CN110100788A - 基于基因操作策略构建疾病模型的方法和应用 - Google Patents
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Classifications
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Abstract
本发明公开了一种基于基因操作策略构建疾病模型的方法和应用，涉及生物技术领域。该方法通过基因操作技术使Emc3基因在目标动物的血管内皮细胞或小脑浦肯野细胞中不表达。利用该方法可以得到表现出视网膜新生血管疾病或小脑共济失调疾病典型特征的疾病动物模型，该方法为构建视网膜新生血管疾病模型或小脑共济失调疾病模型提供了一种新的思路或策略。此外，由该方法得到的疾病模型也为科研工作者研究视网膜新生血管疾病以及筛选治疗视网膜新生血管疾病或小脑共济失调疾病的药物提供了模型基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种基于基因操作策略构建疾病模型的方法和应用。
背景技术
视网膜新生血管性疾病是我国乃至世界范围严重致盲性眼病之一，主要是指由于新生血管生长伴随出血、渗出、增生等病理性改变造成的致盲性玻璃体视网膜疾病。包括糖尿病性视网膜病变、视网膜血管阻塞性疾病、视网膜静脉周围炎、早产儿视网膜病变等，对我国人群视力健康的威胁日益凸显。一直以来，关于视网膜新生血管发生的机制众说纷纭。为此，开展视网膜新生血管性疾病相关免疫学机理的研究，以期寻找可以更早、更有效阻断RNV进程的作用靶点，具有重要的临床意义。
目前，国内外实验室已建立了许多种视网膜新生血管动物模型如：激光光凝诱导视网膜新生血管、高糖饲料或注射链脲佐菌素诱导糖尿病视网膜病变、二氧化碳或酸中毒诱导视网膜病变模型以及缺氧诱导的小鼠视网膜缺血模型等。缺氧诱导的小鼠视网膜缺血模型的视网膜血管病理改变与人类新生儿视网膜病变的病理过程高度相似：先是高氧阶段的血管闭塞和消失及正常发育中的视网膜血管停止生长,然后是进入空气相对低氧的环境下,导致缺氧状态下的视网膜血管异常增殖。此模型制作周期短，动物死亡率低且能产生典型的视网膜新生血管，是理想的模拟视网膜新生血管疾病的动物模型。
共济失调(Ataxia)是指患者无法维持精细步态、完成精确动作的一种病理状态。危及小脑或脊髓传入或传出神经回路途径的病变可能导致共济失调；其中很大一部分由遗传因素所致，称为遗传性共济失调(Hereditary ataxia，HA)。遗传性共济失调具有异质性，至今报道的已有60多种，但尚无统一和公认的分类方法。根据其病发部位可分为四种类型：①深感觉障碍共济失调；②小脑共济失调；③前庭迷路共济失调；④大脑型共济失调。小脑共济失调是遗传性共济失调主要类型，是—大类具有明显遗传异质性的神经系统变性疾病，主要症状为行走不稳，肢体无力以小脑症状为突出特点，并伴有认知障碍。小脑共济失调表现有多个遗传模式，包括常染色体显性、隐性遗传，X-连锁遗传等多种遗传模式，另外还包括一些散发病例。目前已发现了30余种小脑共济失调亚型，约占神经系统遗传性疾病的10％～15％。
小脑共济失调的临床症状复杂、交错重叠，即使同一家族也可表现高度异质性。并且其临床累及面广，各型之间临床表型存在较大的重叠，临床分型非常困难，因此最终诊断小脑共济失调须依靠基因检测。但因其分型众多，致病基因繁冗复杂，为诊断带来极大困难。目前尚缺乏针对小脑共济失调具体有效的治疗方法，其主要原因就是缺乏详细的发病机理研究。其致病基因的发现和致病机理的研究对小脑共济失调的诊断和治疗十分重要。
小脑共济失调的典型神经病理学改变是小脑萎缩，浦肯野细胞的退行性病变和丢失。浦肯野细胞(Purkinje cell，PC)是从小脑皮质发出的唯一能够传出冲动的神经元。PC轴突穿过颗粒层和白质到达深部小脑核团，PC在运动协调中起着重要的作用。由于PC细胞树突巨大，需要大量的蛋白质合成和能量消耗，易发生病变。内质网应激反应在PC细胞病变中起重要作用。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于基因操作策略构建疾病模型的方法，利用该方法可以得到表现出视网膜新生血管疾病典型特征的疾病动物模型，该方法为构建视网膜新生血管疾病模型提供了一种新的思路或策略。此外，由该方法得到的疾病模型也为科研工作者研究视网膜新生血管疾病以及筛选治疗视网膜新生血管疾病的药物提供了模型基础。
本发明的另一目的在于提供由上述方法得到的疾病模型的应用。
本发明是这样实现的：
一方面，本发明提供了一种基于基因操作策略构建疾病模型的方法，上述模型为动物模型，所述疾病模型为视网膜新生血管疾病模型，通过基因操作技术使Emc3基因在目标动物的血管内皮细胞中不表达；
或者所述疾病模型为小脑共济失调疾病模型，通过基因操作技术使Emc3基因在目标动物的小脑浦肯野细胞不表达或表达受到抑制。
EMC3蛋白是内质网复合体的一部分，由EMC3基因编码。人EMC3基因位于第3号染色体，其编码的蛋白产物在体内有多种重要功能。蛋白质作用研究表明，EMC3与内质网关联的蛋白降解(ERAD)有相互作用。EMC3还可以作为膜蛋白插入酶，在蛋白质翻译过程中帮助其目标蛋白折叠。EMC3蛋白在自噬、酯类转运、病毒感染和肺部发育过程中均有重要作用。
本发明的研究首次发现，Emc3基因与视网膜新生血管疾病相关，通过敲除Emc3基因的外显子例如第二外显子，也就是使该基因在动物体的血管内皮细胞的不表达或表达受到抑制(也可以理解为在血管内皮细胞中沉默或突变该基因，或者说是Emc3基因在血管内皮细胞中不发挥功能)，结果显示该动物体表现典型的视网膜新生血管疾病特征，例如：表层或深层视网膜血管发育迟缓、视网膜血管密度降低、视网膜血管顶端细胞数目减少、玻璃体血管退化减缓、视网膜血管内皮细胞增殖减缓等。
同时，本发明的研究还发现，Emc3基因与小脑共济失调疾病相关，使该基因在动物体的小脑浦肯野细胞的不表达或表达受到抑制，果显示该动物体表现典型的小脑共济失调疾病特征，例如：步态不稳，提起尾部后肢蜷缩、小脑进行性萎缩，小脑分子层逐渐变薄，颗粒细胞减少、小脑中浦肯野细胞逐渐减少。
需要说明的是，EMC3基因共8个外显子，只要是敲除其中的一个或多个外显子均可以使得该基因的不表达或表达受到抑制。只要是敲除EMC3基因8个外显子中的任意一个或几个的组合均属于本发明的保护范围。
通过基因操作技术(例如基因编辑技术、基因敲除技术或RNA干扰技术)使Emc3基因在目标动物的血管内皮细胞或小脑浦肯野细胞中不表达，可以得到具有视网膜新生血管疾病特征的视网膜新生血管疾病模型或者是小脑共济失调疾病模型。
在本发明揭示了敲除了Emc3基因可导致视网膜新生血管疾病或小脑共济失调疾病发生的基础上，本领域技术人员容易想到采用任何适宜的基因操作技术操作Emc3基因使其在目标动物的血管内皮细胞或小脑浦肯野细胞不表达或表达受到抑制即不发挥正常的功能。基因操作技术可以是本领域已知的如基因编辑技术、基因敲除技术或RNA干扰技术等技术。在已知目标动物的Emc3基因序列的基础上，本领域技术人员可以利用基因编辑技术、基因敲除技术或RNA干扰技术对Emc3基因操作，使其在血管内皮细胞或小脑浦肯野细胞不发挥正常的功能。
可选的，在本发明的一些实施方式中，上述基因操作技术为基因编辑技术、基因敲除技术或RNA干扰技术。
可选的，在本发明的一些实施方式中，上述基因编辑技术为CRISPR/Cas9技术、ZFN技术或TALEN技术。
CRISPR/Cas9基因敲除系统是最近几年飞速发展起来的一种基于细菌获得性免疫系统的基因编辑技术，经过人工的改造，现已被广泛运用于多种疾病模型构建研究。CRISPR-Cas9 可以特异识别目标DNA序列，Cas9核酸内切酶在向导核糖核酸gRNA引导下切割双链 DNA，造成基因组双链断裂；细胞基因组修复的不稳定性产生非特异重组可以产生修复错误(插入或者缺失)，从而可能产生移码突变而实现基因敲除的目的。在提供特定DNA模版序列的情况下，基因组修复可以在基因组引入特定突变/外来DNA序列，从而实现基因敲入/定点突变。
可选的，在本发明的一些实施方式中，上述基因敲除技术为Cre-loxp基因敲除技术。
可选的，在本发明的一些实施方式中，通过基因操作技术使Emc3基因在目标动物的血管内皮细胞或小脑浦肯野细胞中不表达或表达受到抑制是指：通过Cre-loxp基因敲除技术敲除Emc3基因的第二外显子使Emc3基因在目标动物的血管内皮细胞或小脑浦肯野细胞中不表达或表达受到抑制。
优选地，所述基因操作技术包括如下步骤：
对Emc3loxp/loxp-Pdgfb-Cre小鼠腹腔注射他莫昔芬以诱导Emc3基因敲除；
优选地，在Emc3loxp/loxp-Pdgfb-Cre小鼠出生后的第1、2、3、5天进行腹腔注射他莫昔芬；
优选地，每天腹腔注射他莫昔芬一次，他莫昔芬的注射剂量为50μg/次。
可选的，在本发明的一些实施方式中，上述目标动物为非人哺乳动物。
可选的，在本发明的一些实施方式中，上述非人哺乳动物为小鼠。
