
たが、全て20％O₂中で維持されたもの(17±4％、n=12、p <0.01)よりも顕著に高
かった。分化相に制限された低O₂への曝露は、全て20％O₂中で維持された培養物
と比べて、ドーパミン作動性ニューロンの収量を顕著に増大することはなかった
(21±2％、n=12、p=n.s.)。これらのデータから、低O₂の主な作用はエクスパン
ジョンフェーズにおけるものであることが示された。

【０１０６】半−定量的RT-PCRを用いて、培養物のRNAを様々な時点で、ドーパミン作動性
ニューロン発生に関与する候補遺伝子の示差的発現についてアッセイした(図7)
。20％O₂と比べて、THメッセージのわずかな増加が、分化後の低O₂培養物から検
出された。Ptx3ホメオボックス遺伝子も、ドーパミン作動性ニューロンの発生に
関連していて(Smidtら、1997)、かつ低O₂中での増大したレベルで発現し、この
ことはこれらの条件が、単純にTH遺伝子発現をアップレギュレーションしたので
はなく、ドーパミン作動性表現型を促進したことを示唆している。強力な証拠は
、ソニックヘッジホグ(socnic hedgehog)遺伝子(Echelardら、1993)；及び、Nur
r1 (Saucedo -Cardenasら、1998)遺伝子を、中脳ドーパミン作動性ニューロンの
分化に関連付けているが、発現のO₂−依存性は検出されなかった。しかし、エン
グレイルド-1は、低O₂中でアップレギュレーションされ、これは免疫組織化学的
結果と相似していた(図6)。繊維芽細胞成長因子8b(FGF8b)のメッセージは、エク
スパンジョンフェーズの終了時までに、低O₂中で劇的にアップレギュレーション
される。ドーパミン作動性分化の他の調節因子に対するメッセージは、O₂条件に
著しく左右されることはなかった。

【０１０７】実施例4 考察: 低酸素培養はCNS幹細胞の増殖と生存に好都合である哺乳動物細胞の培養の標準条件は、5％CO₂と95％空気のガス雰囲気中で37℃で
ある。即ち、環境温度は、コア哺乳動物体内温度を反映するように調節され、CO ₂ はほぼ静脈濃度を反映するように調節されるが、著しく対照的には、培養内O₂
レベルは生理的レベルを反映するように調節されない。水面においては、加湿さ
れていない室内空気は、21％のO₂を含有し、95％空気/5％CO₂混合物は、20％O₂
を含有する。肺胞気は14％のO₂を含有し、動脈O₂濃度は12％であり、静脈O₂レベ
ルは5.3％であり、組織細胞内O₂平均濃度は3％である(Guyton, & Hall, 1996)。
本研究に直接関係する成体ラット及びヒツジ胎児の脳平均O₂は、共に1.6％であ
った(Silver & Erecinska, 1988; Koos & Power, 1987)。脳領域の生理的組織O₂ レベルは低い(表1)。本実験においては、CNS幹細胞培養に関する、より生理的な
低酸素レベルの影響を分析し、4つの主な効果: 1)前駆細胞の増殖増加; 2)アポ
トーシスの減少; 3)分化した状態への進行加速; 4)TH+ ニューロンの絶対数と割
合の上昇がわかった。

【０１０８】低O₂培養は、一貫してCNS幹細胞の増殖を促進させた。ほとんどの細胞がネス
チン＋前駆体であるときの増殖フェーズ中に細胞数の2〜4倍の増加が観察された
。この細胞数の増加は、増殖がかなり減少し分化が行われたときのマイトジェン
の使用中止後にも維持された。低O₂において分化した培養中に多くの細胞が存在
するが、ニューロンとグリアの割合は、2つの培養条件において同様であった。
神経組織においては、特殊化されているが、視神経冠由来頚動脈体クロム親和性
細胞において低O₂のマイトジェン活性の支持している先例がある(Nurse & Vollm
er, 1997)。これらのドーパミン作動性糸球体細胞は、機能的に特殊化されたO₂
感受性化学受容体であるので、動脈におけるO₂レベルの変化に特異的に応答する
と考えられる。本結果から、低酸素がCNS幹細胞の増殖と生存を促進させること
がわかる。

