CN116898970A - Atp5d激活剂与b淋巴细胞在制备药物中的用途 - Google Patents
Atp5d激活剂与b淋巴细胞在制备药物中的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116898970A CN116898970A CN202310831370.9A CN202310831370A CN116898970A CN 116898970 A CN116898970 A CN 116898970A CN 202310831370 A CN202310831370 A CN 202310831370A CN 116898970 A CN116898970 A CN 116898970A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mice
- neurons
- disease
- hippocampal
- alzheimer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 118
- 101000766510 Homo sapiens ATP synthase subunit delta, mitochondrial Proteins 0.000 title claims abstract description 96
- 102100025581 ATP synthase subunit delta, mitochondrial Human genes 0.000 title claims abstract description 93
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 36
- 239000012190 activator Substances 0.000 title claims abstract description 25
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title claims description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 4
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims abstract description 179
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims abstract description 94
- 230000000971 hippocampal effect Effects 0.000 claims abstract description 50
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 claims abstract description 31
- 230000003961 neuronal insult Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000009223 neuronal apoptosis Effects 0.000 claims abstract description 17
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 claims abstract description 15
- 230000006870 function Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 claims abstract description 9
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 claims description 36
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 29
- 210000003710 cerebral cortex Anatomy 0.000 claims description 26
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 11
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 claims description 10
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 9
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 4
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 3
- 206010034912 Phobia Diseases 0.000 claims description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 claims description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 2
- 230000008897 memory decline Effects 0.000 claims description 2
- 208000019899 phobic disease Diseases 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims 1
- -1 small molecule compound Chemical class 0.000 claims 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 187
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 45
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 33
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 27
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 17
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 16
- 238000000034 method Methods 0.000 description 16
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 16
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 14
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 14
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 14
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 108010064539 amyloid beta-protein (1-42) Proteins 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 11
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 10
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 10
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 8
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 8
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 8
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 8
- IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L congo red Chemical compound [Na+].[Na+].C1=CC=CC2=C(N)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3)C3=CC=C(C=C3)/N=N/C3=C(C4=CC=CC=C4C(=C3)S([O-])(=O)=O)N)=CC(S([O-])(=O)=O)=C21 IQFVPQOLBLOTPF-HKXUKFGYSA-L 0.000 description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 8
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 7
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 7
- 238000003501 co-culture Methods 0.000 description 7
- 238000010149 post-hoc-test Methods 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- 102100023174 Methionine aminopeptidase 2 Human genes 0.000 description 6
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 6
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 6
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010064397 amyloid beta-protein (1-40) Proteins 0.000 description 5
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 5
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 230000003920 cognitive function Effects 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 238000012549 training Methods 0.000 description 5
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 4
- 101000979001 Homo sapiens Methionine aminopeptidase 2 Proteins 0.000 description 4
- 101000969087 Homo sapiens Microtubule-associated protein 2 Proteins 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 238000012347 Morris Water Maze Methods 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 4
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 4
- 230000003930 cognitive ability Effects 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000015654 memory Effects 0.000 description 4
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 3
- PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N Isoflurane Chemical compound FC(F)OC(Cl)C(F)(F)F PIWKPBJCKXDKJR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 239000007894 caplet Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000010832 independent-sample T-test Methods 0.000 description 3