当然，需要说明的是，非人哺乳动物除小鼠外，也可以是其他的感兴趣的哺乳动物，例如牛、羊、猪、狗、兔、猿、猴、大猩猩等。无论选用何种动物构建疾病模型，只要是通过基因操作技术使Emc3基因在目标动物的血管内皮细胞或小脑浦肯野细胞中不表达以得到相应疾病模型即属于本发明的保护范围。
可选的，在本发明的一些实施方式中，上述视网膜新生血管疾病模型表现出如下特征中的至少一种：
(1)表层或深层视网膜血管发育迟缓，优选地，血管发育速度下降约18％；
(2)血管密度降低，优选地，血管密度下降约20％；
(3)血管顶端细胞数目减少，优选地，血管顶端细胞数目减少约43％；
(4)玻璃体血管退化减缓；
(5)视网膜血管内皮细胞增殖减缓，优选地，视网膜血管内皮细胞增值速度下降约33％。
可选的，在本发明的一些实施方式中，上述小脑共济失调疾病模型表现出如下特征中的至少一种：
(1)步态不稳，提起尾部后肢蜷缩；
(2)小脑进行性萎缩，小脑分子层逐渐变薄，颗粒细胞减少；
(3)小脑中浦肯野细胞逐渐减少。
另一方面，本发明提供了由如上所述的基于基因操作策略构建疾病模型的方法所得到的疾病模型在研究视网膜新生血管疾病或小脑共济失调疾病中的应用。
可选的，在本发明的一些实施方式中，上述研究是以非疾病的治疗为目的，优选的，上述研究为视网膜新生血管疾病发病机制或机理研究或上述研究为筛选治疗视网膜新生血管疾病的药物研究，或者上述研究为小脑共济失调疾病发病机制或机理研究或上述研究为筛选治疗小脑共济失调疾病的药物研究。
由本发明的方法得到的视网膜新生血管疾病或小脑共济失调疾病模型具有广泛的用途，尤其是用于到视网膜新生血管疾病或小脑共济失调疾病研究中，为其提供了一种全新的疾病模型，也为进一步研究视网膜新生血管疾病或小脑共济失调疾病发病机制或机理提供模型基础。
此外，由本发明的方法得到的视网膜新生血管疾病模型也可以用于到药物筛选领域，例如用于筛选治疗视网膜新生血管疾病的药物。利用该视网膜新生血管疾病模型筛选治疗视网膜新生血管疾病的药物方法如下：
给予上述视网膜新生血管疾病模型施用候选药物；
观察被施用所述候选药物后的视网膜新生血管疾病模型是否出现以下变化，如果出现以下变化中的任意一种或几种，则指示所施用的候选药物可以作为治疗视网膜新生血管疾病的药物：
(1)施用候选药物前，视网膜新生血管疾病模型的表层或深层视网膜血管发育迟缓；
施用候选药物后，视网膜新生血管疾病模型的表层或深层视网膜血管发育达到或接近正常水平。
(2)施用候选药物前，视网膜新生血管疾病模型的视网膜血管密度降低；
施用候选药物后，视网膜新生血管疾病模型的视网膜血管密度有增加或增加至正常水平。
(3)施用候选药物前，视网膜新生血管疾病模型的视网膜血管顶端细胞数目减少；
施用候选药物后，视网膜新生血管疾病模型的视网膜血管顶端细胞数目有增加或增加至正常水平。
(4)施用候选药物前，视网膜新生血管疾病模型的玻璃体血管退化减缓；
施用候选药物后，视网膜新生血管疾病模型的玻璃体血管退化速度加快或接近正常水平。
(5)施用候选药物前，视网膜新生血管疾病模型的视网膜血管内皮细胞增殖减缓；
施用候选药物后，视网膜新生血管疾病模型的视网膜血管内皮细胞增殖速度增加。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1采用CRISPR/Cas9技术突变小鼠Emc3基因的策略图。
图2为Emc3血管内皮细胞条件性敲除小鼠的构建。图中：A：利用Cre-loxp系统将小鼠血管内皮细胞中的Emc3第二个外显子敲除。B：他莫昔芬的诱导时间和小鼠处理时间。C：Emc3基因敲除小鼠的基因型鉴定。
图3为Emc3血管内皮细胞条件性敲除小鼠的繁育路线图。
图4为Emc3在小鼠血管中的敲除效率研究。图中：A：出生后第25天的野生型小鼠和Emc3 条件性敲除小鼠肺裂解液免疫印迹实验结果。Emc3为实验组，Gapdh为内参。B：Emc3的蛋白免疫印迹结果统计。C：出生后第25天的野生型小鼠和Emc3条件性敲除小鼠肺mRNA的实时荧光定量PCR结果。
图5为Emc3基因敲除小鼠的视网膜铺片的检测。图中：A:血管内皮细胞特异敲除Emc3基因小鼠视网膜铺片染色结果:共同孵育Isolectin B4和Ter-119抗体。其中，箭头代表渗漏出血管的红细胞。 B:血管内皮细胞特异敲除Emc3基因小鼠视网膜铺片中表层血管长度发育的统计分析。C:血管内皮细胞特异敲除Emc3基因小鼠视网膜铺片中表层血管密度的统计分析。
图6为出生后第九天血管内皮细胞特异敲除Emc3基因小鼠眼球切片免疫组化染色结果。
图7为出生后第九天的血管内皮细胞特异敲除Emc3基因小鼠眼球玻璃体血管免疫组化染色结果。
图8为Emc3基因敲除小鼠的视网膜铺片顶端细胞数统计。
图9为Emc3基因敲除小鼠的血管内皮细胞的增殖实验及其统计结果。
图10为Emc3浦肯野细胞条件性敲除小鼠的构建。利用浦肯野细胞特异表达的Cre将小鼠浦肯野细胞中的Emc3第二个外显子敲除。
图11为浦肯野细胞特异敲除小鼠基因型鉴定方法。Body weight为体重(克，g)。横坐标为不同天龄。
图12为浦肯野细胞特异敲除动物体重表型。
图13为浦肯野细胞特异敲除动物共济失调表型分析。
图14为浦肯野细胞特异敲除动物转棒实验分结果。Rotarod为转棒，转动速度为40转/分钟。动物年龄为四周龄(4-week old)。实验重复4次(trial 1-4)。
图15为浦肯野细胞特异敲除动物小脑切片解剖染色结果。
图16为浦肯野细胞特异敲除动物小脑切片免疫荧光染色结果。图中P63为63天龄。
图17为浦肯野细胞特异敲除动物小脑切片内质网应激反应免疫荧光染色结果。图中P63为63 天龄。PDI(Protein Disulfide Isomerase)为蛋白质二硫键异构酶，是内质网应激反应的标志物。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
采用CRISPR/Cas9技术突变小鼠Emc3基因
1设计靶向敲除Emc3基因的gRNA序列，获得F0代Emc3基因条件性敲除小鼠。针对小鼠 Emc3基因的第二个外显子区域设计gRNA序列：5’-CCTTTGTGAAAACCTGTGTGGCA-3’。体外合成RNA，与Cas9蛋白、修复DNA模版一起显微注射到小鼠受精卵中，得到发生基因突变的首建者小鼠(founder)；CRISPR设计示意图如图1所示。修复DNA模版序列：DNA修复模版序列如下 (SEQ ID NO.1):
CcttcctcagaaacctttatttgttcagagcccagtcactctggaagactgccttggatccATAACTTCGTATAATGTATGCTATA CGAAGTTATggctgtgaaaacctgtgtggcaagttgaatatgtttcattgatttttagggtttttggaaagtttccacacccagcttttgccaaccaggtcc tcccttatgtctgagtgggccttctactttacgcttgctttctttgcgtttcacattttaacatctctttgtcttgtgtttttcagTCAGGTCCTAATTCGA AGCAGAGTCCTCAGGGAAAATGGAAAATACATTCCCAAGCAGgtactcactgatattttatttagaggctccaccattcacctgtaagggcagtaaaaacctaaatgtttttttataagaggatgccagagaaaactggaggtggccatccagttattaagctgcagcATAACTTCG TATAATGTATGCTATACGAAGTTATgaattcggtggtggtgtttgctgtcatttgccctcacccttcttaggaaattgtttttaaatgtgactca 。
实施例2
采用Cre-loxp基因敲除技术敲除小鼠Emc3基因
1.以小鼠为目标动物，利用Cre-loxp条件性敲除系统，构建视网膜新生血管疾病鼠模型。
(1)将携带loxp序列的小鼠(Emc3loxp/loxp)与携带经特异在血管内皮细胞表达的Pdgfb-Cre的工具鼠交配，获得同时携带loxp序列和Cre的小鼠，表示为Emc3loxp/+-Pdgfb-Cre，接着将Emc3loxp/loxp与Emc3loxp/+-Pdgfb-Cre小鼠交配，获得Emc3loxp/loxp-Pdgfb-Cre小鼠(图2中A，图3)。
小鼠Emc3基因组序列如SEQ ID NO.2所示。其中，第501-825位为第一外显子，第9346-9403 位为第二外显子，第9746-9839位为第三外显子，第11572-11676位为第四外显子，第12157-12238 位为第五外显子，第14192-14271位为第六外显子，第14974-5056位为第七外显子，第16122-17279 位为第八外显子。