【０１０９】 2つの特定のシグナリング経路、FGF8及びEPOは、低O₂応答に重要な役割の候補
として同定され、各々が20％のO₂において低O₂表現型の一部を反復し得ることが
わかった。低O₂培養によってエリスロポイエチンとFGF8をコードしているRNAの
相対増加がもたらされた。初期の中脳発達においては、FGF8はマイトジェンとし
て機能する(Dandlian & McMahon 1996)が、CNS幹細胞培養物に対するFGF8の顕著
なマイトジェン又は栄養効果は報告されていない。ここでは、20％O₂中で維持さ
れかつ250 ng/mlのFGG8に曝露した中脳前駆体からの細胞収量の増加が、低O₂の
増殖/栄養効果を部分的に再現し、低O₂中の200〜400％増加と比べて総数が30％
増加した。増殖促進のほかに、低O₂中で培養したCNS幹細胞においてアポトーシ
スが減少する。室内空気培養物中に生じた反応性酸素中間体(ROI)には毒性の潜
在的役割がある。しかしながら、20％O₂培養が低O₂培養より酸化的ストレスを生
じることは、フリーラジカルが虚血状態で生じるので単純に考えることができな
い(Perez Velazquczら, 1997)。低O₂に見られる細胞数の増加と対照的に、増殖した線条体前駆体又は中脳前駆
体に由来するニューロンとアストログリアとオリゴデンドログリアの最終比に影
響がわずかだけ検出された。クローナル分析と共にこの結果から、低酸素で増殖
したネスチン＋前駆体が幹細胞特性を有することが確認される。

【０１１０】実施例5 考察: ドーパミン作動性コミットメント(commitment)と分化 CNS幹細胞が複数のニューロンタイプを生じ得る多くの証拠がある(Joheら, 19
96; Grittiら, 1996; Kalyaniら, 1998)。ニューロンサブタイプ特定化のモデル
として中脳が数年研究されてきた(Hynesら, 1995; Yeら, 1998; Wangら, 1995;
Ericsonら, 1995; Hynes & Rosenthalの総説, 1999)。最近、試験管内で中脳前
駆細胞を増殖し、ドーパミン作動性ニューロンに分化させる条件が確かめられた
(Studerら, 1998)。わずか5％のニューロンがTHに免疫反応であるラット胎児中
脳初代培養と対照的に、E12中脳から分離した前駆体培養においてはこの数字が2
4％のニューロンに上昇した。ここでは、中脳前駆体から生じた56％のニューロ
ンがTH+ であり、この知見はHPLCによりドーパミン生産増加と関連があることが
わかる。この脳領域に見られる他の腹側ニューロンタイプのセロトニンニューロ
ンも低O₂で数の増加が生じた。対照的に、GABA作動性ニューロンとグルタミン酸
作動性ニューロンの数は減少した。低酸素条件は、前駆細胞エクスパンジョンフ
ェーズでドーパミン作動性ニューロンを生成するのにたいてい有効であった。こ
れらの結果は、低酸素条件が分化前に作用するメカニズムによって腹側動態の生
産を高めることを示している。

【０１１１】中脳ドーパミン作動性ニューロン発生の媒介物質と考えられているFGF8及びEn
1の転写物レベル(Yeら, 1998; Simoneら, 1998; Shamimら, 1999)は、低O₂培養
と20％O₂培養においてアップレギュレートした。FGF8は、セロトニンニューロン
のコミットメントにも関与している(Yeら, 1998)。これらの知見は、低O₂培養に
見られるドーパミン作動性ニューロンサブタイプ及びセロトニンニューロンサブ
タイプのエクスパンジョンにおけるFGF8の役割と一致している。しかしながら、
20％O₂培養へのFGF8の添加又は低O₂培養におけるFGF8の中和は、O₂依存性ニュー
ロンサブタイプ分化パターンを再現しなかった。分泌したモルフォゲンソニック
ヘッジホッグ(sonic hedgehog)(SHH)は、初期神経プレートの体外移植組織にお
いてドーパミン作動性ニューロン分化を誘導することがわかっている(Hynesら,
1995; Yeら, 1998; Wangら, 1995)。精製したソニックヘッジホッグは、両酸素
条件下に増殖した中脳前駆体に対して効果がなかった。