- 229960002725 isoflurane Drugs 0.000 description 3
- 206010027175 memory impairment Diseases 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002241 neurite Anatomy 0.000 description 3
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 230000006886 spatial memory Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003371 toe Anatomy 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 2
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 2
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000608935 Homo sapiens Leukosialin Proteins 0.000 description 2
- 102100039564 Leukosialin Human genes 0.000 description 2
- 108090000192 Methionyl aminopeptidases Proteins 0.000 description 2
- 108010019160 Pancreatin Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 2
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000007529 anxiety like behavior Effects 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 2
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 2
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 2
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- ADEBPBSSDYVVLD-UHFFFAOYSA-N donepezil Chemical compound O=C1C=2C=C(OC)C(OC)=CC=2CC1CC(CC1)CCN1CC1=CC=CC=C1 ADEBPBSSDYVVLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000556 factor analysis Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- ASUTZQLVASHGKV-JDFRZJQESA-N galanthamine Chemical compound O1C(=C23)C(OC)=CC=C2CN(C)CC[C@]23[C@@H]1C[C@@H](O)C=C2 ASUTZQLVASHGKV-JDFRZJQESA-N 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000003205 genotyping method Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 2
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000006386 memory function Effects 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 229940055695 pancreatin Drugs 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 2
- 208000020016 psychiatric disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 2
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 201000000980 schizophrenia Diseases 0.000 description 2
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 2
- 238000010008 shearing Methods 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000031836 visual learning Effects 0.000 description 2
- HPOIPOPJGBKXIR-UHFFFAOYSA-N 3,6-dimethoxy-10-methyl-galantham-1-ene Natural products O1C(C(=CC=2)OC)=C3C=2CN(C)CCC23C1CC(OC)C=C2 HPOIPOPJGBKXIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010175 APPswe/PSEN1dE9 Methods 0.000 description 1
- 102100027782 ATP synthase-coupling factor 6, mitochondrial Human genes 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 208000000044 Amnesia Diseases 0.000 description 1
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 1
- 102000017927 CHRM1 Human genes 0.000 description 1
- LPCKPBWOSNVCEL-UHFFFAOYSA-N Chlidanthine Natural products O1C(C(=CC=2)O)=C3C=2CN(C)CCC23C1CC(OC)C=C2 LPCKPBWOSNVCEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150073075 Chrm1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 206010067889 Dementia with Lewy bodies Diseases 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000936965 Homo sapiens ATP synthase-coupling factor 6, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 241000581650 Ivesia Species 0.000 description 1
- 201000002832 Lewy body dementia Diseases 0.000 description 1
- 208000026139 Memory disease Diseases 0.000 description 1
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 1
- 208000036110 Neuroinflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 206010034719 Personality change Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- 201000004810 Vascular dementia Diseases 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 239000003194 amino acid receptor blocking agent Substances 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 210000000709 aorta Anatomy 0.000 description 1
- 101150031224 app gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000003935 attention Effects 0.000 description 1
- 210000004227 basal ganglia Anatomy 0.000 description 1
- 238000010009 beating Methods 0.000 description 1
- 230000006741 behavioral dysfunction Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 239000002771 cell marker Substances 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000000544 cholinesterase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007278 cognition impairment Effects 0.000 description 1
- 230000037410 cognitive enhancement Effects 0.000 description 1
- 230000007370 cognitive improvement Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011970 concomitant therapy Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000011461 current therapy Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000005220 cytoplasmic tail Anatomy 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 210000003520 dendritic spine Anatomy 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 229960003530 donepezil Drugs 0.000 description 1
- 238000012137 double-staining Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000008451 emotion Effects 0.000 description 1
- 230000006353 environmental stress Effects 0.000 description 1
- DZGCGKFAPXFTNM-UHFFFAOYSA-N ethanol;hydron;chloride Chemical compound Cl.CCO DZGCGKFAPXFTNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 229960003980 galantamine Drugs 0.000 description 1
- BGLNUNCBNALFOZ-WMLDXEAASA-N galanthamine Natural products COc1ccc2CCCC[C@@]34C=CCC[C@@H]3Oc1c24 BGLNUNCBNALFOZ-WMLDXEAASA-N 0.000 description 1