Emc3loxp/loxp-Pdgfb-Cre小鼠需要在出生后第1、2、3、5天进行腹腔注射50μg他莫昔芬一次 (Tamoxifen)；具体地，采用下述他莫昔芬诱导方法，每天腹腔注射一次，诱导Emc3敲除，敲除后的小鼠可表示为Emc3iECKO/iECKO(图2中B)。待Emc3loxp/loxp-Pdgfb-Cre小鼠腹腔注射第5天(P5)后利用剪趾法给小鼠编号，提取全肺组织，进行PCR鉴定。
基因型鉴定方法：用50μL的40mM NaOH溶液95℃煮40min溶解组织提取DNA，冷却后加入等体积40mM Tris-Hcl pH 5.5溶液调节pH，之后进行基因型鉴定PCR反应(鉴定凝胶电泳图见图 2中C)。鉴定Emc3的PCR反应条件为：94℃2min，(94℃20s，60℃20s，72℃20s)x34cycles， 4℃hold，鉴定PCR反应的引物如下：
Emc3-Forward：5’-CCCAGGACGGGGATTATAGTGGTGTG-3’；
Emc3-Reverse：5’-CAAATGACAGCAAACACCACCACCG-3’。野生型扩增片段大小为247bp，纯合型扩增片段为287bp，杂合型扩增片段为两个条带247和287bp(图2中C)。
Cre鉴定引物Pdgfb-Creβ-Forward：5’-GCCGCCGGGATCACTCTCG-3’；
Pdgfb-Cre-Reverse：5’-CCAGCCGCCGTCGCAACTC-3’。
鉴定Cre的PCR反应条件为：94℃2min，(94℃20s，58℃20s，72℃20s)x 34cycles，4℃hold。对得到的扩增条带的判断方法见图2中C。野生型扩增片段大小为247bp，纯合型扩增片段为287bp，杂合型扩增片段为两个条带247和287bp。
其中，他莫昔芬诱导方法：配制他莫昔芬的无水乙醇溶液，浓度为10mg/mL，避光4℃保存。在使用前，配制他莫昔芬无水乙醇溶液：玉米油＝1:9的他莫昔芬玉米油溶液，涡旋混匀，用无菌注射器吸取他莫昔芬溶液，对小鼠进行腹腔注射。
2采用蛋白免疫印迹检测Emc3蛋白在小鼠出生后第25天的肺组织表达情况。
(1)收取同窝野生型和敲除型目标小鼠(即Emc3iECKO/iECKO小鼠)肺组织，放入含有蛋白酶抑制剂的1×PBS中，于冰上超声裂解10分钟；以16000g的转速进行4℃离心10分钟，取上清转移至另一干净离心管，加入蛋白上样缓冲液，混匀后95℃加热5min。
(2待样本冷却后，分别取20μl蛋白样品，采用10％分离胶，恒压70v电泳25分钟，160v电泳40分钟。
(3)转膜条件为：恒流0.3A转移1小时30min，随后用去离子水润洗膜一遍，用5％脱脂牛奶封闭液室温封闭1小时。
(4)将膜放入配置于5％脱脂牛奶封闭液的一抗中，4℃摇床孵育过夜。次日用1×TBST润洗3 次，一次5分钟，加入HRP标记的二抗，室温孵育1小时。
(5)向膜上滴加适量的化学发光底物，于化学发光检测仪中观察蛋白条带(图4中A)。蛋白条带灰度用ImageJ检测，用t检验进行统计学差异分析(图4中B)。
3采用荧光定量PCR的方法检测Emc3在出生后第25天的野生型和目标敲除型小鼠肺中表达情况。
提取出生后第25天的野生型和敲除型小鼠肺总RNA，利用cDNA合成试剂盒(Invitrogen,Waltham,MA,USA)合成cDNA。根据Emc3的cDNA序列设计引物：
Q-ms-EMC3-F：5’-GGCATGATCCGCCACTAC-3'；
Q-ms-EMC3-R1：5’-TGCTTGGGAATGTATTTTCCAT-3'。
以提取的cDNA为模板，Gapdh为内参，使用ABI 7500机器进行实时荧光定量PCR实验，结果见图4中C，由图中可以看出，出生后第25天的敲除型小鼠肺中的Ecm3mRNA水平显著下降了约 75％。
实施例2
利用视网膜爬片(wholemount)技术检测视网膜血管发育情况。
将小鼠处死后，取眼球放入4％PFA溶液中室温固定20分钟(可用24孔板作为容器)，随后放入1×PBS中浸泡15分钟。随后用30G针头在角膜中心扎孔，用眼科剪将整个角膜剪掉，并取出晶体。随后用镊子将整个巩膜撕开，留下内层视网膜，并剪成四叶草形状，铺平去掉多于组织后，吸入4％PFA，于4℃继续固定24h。第二天将wholemount转移至0.4％PFA中，4℃保存。wholemount 染色方法：取出wholemount，用1×PBS清洗3次，一次5分钟。随后用100μL封闭液(5％胎牛血清，0.3％TritonX-100，0.03％叠氮钠的PBS溶液)室温封闭1小时。将红细胞特异性抗体Ter-119 与Isolectin B4(可特异性识别血管结构)按照适当的稀释比例配置成混合溶液，加入封闭好的 wholemount中(每个whoulemount 100μL)，4℃孵育过夜。第二天取出whoulemount，用1×PBS清洗3次，一次5分钟，加入提前配置好的荧光二抗(每个100μL)，室温孵育4h。最后，用1×PBS 清洗3次，一次5分钟，封片观察荧光染色结果。结果见图5中A、B和C。通过视网膜铺片的Isolectin B4和Ter-119染色，结果表明血管内皮细胞特异性敲除Emc3基因后，视网膜血管发育迟缓，血管密度和血管辐射半径相较于野生型小鼠分别降低约20％和18％。另外，敲除型小鼠的血管出现红细胞的局部渗漏，表现为Ter-119信号出现在血管外。
实施例3
眼球冰冻切片染色和玻璃体血管(hyaloid)分离染色。
(1)眼球冰冻切片制备：将小鼠处死后，取眼球放入4％PFA溶液中室温固定20分钟，随后用 30G针头在角膜中心扎孔，用眼科剪将整个角膜剪掉。将固定好的眼球用1×PBS润洗一次，置于30％的1×PBS蔗糖溶液中，4℃脱水2小时。随后将眼球的晶体取出，吸干水分，将眼球以相同方向置于装有OCT的冰冻切片包埋盒中，-80℃凝固后，-20℃保存。所有切片厚度为10μm。
(2)玻璃体血管分离：取小鼠眼球，置于装有4％PFA的24孔板中室温固定15分钟，随后将角膜扎孔并完全去除角膜，继续放入4％PFA 4℃固定2小时。将固体明胶配置成5％的PBS溶液， 50℃煮至明胶完全溶解。将去角膜的眼球用1×PBS润洗一遍，浸泡在装有5％明胶溶液的24孔板中， 37℃孵育过夜。第二天取出24孔板，放入4℃冰箱，直至明胶凝固。随后，抠出包裹有固体凝胶的眼球，用制备wholemount的方法将巩膜撕去，留下内部晶体和视网膜部分。随后在预冷的载玻片上小心去除晶体和视网膜，只留下hyaloid血管。最后将hyaloid血管小心剪成四叶草形，整个载玻片置于50℃金属浴上，并用免疫组化笔在hyaloid血管周围画圈。在50℃金属浴上用1×PBS对hyaloid 血管进行润洗，尽量去除残余明胶。
(3)冰冻切片和玻璃体血管染色方法：用免疫组化笔在切片/玻璃体血管周围画圈，37℃烘干后，放入免疫组化湿盒中，用1×PBS润洗3次，一次5分钟。每张切片滴加50μL封闭液(同视网膜爬片染色中的封闭液)，室温封闭半小时。随后加入配置于封闭液中的一抗，4℃孵育过夜。第二天取出湿盒，弃一抗，用1×PBS润洗3次，一次5分钟。加入配置于封闭液中的荧光二抗，室温孵育1小时。取出切片，弃二抗，用1×PBS润洗3次，一次5分钟，每个切片滴加10μL Fluoromount 封片剂，盖上盖玻片，即可观察荧光。眼球切片染色结果如图6，由图中可以看出，在小鼠出生后第9天，野生型小鼠的视网膜血管已开始向深层发育，相比而言，敲除型小鼠血管发育仅仅局限于血管表面，发育明显迟缓。玻璃体血管染色结果见图7，可见小鼠出生后第9天，敲除型小鼠的玻璃体血管多于野生型小鼠，表明其退化减缓。
实施例4
小鼠视网膜铺片顶端细胞计数。
视网膜铺片染色后，通过对血管顶端细胞进行详细分析，如图8所示，发现敲除型小鼠视网膜血管顶端细胞数目比野生型小鼠明显减少，数量下降约43％，证实其血管发育较野生型小鼠而言明显减缓。
实施例5
利用Edu细胞增殖实验检测小鼠视网膜血管内皮细胞增殖情况。
取适龄小鼠，腹腔注射2μM的EdU 50μL三个小时后取视网膜铺片，根据视网膜铺片染色的方法进行EdU二抗染色，比较野生型小鼠和敲除型小鼠血管内皮细胞增殖情况。通过EdU染色实验，发现在敲除型小鼠视网膜血管中，处于增殖期的血管内皮细胞数目相较于野生型小鼠明显降低，证明了敲除型小鼠的视网膜血管内皮细胞增殖减缓，增值减缓约33％。(图9)。
通过上述实施例的结果可以明显得看出，选择性地敲除Emc3基因，使其在小鼠血管内皮细胞不表达，可以使小鼠表现出视网膜新生血管疾病的典型特征。由此充分说明，在血管内皮细胞条件性敲除Emc3基因，可以使目标动物表现出视网膜新生血管疾病，该模型可以作为视网膜新生血管疾病模型。用于到视网膜新生血管疾病的发病机制或机理研究中，或用于到药物筛选领域中。
实施例6
构建小脑共济失调小鼠模型，方法如下：
(1)将携带loxp序列的小鼠(Emc3loxp/loxp)与携带Pcp2-Cre的工具鼠交配，获得同时携带loxp 序列和Cre的小鼠，表示为Emc3loxp/+，Pcp2-Cre，接着将Emc3loxp/loxp与Emc3loxp /+，Pcp2-Cre交配，以获得小脑浦肯野细胞条件性敲除Emc3基因小鼠Emc3loxp/loxp-Pcp2-Cre小鼠(图10)。
(2)Emc3loxp/loxp-Pcp2-Cre待小鼠出生后第5天(P5)利用剪趾法给小鼠编号，用50μL的40mM NaOH溶液95℃煮40min溶解组织提取DNA，冷却后加入等体积40mM Tris-Hcl pH5.5溶液调节pH，之后进行基因型鉴定PCR反应(鉴定凝胶电泳图见图11)。鉴定PCR反应条件为：94℃2min，(94℃ 20s，60℃20s，72℃20s)x 34cycles，4℃hold，鉴定PCR反应的引物为：
Emc3-Forward：5’-CCCAGGACGGGGATTATAGTGGTGTG-3’；
Emc3-Reverse：5’-CAAATGACAGCAAACACCACCACCG-3’；
Cre-F：5’-atttgcctgcattaccggtc–3’；Cre-R：5’-atcaacgttttcttttcgg-3’。
(3)鉴定Cre基因型，结果如图11所示。图11结果显示(图中：WT代表野生型小鼠，Het 代表小脑浦肯野细胞条件性敲除Emc3基因杂合子小鼠，Homo(Emc3loxp/loxp-Pcp2-Cre)代表小脑浦肯野细胞条件性敲除Emc3基因纯合子小鼠，在此简称Emc3pKO)。pKO小鼠发育迟缓，体重轻(图 12)。
实施例7
免疫组织化学方法：
小鼠灌注处死后，快速取小脑组织，放入4％的PFA中固定过夜。24h后，PBS缓冲液冲洗3 遍，然后将小脑置于30％蔗糖溶液中脱水直至组织下沉到管底部。OCT包埋并迅速置于干冰冷冻。冷冻后取出OCT包埋的小脑组织，置于冰冻切片机-25℃平衡约30min后切片，切片厚度为10μm。选取质量较高的片子于37℃烘箱放置15min，然后用免疫组化笔沿着有脑组织的地方画圈，PBS洗三遍以去除OCT，然后5％的正常驴血清(含有0.25％Triton)封闭通透21h，孵育适当稀释的一抗， 4℃过夜。第二天，PBS清洗两遍后，孵育相应的荧光二抗，然后再用PBS清洗三遍，封片，观察。
实施例8
利用构建的Emc3基因敲除小鼠模型进行小脑共济失调研究
1)Emc3pKO小鼠出现小脑共济失调症状
对Emc3pKO行为观察以及后肢紧抱实验(Hind-limb clasping test)表明行为观察Emc3pKO小鼠有小脑共济失调的症状。具体表现为步态不稳，提起尾部后肢蜷缩(图13中A，B)。与对照比较，行走时步幅小(图13中B，C)。转棒实验揭示Emc3pKO鼠不能在旋转棒上保持平衡(图14)。
2)Emc3pKO小鼠小脑萎缩
对敲除小鼠的小脑进行了解剖，发现敲除小鼠小脑萎缩，浦肯野细胞数目减少(图15)。
3)Emc pKO(简称为pKO)小鼠小脑浦肯野细胞减少
对敲除小鼠的小脑进行了冰冻切片、免疫组织化学染色分析，对浦肯野细胞标志蛋白 Calbindin-D28K染色，发现KO鼠小脑中在出生后63天(P63)时敲除小鼠中浦肯野细胞开始死亡 (图16)。图中Calbindin是指对浦肯野细胞标志蛋白；DAPI是指4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (4',6-diamidino-2-phenylindole)，是一种可以较强结合DNA的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。P63 是指63天龄。
4)Emc3pKO小鼠小脑浦肯野细胞出现内质网应激(ER stress)
为探明浦肯野细胞死亡原因，对Emc3KO敲除小鼠的小脑冰冻切片做免疫组织化学染色分析。由于Emc3与内质网蛋白转运相关，因此它的缺失可能会引起细胞内内质网转运紊乱，引起内质网应激。因此我们对小脑冰冻切片做内质网应激标志蛋白PDI染色，发现在出生后63天时，Emc3KO 小鼠浦肯野细胞PDI的表达量明显增加(图17)。图中P63是指63天龄。与野生型对照比较，Emc3 KO小脑组织中内质网应激蛋白标志PDI表达增加(图17)。Emc3敲除后会导致内质网应激。细胞出现内质网应激后会激活细胞凋亡相关通路，最终导致细胞凋亡。
综上所述，本发明实施例首次构建了在小脑浦肯野细胞特异敲除Emc3基因的小鼠模型，该模型表现出小脑共济失调的典型特征：步态不稳，小脑萎缩，浦肯野细胞进行性凋亡等。该模型可用于小脑共济失调的研究。
总之，本发明提供了一种新的构建视网膜新生血管疾病模型的方法，通过该方法构建的模型具有典型的视网膜新生血管疾病特征。该模型可用于视网膜新生血管性疾病的发病机制研究中，丰富视网膜新生血管疾病的理论基础；该模型可以辅助视网膜新生血管疾病治疗手段的研发，在视网膜新生血管疾病发病机制研究中该模型可提供治疗或预防的靶标，同时该模型可作为治疗药物验证的实验动物对象。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川省人民医院
<120> 基于基因操作策略构建疾病模型的方法和应用
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tctcaatttc aaaggcacac aaagcatgta ttcacagaca tacacaaaaa taaaataatt 4740
tttaaaagat gtcctttatt gtaaagcatt tttttgatac agcacgaatt aacattagcc 4800
tgaatagtca caaaaatgga aatgtgctat tttacattat ttaactttta ctgggttgaa 4860
atttagctgt ggaccagata cagtggcata tgactttagt ctcagcactt gagaggcaga 4920
ggcagatggg tctcttaaat ttgaagctag ccaggtctaa atagtgagtt ctaatccaac 4980
caggactata aagtgagacc ttcccttaaa aatgagaaaa ttaactgtaa ctcttttgta 5040
aaatgtataa accagaaatg aaatatacat gaatagaatt atcctacagc tggagactat 5100
atgtgtatgt gtgtgtgagt atatatatgt gtgtgtgtgt gtgtatgtat gtgtgtatgt 5160
gtgtgtatat atatatatat atatatactc acatttctca aactcagaat atattgattt 5220
gttagagaga aaaaaaaaca aaacagattc ttgaggattg ggtgaaatat actaaaagct 5280
aagctgtggg cgtgagaagt acagctggta cctacccaac actgagttca atacctacaa 5340
cctatgtggt agaatgagaa aaccaacttc tgcaggctgt cctctgacct ccagatgtac 5400
cccatgatgt gtgcaacacc ctatcctaaa taaatgtata tatgtatttt ttaaaaacta 5460
aagttttgct acatataatg gtatgcgctt taatcccagt attcagaagg ctgaggcata 5520
aagatcataa attcaagagc agtgtggtgg ttcgaatagg cgtgacccta gtagactcgt 5580
gtgaatgctt agcccataga gagtagtgct gttaggaggc gtagccttgt tagtgtaggt 5640
atgggcttgt tggaagaggt ttgtcactgg gtaattaggc tttaaggttt cctaatttca 5700
agctacacct agtgtggcat acagtctcct tctgctgcct ttgggtcaaa atatagaact 5760
gtttgcttct ccaacaccat gcctgcctgg acacctccat ggttgtgatg gtaatggact 5820
aaaccgcaga aactctaagc tagccctcag taaatgtttt tctttataag agttgcctca 5880
ctgggcagtg gtggtgcaca cctttaatcc cagcacttgg gaggcagagg caggtgggtt 5940
tctgagctca aggccaacct gatctacaga atgagtttca ggtcagcctg ggctacacag 6000
agaaaccctg tctcaggaaa aaaaaaaaaa aagagttgcc tcggtcatgg tacctcaaaa 6060