【０１１２】 Engrailed-1 mRNAとタンパク質レベルは、低酸素で上昇した。Engrailed-1は
、pax2、wnt-1及びFGF8による経路に作用して中脳ニューロンの運命を調節する
と考えられている(Joyner, 1996; Danelian & McMahon, 1996; Wurstら, 1994;
Simoneら, 1998)。FGF8遺伝子は、Engrailedの結合部位を含んでいる(Gemelら,
1999)。更に、FGF8 5'-UTR配列(受託番号#AF065607)は、VEGF及びEPO調節要素に
おける酸素応答性を制御することが既知である9塩基配列(CCTCCCTCA)を含んでい
る(Scandurro, & Beckman, 1998)。本発明者らは、En1が低O₂培養においてFGF8
の直接の上流調節遺伝子として作用するのか又はそれぞれが独立して作用するか
をまだ決定していない。しかし、若いニューロンにおけるEn1の目だった発現は
、ニューロンサブタイプ分化を調節する良好な候補であってもよいことを示して
いる。

【０１１３】 EPOレベルは、造血系において酸素によって調節されることが既知である。EPO
及びその受容体は、初期発生から成体期まで脳において発現する(Juulら, 1999)
が、CNS発達のEPOの特定の役割は記載されていない。しかしながら、成体CNSに
おいて、EPOは神経保護物質として注目され(Sakanakaら, 1998)、PC12細胞のEPO
処理は、細胞内モノアミンレベルを上昇させることが証明されている(Masudaら,
1993)。ここでの結果から、20％O₂においてEPOが低O₂効果の一部をミミックし
得ることがわかる。20％O₂培養におけるドーパミン作動性ニューロンの収量の増
加は用量依存性であるが、収量の増加は低酸素におけるEPOによって仲介されず
、低O₂におけるEPOレベルはこの応答の最大機能レベルにあったことを示してい
る。20％O₂培養のEPO補足は、ドーパミン作動性収量を著しく向上させるが、低O ₂ の十分な効果は再現されず、低O₂においてドーパミン作動性分化を促進させる
のに追加の要因が関係していることを示している。しかし、EPOがエクスパンジ
ョンしたCNS前駆体の分化パターンに影響するという知見は新規であり、低酸素
条件におけるドーパミン作動性ニューロン収量増加の成分としてのEPOを明らか
にしたものである。

【０１１４】分化したドーパミン作動性中脳ニューロンを低酸素条件(0％のO₂ガス混合物)
に曝露するとドーパミン含量が増加することが最近の報告によって強調された(G
rossら, 1999)。他の研究によって、5％O₂に曝露した後のE14ラットからのニュ
ーロン初代培養においてTH発現ニューロンの相対増加が記載されている(Colton
ら, 1995)。また、低酸素条件がTH遺伝子の発現を援助することも既知である(Cz
yzyk-Krzeskaら, 1994; Pauliding, & Czyzyk-Krzeska, 1999)。しかしながら、
これは、低酸素条件がエクスパンジョンフェーズでCNS幹細胞を支持しかつ腹側
ニューロンサブタイプの生産を高める最初の報告である。 20％O₂と比べて低O₂におけるドーパミン作動性ニューロンの正味増殖は、少な
くとも9倍促進した(全細胞数で3倍の増加、及びTH＋ニューロンのパーセンテー
ジで3倍の増加)。HPLCから、これらのニューロンがドーパミンを生産することが
わかる。本結果から、培養において従来用いられているものより非常に低い酸素
レベルがin vivoの現象を模倣するのに用いることができることがわかる。低O₂
培養は、パーキンソン病の移植片治療のためのドーパミン作動性ニューロンの効
率のよい生産にあずかるという実用的意味を有する。最後に、細胞培養に対する
生理的低O₂の効果は、CNSに限定されず、PNS及び他のニューロン組織に及ぶもの
である。