- ASUTZQLVASHGKV-UHFFFAOYSA-N galanthamine hydrochloride Natural products O1C(=C23)C(OC)=CC=C2CN(C)CCC23C1CC(O)C=C2 ASUTZQLVASHGKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000010247 heart contraction Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000002874 hemostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000008812 hippocampal apoptosis Effects 0.000 description 1
- 210000003957 hippocampal ca2 region Anatomy 0.000 description 1
- 210000001661 hippocampal ca3 region Anatomy 0.000 description 1
- ZRJBHWIHUMBLCN-SEQYCRGISA-N huperzine a Chemical compound N1C(=O)C=CC2=C1C[C@H]1/C(=C/C)[C@]2(N)CC(C)=C1 ZRJBHWIHUMBLCN-SEQYCRGISA-N 0.000 description 1
- 208000013403 hyperactivity Diseases 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 210000003715 limbic system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- IYVSXSLYJLAZAT-NOLJZWGESA-N lycoramine Natural products CN1CC[C@@]23CC[C@H](O)C[C@@H]2Oc4cccc(C1)c34 IYVSXSLYJLAZAT-NOLJZWGESA-N 0.000 description 1
- 238000007886 magnetic bead extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- BUGYDGFZZOZRHP-UHFFFAOYSA-N memantine Chemical compound C1C(C2)CC3(C)CC1(C)CC2(N)C3 BUGYDGFZZOZRHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004640 memantine Drugs 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000006984 memory degeneration Effects 0.000 description 1
- 208000023060 memory loss Diseases 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 230000000051 modifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003959 neuroinflammation Effects 0.000 description 1
- 230000007658 neurological function Effects 0.000 description 1
- 230000019581 neuron apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000004693 neuron damage Effects 0.000 description 1
- 230000016273 neuron death Effects 0.000 description 1
- 230000004112 neuroprotection Effects 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000008529 pathological progression Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000003938 response to stress Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- GWHQHAUAXRMMOT-MBANBULQSA-N rivastigmine tartrate Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O.CCN(C)C(=O)OC1=CC=CC([C@H](C)N(C)C)=C1 GWHQHAUAXRMMOT-MBANBULQSA-N 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 230000011273 social behavior Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- 238000002636 symptomatic treatment Methods 0.000 description 1
- 230000003976 synaptic dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本申请公开了ATP5D激活剂在制备药物中的用途，所述药物具备以下任一项或多项功能：1)治疗/预防阿尔茨海默病；2)抑制神经元损伤；3)使神经元形态紧密、排列规则；4)增加海马区颗粒层厚度。本申请还公开B淋巴细胞在制备药物中的用途，所述药物具备以下任一项或多项功能：1)治疗/预防阿尔茨海默病；2)保护神经元；3)减轻神经元损伤；4)促进受损海马神经元轴突生长；5)减少神经元丢失或凋亡；6)增加神经元数量；7)增加神经元和树突积分密度；8)使神经元形态紧密、排列规则；9)增加海马区颗粒层厚度。
Description
技术领域
本说明书涉及医药技术领域，特别涉及ATP5D激活剂在制备治疗/预防阿尔茨海默病的药物中的用途。
背景技术
阿尔茨海默病是目前世界上最严重、分布最广泛的神经退行性疾病之一。阿尔茨海默病是一种退行性脑病，其临床特征为进行性记忆力损伤、混淆、行为障碍，生活不能自理，逐渐发生物理性恶化，并最终导致死亡。全世界约有一千五百万人罹患阿尔茨海默病，预计随着人类寿命延长这一数字还将大幅攀升。阿尔茨海默病的组织学特征为在联合皮质、边缘系统和基底神经节中出现神经斑块。这些斑块的主要组成成分是β淀粉样蛋白前体蛋白(βAPP或APP)的裂解产物β淀粉样蛋白肽(Aβ)。APP是I型跨膜糖蛋白，含有较长的异位N末端域、跨膜域和较短的胞浆尾C末端域。21号染色体上的单个APP基因的转录产物的替代性剪接可产生多种具有不同氨基酸数目的亚型。
当前疗法主要是针对与阿尔茨海默病有关的症状进行对症治疗，尚无任何方法可治愈阿尔茨海默病。
发明内容
鉴于上述现有技术的缺点，本申请提供ATP5D激活剂在制备药物中的用途，所述药物具备以下任一项或多项功能：1)治疗/预防阿尔茨海默病；2)抑制神经元损伤；3)使神经元形态紧密、排列规则；4)增加海马区颗粒层厚度。
本申请还提供B淋巴细胞在制备药物中的用途，所述药物具备以下任一项或多项功能：1)治疗/预防阿尔茨海默病；2)保护神经元；3)减轻神经元损伤；4)促进受损海马神经元轴突生长；5)减少神经元丢失或凋亡；6)增加神经元数量；7)增加神经元和树突积分密度；8)使神经元形态紧密、排列规则；9)增加海马区颗粒层厚度。
本说明书提出的ATP5D激活剂和B淋巴细胞在制备药物中的用途，带来的有益效果包括但不限于：药物中ATP5D激活剂能够：1)治疗/预防阿尔茨海默病；2)抑制Aβ诱导的大脑皮质和/或海马神经元损伤；3)使神经元形态紧密、排列规则；4)增加海马区颗粒层厚度；5)增加阿尔茨海默病个体大脑海马CA2区总神经元数量；6)减少阿尔茨海默病个体大脑皮质和海马CA1、CA2、CA3、DG区黑色神经元数量；7)减轻或逆转阿尔茨海默病个体的认知功能障碍。药物中B淋巴细胞能够：1)治疗/预防阿尔茨海默病；2)保护神经元；3)减轻神经元损伤；4)促进受损海马神经元轴突生长；5)减少神经元丢失或凋亡；6)增加神经元数量；7)增加神经元和树突积分密度；8)使神经元形态紧密、排列规则；9)增加海马区颗粒层厚度。
附图说明
本申请将以示例性实施例的方式进一步说明，这些示例性实施例将通过附图进行详细描述。这些实施例并非限制性的，其中：
图1为根据本申请一些实施例所示的ATP5D可以抑制Aβ诱导的皮质神经元损伤结果图，图1A-图1C：Tuj1和Caspase3的免疫荧光染色WT、ATP5D KO、ATP5D KI的正常、DMSO、Aβ-40μM处理后皮质神经元，标尺＝50μm；图1D-图1E：定量检测WT、ATP5D KO、ATP5DKI的正常、DMSO、Aβ-40μM处理后皮质神经元凋亡和轴突长度。
图2为根据本申请一些实施例所示的ATP5D可以抑制Aβ诱导的海马神经元损伤结果图，图2A-图2B：Tuj1和Caspase3的免疫荧光染色WT、ATP5D KO、ATP5D KI的正常、DMSO、Aβ-40μM处理后海马神经元，标尺＝50μm；图2C-图2D：定量检测WT、ATP5D KO、ATP5DKI的正常、DMSO、Aβ-40μM处理后海马神经元凋亡和轴突长度。
图3为根据本申请一些实施例所示的ATP5D可以改善AD小鼠认知功能结果图，图3A：AD小鼠与ATP5D KO/KI小鼠交配，后代为AD+ATP5D KO和AD+ATP5D KI的转基因小鼠；图3B：ATP5D的相对表达量在WT、ATP5D KO和ATP5D KI小鼠皮质和海马的检测；图3C：WT小鼠、AD小鼠、ATP5D KO小鼠、ATP5D KI小鼠、AD+ATP5D KI小鼠和AD+ATP5D KO小鼠水迷宫实验检测穿台次数和总路程；图3D：Y迷宫实验检测WT小鼠、AD小鼠、ATP5DKO小鼠、ATP5D KI小鼠、AD+ATP5D KI小鼠和AD+ATP5D KO小鼠进入新颖臂次数和交替百分比；图3E：旷场实验检测WT小鼠、AD小鼠、ATP5D KO小鼠、ATP5D KI小鼠、AD+ATP5D KI小鼠和AD+ATP5D KO小鼠站立次数和站立时间，M：月，WT：野生型，AD：阿尔茨海默病。
图4为根据本申请一些实施例所示的ATP5D可以减少9月龄AD小鼠凋亡神经元和斑块数量结果图，图4A：6E10酶组化染色的全切片扫描观察WT，AD和ATP5D KO，ATP5D KI，AD+ATP5D KO，AD+ATP5D KI中总Aβ斑块的沉积，左侧为右脑全景图，标尺＝1mm，红色箭头为红色放大框的斑块位置，标尺＝50μm。图4B-图4C：定量分析总斑块的面积比例和数量在皮质和海马CA1，CA2，CA3和DG区。
图5为根据本申请一些实施例所示的ATP5D可以减少9月龄AD小鼠凋亡神经元和斑块数量结果图，图5A：为WT小鼠、AD小鼠、ATP5D KO小鼠、ATP5D KI小鼠、AD+ATP5DKI小鼠和AD+ATP5D KO小鼠大脑皮质和海马HE染色，标尺为50μm。黑色箭头为正常细胞，红色箭头为损伤细胞，左边为右脑全景图，标尺为1mm；图5B：尼氏染色的全切片扫描观察WT小鼠、AD小鼠、ATP5D KO小鼠、ATP5D KI小鼠、AD+ATP5D KI小鼠和AD+ATP5D KO小鼠中总神经元和黑色神经元，左侧为右脑全景图，标尺＝1mm，黑色箭头为正常神经元，红色箭头为黑色神经元，标尺＝50μm；图5C-图5D定量分析总神经元和黑色神经元数量在皮质和海马CA1，CA2，CA3和DG区。
图6为根据本申请一些实施例所示的脾脏B细胞的培养和鉴定结果图，培养2、7、20、31、52、70h时，明场图像显示B细胞形态；CD19荧光染色检测B细胞纯度，绿色荧光表示CD19阳性细胞(B细胞标记物)，蓝色表示DAPI染色的细胞核，标尺＝100μm，H：小时。
图7为根据本申请一些实施例所示的提取年轻和老年B细胞与海马神经元共培养实验流程图和结果图，图7A：取小鼠脾脏，剪碎组织后加入红细胞裂解液获得纯的单个核细胞，加入小鼠CD43磁珠进行阴性分离，获得纯度较高且活力未受影响的非接触B细胞；图7B：钙黄绿素染色检测年轻(2～4月龄WT小鼠)和老年(15月龄AD小鼠)B细胞活性，绿色代表活细胞，红色代表死亡细胞，标尺＝100μm；图7C：柱状图显示年轻B细胞和老年B细胞(n＝5)的细胞存活率(活细胞百分比)和细胞死亡率(死亡细胞百分比)，主要数据采用独立样本t检验进行分析；图7D：CCK8法检测培养第7、14、21天年轻和老年B细胞(n＝5)的细胞活性。主要数据采用独立样本t检验进行分析；图7E：检测Aβ-40μM处理的神经元与不同密度的B细胞(1×103、5×103、5×104和5×105/200μl)共培养后的细胞状态，标尺＝100μm；图7F：Aβ-40μM处理的海马神经元细胞数，与1×103、5×103、5×104和5×105/200μlB细胞共培养的细胞数，n＝5，采用单因素方差分析和post hoc检验对原始数据进行分析，与Aβ-40μM相比P<0.001；图7G-图7H：免疫荧光染色显示正常组、Aβ-40μM组、青年B细胞组和老年B细胞组之间海马神经元的凋亡和轴突长度，白色箭头代表轴突，标尺＝50μm，n＝5，数据用单因素方差分析，然后进行post hoc检验。RBC：红细胞裂解物；D：天。