accctaacta agacaagcag cctatgaaat ttaaaaacaa aaacaaaaaa cagtacagca 6120
ctacatagtg ggtttttttt tttcctatcc taaaataatg tcttttaatt tcaaattacc 6180
aagcctaccc agtacaaaga cttagttact cttagatatt tataaaaaat aaaatgcaaa 6240
actagtgttt ttgtgtggaa tttttacact caggagaata cagtcatggc tgtcagcttc 6300
agaactcaag catcaggagt acacagctaa gtcagccttc ccctgatcac caccctcagc 6360
ctcaactcta cagctcctca gtagtgtcag tgtaagagct tagctggggt cttgccatct 6420
gagtgtctgg gaaagccctg acttaccacg cagtgaagaa gcctacaggt ggctagcgct 6480
gtgccctaca ctctggggag gtacaaaaca aggcagtggc aagcctctgc tctaataaga 6540
gtttcagtcc aagtgataaa acaggcaaaa agaaaaataa tagatgccac caacccagga 6600
tgtgcccggt ccaactgtga acacttcaca tgagatgaga atgccagcaa gctggctcag 6660
tgttgggtaa atgtggtcac caagcctaac caatgacctg agcttgatcc cgagtacaca 6720
tggtagcaag agagacccga ttcctgcgag ttgtcctctg acatgcacaa tagcatgcgt 6780
gcacgtggac acacacatta aataaatgtt aaaaataaac tcactgagat ggtgtagaca 6840
gactcagctt aaattccttt aaacttctta caagatcatg gccttatatc atgggtccca 6900
cattgccttg aatagttcgt ttttgtttgt ttttaatgtg cctgagtgtt ttgcctacat 6960
gtatgtaatg tgtaccacgg gtgtgcctag tgccctcaga gttcagaagc ggaagttgaa 7020
actggaatta cagatgattg aaagacaaca tgtaggtgct ggcaaccaaa cccaaatcct 7080
ctacaagagc aggaagttct cttaaccact gagccatctc ttcagccctc actctgcatc 7140
ttgcccacct cttcttgctc atttcctctc gtgtatggcc tgtcctcagc cagagtgttg 7200
attttgttac agcgcccata cctgtgacat gccgtggtgc tttggcaagg taattcccac 7260
tcatccttaa gattcctacc tatgggactg gcaagatggc tcagtggtta agaacatgtg 7320
ttgttcttgc agaggatcaa tgcccagcac ccacatggta gcacagcatg tgttacaacc 7380
ttacatacaa ggagatcttc tggcttccaa gggcacaagg cacacaggta gtatacagat 7440
atatagtcaa acaaaacatg catatacgta aaataaaata aaaagaaata aaataaaaca 7500
acaaaagatt cctacttaat cctacattct aagtagggat tcctcttgta cagcatcctc 7560
tatcatacac tcccataatg ccacctcgtt ctccaggatg tgatggctca atttcacatt 7620
tgttcctata gttaggatct tcttttttta ggtaatatgt catgtagctc aagcagtcct 7680
caaacttgct atatactgaa ggacgctgcc acctcccagg acggggatta tagtggtgtg 7740
caatcacact gtttgttgaa tttcttcctt taaacatcag gggaatgtac atttttatcg 7800
ttgtttatgg tactcacatg gtatcggaca gaaggttaag aaatttgtat gcagtaaaag 7860
ccagattgga cagattgtga agggcagttt agggaattaa catgacttgc ccaagatcac 7920
agtttataag tcacagaagg ccaggcacag tggcacacac ctttactccc agtttttgaa 7980
aggtagaagc aggcagattt ctgtgagttc gagcccagcc agggctccat agtgagactg 8040
tataaaaccg tataaaacta gcagagacag aatctgaata aggacaaatg attataaaag 8100
tctccaaatt tttaatattt ttattactgg tttatgtgtg tgggtattgt gcttgcttgt 8160
atgtctgtgt gcacgcagtg cctgaggagt ccataaaaga gcactggact ccctggaact 8220
agagttagat agttgtgtgc tgccatgtgg gtgctaggac ttcgactcag gtcctctgga 8280
agagtagtca aagtgcttaa ctatgagcca tctctccagc cccaagccca tattcttact 8340
ctctgtctga acttagcttt tcacagaata gacttggtcc agagttcatt catggactat 8400
ttgtagccga ctcccaggaa acagaacata tcacacctct ttcctgtagg cctgtgtaag 8460
gcagacagct gtggacaatc acgaggctga gaggagggaa cgcaggtgga gttcttggga 8520
agagtttgtg tggaagatga ctcaaggaag gaagtgaggt gggtggggtg ggactggcag 8580
gaaaggctgg catctgggca tgtggaaggt gccagccgac cccactggct ctgacgactt 8640
ggagcatgtg gctcgtgctg agcaggagcg agaaagctta gcgtggcttt cttgtatgca 8700
tttctgccta cagttttctc acttctcaag actttccatt gacccaaggg ctcttcccct 8760
ctccctccat taaataactt ttgaaaaccc aggggaaagt atggtatttt tatttctgtt 8820
gcatattatt tgttctaaaa aatcaccaat aatgtattca gtaactgtta aagagtgaga 8880
aggaagctgg tctgggccct gggtagaatt tctctctgtt atctgtcagg taactcagaa 8940
atgaggcctg tcctcatttc tctgaatgaa tgaggaagtt cctcttttac cttcaccttc 9000
ctcctaaccc tgcctccaat ctcagagcac tctccagcta ctctttcctt acaaggagag 9060
ttcctttgtg tctcccgtca aatccagaaa ggccaagtgt aatgtcccca attgccttcc 9120
tcagaaacct ttatttgttc agagcccagt cactctggaa gactgccttt gtgaaaacct 9180
gtgtggcaag ttgaatatgt ttcattgatt tttagggttt ttggaaagtt tccacaccca 9240
gcttttgcca accaggtcct cccttatgtc tgagtgggcc ttctacttta cgcttgcttt 9300
ctttgcgttt cacattttaa catctctttg tcttgtgttt ttcagtcagg tcctaattcg 9360