【０１１５】ドーパミン作動性分化に対するEPOの影響が研究された。飽和濃度のEPO又はEP
O中和抗体を、実施例3に示された条件を用いて低O₂又は20％O₂で増殖フェーズと
分化フェーズの間(それぞれ5日間)にE12中脳前駆体培養に添加した。EPOを、播
種時またはbFGFを除いたときの開始時に5 U/mlの用量で5日間培養液に添加した
。総培養時間10日間の終わりに、細胞を固定し、THを染色してドーパミン作動性
ニューロンをマークした。ポジティブ染色細胞の数を計数した。EPO補足によっ
て、20％O₂培養内のTH＋細胞数が著しく増加した(n＝6、p＜0.05)。 EPOの代わりに抗EPOで実験を繰り返した。抗EPO濃度は、飽和濃度にした。時
間は、EPO実験と同じにし、染色し、同じ10日の時点で計数した。EPO中和抗体に
よって、低酸素(n＝6、p＜0.05)培養と20％O₂培養双方においてTH＋細胞数が減
少した。図8は、EPOが初期に添加された場合の結果を示す図である。EPOの後期
添加において同様の結果が得られた。

【０１１６】本明細書に開示され特許を請求した組成物及び/又は方法のすべてが、本開示
によって過度の実験をすることなく実施し得る。本発明の組成物及び方法は好適
実施態様によって記載してきたが、本発明の概念、真意及び範囲から逸脱するこ
となく本明細書に記載された組成物及び/又は方法及び方法の工程又は工程の順
序に変更を加えることができることは当業者に明らかである。更に詳しくは、本
明細書に記載された薬剤を化学的及び生理的双方に関係するある種薬剤に置き換
えることができ、同じ又は似た結果が得られることは明らかである。当業者に明
らかな類似した代用及び変更はすべて、前述の特許請求の範囲によって定義され
た本明細書の真意、範囲及び概念の範囲内と考えられる。

【０１１７】参考文献以下の参考文献は本明細書に述べた方例示的または他の詳細な記載の補足的記
載を提供するものであり、本明細書に引用により取り込まれるものとする。 Bjorklund and Stenevi, Intracerebral neural grafting in animal models o
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【配列表】

【図面の簡単な説明】

以下の図面は本明細書の部分を構成し、本発明の特徴をさらに明らかにするた
めに含まれる。本発明は、本明細書に提示された個々の実施態様の詳細な説明と
ともにこれら図面の１つまたは２つ以上を参照してよりいっそう理解されるであ
ろう。

【図１】図１は、種々のプレート培養密度でのin vitro前駆細胞収量に対
する低酸素の効果を示す。線条体培養を低酸素および周囲酸素中でbFGFでエクス
パンジョンし、増殖５日後に９５％を越える細胞がネスチン＋前駆細胞であると
き総細胞数を判定した。周囲酸素と比較して、顕著な細胞数の増加が低酸素で全
ての密度で検出された。

【図２】図２は、低酸素培養はCNS前駆細胞の増殖増加をもたらすことを
示す。図２Ａ：中脳前駆細胞を固定直前に60分間10μMのBrdUでパルス処理し、
続いてBrdU取り込みについて染色した。より多くのBrdU+細胞が増殖時および分
化時の両方で低酸素培養で観察された。縮尺棒＝２０μｍ。図２Ｂ：低酸素では
中脳前駆細胞は、２０％O₂で維持した培養よりもBrdU+細胞の百分率の増加およ
びBrdU+細胞の絶対数の増加を生じる。データは平均値±ＳＥＭとして示され、
ｎ＝４０である。低酸素と２０％酸素との間の相違は全ての時点および全てのパ
ラメーター（エクスパンジョン４日目のBrdU+細胞の割合を除く；n=8、p=0.10)で
統計的に有意であった。

【図３】図３は、低酸素で培養したCNS前駆細胞は（２０％酸素に対して
）アポトーシスの割合が減少することを示す。図３Ａ：低酸素または２０％酸素
で平行して培養した中脳前駆細胞をＴＵＮＥＬ標識してアポトーシスをアッセイ
した。エクスパンジョン相（培養２日および６日）および分化相（bFGF除去後４
日）の代表的な数値を示す。縮尺棒＝２０μｍ。３Ｂ：低酸素で成育させた前駆
細胞は、従来の培養と比較して顕著なアポトーシス細胞の百分率の低下を示した
(n=8、p<0.05)。