图8为根据本申请一些实施例所示的不同浓度Aβ干预的海马神经元的结果图，图8A：明场图像显示不同浓度的Aβ1-42寡聚体(10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM和200μM)干预的海马神经元的形态；图8B：不同浓度的Aβ1-42寡聚体(10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM和200μM)干预的海马神经元的细胞数量的定量，标尺＝100μm，n＝5。
图9为根据本申请一些实施例所示的尾静脉注射年轻B细胞后AD小鼠的行为分析结果图，图9A：从2-4个月大的WT小鼠的脾脏中提取单个核细胞，进行非接触B细胞磁珠提取。通过尾静脉注射将重悬的B细胞以5×105/200μl注射到9个月大的AD小鼠中；图9B：PKH26试剂处理标记的B细胞，标尺＝100μm；图9C-图9E：B细胞处理的小鼠在1个月、3个月和6个月时进行水迷宫实验(图9C)、Y迷宫(图9D)和旷场(图9E)试验，n＝5，重复测量方差分析用于比较不同组在不同时间点的水迷宫实验数据(目标潜伏期)，其他原始数据通过单因素方差分析进行分析，然后进行post hoc检验，M：月；d：天；WT：野生型；AD：阿尔茨海默病。
图10为根据本申请一些实施例所示的B细胞对阿尔茨海默病小鼠大脑皮质和海马神经元治疗效果的检测。WT组、AD组和B细胞治疗组小鼠大脑皮质和海马区组织行HE染色。黑色箭头表示正常细胞，红色箭头表示损坏的细胞。第一列中的图像显示右脑的全景图，标尺＝1mm。其余列中的图像显示了大脑皮质和海马区CA1、CA2、CA3和DG的详细信息，标尺＝50μm。WT：野生型；AD：阿尔茨海默病。
图11为根据本申请一些实施例所示的B细胞治疗的AD小鼠3个月后神经元丢失的检测，图11A：尼氏染色全切片扫描WT、AD和B细胞处理组的总神经元和黑色神经元，右脑的全景图显示在左栏，标尺＝1mm，黑色箭头是正常神经元，红色箭头是黑色神经元，标尺＝50μm；图11B-图11C：定量分析WT、AD和B细胞处理的AD小鼠大脑皮质和海马区CA1、CA2、CA3和DG区神经元总数和黑色/总神经元的比例，n＝5，对原始数据进行单因素方差分析，然后进行post hoc检验；图11D：WT、AD和B细胞处理的AD小鼠的大脑皮质和海马区CA2区被抗NeuN(绿色)和抗MAP2(红色)荧光染色，标尺＝100μm，白色箭头是神经元的树突；图11E：WT、AD和B细胞处理的AD小鼠的大脑皮质和海马区CA3区被抗NeuN(绿色)和抗活化的caspase3(红色)荧光染色，标尺＝100μm，白色箭头为凋亡性神经元；图11F-图11I：定量直方图显示WT、AD和B细胞处理的AD小鼠大脑皮质和海马区NeuN阳性细胞数、NeuN和MAP2的积分密度、神经元凋亡率，n＝5，对原始数据进行单因素方差分析，然后进行post hoc检验，AD：阿尔茨海默病；WT：野生型小鼠；IntDen：综合密度。
图12为根据本申请一些实施例所示的B细胞治疗AD小鼠3个月后总斑块和致密斑块的检测结果图。图12A：6E10(总斑块)免疫组织化学全切片扫描，观察WT组、AD组和B细胞组小鼠总Aβ斑块沉积情况，左侧为右脑全景图，标尺＝1mm，红色箭头在红色放大框中斑块位置，标尺＝50μm；图12B-图12C：定量分析总斑块的面积比例和在皮质和海马CA1，CA2，CA3和DG区的数量，n＝5，对原始数据进行单因素方差分析，然后进行post hoc检验；图12D：刚果红染色(致密斑块)全切片扫描观察WT、AD和B细胞治疗组致密斑块的沉积，左侧是右脑全景图，标尺＝1mm，红色箭头在红色放大框中显示斑块位置，标尺＝100μm；图12E-图12F：定量分析致密性斑块的面积比例和在皮质和海马CA1，CA2，CA3和DG区的数量，对原始数据进行单因素方差分析，然后进行post hoc检验AD：阿尔茨海默病；WT：野生型小鼠。
具体实施方式
为了更清楚地说明本说明书实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书的一些示例或实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图将本说明书应用于其它类似情景。除非从语言环境中显而易见或另做说明，图中相同标号代表相同结构或操作。
如本说明书和权利要求书中所示，除非上下文明确提示例外情形，“一”、“一个”、“一种”和/或“该”等词并非特指单数，也可包括复数。一般说来，术语“包括”与“包含”仅提示包括已明确标识的步骤和元素，而这些步骤和元素不构成一个排它性的罗列，方法或者设备也可能包含其它的步骤或元素。
本说明书中使用了流程图用来说明根据本说明书的实施例的系统所执行的操作。应当理解的是，前面或后面操作不一定按照顺序来精确地执行。相反，可以按照倒序或同时处理各个步骤。同时，也可以将其他操作添加到这些过程中，或从这些过程移除某一步或数步操作。
阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD)是一种以认知功能退化、渐进性记忆障碍为主要特征，伴随着社会行为能力与日常生活能力严重下降的一种中枢神经系统退行性疾病。临床表现为记忆减退、语言与情感障碍、思维迟钝以及人格改变等。该病起病隐匿，病程缓慢，发病率与年龄增长相关，已成为当代社会严重危害人类健康特别是老年人生存质量的一项重大疾病。
目前，临床上治疗AD的生物药物分为五类：第一类抗胆碱酯酶药物：加兰他敏、多奈哌齐(安理申)、石杉碱甲和重酒石酸卡巴拉汀；第二类兴奋性氨基酸拮抗剂：美金刚；第三类抗β淀粉样蛋白：阿杜单抗；第四类M1受体拮抗剂、抗氧化剂；第五类肠道菌群、神经炎症：GV971。但是，这些药物也只是减缓病情的发展，并不能逆转AD逆转疾病进程。
本申请提供ATP5D激活剂在制备药物中的用途，所述药物具备以下任一项或多项功能：1)治疗/预防阿尔茨海默病；2)抑制神经元损伤；3)使神经元形态紧密、排列规则；4)增加海马区颗粒层厚度。
在一些实施例中，所述ATP5D激活剂可以是所述药物的唯一有效成分。在一些实施例中，所述ATP5D激活剂可以是所述药物的有效成分之一。所述ATP5D基因在NCBI GenBank数据库中Gene ID为513。
本申请还提供B淋巴细胞在制备药物中的用途，所述药物具备以下任一项或多项功能：1)治疗/预防阿尔茨海默病；2)保护神经元；3)减轻神经元损伤；4)促进受损海马神经元轴突生长；5)减少神经元丢失或凋亡；6)增加神经元数量；7)增加神经元和树突积分密度；8)使神经元形态紧密、排列规则；9)增加海马区颗粒层厚度。
在一些实施例中，所述B淋巴细胞可以是所述药物的唯一有效成分。在一些实施例中，所述B淋巴细胞可以是所述药物的有效成分之一。
术语“治疗/预防”(及其语法变体)指试图改变治疗个体中疾病的自然进程，并且可以是为了预防或在临床病理学的过程期间实施的临床干预。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、缓解症状、降低疾病的任何直接或间接病理学后果、预防转移、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。
在一些实施例中，术语“治疗”可以指在正被施用ATP5D激活剂的受试者中获得期望的药理学和/或生理学效果。在一些实施例中，术语“治疗”可以指在正被施用B淋巴细胞的受试者中获得期望的药理学和/或生理学效果。因此，如本文使用的术语“治疗”包括：(a)抑制AD，例如遏制其发展；(b)逆转AD，例如使AD消退；或(c)与不接受治疗情况下的预期生存期相比延长生存期。在一些实施例中，治疗可以具有疾病调修效果。这意指治疗减缓或延缓潜在的病理性或病理生理性疾病过程，并且相对于安慰剂或对照组而言，AD的临床体征和症状有所改善。
在一些实施例中，治疗可以引起症状改善。这可能由认知增强、自主权更多和/或神经精神和行为功能障碍改善(即使只是有限的持续时间)组成。
在一些实施例中，所述神经元可以为大脑皮质和/或海马神经元。
在一些实施例中，所述神经元损伤可以由Aβ寡聚体导致。在一些实施例中，所述Aβ寡聚体可以为Aβ1-42寡聚体。在一些实施例中，所述Aβ1-42寡聚体的浓度可以为40μM。
在一些实施例中，所述神经元损伤可以为神经元凋亡数目增加和/或神经元轴突长度变短。
在一些实施例中，所述B淋巴细胞可以为健康B淋巴细胞。
在一些实施例中，所述B淋巴细胞可以来源于非阿尔茨海默病个体。在一些实施例中，所述个体可以为哺乳动物。在一些实施例中，哺乳动物可以为人、猴子或小鼠。在一些实施例中，所述B淋巴细胞可以来源于年轻非阿尔茨海默病人。在一些实施例中，所述B淋巴细胞可以来源于18-55周岁非阿尔茨海默病人。在一些实施例中，优选的，所述B淋巴细胞可以来源于20-30周岁非阿尔茨海默病人。在一些实施例中，非阿尔茨海默病人可以是无认知功能障碍或精神类疾病的人。在一些实施例中，非阿尔茨海默病人可以是神经功能正常的人。在一些实施例中，非阿尔茨海默病个体的年龄可以低于阿尔茨海默病个体。
在一些实施例中，所述药物中，B淋巴细胞可以用于减轻或逆转阿尔茨海默病个体的认知功能障碍。
在一些实施例中，所述药物中，B淋巴细胞可以用于减少阿尔兹海默病个体大脑皮质和海马区总斑块和致密斑块的面积和数量。在一些实施例中，所述海马区可以包括CA1、CA2、CA3和DG区。
在一些实施例中，所述神经元可以为海马神经元。在一些实施例中，所述药物中，B淋巴细胞可以用于减轻海马神经元损伤。在一些实施例中，优选的，所述海马神经元损伤可以为海马神经元轴突长度缩短或神经元凋亡增加。在一些实施例中，更优选的，所述损伤可以由Aβ寡聚体导致。
在一些实施例中，所述药物中，B淋巴细胞可以用于促进阿尔茨海默病个体海马神经元轴突生长。在一些实施例中，优选的，所述海马神经元可以由Aβ寡聚体致损伤。在一些实施例中，所述Aβ寡聚体可以为Aβ1-42寡聚体。在一些实施例中，所述Aβ1-42寡聚体的浓度可以为10μM～200μM。在一些实施例中，所述Aβ1-42寡聚体的浓度可以为10μM，20μM，40μM，60μM，800μM，100μM和200μM。在一些实施例中，优选的，所述Aβ1-42寡聚体的浓度可以为40μM。
β淀粉样蛋白(amyloid-β，Aβ)是一种细胞外聚集物，它可由多种细胞产生，循环于血液、脑脊液和脑间质液中，大多与伴侣蛋白分子结合，少数以游离状态存在。人体内Aβ最常见的亚型是Aβ1-40和Aβ1-42。在人脑脊液和血中，Aβ1-42容易聚集，从而形成Aβ沉淀的核心，引发神经毒性作用。目前认为由42个氨基酸组成的Aβ寡聚体是AD的致病因子。虽然最初，人们认为致密Aβ斑块的出现对AD病理发展是非常重要的，但现在认为可溶性Aβ寡聚物可能是最常见的病理形式：从AD脑中纯化并应用于体外神经元的寡聚体能够增强长期抑制作用，引起突触功能障碍，树突棘被破坏，最终引发神经细胞死亡。
在一些实施例中，所述药物中，B淋巴细胞可以用于：a增加阿尔茨海默病个体大脑皮质总神经元数量；b减少阿尔茨海默病个体大脑皮质黑色神经元数量；c减少阿尔茨海默病个体海马区CA2、CA3区黑色神经元数量。
本发明提供一种治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括向阿尔茨海默病个体施以治疗/预防有效量的B淋巴细胞。在一些实施例中，所述B淋巴细胞可以通过静脉回输施以AD个体。
术语“有效量”指本申请的B淋巴细胞的数量或剂量，其以单一或多次剂量施以个体后，在治疗的个体中产生预期效果。“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。本申请的B淋巴细胞的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中B淋巴细胞的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。
在一些实施例中，所述药物中，ATP5D激活剂可以用于减轻或逆转阿尔茨海默病个体的认知功能障碍。
术语“认知功能障碍”指个体在记忆功能、解决问题、方向性和/或抽象的一种或多种中的获得性缺陷，影响个体独立发挥功能的疾病。例如阿兹海默病、路易体痴呆、肌萎缩侧索硬化症、记忆损伤、记忆丢失、认知缺陷、注意力缺陷、多动症、精神分裂症、帕金森氏病痴呆和血管性痴呆。
在一些实施例中，个体可以是哺乳动物。在一些实施例中，个体可以是人、猴子或小鼠。
术语“个体”在本申请中优选指人，尤其是被诊断患有认知损伤、精神分裂症或其他精神疾病的患者，所述精神疾病是在记忆功能、解决问题、方向性和/或抽象的一种或多种中的获得性缺陷，影响个体独立发挥功能的能力。对象、患者或个体可互换的使用。
在一些实施例中，所述认知功能障碍可以选自记忆力衰退和/或陌生环境恐惧症。