aagcagagtc ctcagggaaa atggaaaata cattcccaag caggtactca ctgatatttt 9420
atttagaggc tccaccattc acctgtaagg gcagtaaaaa cctaaatgtt tttttataag 9480
aggatgccag agaaaactgg aggtggccat ccagttatta agctgcagcc tggtggtgtt 9540
tgctgtcatt tgccctcacc cttcttagga aattgttttt aaatgtgact cagctaaagt 9600
gtcagattgg ctgccaagga gcctgacagc tcagagtgta taagtgtatt ccaagggcct 9660
ttagtcagtt ccctggggga taatttggca atttactatg tcacaactct catatttaaa 9720
aaaggttttc ttttttttct gctagtcttt cttaacacga aaatattact tcaacaaccc 9780
agaggatgga tttttcaaaa aaacaaaaag gaaggttgtg ccaccttccc ccatgacagg 9840
tatgtttatt caccatgggt ggttgagtat gaagtcccag gagacagtca tgtaaaggac 9900
ttggaaacca tctaactatc tctgggctgt gagggagtgt tgattttttg aggcttcgtg 9960
cagtgtccag gatggaagcc aaggcctaat acatgcaagc actctcccgc ttaggtgcat 10020
ccccagcccc taatatagga gtccttgaaa gtggggctcg gtttttccaa tcaatccaca 10080
aatcctagtt tatcgaactc tttgttcggt gctgtaggaa cttgggagca gttcctaccc 10140
agtgtctaga tcgttgctgg aagcttgtgc ccaaatgaag agcagttgcc ccttgattgc 10200
ccacaccaac atacagtttg tgacctagct gatatatgac tgctgccacc cccgttttgt 10260
gaaaagtgac tatgtaaagt ggacaaaagc agtgttggcc ttctctcttt ccagtctctt 10320
ccttctaggt gagataatca gcccttctga tcctacagaa gatactagtg ttaacactta 10380
ggggcaacaa aatgtccgtg tacatatgaa aaagatggtc gcctcactag tccaggggtg 10440
caaatcaaag caagatttag tccttttagt ctgttaaacc aaagagtaaa gctgttcaaa 10500
gccatggttg tcaaggcctt gttatgactt gaaactctac ccctactcca accccccaaa 10560
aagaattact ctttagaaac acataaataa gacattggtc tgttacctct tacaaggtag 10620
gtagcagcag cactccctgg tggaaaggct gagaatgaaa atattgagag atctggggct 10680
ggaggggtga ctcgcactta aaagcacttg ctgtttttgc agaggaccca ggttcagttc 10740
caggctccca tatgacagct cacaactgtc tataactcca gtcccagaga atctgatgcc 10800
ttttctggcc tttgcaagag gccatgatgc acagatagat atatgtaggc aaaacaacaa 10860
cgggtatttt tttaatcttt aaaaaatatg tatgtatctt gagagattgg taccatgaca 10920
atgtgaaaat gtcatcaaaa attatttttt cttttttggt attgagaact gctctgcaca 10980
ctcctgcatg gtaagcagtg ctctgcccct gagctacatc gtcagccttt cttcataaaa 11040
ttaattttca aaaacagatt gaaaggtaga aagatatgga acagggctgg agagatggag 11100
agagcagtta agagcactga ctactcttcc gaaggtcctg agttcaaatc ccagcaacca 11160
catggtggct cacaaccatc tgtaatgaga tcggatgccc tcttctggtg tgtctgaaga 11220
cagctacatt gcactcctat acataaaata aatctttttt ttaaaaaaga aagaaagaaa 11280
gatatgctac agagaactca aaggatttca ggagagggta gagaggaatt gtctgcatct 11340
tatgttctga gatcatttga acttgtacag taaacctgac ggctggcccg ctatgctggc 11400
acatgcctct ttcaccctac agtcagaaag cagtgacagg caaacctctg ttagtcaagg 11460
ccagctgggc tacacagtaa gatcctgtct taaaaacaac tgtctgcctt aaatttgtga 11520
agtctctgcc aacaaaggga aacgtggtgt tttcttctgt gtttgtctca gaccccacca 11580
tgctcacaga catgatgaaa gggaatgtca caaatgtcct cccaatgatt cttatcggcg 11640
gatggatcaa catgacgttt tcaggctttg tcacaagtaa gtctcaggtc tgggagacct 11700
cctacgtcct tcacccaggt ccctttctca gtgctactga gaacctaatg tcacctcgcg 11760
ggtagtatgt tttcttgtga aaataacatc tttttgaaca aaaatcttga gttctaacct 11820
gactcagagt tcccagggtg atgctttgta agtagggtga cacaggaggc tttagtgcac 11880
gcttctccca aatgtcaggt catgcttcat cctgggtacc tgcttgctcc atggtctaga 11940
aactgtcatc cctcagggaa atcagagcag agtgacattt tagctgttct ggtctcccta 12000
cgctgctacc aatttccttg tgaaaatcat tttccagaag ccagtggcac agagttccca 12060
cctcctctgg gaaagaatgt gtgttcacac ttcagctggc tcaggtacct accatggttt 12120
gaggcaaaca cttggtgttt ttttctttgc ctacagctaa ggtcccgttt ccactgacac 12180
ttcgcttcaa gcctatgctt cagcaaggaa tagagctgct cacactagac gcatcctggt 12240
aagcgtggtg tctaaagagg ccgctggccc cacagttcta gtttccattc cactagaatg 12300
aggttgtttc tgtttgagaa atcttgactc ttctttcttc tctccctctc tctctctctc 12360
tctctctctc tctctctttc tctctcttaa atgaaagctc tatttgaaat gccactgcta 12420
gactaaaaca gttttacagg agtcttgcca aaagaaggtt tgttagcctc tcttcttaga 12480
tcttaacaat gtaggagtga aggtatggaa aggttaagta gtctggccaa gcagagcttc 12540
ttaacaatgc cctacagctt atgagaatgg agcctgtgtt tgtcagctct ctgtcactga 12600
aacactgaga gcatcacctt gcgaagaaga gtattttgta ttttggctca ccgttttgga 12660
ggctcgtgtc acgaacctgt agtctcagtg ctttggatct gtgatgcagc agggtgtggc 12720
agtgccatat aatgaaggtg aatgctcccc atagggtcag aacaagagag aaagatgaag 12780
tattcagact cctacaatct cctccaagaa cacctccacc cctgtgacct aaaactgccc 12840
aataggcatc catctcctaa aggtcccccc actgtccatt agtaccacag actggggccc 12900
aagcctttag tacatgagct tgtttgtttg cttgttttgc tttttgtgag acagactcta 12960
catagtcctg gctgtcttgg aactcatgtg gaccaggctg gcctggaaat cacagcaatc 13020
tatatgcctc tgttctgcct cccaagtgat ggaattaaag gcatgtgcca tcatatcagg 13080
ctaacacatg ggcttttaaa aagaacattc tagatccaaa ttatagaaaa gtttgtactg 13140
tcattttcct tagttccagt tagcctcaca gcaaccctgt gaggtctgca aatgtaatgg 13200
tggtccacac acaacttttc cataaccagt acttgcacct ctttctactc cagtgactta 13260
gagcagaaca cccagctgga atctaaaagc cctcttgaga aacactggca tgatacccaa 13320
agtacagtaa cactgactcc tgtggtcctt ccgggctgtt ctgtctgtag cttctcaaga 13380
actggcctga aacaaactcg aacaagaaga agaagaggag ggtctggtgg caatttagac 13440
ttctctggtt tgagtagagc catctctggt tgtatgaacc cagggcaaag aaaatgcctc 13500
accctgctct gtgtgagaag aaaagctacc tgtgagcttt gtgactccgt gaaactattc 13560
cctgccaggc tcactggcta agcataaatg ccagggctgg agaaaagcgt atcttttctc 13620
agcatttgca caggtatgca cctcacgtct gtgggcagac aggggagcca ggcaacgttc 13680
cagtggggct cagtgcttgc ttcagcagac acgcagtaga gtaactgttg tggatagatc 13740
actggcactg caggaccgat gcacccttac agtctatggc agtagccaga gcagacgcag 13800
tgaagcgtcg gtcgctcttc ccatgtgggt agcactcttc attgcccttt ggtttctatt 13860
acatgtaagc acatttatgg cttcccaagt cgggtggtga gataaaggct agacgatcaa 13920
gttccaaatt tgttcaggta gccttcaccc tcatcattgc aaatgcttcc caaaggtcat 13980
gcctggtcct ctccactaag tggggaacac acaaacacac caacactcct aggggatgag 14040
gttcacagta gatggcctct ttcagtgtca cccactgtgc agtgtgtcag aagacagcct 14100
tactgtgcta ctgagcagct gtgggtagtg cagatgtgag cgccgttcac ctccctaata 14160
acccaccgca ctctcccggt tgctttgcta gggtgagttc tgcatcctgg tacttcctca 14220
atgtgtttgg gctccggagc atttactctc taatcctggg ccaagataac ggtaagaagc 14280
agagtgggtt agtgagcagc tgctgcctgc tgggtggggt agtcacctgt ttcctgctgt 14340
tggttagcgc agccccacat agtgctttgg ttggtgagtt tctgaggatg gtcttaacag 14400
atgcaaagct cagactgaac atgggcatct ctccagcagt cactgagcag tacttgctca 14460
gggtctgaca cctttctgta aagacccagc actccgttaa gcctctgacc ctgaagccta 14520
aggaaggacc tggctagatc agttcctgtt ttgagcagct tcctcagcag tgctaaactt 14580
ggctcttgtt cagtgatgag gaccttggac actgttaacc actgattgtt tttctctaca 14640
gtaggtctta atagttacct tatggggtta agtgcagata gaggataaaa cagagaaata 14700
cctgggcaca tagccctgct cagtaattgg tgtctagtgt catattgaca tttaagataa 14760
agtttggagc actttagttt tgtctgtatt ccacttataa tcaccctcat tttcctggac 14820
tttctcagaa tcacatacca gggtgaccag gctagtgagg tgtcccaatt ctcaaaccca 14880
ccaccaagca tctataagtc atgcctattc tcccataagg gtgctgggtg gttatggagc 14940
cttggtactc actgggcctg tcttatgctg cagccgccga ccagtcacga atgatgcagg 15000
agcagatgac aggagcagcg atggccatgc ctgcagacac caacaaagct ttcaaggtac 15060
atgccagaga ctgttcagaa ctgcaggggt atctcagact tacaccagtc ctccctcaac 15120
cacagctcac agttgcttct gttcaagtgc aatccaaatg aacagtatga tgaaatatgc 15180
tgtcctgccc caccctatcc aggacataaa tgatcacttt gtccagtgta tccacactgt 15240
atgtgctgga tgcctcatga cagtgagaga gagaaaccat attcccatta ctttcattac 15300
agtttactca tgttctagtt ttgaaagttt ttttttttta attttatctg cctgtttgtg 15360
cacctaagat tatgtatatc tgtggaccac gtgcatgcag gtgcttatag aggtcagaag 15420
aggcattgca taccctagaa cttgagttat aggtggttac gagctgccgt gtaggtgcta 15480
ggaactgaac ccaggtcctc tacaagagca cttaacagca gagccacccc tccagcccct 15540
ctgtataatg tttatacagc aaagtctcac ttgattaaaa gtaaattaag ggaagttctt 15600
cattctggtt cacaggaata tagaaagacc tcttagagtt tgaggctagc ctatactaca 15660
tgagacctta cctcaaaaaa cagcaaaaca acaaaattct aaaacatgga cataaaatta 15720
aaacacgtct ttgtgatctt gtacaggaca gttttgtttt agtttgaggg ttgttgtttt 15780
ttaatttata tatgtgggta ttgtatatgt tttaactgct gagccccctc tccatggttt 15840
ttgacttttt gagaccgtct cctgcctttg cttctcaagt gctgaaattg tagacatgtt 15900
ccaccatgcc tggccttagt aagcttttaa agattgcttt atgagtattt gtatatctgg 15960
gaggcatatg gacatctctg cttcacacga tccaatgagc tcatacacag aacagccttg 16020
cttagctgct ggtcagagag gtggtcactc catgctgtcc ccagctgtca gctcagtggc 16080
aagcatccct cttagcatcc ctgtgttctc ttcctgtgca gacagagtgg gaagctttgg 16140
aactgacaga tcaccagtgg gcgctcgatg atgtggaaga agaactcatg gccagagacc 16200
tccactttga aggcatgttc aaaaaggaac tacagacgtc catattctaa ccacatgcgg 16260
ggtcagctgt gtccggaact tgcagtagca cttaaccttg taacttccgt ggagctggag 16320
cctctgagaa taaaaaggag ggtgcagggg ctggcgggtg cagcaaggct cattcttgtc 16380
tgagctgggt tcccctttat gttggaaact agaggaaaag gagttgtggg tgactgctgt 16440
cttaaagttt gtgattgttc cttcaggtga ctctagtaag gacgtcagag aaaggggaga 16500
ccccatgcta ctgagaatag ctcaaccctt agcaaaaact ccgtgcttgg aaagagcatt 16560
gtcagttata gcagttacta tgttcggtca gcctgacttc cagccacagt aaactcctgt 16620
tttcttagga tccaaacacc ctgcatttta ccttgaattt cttgtttgta tttttaactt 16680
tctttacaca cgtaatatac ttttctctac cacaatttag aaactatggc tgagcagcac 16740
agcgctcccc gcactgttca cttgagccta caaaggacgc agagaactgg tgtggcccaa 16800
cattgctgaa ataaactctt tgcagagtgg atccccaggg ccggggcaga ctcagcaaac 16860
ttttcatatc tcttcatact tagtccagtg aaaacaggtg accctgaggc acagccagac 16920
tctcaagtgc ctttgggctc atcagagaca ggttacatat acaagttctt gattggaact 16980
tgaggaaata tcaactctat cggccagtca atggtgctgt gctgtaaatg gctactcatt 17040
tgaacgaatg acctcatccc agttcctctg ggcaggagag aacttaccac tgttggggca 17100
agaggacagt ttctggtgga tatgtagatt aaggtgccca ggagtcctct gaccagggaa 17160
gtgttagggt gccatttctg taccaaaagc tgggtgtgtt gcatgttaag cactgtagcc 17220
aagaacaagc gactcttgac tcttaattaa acagccctgt tttctctttg cctgtgaaag 17280
tgttgcttct gtgggttctg aaggggaaag agataagagc ctttgccctc aacaaactca 17340
tagagggggg cgggggatct gtggatgtag cctagtgatg tcagttaaga gtacattatc 17400
cccagaacac acacaaaaga cctcatctga gagaactgct tattttcttt tatctgtatg 17460
agtgtttggc ttgtatcagg tctgtgcccc acatgtgtca gcgcctgcag aggctagaga 17520
gggtggtgag ttccctggaa ctggagttat catgggttgt aagctaccgt gagggtgctg 17580
ggaaccaaac cctggtcctc cacaagagca accagtgctc ttaagcacgt ctctgcatcc 17640
ccaagagaga tctattttga ggtcatagaa cctctgaatc tgatggtcca aagccagggt 17700
gacttgtgag ccatctcaga agcaaacttg atcctgaaag tggggggagg gactaagggt 17760
cagggcttgc agctggggt 17779
Claims (10)
1.基于基因操作策略构建疾病模型的方法，所述模型为动物模型，其特征在于，所述疾病模型为视网膜新生血管疾病模型，通过基因操作技术使Emc3基因在目标动物的血管内皮细胞中不表达或表达受到抑制；
或者所述疾病模型为小脑共济失调疾病模型，通过基因操作技术使Emc3基因在目标动物的小脑浦肯野细胞不表达或表达受到抑制。
2.根据权利要求1所述的基于基因操作策略构建疾病模型的方法，其特征在于，所述基因操作技术为基因编辑技术、基因敲除技术或RNA干扰技术。
3.根据权利要求2所述的基于基因操作策略构建疾病模型的方法，其特征在于，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9技术、ZFN技术或TALEN技术。
4.根据权利要求2所述的基于基因操作策略构建疾病模型的方法，其特征在于，所述基因敲除技术为Cre-loxp基因敲除技术。
5.根据权利要求4所述的基于基因操作策略构建疾病模型的方法，其特征在于，通过基因操作技术使Emc3基因在目标动物的血管内皮细胞或小脑浦肯野细胞中不表达是指：通过Cre-loxp基因敲除技术敲除Emc3基因的第二外显子使Emc3基因在目标动物的血管内皮细胞或小脑浦肯野细胞中不表达或表达受到抑制；
优选地，所述基因操作技术包括如下步骤：
对Emc3loxp/loxp-Pdgfb-Cre小鼠腹腔注射他莫昔芬以诱导Emc3基因敲除；
优选地，Emc3loxp/loxp-Pdgfb-Cre小鼠出生后的第1、2、3、5天进行腹腔注射他莫昔芬；
优选地，每天腹腔注射他莫昔芬一次，他莫昔芬的注射剂量为50μg/只。
6.根据权利要求1所述的基于基因操作策略构建疾病模型的方法，其特征在于，所述目标动物为非人哺乳动物。
7.根据权利要求6所述的基于基因操作策略构建疾病模型的方法，其特征在于，所述非人哺乳动物为小鼠。
8.根据权利要求1-7任一项所述的基于基因操作策略构建疾病模型的方法，其特征在于，所述视网膜新生血管疾病模型表现出如下特征中的至少一种：
(1)表层或深层视网膜血管发育迟缓，优选的，血管发育速度下降18％；
(2)血管密度降低，优选的，血管密度下降20％；
(3)血管顶端细胞数目减少，优选的，血管顶端细胞数目减少43％；
(4)玻璃体血管退化减缓；
(5)视网膜血管内皮细胞增殖减缓，优选的，视网膜血管内皮细胞增值速度下降33％；
或者所述小脑共济失调疾病模型表现出如下特征中的至少一种：
(1)步态不稳，提起尾部后肢蜷缩；
(2)小脑进行性萎缩，小脑分子层逐渐变薄，颗粒细胞减少；
(3)小脑中浦肯野细胞逐渐减少。
9.由权利要求1-8任一项所述的基于基因操作策略构建疾病模型的方法所得到的疾病模型在研究视网膜新生血管疾病或小脑共济失调疾病中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述研究是以非疾病的治疗为目的；
优选的，所述研究为视网膜新生血管疾病发病机制或机理研究或所述研究为筛选治疗视网膜新生血管疾病的药物研究，或者所述研究为小脑共济失调疾病发病机制或机理研究或所述研究为筛选治疗小脑共济失调疾病的药物研究。
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