【図４】低酸素および２０％酸素培養でのCNS幹細胞の基本的分化パター
ンを示す。図４Ａ：前駆細胞由来ニューロン（ＴＵＪ１染色による）、星状神経
膠細胞（ＧＦＡＰ）および稀突起神経膠細胞（Ｇａｌ−Ｃ）の相対百分率につい
て、低酸素または２０％酸素中での線条体培養を５日間のｂＦＧＦ増殖とそれに
続く４日間の細胞分化後に調べた（定量については本文を参照されたい）。図４
Ｂ：低酸素および２０％酸素培養でのCNS幹細胞の基本的分化パターンを示す。
低酸素または２０％酸素で継代中脳前駆細胞を６日間増殖させ、さらに５日間分
化させて、稀突起神経膠細胞の前駆細胞のマーカーであるＯ４について分析した
。Ｏ４＋細胞は低酸素培養でのみ検出できた。図４Ｃ：低酸素および２０％酸
素培養でのCNS幹細胞の基本的分化パターンを示す。ネスチン＋クローンは、継
代中脳前駆細胞の単一細胞から２０日間のｂＦＧＦ増殖の後で得られた（左図）
。低酸素中のクローンは、ｂＦＧＦ除去に際してＴＵＪ１＋ニューロンに分化し
た（右図）。図４Ｄ：低酸素および２０％酸素培養でのCNS幹細胞の基本的分
化パターンを示す。低酸素はクローン形成を効率的に促進する。単一前駆細胞に
由来するクローンの収量は、２０％酸素培養と比較して低酸素培養で３倍高かっ
た（左図）。低酸素培養の前駆細胞に由来するクローンの大半は５０−５００細
胞を含み、一方、２０％酸素培養のクローンサイズは一般に５−５０細胞であっ
た（右図）。縮尺棒＝２０μｍ（全図）。

【図５】図５は低酸素培養は機能的前駆細胞由来ドーパミン作動性ニュー
ロンの収量を改善することを示す。図５Ａおよび図５Ｂ：Ｅ１２中脳からの前駆
細胞をｂＦＧＦで５日間増殖させ、続いて５日間分化させた。その後ニューロン
マーカーＴＵＪ１についてさらにTHについて染色した。TH＋ニューロン総数（お
よび％）の顕著な増加が、２０％酸素培養と比較して低酸素培養で認められた(p
<0.001)。縮尺棒＝２０μｍ。図５Ｃ：ウェスタンブロット分析によるTHタンパ
ク質レベルの定量で、低酸素培養から得たサンプルでは２０％酸素培養に比して
THが顕著に多いことが分かった。各レーンに総タンパク質2.5mμgをロードした
。図５Ｄ：電気化学的検出を装備したｒｐ−ＨＰＬＣを用いて、条件付け培養液
（２４時間）、１５分条件付け処理後ＨＢＳＳ（基準放出）、および１５分処理
後にHBSS+56mMKCl（誘起放出）でのドーパミンレベルを定量した。低酸素で維持
した培養では、これら全ての条件で２０％酸素で成育させた場合と比較して顕著
に多いドーパミンが検出された（条件付け培養液p<0.01;基準および喚起放出p<0
.05）。挿入図は、低酸素および２０％酸素培養でのドーパミン検出について典
型的なクロマトグラフィー図を示している。

【図６】図６は、低酸素培養と２０％酸素培養における中脳前駆細胞から
のニューロンサブタイプ分化を示す。二重免疫細胞化学標識によって、低酸素培
養はドーパミン作動性およびセロトニン作動性ニューロン（Ｔｕｊ１＋）サブタ
イプの出現を顕著に増加させるが、GABA＋およびグルタミン酸＋ニューロンの出
現を減少させることが明らかにされた。２０％酸素培養でGABA染色で表示された
コロニーは、これらの状態での非常に高いGABA発現の通常でない例である。THお
よびGABAは、いくつかの発生中ニューロンでin vivoで認められるように同時に
発現されることはなかった。フロアプレート細胞（floor plate cell）（ＦＰ４
＋）は、中脳転写因子Ｅｎ１を発現しているニューロンの百分率と同様に低酸素
培養でより多かった。２０％酸素状態（下方右図）と比較して、前駆細胞マーカ
ーネスチンおよびPSA-NCAMは両方とも低酸素培養で分化後に減少した。縮尺棒＝
２０μｍ。