在一些实施例中，所述药物中，ATP5D激活剂可以用于减少阿尔茨海默病个体大脑皮质和海马中总斑块沉积。
在一些实施例中，所述药物中，ATP5D激活剂可以用于减少阿尔茨海默病个体大脑皮质和海马CA1和DG区总斑块的面积和数量。
在一些实施例中，所述药物中，ATP5D激活剂可以用于：a增加阿尔茨海默病个体大脑海马CA2区总神经元数量；b减少阿尔茨海默病个体大脑皮质和海马CA1、CA2、CA3、DG区黑色神经元数量。
黑色神经元是脑损伤后受损神经元的典型形态学变化，这些神经元收缩或含有液泡，而正常神经元有相对较大、完整的胞体和圆形、较大的细胞核。
在一些实施例中，所述ATP5D激活剂可以用于激活/增强ATP5D基因的表达。
术语“ATP5D激活剂”是指增强ATP5D活性的物质，作为ATP5D激活剂并不特别限制，只要能够显示ATP5D的激活或增强活性即可，可以是任何物质，例如抗体或化合物，由本领域技术人员适当决定。
本发明提供一种治疗阿尔茨海默病的方法，所述方法包括向阿尔茨海默病个体施以治疗/预防有效量的包含ATP5D激动剂的药物。可以使用本领域己知的多种方法中的一种或多种，通过一种或多种施用途径施用本申请的药物。施用途径可包括静脉内、肌肉内、皮肤内、腹膜内、皮下、脊柱或其他施用途径，例如注射或灌注。所述注射包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心脏内、皮肤内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、被膜下、蛛网膜下、脊柱内和硬膜外注射和灌注。可选的，可以通过非肠胃外的途径施用药物，如局部的、表皮的或粘膜的施用途径，例如鼻内、口服、阴道、直肠、舌下或局部施用。在一些实施例中，所述药物可以通过口服、皮下注射注射或静脉回输施以AD个体。
术语“有效量”指本申请的ATP5D激活剂的数量或剂量，其以单一或多次剂量施以个体后，在治疗的个体中产生预期效果。有效量可以由作为本领域技术人员的主治医师通过考虑以下多种因素来容易地确定：诸如哺乳动物的物种；它的大小、年龄和一般健康；涉及的具体疾病；疾病的程度或严重性；个体的应答；施用模式；施用制剂的生物利用率特征；选择的给药方案；和任何伴随疗法的使用。
“治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需治疗结果的量。本申请的ATP5D激活剂的治疗有效量可以根据多种因素如疾病状态、个体的年龄、性别和重量而变动。治疗有效量也是这样的一个量，其中ATP5D激活剂的任何有毒或有害作用不及治疗有益作用。
“预防有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防结果的量。通常，由于预防性剂量在对象中在疾病较早阶段之前或在疾病较早阶段使用，故预防有效量将小于治疗有效量。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
本发明实施例中的相关试验方法如下：
1、动物与分组
C57BL/6背景的APP/PS1转基因小鼠(AD小鼠)、ATP5D KO(敲除)和ATP5D KI(敲入)小鼠从昆明医科大学实验动物学部获得并饲养。此外，24小时新生小鼠用于培养海马神经元。所有动物都在SPF实验室动物室的标准条件下饲养。所有实验均符合美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》。该动物研究方案由昆明医科大学动物保护与福利委员会依法批准，批准号为kmmu2019058。
2、原代皮质和海马神经元培养
取24h内新生小鼠(WT、ATP5D KO和ATP5D KI)，75％乙醇中消毒，用预冷PBS冲洗干净。麻醉后断脊法处死乳鼠，迅速将头颅离断，放入盛有预冷DMEM和双抗培养基的培养皿中清洗。解剖全程在冰上进行，分离出乳鼠大脑皮层和“月牙形”海马区组织，转移置入盛有DMEM和双抗的EP管中。将收集到的大脑皮质和海马组织分别剪碎(大小为1.0-2.0mm3)，加入0.25％胰酶37℃消化10-15min，间隔5min摇匀1次，加入FBS终止消化。然后用一次性过滤网过滤到15ml离心管中，1500r离心5min，弃上清液，用神经元接种液重悬细胞，随后将细胞悬液接种至24孔板(内含爬片，提前用PLL包被)，置于37℃、体积分数为5％CO2培养箱内培养，5h后全量更换预热的神经元培养液，之后每隔3天半量换液，培养至5d后进行Aβ1-42寡聚体干预，Aβ由粉末配成原液(230μM)：1ml原液由1μl DMSO(二甲基亚砜)、1ml神经元培养基和1mg Aβ1-42寡聚体粉末组成。选择Aβ1-42 40μM为最适浓度干预皮质和海马神经元，放入37℃培养箱中1d。
3、细胞免疫荧光染色
将Aβ1-42寡聚体干预过的皮质和海马神经元细胞弃掉培养液，用PBS洗一遍，每组分别用4％多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)室温固定10min，用PBS洗3遍，用5％山羊血清和0.3％Triton X-100在常温下孵育2h，滴加用2％羊血清稀释的一抗(Tuj1，Abcam，Mouse，1：200；Cleaved caspase3，Servicebio，Rabbit，1：100)4℃孵育18h，PBS洗3遍，37℃下孵育二抗(IgG 488，Abbkine，Mouse，1：400；IgG 594，Abbkine，Rabbit，1：200)，避光37℃孵育1h，PBS洗3遍，用含DAPI封片剂封片，激光共聚焦显微镜(徕卡)×200倍显微镜下每个孔随机选择5个视野用于图像采集。选择每个区域的10个神经元来计算神经元轴突长度，并使用Image-Pro Plus 6.0软件(MediaCybernetics，Silver Spring，MD，USA)在每组的5个孔中测量神经元轴突长度和凋亡。
4、ATP5D KO/KI转基因鼠鉴定
对于繁殖的子代，为了筛选出ATP5D转基因小鼠的基因型，本研究采用常规PCR对小鼠的基因型分析。收集出生后一周的小鼠脚趾，以小鼠脚趾全基因组DNA为模板进行扩增、电泳。
(1)使用碧云天鼠尾基因型快速鉴定试剂盒(D7283S)提取小鼠基因组DNA。将小鼠脚趾放入碧云天鼠尾基因型鉴定试剂盒的消化液中，需确保溶液完全浸没小鼠尾巴。
(2)将消化好的离心管置于PCR仪中，55℃15min，95℃5min。
(3)向孵育好的离心管中加入100μl Stop Solution，混匀后看到白色絮状络合物沉淀完全溶解，即为目标基因组DNA。
(4)引物序列如下：
ATP5D KO Forward primer：5’-GACCCGTGGAAGAGGTTCTC-3’(SEQ ID NO.1)
ATP5D KO Reverse primer：5’-AATGTGGCAAACTCAGGTTCTG-3’(SEQ ID NO.2)
KI需要用两条引物来鉴定：
Primers1 F:5’-AAAGATCGCTCTCCACGCCCTAG-3’(SEQ ID NO.3)
R:5’-AGATGTACTGCCAAGTAGGAAAGTC-3’(SEQ ID NO.4)
Primers2 F：5’-CTGCTGTCCATTCCTTATTCCATAG-3’(SEQ ID NO.5)
R:5’-CTGGAAATCAGGCTGCAAATCTC-3’(SEQ ID NO.6)
(5)按以下体系进行PCR反应：
(6)PCR工作条件：
(7)配置琼脂糖凝胶：使用精密天平取琼脂糖粉2g放入容器中，再向瓶内加入100ml1×TAE溶液，轻轻混匀后放入微波炉高火加热5min，煮沸后取出，反复重复煮沸2-3次，待溶液澄清；室温冷却1min，待液体不烫手时时向瓶内加入10μl EB染料接着迅速倒入模型槽中冷却成型。
(8)上样和电泳：将凝固好的胶放入电泳槽的透明卡槽，向电泳槽中添加电泳液浸没凝胶；每孔加入5μl扩增后的样本，120V电压条件下电泳20min，在凝胶成像仪中成像，记录并保存图像。
5、qRT-PCR
为了进一步验证ATP5D KO和KI转基因鼠构建成功，我们用qRT-PCR检测了小鼠大脑皮质和海马区ATP5D的表达。具体的操作方法如下：①总RNA提取：组织样本首先用1mlTrizol裂解液，立即裂解细胞提取总RNA，放置10min后，加入300μl氯仿，剧烈震荡后静置15min。4℃离心机12000r离心15min，收集上层水相至1.5ml EP管中，加入异丙醇750μl，颠倒数次混匀，放置-20℃过夜。于4℃条件下，12000r离心15min，弃上清，管底为RNA沉淀。加入1ml 80％冰乙醇，颠倒数次混匀，利用有机溶剂相似相溶的原理以除去异丙醇后在4℃下12000r离心10min，弃上清，用滤纸吸走EP管口液体，开盖干燥RNA片刻(8min)，加入20μlDEPC水溶解RNA(RNA遇水即溶)，混匀。②逆转录合成cDNA：测浓度(ng/μl)：先用2.5μl DEPC水洗2次微量板，用高级纸巾擦拭干净，再加入2.5μl样品去测浓度。取PCR管，每管加入11μl溶液，其中包括1μl OLigDT(浓度0.5μg/μl)，10μl模板和DEPC水，混匀后PCR仪70℃5min，12℃∝，冷却。然后依次加入：4μl 5×5X Reaction Buffer，3μl MgCl2，1μl 0.5mM dNTPmix，1μl RevertAidTMM-MμlV Reverse Transcriptase，25℃5min，42℃1h，75℃15min后将至12℃∝，冷却。将RNA逆转录成cDNA，置于-20℃冰箱保存备用。③实时荧光定量PCR：反应体系总体积为20μl，每管其他试剂用量为：2×SYBR GREEN：10μl(Thermo DBIBioscience)，上游引物：0.6μl，下游引物：0.6μl，cDNA：1μl，水：7.8μl，预变性95℃5min，变性95℃10s，退火20s，延伸72℃20s，循环40次。
引物序列：GAPDH上游引物：5'CCTCAAGATTGTCAGCAAT 3'(SEQ ID NO.7)，下游引物：5'CCATCCACAGTCTTCTGAGT 3'(SEQ ID NO.8)，退火温度53℃；ATP5D上游引物：5'CCCCAACCAGATGTCCTTCA3'(SEQ ID NO.9)，下游引物：5'TCTTCGGCCAACAACTGCA3'(SEQ IDNO.10)，退火温度：52℃。反应体系在实时荧光定量PCR仪上进行，参照(GAPDH)控制水平，通过计算2-△△Ct值，对PCR扩增产物进行分析。
6、Morris水迷宫
用Morris水迷宫检测WT、AD、ATP5D KO/KI以及AD+ATP5D KO/KI小鼠在4、9、12个月的空间记忆和学习能力。水池的内径为90cm，深度为0.5m，被分成四个相等的象限。随机选择某一个象限中心的水面以下1.5cm处放置一个小圆形平台。在实验前，向水池中加入白色食用添加剂，白色食用添加剂的量以水池中不能看见小圆台为准。通过摄像头采集小鼠游泳轨迹分析寻找到平台时间及穿台次数和路程等。测试方法分定位航行实验(placenavigation)和空间搜索实验(spatial probe test)两个过程。①定位航行实验：将小鼠按照第1，2，3，4象限的顺序依次放入水池。观察和记录小鼠找到象限中点处的平台所需要的时间，即为小鼠潜伏期。在此过程中，如果潜伏期超过60s，则将小鼠引导至平台。让动物在平台上停留30s。每次将小鼠拿开水池后，将小鼠身体擦干，放在150W的白炽灯下烤2min，放回笼内。连续训练5d。②空间搜索实验：定位航行5d后撤去小鼠站立平台，于水迷宫第6d将小鼠由原平台所在象限的对侧象限侧壁中点放入水中，记录小鼠穿过原平台所在区域的次数，以及小鼠在到达目标区域之前的训练时间和最后一天距离。最后，每次实验结束后，小鼠都被晾干，然后回到它们的笼子里。训练间隔时间为15-20min。
7、Y迷宫
用Y迷宫检测WT、AD、ATP5D KO/KI以及AD+ATP5D KO/KI小鼠在4、9、12个月的空间识别记忆能力。Y迷宫实验是用于检测小鼠空间识别记忆能力的行为学方法。本实验所使用的Y迷宫设备由3个臂组成，3个臂之间的夹角均为120°，每个臂长35cm、宽5cm、高15cm。在中央区与3个臂相连处各有一个可移动的隔板，迷宫内臂及底部均为白色。Y迷宫的3个臂被随机分为新异臂(novel arm)、起始臂(start arm)和其他臂(other arm)。起始臂为小鼠进入迷宫时所在的臂。位于Y迷宫正上方的摄像系统用于记录小鼠在迷宫内的行为学。本次测试分为自发交替实验和空间记忆实验，自发交替实验：开放Y迷宫的起始臂和其他臂，小鼠由起始臂壁放入迷宫，在起始臂和其他臂自由探索8min。记录进入三臂的顺序和进入每臂的总数，交替率计算为交替数/(总次数-2)×100。空间记忆实验：开放Y迷宫的起始臂和其他臂，关闭新异臂，让小鼠自由探索15min，训练结束后小鼠回到原饲养笼，1h后进入测试期，测试期:同时开放Y迷宫的新异臂、起始臂和其他臂，小鼠由起始臂面壁放入，在3个臂之间自由探索5min，测量和分析每只小鼠进入新颖臂的次数和在新颖臂中花费的总时间。实验时保持环境安静、昏暗。每次实验完成后，采用75％乙醇擦洗迷宫，以除去气味对下一只小鼠的干扰。
8、旷场
