CN107206105A - 色素性视网膜炎的rpgr基因疗法 - Google Patents

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M·A·桑德博格
B·鲍里克
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Abstract

治疗患有由于编码色素性视网膜炎GTPase调节因子(RPGR)蛋白的基因中的功能丧失突变而导致的X连锁色素性视网膜炎(XLRP)或另一种临床上定义的眼科病症的人类受试者的方法，所述方法包括将包含腺伴随病毒载体的核酸给予所述受试者，所述腺伴随病毒载体包含缩短的人RPGR cDNA。

Description

色素性视网膜炎的RPGR基因疗法
优先权要求
根据35USC§119(e)，本申请要求于2014年7月24日提交的美国专利申请序列No.62/028,638的优先权。上述专利申请的全部内容以引用的方式纳入本文。
联邦资助的研究或开发
本发明是在由国立卫生研究院授予的基金EY10581和5P30EY14104的政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。
技术领域
本发明涉及治疗患有由于编码色素性视网膜炎GTPase调节因子(RPGR)蛋白的基因中的功能丧失突变而导致的X连锁色素性视网膜炎(XLRP)或另一种眼科病症的人类受试者的方法，所述方法包括将包含腺伴随病毒载体的核酸给予所述受试者，所述腺伴随病毒载体包含缩短的人RPGR cDNA。
背景技术
色素性视网膜炎(RP)是人类遗传性失明的首要形式。在三种通常的遗传模式(常染色体显性、常染色体隐性和X连锁)中，X连锁的RP(XLRP)与严重形式的涉及视杆细胞和视锥细胞作为主要靶标的疾病有关(Berson 1993；Sandberg and others 2007)。超过70％的X连锁的RP和10％-20％的全部RP病例是由编码RPGR的基因中的突变引起的(Bader andothers 2003；Branham and others 2012；Churchill and others；Pelletier and others2007)。鉴于目前已知超过100种基因中的突变导致RP和更严重的X连锁疾病，RPGR是最重要的RP疾病基因之一。
发明内容
本发明是基于成功地重新产生功能性RPGR活性的缩短形式的人RPGR的发现，并因此包括治疗患有由RPGR中的突变引起的RP的受试者的方法。可通过本发明方法治疗的受试者可包括视觉功能丧失(例如对视网膜电图(ERG)测试的受损应答)但是保留了一些感光细胞(通过光学相干断层成像术(OCT)测定)的那些。
因此，在一方面，本发明提供了治疗患有由于编码色素性视网膜炎GTPase调节因子(RPGR)蛋白的基因中的功能丧失突变而导致的XLRP或另一种临床上定义的眼科病症的人类受试者的方法。所述方法包括将包含腺伴随病毒载体的核酸给予所述受试者，所述腺伴随病毒载体包含缩短的人RPGR cDNA，其中所述缩短的人RPGR cDNA编码与SEQ ID NO:2全长至少80％相同的蛋白，所述蛋白任选地在SEQ ID NO:2中的缺失区(即SEQ ID NO:2的氨基酸861和862之间)周围的区域中具有最多达共200个额外的氨基酸的缺失。
在一些实施方案中，RPGR cDNA受人视紫红质激酶(hRK)启动子(例如包含SEQ IDNO:5或基本上由SEQ ID NO:5组成的hRK启动子)的控制。
在一些实施方案中，所述腺伴随病毒载体是AAV-2，血清型-8(AAV2/8)或AAV-8。
在一些实施方案中，所述RPGR cDNA包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列或基本上由该序列组成。
在一些实施方案中，所述人RPGR cDNA编码与SEQ ID NO:2全长至少95％相同的蛋白。
在一些实施方案中，所述方法包括以约2×1010vg/mL的低剂量、约2×1011vg/mL的中等剂量，或约2×1012vg/mL的高剂量给予所述核酸。在一些实施方案中，将所述核酸给予到视网膜下隙。在一些实施方案中，将微注射插管插入到视网膜下隙——位于视神经的颞部并且刚好位于主弓形血管(major arcade vessel)的上方，以使液体流动能够朝向视网膜黄斑。
在另一方面，本发明提供了编码缩短的人RPGR的核酸，其中所述缩短的人RPGRcDNA编码与SEQ ID NO:2全长至少80％相同的蛋白，所述蛋白任选地在SEQ ID NO:2中的缺失区周围具有最多达200个额外的氨基酸的缺失。
在一些实施方案中，RPGR cDNA受人视紫红质激酶(hRK)启动子(例如包含SEQ IDNO:5或基本上由SEQ ID NO:5组成的hRK启动子)的控制。
在一些实施方案中，所述RPGR cDNA包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列或基本上由该序列组成。
在一些实施方案中，所述人RPGR cDNA编码与SEQ ID NO:2全长至少95％相同的蛋白。
在一些实施方案中，所述人RPGR cDNA与SEQ ID NO:1全长至少80％相同，任选地在缺失区周围具有编码最多达200个额外氨基酸的核苷酸的缺失。
本文还提供了载体，例如腺伴随病毒载体，例如AAV-2，血清型-8(AAV2/8)或AAV-8，其包含编码本文所述的缩短的人RPGR的核酸，以及含有编码缩短的人RPGR的核酸并任选地表达所述缩短的人RPGR蛋白的分离的细胞(即不存在于活的人类受试者或宿主动物中的细胞)。
除非另有说明，本文使用的全部技术术语和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文记载了用于本发明的方法和材料；另外，也可使用本领域已知的适合的方法和材料。所述材料、方法和实施例仅为说明性的，不意欲进行限制。本文提到的全部出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目(entry)和其他参考文献以引用的方式全文纳入本文。如果出现冲突，以本说明书(包括定义)为准。
根据以下详细描述和附图以及权利要求，本发明的其他特征和优势将是显而易见的。
附图说明
图1A-B：(A)天然人RPGR ORF15编码区和两种缩短形式的AAV递送的人ORF15cDNA的图。(B)两种重组形式的人RPGR-ORF15的免疫印迹。小缺失的人cDNA的AAV递送(AAV-ORF15-L，“长型”)导致大小约160kD的人RPGR-ORF15蛋白的表达。大缺失的人cDNA的AAV递送(AAV-ORF15-S，“短型”)导致大小约130kD的蛋白的表达。这两种形式的人RPGR-ORF15蛋白比人视网膜组织中发现的内源人RPGR ORF15(约200kD)更小。
图2A-D：在AAV-RPGR ORF15的视网膜下递送之后，RPGR-/-小鼠视网膜中的RPGRORF 15表达。(A)叠加在Nomarski图像上以说明外视网膜的分层的人RPGR ORF15蛋白的短型(ORF15-S)和长型(ORF 15-L)的荧光图像。在1-2月龄时进行处理之后3周，对未固定的冷冻视网膜切片进行染色。(B)与小根蛋白(rootletin)共定位的两种形式的人RPGR ORF15的荧光图像。类似于野生型，两种形式的人RPGR ORF15准确定位于刚好在小根蛋白远端的感光细胞连接纤毛。RPE，视网膜色素上皮；OS，外段；CC(TZ)，连接纤毛(过渡区)；IS，内段；ONL，外核层。(C)对于用ORF15-S处理的Rpgr-/-眼(n＝3)、用ORF15-L处理的Rpgr-/-眼(n＝3)和野生型眼(n＝3)，hRPGR荧光粒子与连接纤毛处的荧光小根蛋白纤维的比例。获得内段内的小根蛋白和在100μm长的中部周边视网膜上刚好在小根蛋白远端的RPGR的计数。数值为平均值±标准误差。(D)在Rpgr-/-小鼠的固定漂浮的视网膜切片中，短型和长型ORF15蛋白的表达模式。在2-3月龄时进行处理之后4-6周，对切片进行染色以对人RPGR ORF 15蛋白定位。在野生型视网膜中，观察到鼠RPGR ORF 15蛋白为占据感光细胞内段和外段之间区域的离散的绿色荧光信号(点)，其处于过渡区或连接纤毛的水平。相比之下，短型ORF15(AAV-ORF15-S)的荧光信号不限于感光细胞连接纤毛的水平，但是观察到其也是遍及内段和外段的离散信号。长型ORF 15的荧光信号显示出非常少(如果有的话)的错误定位，并且主要限于与野生型类似的连接纤毛区。OS，外段；CC(TZ)，连接纤毛(过渡区)；IS，内段；ONL，外核层。
图3：在13月龄时(注射后6个月)，对经处理的(长型和短型ORF 15)和对照RPGR-/-小鼠视网膜中视杆细胞和视锥细胞的免疫组织化学(初始为黄色)分析。在用短型ORF 15(AAV8-ORF15-s)处理的RPGR-/-小鼠视网膜中，实际上不能区分视紫红质和视锥视蛋白(在下半部视网膜中的混合S&M视锥)错误定位染色模式与在对照视网膜中观察到的那些。在这两种小鼠视网膜中，注意到在内段和突触层中的视锥视蛋白错误定位。类似地，与月龄匹配的野生型视网膜相比，视杆和视锥外段缩短且无序，具有减少的外核层。相比之下，在用长型ORF15(AAV8-ORF15-1)处理的RPGR-/-小鼠视网膜中，视紫红质显示出类似于野生型小鼠视网膜的外段分隔(partitioning)。另外，与对照视网膜相比，在ORF 15长型处理的视网膜中，视杆外段更长且组织有序，并且ONL更厚。与对照相比，在ORF15长型处理的RPGR-/-小鼠视网膜中，视锥视蛋白染色显示出更多的具有伸长且组织有序的外段的视锥细胞。
图4A-B：在RPGR-/-小鼠中用RPGR ORF 15-1处理后对感光细胞的拯救。(A)示出了在3只18月龄的小鼠中经处理的眼(初始为红色)和对侧对照眼(初始为蓝色)的ONL厚度(上图)和IS/OS长度(下图)的堆叠条形图。(B)来自野生型小鼠和来自18月龄的RPGR-/-小鼠的经ORF15-1处理的眼和对侧对照眼的代表性光显微图像。图像取自上半部视网膜中沿着垂直经线的中部周边。
图5A-C：(A)11-14月龄时来自16只RPGR-/-小鼠的视杆a波、视杆b波和视锥b波振幅。与野生型小鼠的下限相比，对照眼(OD)显示出视锥b波振幅相对于视杆b波振幅的不成比例的损耗。除了在一种情况中，所有经处理的眼(OS)都比对侧对照眼具有更大的反应。特别地，注意到在该月龄时一半以上的经处理的眼具有等于或大于野生型下限的视杆ERG b波振幅。眼之间的所有三次测量的平均值显著不同(P<0.01)。(B)对于暗适应的(视杆)b波(上图)和光适应的(视锥)b波(下图)，在对数尺度上22只9至18月龄的RPGR-/-小鼠的ERG振幅的散点图。对于各月龄组，数据点在水平方向上轻微移动以使数据重叠最小化。使用基于全部可用数据的SAS的PROC MIXED，通过重复测量纵向回归来拟合经处理的眼和对照眼的回归线。(C)来自一对18月龄的经ORF15-1处理的和对侧对照RPGR-/-眼的代表性暗适应(DA)和光适应(LA)ERG波形。示出野生型(月龄匹配)ERG波形用于比较。在该月龄时，对照眼分别具有严重减少或几乎消失的视杆和视锥ERG。然而，经处理的眼在该时间点时仍具有显著的视杆和视锥功能，其分别为野生型数值的约70％和35％。
图6：5名因RPGR ORF 15突变而患有XLRP的患者对0.5Hz白光闪光和对30Hz相同的白光闪光的全视野ERG。将三次或多次迹线叠加以说明重现性。迹线上方的点指示闪光开始。尽管对0.5Hz闪光的反应仅比正常下限(350μV)减小6％至65％，对30Hz闪光的反应未能如图说明被检测出(即，没有带通滤波和信号平均)。
具体实施方式
病毒载体介导的体基因疗法已在治疗人视网膜变性疾病的动物模型中表现出广阔的前景。迄今为止，已有许多在小动物模型(Ali and others2000；Pang and others2012；Pawlyk and others 2010；Pawlyk and others 2005；Tan and others 2009)和大动物模型(Acland and others2001；Alexander and others 2007；Beltran and others2012；Komaromy and others 2010；Lheriteau and others 2009)中使用腺伴随病毒(AAV)介导的基因递送以拯救感光细胞变性的成功的研究。在这些病例中，视网膜色素上皮(RPE)或感光细胞是转基因表达的主要靶标。此外，I期临床试验——包括对患有靶向RPE的先天性利伯氏黑蒙(LCA)(Bainbridge and others 2008；Cideciyan and others 2008；Maguire and others 2008)以及最近的无脉络膜(Maclaren and others2014)的患者的基因治疗——已经取得了一些成功。目前没有临床试验使用AAV介导的基因置换疗法来治疗患有X连锁的RP的患者。
本发明人之前已使用转基因方法，利用在富含嘌呤的羧基末端缺少约600bp的缩短的鼠RPGR ORF15同源体证明了在缺少RPGR的小鼠中对视杆细胞和视锥细胞的功能和形态拯救(Hong and others2005)。在正常个体中频繁发现在重复区长度中的一些变异(Bader and others 2003；Jacobi and others 2005；Karra and others 2006)。然而，缩短的人RPGR的功能尚未被描述。
在本研究中，由之前记载的视紫红质激酶(RK)启动子驱动(Khani and others2007；Sun and others 2010)并且在快速作用的AAV8载体中递送(Allocca and others2007；Natkunarajah and others2008)的缩短的人RPGR ORF15置换基因能够在RPGR敲除小鼠模型中拯救感光细胞变性表型。ORF 15外显子的富含嘌呤的重复区是RPGR的准确的亚细胞定位和功能所必需的，但是将其长度缩短最多达1/3似乎并未损害它的功能。在未来的人类基因治疗试验中，这种缩短的RPGR替换基因提供了迄今为止回避的“全长”RPGR ORF 15的可行的替代物。