【図７】図７は、低酸素および２０％酸素培養での中脳前駆細胞における
示差的遺伝子発現のRT-PCRによる評価を示す。図７Ａ：酸素レベル変化に対する
生理的反応に必要な遺伝子の発現を示す。ＨＩＦ１α、ＶＨＬ、EPOおよびＶＥ
ＧＦの発現を、低酸素および２０％酸素で２または６日間のエクスパンジョン後
および分化後（分化第４日＝培養第１０日）に判定した。データはＧＡＰＤＨ発
現に対して標準化した。２０％酸素に比して、顕著なEPO発現の増加がほとんど
の細胞分化時に低酸素培養で検出され、一方、ＶＥＧＦ発現はエクスパンジョン
および分化の両方でアップレギュレートされた。驚くべきことには、ＨＩＦ１α
またはＶＨＬの主要な酸素依存調節は認められなかった。図７Ｂ：中脳発生に必
要な候補遺伝子もまた酸素依存性分化発現について調べられた。細胞分化中のTH
およびPtx-3の発現増加によって、低酸素培養における多数の機能的ドーパミン
作動性ニューロンの存在が確認された（図５と比較されたい）。ＦＧＦ８および
Ｅｎ１の発現レベルにおける酸素仲介変化の顕著な低下もまた検出された。

【図８】図８は、EPOはドーパミン作動性分化に対する低酸素の効果と類
似することを示す。飽和濃度のEPOまたはEPO中和抗体を、低酸素または２０％酸
素で増殖相および分化相の両方のＥ１２中脳前駆細胞培養に（それぞれ５日間）
加えた。EPOの補充は、２０％酸素培養でTH＋細胞の数を顕著に増加させた(n=6、
p<0.05)。EPO中和抗体は、低酸素(n=6、p<0.01)および20%酸素培養(n=6、p<0.05)の
両方でTH+細胞数を減少させた。縮尺棒=20μm。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者セステマリーアメリカ合衆国カリフォルニア州 91030 サウスパサディナマウンテンヴューアヴェニュー 1308 (72)発明者ドイルジョンアメリカ合衆国カリフォルニア州 91030 サウスパサディナマウンテンヴューアヴェニュー 1308 (72)発明者ウォルドバーバラジェイアメリカ合衆国カリフォルニア州 91108 サンマリノアードモアロード 2780 (72)発明者マッカイロンアメリカ合衆国メリーランド州 20892 −4157 ベセスダエムエスシー 4157 コンヴェントドライヴ 36 エスエイ29 エヌアイエイチ／エヌアイエヌディーエスエルエムビービルディング 36 (72)発明者ストゥーダーロレンツアメリカ合衆国メリーランド州 20892 −4157 ベセスダエムエスシー 4157 コンヴェントドライヴ 36 エスエイ29 エヌアイエイチ／エヌアイエヌディーエスエルエムビービルディング 36 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 BA30 DA02 FA02 GA18 HA17 4B065 AA93X AB04 BA01 BC14 4C087 AA01 AA02 AA03 BB45 BB64 CA04 NA20 ZA15