本研究采用旷场实验，主要观察WT、AD、ATP5D KO/KI以及AD+ATP5D KO/KI小鼠在4、9、12个月的自主、探索和焦虑样行为。实验装置由40cm×40cm×40cm的正方体组成，分为底部和白色内墙的露天反应箱，以及自动数据采集和处理系统(上海信软信息技术有限公司)。反应箱底部由16个10×10cm的正方体组成，分为中心区和外周区两个部分，位于旷场箱正上方的摄像系统用于记录小鼠在旷场内的行为学。实验开始时将动物放入箱内底面中心，让小鼠在箱内自由活动10min并全程进行视频采集。实验时保持环境安静、昏暗。旷场实验完成后，采用75％乙醇擦洗旷场箱，以除去气味对下一只小鼠的干扰。使用智能追踪系统记录动物站立的时间和次数。
9、动物取材
小鼠行为学实验结束24h后，将所有小鼠采用5％异氟烷吸入诱导，3％维持麻醉，仰卧位固定，提起腹部皮肤，暴露胸腔，沿着主动脉立即灌注预冷的0.9％生理盐水80-100ml，直到右心耳流出液呈透明状，肝脏变白。将小鼠俯卧固定，剪开头部皮肤，剥离颅骨，取出脑组织用4％多聚甲醛中固定72h。修剪后的脑组织块脱水，进行石蜡包埋。石蜡切片将前囟后2.66mm～4.3mm的区域切成冠状切片(5μm厚)，37℃烘烤12h，室温保存用于免疫组织化学染色、尼氏染色和苏木精-伊红(HE)染色。
10、免疫酶组织化学染色
取脑组织石蜡切片进行脱蜡和水化。用柠檬酸钠修复抗原后，用0.01M PBST洗涤5次，每次5min，然后用3％过氧化氢孵育10min以消除内源性过氧化物酶，再用PBST(0.01MPBS中含有0.5％吐温)洗涤5次后，将切片于5％山羊血清和0.3％Triton X-100在常温下封闭2h。之后加入用2％山羊血清稀释的一抗anti-β-Amyloid，1-16(6E10，Biolegend，Mouse，1：1000)或p-tau(phospho Ser396，abbkine，Mouse，1：200)，并在4℃下孵育18h。阴性对照组切片用2％山羊血清处理。用PBST冲洗5次后，将它们与免疫染色显色剂(MaxVision-HRP，小鼠/兔)在常温下孵育15min，然后加入DAB溶液显色。最后，切片在梯度酒精和TO中脱水并用中性树脂封片。在数码切片扫描(Pannoramic MIDI)下用低倍镜(x100)进行图片采集定量，随机挑选5个视野，用Image Plus Pro软件计数Aβ斑块面积和数量。
11、HE染色
取脑组织石蜡切片，进行常规脱蜡(TOⅠ10min、TOⅡ10min)，梯度酒精脱水(浓度梯度分别100％、95％、90％、80％、70％各5min)，蒸馏水中5min将脑片置于湿盒切片滴入苏木素中染色约3min。用自来水冲洗掉紫色，片刻即可。将切片滴加1％盐酸乙醇液，使其褪色，约30s。切片变红，颜色较浅即可切片放入自来水流水中使其恢复蓝色。约8-10min。95％酒精2min→伊红染色3min→85％酒精2min→95％酒精2min→100％酒精Ⅰ2min→100％酒精Ⅱ2min伊红主要染细胞质。切片放入TOⅠ、Ⅱ中各3min。中性树胶封片，在数码切片扫描(Pannoramic MIDI)下用低倍镜(x200)观察组织的形态学改变。
12、尼氏染色
取脑组织石蜡切片，进行常规脱蜡(TOⅠ10min、TOⅡ10min)，梯度酒精脱水(浓度梯度分别100％、95％、90％、80％、70％各5min)，将脑片置于湿盒上，将尼氏染色液滴加到组织上(覆盖住脑)，室温浸染10min(注意避光)，倾去染色液，放在盛有蒸馏水的缸中，流水冲洗1min，将组织放入70％酒精中分化(根据颜色深浅决定分化时间)，无水乙醇迅速脱水，TO透明，中性树胶封片，在数码切片扫描(Pannoramic MIDI)下用低倍镜(x100)对图片进行采集定量，随机挑选5个视野，应用Image J软件计算总神经元和黑色神经元的数量。
13、B细胞的培养和鉴定
从2-4个月大的WT小鼠和15个月大的AD小鼠中获取B细胞。在用3％异氟烷麻醉小鼠后(确保老鼠心脏跳动)，小鼠处平卧位，于中下腹剪开皮肤，并用止血钳夹住上腹皮肤向上翻，充分暴露脏器，脾脏于小鼠左膈肌下取出后放入分离缓冲液中浸泡(在超净工作台中)。先用分离缓冲液洗涤3次脾脏，每个脾脏加入2ml分离缓冲液并用组织剪剪碎脾脏组织成1立方毫米碎块，移至研磨器中进行研磨，滤网过滤，收集滤出的细胞悬液，加入10倍体积的红细胞裂解液(Biosharp)，冰上裂解20min，每5min颠倒混匀一次，离心1500转5min；弃去上清液，加分离缓冲液洗涤，1500r离心5min；弃去上清液，加分离缓冲液，细胞计数仪计数。小鼠CD43阴性磁珠放置于三维摇床上5min，准备好磁力架用酒精消毒后放入超净台。清洗磁珠2次，清洗完成后吸出上清缓冲液。将清洗完的磁珠和脾单个核细胞悬液吹打混匀后放置于三维摇床20min，之后吹打＞10次，加入分离缓冲液置于磁力架2min，将管内的液体转移至新管子，放置于磁力架2min，再次清除残留磁珠，离心，弃去上清液。B细胞接种于培养基中(PS+1640培养基+澳洲血清)，置于37℃、体积分数为5％CO2培养箱内培养。
为了鉴定提取的脾脏B细胞，进行CD19免疫荧光染色。用PBS洗涤培养的B细胞，并均匀涂抹在载玻片上。随后，载玻片用4％多聚甲醛(PFA)在室温下固定10min。再次洗涤3次后，将细胞与5％山羊血清和0.3％Triton X-100在室温下温育2h，然后加入用2％山羊血清稀释的第一抗体(CD19，Santa，小鼠，1∶200)并在4℃下温育18h。用PBS洗涤3次，加入二抗(IgG 488，Abbkine，小鼠，1∶400)并在室温下温育3h。再次用PBS洗涤3次后，用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂切片。最后，细胞在激光共聚焦下以x200倍显微镜(徕卡)拍照。
14、钙黄绿素-AM/PI活细胞/死细胞双重染色试验
钙黄绿素-AM是一种用于活细胞荧光标记的细胞染色试剂。提取年轻(2-4个月大的WT小鼠)和年老(15个月大的AD小鼠)B细胞并离心(1500rpm，5min)，除去上清液。用1×测定缓冲液洗涤细胞2-3次以完全去除残留的酯酶活性，并用1×测定缓冲液制备细胞悬浮液至密度为1×105-1×106细胞/ml。将100μl染色溶液加入200μl B细胞悬浮液中，混合，并在37℃下孵育15-30min。在激光共聚焦显微镜(徕卡)下同时检测活细胞(黄绿色荧光)和死细胞(红色荧光)的比例。细胞活力％＝(活细胞)/(活细胞+死细胞)×100％。细胞死亡率％＝(死细胞)/(活细胞+死细胞)×100％。
15、CCK-8测定细胞活力
提取年轻(2-4个月的WT小鼠)和年老(15个月的AD小鼠)B细胞，将处于对数生长期的B细胞(每孔1×104/100μl)在37℃的培养箱中培养8-10h，分别在培养的第7、14和21天加入10μl CCK-8溶液，使用酶联免疫测定法在450nm下测量每孔的光密度(OD)值。最后，计算不同时间的B细胞活力。实验重复三次，取平均值计算生存力。细胞存活率％＝(实验组OD-空白OD)/(对照细胞OD-空白OD)×100％
16、海马神经元培养和Aβ1-42寡聚体干预
取24h内新生小鼠，75％乙醇中消毒，用预冷PBS冲洗干净。麻醉后断脊法处死乳鼠，迅速将头颅离断，放入盛有预冷DMEM和双抗培养基的培养皿中清洗。解剖全程在冰上进行，分离出乳鼠大脑“月牙形”海马区组织，转移置入盛有DMEM和双抗的EP管中。将收集到的大脑海马组织剪碎(大小为1.0-2.0mm3)，加入0.25％胰酶37℃消化10-15min，间隔5min摇匀1次，加入FBS终止消化。然后用一次性过滤网过滤到15ml离心管中，1500r离心5min，弃上清液，用神经元接种液重悬细胞，随后将细胞悬液接种至24孔板(内含爬片，提前用PLL包被)，置于37℃、体积分数为5％CO2培养箱内培养，5h后全量更换预热的神经元培养液，之后每隔3天半量换液，培养至5d后进行Aβ1-42寡聚体干预，Aβ由粉末配成原液(230μM)：1ml原液由1μl DMSO(二甲基亚砜)、1ml神经元培养基和1mg Aβ1-42寡聚体粉末组成。每孔按照不同浓度(10μM，20μM，40μM，60μM，80μM，100μM和200μM)稀释Aβ1-42寡聚体，最后选择40μM为最适浓度干预海马神经元，放入37℃培养箱中1d。
17、海马神经元与B细胞的共培养
将正常和Aβ1-42寡聚体干预的海马神经元培养至6d时(24孔板)，更换培养基，于培养板中加培养液至500μl(可浸没小室的膜)。取出培养的B细胞，离心(1500r，5min)重悬，每个小室按照B细胞5×104/200μl密度接种，共培养1天后，用免疫荧光染色观察细胞形态。
18、细胞免疫荧光染色
将共培养的海马神经元细胞弃掉培养液，用PBS洗一遍，每组分别用4％多聚甲醛(paraformaldehyde，PFA)室温固定10min，用PBS洗3遍，用5％山羊血清和0.3％Triton X-100在常温下孵育2h，滴加用2％羊血清稀释的一抗(Tuj1，Abcam，Mouse，1：200)4℃孵育18h，PBS洗3遍，37℃下孵育二抗(IgG 488，Abbkine，Mouse，1：400和TUNEL显色液)，避光孵育1h，PBS洗3遍，用含DAPI封片剂封片，激光共聚焦显微镜(徕卡)×200倍显微镜下每个孔随机选择5个视野用于图像采集。选择每个区域的10个神经元来计算神经元轴突长度，并使用Image-Pro Plus 6.0软件(MediaCybernetics，Silver Spring，MD，USA)在每组的5个孔中测量神经元凋亡(Tuj1凋亡细胞/Tuj1阳性细胞)。
19、小鼠B细胞治疗
将提取标记的B细胞(来自2-4个月的WT小鼠)利用小鼠尾注射静脉显像仪，按每只老鼠200μl(约1×106个细胞)注射到9月龄AD鼠中，对照组AD小鼠注射等量的PBS溶液，做好标记，将小鼠放回鼠笼饲养，并在注射后1、3和6个月做行为学观察B细胞的作用。
20、Morris水迷宫
用Morris水迷宫检测WT和AD小鼠B细胞治疗后1个月、3个月和6个月的空间记忆和学习能力。具体实验步骤参见上述实验方法6。
21、旷场实验
本研究采用旷场实验，主要观察WT、AD对照组和AD治疗组小鼠在B细胞治疗后1、3、6个月的自主、探索和焦虑样行为。具体实验步骤参见上述实验方法8。
22、Y迷宫
用Y迷宫检测WT和AD小鼠在B细胞治疗后1、3、6个月的空间识别记忆能力。具体实验步骤参见上述实验方法7。
23、组织获取
小鼠在B细胞处理后3个月用3％异氟烷麻醉，并用预冷的0.9％生理盐水灌注，直到肝脏变白。取出脑组织并在4％多聚甲醛中固定72小时将修整过的脑组织块脱水，分别包埋在石蜡和冰冻切片中。将前囟后2.66mm～4.3mm的区域切成冠状切片(5微米厚)，随后在60℃下烘烤12小时并在室温下保存，用于尼氏染色、免疫组织化学染色、刚果红染色和苏木精-伊红(HE)染色。而冷冻的冠状切片(15微米厚)在37℃烘烤1小时，然后储存在-20℃冰箱中用于免疫荧光染色。
24、HE染色
于B细胞治疗后3个月取大脑皮质和海马区(CA1、CA2、CA3和DG区)进行HE染色观察。总之，在同一位置制备的切片进行HE染色(Beyotime生物技术研究所)，并使用数字切片扫描仪(KF-PRO-005，KFBio，宁波，中国)观察器官和脑组织的形态变化。具体实验步骤参见上述实验方法11。
25、尼氏染色
尼氏染色用于检测WT、AD和B细胞治疗的AD小鼠的皮质和海马(CA1、CA2、CA3和DG区域)中的总神经元和黑色神经元。B细胞治疗三个月后，处死小鼠，如上所述处理脑切片。具体实验步骤参见上述实验方法12。
26、免疫荧光染色
在B细胞治疗后3个月，来自WT、AD和B细胞处理的AD小鼠脑冰冻切片的皮质和海马(CA1、CA2、CA3和DG区域)用于NeuN、MAP2和活化的caspase3的免疫荧光染色。用柠檬酸钠修复抗原后，将脑片置于PBST中漂洗3次，每次5min。3％过氧化氢孵育10min后，用5％山羊血清和0.3％Triton X-100在常温下封闭2h，之后加入用2％山羊血清稀释的一抗(NeuN，Abcam，Mouse，1：400)，4℃孵育18h，用PBST冲洗8次后，二抗(MaxVision-HRP，小鼠/兔)常温孵育10min，PBST冲洗8次，TSAPlus荧光增强染色剂iF488-Tyramide(Servicebio，1：1000)孵育10min，避光处理，PBST冲洗8次。再进行柠檬酸钠修复抗原，置于PBST中漂洗3次，每次5min。3％过氧化氢孵育10min后，用5％山羊血清和0.3％Triton X-100在常温下封闭2h，一抗(MAP2，Abcam，Rabbit，1：1000或Cleaved caspase3，Servicebio，Rabbit，1：100)4℃孵育18h，用PBST冲洗8次后，二抗(MaxVision-HRP，小鼠/兔)常温孵育10min，PBST冲洗8次，TSAPlus荧光增强染色剂iF555-Tyramide(Servicebio，1：1000)孵育10min后PBST冲洗8次。DAPI复染10min，抗荧光淬灭封片剂封片。在双光子共聚焦显微镜(徕卡TCS SP8 DIVE)下，随机选择每个切片的五个视野(每个视野1mm2)和每个动物的三个切片(x200)，用Image J软件定量NeuN阳性细胞以及NeuN和MAP2的密度(IntDen)。神经元凋亡计算为神经细胞凋亡细胞/神经细胞阳性细胞的百分比。