RPGR
RPGR以复杂的模式表达，已记载默认的变体和ORF 15变体(Vervoort and others2000)。RPGR的默认型或组成型跨越外显子1-19，并且ORF 15在外显子16-19开始之前在被指定为ORF 15的大可变外显子中终止。ORF15外显子的独特之处在于，它包含很长一段富含嘌呤的重复序列，该序列被证明难以克隆成cDNA并且在许多重组DNA操作步骤中不稳定。尽管RPGR的更小的默认形式是具有运动纤毛(Hong et al,2003)和许多类型的原纤毛(我们未公开的数据)的组织中的主要形式，RPGR的ORF 15同源体是视网膜中正常视杆和视锥功能必需的(Vervoort and others 2000；Vervoort and Wright 2002)，并且主要在感光细胞中表达(Hong and others 2003)。ORF 15也是RPGR突变的通常位点，具有在22-60％的X连锁的RP患者中鉴定的突变(Breuer and others 2002；Vervoort and others2000)。
本发明人促成开发了携带RPGR中的无效突变、任何RPGR的同源体的水平都不可检测的第一个X连锁RP的小鼠模型(Hong and others 2000)。RPGR无效小鼠表现出缓慢发展的视网膜变性，其特征在于早期视锥细胞视蛋白在细胞体和突触中的错误定位以及视杆细胞中的视紫红质水平降低。因此，这些小鼠具有视锥-视杆变性。到12月龄时，通过视网膜电图(ERG)测量的显著的感光细胞损失以及视锥和视杆功能减退变得明显。在视网膜中，RPGR经由RPGR相互作用蛋白(RPGRIP1)结合于位于内段和外段之间的感光细胞连接纤毛(参见，例如Boylan and Wright 2000；Hong and others 2001；Roepman and others 2000)。所述连接纤毛类似于运动纤毛或原纤毛的过渡区，其可充当通向外段的通道。这种亚细胞定位模式和突变的小鼠表型表明，RPGR可在视杆和视锥的内段和外段之间的蛋白转运中发挥作用(Hong and Li 2002；Hong and others 2000；Hong and others 2001)。为了开发具有更快变性进程的RPGR突变小鼠模型，最近已开发了若干其他RPGR小鼠系(Brunner,et al,2010；Huang et al,2012)。最近还报道了天然存在的X连锁RPGR模型(rd9)(Thompson andothers 2012)。在全部这些情况中，包括RPGR无效小鼠表现出缓慢发展的感光细胞损失，但是视杆和视锥参与程度不同，这可能部分是由于应力(strain)和/或色素沉着的差异。这些发现表明，敲除模型中的缓慢的变性速率是由于物种差异而非脱离(ablation)不完全，并且确认了该鼠模型在患者中的无效RPGR突变的治疗研究中的适用性。
全长人RPGR的两种变体(A和C)(也已知为CRD；RP3；COD1；PCDX；RP15；XLRP3；orfl5；和CORDX1)记载于GenBank；同源体A的登录号为NM_000328.2(核酸)和NP_000319.1(蛋白)；同源体C的登录号为NM_001034853.1(核酸)和NP 001030025.1(蛋白)。与变体C相比，变体(A)使用可变剪接位点并且在3’编码区包含多个可变外显子，并且编码同源体A(也称为同源体1)，所述同源体A与同源体C相比更短并且具有不同的C端。用于本文所述的示例性组合物的序列如以下SEQ ID NO：1所示。可用于本文所述的组合物和方法的人RPGR的序列可与SEQ ID NO：1全长至少80％，例如85％、90％、95％或100％相同，从缺失区缺失最多达额外的50、100、150或200个氨基酸，所述缺失在以下序列中通过破折号来表示。
具有378bp缺失的人RPGRORF15序列的缩短形式，缺失区由破折号表示(“-”；破折号的数目与缺失的大小不相关)。
ATGAGGGAGCCGGAAGAGCTGATGCCCGATTCGGGTGCTGTGTTTACATTTGGGAAAAGTAAATTTGCTGAAAATAATCCCGGTAAATTCTGGTTTAAAAATGATGTCCCTGTACATCTTTCATGTGGAGATGAACATTCTGCTGTTGTTACCGGAAATAATAAACTTTACATGTTTGGCAGTAACAACTGGGGTCAGTTAGGATTAGGATCAAAGTCAGCCATCAGCAAGCCAACATGTGTCAAAGCTCTAAAACCTGAAAAAGTGAAATTAGCTGCCTGTGGAAGGAACCACACCCTGGTGTCAACAGAAGGAGGCAATGTATATGCAACTGGTGGAAATAATGAAGGACAGTTGGGGCTTGGTGACACCGAAGAAAGAAACACTTTTCATGTAATTAGCTTTTTTACATCCGAGCATAAGATTAAGCAGCTGTCTGCTGGATCTAATACTTCAGCTGCCCTAACTGAGGATGGAAGACTTTTTATGTGGGGTGACAATTCCGAAGGGCAAATTGGTTTAAAAAATGTAAGTAATGTCTGTGTCCCTCAGCAAGTGACCATTGGGAAACCTGTCTCCTGGATCTCTTGTGGATATTACCATTCAGCTTTTGTAACAACAGATGGTGAGCTATATGTGTTTGGAGAACCTGAGAATGGGAAGTTAGGTCTTCCCAATCAGCTCCTGGGCAATCACAGAACACCCCAGCTGGTGTCTGAAATTCCGGAGAAGGTGATCCAAGTAGCCTGTGGTGGAGAGCATACTGTGGTTCTCACGGAGAATGCTGTGTATACCTTTGGGCTGGGACAATTTGGTCAGCTGGGTCTTGGCACTTTTCTTTTTGAAACTTCAGAACCCAAAGTCATTGAGAATATTAGGGATCAAACAATAAGTTATATTTCTTGTGGAGAAAATCACACAGCTTTGATAACAGATATCGGCCTTATGTATACTTTTGGAGATGGTCGCCACGGAAAATTAGGACTTGGACTGGAGAATTTTACCAATCACTTCATTCCTACTTTGTGCTCTAATTTTTTGAGGTTTATAGTTAAATTGGTTGCTTGTGGTGGATGTCACATGGTAGTTTTTGCTGCTCCTCATCGTGGTGTGGCAAAAGAAATTGAATTCGATGAAATAAATGATACTTGCTTATCTGTGGCGACTTTTCTGCCGTATAGCAGTTTAACCTCAGGAAATGTACTGCAGAGGACTCTATCAGCACGTATGCGGCGAAGAGAGAGGGAGAGGTCTCCAGATTCTTTTTCAATGAGGAGAACACTACCTCCAATAGAAGGGACTCTTGGCCTTTCTGCTTGTTTTCTCCCCAATTCAGTCTTTCCACGATGTTCTGAGAGAAACCTCCAAGAGAGTGTCTTATCTGAACAGGACCTCATGCAGCCAGAGGAACCAGATTATTTGCTAGATGAAATGACCAAAGAAGCAGAGATAGATAATTCTTCAACTGTAGAAAGCCTTGGAGAAACTACTGATATCTTAAACATGACACACATCATGAGCCTGAATTCCAATGAAAAGTCATTAAAATTATCACCAGTTCAGAAACAAAAGAAACAACAAACAATTGGGGAACTGACGCAGGATACAGCTCTTACTGAAAACGATGATAGTGATGAATATGAAGAAATGTCAGAAATGAAAGAAGGGAAAGCATGTAAACAACATGTGTCACAAGGGATTTTCATGACGCAGCCAGCTACGACTATCGAAGCATTTTCAGATGAGGAAGTAGAGATCCCAGAGGAGAAGGAAGGAGCAGAGGATTCAAAAGGAAATGGAATAGAGGAGCAAGAGGTAGAAGCAAATGAGGAAAATGTGAAGGTGCATGGAGGAAGAAAGGAGAAAACAGAGATCCTATCAGATGACCTTACAGACAAAGCAGAGGTGAGTGAAGGCAAGGCAAAATCAGTGGGAGAAGCAGAGGATGGGCCTGAAGGTAGAGGGGATGGAACCTGTGAGGAAGGTAGTTCAGGAGCAGAACACTGGCAAGATGAGGAGAGGGAGAAGGGGGAGAAAGACAAGGGTAGAGGAGAAATGGAGAGGCCAGGAGAGGGAGAGAAGGAACTAGCAGAGAAGGAAGAATGGAAGAAGAGGGATGGGGAAGAGCAGGAGCAAAAGGAGAGGGAGCAGGGCCATCAGAAGGAAAGAAACCAAGAGATGGAGGAGGGAGGGGAGGAGGAGCATGGAGAAGGAGAAGAAGAGGAGGGAGACAGAGAAGAGGAAGAAGAGAAGGAGGGAGAAGGGAAAGAGGAAGGAGAAGGGGAAGAAGTGGAGGGAGAACGTGAAAAGGAGGAAGGAGAGAGGAAAAAGGAGGAAAGAGCGGGGAAGGAGGAGAAAGGAGAGGAAGAAGGAGACCAAGGAGAGGGGGAAGAGGAGGAAACAGAGGGGAGAGGGGAGGAAAAAGAGGAGGGAGGGGAAGTAGAGGGAGGGGAAGTAGAGGAGGGGAAAGGAGAGAGGGAAGAGGAAGAGGAGGAGGGTGAGGGGGAAGAGGAGGAAGGGGAGGGGGAAGAGGAGGAAGGGGAGGGGGAAGAGGAGGAAGGAGAAGGGAAAGGGGAGGAAGAA-GGGGAGGGGGAAGAGGAGGAAGGGGAAGAAGAAGGGGAGGAAGAAGGAGAGGGAGAGGAAGAAGGGGAGGGAGAAGGGGAGGAAGAAGAGGAAGGGGAAGTGGAAGGGGAGGTGGAAGGGGAGGAAGGAGAGGGGGAAGGAGAGGAAGAGGAAGGAGAGGAGGAAGGAGAAGAAAGGGAAAAGGAGGGGGAAGGAGAAGAAAACAGGAGGAACAGAGAAGAGGAGGAGGAAGAAGAGGGGAAGTATCAGGAGACAGGCGAAGAAGAGAATGAAAGGCAGGATGGAGAGGAGTACAAAAAAGTGAGCAAAATAAAAGGATCTGTGAAATATGGCAAACATAAAACATATCAAAAAAAGTCAGTTACTAACACACAGGGAAATGGGAAAGAGCAGAGGTCCAAAATGCCAGTCCAGTCAAAACGACTTTTAAAAAATGGGCCATCAGGTTCCAAAAAGTTCTGGAATAATATATTACCACATTACTTGGAATTGAAGTAA(SEQ ID NO：1)
缩短形式的人RPGRORF15的蛋白序列，缺失区由破折号表示(“-”；破折号的数目与缺失的大小不相关)
全长人RPGRORF15cDNA序列；缩短形式中缺失的378bp在以下序列中以加粗和下划线示出。
全长人RPGRORF15氨基酸序列；缩短形式中缺失的氨基酸在以下序列中以加粗和下划线示出。
可使用数学算法来实现序列比较并确定两条序列之间的同一性百分数。例如，可使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.48：444-453)算法(其在GCG软件包(可在万维网gcg.com获得)中被并入GAP程序)，使用默认参数(例如Blossum 62计分矩阵，空位罚分12，空位延伸罚分4，移码空位罚分5)来确定两条氨基酸序列之间的同一性百分数。
RK启动子
在本文所述方法的一些实施方案中，使用了置换基因构建体，其中缩短的人RPGRcDNA被置于人视紫红质激酶(hRK)启动子的控制下。在一些实施方案中，所述RK启动子的长度约为200bp(来自视紫红质激酶(RK)基因的短启动子，其已显示出在视杆细胞和视锥细胞中驱动细胞特异性表达(Khani et al，2007；Sun et al，2010；Young et al，2003))。示例性的hRK启动子序列是-112/+87(Khani et al.，2007)：
GGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGT(SEQ ID NO：5)
病毒递送载体
上述缩短的人RPGR cDNA被包装成递送载体，例如AAV8或AAV2/8载体。
可以以任何有效的载体(例如任何能够将组分基因有效递送到体内细胞的制剂或组合物)来给予置换基因(cDNA)。方法包括将所述基因插入到非致病性、非复制型的病毒载体(包括重组逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、慢病毒和单纯疱疹病毒-1)或重组的细菌或真核质粒。病毒载体直接转染细胞；质粒DNA可在裸露状态下递送，或借助例如阳离子脂质体(lipofectamine)或衍生的(例如抗体缀合的)多聚赖氨酸缀合物、gramacidin S、人工病毒包膜或其他这类胞内载体，以及在体内进行的基因构建体的直接注射或CaPO4沉淀。
在体内将核酸引入细胞中的优选方法是通过使用包含核酸(例如cDNA)的病毒载体。用病毒载体感染细胞的优势在于，大部分靶细胞能够接收核酸。此外，在病毒载体内编码的分子(例如通过病毒载体中包含的cDNA)可在吸收病毒载体核酸的细胞中有效表达。