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】未分化の中枢神経系(CNS)細胞を低酸素環境条件下で培養す
ることを含む、細胞の分化を増大させる方法であって、前記低酸素環境条件は前
記神経細胞の細胞分化を促進するものである前記方法。
【請求項２】低酸素環境条件が約0.25％〜約18％酸素の環境酸素条件を含
む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】低酸素環境条件が約0.5％〜約15％酸素の環境酸素条件を含
む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】低酸素環境条件が約１％〜約10％酸素の環境酸素条件を含む
、請求項１に記載の方法。
【請求項５】低酸素環境条件が約1.5％〜約６％酸素の環境酸素条件を含
む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】低酸素環境条件がCNS細胞にとっての生理学的酸素条件を模
倣するものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】細胞が初代組織培養細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】細胞が細胞株由来である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】細胞が、中枢神経系幹細胞、脊髄由来前駆細胞、グリア細胞
、星状細胞、神経幹細胞、中枢神経系神経冠由来細胞、神経前駆細胞、神経細胞
、肝細胞、および骨髄由来細胞からなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法
。
【請求項１０】細胞が胎児細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】細胞が成体細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】細胞が、中脳前駆細胞、側方神経節前駆細胞、皮質前駆細
胞、星状細胞および神経芽細胞からなる群より選ばれる、請求項１に記載の方法
。
【請求項１３】分化が細胞の分化特異的表現型を監視することによって決
定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】分化特異的表現型が、メッセージレベル、タンパク質レベ
ル、細胞下局在性、機能アッセイまたは形態変化を監視することによって決定さ
れる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】メッセージレベルが、PCR^TM、in situハイブリダイゼーシ
ョン、RNase保護アッセイ、または単一細胞PCR^TMを用いて監視される、請求項１
４に記載の方法。
【請求項１６】タンパク質レベルが抗体染色、HPLC、ウエスタンブロット
または免疫沈降によって監視される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】監視されるメッセージレベルが、ネスチン、チロシンヒド
ロキシラーゼ、GAPDH；BDNF；GDNF；FGFR3；En1；FGF8；SHH、Ptx3；Nurr1；VEG
F；EPO；HIF1αまたはVHLに対するメッセージである、請求項１４に記載の方法
。
【請求項１８】監視されるタンパク質レベルが、ネスチン、チロシンヒド
ロキシラーゼ、ドーパミンβ-ヒドロキシラーゼまたはドーパミン輸送因子のレ
ベルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】機能解析がドーパミン産生速度を監視するものである、請
求項１４に記載の方法。
【請求項２０】低酸素条件が、20％酸素インキュベーター条件で育成した
類似の細胞集団に比較して、ドーパミン作動性神経細胞が濃縮された細胞集団を
産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】低酸素条件が、20％酸素インキュベーター条件で育成した
類似の細胞集団に比較して、セロトニン作動性神経細胞が濃縮された細胞集団を
産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】低酸素条件が、20％酸素インキュベーター条件で育成した
類似の細胞集団に比較して、GABA作動性神経細胞が濃縮された細胞集団を産生す
る、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】低酸素条件が、20％酸素インキュベーター条件で育成した
類似の細胞集団に比較して、グルタミン酸作動性神経細胞が濃縮された細胞集団
を産生する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】神経細胞成長刺激剤、有糸分裂促進剤、サイトカイン、神
経細胞保護因子または抗-アポトーシス剤の存在下で細胞を育成する、請求項１
に記載の方法。
【請求項２５】分化した表現型が細胞を低酸素環境条件から20％酸素培養
条件に移した後も維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】 20％酸素培養条件に移す前に、細胞が低酸素環境条件下で
複数世代増殖される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】細胞が低酸素環境条件下で連続的に維持される、請求項１
に記載の方法。
【請求項２８】細胞を低酸素環境条件で培養することを含む，培養中のCN
S細胞のアポトーシスを阻害する方法。
【請求項２９】低酸素環境条件が、約0.25％〜約18％酸素の環境酸素条件
を含む，請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】細胞を低酸素環境下で培養することを含む培養物中のCNS
細胞の拡張を増加させる方法であって、前記細胞が20％酸素インキュベーター条
件で育成した前記細胞に比較して増大した拡張を示す、前記方法。
【請求項３１】低酸素環境条件が、約0.25％〜約18％酸素の環境酸素条件
を含む，請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】低酸素環境条件がCNS細胞にとっての生理学的酸素条件を
模倣するものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】細胞が初代組織培養細胞である、請求項３０に記載の方法
。
【請求項３４】細胞が細胞株由来である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】細胞が胎児細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】細胞が成体細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】 CNS細胞を低酸素環境下で培養することを含む、培養物中
のCNS細胞の増殖を増加させる方法であって、前記低酸素環境下の培養が、20％
酸素インキュベーター条件で育成する場合に比較して細胞増殖を増加させる、前
記方法。
【請求項３８】神経変性疾病に対して使用する細胞を調製する方法であっ
て、ａ）CNS細胞の集団を得ること、およびｂ）前記細胞を低酸素環境条件で育成することであって、前記低酸素環境条件が
前記神経変性疾病に関与する遺伝子の発現を増大させるものであること、を含む，前記方法。
【請求項３９】神経変性疾病がパーキンソン病である、請求項３８に記載
の方法。
【請求項４０】遺伝子がチロシンヒドロキシラーゼ(TH)である、請求項３
８に記載の方法。
【請求項４１】細胞が初代細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】細胞が細胞株由来である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】更に、細胞をドーパミン生合成タンパク質をコードする第
１のポリヌクレオチドと、前記タンパク質の発現に適した条件下で接触させるこ
とを含み、前記ポリヌクレオチドが前記細胞中で活性なプロモーターの転写制御
下にある、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】更に、細胞をドーパミン放出タンパク質をコードする第１
のポリヌクレオチドと、前記タンパク質の発現に適した条件下で接触させること
を含み、前記ポリヌクレオチドが前記細胞中で活性なプロモーターの転写制御下
にある、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】更に、細胞をドーパミン放出タンパク質をコードする第２
のポリヌクレオチドと、前記タンパク質の発現に適した条件下で接触させること
を含み、前記ポリヌクレオチドが前記細胞中で活性なプロモーターの転写制御下
にある、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】更に、細胞を、ドーパミン生合成タンパク質をコードする
第２のポリヌクレオチドと、前記タンパク質の発現に適した条件下で接触させる
ことを含み、前記ポリヌクレオチドが前記細胞中で活性なプロモーターの転写制
御下にある、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】ドーパミン生合成タンパク質がTH；L-アミノ酸デカルボキ
シラーゼ(AADC)およびエリスロポイエチンからなる群より選ばれる、請求項４３
に記載の方法。
【請求項４８】ドーパミン放出タンパク質が小胞モノアミン輸送因子(VMA
T)である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】第１および第２のポリヌクレオチドが異なるプロモーター
の制御下にある、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】第１および第２のポリヌクレオチドが異なるプロモーター
の制御下にある、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】プロモーターが、CMV IE、SV40 IE、β-アクチン、THプロ
モーター、AADCプロモーター、およびネスチンプロモーターからなる群より選ば
れる、請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】第１および第２のポリヌクレオチドは各々ポリアデニル化
シグナルに共有結合している、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】第１および第２のポリヌクレオチドは各々ポリアデニル化
シグナルに結合している、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】出発CNS細胞を得ること、および前記細胞を低酸素環境条
件で育成することを含み、前記条件が分化神経細胞を生成するものである方法に
よって作製された細胞。
【請求項５５】出発細胞がネスチン-陽性細胞である、請求項５４に記載
の方法。
【請求項５６】低酸素環境条件がネスチン-陰性細胞を作り出す、請求項
５４に記載の方法。
【請求項５７】低酸素環境条件がTH陽性細胞を作り出す、請求項５４に記
載の方法。
【請求項５８】細胞が、更に、外来性遺伝子をコードし、プロモーターに
機能的に結合したポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む，請求項５４に記
載の方法。
【請求項５９】患者のパーキンソン病を治療する方法であって、ａ）患者に移植するために適切な細胞を得ること、ｂ）前記細胞を低酸素環境条件で育成すること、および、ｃ）工程ｂ）で育成した前記細胞を前記患者に移植すること、を含み、前記移植細胞は20％酸素インキュベーター条件で育成した類似の細胞に
比べて、前記患者においてドーパミン産生能が増加している、前記方法。
【請求項６０】細胞が患者からのものであり、ドーパミン産生を増加させ
るタンパク質を発現するポリヌクレオチドでトランスダクションされたものであ
る、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】細胞が患者と異なる供給源からのCNS細胞である、請求項
５９に記載の方法。
【請求項６２】細胞が、ドーパミン産生を増加させるタンパク質を発現す
るポリヌクレオチドでトランスダクションされている、請求項５９に記載の方法
。