CN108404118A

CN108404118A - 人源乳凝集素亚型蛋白的新用途

Info

Publication number: CN108404118A
Application number: CN201810592824.0A
Authority: CN
Inventors: 张建宁; 董京飞; 周源; 赵子龙; 田野; 江荣才; 雷平; 陈心
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2017-06-14
Filing date: 2018-06-11
Publication date: 2018-08-17
Also published as: CN113893328A

Abstract

本发明提供了一种人源乳凝集素亚型蛋白的新用途，可用于制备血管痉挛治疗药物，由于Lactadherin蛋白既可以取自人血巨噬细胞，也可以通过体外细胞培养加基因工程表达大量获取，而且治疗血管痉挛用量微小，发挥效应时间极其短，效果奇佳，经过生物工程处理后完全可以达到临床应用标准，而且由于Lactadherin蛋白是人体内正常分泌的一种蛋白，其安全性和实用性良好。

Description

人源乳凝集素亚型蛋白的新用途

技术领域

本发明涉及人源乳凝集素亚型蛋白的新用途。

背景技术

创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)的发病率、致残率和致死率高，而且很难控制原发性损伤，因此控制TBI后的继发性脑损伤成为提高患者预后的重要干预靶点。TBI后继发的凝血功能障碍(traumatic brain injury-associated coagulopathy,TBI-AC)及过度免疫炎症反应是患者伤后致死致残的重要原因，但目前机制尚不明确、临床治疗效果不佳。TBI后脑源性微粒(brain derived microparticles,BDMP)可大量释放进入循环血，通过激活凝血通路及血小板导致消耗性凝血功能障碍和出血。

脑血管痉挛是脑外伤、脑梗塞、脑出血、部分脑肿瘤和各类脑外科手术中常见的继发性脑损伤中的关键病理生理环节，严重者可迅速致死致残，避免或减轻脑血管痉挛一直是神经外科医生医疗生涯中最大挑战。迄今除了尼膜同被认为对自发性蛛网膜下腔出血的患者有部分疗效外，国内外尚无其他公认有效的临床药物，其他已经在临床应用的预防性措施的效果也不够理想，广大患者深受其害。

人源乳凝集素亚型蛋白(lactadherin isoform a preproprotein[Homosapiens])，文中简称Lactadherin或Lactadherin蛋白，来源见https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_005919.2，具有序列表<400>1所述蛋白序列。

Lactadherin蛋白是巨噬细胞分泌的一种45kDa大小的糖蛋白，Lactadherin蛋白包含两个N-末端表皮生长因子(EGF)同源结构域EGF1和EGF2(其中含有RGD序列能与多种整合素受体结合)和两个C-末端(C1和C2结构域)。C-末端的结构域的盘状结构可以与PS结合，而N-末端可以与αvβ3和αvβ5整合素结合。Lactadherin蛋白能够做为一个桥梁将高表达PS的凋亡细胞与巨噬细胞联系起来，介导凋亡细胞的吞噬。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供人源乳凝集素亚型蛋白的新用途。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

人源乳凝集素亚型蛋白在制备增强并加速BDMP清除的药物方面的用途。

优选的，上述人源乳凝集素亚型蛋白的用途，所述药物能减少TBI患者血浆中的BDMP含量。

优选的，上述人源乳凝集素亚型蛋白的用途，所述药物能促进巨噬细胞粘附吞噬BDMP。

人源乳凝集素亚型蛋白能够增强并加速BDMP(TBI后脑源性微粒)的清除，预防或减少TBI-AC(TBI后继发的凝血功能障碍)的发生，改善TBI(创伤性脑损伤)的预后。

上述人源乳凝集素亚型蛋白为背景技术中所述蛋白，具有序列表<400>1所示序列。

人源乳凝集素亚型蛋白在制备治疗血管痉挛的药物中的用途。

优选的，上述用途，所述血管痉挛为脑血管痉挛。

人源乳凝集素亚型蛋白在制备治疗TBI-AC的药物中的用途。

人源乳凝集素亚型蛋白在制备治疗TBI后继发性损伤的药物中的用途。

上述人源乳凝集素亚型蛋白新用途的研究方法如下：

(1)通过小鼠TBI模型，鼠尾静脉注射Lactadherin观察其是否能降低死亡率并改善TBI的预后。

(2)通过伊文思蓝染色观察小鼠TBI模型鼠尾静脉注射Lactadhein能否减少血脑屏障的渗漏。

(3)通过磷钨酸-苏木精染色观察小鼠肺组织的纤维素沉积。

(4)通过ELISA检测血浆中D二聚体的含量变化及通过凝血因子Xa凝血时间实验检测Lactadhein能否减少TBI-AC的发生。

(5)通过全血细胞计数研究TBI后血细胞含量的变化。

(6)通过流式细胞术检测TBI后血浆中BDMP的含量变化。

(7)通过ELISA检测小鼠血浆内Lactadherin蛋白在TBI前后的含量变化。

(8)伤后给予Lactadherin蛋白研究使用Lactadherin蛋白治疗的可行性。

(9)注射生物素标记的BDMP，并做组织病理染色，明确BDMP的清除途径。

(10)通过流式细胞术检测MP，Lactadherin及白细胞复合体的形成。

(11)利用Lactadherin基因敲除小鼠及其同窝小鼠验证实验。

(12)利用基因蛋白工程技术研究Lactadherin蛋白发挥作用的机制。

(13)体外Transwell实验检测Lactadhein能否减少BDMP导致的内皮细胞间的渗漏。

(14)体外流式细胞术验证Lactadherin蛋白发挥作用的机制。

(15)利用可视流式系统Amnis Mk II观察mtMP与单核细胞的结合，并尝试阻断其可能的结合位点。

实验结果显示：

(1)注射Lactadherin蛋白能减少TBI小鼠的死亡率，改善预后，降低血脑屏障渗漏，减少肺组织纤维素渗出。

(2)体外Transwell实验也证实Lactadherin蛋白能减少内皮细胞间的渗漏。

(3)注射Lactadherin蛋白能减少TBI小鼠血浆中的BDMP含量，减少血小板的消耗，改善血液的高凝状态。

(4)ELISA结果显示TBI后血浆中正常分泌的Lactadherin蛋白含量升高但不足以清除大量释放的BDMP。

(5)TBI后给予充足的Lactadherin蛋白能有效地帮助BDMP清除，改善小鼠预后。

(6)生物素标记的BDMP定位实验显示Lactadherin蛋白能增加BDMP在肝脏被巨噬细胞清除的量，同时体外实验也能观察到Lactadherin蛋白能促进巨噬细胞粘附吞噬BDMP。

(7)通过流式细胞术观察到Lactadherin蛋白主要结合在BDMP的PS上。

(8)单纯的Lactadherin蛋白的C1C2片段对BDMP的清除能力十分有限，提示Lactadherin蛋白上的EGF片段(该片段能与巨噬细胞上的αvβ3和αvβ5整合素受体结合)是不可缺少的部分。

实验结论如下：

(1)注射Lactadherin蛋白能通过降低血脑屏障渗漏、减少肺组织纤维素渗出、改善血液的高凝状态等几方面减少TBI小鼠的死亡率，改善预后。

(2)正常分泌的Lactadherin蛋白量较少不足以清除TBI后大量释放的BDMP。

(3)Lactadherin蛋白能有效地帮助BDMP与巨噬细胞结合促进吞噬。

(4)Lactadherin蛋白的C1C2片段能与BDMP上的PS相结合，EGF片段能与巨噬细胞上的αvβ3和αvβ5整合素结合，要充分的发挥清除作用二者缺一不可。

可见，Lactadherin蛋白能减少TBI小鼠的死亡率，改善预后，同时揭示了Lactadherin蛋白清除BDMP的机制，为临床治疗TBI后的继发性损伤提供了新的治疗的方法和理论基础。

本发明的有益效果是：

另外，所述Lactadherin蛋白能够增强并加速BDMP的清除，预防或减少TBI-AC的发生，改善TBI的预后，进而在制备治疗TBI-AC及TBI后继发性损伤的药物中进行应用。由于人体正常分泌的Lactadherin蛋白量水平较低，不足以清除TBI后大量释放的BDMP。而Lactadherin蛋白能增加BDMP和mtMP微粒的清除率，通过降低血脑屏障渗漏、减少肺组织纤维素渗出、改善血液的高凝状态等几方面减少TBI小鼠的死亡率，改善预后。因此，TBI后给予足够剂量的Lactadherin蛋白能够增加微粒的清除率，为临床治疗TBI后的继发性损伤提供了新的药物治疗方向和理论基础。

附图说明

图1.1为随机分组的30只C57/BL6小鼠分别尾静脉注射BDMP+PBS，BDMP+LAC，PBS后7天的卡普兰生存曲线图(其中BDMP的注射量为1.5X10⁷个/只，Lactadherin的注射量为10ug/只，注射体积为200ul)，*与BDMP+PBS组相比P<0.05,结果有统计学差异。

图1.2为随机分组的30只C57/BL6小鼠被分为1.FPI前30分钟注射Lactadherin组，2.FPI前30分钟注射PBS组，3.FPI前30分钟进行PBS注射的假手术组(即不进行液压打击损伤，其余步骤均一致)进行操作后7天的卡普兰生存曲线图，*与FPI+PBS组相比P<0.05，结果有统计学差异。