腺病毒载体和腺伴随病毒载体可用作重组基因递送系统，用于在体内转移外源基因，特别是转移到人中。这些载体提供基因到细胞中的有效递送，并且被转移的核酸被稳定整合到宿主的染色体DNA中。仅产生复制缺陷型逆转录病毒的特定的细胞系(被称为“包装细胞”)的开发增大了逆转录病毒用于基因治疗的实用性，并且缺陷型逆转录病毒被表征为用于以基因治疗为目的的基因转移(参见Miller，Blood76：271(1990))。复制缺陷型逆转录病毒可被包装成病毒粒子，所述病毒粒子可用于通过标准技术使用辅助病毒来感染靶细胞。产生重组逆转录病毒和在体外或体内用这样的病毒感染细胞的方案可参见Ausubel，etal，eds.，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates，(1989)，Sections 9.10-9.14和其他标准实验室手册。适合的逆转录病毒的实例包括本领域技术人员已知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。用于制备亲嗜性和兼嗜性逆转录病毒系统的适合的包装病毒系包括ΨCrip、ΨCre、Ψ2和ΨAm。逆转录病毒用于在体外和/或体内将多种基因引入许多不同的细胞类型，包括上皮细胞(参见，例如Eglitis,et al.(1985)Science230:1395-1398；Danos and Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464；Wilson et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3014-3018；Armentano et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:6141-6145；Huber et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88:8039-8043；Ferry et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:8377-8381；Chowdhuryet al.(1991)Science254:1802-1805；van Beusechem et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:7640-7644；Kay et al.(1992)Human Gene Therapy3:641-647；Dai et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10892-10895；Hwu et al.(1993)J.Immunol.150:4104-4115；U.S.Patent No.4,868,116；U.S.Patent No.4,980,286；PCT申请WO 89/07136；PCT申请WO 89/02468；PCT申请WO 89/05345；和PCT申请WO 92/07573)。
另一种可用于本发明方法的病毒基因递送系统利用衍生自腺病毒的载体。可操纵腺病毒的基因组，以使它编码和表达目的基因产物，但是丧失其在正常的裂解病毒生命周期中复制的能力。参见，例如Berkner et al,BioTechniques 6:616(1988)；Rosenfeld etal,Science252:431-434(1991)；和Rosenfeld et al,Cell 68:143-155(1992)。源自腺病毒毒株Ad 5型dl324或腺病毒其他毒株(例如Ad2、Ad3或Ad7等)的适合的腺病毒载体是本领域技术人员已知的。重组腺病毒在某些情况下的优势在于，它们不能感染非分裂细胞并且可用于感染多种细胞类型，包括上皮细胞(Rosenfeld et al,(1992)，见上文)。此外，病毒粒子是相对稳定的并且易于被纯化和浓缩，并且如上文所述，可对病毒粒子进行修饰以影响感染性范围。此外，被引入的腺病毒DNA(和其中包含的外源DNA)未被整合到宿主细胞的基因组中，而是保持游离，从而避免了由于原位(被引入的DNA整合到宿主基因组中的位置(例如逆转录病毒DNA))插入诱变而产生的潜在问题。此外，腺病毒基因组对外源DNA的携带能力相对于其他基因递送载体更大(最多达8千碱基)(Berkner et al，见上文；Haj-Ahmandand Graham,J.Virol.57:267(1986))。
另一种可用于递送核酸的病毒载体系统是腺伴随病毒(AAV)。腺伴随病毒是天然存在的缺陷型病毒，其需要另一种病毒(例如腺病毒或疱疹病毒)作为辅助病毒以实现有效复制和生产性的生命周期(参见Muzyczka et al,Curr.Topics in Micro,andImmunol.l58:97-129(1992))。它也是可将其DNA整合到非分裂细胞中并且表现出高频率稳定整合的少数病毒之一(参见，例如Flotte et al,Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7:349-356(1992)；Samulski et al,J.Virol.63:3822-3828(1989)；和McLaughlin et al,J.Virol.62:1963-1973(1989))。AAV的包含少达300碱基对的载体能够被包装并整合。外源DNA的空间被限制在约4.5kb。AAV载体(如Tratschin et al,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)中记载的载体)可用于将DNA引入细胞中。已使用AAV载体将许多核酸引入不同的细胞类型中(参见，例如Hermonat et al,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6466-6470(1984)；Tratschin et al,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1985)；Wondisford et al,Mol.Endocrinol.2:32-39(1988)；Tratschin et al,J.Virol.51:611-619(1984)；和Flotte et al,J.Biol.Chem.268:3781-3790(1993))。
在优选的实施方案中，所述病毒递送载体是重组的AAV2/8病毒。
在给药前，最终产品将经过一系列超纯化步骤以符合临床级标准。
受试者选择
为本发明的治疗方法的候选者的受试者包括被诊断具有由编码RPGR的基因中的突变引起的RP的那些。也可使用本文所述的方法来治疗患有由编码RPGR的基因中的突变引起的其他眼科临床确定的病症(例如X连锁的视锥-视杆营养不良)的受试者。可使用本领域已知的方法来诊断由编码RPGR的基因中的突变引起的XLRP或另一种眼科病症。
本文所述的方法可包括鉴定受试者(例如，儿童、青少年或年轻成年受试者)，其患有由编码RPGR的基因中的突变引起的XLRP或另一种眼科病症，或疑似患有由编码RPGR的基因中的突变引起的XLRP或另一种眼科病症(例如，基于存在所述病症的症状并且没有其他明显的原因)；以及从所述受试者获得包含基因组DNA的样品，使用已知的分子生物学方法检测RPGR中突变的存在，以及选择具有导致XLRP或另一种病症的RPGR中的突变的患者。检测RPGR中的突变可包括检测ORF15中的突变，例如Sandberg et al,(2007).InvestOphthalmol Vis Sci 48,1298-304；Dror et al,Am J Hum Genet.Nov 2003；73(5):1131-1146中所记载的。
RPGR ORF15中的突变包括移码突变、无义突变、剪接位点突变和错义突变。示例性的突变包括ORF15Glu446(1-bp-del)、ORF15Glu447(2-bp-del)和ORF15GLys521(l-bp-ins)。
检测RPGR中的突变也可包括对受试者的RPGR基因进行全部测序或部分(例如ORF15区域)测序，以及比较所述序列与参照序列(例如，GenBank登录号NG_009553.1)以检测突变。移码突变、截短突变、改变保守氨基酸的突变或影响调控区(例如启动子)的突变可被认为是导致本文所述的XLRP或另一种眼科病症的突变；可通过体外(例如在培养的细胞中)或体内(例如在转基因动物中)表达突变体并测定例如功能或亚细胞定位来确认功能改变。
可使用本文所述的方法来治疗的患有因RPGR突变而导致的XLRP或另一种眼科病症的患者优选保留一些感光细胞和视觉功能，例如通过标准视觉功能或视野测试和/或光学相干断层成像术(OTC，例如谱域OTC(SD-OCT))所测量的；参见，例如Sandberg et al,Invest Ophthalmol Vis Sci.2007；48:1298-1304。本文所述的方法可包括鉴定受试者，其被诊断为患有因RPGR突变而导致的XLRP或另一种眼科病症，其具有导致他们的病症的RPGR中的经确认的突变；以及检测他们的视觉能力并检测剩余的中央感光细胞的存在。可使用本发明方法来治疗的受试者(例如儿童、青少年、年轻成年人或成年人受试者)优选具有至少20/200的视敏度(用于测定视敏度的方法是本领域熟知的；参见例如Johnson,Deafness and Vision Disorders:Anatomy and Physiology,Assessment Procedures,Ocular Anomalies,and Educational Implications,Charles C.Thomas Publisher；1999；Carlson,N；Kurtz,D.；Heath,D.；Hines,C.Clinical Procedures for Ocular Examination.Appleton&Lange；Norwalk,CT.1990)和中央凹中的可检测的外核层(例如，至少正常厚度的75％、80％、90％、95％或99％)。
实施例
在以下实施例中对本发明作进一步描述，所述实施例并不限制权利要求中所述的本发明的范围。
材料和方法
以下材料和方法用于下文所述的实施例。
动物
之前记载了RPGR-/-小鼠的产生和分析(Hong and others 2000)。用于本研究的RPGR-/-小鼠是从我们的机构动物设施中养育的缺合型RPGR雄性和纯合型(RPGR-/-)雌性之间的同胞交配而繁殖的。用于研究的野生型小鼠是来自Charles River实验室(Wilmington,MA)的C57BL。将小鼠养育在12hr光照/12hr黑暗的光照周期中。研究按照在眼科和视觉研究中使用动物的ARVO声明完成，并且由马萨诸塞州眼耳医院的IACUC批准。
质粒构建和重组AAV8的产生
使用被设计以包含全部RPGR ORF 15同源体编码区的引物，通过PCR从人视网膜cDNA扩增人RPGR ORF 15cDNA。尽管使用多种方法反复尝试，仍未得到全长ORF 15cDNA，这与其他研究者和我们自己的经验一致(Hong and others 2005)。相反，我们获得了在ORF15外显子中包含大的314个密码子(942bp)框内缺失的缩短的ORF 15cDNA(剩余2517bp)，其中富含嘌呤的重复区被移除(密码子696-1010del，“短型”)(图1A)。通过重组DNA操作来构建第二ORF15cDNA，其在外显子15的高度重复区中包含126个密码子(378bp)框内缺失(在ORF 15外显子中剩余3081bp)(密码子862-988del，“长型”)。对这些ORF15cDNA进行测序以验证保真度。为了构建AAV载体，将RPGR cDNA插入到亲本pAAV-RK-zsGreen载体的多克隆位点。将所得的pAAV-RK-mRPGR和pAAV-RK-hRPGR载体包装成AAV。通过三部分转染产生AAV2/8假型载体：(1)编码目的基因的AAV载体质粒；(2)编码来自血清型2的AAV Rep蛋白和来自血清型8的Cap蛋白的AAV辅助质粒pLT-RC03；和(3)进入293A细胞的腺病毒辅助小质粒pHGTI-Adeno1)。使用Xiao及其合作者开发的方案进行转染(Xiao,et al,1998)。转染后两天，通过反复的冷融循环来裂解细胞。在初步除去细胞碎片后，通过核酸酶(Benzonase)处理来除去病毒生产细胞的核酸组分。通过碘克沙醇密度梯度纯化重组的AAV载体粒子。将纯化的载体粒子用PBS大量透析，并通过斑点印迹杂交进行滴定。
视网膜下注射
使用腹膜内注射氯胺酮(90mg/kg)/甲苯噻嗪(9mg/kg)，将小鼠置于全身麻醉。将0.5％丙对卡因溶液作为局部麻醉剂施用到角膜。通过局部施用环喷托酯和盐酸去氧肾上腺素使瞳孔扩大。在眼科手术显微镜下，使用18号针头，穿过与角膜缘邻近的角膜切开一个小切口。将安装到Hamilton注射器的33号钝针头通过切口插入到晶状体后并推过视网膜。在视网膜的鼻象限内的位置，在视网膜下进行全部注射。在视网膜的鼻象限内，在视网膜下进行注射。每只眼接受2×109载体基因组(AAV-ORF15-L)/μl或5×109载体基因组(AAV-ORF15-S)/μl。将RPGR-ORF15载体给予至左眼(OS，左眼)，并且将对照载体(AAV8-RK-EGFP)给予至右眼(OD，右眼)。这些在本文中分别被称为“经处理的”或“对照”。通过向载体悬浮液中添加0.1体积％的荧光素(100mg/ml AK-FLUOR,Alcon,Inc.)来辅助注射期间的可视化(visualization)。注射之后的眼底检查发现在大多数情况下>30％的视网膜分离，确认了成功的视网膜下递送。在1月龄时对小鼠群(总共n＝50)进行注射以进行蛋白表达研究，并且在主要感光细胞丧失之前在3至7月龄时(因为ERG在该月龄期间保持正常)进行注射以进行功能(ERG)和组织学研究。
组织学和免疫荧光法
对于光学显微镜检查和透射电子显微镜检查，将摘出的眼固定在溶于0.1M二甲胂酸盐缓冲液(pH7.5)中的1％甲醛、2.5％戊二醛中10分钟。在除去前段和晶状体之后，在4℃将眼杯(eyecup)留在相同的固定剂中过夜。将眼杯用缓冲液冲洗，然后在四氧化锇中后固定，通过分级醇系列脱水并包埋在Epon中。切割半薄切片(1μm)，用于光学显微镜观察。对于EM，将超薄切片在乙酸双氧铀和柠檬酸铅中染色，然后在JEOL 100CX电子显微镜上检查。
对于纤毛蛋白的免疫荧光染色，摘除眼睛，速冻并在低温恒温器中切成10μm切片。然后在玻片上收集未固定的冷冻切片并进行染色。对于所有其他蛋白的免疫染色，收集漂浮的视网膜切片并进行染色。对于这一过程，将眼置于固定剂(2％甲醛，0.25％戊二醛/PBS)中并除去它们的前段和晶状体。固定的持续时间通常为20分钟。将固定的组织浸泡在30％蔗糖/PBS中至少2小时，速冻并与未固定的组织类似地切成切片。然后将切片收集到PBS缓冲液中并使其在免疫染色过程的持续时间中保持自由漂浮。观察染色的切片并在激光扫描共焦显微镜(model TCS SP2；Leica)上拍照。使用的抗体是小鼠RPGR(SI)、人RPGRC100、抗小根蛋白、1D4(抗视紫红质)、混合蓝/绿视锥抗视蛋白和Hoechst 33342、核染料染色。
免疫印迹分析
在RIPA缓冲液中使视网膜组织均质化，在Laemmli缓冲液中煮沸并在5％SDS-PAGE凝胶上以15μg/泳道上样。凝胶分离后，通过电转移将蛋白质印在PVDF膜上。将膜用5％脱脂乳封闭，并在室温下用一级抗体孵育过夜。冲洗后，将膜用过氧化物酶缀合的二级抗体孵育。West Pico化学发光底物(Pierce)用于检测。对于归一化(normalization)，将蛋白质样品在SDS-PAGE上分离并用转导素α抗体(Vanderbilt大学Heidi Hamm博士的赠予)探测。
ERG记录
使小鼠在黑暗中过夜适应，在试验前经腹膜内注射戊巴比妥钠来麻醉小鼠。使用盐酸去氧肾上腺素和盐酸环喷托酯来使每只动物的两个瞳孔局部放大，然后将小鼠置于加热的平台上。在Ganzfeld拱顶(dome)中使用以1分钟间隔出现的白光的10-μs闪光(1.37×105cd/m2)在黑暗中引起视杆主导的反应。在41cd/m2视杆脱敏的白光背景下，使用以1Hz间隔出现的相同闪光(1.37×105cd/m2)来引起光适应的视锥反应。使用与每只角膜(其用盐酸丙对卡因局部麻醉并用羟丙甲纤维素眼液(Goniosol)润湿)接触的银线环形电极同时从双眼监测ERG，使用颈部中的皮下电极作为参照；将电屏蔽的室用作接地端(ground)。
将所有反应在1000增益(在2Hz和300Hz下-3db；AM502,Tektronix Instruments,Beaverton,OR)下差异放大，使用可调节的峰峰输入振幅在16位分辨率下数字化(PCI-6251,National Instruments,Austin,TX)，并使用定制软件在个人计算机上显示(Labview,version 8.2,National Instruments)。单独地对于每只眼，将视锥反应通过60Hz陷波滤波器和可调节的产物-拒绝窗口(artifact-reject window)进行调整，求和(n＝4-20)，然后拟合到具有可变硬度的三次样条函数以提高信噪比而不影响时间特征；以这种方式，我们能够以小至2μV来解析b波反应。
统计学分析
使用JMP，版本6(SAS Institute,Cary,NC)来比较横向的ERG振幅和隐含的次数。使用PROC MIXED OF SAS，版本9.3(SAS Institute)的重复测量分析用于组织学比较并用于比较处理的眼相对于未处理的眼的纵向ERG数据。
患者
检查从Sharon,et al(2003)中记载的数据组获得的针对111名患有因ORF15RPGR突变而导致的XLRP的患者的全视野视网膜电图(ERG)数据，以比较对0.5Hz白光的b波振幅，其反映了剩余的视杆+视锥功能，以及对相同白光的30Hz闪光的b波振幅，其反映了剩余的单独的视锥功能。为了确定他们是否患有视杆-视锥或视锥-视杆疾病，我们计算了对于OD和对于OS他们对0.5Hz闪光的振幅除以他们对30Hz闪光的振幅的比值；在我们的系统中正常的下限的相同比值为350μV/50μV＝7。为了更精确地定量对0.5Hz闪光的反应振幅并且使主要的感光细胞变性的可能的次要效应最小化，我们集中在其对0.5Hz闪光的振幅>50μV(反映出早期或程度较轻的疾病)的那些患者(n＝14)。
具有ORF15突变的患者的ERG
对于14名对0.5Hz白光闪光具有最强反应(反映出剩余的视杆+视锥功能)的患者而言，对该条件的振幅范围为53μV至329μV OD和59μV至282μV OS。他们对相同白光的30Hz闪光的振幅(反映出单独的视锥功能并使用带通滤波和振幅<10μV的信号平均来进行监测)范围为0.98μV至23.5μV OD和0.95μV至20μV OS。对0.5Hz闪光的反应振幅除以对30Hz闪光的反应振幅的比值的平均值±标准误差为47.0±12.7OD和48.7±13.0OS。这些平均值显著不同于7.0——基于正常的下限的比值(非参数符号秩检验，p＝0.0004OD和p＝0.001OS)。换言之，这些具有ORF15突变的患者具有显著不成比例的视锥功能丧失。这些ERG的实例示于图6。
实施例1.AAV介导的人RPGR ORF15的表达
我们构建了两种人RPGR ORF15置换基因，一种具有126个密码子的框内缺失(长型，ORF 15-L)，另一种具有314个密码子的框内缺失(短型，ORF 15-S)。将这两种基因插入到AAV8载体中，所述载体受人视紫红质激酶启动子(图1A)的控制(Khani and others2007；Sun and others 2010)。所述两种人RPGR ORF15置换基因的视网膜下递送(左眼)导致产生重组RPGR蛋白。通过蛋白质印迹法，在给予AAV载体之后2周，长型ORF 15产生约160kD蛋白，而短型ORF 15产生约125kD蛋白。这两种蛋白产物都小于人视网膜组织中的天然ORF 15(约200kD)(图1B、C)。当使用针对人RPGR的C端的抗体探测时，这两种置换ORF15形式呈现为单一条带。在我们的实验条件和给予的剂量下，ORF15-S和ORF 15-L的表达水平是相当的。对照眼(右眼)接受AAV-GFP。
通过未固定的冰冻切片的免疫荧光染色可在RPGR-/-小鼠的视网膜中看见ORF 15的两种形式(视网膜下注射之后3周)，其准确定位于连接纤毛所在的内段和外段之间的层。然而，短型(AAV8-ORF15-s)产生的信号比长型(AAV8-ORF15-l)产生的信号弱得多(图2A)。在良好转导的视网膜区，来自经长型处理的视网膜的信号似乎无法与野生型信号区分开(图2A、B)。使用抗体对纤毛根丝——其源自基体的近端并向细胞内部延伸，因此被用作纤毛区的极好的标记物(Hong and others 2003；Yang and others2002)——进行的双标记确认了重组RPGR到连接纤毛的准确亚细胞定位(图2B)。不同于通过蛋白质印迹法测定的蛋白表达水平的相似性，只有长型ORF 15似乎在与根丝数目匹配的每个CC具有强信号，而在短型处理的视网膜中，许多根丝在其远端不具有RPGR信号。图2C示出了相对于用长型或短型人ORF 15处理的Rpgr-/-小鼠视网膜中以及未处理的野生型小鼠视网膜中的小根蛋白纤维的计数，代表RPGR标记计数的柱状图。ORF 15长型相对于野生型，平均比值(RPGR信号计数除以小根蛋白纤维计数)没有差异(Dunnett’s方法，p＝.24)，但是与野生型相比，ORF 15短型的平均比值显著更低(p＝.0019)。
鉴于通过免疫印迹法测定的相似的表达水平，在连接纤毛处的蛋白定位差异表明，或许一部分短型ORF 15错误定位到感光细胞内部的其他位置。通过免疫染色对固定的视网膜切片(其以损耗信号强度为代价，更好地保存组织)的进一步分析揭示出短型ORF 15的错误定位到感光细胞内段和外段的ORF 15模式(图2D)。对于长型ORF15而言，未见到错误定位，所述长型ORF15与野生型具有相似的染色模式。因此，短型RPGR在CC处的染色缺乏是由于定位于或局限于该亚细胞区室的能力降低，而非总体表达水平更低。
实施例2.在RPGR无效的小鼠中的人ORF15-l(长型)表达促进视杆和视锥细胞存活
为了研究所述两种置换基因的治疗功效，我们通过免疫染色评估了RPGR-/-小鼠感光细胞以寻找视杆和视锥细胞形态改善的征象。到13月龄(处理后6个月)时，使用短型人ORF15未观察到视杆或视锥细胞形态的显著差异(图3)；在该月龄时对照和短型ORF15处理的眼都具有典型的变性外观。与野生型眼相比，视杆和视锥外段缩短且无序，可看见视杆视蛋白在整个外核层的错误定位以及视锥视蛋白另外在突触层中的错误定位。在对照和短型ORF 15处理的眼中，外核层的厚度也同样减小。
相比之下，用长型人ORF 15处理的眼在视杆细胞中具有正确分布于外段的视蛋白表达，没有明显的错误定位征象。类似地，在这些用更长的ORF 15构建体处理的眼中，视锥视蛋白的错误定位是罕见的。此外，发现经ORF 15-l处理的眼比对照或经ORF15-S处理的眼具有更多的视杆和视锥细胞(具有几乎正常的外段)。
基于这些发现，在用长型ORF 15处理的小鼠中进行纵向研究。为了定量经ORF 15-l处理的眼相对于对照眼的拯救程度，我们测量了3只Rpgr-/-小鼠的对侧眼中外核层(ONL)的厚度和感光细胞内段/外段的长度。这些在上半球的3个区和下半球的3个区中进行测量，每个区分隔600μm并且在沿着垂直经线距视神经头的任一侧600μm处开始；在11月龄和18月龄时，使用重复测量全因子回归来鉴定作为主效应的眼、半球和区域以及它们的交叉产物的差异，以确定治疗作用是否在位置上发生改变。在11月龄时，ONL厚度正常分布但是内段/外段长度不是正常分布(Shapiro-Wilk W拟合优度检验，p＝.016)；在18月龄时，ONL厚度和内段/外段长度都不是正常分布(分别为p＝.0011和p＝.0002)。在11月龄时，经处理的眼的平均ONL厚度(48.0μm)显著大于对照眼(38.0μm,p＝.0015)；经处理的眼的平均内段/外段长度(45.1μm)也显著大于对照眼(29.5μm，p<.0001，对于归一化的秩p<.0001)。在该月龄时，对于上半球和下半球而言，关于ONL厚度和IS/OS长度的治疗益处是相当的。在18月龄时，对侧眼之间的视网膜形态差异更加显著：对于经处理的眼，平均ONL厚度为22.8μm；对于对照眼，平均ONL厚度为13.7μm(p<.0001，对于归一化的秩p<.0001)；而对于经处理的眼，平均内段/外段长度为19.8μm；对于对照眼，平均内段/外段长度为7.3μm(p<.0001，对于归一化的秩p<.0001)。在该月龄时，我们最初观察到，18月龄时对于IS/OS长度而言在上部视网膜的治疗益处显著大于在下部视网膜的治疗益处(p＝.0036)，但是将长度转换为归一化的秩之后不再成立(p＝.17)。图4A说明了3只18月龄的小鼠中经处理的眼和对照眼中根据区域的ONL厚度和IS/OS长度。
图4B示出了取自18月龄时代表性的经ORF 15-L处理的眼和对侧对照眼的代表性光显微图像。在对照视网膜中，保存最好的区域仅有约2-3排松散排列的感光细胞核，具有缩短和无序的感光细胞内段/外段。注意到内段和外段的边缘不再明显。另一方面，经处理的视网膜始终具有约5-6排感光细胞，具有更长、更有序和明显的内段和外段。
实施例3.人RPGR ORF15长型表达改善了视杆和视锥细胞功能
在9-18月龄的RPGR-/-小鼠群体(n＝22)中评估视网膜功能，所述视网膜功能通过全视野视杆和视锥ERG来监测。小鼠在3至7月龄之间接受治疗，并且在注射之后6个月时立即记录后续ERG。图5A示出了在11至14月龄之间进行测试的16只小鼠的眼的视杆和视锥ERG振幅。与野生型小鼠的下限相比，对照眼(OD)显示出视锥b波振幅相对于视杆b波振幅的不成比例的损耗，如之前在RPGR-/-小鼠的鼠模型中所观察到的以及如视锥-视杆变性所显示的。在每只小鼠(除一只小鼠以外)中，与对侧对照眼(OD)相比，经处理的眼(OS)具有更大的ERG a波和b波振幅，表明视杆和视锥感光细胞功能的改善。实际上，一半以上的经处理的眼(9/16)具有等于或大于月龄匹配的野生型值下限(虚线)的视杆b波振幅。视杆ERG a波振幅的几何平均值为121μV OS和65μV OD，视杆ERG b波振幅的几何平均值为482μV OS和267μVOD。平均视锥ERG b波振幅为22μV OS和11μV OD。这些数据表明，对于该月龄范围，AAV-ORF15处理使视杆功能改善81-86％，视锥功能改善100％。
在全部22只小鼠群组中，我们使用重复测量纵向回归来比较眼的视杆和视锥b波振幅的变化速率(图5B)。对于对照眼的视杆b波振幅，估计的平均变化速率为-8.6％/月，对于经处理的眼的视杆b波振幅，估计的平均变化速率为-3.8％/月；这两个平均值之间的差异是显著的(p＝0.0001)。对于对照眼的视锥b波振幅，估计的平均变化速率为-5.8％/月，对于经处理的眼的视锥b波振幅，估计的平均变化速率为-0.8％/月；这两个平均值之间的差异也是显著的(p<0.0001)。此外，发现经处理的眼的视锥b波振幅的衰减并非显著不同于零(p＝0.54)，表明视锥功能的稳定性，不具有可观察到的进展。
图5C示出了代表性的视杆和视锥ERG以说明在经处理的眼和对照眼(包括18月龄(最终时间点)的野生型)中的波形。在该月龄时对照眼的视杆功能严重降低(平均降低75％)，而视锥功能最小且在一些情况下实际上是不可检测的。相反，在该时间点经处理的眼仍具有显著的视杆和视锥功能，尽管其功能低于在野生型眼中所见的那些功能。
参考文献
ACLAND GM，AGUIRRE GD，RAY J，ZHANG Q，et al.(2001).Gene therapy restoresvision in a canine model of childhood blindness.Nat Genet 28，92-5.
ALEXANDER JJ，UMINO Y，EVERHART D，CHANG B，et al.(2007).Restoration ofcone vision in a mouse model of achromatopsia.Nat Med 13，685-7.
ALI RR，SARRA GM，STEPHENS C，ALWIS MD，et al.(2000).Restoration ofphotoreceptor ultrastructure and function in retinal degeneration slow miceby gene therapy.Nat Genet 25,306-10.
ALLOCCA M，MUSSOLINO C，GARCIA-HOYOS M，SANGES D，et al.(2007).Noveladeno-associated virus serotypes efficiently transduce murinephotoreceptors.J Virol 81，11372-80.
BADER I，BRANDAU O，ACHATZ H，APFELSTEDT-SYLLA E，et al.(2003).X-linkedretinitis pigmentosa：RPGR mutations in most families with definite X linkageand clustering of mutations in a short sequence stretch of exon ORF 15.InvestOphthalmol Vis Sci 44，1458-63.
BAINBRIDGE JW，SMITH AJ，BARKER SS，ROBBIE S，et al.(2008).Effect of genetherapy on visual function in Leber′s congenital amaurosis.N Engl J Med 358，2231-9.
BELTRAN WA，CIDECIYAN AV，LEWIN AS，IWABE S，et al.(2012).Gene therapyrescues photoreceptor blindness in dogs and paves the way for treating humanX-linked retinitis pigmentosa.Proc Natl Acad Sci U S A 109,2132-7.
BERSON EL.(1993).Retinitis pigmentosa.The Friedenwald Lecture.InvestOphthalmol Vis Sci 34，1659-76.
BOYLAN JP，WRIGHT AF.(2000).Identification of a novel proteininteracting with RPGR.Hum Mol Genet 9，2085-2093.
BRANHAM K，OTHMAN M，BRUMM M，KAROUKIS AJ，et al.(2012).Mutations in RPGRand RP2 Account for 15％of Males with Simplex Retinal DegenerativeDisease.Invest Ophthalmol Vis Sci 53，8232-7.
BREUER DK，YASHAR BM，FILIPPOVA E，HIRIYANNA S，et al.(2002).Acomprehensive mutation analysis of RP2 and RPGR in a North American cohort offamilies with X-linked retinitis pigmentosa.Am J Hum Genet 70,1545-54.
CHURCHILL JD，BOWNE SJ，SULLIVAN LS，LEWIS RA，et al.(2013).Mutations inthe X-linked retinitis pigmentosa genes RPGR and RP2 found in 8.5％offamilies with a provisional diagnosis of autosomal dominant retinitispigmentosa.Invest Ophthalmol Vis Sci 54，1411-6.
CIDECIYAN AV，ALEMAN TS，BOYE SL，SCHWARTZ SB，et al.(2008).Human genetherapy for RPE65 isomerase deficiency activates the retinoid cycle of visionbut with slow rod kinetics.Proc Natl Acad Sci U S A 105，15112-7.
HONG DH，LI T.(2002).Complex expression pattern of RPGR reveals a rolefor purine-rich exonic splicing enhancers.Invest Ophthalmol Vis Sci 43，3373-82.
HONG DH，PAWLYK B，SOKOLOV M，STRISSEL KJ，et al.(2003).RPGR isoforms inphotoreceptor connecting cilia and the transitional zone of motilecilia.Invest Ophthalmol Vis Sci 44，2413-21.
HONG DH，PAWLYK BS，ADAMIAN M，SANDBERG MA，et al.(2005).A single，abbreviated RPGR-ORF15 variant reconstitutes RPGR function in vivo.InvestOphthalmol Vis Sci 46，435-41.
HONG DH，PAWLYK BS，SHANG J，SANDBERG MA，et al.(2000).A retinitispigmentosa GTPase regulator(RPGR)-deficient mouse model for X-linkedretinitis pigmentosa(RP3).Proc Natl Acad Sci USA 97，3649-54.
HONG DH，YUE G，ADAMIAN M，LIT.(2001).Retinitis pigmentosa GTPaseregulator(RPGR)-interacting protein is stably associated with thephotoreceptor ciliary axoneme and anchors RPGR to the connecting cilium.JBiol Chem 276，12091-12099.
JACOBI FK，KARRA D，BROGHAMMER M，BLIN N，et al.(2005).Mutational risk inhighly repetitive exon ORF15 of the RPGR multidisease gene is not associatedwith haplotype background.Int J Mol Med16，1175-8.
KARRA D，JACOBI FK，BROGHAMMER M，BLIN N，et al.(2006).Populationhaplotypes of exon ORF 15 of the retinitis pigmentosa GTPase regulator genein Germany：implications for screening for inherited retinal disorders.MolDiagn Ther 10，115-23.
KHANI SC，PAWLYK BS，BULGAKOV OV，KASPEREK E，et al.(2007).AAV-MediatedExpression Targeting of Rod and Cone Photoreceptors with a Human RhodopsinKinase Promoter.Invest Ophthalmol Vis Sci 48，3954-61.
KOMAROMY AM，ALEXANDER JJ，ROWLAN JS，GARCIA MM，et al.(2010).Genetherapy rescues cone function in congenital achromatopsia.Hum Mol Genet 19，2581-93.
LHERITEAU E，LIBEAU L，STIEGER K，DESCHAMPS JY，et al.(2009).The RPGRIP1-deficient dog，a promising canine model for gene therapy.Mol Vis 15，349-61.
MACLAREN RE，GROPPE M，BARNARD AR，COTTRIALL CL，et al.(2014).Retinalgene therapy in patients with choroideremia：initial findings from a phase 1/2clinical trial.Lancet.
MAGUIRE AM，SIMONELLI F，PIERCE EA，PUGH EN，JR.，et al.(2008).Safety andefficacy of gene transfer for Leber′s congenital amaurosis.N Engl J Med358，2240-8.
NATKUNARAJAH M，TRITTIBACH P，MCINTOSH J，DURAN Y，et al.(2008).Assessment of ocular transduction using single-stranded and self-complementary recombinant adeno-associated virus serotype 2/8.Gene Ther 15，463-7.
PANG JJ，LEI L，DAI X，SHIW，et al.(2012).AAV-mediated gene therapy inmouse models of recessive retinal degeneration.Curr Mol Med 12，316-30.
PAWLYK BS，BULGAKOV OV，LIU X，XU X，et al.(2010).Replacement genetherapy with a human RPGRIP1sequence slows photoreceptor degeneration in amurine model of Leber congenital amaurosis.Hum Gene Ther 21,993-1004.
PAWLYK BS，SMITH AJ，BUCH PK，ADAMIAN M，etal.(2005).Gene replacementtherapy rescues photoreceptor degeneration in a murine model of Lebercongenital amaurosis lacking RPGRIP.Invest Ophthalmol Vis Sci 46,3039-45.
PELLETIER V，JAMBOU M，DELPHIN N，ZINOVIEVA E，et al.(2007).Comprehensivesurvey of mutations in RP2 and RPGR in patients affected with distinctretinal dystrophies：genotype-phenotype correlations and impact on geneticcounseling.Hum Mutat 28,81-91.
ROEPMAN R，BERNOUD-HUBAC N，SCHICK DE，MAUGERI A，et al.(2000).Theretinitis pigmentosa GTPase regulator(RPGR)interacts with novel transport-like proteins in the outer segments of rod photoreceptors.Hum Mol Genet 9，2095-2105.
SANDBERG MA，ROSNER B，WEIGEL-DIFRANCO C，DRYJA TP，et al.(2007).Diseasecourse of patients with X-linked retinitis pigmentosa due to RPGR genemutations.Invest Ophthalmol Vis Sci 48，1298-304.
SUN X，PAWLYK B，XU X，LIU X，et al.(2010).Gene therapy with a promotertargeting both rods and cones rescues retinal degeneration caused byAIPL1mutations.Gene Ther 17，117-131.
TAN MH，SMITH AJ，PAWLYK B，XU X，et al.(2009).Gene therapy for retinitispigmentosa and Leber congenital amaurosis caused by defects in AIPL 1：effective rescue of mouse models of partial and complete Aipll deficiencyusing AAV2/2and AAV2/8vectors.Hum Mol Genet.
THOMPSON DA，KHAN NW，OTHMAN MI，CHANG B，et al.(2012).Rd9is a naturallyoccurring mouse model of a common form of retinitis pigmentosa caused bymutations in RPGR-ORF15.PLoS One 7，e35865.
VERVOORT R，LENNON A，BIRD AC，TULLOCH B，et al.(2000).Mutational hotspot within a new RPGR exon in X-linked retinitis pigmentosa.Nature Genetics25，462-466.
VERVOORT R，WRIGHT AF.(2002).Mutations of RPGR in X-linked retinitispigmentosa(RP3).Hum Mutat 19，486-500.
YANG J，LIU X，YUE G，ADAMIAN M，et al.(2002).Rootletin，a novel coiled-coil protein，is a structural component of the ciliary rootlet.J Cell Biol159，431-440.
其他实施方案
应理解，尽管已结合本发明的详细说明对本发明进行了描述，但前述说明意欲说明而非限制本发明的范围，本发明的范围通过所附的权利要求书的范围来限定。其他方面、优势和修改在以下权利要求书的范围内。
序列表
<110> 麻省眼耳科医院
<120> 色素性视网膜炎的RPGR基因治疗
<130> 00633-0182WO1
<150> US 62/028,638
<151> 2014-07-24
<160> 5
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 3081
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 缺失378bp的人RPGRORF15序列
<400> 1
atgagggagc cggaagagct gatgcccgat tcgggtgctg tgtttacatt tgggaaaagt 60
aaatttgctg aaaataatcc cggtaaattc tggtttaaaa atgatgtccc tgtacatctt 120
tcatgtggag atgaacattc tgctgttgtt accggaaata ataaacttta catgtttggc 180
agtaacaact ggggtcagtt aggattagga tcaaagtcag ccatcagcaa gccaacatgt 240
gtcaaagctc taaaacctga aaaagtgaaa ttagctgcct gtggaaggaa ccacaccctg 300
gtgtcaacag aaggaggcaa tgtatatgca actggtggaa ataatgaagg acagttgggg 360
cttggtgaca ccgaagaaag aaacactttt catgtaatta gcttttttac atccgagcat 420
aagattaagc agctgtctgc tggatctaat acttcagctg ccctaactga ggatggaaga 480
ctttttatgt ggggtgacaa ttccgaaggg caaattggtt taaaaaatgt aagtaatgtc 540
tgtgtccctc agcaagtgac cattgggaaa cctgtctcct ggatctcttg tggatattac 600
cattcagctt ttgtaacaac agatggtgag ctatatgtgt ttggagaacc tgagaatggg 660
aagttaggtc ttcccaatca gctcctgggc aatcacagaa caccccagct ggtgtctgaa 720
attccggaga aggtgatcca agtagcctgt ggtggagagc atactgtggt tctcacggag 780
aatgctgtgt atacctttgg gctgggacaa tttggtcagc tgggtcttgg cacttttctt 840
tttgaaactt cagaacccaa agtcattgag aatattaggg atcaaacaat aagttatatt 900
tcttgtggag aaaatcacac agctttgata acagatatcg gccttatgta tacttttgga 960
gatggtcgcc acggaaaatt aggacttgga ctggagaatt ttaccaatca cttcattcct 1020
actttgtgct ctaatttttt gaggtttata gttaaattgg ttgcttgtgg tggatgtcac 1080
atggtagttt ttgctgctcc tcatcgtggt gtggcaaaag aaattgaatt cgatgaaata 1140
aatgatactt gcttatctgt ggcgactttt ctgccgtata gcagtttaac ctcaggaaat 1200
gtactgcaga ggactctatc agcacgtatg cggcgaagag agagggagag gtctccagat 1260
tctttttcaa tgaggagaac actacctcca atagaaggga ctcttggcct ttctgcttgt 1320
tttctcccca attcagtctt tccacgatgt tctgagagaa acctccaaga gagtgtctta 1380
tctgaacagg acctcatgca gccagaggaa ccagattatt tgctagatga aatgaccaaa 1440
gaagcagaga tagataattc ttcaactgta gaaagccttg gagaaactac tgatatctta 1500
aacatgacac acatcatgag cctgaattcc aatgaaaagt cattaaaatt atcaccagtt 1560
cagaaacaaa agaaacaaca aacaattggg gaactgacgc aggatacagc tcttactgaa 1620
aacgatgata gtgatgaata tgaagaaatg tcagaaatga aagaagggaa agcatgtaaa 1680
caacatgtgt cacaagggat tttcatgacg cagccagcta cgactatcga agcattttca 1740
gatgaggaag tagagatccc agaggagaag gaaggagcag aggattcaaa aggaaatgga 1800
atagaggagc aagaggtaga agcaaatgag gaaaatgtga aggtgcatgg aggaagaaag 1860
gagaaaacag agatcctatc agatgacctt acagacaaag cagaggtgag tgaaggcaag 1920
gcaaaatcag tgggagaagc agaggatggg cctgaaggta gaggggatgg aacctgtgag 1980
gaaggtagtt caggagcaga acactggcaa gatgaggaga gggagaaggg ggagaaagac 2040
aagggtagag gagaaatgga gaggccagga gagggagaga aggaactagc agagaaggaa 2100
gaatggaaga agagggatgg ggaagagcag gagcaaaagg agagggagca gggccatcag 2160
aaggaaagaa accaagagat ggaggaggga ggggaggagg agcatggaga aggagaagaa 2220
gaggagggag acagagaaga ggaagaagag aaggagggag aagggaaaga ggaaggagaa 2280
ggggaagaag tggagggaga acgtgaaaag gaggaaggag agaggaaaaa ggaggaaaga 2340
gcggggaagg aggagaaagg agaggaagaa ggagaccaag gagaggggga agaggaggaa 2400
acagagggga gaggggagga aaaagaggag ggaggggaag tagagggagg ggaagtagag 2460
gaggggaaag gagagaggga agaggaagag gaggagggtg agggggaaga ggaggaaggg 2520
gagggggaag aggaggaagg ggagggggaa gaggaggaag gagaagggaa aggggaggaa 2580
gaaggggagg gggaagagga ggaaggggaa gaagaagggg aggaagaagg agagggagag 2640
gaagaagggg agggagaagg ggaggaagaa gaggaagggg aagtggaagg ggaggtggaa 2700
ggggaggaag gagaggggga aggagaggaa gaggaaggag aggaggaagg agaagaaagg 2760
gaaaaggagg gggaaggaga agaaaacagg aggaacagag aagaggagga ggaagaagag 2820
gggaagtatc aggagacagg cgaagaagag aatgaaaggc aggatggaga ggagtacaaa 2880
aaagtgagca aaataaaagg atctgtgaaa tatggcaaac ataaaacata tcaaaaaaag 2940
tcagttacta acacacaggg aaatgggaaa gagcagaggt ccaaaatgcc agtccagtca 3000
aaacgacttt taaaaaatgg gccatcaggt tccaaaaagt tctggaataa tatattacca 3060
cattacttgg aattgaagta a 3081
<210> 2
<211> 1026
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 缺失126个氨基酸的人RPGRORF15序列
<400> 2
Met Arg Glu Pro Glu Glu Leu Met Pro Asp Ser Gly Ala Val Phe Thr
1 5 10 15
Phe Gly Lys Ser Lys Phe Ala Glu Asn Asn Pro Gly Lys Phe Trp Phe
20 25 30
Lys Asn Asp Val Pro Val His Leu Ser Cys Gly Asp Glu His Ser Ala
35 40 45
Val Val Thr Gly Asn Asn Lys Leu Tyr Met Phe Gly Ser Asn Asn Trp
50 55 60
Gly Gln Leu Gly Leu Gly Ser Lys Ser Ala Ile Ser Lys Pro Thr Cys
65 70 75 80
Val Lys Ala Leu Lys Pro Glu Lys Val Lys Leu Ala Ala Cys Gly Arg
85 90 95
Asn His Thr Leu Val Ser Thr Glu Gly Gly Asn Val Tyr Ala Thr Gly
100 105 110
Gly Asn Asn Glu Gly Gln Leu Gly Leu Gly Asp Thr Glu Glu Arg Asn
115 120 125
Thr Phe His Val Ile Ser Phe Phe Thr Ser Glu His Lys Ile Lys Gln
130 135 140
Leu Ser Ala Gly Ser Asn Thr Ser Ala Ala Leu Thr Glu Asp Gly Arg
145 150 155 160
Leu Phe Met Trp Gly Asp Asn Ser Glu Gly Gln Ile Gly Leu Lys Asn
165 170 175
Val Ser Asn Val Cys Val Pro Gln Gln Val Thr Ile Gly Lys Pro Val
180 185 190
Ser Trp Ile Ser Cys Gly Tyr Tyr His Ser Ala Phe Val Thr Thr Asp
195 200 205
Gly Glu Leu Tyr Val Phe Gly Glu Pro Glu Asn Gly Lys Leu Gly Leu
210 215 220
Pro Asn Gln Leu Leu Gly Asn His Arg Thr Pro Gln Leu Val Ser Glu
225 230 235 240
Ile Pro Glu Lys Val Ile Gln Val Ala Cys Gly Gly Glu His Thr Val
245 250 255
Val Leu Thr Glu Asn Ala Val Tyr Thr Phe Gly Leu Gly Gln Phe Gly
260 265 270
Gln Leu Gly Leu Gly Thr Phe Leu Phe Glu Thr Ser Glu Pro Lys Val
275 280 285
Ile Glu Asn Ile Arg Asp Gln Thr Ile Ser Tyr Ile Ser Cys Gly Glu
290 295 300
Asn His Thr Ala Leu Ile Thr Asp Ile Gly Leu Met Tyr Thr Phe Gly
305 310 315 320
Asp Gly Arg His Gly Lys Leu Gly Leu Gly Leu Glu Asn Phe Thr Asn
325 330 335
His Phe Ile Pro Thr Leu Cys Ser Asn Phe Leu Arg Phe Ile Val Lys
340 345 350
Leu Val Ala Cys Gly Gly Cys His Met Val Val Phe Ala Ala Pro His
355 360 365
Arg Gly Val Ala Lys Glu Ile Glu Phe Asp Glu Ile Asn Asp Thr Cys
370 375 380
Leu Ser Val Ala Thr Phe Leu Pro Tyr Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asn
385 390 395 400
Val Leu Gln Arg Thr Leu Ser Ala Arg Met Arg Arg Arg Glu Arg Glu
405 410 415
Arg Ser Pro Asp Ser Phe Ser Met Arg Arg Thr Leu Pro Pro Ile Glu
420 425 430
Gly Thr Leu Gly Leu Ser Ala Cys Phe Leu Pro Asn Ser Val Phe Pro
435 440 445
Arg Cys Ser Glu Arg Asn Leu Gln Glu Ser Val Leu Ser Glu Gln Asp
450 455 460
Leu Met Gln Pro Glu Glu Pro Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Met Thr Lys
465 470 475 480
Glu Ala Glu Ile Asp Asn Ser Ser Thr Val Glu Ser Leu Gly Glu Thr
485 490 495
Thr Asp Ile Leu Asn Met Thr His Ile Met Ser Leu Asn Ser Asn Glu
500 505 510
Lys Ser Leu Lys Leu Ser Pro Val Gln Lys Gln Lys Lys Gln Gln Thr
515 520 525
Ile Gly Glu Leu Thr Gln Asp Thr Ala Leu Thr Glu Asn Asp Asp Ser
530 535 540
Asp Glu Tyr Glu Glu Met Ser Glu Met Lys Glu Gly Lys Ala Cys Lys
545 550 555 560
Gln His Val Ser Gln Gly Ile Phe Met Thr Gln Pro Ala Thr Thr Ile
565 570 575
Glu Ala Phe Ser Asp Glu Glu Val Glu Ile Pro Glu Glu Lys Glu Gly
580 585 590
Ala Glu Asp Ser Lys Gly Asn Gly Ile Glu Glu Gln Glu Val Glu Ala
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Val Lys Val His Gly Gly Arg Lys Glu Lys Thr Glu
610 615 620
Ile Leu Ser Asp Asp Leu Thr Asp Lys Ala Glu Val Ser Glu Gly Lys
625 630 635 640
Ala Lys Ser Val Gly Glu Ala Glu Asp Gly Pro Glu Gly Arg Gly Asp
645 650 655
Gly Thr Cys Glu Glu Gly Ser Ser Gly Ala Glu His Trp Gln Asp Glu
660 665 670
Glu Arg Glu Lys Gly Glu Lys Asp Lys Gly Arg Gly Glu Met Glu Arg
675 680 685
Pro Gly Glu Gly Glu Lys Glu Leu Ala Glu Lys Glu Glu Trp Lys Lys
690 695 700
Arg Asp Gly Glu Glu Gln Glu Gln Lys Glu Arg Glu Gln Gly His Gln
705 710 715 720
Lys Glu Arg Asn Gln Glu Met Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu His Gly
725 730 735
Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Asp Arg Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu
740 745 750
Gly Glu Gly Lys Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Val Glu Gly Glu Arg
755 760 765
Glu Lys Glu Glu Gly Glu Arg Lys Lys Glu Glu Arg Ala Gly Lys Glu
770 775 780
Glu Lys Gly Glu Glu Glu Gly Asp Gln Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu
785 790 795 800
Thr Glu Gly Arg Gly Glu Glu Lys Glu Glu Gly Gly Glu Val Glu Gly
805 810 815
Gly Glu Val Glu Glu Gly Lys Gly Glu Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu
820 825 830
Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu
835 840 845
Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly
850 855 860
Glu Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu
865 870 875 880
Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Gly Glu Val Glu
885 890 895
Gly Glu Val Glu Gly Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu
900 905 910
Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Arg Glu Lys Glu Gly Glu Gly Glu Glu
915 920 925
Asn Arg Arg Asn Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Lys Tyr Gln
930 935 940
Glu Thr Gly Glu Glu Glu Asn Glu Arg Gln Asp Gly Glu Glu Tyr Lys
945 950 955 960
Lys Val Ser Lys Ile Lys Gly Ser Val Lys Tyr Gly Lys His Lys Thr
965 970 975
Tyr Gln Lys Lys Ser Val Thr Asn Thr Gln Gly Asn Gly Lys Glu Gln
980 985 990
Arg Ser Lys Met Pro Val Gln Ser Lys Arg Leu Leu Lys Asn Gly Pro
995 1000 1005
Ser Gly Ser Lys Lys Phe Trp Asn Asn Ile Leu Pro His Tyr Leu Glu
1010 1015 1020
Leu Lys
1025
<210> 3
<211> 3459
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
atgagggagc cggaagagct gatgcccgat tcgggtgctg tgtttacatt tgggaaaagt 60
aaatttgctg aaaataatcc cggtaaattc tggtttaaaa atgatgtccc tgtacatctt 120
tcatgtggag atgaacattc tgctgttgtt accggaaata ataaacttta catgtttggc 180
agtaacaact ggggtcagtt aggattagga tcaaagtcag ccatcagcaa gccaacatgt 240
gtcaaagctc taaaacctga aaaagtgaaa ttagctgcct gtggaaggaa ccacaccctg 300
gtgtcaacag aaggaggcaa tgtatatgca actggtggaa ataatgaagg acagttgggg 360
cttggtgaca ccgaagaaag aaacactttt catgtaatta gcttttttac atccgagcat 420
aagattaagc agctgtctgc tggatctaat acttcagctg ccctaactga ggatggaaga 480
ctttttatgt ggggtgacaa ttccgaaggg caaattggtt taaaaaatgt aagtaatgtc 540
tgtgtccctc agcaagtgac cattgggaaa cctgtctcct ggatctcttg tggatattac 600
cattcagctt ttgtaacaac agatggtgag ctatatgtgt ttggagaacc tgagaatggg 660
aagttaggtc ttcccaatca gctcctgggc aatcacagaa caccccagct ggtgtctgaa 720
attccggaga aggtgatcca agtagcctgt ggtggagagc atactgtggt tctcacggag 780
aatgctgtgt atacctttgg gctgggacaa tttggtcagc tgggtcttgg cacttttctt 840
tttgaaactt cagaacccaa agtcattgag aatattaggg atcaaacaat aagttatatt 900
tcttgtggag aaaatcacac agctttgata acagatatcg gccttatgta tacttttgga 960
gatggtcgcc acggaaaatt aggacttgga ctggagaatt ttaccaatca cttcattcct 1020
actttgtgct ctaatttttt gaggtttata gttaaattgg ttgcttgtgg tggatgtcac 1080
atggtagttt ttgctgctcc tcatcgtggt gtggcaaaag aaattgaatt cgatgaaata 1140
aatgatactt gcttatctgt ggcgactttt ctgccgtata gcagtttaac ctcaggaaat 1200
gtactgcaga ggactctatc agcacgtatg cggcgaagag agagggagag gtctccagat 1260
tctttttcaa tgaggagaac actacctcca atagaaggga ctcttggcct ttctgcttgt 1320
tttctcccca attcagtctt tccacgatgt tctgagagaa acctccaaga gagtgtctta 1380
tctgaacagg acctcatgca gccagaggaa ccagattatt tgctagatga aatgaccaaa 1440
gaagcagaga tagataattc ttcaactgta gaaagccttg gagaaactac tgatatctta 1500
aacatgacac acatcatgag cctgaattcc aatgaaaagt cattaaaatt atcaccagtt 1560
cagaaacaaa agaaacaaca aacaattggg gaactgacgc aggatacagc tcttactgaa 1620
aacgatgata gtgatgaata tgaagaaatg tcagaaatga aagaagggaa agcatgtaaa 1680
caacatgtgt cacaagggat tttcatgacg cagccagcta cgactatcga agcattttca 1740
gatgaggaag tagagatccc agaggagaag gaaggagcag aggattcaaa aggaaatgga 1800
atagaggagc aagaggtaga agcaaatgag gaaaatgtga aggtgcatgg aggaagaaag 1860
gagaaaacag agatcctatc agatgacctt acagacaaag cagaggtgag tgaaggcaag 1920
gcaaaatcag tgggagaagc agaggatggg cctgaaggta gaggggatgg aacctgtgag 1980
gaaggtagtt caggagcaga acactggcaa gatgaggaga gggagaaggg ggagaaagac 2040
aagggtagag gagaaatgga gaggccagga gagggagaga aggaactagc agagaaggaa 2100
gaatggaaga agagggatgg ggaagagcag gagcaaaagg agagggagca gggccatcag 2160
aaggaaagaa accaagagat ggaggaggga ggggaggagg agcatggaga aggagaagaa 2220
gaggagggag acagagaaga ggaagaagag aaggagggag aagggaaaga ggaaggagaa 2280
ggggaagaag tggagggaga acgtgaaaag gaggaaggag agaggaaaaa ggaggaaaga 2340
gcggggaagg aggagaaagg agaggaagaa ggagaccaag gagaggggga agaggaggaa 2400
acagagggga gaggggagga aaaagaggag ggaggggaag tagagggagg ggaagtagag 2460
gaggggaaag gagagaggga agaggaagag gaggagggtg agggggaaga ggaggaaggg 2520
gagggggaag aggaggaagg ggagggggaa gaggaggaag gagaagggaa aggggaggaa 2580
gaaggggaag aaggagaagg ggaggaagaa ggggaggaag gagaagggga gggggaagag 2640
gaggaaggag aaggggaggg agaagaggaa ggagaagggg agggagaaga ggaggaagga 2700
gaaggggagg gagaagagga aggagaaggg gagggagaag aggaggaagg agaagggaaa 2760
ggggaggagg aaggagagga aggagaaggg gagggggaag aggaggaagg agaaggggaa 2820
ggggaggatg gagaagggga gggggaagag gaggaaggag aatgggaggg ggaagaggag 2880
gaaggagaag gggaggggga agaggaagga gaaggggaag gggaggaagg agaaggggag 2940
ggggaagagg aggaaggaga aggggagggg gaagaggagg aaggggaaga agaaggggag 3000
gaagaaggag agggagagga agaaggggag ggagaagggg aggaagaaga ggaaggggaa 3060
gtggaagggg aggtggaagg ggaggaagga gagggggaag gagaggaaga ggaaggagag 3120
gaggaaggag aagaaaggga aaaggagggg gaaggagaag aaaacaggag gaacagagaa 3180
gaggaggagg aagaagaggg gaagtatcag gagacaggcg aagaagagaa tgaaaggcag 3240
gatggagagg agtacaaaaa agtgagcaaa ataaaaggat ctgtgaaata tggcaaacat 3300
aaaacatatc aaaaaaagtc agttactaac acacagggaa atgggaaaga gcagaggtcc 3360
aaaatgccag tccagtcaaa acgactttta aaaaatgggc catcaggttc caaaaagttc 3420
tggaataata tattaccaca ttacttggaa ttgaagtaa 3459
<210> 4
<211> 1152
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Met Arg Glu Pro Glu Glu Leu Met Pro Asp Ser Gly Ala Val Phe Thr
1 5 10 15
Phe Gly Lys Ser Lys Phe Ala Glu Asn Asn Pro Gly Lys Phe Trp Phe
20 25 30
Lys Asn Asp Val Pro Val His Leu Ser Cys Gly Asp Glu His Ser Ala
35 40 45
Val Val Thr Gly Asn Asn Lys Leu Tyr Met Phe Gly Ser Asn Asn Trp
50 55 60
Gly Gln Leu Gly Leu Gly Ser Lys Ser Ala Ile Ser Lys Pro Thr Cys
65 70 75 80
Val Lys Ala Leu Lys Pro Glu Lys Val Lys Leu Ala Ala Cys Gly Arg
85 90 95
Asn His Thr Leu Val Ser Thr Glu Gly Gly Asn Val Tyr Ala Thr Gly
100 105 110
Gly Asn Asn Glu Gly Gln Leu Gly Leu Gly Asp Thr Glu Glu Arg Asn
115 120 125
Thr Phe His Val Ile Ser Phe Phe Thr Ser Glu His Lys Ile Lys Gln
130 135 140
Leu Ser Ala Gly Ser Asn Thr Ser Ala Ala Leu Thr Glu Asp Gly Arg
145 150 155 160
Leu Phe Met Trp Gly Asp Asn Ser Glu Gly Gln Ile Gly Leu Lys Asn
165 170 175
Val Ser Asn Val Cys Val Pro Gln Gln Val Thr Ile Gly Lys Pro Val
180 185 190
Ser Trp Ile Ser Cys Gly Tyr Tyr His Ser Ala Phe Val Thr Thr Asp
195 200 205
Gly Glu Leu Tyr Val Phe Gly Glu Pro Glu Asn Gly Lys Leu Gly Leu
210 215 220
Pro Asn Gln Leu Leu Gly Asn His Arg Thr Pro Gln Leu Val Ser Glu
225 230 235 240
Ile Pro Glu Lys Val Ile Gln Val Ala Cys Gly Gly Glu His Thr Val
245 250 255
Val Leu Thr Glu Asn Ala Val Tyr Thr Phe Gly Leu Gly Gln Phe Gly
260 265 270
Gln Leu Gly Leu Gly Thr Phe Leu Phe Glu Thr Ser Glu Pro Lys Val
275 280 285
Ile Glu Asn Ile Arg Asp Gln Thr Ile Ser Tyr Ile Ser Cys Gly Glu
290 295 300
Asn His Thr Ala Leu Ile Thr Asp Ile Gly Leu Met Tyr Thr Phe Gly
305 310 315 320
Asp Gly Arg His Gly Lys Leu Gly Leu Gly Leu Glu Asn Phe Thr Asn
325 330 335
His Phe Ile Pro Thr Leu Cys Ser Asn Phe Leu Arg Phe Ile Val Lys
340 345 350
Leu Val Ala Cys Gly Gly Cys His Met Val Val Phe Ala Ala Pro His
355 360 365
Arg Gly Val Ala Lys Glu Ile Glu Phe Asp Glu Ile Asn Asp Thr Cys
370 375 380
Leu Ser Val Ala Thr Phe Leu Pro Tyr Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asn
385 390 395 400
Val Leu Gln Arg Thr Leu Ser Ala Arg Met Arg Arg Arg Glu Arg Glu
405 410 415
Arg Ser Pro Asp Ser Phe Ser Met Arg Arg Thr Leu Pro Pro Ile Glu
420 425 430
Gly Thr Leu Gly Leu Ser Ala Cys Phe Leu Pro Asn Ser Val Phe Pro
435 440 445
Arg Cys Ser Glu Arg Asn Leu Gln Glu Ser Val Leu Ser Glu Gln Asp
450 455 460
Leu Met Gln Pro Glu Glu Pro Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Met Thr Lys
465 470 475 480
Glu Ala Glu Ile Asp Asn Ser Ser Thr Val Glu Ser Leu Gly Glu Thr
485 490 495
Thr Asp Ile Leu Asn Met Thr His Ile Met Ser Leu Asn Ser Asn Glu
500 505 510
Lys Ser Leu Lys Leu Ser Pro Val Gln Lys Gln Lys Lys Gln Gln Thr
515 520 525
Ile Gly Glu Leu Thr Gln Asp Thr Ala Leu Thr Glu Asn Asp Asp Ser
530 535 540
Asp Glu Tyr Glu Glu Met Ser Glu Met Lys Glu Gly Lys Ala Cys Lys
545 550 555 560
Gln His Val Ser Gln Gly Ile Phe Met Thr Gln Pro Ala Thr Thr Ile
565 570 575
Glu Ala Phe Ser Asp Glu Glu Val Glu Ile Pro Glu Glu Lys Glu Gly
580 585 590
Ala Glu Asp Ser Lys Gly Asn Gly Ile Glu Glu Gln Glu Val Glu Ala
595 600 605
Asn Glu Glu Asn Val Lys Val His Gly Gly Arg Lys Glu Lys Thr Glu
610 615 620
Ile Leu Ser Asp Asp Leu Thr Asp Lys Ala Glu Val Ser Glu Gly Lys
625 630 635 640
Ala Lys Ser Val Gly Glu Ala Glu Asp Gly Pro Glu Gly Arg Gly Asp
645 650 655
Gly Thr Cys Glu Glu Gly Ser Ser Gly Ala Glu His Trp Gln Asp Glu
660 665 670
Glu Arg Glu Lys Gly Glu Lys Asp Lys Gly Arg Gly Glu Met Glu Arg
675 680 685
Pro Gly Glu Gly Glu Lys Glu Leu Ala Glu Lys Glu Glu Trp Lys Lys
690 695 700
Arg Asp Gly Glu Glu Gln Glu Gln Lys Glu Arg Glu Gln Gly His Gln
705 710 715 720
Lys Glu Arg Asn Gln Glu Met Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu His Gly
725 730 735
Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Asp Arg Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu
740 745 750
Gly Glu Gly Lys Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Val Glu Gly Glu Arg
755 760 765
Glu Lys Glu Glu Gly Glu Arg Lys Lys Glu Glu Arg Ala Gly Lys Glu
770 775 780
Glu Lys Gly Glu Glu Glu Gly Asp Gln Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu
785 790 795 800
Thr Glu Gly Arg Gly Glu Glu Lys Glu Glu Gly Gly Glu Val Glu Gly
805 810 815
Gly Glu Val Glu Glu Gly Lys Gly Glu Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu
820 825 830
Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu
835 840 845
Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu
850 855 860
Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu
865 870 875 880
Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu
885 890 895
Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly
900 905 910
Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Gly
915 920 925
Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Asp Gly
930 935 940
Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Trp Glu Gly Glu Glu Glu
945 950 955 960
Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu
965 970 975
Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu
980 985 990
Glu Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu
995 1000 1005
Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Gly Glu Val Glu Gly Glu
1010 1015 1020
Val Glu Gly Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu
1025 1030 1035 1040
Glu Glu Gly Glu Glu Arg Glu Lys Glu Gly Glu Gly Glu Glu Asn Arg
1045 1050 1055
Arg Asn Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Lys Tyr Gln Glu Thr
1060 1065 1070
Gly Glu Glu Glu Asn Glu Arg Gln Asp Gly Glu Glu Tyr Lys Lys Val
1075 1080 1085
Ser Lys Ile Lys Gly Ser Val Lys Tyr Gly Lys His Lys Thr Tyr Gln
1090 1095 1100
Lys Lys Ser Val Thr Asn Thr Gln Gly Asn Gly Lys Glu Gln Arg Ser
1105 1110 1115 1120
Lys Met Pro Val Gln Ser Lys Arg Leu Leu Lys Asn Gly Pro Ser Gly
1125 1130 1135
Ser Lys Lys Phe Trp Asn Asn Ile Leu Pro His Tyr Leu Glu Leu Lys
1140 1145 1150
<210> 5
<211> 199
<212> DNA
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60
gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt 120
ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttagcctg 180
gtgctgtgtc agccccggt 199

Claims (23)

1.一种治疗患有由于编码色素性视网膜炎GTPase调节因子(RPGR)蛋白的基因中的功能丧失突变而导致的X连锁色素性视网膜炎(XLRP)或另一种眼科病症的人类受试者的方法，所述方法包括将包含腺伴随病毒载体的核酸给予至所述受试者的眼睛，所述腺伴随病毒载体包含缩短的人RPGR cDNA，其中所述缩短的人RPGR cDNA编码与SEQ ID NO:2全长至少80％相同的蛋白，所述蛋白任选地在SEQ ID NO:2中的缺失区周围的区域中具有最多达共200个额外氨基酸的缺失。
2.一种包含腺伴随病毒载体的核酸，其用于治疗患有由于编码色素性视网膜炎GTPase调节因子(RPGR)蛋白的基因中的功能丧失突变而导致的X连锁色素性视网膜炎(XLRP)或另一种眼科病症的人类受试者，所述腺伴随病毒载体包含缩短的人RPGR cDNA，其中所述缩短的人RPGR cDNA编码与SEQ ID NO:2全长至少80％相同的蛋白，所述蛋白任选地在SEQ IDNO:2中的缺失区周围的区域中具有最多达共200个额外氨基酸的缺失。
3.权利要求1的方法或权利要求2的用途，其中所述RPGR cDNA受人视紫红质激酶(hRK)启动子的控制。
4.权利要求1的方法或权利要求2的用途，其中所述腺伴随病毒载体是AAV-2、血清型-8(AAV2/8)或AAV-8。
5.权利要求1的方法或权利要求2的用途，其中所述hRK启动子包含SEQ ID NO:5或基本上由SEQ ID NO:5组成。
6.权利要求1的方法或权利要求2的用途，其中所述RPGR cDNA包含与SEQ ID NO:1至少80％相同的序列或基本上由该序列组成。
7.权利要求1的方法或权利要求2的用途，其中所述人RPGR cDNA编码与SEQ ID NO:2全长至少95％相同的蛋白，或编码包含SEQ ID NO:2的蛋白。
8.权利要求1的方法或权利要求2的用途，其包括以约2×1010vg/mL的低剂量、约2×1011vg/mL的中等剂量或2×1012vg/mL的高剂量给予所述核酸。
9.权利要求1的方法或权利要求2的用途，其中将所述核酸给予到视网膜下隙。
10.权利要求9的方法或用途，其中将微注射插管插入到视网膜下隙——位于视神经的颞部并且刚好位于主弓形血管(major arcade vessel)的上方，以使液体流动能够朝向视网膜黄斑。
11.编码缩短的人RPGR的核酸，其中所述缩短的人RPGR cDNA编码与SEQ ID NO:2全长至少80％相同的蛋白，所述蛋白任选地在SEQ ID NO:2中的缺失区周围具有最多达200个额外氨基酸的缺失。
12.权利要求11的核酸，其中所述RPGR cDNA受人视紫红质激酶(hRK)启动子的控制。
13.权利要求11的核酸，其中所述hRK启动子包含SEQ ID NO:5。
14.权利要求11的核酸，其中所述hRK启动子基本上由SEQ ID NO:5组成。
15.权利要求11的核酸，其中所述人RPGR cDNA编码与SEQ ID NO:2全长至少95％相同的蛋白，或编码包含SEQ ID NO:2的蛋白。
16.权利要求11的核酸，其中所述人RPGR cDNA与SEQ ID NO:1全长至少80％相同，其任选地在缺失区周围具有编码最多达200个额外氨基酸的核苷酸缺失。
17.权利要求11-16的核酸，其用于治疗患有由于编码色素性视网膜炎GTPase调节因子(RPGR)蛋白的基因中的功能丧失突变而导致的X连锁色素性视网膜炎(XLRP)或另一种眼科病症的人类受试者。
18.包含权利要求11-16中任一项的核酸的病毒载体。
19.权利要求18的病毒载体，其为腺伴随病毒载体。
20.权利要求19的病毒载体，其中所述腺伴随病毒载体是AAV-2、血清型-8(AAV2/8)或AAV-8。
21.权利要求18至20的病毒载体，其用于治疗患有由于编码色素性视网膜炎GTPase调节因子(RPGR)蛋白的基因中的功能丧失突变而导致的X连锁色素性视网膜炎(XLRP)或另一种眼科病症的人类受试者。
22.包含权利要求18至20的病毒载体或权利要求11-16中任一项的核酸的分离的宿主细胞。
23.权利要求22的分离的宿主细胞，其中所述细胞表达缩短的人RPGR蛋白。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111867635A (zh) * 2017-10-20 2020-10-30 法国国家卫生及研究医学协会 包括视网膜下递送治疗有效量的重组aav9衍生载体的在对象的视锥细胞光感受器中表达目的多核苷酸的方法
CN115379834A (zh) * 2020-03-11 2022-11-22 马萨诸塞眼科耳科诊所 用于nmnat1相关视网膜变性的基因疗法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107206105A (zh) * 2014-07-24 2017-09-26 麻省眼耳科医院 色素性视网膜炎的rpgr基因疗法
WO2016098078A2 (en) * 2014-12-19 2016-06-23 Novartis Ag Dimerization switches and uses thereof
CA2979229A1 (en) * 2015-03-11 2016-09-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Rp2 vectors for treating x-linked retinitis pigmentosa
GB201516066D0 (en) 2015-09-10 2015-10-28 Young & Co Llp D Treatment of retinitis pigmentosa
GB201704192D0 (en) 2017-03-16 2017-05-03 Nightstarx Ltd Treatment of Retinitis Pigmentosa
MX2020005008A (es) * 2017-11-15 2020-11-06 Univ Michigan Regents Vectores virales que comprenden regiones de codificación de la proteína retinol deshidrogenasa 12 (rdh12) y métodos de tratamiento de distrofias retinianas.

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001077380A2 (en) * 2000-04-10 2001-10-18 Medical Research Council Method for predicting predisposition to a disease associated with mutations in a rpgr gene
CN102925445A (zh) * 2011-08-08 2013-02-13 刘军 一种获得rpgr 基因新的转录剪切形式的方法
WO2014011210A1 (en) * 2012-07-11 2014-01-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav-mediated gene therapy for rpgr x-linked retinal degeneration

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0228458B2 (en) 1985-07-05 1997-10-22 Whitehead Institute For Biomedical Research Epithelial cells expressing foreign genetic material
US4980286A (en) 1985-07-05 1990-12-25 Whitehead Institute For Biomedical Research In vivo introduction and expression of foreign genetic material in epithelial cells
JPS6259797A (ja) * 1985-09-10 1987-03-16 日本電信電話株式会社 地中管体の推進方法
EP0378576B1 (en) 1987-09-11 1995-01-18 Whitehead Institute For Biomedical Research Transduced fibroblasts and uses therefor
EP0391960B1 (en) 1987-12-11 1994-08-17 Whitehead Institute For Biomedical Research Genetic modification of endothelial cells
JP2917998B2 (ja) 1988-02-05 1999-07-12 ホワイトヘッド・インスティチュート・フォー・バイオメディカル・リサーチ 修飾された肝細胞およびその用途
EP0556345B2 (en) 1990-10-31 2005-10-12 Cell Genesys, Inc. Retroviral vectors useful for gene therapy
US5767079A (en) * 1992-07-08 1998-06-16 Celtrix Pharmaceuticals, Inc. Method of treating ophthalmic disorders using TGF -β
WO2001038578A1 (en) * 1999-11-24 2001-05-31 Cornell Research Foundation, Inc. Inherited retinal diseases at the canine rp3 locus: linkage, marker- and mutation-based tests
GB201412011D0 (en) 2014-07-04 2014-08-20 Ucl Business Plc Treatments
CN107206105A (zh) * 2014-07-24 2017-09-26 麻省眼耳科医院 色素性视网膜炎的rpgr基因疗法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001077380A2 (en) * 2000-04-10 2001-10-18 Medical Research Council Method for predicting predisposition to a disease associated with mutations in a rpgr gene
CN102925445A (zh) * 2011-08-08 2013-02-13 刘军 一种获得rpgr 基因新的转录剪切形式的方法
WO2014011210A1 (en) * 2012-07-11 2014-01-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav-mediated gene therapy for rpgr x-linked retinal degeneration

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DONG-HYUN HONG等: "A Single, Abbreviated RPGR-ORF15 Variant Reconstitutes RPGR Function In Vivo", 《INVESTIGATIVE OPHTHALMOLOGY & VISUAL SCIENCE》 *
DONG-HYUN HONG等: "A Single, Abbreviated RPGR-ORF15", 《INVESTIGATIVE OPTHALMOLOGY&VISUAL SCIENCE》 *
朱静等: "X性连锁视网膜色素变性中的RPGR基因的研究进展 ", 《现代生物医学进展》 *
朱静等: "X性连锁视网膜色素变性中的RPGR基因的研究进展", 《现代生物医学进展》 *
李杨等: "一个X-连锁视网膜色素变性中国家系的RPGR基因的新突变(英文) ", 《中华医学遗传学杂志》 *
李杨等: "一个X-连锁视网膜色素变性中国家系的RPGR基因的新突变(英文)", 《中华医学遗传学杂志》 *
金磊等: "RPGR基因5'端新cDNA顺序和15号内含子中表达序列的发现 ", 《高技术通讯》 *
金磊等: "RPGR基因5'端新cDNA顺序和15号内含子中表达序列的发现", 《高技术通讯》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111867635A (zh) * 2017-10-20 2020-10-30 法国国家卫生及研究医学协会 包括视网膜下递送治疗有效量的重组aav9衍生载体的在对象的视锥细胞光感受器中表达目的多核苷酸的方法
CN115379834A (zh) * 2020-03-11 2022-11-22 马萨诸塞眼科耳科诊所 用于nmnat1相关视网膜变性的基因疗法

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