27、免疫酶组织化学染色
取脑组织石蜡切片进行脱蜡和水化。用柠檬酸钠修复抗原后，用0.01M PBST洗涤5次，每次5min，然后用3％过氧化氢孵育10min以消除内源性过氧化物酶，再用PBST(0.01MPBS中含有0.5％吐温)洗涤5次后，将切片于5％山羊血清和0.3％Triton X-100在常温下封闭2h。之后加入用2％山羊血清稀释的一抗anti-β-Amyloid，1-16(6E10，Biolegend，Mouse，1：1000)或p-tau(phospho Ser396，abbkine，Mouse，1：200)，并在4℃下孵育18h。阴性对照组切片用2％山羊血清处理。用PBST冲洗5次后，将它们与免疫染色显色剂(MaxVision-HRP，小鼠/兔)在常温下孵育15min，然后加入DAB溶液显色。最后，切片在梯度酒精和TO中脱水并用中性树脂封片。在数码切片扫描(Pannoramic MIDI)下用低倍镜(x100)进行图片采集定量，随机挑选5个视野，用Image Plus Pro软件计数Aβ斑块面积和数量。
28、刚果红染色
在B细胞治疗3个月后，在相同位置取脑切片进行刚果红染色，以识别皮质和海马区致密斑块。石蜡切片常规脱蜡(TOⅠ10min、TOⅡ10min)，梯度酒精脱水(浓度梯度分别100％、95％、90％、80％、70％各5min)，蒸馏水中5min将脑片置于湿盒，按氯化钠溶液：Puchtler碱化液＝100：1的比例配制碱性氯化钠溶液，切片直接入碱性氯化钠溶液浸染15min。然后按刚果红染色液：Puchtler碱化液＝100：1的比例配制碱性刚果红染色液，切片直接入碱性刚果红染色液浸染15min。最后用无水乙醇快速轻轻冲洗2-3次。TO透明，中性树胶封片。用数字化切片扫描仪(KF-PRO-005，KFBio，宁波，中国)观察脑组织的形态变化。用Image-ProPlus6.0软件(MediaContronetics，Silver Spring，MD，USA)对大脑皮质和海马4个区域(每个区域各0.5mm2)(CA1、CA2、CA3和DG区，3个切片/每只动物)的斑块面积百分比(斑块面积/每个区域的面积)和Aβ斑块数量进行定量分析。
29、统计学分析
所有数据均用原始数据作图，误差棒表示标准差，P<0.05表示结果具有统计学意义，所有统计分析均使用SPSS 21.0软件(IBM Corporation，NY，USA)进行。使用独立样本T检验分析两组间的比较，使用单因素方差分析(one-way ANOVA)分析多组间的比较。对于水迷宫实验，比较不同时间点、不同组间使用重复测量方差分析。
实施例1--ATP5D可以抑制Aβ诱导的皮质和海马神经元损伤
我们发现Aβ干预(WT+Aβ40μM)后的皮质神经元和海马神经元轴突长度比DMSO处理组(WT+DMSO)和正常组(WT)短和且凋亡数目更多(图1A、D、E；图2A、C、D)。而经Aβ干预(ATP5DKO+Aβ40μM)后的ATP5D KO小鼠，显示出其皮质神经元和海马神经元轴突长度短于ATP5D KO小鼠皮质神经元和海马神经元经DMSO处理(ATP5DKO+DMSO)和WT+Aβ40μM组，且ATP5D KO+Aβ40μM组的神经元凋亡数量比ATP5DKO+DMSO组和WT+Aβ40μM组更多(图1B、D、E；图2B、C、D)。然而，经Aβ干预(ATP5D KI+Aβ40μM)后的ATP5D KI小鼠，显示出其皮质神经元和海马神经元轴突长度短于ATP5D KI小鼠皮质神经元和海马神经元经DMSO处理(ATP5D KI+DMSO)组，但长于WT+Aβ40μM组，且ATP5D KI+Aβ40μM组的神经元凋亡数量虽比ATP5D KI+DMSO组多，但和WT+Aβ40μM组相比，其皮质神经元和海马神经元凋亡数目明显下降(图1C、D、E；图2B、C、D)。这些表明ATP5D可以抑制Aβ诱导的皮质和海马神经元损伤。
实施例2--ATP5D可改善AD小鼠认知功能，减少脑内总斑块沉积
我们将AD小鼠与ATP5D KO/KI交配，后代即为AD+ATP5D KO和AD+ATP5D KI的转基因小鼠，我们发现ATP5D KO的小鼠ATP5D的表达量在皮质和海马比WT组明显降低，相反ATP5D KI的小鼠ATP5D表达量明显上升(图3A、B)。通过4个月、9个月和12个月的水迷宫实验发现，AD小鼠认知能力比WT小鼠认知能力明显下降。在9个月和12个月ATP5D KI的小鼠，总路程比AD小鼠明显减少。ATP5D KO的小鼠在4个月和9个月时穿台次数比野生型小鼠明显降低，认知能力恶化，同时，12月时AD+ATP5D KO小鼠的穿台次数比AD小鼠穿台次数显著降低，这更进一步证实ATP5D在改善AD小鼠认知能力中有重要作用(图3C)。Y迷宫实验表明AD小鼠比WT小鼠在4个月、9个月、12个月时认知能力均有下降。AD+ATP5D KI的小鼠比AD在9个月、12个月时进入新颖臂的次数和4个月、9个月交替百分比增多，说明ATP5D可以改善AD小鼠认知能力(图3D)。此外，旷场实验显示在4个月和12个月时AD+ATP5D KI小鼠比AD小鼠站立时间更长，表明ATP5D KI的AD小鼠比AD小鼠对环境的紧张度更低(图3E)。
通过6E10酶组化染色发现皮质和海马中AD小鼠的总斑块的面积和数量明显比WT小鼠多，且经过ATP5D KI干预的AD小鼠在皮质和海马CA1和DG区总斑块的面积和数量明显比AD小鼠少(图4A-C)，而经过ATP5D KO干预的AD小鼠在海马CA1和CA3区总斑块数量明显比AD小鼠多。说明ATP5D可以减少AD小鼠脑内皮质和海马中总斑块的沉积(图4)。
HE染色结果显示AD小鼠的皮质和海马CA1，CA2，CA3和DG区细胞数量明显比WT小鼠少，且比较疏松，细胞形态排列不规则，且海马颗粒层厚度也明显比WT小鼠薄。在经过ATP5DKI干预后，AD小鼠的皮质和海马区细胞形态表现出和WT小鼠一样的趋势(图5)。尼氏染色结果显示AD小鼠中总神经元比WT小鼠少，黑色神经元比WT小鼠多，但是ATP5DKI干预的AD小鼠中总神经元在海马CA2区比AD小鼠多，黑色神经元在皮质和海马CA1、CA2、CA3、DG区比AD小鼠少，而ATP5D KO干预的AD小鼠结果相反，这些结果表明ATP5D可以减少AD小鼠凋亡神经元(图5)
实施例3--年轻小鼠B细胞促进海马神经元轴突生长，减少海马神经元凋亡
为了进一步研究B细胞在AD中的作用，采用阴性磁珠分选方法从小鼠脾脏中提取B细胞(图7A)。用CD19(B细胞标记物)抗体染色获得的B细胞(图6)。在获取一定纯度的B细胞后，发现来自2-4月龄小鼠(WT)的B细胞比来自15月龄(AD)的老年小鼠的B细胞活性显著更高(p＝0.012)，并且B细胞的死亡率也低于老年(图7B-C，p＝0.012)。CCK8结果显示，在培养第7、14和21天，年轻B细胞的活性也显著高于老年B细胞(图7D，p＝0.001，p＝0.015)。为了进一步验证B细胞对海马神经元的作用，本申请在体外建立了AD细胞模型，并用不同浓度的Aβ1-42寡聚体(10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM和200μM)干预海马神经元，根据细胞数量选择40μM作为后续实验的浓度(图8A-B)。由于不同数量的B细胞对海马神经元有不同的影响，因此筛选出B细胞共培养的最佳浓度为5×104/200μl(存活神经元的最大数量)(图7E-F，p<0.001)。与正常组相比，Aβ干预组大鼠海马神经元轴突长度明显缩短，神经元凋亡率显著增加(P<0.001)，而年轻B细胞共培养组的结果则相反(图7G-H，p＝0.002，p＝0.020)。然而，老年B细胞干预的海马神经元与Aβ干预组观察到的没有明显差异，年轻B细胞的神经保护作用优于老年B细胞(图7G-H，p＝0.002，p＝0.028)，表明年轻B细胞可减轻Aβ所致的海马神经元损伤。
实施例4--输注年轻B细胞改善AD小鼠的认知功能
为了探讨年轻B细胞对AD小鼠认知功能的影响，用PKH26体外标记B细胞，并将其注射到9月龄AD小鼠尾静脉(图9A-B)。行为学检测表明，与WT小鼠相比，AD小鼠的认知障碍显著(图9C-E)。实验发现，在水迷宫实验中，在3个月和6个月时，B细胞治疗的AD小鼠找到目标平台的时间明显短于AD对照组(图9C，p＝0.006，p＝0.002)，B细胞治疗的AD小鼠表现出明显的认知改善趋势，表现为在3个月的训练5天总行程减少(p＝0.008)，在1个月、3个月和6个月的测试中穿台次数增加(图9C，p＝0.039，p＝0.048，p＝0.033)。Y迷宫实验进一步证明，在3个月时，B细胞治疗组小鼠的交替百分率显著高于AD对照组(p＝0.001)，并在3个月和6个月时进入新颖臂的次数增加(图9D，p＝0.040，p＝0.047)。此外，3个月和6个月的旷场实验显示，B细胞干预对AD小鼠的环境紧张没有影响，但在1个月时出现了一些紧张反应(图9E)。B细胞治疗在输注后3个月效果显著，并通过形态学检测得到证实。
实施例5--来自年轻小鼠的B细胞可改善AD小鼠的神经元丢失和总斑块和致密斑块的沉积
HE染色显示AD组小鼠大脑皮质和海马区CA1、CA2、CA3和DG区细胞明显少于WT组，细胞形态稀疏、排列不规则，海马区颗粒层厚度也明显薄于WT组。在B细胞治疗后，AD小鼠大脑皮层和海马区的细胞形态显示出与WT小鼠相同的趋势(图10)。尼氏染色结果显示，AD组小鼠大脑皮质神经元总数比WT组小鼠少(p<0.001)，黑色神经元数比WT组小鼠多，而B细胞治疗组AD小鼠皮质神经元总数与AD小鼠无明显差异，但黑色神经元数量明显减少(图11A-C，p<0.001)。同样，AD组小鼠海马区CA1、CA2、CA3和DG区神经元总数显著减少(p＝0.027，p＝0.003，p＝0.024，p＝0.002)，并伴有AD鼠四个区黑色神经元数量的显著增加(图11A-C，p<0.001)。经B细胞治疗后，海马CA2、CA3区黑色神经元数量明显减少(p<0.001，p＝0.001)，但神经元总数无明显变化(图11A-C)。为了进一步验证B细胞对AD小鼠神经元的影响，本申请在大脑皮层和海马区(CA1、CA2、CA3和DG区)进行了Neun/MAP2和Neun/活化的caspase 3的免疫组织化学染色。结果显示，阿尔茨海默病小鼠的NeuN(神经元)数量显著减少(图11D，F，p<0.001，p＝0.011，p＝0.001，p＝0.010)和MAP2(树突)的密度(图11D，G，H，p<0.001，p＝0.010，p＝0.001)，与WT小鼠相比，神经元凋亡率(用裂解的caspase-3检测)显著增加(p<0.001，p＝0.003，p＝0.001，图11E，I)。在B细胞治疗后，AD组小鼠的神经元数量(p＝0.013，p＝0.043，p＝0.004，p＝0.018)和神经元(p＝0.008，p＝0.002)和树突(p＝0.035，p＝0.006，p＝0.002)的积分密度明显高于对照组，而凋亡神经元(p＝0.001，p＝0.006，p＝0.004，p＝0.002)明显少于对照组(图11D-I)。这些数据表明，年轻小鼠的B细胞可以减少AD小鼠的神经元丢失。
此外，6E10的免疫组织化学染色和刚果红染色显示AD小鼠比野生型小鼠在皮质(p＝0.007，p<0.001，p＝0.013)和海马(面积分数：p＝0.012，p<0.001，p＝0.006；斑块数:总斑块数p＝0.004，p＝0.003，p<0.001，p＝0.017；面积分数：p＝0.005，p＝0.008，p＝0.002；斑块数目：p＝0.003，p＝0.007，p＝0.001，对于致密斑块，p<0.001)中面积更大且有更多的总斑块和致密斑块的数量(图12A-F)。B细胞治疗后，AD小鼠海马CA2、CA3和DG中总斑块的面积分数(p＝0.002，p<0.001，p＝0.023)以及皮质和海马CA2和CA3中总斑块的数量显著减少(图12A-C，p<0.001，p＝0.021)。此外，皮质(p＝0.013，p＝0.023)和四个海马区(面积分数：p＝0.039，p＝0.007，p＝0.020，p＝0.026斑块数：p＝0.006，p＝0.008，p＝0.004，p<0.001)的结果(图12D-F)，表明年轻的B细胞可以减少AD小鼠大脑皮层和海马区总斑块和致密斑块的沉积。
上文已对基本概念做了描述，显然，对于本领域技术人员来说，上述详细披露仅仅作为示例，而并不构成对本说明书的限定。虽然此处并没有明确说明，本领域技术人员可能会对本说明书进行各种修改、改进和修正。该类修改、改进和修正在本说明书中被建议，所以该类修改、改进、修正仍属于本说明书示范实施例的精神和范围。
同时，本说明书使用了特定词语来描述本说明书的实施例。如“一个实施例”、“一实施例”、和/或“一些实施例”意指与本说明书至少一个实施例相关的某一特征、结构或特点。因此，应强调并注意的是，本说明书中在不同位置两次或多次提及的“一实施例”或“一个实施例”或“一个替代性实施例”并不一定是指同一实施例。此外，本说明书的一个或多个实施例中的某些特征、结构或特点可以进行适当的组合。