图1.3为FPI+LAC,FPI+PBS，Sham组小鼠在FPI打击后一天的运动神经功能评分，P<0.05，差异有统计学意义。

图1.4中图A为FPI+LAC,FPI+PBS，Sham组小鼠伊文思蓝染色并灌注后的脑组织大体图片及损伤区的冠状位切片，图B，C，D为各组小鼠相应脑组织的冰冻切片并用DAPI染细胞核荧光显微镜下观察的免疫荧光图片。

图1.5中FPI+LAC,FPI+PBS，Sham组小鼠脑组织伊文思蓝提取液在OD620nm处的吸光度值，P<0.001，结果有统计学意义。

图1.6为肺组织免疫组化切片的磷钨酸-苏木精染色(PTAH)结果，和*所示处可见蓝色的纤维素异常沉积在肺血管周围，其中，图A,B,C中标尺长度为50um，图D,E,F中标尺长度为100um。

图2.1中左图所示为FPI+LAC，FPI+PBS，Sham组小鼠在FPI后3小时和6小时的血浆凝血因子Xa凝血时间测定结果，P<0.001，结果有统计学意义；右图所示为FPI+LAC,FPI+PBS，Sham组小鼠在FPI打击后3小时和6小时的血浆D二聚体测定的结果，P<0.001，结果有显著的统计学差异。

图2.2中左图为BDMP+LAC，BDMP+PBS，PBS组小鼠在注射后3小时和6小时的血浆凝血因子Xa凝血时间测定结果，P<0.05，结果有统计学意义；右图为BDMP+LAC，BDMP+PBS，PBS组小鼠在注射后3小时和6小时的血浆D二聚体测定的结果。P<0.001，结果有显著的统计学差异。

图2.3中左图为全血细胞计数仪测得的FPI+LAC,FPI+PBS，Sham组小鼠在FPI打击后3小时和6小时时全血中的血小板计数，P<0.05，差异有统计学意义；右图所示为BDMP+LAC，BDMP+PBS，PBS组小鼠在注射后3小时和6小时时的血中血小板计数，P<0.05，差异有统计学意义。

图2.4中左图为按照标准大小微粒框选出的微粒所在位置P1；右图为P1区域圈内的微粒散点图，横轴为APC-Annexin V，纵轴为PE-NSE。

图2.5为由右至左依次为按照1：10，1:100，1:1000倍稀释的MitoTracker Green标记的微粒，并由此确定MitoTracker Green标记阳性的P2区域。

图2.6中左图为向微粒的孵育体系中加入1ul的同型对照IgG作为PE-NSE的阴性对照，并据此确定NSE的阳性区域P3；右图为TBI后的小鼠可见PE-NSE的阳性率显著升高。

图2.7中左图为注射BDMP后各组小鼠3小时的血浆中mtMP和神经元来源的MP的含量变化，P<0.001，结果有显著的统计学差异；右图为FPI打击后各组小鼠3小时的血浆中mtMP和神经元来源的MP的含量变化，P<0.001，结果有显著的统计学差异。

如图2.8中图A为ELISA法测定的为各组小鼠TBI前后血浆中的Lactadherin蛋白的含量变化，#表示与Sham组相比结果有统计学差异P<0.05，*表示与TBI组相比结果有统计学差异P<0.05；图B为ELISA法测定脑外伤后的鼠血和人血中Lactadherin蛋白的含量差异。

图2.9中图A为流式细胞术测定的FPI打击前后血浆中的神经元来源MP的含量，#表示与Sham组相比结果有统计学差异P<0.05，*表示与FPI+PBS组相比结果有统计学差异P<0.05；图B为流式细胞术测定的FPI打击前后血浆中的线粒体来源MP的含量，*表示与FPI+PBS组相比结果有统计学差异P<0.05。

图2.10中左图A为FPI打击后给予Lactadherin蛋白实验中各组小鼠在FPI后3小时和6小时的血浆凝血因子Xa凝血时间测定结果，P<0.05，结果有统计学意义；右图B为FPI打击后给予Lactadherin蛋白实验中各组小鼠在FPI打击后3小时和6小时的血浆D二聚体测定的结果，P<0.05，结果有统计学差异。

图3.1中图A为流式细胞术测定的血浆中Bio-BDMP的数量，*表示P<0.05，结果有统计学差异；图B为各组小鼠的病理切片，切片用于血管渗漏的苏木精和曙红(HE)和用于血管纤维蛋白沉积的磷钨酸苏木精(PTAH))染色，并使用HRP-链霉亲和素染色以检测生物素化的BDMP；图C为用Image J软件对图B中病理切片统计的结果，P<0.05，结果有统计学差异。

图3.2为FPI+LAC,FPI+PBS，Sham组小鼠打击后3、6小时的小鼠新鲜抗凝全血使用了抗CL抗体来抓取mtMP并用流式细胞术来检测，与mtMP发生粘连的血液中细胞成分，并用CD45-Fitc染色检测血中的mtMP-白细胞复合物的数量，P<0.05，结果有统计学差异。

图3.3中图A为Lactadherin基因敲除小鼠如前被分为为FPI+LAC，FPI+PBS，Sham组后小鼠在FPI打击后3小时和6小时时血浆中BDMP的含量变化，NSE阳性的为神经元来源的MP，Annexin V阳性的为PS阳性的MP，*表示P<0.05，结果有统计学意义；图B为Lactadherin基因敲除小鼠如前被分为FPI+LAC，FPI+PBS，Sham组后小鼠在FPI打击后3小时和6小时时的血浆凝血因子Xa凝血时间测定结果，*表示P<0.05，结果有统计学意义；图C为Lactadherin基因敲除小鼠如前被分为为FPI+LAC，FPI+PBS，Sham组后小鼠在FPI打击后3小时和6小时时的血浆中D二聚体的含量，*表示P<0.05，结果有统计学意义。

图3.4中图A为FPI打击前注射C1C2蛋白片段后小鼠在FPI打击后3小时和6小时时血浆中BDMP的含量变化，NSE阳性的为神经元来源的MP，*表示P<0.05，结果有统计学差异；图B为FPI打击前注射C1C2蛋白片段后小鼠在FPI打击后3小时和6小时时血浆中BDMP的含量变化，MitoTracker Green阳性的为线粒体来源的MP，*表示P<0.05，结果有统计学差异。

图3.5中图A为FPI打击前注射C1C2蛋白片段后小鼠在FPI打击后3小时和6小时时血浆中的凝血因子Xa凝血时间测定结果，P<0.05，结果有统计学意义；图B为FPI打击前注射C1C2蛋白片段后小鼠在FPI打击后3小时和6小时时血浆中的D二聚体含量测定的结果，P<0.05，结果有统计学差异。

图4.1为使用transwell小室中培养满的HUVEC细胞进行的内皮细胞渗漏实验，其中的BDMP为PKH-26标记的DBMP带PE荧光，实验采用流失细胞仪对下面24孔板内的穿孔液体进行的检测，P<0.001，结果有统计学意义。

图4.2为Fitc-Lac竞争抑制实验，使用绿色荧光标记的Lactadherin与BDMP孵育结合半小时后，分别加入100倍浓度的无荧光标记的Lactadherin、Annexin V、PBS对照以及不加荧光标记的Lactadherin的BDMP的阴性对照，P<0.005，结果有显著的统计学意义。

图4.3中左图为Amnis Mk II拍到的mtMP与单核细胞的结合，mtMP使用MitoTracker Green标记，单核细胞用APC-CD-45标记；右图为通过Amnis Mk II系统测试的磷脂竞争实验，P<0.01，结果有显著的统计学意义。

图5为激光散斑实验中脑血流变化图(即脑血管痉挛的情况)，其中，该部分所有图中纵轴为脑血流量，横轴为时间。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图及具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。

下述实施例通过小鼠TBI模型，验证Lactadherin蛋白(具有背景技术中序列表<400>1所述蛋白序列)能否减少TBI后小鼠的死亡率，改善其预后，同时将检测其对血脑屏障渗漏的影响，也同时通过体外实验研究Lactadherin蛋白对内皮细胞通透性的影响。研究Lactadherin蛋白能否减少TBI后外周血中BDMP的存在，以减少BDMP对凝血功能的影响；探索为何体内正常分泌的Lactadherin蛋白不能够有效地减少TBI后小鼠外周血中的BDMP含量。研究Lactadherin蛋白如何帮助清除血中的BDMP，Lactadherin蛋白的哪部分结构主要发挥功能。以及使用Lactadherin基因敲除小鼠验证猜想，并研究TBI后通过给予Lactadherin蛋白能否起到较好的治疗效果。

下述实施例中所使用缩略语如下：

实施例1

Lactadherin蛋白能减少TBI小鼠的死亡、改善预后

1.1对象和方法

1.1.1实验小鼠、仪器

所有实验小鼠均来自美国Jackson实验室，实验使用8-20周龄的雄性C57/BL6小黑鼠，体重范围在20～26g。小鼠被饲养于BloodWorks Northwest Research Institute的无特定病原体动物(SPF)级动物饲养房，所有实验小鼠均使用标准颗粒饲料喂食，自由饮水，并其将室温控制在20～24℃内，光照强度250Iux，白昼交替的条件下由专业动物饲养员饲养。

1.1.2实验试剂

1.1.3实验方法

1.1.3.1小鼠脑组织匀浆梯度离心法制备BDMP

(1)取液氮中冻存的C57BL/6小鼠脑组织放于室温下复温约2min后，放入组织匀浆器中并加入1ml PBS，均匀研磨30‐40次以得到匀浆的脑组织。

(2)取脑组织匀浆加入1.5ml的EP管，1,500g，4℃，离心20min，以除去组织及细胞团。

(3)取上清加入另一个1.5ml的EP管，13,000g，4℃，离心2min，以除去大细胞碎片。

(4)取上清加入超速离心管，100,000g，4℃，离心1h，取沉淀，PBS重悬后再离心一次，再取沉淀，PBS重悬即为BDMP悬液以备之后使用。

(5)取BDMP悬液25ul，加入计数Beads 20ul后PBS稀释到500ul，用流式细胞仪进行计数，算得原BDMP悬液浓度，后用PBS将BDMP悬液稀释成15 000单位/μl。

1.1.3.2小鼠分别尾静脉注射BDMP+PBS，BDMP+LAC，PBS

(1)利用脑组织匀浆梯度离心法制备BDMP悬液，用流式细胞仪进行计数，后用PBS将BDMP悬液稀释成150,000单位/μl浓度以备注射使用。

(2)注射前60min后，使用眶周外眦静脉取血法并用3.6％浓度的枸橼酸钠盐抗凝，全血与枸橼酸钠盐按照体积比9:1加入，每只鼠的取血量约为100μl。

(3)小鼠随机分为三组分别尾静脉注射BDMP+PBS，BDMP+LAC，PBS，注射方法如下：

1).BDMP+PBS组使用28G1/2大小的针头向两条鼠尾静脉分别注射BDMP和PBS各100ul；

2).BDMP+LAC组使用28G1/2大小的针头向两条鼠尾静脉分别注射BDMP和Lactadherin各100ul；

3).PBS组使用28G1/2大小的针头向两条鼠尾静脉分别注射PBS和PBS各100ul；

(4)注射后1小时，3小时，6小时取血，使用眶周外眦静脉取血法并用3.6％浓度的枸橼酸钠盐抗凝，全血与枸橼酸钠盐按照体积比9:1加入，每次每只鼠的取血量约为100μl。

(5)取血后常温下1 500g离心20min以除去大的血细胞及血小板，得到缺血小板血浆PPP，可用凝血因子Xa凝血时间测定，D二聚体测定，流式细胞仪BDMP含量测定等。

(6)24小时后处死注射后的小鼠，并取小鼠的心、肺、脑、肾和脾等组织，用4％浓度的多聚甲醛固定24小时，以备之后病理切片使用。

1.1.3.3Lactadherin对创伤性脑损伤模型小鼠的影响。

小鼠液压打击脑外伤模型的制备：

实验中采用液压打击损伤(fluid pressure injury,FPI)的方法模拟中度小鼠创伤性脑损伤。使用小鼠气体麻醉机将异氟醚和氧气(体积比1:1)混合气体通过特殊的面罩对C57/BL6小鼠进行气体麻醉，后用脱毛膏备皮去除头颈部的毛发，并小鼠头部固定于小鼠立体定向仪上，之后用碘伏棉球和70％的酒精棉球对头颈部皮肤依次由内向外消毒3遍，用手术刀沿中线切开头皮，并顿性分离皮下组织，在距离小鼠冠状缝后2mm和失状缝右侧旁开2mm处使用高速磨钻磨去直径为3mm大小的圆形骨瓣，此时要注意保证硬脑膜的完整性，通过使用I型增强型玻璃离子体水门汀将连接帽固定于鼠脑去骨瓣的区域上，然后用无菌生理盐水灌满连接帽和液压打击仪，以排出空气注意不要留有气泡，再将连接帽连接于液压打击仪，待小鼠麻醉苏醒后使用18度的撞击锤角度进行液压打击，以1.9±0.2atm的压力制造中度小鼠液压打击脑外伤模型。假手术组的小鼠同样也开颅去骨瓣，但不进行打击损伤。液压打击损伤后立即给予小鼠心脏按压、吸氧和保持体温等，待小鼠恢复了自主呼吸后伤口周围皮肤用碘伏消毒，并用4‐0号可吸收缝线缝合伤口，并涂以适量组织胶封闭创口。

小鼠分组及造模完成后的监测

将小鼠进行随机分组：分为1.TBI前30分钟注射Lactadherin组，2.TBI前30分钟注射PBS组，3.TBI前30分钟进行注射PBS的假手术组(即不进行液压打击损伤，其余步骤均一致)，4.TBI后30分钟注射Lactadherin组，5.TBI后30分钟注射PBS组，6.TBI后30分钟进行注射PBS的假手术组。并对各组C57/BL6小鼠取TBI打击前1小时和打击后3小时，6小时，24小时的血(眶周外眦静脉取血法)分别装入0.5ml的EP管，并用3.6％浓度的枸橼酸钠盐抗凝，全血与枸橼酸钠盐按照体积比9:1加入，每次每只鼠的取血量约为100μl。对打击损伤1天后的小鼠做改良型运动神经功能学评分(MNSS)。造模完成后每天观察小鼠的活动、测量其体重，并记录小鼠7天内的死亡率。

1.1.3.5伊文思蓝实验检测血脑屏障渗漏

(1)在TBI 1天后的小鼠通过尾静脉注射100μl的2％伊文思蓝(溶于PBS中)。注射的伊文思蓝色染料的静脉内伊文思蓝能结合白蛋白和其他血浆蛋白，能作为血浆渗出的标志物。

(2)注射两小时后将上所述动物处死并用肝素化盐水灌注。将灌注好的脑组织样品分成两批，一批采用萃取的方法检测脑组织中伊文思蓝的含量，另一批用于做冰冻切片并染色以观察渗漏，具体方法如下:

1)萃取伊文思蓝检测脑组织中伊文思蓝的含量:将灌注后的脑组织放在‐55℃异戊烷中快速冷冻并冷冻干燥，然后将冷冻干燥的样品放在在甲酰胺(1:20w/v)中萃取，并在60℃下孵育过夜。将匀浆物以14000rpm离心30分钟后，通过分光光度计测定620nm处的吸光度，吸光度值与上清液中的EB含量成正比。

2)冰冻切片染色法观察伊文思蓝渗漏：

①取材，将脑组织按冠状面垂直切成2mm厚度的薄片。

②取出组织支收纳器，滴上OCT让其冷冻，形成一个小平台后，再放上并展平脑组织，并在周边滴上包埋剂后迅速放于冷冻台上，冰冻。

③将冷冻好的组织块，夹紧于固定于冰冻切片机的持承器上，调整好距离，转动切片，直到组织所在的层面，调整切片的厚度为5～10um，并调好防卷板。

④开始切片，得到完整未断裂的组织片后掀起防卷板，取一块载玻片，将组织片附贴上。

⑤将切好的切片放于丙酮中浸泡4℃过夜后取出备用。

⑥用DEPI染细胞核约20min后即可中性树胶固定封片(伊文思蓝自带红色荧光)。

1.1.3.6伊红苏木素染色

(1)4％的多聚甲醛溶液固定各组小鼠肺组织24小时。

(2)再将各组的肺组织依次经过脱水、浸蜡，石蜡包埋。

(3)将包埋好的蜡块用切片机进行切片，厚度设定为5um，切片完成后将蜡片放入展片机中展片后用玻璃载玻片贴片，最后将玻璃载玻片晾干完成石蜡切片。

(4)将切好的石蜡切片经过脱蜡、复水，后二甲苯浸泡2次，每次10min，后经过100％酒精、100％酒精、95％酒精、90％酒精、80％酒精、70％酒精浸洗，每次浸洗时间为5min，再自来水洗1min，最后蒸馏水洗1min，完成脱蜡。

(5)将脱蜡后的组织切片放入PH为6.4的抗原修复液内，并微波加热，后大火加热10min，小火加热10min后，将其从微波炉中取出，冷却至室温并放入蒸馏水中洗5min。

(6)将病理切片放入3％H2O2中，震荡5min，后蒸馏水洗5min。

(7)将病理切片放入5％BSA中封闭，在37℃温箱内封闭30min，甩去封闭液。

(8)用组化笔画框出组织区域，用苏木素染色5min，显微镜下能观查到细胞核后，再自来水洗1min。

(9)再用1.5％盐酸酒精分化1min，自来水洗1min，PBS返蓝1min。

(10)后用伊红染色2min，病理切片依次过70％酒精、80％酒精、90％酒精、95％酒精、100％酒精、100％酒精缸梯度脱水，每次5min，再经过二甲苯浸泡透明10min两次。

(11)将组织切片从取出，中性树脂胶封片，并覆盖盖玻片封片，此时要注意避免气泡，最后光镜下进行观察、拍照、留存。

1.1.3.7小鼠肺组织的磷钨酸-苏木精染色(PTAH)检测纤维素沉积

(1)各组小鼠肺组织4％多聚甲醛中浸泡过夜，用自来水洗6小时。

(2)肺组织用70％酒精浸泡2小时后，用蒸馏水洗3次，每次10min。

(3)依次通过80％酒精，90％酒精，95％酒精，95％酒精，100％酒精，100％酒精，氯仿，氯仿浸泡2小时，后浸蜡三遍，每次浸泡时间为1小时，最后进行石蜡包埋。

(4)用石蜡切片机连续切片，切片厚度为5‐10μm，制做石蜡切片。

(5)将组织切片放在PH为6.4的抗原修复液内，并大火加热10min，小火加热10min，将其从微波炉中取出，室温下冷却后放入蒸馏水中洗5min。

(6)将病理切片放入3％H2O2中，震荡5min，后蒸馏水洗5min。

(8)病理切片用0.25％高锰酸钾水溶液浸泡10min后，经自来水洗3次，每次10min。

(9)病理切片用2.5％草酸水溶液浸泡5min，直到发白，后用蒸馏水洗3次，每次10min。

(10)将病理切片浸泡在磷钨酸‐苏木精溶液中染色12h，后用95％的乙醇脱色。

(11)用70％酒精、80％酒精、90％酒精、95％酒精、100％酒精、100％酒精进行梯度脱水，每次5min，然后二甲苯浸泡5min两次，最后后自来水洗5min。

(12)取出组织切片，中性树脂胶封片，并覆盖盖玻片，此时要注意避免产生气泡，即可在光镜下进行观察、拍照及留存。

1.1.4统计学方法

采用SPSS18.0和Sigma Plot软件进行统计学分析和绘图。通过Kaplan Meier曲线分析生存数据，分类变量以均数±标准差表示为百分比和连续变量，多组样本间的比较使用单因素方差分析，两组配对样本间的比较使用独立样本t检验，p值小于0.05则认为结果有统计学意义。

1.2结果

1.2.1Lactadherin能减少TBI小鼠的死亡率，改善预后

如图1.1所示，结果显示，小鼠在注射了BDMP后有近40％在前两天内死亡，7天内存活率约为50％，而注射了Lactadherin蛋白的小鼠能显著提高注射BDMP后小鼠的存活率达，7天内存活率约为90％，差异有统计学意义(P<0.05)。

如图1.2所示，结果显示，小鼠在FPI打击损伤后有近50％在前两天内死亡，7天内存活率约为40％，而注射了Lactadherin蛋白的小鼠能显著提高被FPI打击后小鼠的存活率达，7天内存活率约为90％，差异有统计学意义(P<0.05)。

如图1.3所示，结果显示Lactadherin能减少由FPI带来的对小鼠的运动神经功能的损伤。P<0.05，差异有统计学意义。

1.2.2伊文思蓝实验发现Lactadherin蛋白能减少血脑屏障渗漏

如图1.4所示：损伤区的伊文思蓝渗漏在注射Lactadherin组较注射同等体积PBS的组明显减少。

使用萃取法测量FPI+LAC,FPI+PBS，Sham组小鼠脑组织伊文思蓝提取液在OD620nm处的吸光度值，如图1.5所示，可以看出Lactadherin能明显减少由于液压打击所致的小鼠血脑屏障开放P<0.001，结果有统计学意义，但其并不能阻断血脑屏障的开放P<0.001。

1.2.3磷钨酸-苏木精染色观察小鼠肺组织纤维素沉积

免疫组化HE染色和磷钨酸-苏木精共染色的(PTAH)病理切片结果显示，

FPI+PBS组可见大量纤维素沉积(见图1.6B,E)，而FPI+Lactadherin组肺组织纤维素沉积明显较少(见图1.6A,D)，Sham组(见图1.6C,F)基本无纤维素渗出。

1.3小结

综上，通过使用小鼠TBI模型分别注射Lactadherin和PBS的方法观察发现注射Lactadherin蛋白能减少TBI小鼠的死亡率，改善其运动神经功能损伤；通过伊文思蓝染色发现注射Lactadherin蛋白能减少TBI小鼠的血脑屏障渗漏；通过TBI小鼠病理切片的方法发现Lactadherin蛋白能减少TBI小鼠肺组织纤维素渗出。总的来说注射Lactadherin蛋白能通过降低血脑屏障渗漏、减少肺组织纤维素渗出等方面减少TBI小鼠的死亡率，改善预后。

实施例2

Lactadherin蛋白对小鼠TBI-AC的抑制作用

2.1对象和方法

2.1.1实验小鼠、仪器

2.1.2实验试剂

2.1.3实验方法

2.1.3.1凝血因子Xa凝血时间测定

取C57/BL6小鼠TBI打击前1小时和打击后1小时，3小时，6小时的血(眶周外眦静脉取血法)分别装入0.5ml的EP管，使用3.6％浓度的枸橼酸钠盐抗凝，全血与枸橼酸钠盐按照体积比9:1加入，每次每只鼠的取血量约为100μl。

将取得全血按照体积比1:1比例加入样品稀释液稀释后，放入离心机1500g，4℃，离心20min，以除去大的血细胞及血小板，得到缺血小板血浆PPP。

打开凝血时间测试仪，向预热槽内加入凝血因子Xa溶液37℃预热10min。

配好不同浓度0-80ug/ml标准品，并测定标准品的凝血时间绘制标准曲线。

取25μl的缺血小板血浆PPP，与25μl低磷脂动物血清(PPL)先预混后放入37℃管槽预热2min，后将100μl重组凝血因子Xa溶液加入凝血时间测试仪，并启动转子开始计时，测定凝血时间，每个样品测三遍并记录。

2.1.3.2小鼠血浆中D二聚体的含量的检测

使用购买的小鼠D二聚体ELISA试剂盒

(1)将待测的小鼠血液样品与标准品稀释液按1:5的比例稀释备用，并按说明书配置不同浓度的标准品溶液。

(2)待测样品和不同浓度的标准品溶液按50μl/孔分别加入96孔板中，每个样品加两遍。

(3)用排枪加入50μl/孔检测试剂A，贴膜覆盖，并轻轻振荡混匀，在37℃下孵育1小时。

(4)用排枪加入350ul/孔的洗液，每个孔洗3次，每次1-2min，甩去洗液，并在吸水纸上拍干。

(5)用排枪加入100ul/孔检测试剂B，贴膜覆盖，并轻轻振荡混匀，在37℃下孵育30min。

(6)用排枪加入350ul/孔的洗液，每个孔洗5次，每次1-2min，甩去洗液，并在吸水纸上拍干。

(7)用排枪加入90ul/孔的反应底物，贴膜覆盖，并轻轻振荡混匀，避光在37℃下孵育15min。

(8)用排枪加入50ul/孔的酸性终止液，并轻轻振荡混匀，30min内用酶标仪测450nm波长处各孔的吸光度值。

2.1.3.3全血细胞计数

取各组的新鲜鼠血按9:1的比例加入3.6％的枸橼酸盐抗凝，并保持低速混匀，10分钟内用全血细胞计数仪计数。

2.1.3.2流式细胞仪检测小鼠血浆中的神经元特异性烯醇化酶(neuron specificenolase，NSE)和MitoTracker Green标记的线粒体来源MP(mtMP)和Annexin V结合的PS阳性MP的含量

(1)向试管中加入25μl PPP，和22ul的无钙HEPES缓冲液，然后加入2ul鼠源直标抗小鼠FITC-GFAP抗体(抗体的最终浓度为10ng/μl)和1ul兔源的抗小鼠NSE抗体(抗体的最终浓度为10ng/μl)，然后低速震荡混匀，避光在室温下孵育30min；

(2)向试管内加入50μl 2倍钙浓度的HEPES缓冲液，然后加入1ul山羊抗兔IgG-PE标记的二抗(抗体的最终浓度为10ng/μl)和5ul抗鼠直标Annexin V–APC抗体，然后低速震荡混匀，避光在室温下孵育30min；

(3)最后加入1X的含钙离子(因为Annexin V与PS结合需要钙离子的参与)HEPES缓冲液将体积补足到500μl，然后低速震荡混匀，进行流式细胞仪检测。

(4)同时制作3管同型对照：

管1：用梯度稀释的FITC-MitoTracker Green做为FITC颜色的同型对照。

管2：加入相同浓度的兔IgG和山羊抗兔PE二抗做为PE颜色的同型对照。

管3：加入相同浓度的Annexin V–APC和EDTA(EDTA的终浓度为5mM)做为AnnexinV–APC的同型对照。

2.1.3.4小鼠血浆中Lactadherin的含量的检测

使用购买的小鼠Lactadherin ELISA试剂盒

(2)待测样品和不同浓度的标准品溶液按100μl/孔分别加入96孔板中，每个样品加两遍。

(3)贴膜覆盖，并轻轻振荡混匀，在37℃下孵育1.5小时后甩去板内液体，并在吸水纸上拍干。

(4)用排枪加入100ul/孔生物素标记的抗鼠Lactadherin抗体，贴膜覆盖，并轻轻振荡混匀，在37℃下孵育60min。

(5)用排枪加入300ul/孔的0.01M浓度的PBS洗液，每个孔洗3次，每次1-2min，甩去洗液，并在吸水纸上拍干。

(6)用排枪加入100ul/孔ABC工作液，贴膜覆盖，并轻轻振荡混匀，在37℃下孵育30min。

(7)用排枪加入300ul/孔的0.01M浓度的PBS洗液，每个孔洗5次，每次1-2min，甩去洗液，并在吸水纸上拍干。

(8)用排枪加入90ul/孔的反应底物，贴膜覆盖，并轻轻振荡混匀，避光在37℃下孵育30min。

(9)用排枪加入100ul/孔的酸性终止液，并轻轻振荡混匀，30min内用酶标仪测450nm波长处各孔的吸光度值。

2.1.3.5小鼠血浆中Annexin V的含量的检测

使用购买的小鼠Annexin VELISA试剂盒

(3)贴膜覆盖，并轻轻振荡混匀，在37℃下孵育1小时后甩去板内液体，并在吸水纸上拍干。

(4)用排枪加入100μl/孔检测试剂A，贴膜覆盖，并轻轻振荡混匀，在37℃下孵育1小时。

(5)用排枪加入350ul/孔的洗液，每个孔洗3次，每次1-2min，甩去洗液，并在吸水纸上拍干。

(6)用排枪加入100ul/孔检测试剂B，贴膜覆盖，并轻轻振荡混匀，在37℃下孵育30min。

(7)用排枪加入350ul/孔的洗液，每个孔洗5次，每次1-2min，甩去洗液，并在吸水纸上拍干。

(8)用排枪加入90ul/孔的反应底物，贴膜覆盖，并轻轻振荡混匀，避光在37℃下孵育15min。

(9)用排枪加入50ul/孔的酸性终止液，并轻轻振荡混匀，30min内用酶标仪测450nm波长处各孔的吸光度值。

2.1.4统计学方法

2.2结果

2.2.1Lactadherin能显著改善TBI后小鼠的血液高凝状态如图2.1中左图所示为FPI+LAC，FPI+PBS，Sham组小鼠在FPI后3小时和6小时的血浆凝血因子Xa凝血时间测定结果。注射Lactadherin并进行FPI打击组的小鼠的凝血时间与假手术组的时间相当，而注射PBS并进行FPI打击组小鼠的凝血时间明显缩短，P<0.001，结果有统计学意义。说明Lactadherin能抑制创伤后的凝血功能障碍，减少由于凝血物质消耗引起的凝血功能障碍。

如图2.1所示，右图为FPI+LAC,FPI+PBS，Sham组小鼠在FPI打击后3小时和6小时的血浆D二聚体测定的结果。可以看出注射PBS并进行FPI打击组小鼠的D二聚体明显升高，说明血液呈现高凝状态。而注射Lactadherin并进行FPI打击组的小鼠的血浆D二聚体含量与假手术组相当，P<0.001，结果有显著的统计学差异，说明Lactadherin能抑制创伤后的凝血功能过度激活。

为了与之对比，对BDMP注射组小鼠进行测试，分组如下，分为BDMP+LAC，BDMP+PBS，PBS组。如图2.2中左图所示为BDMP+LAC，BDMP+PBS，PBS组小鼠在注射后3小时和6小时的血浆凝血因子Xa凝血时间测定结果，P<0.05，结果有显著的统计学差异。右图为BDMP+LAC，BDMP+PBS，PBS组小鼠在注射后3小时和6小时的血浆D二聚体含量。P<0.001，结果有显著的统计学差异。

2.2.2全血细胞计数结果

图2.3中左图所示为全血细胞计数仪测得的FPI+LAC,FPI+PBS，Sham组小鼠在FPI打击后3小时和6小时时全血中的血小板计数，可以看出注射PBS并进行FPI打击组小鼠打击后6小时的血中血小板数明显降低，P<0.05，差异有统计学意义。而注射Lactadherin并进行FPI打击组的小鼠6小时的血中血小板计数仍在正常范围。

为了与之对比，对BDMP注射组小鼠进行测试，分组如下，分为BDMP+LAC，BDMP+PBS，PBS组。图2.2中右图所示为BDMP+LAC，BDMP+PBS，PBS组小鼠在注射后3小时和6小时时的血中血小板计数。可以看出注射BDMP+PBS的小鼠注射后6小时的血中血小板数明显降低，P<0.05，差异有统计学意义。而注射BDMP+Lactadherin组的小鼠6小时的血中血小板计数仍在正常范围，与FPI打击组结果相互印证。

2.2.3流式细胞术检测小鼠颅脑外伤后外周血中MPs的水平

首先建立标准流式细胞微粒检测模板，在FSC和SSC，使用购买的标准大小的Megamix微粒，有直径分别为0.5，0.9和3μm大小的微粒，确定不同大小微粒的位置，使用对数刻度，并预先设定好微粒检测的区域，圈选微粒直径小于1.0μm的区域设为P1区域。并新建以一个线粒体标记FITC-MitoTracker Green为横轴，神经元细胞标记物NSE-PE颜色为纵轴的散点图，选择仅显示P1区域内的事件，以备实验使用。设置NSE-PE的对照组，分别加入相同于一抗浓度的兔IgG并孵育30min和山羊抗兔PE二抗孵育30min做为PE颜色的同型对照，根据此确定NSE的阳性区域。同时，为了确定MitoTracker Green的阳性区域，将用MitoTracker Green标记的微粒用PBS溶液按照1：10，1:100，1:1000倍稀释，分别上机后，框选出经稀释后FTIC信号不再衰减的临界区域作为Mito Trakcer Green的阳性区域。

如图2.4、图2.5、图2.6所示，根据上述流式细胞仪检测微粒大小的事件，并根据NSE-PE和MitoTracker Green-FITC阳性的区域计算阳性微粒的百分率，结果即为小鼠脑创伤模型和假手术对照组外周血中Mito Tracker Green阳性的MP，即mtMPs的表达率，以及神经元来源的NSE阳性的MP。由于注射组和打击组中均用到了Lactadherin，它能结合PS能与BDMP的标记物Annexin V共同竞争同一个位点，而BDMP中主要的致凝物质为mtMP，故此处使用mtMP的标记MitoTracker Green-FITC来标记mtMP。如图2.7所示，实验结果示，在注射BDMP后3小时的小鼠中，血浆中mtMP和神经元来源的MP含量急聚增高，与PBS注射组相比有显著的统计学差异(P<0.001，图2.7A)，而同时注射了Lactadherin的BDMP注射组血浆中的mtMP和神经元来源的MP含量相比较少，P<0.005，有显著的统计学差异。与之相类似的在小鼠FPI打击后3h的血中也观察到了相似的现象，血浆中mtMP和神经元来源的MP含量急聚增高，与Sham组相比有显著的统计学差异(P<0.01，图2.7B)，而注射了Lactadherin的FPI打击组血浆中的mtMP和神经元来源的MP含量相比较少，P<0.05，差异有统计学意义。

2.2.4小鼠TBI前后血浆中Lactadherin蛋白的含量变化如图2.8A所示，可以看出外伤打击前各组小鼠血浆中的Lactadherin水平基本相当，但打击后3小时TBI+LAC组的小鼠血中的Lactadherin含量上升最高最快，TBI组小鼠血中的Lactadherin含量第二高，但相比打击前已经有所上升，Sham组小鼠血中的Lactadherin含量基本保持不变。6小时后，TBI+LAC组的小鼠血中的Lactadherin含量相比之前有所下降，但仍然处于3组中的最高水平，TBI组小鼠血中的Lactadherin含量仍然稳步上升，其值已接近TBI+LAC组的水平。Sham组小鼠血中的Lactadherin含量仍基本保持不变。

如图2.8B所示，C57BL/6J小鼠的Lactadherin蛋白的基线水平处于相对较窄的范围(1.1±0.1ng/ml)，而在370个人类健康受试者(45-65岁，47％为女性)的血浆中的Lactadherin蛋白含量从3.0变化到651.1ng/ml，变异度很大。

2.2.5TBI后注射Lactadherin模拟治疗

模拟临床状态下外伤后注射Lactadherin的治疗模型。实验分为3组：1.FPI打击后注射Lactadherin组。2.FPI打击后注射PBS组。3.假手术组(Sham组)。试验中在小鼠FPI打击后30分钟给与Lactadherin尾静脉注射，终浓度为200nM/ul。如图2.9所示，结果如下：

和打击前注射Lactadherin的实验结果类似：FPI打击后血浆中mtMP(图2.9B)和神经元来源(图2.9A)的MP含量急聚增高，与Sham组相比有统计学差异，P<0.05；而注射了Lactadherin的FPI打击组血浆中的mtMP和神经元来源的MP含量相比较少，P<0.05，差异有统计学意义。

同样，测定Lactadherin治疗组FPI打击后3小时和6小时血浆中的凝血因子Xa凝血时间，测定结果如图2.10所示。进行FPI打击并注射Lactadherin组的小鼠的凝血时间与假手术组的时间相当，而进行FPI打击并注射PBS组小鼠的凝血时间明显缩短，P<0.05，结果有统计学意义。说明打击后注射Lactadherin仍能减少由于凝血物质消耗引起的凝血功能障碍。同时测量了血浆中的D二聚体含量，可以看出进行FPI打击并注射PBS组小鼠的D二聚体明显升高，说明血液呈现高凝状态。而进行FPI打击并注射Lactadherin组的小鼠的血浆D二聚体含量与假手术组相当，P<0.05，结果有统计学差异，说明Lactadherin能抑制创伤后的凝血功能过度激活。

所有结果均与FPI打击前给与Lactadherin蛋白的实验结果相似，说明FPI打击后给与Lactadherin蛋白仍然能有较好的疗效。

2.3小结

综上，通过使用小鼠TBI模型分别注射Lactadherin和PBS的方法使用流式细胞术观察发现注射Lactadherin蛋白能减少TBI小鼠血浆中的BDMP含量；全血细胞计数结果显示注射Lactadherin蛋白能减少TBI小鼠血中血小板的消耗；凝血时间测定和血浆中D二聚体含量。测定显示注射Lactadherin蛋白能改善TBI小鼠的血液高凝状态。ELISA结果显示TBI后血浆中正常分泌的Lactadherin蛋白含量升高但不足以清除大量释放的BDMP。TBI后给予充足的Lactadherin蛋白能有效地帮助BDMP清除，改善小鼠预后。为临床治疗TBI后的凝血功能障碍提供了新的治疗的方法。

实施例3

体内实验研究Lactadherin蛋白的作用机制

3.1对象和方法

3.1.1实验小鼠、仪器

3.1.2实验试剂

3.1.3实验方法

3.1.3.1Biotinylated BDMP

使用商业购买的EZ-Link^TM Sulfo-NHS-Biotin试剂盒(ThermoFisherScientific，Waltham，MA)

(1)将提取的BDMP用预冷的4℃PBS(PH为8.0)洗1遍。

(2)将重悬的BDMP悬液用预冷的PBS稀释到1.5X107个/ul.

(3)每毫升BDMP悬浮液中加入1.0mg EZ-Link^TM Sulfo-NHS-Biotin试剂,并轻轻震荡混匀。

(4)将混合后的BDMP在4℃下孵育60分钟。

(5)用PBS+100mM的甘氨酸洗涤BDMP悬液三次以除去多余的生物素试剂和副产物。

(6)通过使用流式细胞术用FITC缀合的链霉抗生物素蛋白检测生物素化的BDMP的含量。链霉抗生物素蛋白的结合并不受Lactadherin处理的影响。

(7)注射前60min后，使用眶周外眦静脉取血法并用3.6％浓度的枸橼酸钠盐抗凝，全血与枸橼酸钠盐按照体积比9:1加入，每只鼠的取血量约为100μl。

(8)小鼠随机分为三组分别尾静脉注射Bio-BDMP+PBS，Bio-BDMP+LAC，PBS，Bio-BDMP注射量为1.5×107/小鼠，Lactadherin注射量为10ug/ml。注射方法和分组如下：

BDMP+PBS组使用28G1/2大小的针头向两条鼠尾静脉分别注射Bio-BDMP和PBS各100ul；

BDMP+LAC组使用28G1/2大小的针头向两条鼠尾静脉分别注射Bio-BDMP和Lactadherin各100ul；

PBS组使用28G1/2大小的针头向两条鼠尾静脉分别注射PBS和PBS各100ul。

(9)注射后1小时，3小时，6小时取血，使用眶周外眦静脉取血法并用3.6％浓度的枸橼酸钠盐抗凝，全血与枸橼酸钠盐按照体积比9:1加入，每次每只鼠的取血量约为100μl。

(10)注射后24小时，二氧化碳处死小鼠，灌注解剖取出小鼠心、脑、肺、肾、肝、脾、肠等组织，并用4％多聚甲醛固定过夜

(11)将取出的血离心得到血浆，用流式细胞术测量血浆中Bio-BDMP的含量变化，并做组织病理检测各脏器脏中的Bio-BDMP累积(如前所述，切片用用于血管渗漏的苏木精和曙红(HE)和用于血管纤维蛋白沉积的磷钨酸苏木精(PTAH))染色。注射生物素化BDMP的小鼠的各个脏器还用HRP-链霉亲和素染色以检测生物素化的BDMP)。

3.1.3.2流式细胞仪检测MP-WBC复合物的形成

(1)配置偶联缓冲液，洗涤缓冲液，并将CL抗体稀释与蛋白A/G磁珠的结合。

(2)向洗净的抗蛋白A/G磁珠中加入稀释的CL抗体和偶联缓冲液，在旋转平台上轻轻混匀并孵育15分钟。在孵育过程中每隔5-10分钟轻轻震动孵育管，以确保磁珠保持悬浮状态。

(3)将偶联好的磁珠洗净，加入取出的小鼠全血样品，室温下孵育1小时。

(4)使细胞悬浮液通过用含有0.5％牛血清白蛋白和2mM EDTA(pH7.2)的PBS预冲洗的LS柱。

(5)收集由蛋白A/G磁珠捕获的mtMP结合的细胞后，用FITC标记的CD45抗体染色30分钟。

(6)用流式细胞术进行分析。

3.1.3.3C1C2蛋白片段量产

通过基因工程技术将人lactadherin基因进行剪切，将得到的C1C2基因片段进行转染入细胞，进行翻译表达，并从中提取出翻译好的C1C2蛋白并将其纯化备用。下面主要叙述转染和筛选步骤；

(1)将复苏好的CHO-K1细胞种于6孔板内待其长到70％-90％的满度时即可使用。

(2)将2000DNA转染试剂(1:10)用Opti-MEM培养基稀释。

(3)将C1C2片段的cDNA(0.5–5μg/μL)用Opti-MEM培养基稀释。

(4)将稀释好的cDNA和2000DNA转染试剂按照1:1混匀。

(5)室温下孵育5min。

(6)将混合液加入6孔板中，混合液培养基按1:10稀释

(7)37℃孵育1-3天后，换全培养基，培养3天后加入hygromycin B(浓度为200ug/ml)筛选细胞。

(8)一周后，改用100ug/ml hygromycin B维持培养。

(9)收集细胞和培养基，裂解细胞后用 Histidine-tagged ProteinPurification Maxi Kit(镍柱)纯化。

(10)纯化后的蛋白用Pierce^TM Microplate BCA Protein Assay Kit检测蛋白浓度，并用质谱仪检测其成分和C1C2浓度，以备使用。

3.1.4统计学方法

3.2结果

3.2.1Bio-BDMP实验表明MP主要通过小鼠的肝脏进行清除。实验结果如图3.1所示：

图A中小鼠尾静脉分别注射Bio-BDMP和Lactadherin或PBS，并留取注射前，注射后1、3、6小时的鼠血，使用流式细胞术测定血浆中PE连接的链霉亲和素标记的Bio-BDMP含量。结果显示注射Bio-BDMP+PBS组注射后6小时内血浆中Bio-BDMP的含量经历一个先升高后降低的过程，而注射Bio-BDMP+Lactadherin组注射后6小时内血浆中Bio-BDMP的含量基本不变(维持在低水平)。3、6小时两组的血浆中的Bio-BDMP的含量差异有统计学意义，P<0.05。

图B中小鼠尾静脉分别注射Bio-BDMP+Lactadherin、Bio-BDMP+PBS和PBS组小鼠在注射后1小时处死后灌注，留取的肝组织切片用用于血管渗漏的苏木精和曙红(HE)和用于血管纤维蛋白沉积的磷钨酸苏木精(PTAH))染色，并使用HRP-链霉亲和素染色以检测生物素化的BDMP(主要在肝脏，其次在脾脏，其他组织中的检出量均较低)。结果显示Bio-BDMP+Lactadherin组相比另外两组肝血窦周围可见大量Bio-BDMP，Bio-BDMP+PBS组肝血窦周围可见少量Bio-BDMP，PBS注射组基本无Bio-BDMP。

图C说明Lactadherin可以帮助使Bio-BDMP沉积在肝血窦周围。

3.2.2Lactadherin通过协助白细胞吞噬MP发挥作用

如图3.2所示，对FPI+LAC,FPI+PBS，Sham组小鼠打击后3、6小时的小鼠新鲜抗凝全血使用了抗CL抗体来抓取mtMP并用流式细胞术来检测，与mtMP发生粘连的血液中细胞成分，并用CD45-Fitc染色发现注射有Lactadherin组的血中检出的mtMP-白细胞复合物的数量明显较其他组多，P<0.05，结果有统计学差异。

3.2.3Lactadherin基因敲除小鼠

如图3.3所示：图A显示Lactadherin基因敲除小鼠如前被分为为FPI+LAC，FPI+PBS，Sham组后小鼠在FPI打击后3小时和6小时时血浆中BDMP的含量变化，NSE阳性的为神经元来源的MP，可见FPI打击前Lactadherin基因敲除小鼠与其同窝小鼠血浆中的神经元来源MP含量基本持平，而打击后3、6小时血浆中的神经元来源MP含量在Lactadherin基因敲除小鼠中比其同窝小鼠显著增高，*表示P<0.05，结果有统计学差异。有趣的是两组小鼠血浆中PS阳性的MP在打击前就有统计学差异，打击后3、6小时PS阳性的MP均有增高，而且可以看到6小时的血浆中Lactadherin基因敲除小鼠的MP含量相比3小时仍有增高，而其同窝小鼠的血浆中MP含量已稍有下降。*表示P<0.05，结果有统计学差异。

如图B中所示为Lactadherin基因敲除小鼠如前被分为为FPI+LAC，FPI+PBS，Sham组后小鼠在FPI打击后3小时和6小时时的血浆凝血因子Xa凝血时间测定结果，可以看出打击前两组的凝血时间基本相同，打击后两组的凝血时间均有下降，显示血液呈现高凝状态，而打击后6小时Lactadherin基因敲除组的血浆相比其同窝小鼠更加高凝，*表示P<0.05，结果有统计学意义。

如图C中所示为Lactadherin基因敲除小鼠如前被分为为FPI+LAC，FPI+PBS，Sham组后小鼠在FPI打击后3小时和6小时时的血浆中D二聚体的含量，可以看到打击前两组小鼠血浆中的D二聚体含量基本持平，打击后3小时两组血浆中的D二聚体含量均显著增加，而且Lactadherin基因敲除组小鼠的血浆中D二聚体的含量相比其同窝小鼠要更高，打击后6小时两组小鼠血浆中的D二聚体的含量相比3小时均有所下降，而且Lactadherin基因敲除组小鼠的血浆中D二聚体的含量相比其同窝小鼠仍然要更高，*表示P<0.05，结果有统计学意义。

3.2.4单纯的C1C2片段作用差

如图3.4A中所示：图A显示为FPI打击前注射C1C2蛋白片段后小鼠在FPI打击后3小时和6小时时血浆中BDMP的含量变化，NSE阳性的为神经元来源的MP，可见注射C1C2蛋白片段组并不能像注射Lactadherin组一样强力的减少血浆中的神经元来源的MP含量。*表示P<0.05，结果有统计学差异。

如图3.4B中所示：图B显示为FPI打击前注射C1C2蛋白片段后小鼠在FPI打击后3小时和6小时时血浆中BDMP的含量变化，MitoTracker Green阳性的为线粒体来源的MP，可见注射C1C2蛋白片段组并不能像注射Lactadherin组一样强力的减少血浆中的mtMP含量。*表示P<0.05，结果有统计学差异。

同时，测定FPI打击前注射C1C2蛋白片段后小鼠在FPI打击后3小时和6小时时血浆中的凝血因子Xa凝血时间测定结果。如图3.5所示，同样的单纯的C1C2蛋白片段并不能像注射Lactadherin组一样强力的降低血液的高凝状态，P<0.05，结果有统计学意义。同时也测量了血浆中的D二聚体含量，可以看出单纯的C1C2蛋白片段也没能像注射Lactadherin组一样强力的降低血液中D二聚体的含量，P<0.05，结果有统计学差异。说明单纯的C1C2蛋白片段作用较弱。

3.3小结

综上，通过使用小鼠TBI模型注射生物素标记的BDMP和Lactadherin或PBS的方法观察发现：生物素标记的BDMP主要在肝脏被巨噬细胞清除，而Lactadherin蛋白能增加BDMP在肝脏被巨噬细胞清除的量；同时体外实验也能观察到Lactadherin蛋白能促进巨噬细胞粘附吞噬BDMP。并通过Lactadherin基因敲除小鼠验证实验，也使用蛋白工程技术纯化了Lactadherin蛋白的C1C2片段，并发现其对BDMP的清除能力十分有限，提示Lactadherin蛋白上的EGF片段(该片段能与巨噬细胞上的αvβ3和αvβ5整合素受体结合)是不可缺少的部分。

实施例4

体外实验验证Lactadherin蛋白的作用及其机制

4.1对象和方法

4.1.1实验小鼠、仪器

所有实验小鼠均来自美国Jackson实验室，实验使用8-20周龄的雄性C57/BL6小黑鼠，体重范围在20～26g。小鼠被饲养于BloodWorks Northwest Research Institute的无特定病原体动物(SPF)级动物饲养房，所有实验小鼠均使用标准颗粒饲料喂食，自由饮水，并将室温控制在20～24℃内，光照强度250Iux，白昼交替的条件下由专业动物饲养员饲养。

4.1.2实验试剂

4.1.3实验方法

4.1.3.1体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)

(1)采用的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)来自美国Lonza公司。用T75的培养瓶，每瓶加3ml的0.5％浓度的明胶溶液，均匀包被培养瓶底部，并置于37℃培养箱中过夜。

(2)37℃水浴加热EBM-2培养基和各种因子，配置EGM-2培养基。然后从液氮中取出冻存的HUVEC细胞，快速复温至37℃，此过程不要超过两分钟。并用75％酒精消毒管外壁。

(3)将37℃EGM-2培养基9ml加入15ml无菌离心管中，后将HUVEC细胞慢慢加入，并边加边摇匀。

(4)将重悬的细胞悬液在1 200rpm，室温，离心10min，留取沉淀。加入EGM-2培养基12ml，混匀，细胞计数，备用。

(5)用负压吸引器吸去T75培养瓶中的包被液，并按2 000～6 000个细胞/cm²接种细胞，向培养瓶中加入12ml的EBM-2培养基，在37℃、5％CO2浓度的培养箱环境下培养。

(6)接种24h后全换液一次，继续在37℃、5％CO2培养箱内培养，每2～3天换液一次，直至细胞长至覆盖培养瓶底的70～90％进行传代。

4.1.3.2PKH-26荧光体外标记BDMP

(1)取100ul的BDMP悬液加入1.5ml的EP管中(管1)，之后取出PKH26试剂盒中的稀释液C加400ul入EP管中并吹打混匀3-5次，避免出现涡流。

(2)取另一个EP管将5ul PKH-26染料加到495ul的稀释液C溶液中，吹打混匀3-5次。

(3)将第二个管内的液体加入第一个EP管并吹打混匀3-5次，在室温下孵育5min。PKH-26染料为PE荧光。

(4)向孵育后的混合液内加入10％BSA 500ul并孵育1min来结合掉多余的染料。100 000g，4℃，离心1小时，取沉淀，PBS重悬备用。

4.1.3.3人静脉血PRP的提取

(1)所有新鲜血液样品均来自成人志愿者的上肢静脉血，捐献者要求在7天内没服用过抗血小板药物。

(2)使用21G针头从上肢静脉取血，并使用用3.6％枸橼酸钠盐抗凝，血液与抗凝剂的体积比例为9:1。

(3)将全血在120g，室温，离心15～30min，具体离心时间取决于血液量，血液量小于20ml的离心15min即可，血液量大于20ml的需要离心30min，注意关闭离心机的制动器，防止血小板被激活，使其缓慢的升速和降速。

(4)用剪刀将吸口修大修园的巴氏吸管小心从离心管的上层缓慢吸取PRP备用，注意不要吸到白膜层。

4.1.3.4Transwell实验并用流式细胞仪检测BDMP的通过率

(1)将HUVEC细胞培养至覆盖培养瓶地面70～90％的满度，后吸去培养液，加入12ml的汉克斯洗液，轻轻洗两遍，用负压吸引器吸去。

(2)加入0.25％胰蛋白酶内含0.04％EDTA-2Na液约3ml，使其与培养瓶底面细胞充分接触，放置于37℃消化5min，轻轻震荡混匀使大部分细胞脱落，后通过显微镜下观察如果大部分细胞悬浮即可。

(3)向培养瓶中加入6ml含5％FBS的EGM-2培养基来中和胰酶消化。

(4)用移液管轻轻吹打培养瓶底面使细胞完全脱落并让细胞散在分布后，移液到15ml的无菌离心管中，1200rpm，室温，离心10min后，取细胞沉淀。

(5)向细胞沉淀中加入6ml培养基后重悬，取10ul细胞悬液用细胞计数板计数后，调整离心管中的细胞数量为2000～6000个/cm²，后将细胞悬液接种在Transwell小室的底面(小室的底面为0.4μm孔径的胶原包被的聚四氟乙烯膜)并放入24孔板中，放入37℃、5％CO₂培养箱内培养约3天。

(6)定期换液，待HUVEC细胞长满聚四氟乙烯膜表面，向小室内加入过滤过的最终浓度为25μM的组胺激活HUVEC细胞，放置于37℃孵育30min。

(7)然后用PBS洗3次，并更换24孔板向培养孔中加入600μl过滤过的EBM-2培养基，然后分别向Transwell小室中加入100μlPKH26标记的BDMP(BDMP终浓度为1.5×10⁴个/μl)+PRP(血小板终浓度为3×10⁴个/μl)+Lactadherin(终浓度为200nM)、PKH26标记的BDMP+PRP+PBS(与Lactadherin加入的量等体积)、PRP+PBS(与Lactadherin加BDMP加入的体积之和相等)，在37℃、5％CO2的培养箱内放置3小时。

(8)3小时后收集Transwell试验后24孔板中的培养基500μl/孔，另外分别取PKH26标记和未标记的BDMP相同的量加入600ul过滤过的EBM-2培养基,以分别制作阳性和阴性对照管备用。

(9)流式细胞仪检测PE阳性的PKH-26标记的BDMP数量。

4.1.3.5Fitc-Lac竞争抑制实验

对于与BDMP结合的乳糖素，将FITC缀合的牛乳腺素(HaematologicTechnologies，Inc.，Essex Junction，VT)与纯化的BDMP孵育30分钟，然后与PE-缀合的针对胶质细胞标记谷氨酸转运蛋白1(EMD)的单克隆抗体Millipore)20分钟在不存在和存在倍过量浓度的未标记的乳胶素或膜联蛋白V的流式细胞术下，通过FITC荧光检测谷氨酸转运蛋白1+微粒上的乳糖素结合。

4.1.3.6Amnis Mk II系统观察mtMP与单核细胞的结合

(1)分别准备个EP管，分别加入BDMP，BDMP+WBC，BDMP+WBC+PS，BDMP+WBC+PC，BDMP+WBC+CL后混匀，室温下孵育30min。

(2)上样并设置参数，选出BDMP与白细胞结合的区域进行统计。

4.1.4统计学方法

4.2结果

4.2.1transwell实验表明Lactadherin能协助白细胞清除BDMP减少内皮细胞渗漏

如图4.1所示，使用transwell小室中培养满的HUVEC细胞进行的内皮细胞渗漏实验，其中的BDMP为PKH-26标记的DBMP带PE荧光。实验采用流失细胞仪对下面24孔板内的穿孔液体进行的检测。结果表明，白细胞能在Lactadherin的帮助下明显抑制由BDMP导致的内皮渗漏。P<0.001，结果有统计学意义。

4.2.2Fitc-Lac竞争抑制实验

为了明确Lactadherin与BDMP的结合位点，进行Fitc-Lac竞争抑制实验。实验中使用绿色荧光标记的Lactadherin与BDMP孵育结合半小时后，分别加入100倍浓度的无荧光标记的Lactadherin、Annexin V、PBS对照以及不加荧光标记的Lactadherin的BDMP的阴性对照。

结果如图4.2所示，加入绿色荧光标记的Lactadherin的管，大量BDMP带上了绿色荧光标记，加入了100倍浓度的无荧光标记的Lactadherin或Annexin V的组均对荧光强度产生了很大程度的抑制，P<0.05，结果有统计学意义，说明其能竞争绿色荧光标记的Lactadherin的结合位点。而Annexin V与BDMP的结合位点十分明确，为PS。故Lactadherin与BDMP的结合位点也为PS。

4.2.3Amnis Mk II系统观察mtMP与单核细胞的结合，并且可以看到CL和PS能显著抑制其结合，而PC不能。

为了进一步明确观察mtMP与单核细胞的结合，使用可视化的流式细胞术系统Amnis Mk II系统观察mtMP与单核细胞的结合。结果如图4.3所示，左图为Amnis Mk II拍到的mtMP与单核细胞的结合，mtMP使用MitoTrackerGreen标记，单核细胞用APC-CD-45标记。图中可明确看到mtMP与单核细胞的结合。右图为通过Amnis Mk II系统测试的磷脂竞争实验，实验结果表明大量的CL和PS能显著抑制mtMP与单核细胞的结合，而大量的PC却不能。P<0.01，结果有显著的统计学意义。

4.3小结

综上，在实施例3的基础上，通过体外Transwell实验也证实Lactadherin蛋白能减少内皮细胞间的渗漏；Fitc-Lac竞争抑制实验说明Lactadherin蛋白与BDMP的结合位点为PS；并使用可视流式细胞术观察到BDMP与巨噬细胞的结合。揭示了Lactadherin蛋白清除BDMP的机制，为临床治疗TBI后的继发性损伤提供了新的治疗的方法和理论基础。

可见，通过上述实施例1-4的实验研究发现：

Lactadherin蛋白能改善TBI患者运动神经功能损伤；

Lactadherin蛋白能减少TBI患者血脑屏障渗漏；

Lactadherin蛋白能减少TBI患者肺组织纤维素渗出；

Lactadherin蛋白能减少TBI患者血浆中的BDMP含量；

Lactadherin蛋白能减少TBI患者血中血小板的消耗；

Lactadherin蛋白能改善TBI患者的血液高凝状态；

Lactadherin蛋白能够治疗TBI后的凝血功能障碍；

Lactadherin蛋白能促进巨噬细胞粘附吞噬BDMP；

Lactadherin蛋白能减少内皮细胞间的渗漏；

Lactadherin蛋白能够治疗TBI后的继发性损伤。

实施例5

Lactadherin蛋白对血管痉挛相关治疗作用的验证试验

通过激光散斑实验观察脑血流变化(即脑血管痉挛的情况)

1、麻醉：10％水合氯醛30ul(0.15ml/100g)腹腔注射。

2、固定：小鼠固定在立定定向仪上，充分利用卡槽牢固固定。

3、沿眉心后1mm为边际剪开一马蹄形皮瓣，充分暴露小鼠额骨及两侧顶骨。将皮瓣翻向枕骨下方。颅骨上涂抹甘油以保持颅骨水分。

4、颅骨表面与激光散斑探测器之间距离控制在10±0.2cm后进行观测。

5、尾静脉注射：分为4组，控制每组的注射总量为150ul

(1)BDMP 1.5×10⁷单位/只

实验中发现小鼠的半数致死量LD50是1.5×10⁷单位/只,故将1.5×10⁷单位/只的BDMP稀释至PBS溶液内，通过鼠尾静脉分别注射至小鼠体内

(2)PBS 150ul

(3)注射尼膜地平100ul后20分钟注射BDMP 1.5×10⁷单位/只

(4)注射Lactadherin 10ug/只后20分钟注射BDMP 1.5×10⁷单位/只

由于BDMP能导致血管痉挛的发生，而Lactadherin能通过促进BDMP的清除，从而减少BDMP导致的血管痉挛的发生。从图5中可以清楚观察到Lactadherin能有效减少血管痉挛导致的小鼠脑血流灌注减少，降低死亡率。

综上可以看出，注射Lactadherin蛋白可以通过结合脑源性微粒增加清除，从而迅速解除血管痉挛，显著减轻脑源性微粒引起的血液高凝状态，降低该模型死亡率。因此可以确认，使用Lactadherin蛋白治疗血管痉挛的疗效显著、安全性好，具有潜在的临床应用价值，具有先进性。

上述参照具体实施方式对该人源乳凝集素亚型蛋白的新用途进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 张建宁

<120> 人源乳凝集素亚型蛋白的新用途

<130> 2018

<150> 201710446984X

<151> 2017-06-14

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 387

<212> PRT

<213> Lactadherin蛋白(糖蛋白)

<220>

<221> CHAIN

<222> (1)..(387)

<400> 1

Met Pro Arg Pro Arg Leu Leu Ala Ala Leu Cys Gly Ala Leu Leu Cys

1 5 10 15

Ala Pro Ser Leu Leu Val Ala Leu Asp Ile Cys Ser Lys Asn Pro Cys

20 25 30

His Asn Gly Gly Leu Cys Glu Glu Ile Ser Gln Glu Val Arg Gly Asp

35 40 45

Val Phe Pro Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Asn

50 55 60

His Cys Glu Thr Lys Cys Val Glu Pro Leu Gly Leu Glu Asn Gly Asn

65 70 75 80

Ile Ala Asn Ser Gln Ile Ala Ala Ser Ser Val Arg Val Thr Phe Leu

85 90 95

Gly Leu Gln His Trp Val Pro Glu Leu Ala Arg Leu Asn Arg Ala Gly

100 105 110

Met Val Asn Ala Trp Thr Pro Ser Ser Asn Asp Asp Asn Pro Trp Ile

115 120 125

Gln Val Asn Leu Leu Arg Arg Met Trp Val Thr Gly Val Val Thr Gln

130 135 140

Gly Ala Ser Arg Leu Ala Ser His Glu Tyr Leu Lys Ala Phe Lys Val

145 150 155 160

Ala Tyr Ser Leu Asn Gly His Glu Phe Asp Phe Ile His Asp Val Asn

165 170 175

Lys Lys His Lys Glu Phe Val Gly Asn Trp Asn Lys Asn Ala Val His

180 185 190

Val Asn Leu Phe Glu Thr Pro Val Glu Ala Gln Tyr Val Arg Leu Tyr

195 200 205

Pro Thr Ser Cys His Thr Ala Cys Thr Leu Arg Phe Glu Leu Leu Gly

210 215 220

Cys Glu Leu Asn Gly Cys Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys Asn Asn Ser

225 230 235 240

Ile Pro Asp Lys Gln Ile Thr Ala Ser Ser Ser Tyr Lys Thr Trp Gly

245 250 255

Leu His Leu Phe Ser Trp Asn Pro Ser Tyr Ala Arg Leu Asp Lys Gln

260 265 270

Gly Asn Phe Asn Ala Trp Val Ala Gly Ser Tyr Gly Asn Asp Gln Trp

275 280 285

Leu Gln Val Asp Leu Gly Ser Ser Lys Glu Val Thr Gly Ile Ile Thr

290 295 300

Gln Gly Ala Arg Asn Phe Gly Ser Val Gln Phe Val Ala Ser Tyr Lys

305 310 315 320

Val Ala Tyr Ser Asn Asp Ser Ala Asn Trp Thr Glu Tyr Gln Asp Pro

325 330 335

Arg Thr Gly Ser Ser Lys Ile Phe Pro Gly Asn Trp Asp Asn His Ser

340 345 350

His Lys Lys Asn Leu Phe Glu Thr Pro Ile Leu Ala Arg Tyr Val Arg

355 360 365

Ile Leu Pro Val Ala Trp His Asn Arg Ile Ala Leu Arg Leu Glu Leu

370 375 380

Leu Gly Cys

385

Claims

1.人源乳凝集素亚型蛋白在制备增强并加速BDMP清除的药物方面的用途。

2.人源乳凝集素亚型蛋白在制备治疗血管痉挛的药物中的用途。

3.根据权利要求1所述用途，所述血管痉挛为脑血管痉挛。

4.人源乳凝集素亚型蛋白在制备治疗TB I-AC的药物中的用途。

5.人源乳凝集素亚型蛋白在制备治疗TB I后继发性损伤的药物中的用途。

6.人源乳凝集素亚型蛋白在制备改善TB I患者运动神经功能损伤的药物中的用途。

7.人源乳凝集素亚型蛋白在制备减少TB I患者血脑屏障渗漏的药物中的用途。

8.人源乳凝集素亚型蛋白在制备减少TB I患者肺组织纤维素渗出的药物中的用途。

9.人源乳凝集素亚型蛋白在制备减少TB I患者血中血小板的消耗的药物中的用途。

10.人源乳凝集素亚型蛋白在制备改善TB I患者血液高凝状态的药物中的用途。

11.人源乳凝集素亚型蛋白在制备TB I后凝血功能障碍的治疗药物中的用途。

12.人源乳凝集素亚型蛋白在制备减少内皮细胞间渗漏的药物中的用途。

13.人源乳凝集素亚型蛋白在制备TB I后的继发性损伤的治疗药物中的用途。