一些实施例中使用了描述成分、属性数量的数字，应当理解的是，此类用于实施例描述的数字，在一些示例中使用了修饰词“大约”、“近似”或“大体上”来修饰。除非另外说明，“大约”、“近似”或“大体上”表明所述数字允许有±20％的变化。相应地，在一些实施例中，说明书和权利要求中使用的数值参数均为近似值，该近似值根据个别实施例所需特点可以发生改变。在一些实施例中，数值参数应考虑规定的有效数位并采用一般位数保留的方法。尽管本说明书一些实施例中用于确认其范围广度的数值域和参数为近似值，在具体实施例中，此类数值的设定在可行范围内尽可能精确。
最后，应当理解的是，本说明书中所述实施例仅用以说明本说明书实施例的原则。其他的变形也可能属于本说明书的范围。因此，作为示例而非限制，本说明书实施例的替代配置可视为与本说明书的教导一致。相应地，本说明书的实施例不仅限于本说明书明确介绍和描述的实施例。
Claims (10)
1.ATP5D激活剂在制备药物中的用途，所述药物具备以下任一项或多项功能：
1)治疗/预防阿尔茨海默病；
2)抑制神经元损伤；
3)使神经元形态紧密、排列规则；
4)增加海马区颗粒层厚度。
2.B淋巴细胞在制备药物中的用途，所述药物具备以下任一项或多项功能：
1)治疗/预防阿尔茨海默病；
2)保护神经元；
3)减轻神经元损伤；
4)促进受损海马神经元轴突生长；
5)减少神经元丢失或凋亡；
6)增加神经元数量；
7)增加神经元和树突积分密度；
8)使神经元形态紧密、排列规则；
9)增加海马区颗粒层厚度。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述神经元为大脑皮质和/或海马神经元。
4.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述神经元损伤由Aβ寡聚体导致。
5.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述神经元损伤为神经元凋亡数目增加和/或神经元轴突长度变短。
6.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述药物用于减轻或逆转阿尔茨海默病个体的认知功能障碍。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述认知功能障碍选自记忆力衰退和/或陌生环境恐惧症。
8.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物中，ATP5D激活剂用于：
减少阿尔茨海默病个体大脑皮质和海马中总斑块沉积；
和/或，减少阿尔茨海默病个体大脑皮质和海马CA1和DG区总斑块的面积和数量；
和/或，增加阿尔茨海默病个体大脑海马CA2区总神经元数量；
和/或，减少阿尔茨海默病个体大脑皮质和海马CA1、CA2、CA3、DG区黑色神经元数量。
9.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述ATP5D激活剂用于激活/增强ATP5D基因的表达；
和/或，所述ATP5D激活剂选自抗体、多肽、蛋白质、小分子化合物或核酸中至少一种。
10.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述B淋巴细胞为健康B淋巴细胞；所述药物中，B淋巴细胞用于：
减轻海马神经元损伤；优选的，所述海马神经元损伤为海马神经元轴突长度缩短或神经元凋亡增加；
和/或，减少阿尔兹海默病个体大脑皮质和海马区总斑块和致密斑块的面积和数量；
和/或，促进阿尔茨海默病个体海马神经元轴突生长；优选的，所述海马神经元由Aβ寡聚体致损伤；
和/或，增加阿尔茨海默病个体大脑皮质总神经元数量；
和/或，减少阿尔茨海默病个体大脑皮质黑色神经元数量；
和/或，减少阿尔茨海默病个体海马区CA2、CA3区黑色神经元数量。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310831370.9A CN116898970A (zh) | 2023-07-07 | 2023-07-07 | Atp5d激活剂与b淋巴细胞在制备药物中的用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310831370.9A CN116898970A (zh) | 2023-07-07 | 2023-07-07 | Atp5d激活剂与b淋巴细胞在制备药物中的用途 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116898970A true CN116898970A (zh) | 2023-10-20 |
Family
ID=88359527
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310831370.9A Pending CN116898970A (zh) | 2023-07-07 | 2023-07-07 | Atp5d激活剂与b淋巴细胞在制备药物中的用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116898970A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117122612A (zh) * | 2023-07-07 | 2023-11-28 | 河络新图生物科技(上海)有限公司 | 外周血单个核细胞在制备治疗/预防阿尔茨海默病的药物中的用途 |
-
2023
- 2023-07-07 CN CN202310831370.9A patent/CN116898970A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117122612A (zh) * | 2023-07-07 | 2023-11-28 | 河络新图生物科技(上海)有限公司 | 外周血单个核细胞在制备治疗/预防阿尔茨海默病的药物中的用途 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Eandi et al. | Subretinal mononuclear phagocytes induce cone segment loss via IL-1β | |
| Nandi et al. | The CSF-1 receptor ligands IL-34 and CSF-1 exhibit distinct developmental brain expression patterns and regulate neural progenitor cell maintenance and maturation | |
| Reis et al. | Conserved genetic pathways associated with microphthalmia, anophthalmia, and coloboma | |
| US10471080B2 (en) | Use of trehalose for prevention of neural tube defects | |
| Wang et al. | TREM2 overexpression attenuates cognitive deficits in experimental models of vascular dementia | |
| Wu et al. | Hippocampal overexpression of TREM2 ameliorates high fat diet induced cognitive impairment and modulates phenotypic polarization of the microglia | |
| Zepeda et al. | Functional reorganization of visual cortex maps after ischemic lesions is accompanied by changes in expression of cytoskeletal proteins and NMDA and GABAA receptor subunits | |
| Han et al. | Novel derivative of Paeonol, Paeononlsilatie sodium, alleviates behavioral damage and hippocampal dendritic injury in Alzheimer's disease concurrent with cofilin1/phosphorylated-cofilin1 and RAC1/CDC42 alterations in rats | |
| US20170312253A1 (en) | Methods of preventing and treating cerebral amyloid angiopathy (caa) with an edaravone medicament | |
| Fitz et al. | ABCA1 deficiency affects basal cognitive deficits and dendritic density in mice | |
| CN116898970A (zh) | Atp5d激活剂与b淋巴细胞在制备药物中的用途 | |
| WO2021013214A1 (zh) | 中性粒细胞在制备治疗和/或预防自身免疫性肝炎的药物中的用途 | |
| CN110100788A (zh) | 基于基因操作策略构建疾病模型的方法和应用 | |
| Zhou et al. | Enhanced autolysosomal function ameliorates the inflammatory response mediated by the NLRP3 inflammasome in Alzheimer’s disease | |
| Song et al. | Putative complement control protein CSMD3 dysfunction impairs synaptogenesis and induces neurodevelopmental disorders | |
| JP2006516538A (ja) | 記憶障害の診断および治療におけるｆｇｆ−１８の使用 | |
| Mao et al. | Elevated TGFβ signaling contributes to ocular anterior segment dysgenesis in Col4a1 mutant mice | |
| Zhang et al. | Matrine alleviates spatial learning and memory impairment in diabetic mice by inhibiting endoplasmic reticulum stress and through modulation of PK2/PKRs pathway | |
| Yang et al. | Cardioprotective effect of NRG-4 gene expression on spontaneous hypertension rats and its mechanism through mediating the activation of ErbB signaling pathway | |
| Song et al. | Metformin improves the prognosis of adult mice with sepsis-associated encephalopathy better than that of aged mice | |
| CN114344295A (zh) | 抑制剂brd4770在制备预防和治疗主动脉夹层的药物中的应用和其药物组合物 | |
| Lv et al. | Tcap deficiency in zebrafish leads to ROS production and Mitophagy, and Idebenone improves its phenotypes | |
| CN113862346B (zh) | 长链非编码rna在治疗阿尔茨海默病中的应用 | |
| Marechal et al. | Multiple congenital malformations arise from somatic mosaicism for constitutively active Pik3ca signaling | |
| Rice et al. | Sox9 marks limbal stem cells and is required for asymmetric cell fate switch in the corneal epithelium |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |