JP6966532B2 - 網膜色素変性症のためのｒｐｇｒ遺伝子治療 - Google Patents

Description

優先権の主張
本出願は、2014年7月24日出願の米国特許出願第62/028,638号に対して米国特許法第119条(e)に基づく優先権を主張する。上記出願の全内容が参照により本明細書に援用される。

連邦支援研究開発
本発明は、米国国立衛生研究所により授与された助成番号EY10581および5P30EY14104の下での政府援助を用いて行なわれた。政府は本発明について一定の権利を有する。

技術分野
本発明は、網膜色素変性症GTPase調節因子（RPGR）タンパク質をコードする遺伝子中の機能喪失突然変異に起因する、X連鎖性網膜色素変性症（XLRP）または別の眼科的症状を有するヒト被験体を治療するための方法に関し、該方法は、短縮型（abbreviated）ヒトRPGR cDNAを含むアデノ随伴ウイルスベクターを含む核酸を被験体に投与することを含む。

網膜色素変性症（RP）は、ヒトでの遺伝的な失明の主要な形態である。3種類の一般的な遺伝形式（常染色体優性、常染色体劣性、およびX連鎖性）のうちで、X連鎖性RP（XLRP）は主な標的として桿体光受容器および錐体光受容器の両方を巻き込む疾患の重症型に関連する（Berson 1993；Sandberg他 2007）。X連鎖性RPのうちの70％超およびすべてのRP症例のうちの10％〜20％が、RPGRをコードする遺伝子中の突然変異により引き起こされる（Bader他 2003；Branham他 2012；Churchill他；Pelletier他 2007）。100種類を大幅に上回る遺伝子での突然変異がRPおよびX連鎖性疾患のさらに高い重症度を引き起こすことが現在知られていることを考慮すれば、RPGRは、最も重要なRP疾患遺伝子のうちの1つである。

本発明は、機能的RPGR活性を再現することに成功するヒトRPGRの短縮型の発見に基づき、したがって、RPGRの突然変異により引き起こされるRPを有する被験体を治療するための方法を含む。本発明の方法により治療することができる被験体としては、視覚機能の喪失（例えば、網膜電図（ERG）検査での応答障害）を有するが、光波コヒーレンス断層映像法（OCT）により測定した場合に一部の光受容細胞を保持する被験体が挙げられる。

つまり、一態様では、本発明は、網膜色素変性症GTPase調節因子（RPGR）タンパク質をコードする遺伝子中の機能喪失突然変異に起因する、XLRPまたは別の臨床的に定義された眼科的症状を有するヒト被験体を治療するための方法を提供する。該方法は、短縮型ヒトRPGR cDNAを含むアデノ随伴ウイルスベクターを含む核酸を被験体に投与することを含み、短縮型ヒトRPGR cDNAは、配列番号2の全長に対して少なくとも80％同一であり、任意により、配列番号2の欠失領域（すなわち、配列番号2のアミノ酸861と862との間）を囲む領域中に最大で合計200個の追加のアミノ酸の欠失を有するタンパク質をコードする。

一部の実施形態では、RPGR cDNAは、ヒトロドプシンキナーゼ（hRK）プロモーター、例えば、配列番号5を含むかまたは実質的に配列番号5からなるhRKプロモーターの制御下にある。

一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクターはAAV-2、血清型8（AAV2/8）またはAAV-8である。

一部の実施形態では、RPGR cDNAは、配列番号1に対して少なくとも80％同一である配列を含むかまたは実質的に該配列からなる。

一部の実施形態では、ヒトRPGR cDNAは、配列番号2の全長に対して少なくとも95％同一であるタンパク質をコードする。

一部の実施形態では、方法は、約2×10¹⁰vg/mLの低用量、約2×10¹¹vg/mLの中間用量、または約2×10¹²vg/mLの高用量で核酸を投与することを含む。一部の実施形態では、核酸は、網膜下腔へと投与される。一部の実施形態では、ミクロ注入カニューレを、視神経の側頭側かつ主要アーケード血管（major arcade vessel）の直上にて、網膜下腔へと挿入し、それにより液流が黄斑へと向かうことができるようにする。

別の態様では、本発明は、短縮型ヒトRPGRをコードする核酸を提供し、このとき、短縮型ヒトRPGR cDNAは、配列番号2の全長に対して少なくとも80％同一であるタンパク質をコードし、任意により、配列番号2の欠失領域の周囲に最大で200個の追加のアミノ酸の欠失を有する。

一部の実施形態では、RPGR cDNAは、ヒトロドプシンキナーゼ（hRK）プロモーター、例えば、配列番号5を含むかまたは実質的に配列番号5からなるhRKプロモーターの制御下にある。

一部の実施形態では、RPGR cDNAは、配列番号1に対して少なくとも80％同一である配列を含むかまたは実質的に該配列からなる。

一部の実施形態では、ヒトRPGR cDNAは、配列番号2の全長に対して少なくとも95％同一であるタンパク質をコードする。

一部の実施形態では、ヒトRPGR cDNAは、配列番号1の全長に対して少なくとも80％同一であり、任意により、欠失領域の周囲に最大で200個の追加のアミノ酸をコードするヌクレオチドの欠失を有する。

本明細書中に記載される通りの短縮型ヒトRPGRをコードする核酸を含むベクター、例えば、アデノ随伴ウイルスベクター、例えば、AAV-2、血清型8（AAV2/8）またはAAV-8、ならびに短縮型ヒトRPGRをコードする核酸を保持し、かつ任意により短縮型ヒトRPGRタンパク質を発現する単離細胞（すなわち、生存ヒト被験体または宿主動物中に存在しない細胞）もまた本明細書中に提供される。

特に定義しない限り、本明細書中で用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。方法および材料は、本発明での使用のために本明細書中に記載され；当技術分野で公知の他の好適な方法および材料もまた用いることができる。材料、方法、および実施例は、単に例示的なものであり、制限的なものであるとは意図されない。本明細書中で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベース登録事項、および他の参照は、それらの全体が参照により組み入れられる。矛盾がある場合には、定義を含む本明細書が支配するであろう。

本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。

生来型ヒトRPGR ORF15コード領域およびAAV送達型ヒトORF15 cDNAの両方の短縮型（shortened form）のマップを示す図である。 ヒトRPGR-ORF15の2種類の組み換え型に対する免疫ブロットを示す図である。小さく欠失したヒトcDNA（AAV-ORF15-L、「長分子型」）のAAV送達は、約160kDのサイズのヒトRPGR-ORF15タンパク質の発現をもたらす。大きく欠失したヒトcDNA（AAV-ORF15-S、「短分子型」）のAAV送達は、約130kDのサイズのタンパク質の発現をもたらす。両方の形態のヒトRPGR-ORF15タンパク質が、ヒト網膜組織中で見出される内在性ヒトRPGR ORF15（約200kDa）よりも小さい。 AAV-RPGR ORF15の網膜下送達後のRPGR^-/-マウス網膜でのRPGR ORF15発現を示す図である。(A) 網膜外層を示すためのノマルスキー画像と重ね合わせた短分子型（ORF15-S）および長分子型（ORF15-L）の両方のヒトRPGR ORF15タンパク質発現の蛍光画像。未固定凍結網膜切片の染色を、1〜2ヵ月齢での処置から3週間後に行なった。 AAV-RPGR ORF15の網膜下送達後のRPGR^-/-マウス網膜でのRPGR ORF15発現を示す図である。(B)ルートレチン（rootletin）と共局在する両方の形態のヒトRPGR ORF15の蛍光画像。WTと同様に、両方の形態のヒトRPGR ORF15が、ルートレチンのすぐ遠位の光受容器結合繊毛に正しく局在した。RPE：網膜色素上皮；OS：外節；CC（TZ）：結合繊毛（移行帯）；IS：内節；ONL：外核層。 AAV-RPGR ORF15の網膜下送達後のRPGR^-/-マウス網膜でのRPGR ORF15発現を示す図である。(C) ORF15-Sを用いて処置したRpgr^-/-眼（n＝3）、ORF15-Lを用いて処置したRpgr^-/-眼（n＝3）、およびWT眼（n＝3）に対する、結合繊毛でのhRPGR蛍光粒子と蛍光ルートレチン線維との比率。カウントは、中部周辺網膜（midperipheral retina）の100μm長さにわたって、内節中のルートレチンとルートレチンのすぐ遠位のRPGRとの両方に関して取得した、値は平均±1標準誤差である。 AAV-RPGR ORF15の網膜下送達後のRPGR^-/-マウス網膜でのRPGR ORF15発現を示す図である。(D) Rpgr^-/-マウスの固定済み浮遊網膜切片での短分子型および長分子型ORF15タンパク質の発現パターン。切片を、2〜3ヵ月齢での処置から4〜6週間後にヒトRPGR ORF15タンパク質局在に関して染色した。WT網膜では、マウスRPGR ORF15タンパク質は、移行帯または結合繊毛のレベルで、光受容器内節と外節との間の領域を占める散在性の緑色蛍光シグナル（ドット）として見られた。対照的に、ORF15の短分子型（AAV-ORF15-S）に対する蛍光シグナルは光受容器結合繊毛のレベルに限定されず、内節および外節全体でも同様に拡散したシグナルとして見られる。ORF15の長分子型に対する蛍光シグナルは、誤局在があるにしても非常に少数しか見られず、多くはWTと同様に結合繊毛領域に限定される。OS：外節；CC（TZ）：結合繊毛（移行帯）；IS：内節；ONL：外核層。 13ヵ月齢（注入から6ヵ月後）での処置済み（ORF15の短分子型および長分子型）および対照RPGR^-/-マウス網膜での桿体光受容器および錐体光受容器の免疫組織化学的（元は黄色）分析を示す図である。ORF15の短分子型（AAV8-ORF15-S）を用いて処置したRPGR^-/-マウス網膜では、ロドプシンおよび錐体オプシン（下側網膜（inferior retina）中の混合型S＆M錐体）誤局在染色パターンは、対照網膜で見られるものとほとんど区別がつかない。これらの両方のマウスの網膜での、内節およびシナプス層での錐体オプシン誤局在に留意されたい。同様に、桿体および錐体外節は、月齢マッチングWTマウスと比較して減少した外核層を有して、短くなりかつ無秩序な構造を有する。対照的に、長分子型のORF15（AAV8-ORF15-L）を用いて処置されたRPGR^-/-マウス網膜では、ロドプシンは、WTマウス網膜と同様の外節分割を示す。ORF15長分子型で処置した網膜ではまた、桿体外節はより長くかつ十分に構造を保っており、ONLは対照網膜よりも厚い。錐体オプシン染色は、対照と比較してORF15長分子型で処置したRPGR^-/-マウス網膜にて、長くかつ十分に構造を保った外節を有する、より多数の錐体光受容器を示す。 RPGR^-/-マウスでのRPGR ORF15-Lを用いた処置後の光受容細胞のレスキューを示す図である。(A) 18ヵ月齢の3頭のマウスでの処置済み眼（元は赤色）および僚眼（fellow）対照（元は青色）に対するONL厚（上側）およびIS/OS長（下側）についての積み重ね棒グラフを示す。 RPGR^-/-マウスでのRPGR ORF15-Lを用いた処置後の光受容細胞のレスキューを示す図である。(B) 18ヵ月齢でのWTマウスならびにRPGR^-/-マウス由来のORF15-L処置済み眼および僚眼対照からの代表的光学顕微鏡写真。画像は、上側網膜（superior retina）の垂直子午線に沿った中部周辺領域（mid periphery）から取得した。 11〜14ヵ月齢の16頭のRPGR^-/-マウス由来の桿体a波、桿体b波、および錐体b波振幅を示す図である。対照眼（OD）は、野生型マウスについての下限と比較して、桿体b波振幅に対して錐体b波振幅の不均衡な低下を示した。1つの例を除いて、処置済み眼（OS）はすべて、僚眼対照よりも大きな応答を有した。特に、この月齢の処置済み眼の半数超が、野生型の下限以上である桿体ERG b波振幅を有したことに留意されたい。3つすべての測定値に対する平均値が、眼毎に有意に異なった（P＜0.01）。 暗順応（桿体）b波（上側グラフ）および明順応（錐体）b波（下側グラフ）についての、対数スケールでの9〜18ヵ月齢の22頭のRPGR^-/-マウスに関するERG振幅の散布図を示す図である。データ点は、データ重複を最小限にするために各月齢群について水平方向に若干ずらしてある。処置眼および対照眼に対する回帰直線を、すべての利用可能なデータに基づいて、SASのPROC MIXEDを用いた反復測定時系列回帰（repeated measures longitudinal regression）によりフィッティングした。 18ヵ月齢での1対のORF15-L処置済みRPGR^-/-眼および僚眼対照RPGR^-/-眼由来の代表的な暗順応（DA）および明順応（LA）ERG波形を示す図である。WT（月齢マッチング）ERG波形を比較のために示す。対照眼は、重度に低下したかまたはほとんど消失した、この月齢での桿体ERGおよび錐体ERGをそれぞれ有する。しかしながら、処置済み眼は、それぞれWT値の約70％および35％の、この時点でのかなり大きな桿体機能および錐体機能を未だ有する。 RPGR ORF15突然変異に起因するXLRPを有する5名の患者由来の、白色光の0.5Hzフラッシュおよび同じ白色光の30Hzフラッシュに対する全視野ERGを示す図である。再現性を示すために、3本以上のトレースを重ね合わせてある。トレース上のドットは、フラッシュ開始を表わす。0.5Hz応答に対する応答が正常の下限（350μV）よりも6％〜65％しか低下しなかった一方で、30Hzフラッシュに対する応答は、図示される通り、検出不可能であった（すなわち、バンドパスフィルター処理およびシグナル平均化なし）。

ウイルスベクター媒介体細胞遺伝子治療は、ヒト網膜変性疾患の動物モデルの治療で非常に有望であることが示されてきた。現在までに、小型動物モデル（Ali他 2000；Pang他 2012；Pawlyk他 2010；Pawlyk他 2005；Tan他 2009）および大型動物モデル（Acland他 2001；Alexander他 2007；Beltran他 2012；Komaromy他 2010；Lheriteau他 2009)での光受容器変性をレスキューするためのアデノ随伴ウイルス（AAV）媒介遺伝子送達を用いた多数の研究が成功している。これらのケースでは、網膜色素上皮（RPE）または光受容器が導入遺伝子発現のための主要標的であった。また、RPEを標的とする、レーバー先天性黒内障（Leber Congenital Amaurosis；LCA）を有する患者に対する遺伝子治療を含む第一相臨床試験（Bainbridge他 2008；Cideciyan他 2008；Maguire他 2008）、より最近では先天性脈絡膜欠如（choroideremia）に対する臨床試験（Maclaren他 2014）が、既に一定の成功を収めている。現在、X連鎖性RPを有する患者の治療に対するAAV媒介遺伝子置換治療を用いる臨床試験は行われていない。

本発明者らは、トランスジェニックアプローチを用いて、プリンリッチなカルボキシル末端で約600bpを欠失する短縮型マウスRPGR ORF15アイソフォームを用いて、RPGR欠損マウスでの桿体光受容細胞および錐体光受容細胞の両方の機能的および形態学的レスキューを以前に実証している（Hong他 2005）。反復領域の長さでの何らかの変動が、正常個体で頻繁に見出される（Bader他 2003；Jacobi他 2005；Karra他 2006）。しかしながら、短縮型ヒトRPGRの機能は説明されていない。

本研究では、以前に記載されたロドプシンキナーゼ（RK）プロモーター（Khani他 2007；Sun他 2010）により駆動され、かつ即効性AAV8ベクター（Allocca他 2007；Natkunarajah他 2008）中で送達される短縮型（shortened）ヒトRPGR ORF15置換遺伝子が、RPGRノックアウトマウスモデルでの光受容器変性表現型をレスキューすることができた。ORF15エキソンのプリンリッチ反復領域は、RPGRの正しい細胞内局在および機能に必要とされるが、最大で3分の1までのその長さの短縮は、その機能を傷害しないようである。この短縮型（shortened）RPGR置換遺伝子は、現行の回避的「全長」RPGR ORF15に対する、将来のヒト遺伝子治療治験での実現可能な代替案を提供する。

RPGR
RPGRは、初期型および記載してきたORF15変異体の両方について、複雑なパターンで発現する（Vervoort他 2000）。RPGRの初期型または構成的形態はエキソン1〜19にわたり、ORF15はエキソン16〜19の出発点より前のORF15と称される大きなオルタナティブエキソンで終結する。ORF15エキソンは、cDNA中にクローニングすることが困難でありかつ組み換えDNA操作の多数の手順にて不安定であることが証明された、長く連なるプリンリッチな反復配列を含む点でユニークである。RPGRの比較的小型の初期型が運動毛を有する組織（Hong et al., 2003）および多数のタイプの一次繊毛を有する組織（本発明者らの未発表データ）では優勢な形態であるが、RPGRのORF15アイソフォームは網膜での正常な桿体および錐体機能に必要であり（Vervoort他 2000；Vervoort and Wright 2002）、光受容器で主に発現される（Hong他 2003）。ORF15はまた、RPGRにおける突然変異について一般的な部位であり、X連鎖性RPを有する患者のうちの22〜60％で突然変異が見出される（Breuer他 2002；Vervoort他 2000）。

本発明者らは、RPGRのいずれのアイソフォームも検出可能なレベルで有しない、RPGRのヌル突然変異を有するX連鎖性RPの最初のマウスモデルの開発に寄与した（Hong他 2000）。RPGRヌルマウスは、細胞体およびシナプスでの早期の錐体オプシン誤局在ならびに桿体でのロドプシンレベルの低下を特徴とする緩徐進行性網膜変性を示す。結果として、これらのマウスは、錐体-桿体変性を有する。12ヵ月齢までに、相当な光受容細胞の喪失ならびに網膜電図（ERG）により測定した場合の錐体および桿体機能の低下が明らかになる。網膜では、RPGRは、RPGR結合性タンパク質（RPGRIP1）を介して内節と外節の間に局在する光受容器結合繊毛に結合する（例えば、Boylan and Wright 2000；Hong他 2001；Roepman他 2000を参照されたい）。結合繊毛は、運動毛または一次繊毛の移行帯に類似し、外節に対する出入り口として機能することができる。この細胞内局在パターンおよび突然変異体マウス表現型は、RPGRが桿体および錐体の両方の内節と外節との間でのタンパク質輸送にて役割を果たし得ることを示唆する（Hong and Li 2002；Hong他 2000；Hong他 2001)。より速い変性経過を有するRPGR突然変異体マウスモデルを開発するための試みの中で、数種類の他のRPGRマウス系統が、近年開発されている（Brunner, et al, 2010；Huang et al, 2012）。X連鎖性RPGRの天然に存在するモデル（rd9）もまた、近年報告されている（Thompson他 2012）。RPGRヌルマウスを含むこれらのケースのすべてが、緩徐進行性の光受容器喪失を示すが、桿体および錐体の含有度合は様々であり、これは、部分的には、系統および/または色素形成の差異に起因するものであり得る。これらの知見は、ノックアウトモデルでの緩慢な変性速度が、切除が不完全なのではなく、生物種間の差異に起因するものであることを示し、かつ、患者でのヌルRPGR突然変異の治療的研究でのこのマウスモデルの適用可能性を確認する。

全長ヒトRPGRの2種類の変異体（AおよびC）（CRD；RP3；COD1；PCDX；RP15；XLRP3；orf15；およびCORDX1としても知られる）がGenBankに記載され；アイソフォームAは登録番号NM_000328.2（核酸）およびNP_000319.1（タンパク質）であり；アイソフォームCは登録番号NM_001034853.1（核酸）およびNP_001030025.1（タンパク質）である。変異体(A)は、交互のスプライシング部位を用い、変異体Cと比較して3’コード領域に複数のオルタナティブエキソンを含み、かつアイソフォームA（アイソフォーム1とも称される）をコードし、アイソフォームAは、アイソフォームCと比較して短く、かつ異なったC末端を有する。本明細書中に記載される例示的な組成物中で用いられる配列は、配列番号1として以下で説明される。本明細書中に記載される組成物および方法で有用なヒトRPGRの配列は、配列番号1の全長に対して少なくとも80％、例えば、85％、90％、95％、または100％同一であり得、以下の配列中にハイフンで示される欠失領域から、最大で50個、100個、150個、または200個の追加のアミノ酸の欠失を有することができる。

ヒトRPGR ORF15配列の短縮形態；378bpが欠失し、欠失領域はハイフンにより示される（「-」；ハイフンの数は欠失のサイズと相関しない）

ヒトRPGR ORF15の短縮形態のタンパク質配列；欠失領域はハイフンにより示される（「-」；ハイフンの数は欠失のサイズと相関しない）

全長ヒトRPGR ORF15 cDNA配列；短縮形態で欠失している378bpは、以下の配列中で太字かつ下線が付されている

全長ヒトRPGR ORF15アミノ酸配列；短縮形態で欠失しているアミノ酸は、以下の配列中で太字かつ下線が付されている

配列の比較および2種類の配列間の同一性％の決定は、数学的アルゴリズムを用いて行なうことができる。例えば、2種類のアミノ酸配列間の同一性％は、GCGソフトウェアパッケージ（www.gcg.comにて入手可能）の中のGAPプログラムに組み込まれているNeedlemanおよびWunsch（(1970) J. Mol. Biol. 48:444-453）のアルゴリズムを用いて、初期値パラメーター（例えば、Blossum 62スコアリング行列、ギャップペナルティ＝12、ギャップ伸長ペナルティ＝4、およびフレームシフトギャップペナルティ＝5）を使用して、決定することができる。

RKプロモーター
本明細書中に記載される方法の一部の実施形態では、本明細書中に記載される通りの短縮型ヒトRPGR cDNAがヒトロドプシンキナーゼ（hRK）プロモーターの制御下に置かれている置換遺伝子構築物が用いられる。一部の実施形態では、RKプロモーターは約200bp長である（桿体および錐体での細胞特異的発現を駆動することが示されているロドプシンキナーゼ（RK）遺伝子由来の短いプロモーター（Khani et al., 2007; Sun et al., 2010；Young et al., 2003））。例示的なhRKプロモーター配列は、-112/+87である（Khani et al., 2007）。

ウイルス送達ベクター
上記の通りの短縮型ヒトRPGR cDNAが、送達ベクター、例えば、AAV8またはAAV2/8ベクターへとパッケージングされる。

置換遺伝子（cDNA）は、いずれかの有効なキャリア中で、例えば、in vivoにて細胞へと成分遺伝子を効率的に送達することが可能ないずれかの製剤または組成物中で、投与することができる。アプローチとしては、組み換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス、および1型単純ヘルペスウイルスをはじめとする非病原性非複製性ウイルスベクター、または組み換え細菌プラスミドもしくは組み換え真核生物プラスミドへの遺伝子の挿入が挙げられる。ウイルスベクターは細胞を直接的にトランスフェクトし；プラスミドDNAは裸で、または、例えばカチオン性リポソーム（リポフェクタミン）、または誘導体化（例えば、抗体コンジュゲート化）、ポリリジンコンジュゲート、グラマシジンS、人工ウイルスエンベロープまたは他のそのような細胞内キャリア、ならびに遺伝子構築物の直接注入またはin vivoで行なわれるCaPO₄沈殿の助けにより送達することができる。

細胞への核酸のin vivo導入のための好ましいアプローチは、核酸、例えばcDNAを含むウイルスベクターの使用によるものである。ウイルスベクターによる細胞の感染は、標的細胞の大部分が核酸を受け取ることができるという利点を有する。また、例えば、ウイルスベクター中に含まれるcDNAにより、ウイルスベクター内にコードされる分子は、ウイルスベクター核酸を取り込んだ細胞中で効率的に発現される。

レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターを、特にヒトへの、in vivoでの外来性遺伝子の輸送のための組み換え遺伝子送達系として用いることができる。これらのベクターは、細胞への遺伝子の効率的な送達をもたらし、輸送された核酸は宿主の染色体DNAへと安定的にインテグレートされる。複製欠損型レトロウイルスのみを生成する特殊な細胞株（「パッケージング細胞」と称される）の開発が、遺伝子治療に対するレトロウイルスの実用性を増大させており、欠損型レトロウイルスは遺伝子治療の目的のための遺伝子輸送での使用に関して特性決定されている（総説として、Miller, Blood 76:271 (1990)を参照されたい）。複製欠損型レトロウイルスはビリオンへとパッケージングすることができ、このレトロウイルスを、標準的技術によりヘルパーウイルスの使用を介して標的細胞に感染させるために用いることができる。組み換えレトロウイルスを作製するためのプロトコールおよびそのようなウイルスを用いてin vitroまたはin vivoで細胞に感染させるためのプロトコールは、Ausubel, et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14、および他の標準的実験室マニュアルに見出すことができる。好適なレトロウイルスの例としては、当業者に公知であるpLJ、pZIP、pWEおよびpEMが挙げられる。同種指向性および両種性の両方のレトロウイルス系を作製するための好適なパッケージングウイルス株の例としては、ΨCrip、ΨCre、Ψ2およびΨAmが挙げられる。レトロウイルスは、in vitroおよび/またはin vivoで、上皮細胞をはじめとする多数の異なる細胞タイプへと様々な遺伝子を導入するために用いられてきた（例えば、Eglitis, et al. (1985) Science 230:1395-1398；Danos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464；Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3014-3018；Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6141-6145；Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043；Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8377-8381；Chowdhury et al. (1991) Science 254:1802-1805；van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7640-7644；Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3:641-647；Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10892-10895；Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150:4104-4115；米国特許第4,868,116号；同第4,980,286号；国際公開第89/07136号；同第89/02468号；同第89/05345号；および同第92/07573号を参照されたい）。

本発明の方法で有用な別のウイルス性遺伝子送達系は、アデノウイルス由来ベクターを利用する。アデノウイルスのゲノムは、対象となる遺伝子産物をコードしかつ発現するが、正常な溶解性ウイルス生活環で複製する能力に関して不活性化されているように操作することができる。例えば、Berkner et al., BioTechniques 6:616 (1988)；Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991)；およびRosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992)を参照されたい。アデノウイルス株Ad type 5 dl324またはアデノウイルスの他の株（例えば、Ad2、Ad3、またはAd7など）に由来する好適なアデノウイルスベクターは、当業者に公知である。組み換えアデノウイルスは、非分裂細胞に感染できないこと、および上皮細胞をはじめとする広範な細胞タイプに感染させるために用いることができる点で、特定の状況では有利であり得る（Rosenfeld et al., (1992)上掲）。さらに、ウイルス粒子は比較的安定であり、かつ精製および濃縮を行ないやすく、また上記の通り、感染性スペクトルを変化させるために改変することができる。また、導入されたアデノウイルスDNA（およびそこに含有される外来性DNA）は、宿主細胞のゲノムにインテグレートされずに、エピソームに留まり、それにより、導入されたDNAが宿主ゲノムへとインテグレートされる場合（例えば、レトロウイルスDNA）にin situでの挿入突然変異の結果として生じ得る潜在的な問題を回避する。さらに、外来性DNAに関するアデノウイルスゲノムの運搬許容量は、他の遺伝子送達ベクターと比べて大きい（最大で8kb）（Berkner et al., 上掲；Haj-Ahmand and Graham, J. Virol. 57:267 (1986)）。

核酸の送達に有用なまた別のウイルスベクター系は、アデノ随伴ウイルス（AAV）である。アデノ随伴ウイルスは、天然に存在する欠損型ウイルスであり、効率的な複製および生産性生活環のためにヘルパーウイルスとして別のウイルス（アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなど）を必要とする（総説として、Muzyczka et al., Curr. Topics in Micro. and Immunol. 158:97-129 (1992)を参照されたい）。アデノ随伴ウイルスはまた、非分裂細胞へとそのDNAがインテグレートされることがある数種類のウイルスのうちの1種類でもあり、高頻度に安定的なインテグレーションを生じさせる（例えば、Flotte et al., Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-356 (1992)；Samulski et al., J. Virol. 63:3822-3828 (1989)；およびMcLaughlin et al., J. Virol. 62:1963-1973 (1989)を参照されたい）。300塩基対ほどしかないAAVを含むベクターをパッケージングすることができ、これをインテグレートさせることができる。外来性DNAのための空き場所は約4.5kbに限られている。Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)に記載されるものなどのAAVベクターを、細胞へのDNAの導入に用いることができる。種々の核酸が、AAVベクターを用いて様々な細胞タイプへと導入されてきた（例えば、Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6466-6470 (1984)；Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1985)；Wondisford et al., Mol. Endocrinol. 2:32-39 (1988)；Tratschin et al., J. Virol. 51:611-619 (1984)；およびFlotte et al., J. Biol. Chem. 268:3781-3790 (1993)を参照されたい）。

好ましい実施形態では、ウイルス送達ベクターは組み換えAAV2/8ウイルスである。

投与に先立って、最終生成物に対して、臨床グレード基準を満たすための一連の超精製ステップが行なわれるであろう。

被験体選択
本発明の治療方法のための候補である被験体としては、RPGRをコードする遺伝子中の突然変異により引き起こされたRPの診断を有する被験体が挙げられる。RPGRをコードする遺伝子中の突然変異により引き起こされる他の臨床的に定義された眼科的症状（例えば、X連鎖性桿体-錐体ジストロフィー（cone-rod dystrophy））に見舞われている被験体もまた、本明細書中に記載される方法を用いて治療することができる。RPGRをコードする遺伝子中の突然変異により引き起こされるXLRPまたは別の眼科的症状の診断は、当技術分野で公知の方法を用いて行なうことができる。

本明細書中に記載される方法は、被験体（例えば、RPGRをコードする遺伝子中の突然変異により引き起こされるXLRPもしくは別の眼科的症状を有するか、またはRPGRをコードする遺伝子中の突然変異により引き起こされるXLRPもしくは別の眼科的症状を有することが疑われる（例えば、該症状の徴候の存在および他の明らかな原因の非存在に基づいて）小児、若年者、または若年成人被験体）を特定するステップ、ならびに該被験体からゲノムDNAを含むサンプルを取得するステップ、公知の分子生物学的方法を用いてRPGR中の突然変異の存在を検出するステップ、およびXLRPまたは別の症状を引き起こすRPGR中の突然変異を有する患者を選択するステップを含むことができる。RPGR中の突然変異を検出するステップは、例えば、Sandberg et al., (2007). Invest Ophthalmol Vis Sci 48, 1298-304；Dror et al., Am J Hum Genet. Nov 2003; 73(5): 1131-1146に記載される通りに、ORF15での突然変異を検出することを含むことができる。

RPGR ORF15での突然変異としては、フレームシフト突然変異、ナンセンス突然変異、スプライシング部位突然変異、およびミスセンス突然変異が挙げられる。例示的な突然変異としては、ORF15Glu446（1-bp-del）、ORF15Glu447（2-bp-del）、およびORF15GLys521（1-bp-ins）が挙げられる。

RPGR中の突然変異の検出ステップはまた、被験体でのRPGR遺伝子の全体または一部分（例えば、ORF15領域）を配列決定するステップ、および、突然変異を検出するために該配列を参照配列（例えば、GenBank登録番号NG_009553.1）と比較するステップも含むことができる。フレームシフト突然変異、切断突然変異、保存されたアミノ酸を変化させる突然変異、または調節（例えば、プロモーター）領域に影響する突然変異は、本明細書中に記載される通りのXLRPまたは別の眼科的症状を引き起こすことができる突然変異であると見なすことができ；機能の変化は、in vitro（例えば、培養細胞中）またはin vivo（例えば、トランスジェニック動物）にて突然変異体を発現させること、および例えば、機能または細胞内局在をアッセイすることにより確認することができる。

本明細書中に記載される方法を用いて治療することができるRPGR突然変異に起因するXLRPまたは別の眼科的症状を有する患者は、好ましくは、例えば、標準的視覚機能もしくは視野検査および/または光波コヒーレンス断層映像法（OCT、例えば、スペクトルドメインOCT（SD-OCT））により測定される場合の、一部の光受容器および視覚機能を保持し；例えば、Sandberg et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007;48:1298-1304を参照されたい。本明細書中に記載される方法は、それらの症状を引き起こすことが確認されたRPGR中の突然変異を有する、RPGR突然変異に起因するXLRPまたは別の眼科的症状を有すると診断されている被験体を特定するステップ、ならびに該被験体の視覚能力を検査するステップおよび残留する中央部光受容器（central photoreceptor）の存在を検出するステップを含むことができる。本発明の方法を用いて治療することができる被験体（例えば、小児、若年者、若年成人、または成人被験体）は、好ましくは、少なくとも20/200の視力（視力を測定するための方法は当技術分野で周知であり；例えば、Deafness and Vision Disorders: Anatomy and Physiology, Assessment Procedures, Ocular Anomalies, and Educational Implications, Charles C. Thomas Publisher; 1999) Carlson, N; Kurtz, D.; Heath, D.; Hines, C. Clinical Procedures for Ocular Examination. Appleton & Lange; Norwalk, CT. 1990を参照されたい）および中心窩での検出可能な外核層（例えば、正常な厚みの少なくとも75％、80％、90％、95％、または99％）を有するであろう。

本発明が以下の実施例にてさらに説明され、以下の実施例は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。

材料および方法
以下の材料および方法が、下記の実施例で用いられた。

動物
RPGR^-/-マウスの作製および分析は、以前に記載されている（Hong他 2000）。本研究で用いられるRPGR^-/-マウスは、本発明者らの機関の動物施設で維持されているヌル接合（nullizygous）RPGR雄とホモ接合（RPGR^-/-）雌との間での同胞交配（sibling mating）から繁殖させた。本研究で用いられるWTマウスは、Charles River Laboratory社（Wilmington, MA）からのC57BLであった。マウスは、12時間明/12時間暗の照明サイクルで維持した。研究は、眼科および視覚研究での動物使用に関するARVO声明（the ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research）に従って行ない、マサチューセッツ眼科耳鼻科病院（Massachusetts Eye and Ear Infirmary）のIACUCにより承認された。

プラスミド構築および組み換えAAV8の作製
ヒトRPGR ORF15 cDNAを、RPGR ORF15アイソフォームコード領域全体を含むように設計されたプライマーを用いるPCRにより、ヒト網膜cDNAから増幅した。様々な方法を用いて繰り返し試みたにもかかわらず、全長ORF15 cDNAは得られず、このことは、他の研究者および本発明者ら自身の経験と合致した（Hong他 2005）。その代わりに、本発明者らは、プリンリッチ反復領域の大部分が除去された、ORF15エキソン中に大きな314コドン（942bp）インフレーム欠失（2517bpが残存）を含む短縮型ORF15 cDNAを得た（コドン696-1010del、「短分子型」）（図1A）。2番目のORF15 cDNAは組み換えDNA操作を介して得られ、エキソン15の高度に反復された領域内での126コドン（378bp）インフレーム欠失（ORF15エキソン中に3081bpが残存）を含んだ（コドン862-988del、「長分子型」）。これらのORF15 cDNAを、フィデリティを確認するために配列決定した。AAVベクターを構築するために、RPGR cDNAを、親となるpAAV-RK-zsGreenベクターのマルチクローニング部位へと挿入した。得られたpAAV-RK-mRPGRベクターおよびpAAV-RK-hRPGRベクターをAAVへとパッケージングした。AAV2/8偽型ベクターを、293A細胞への3成分トランスフェクションにより生成した：(1)対象となる遺伝子をコードするAAVベクタープラスミド、(2)血清型2由来のAAV Repタンパク質および血清型8由来のCapタンパク質をコードするAAVヘルパープラスミドpLT-RC03、ならびに(3)アデノウイルスヘルパーミニプラスミドpHGTI-Adeno1。トランスフェクションは、Xiaoおよび共同研究者により開発されたプロトコールを用いて行なった（Xiao, et al., 1998）。トランスフェクション2日後、細胞を、凍結融解サイクルを繰り返し行なうことにより溶解させた。細胞残渣の最初の除去後、ウイルス産生細胞の核酸成分をベンゾナーゼ（Benzonase）処理により除去した。組み換えAAVベクター粒子をイオジキサノール（iodixanol）密度勾配により精製した。精製されたベクター粒子をPBSに対して十分に透析し、ドットブロットハイブリダイゼーションにより力価決定した。

網膜下注入
マウスを、ケタミン（90mg/kg）/キシラジン（9mg/kg）の腹腔内注入を用いて全身麻酔下に置いた。0.5％プロパラカイン（proparacaine）溶液を、局所麻酔として角膜に投与した。シクロペントレートおよび塩酸フェニルエフリンの局所投与を用いて瞳孔を散大させた。眼科手術用顕微鏡下にて、18ゲージ針を用いて角膜縁の近傍で角膜を小さく切開した。ハミルトンシリンジに取り付けた33ゲージ鈍針を、切開部から水晶体の奥へと挿入し、網膜を通して押し込んだ。すべての注入は、網膜の鼻側四半部（nasal quadrant）内の位置で網膜下へと行なった。注入は、網膜の鼻側四半部（nasal quadrant）内にて網膜下へと行なった。それぞれの眼に、2×10⁹ベクターゲノム（AAV-ORF15-L）または5×10⁹ベクターゲノム（AAV-ORF15-S）のいずれかを1μLの体積で投与した。RPGR-ORF15ベクターを左眼（OS、oculus sinister）に投与し、対照ベクター（AAV8-RK-EGFP）を右眼（OD、oculus dexter）に投与した。これらを、本明細書全体を通して、それぞれ「処置済み」または「対照」と記載する。注入の際の可視化を、フルオレセイン（100mg/mL AK-FLUOR、Alcon社）のベクター溶液への0.1体積％での添加により補助した。注入後の眼底検査により、大多数の症例では網膜の30％超が剥離していることが見出され、このことにより、網膜下送達の成功を確認した。マウスのコホート（合計でn＝50）に、タンパク質発現研究に関しては1ヵ月齢、機能研究（ERG）および組織学的研究に関しては3〜7ヵ月齢（この月齢期間にはERGは正常のままであったので）にて大幅な光受容器欠損の前に注入した。

組織学および免疫蛍光法
光学顕微鏡および透過型電子顕微鏡観察の両方のために、摘出眼球を、0.1Mカコジル酸バッファー（pH7.5）中の1％ホルムアルデヒド、2.5％グルタルアルデヒド中で10分間固定した。前眼部および水晶体の除去後、眼杯を同じ固定剤中に4℃で一晩置いた。眼杯をバッファーで洗浄し、四酸化オスミウム中で後固定し、段階的なアルコール系列を通して脱水し、エポンに包埋した。準薄切片（semi-thin section）（1μm）を光学顕微鏡観察用に切り出した。EM用には、超薄切片を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、その後にJEOL 100CX電子顕微鏡で観察した。

繊毛タンパク質の免疫蛍光染色のために、眼球を摘出し、急速凍結し、クライオスタットにて10μm厚で薄切した。その後、未固定凍結切片をガラス上に回収し、染色した。すべての他のタンパク質の免疫染色に関しては、浮遊網膜切片を回収して染色した。このプロセスのために、眼球を固定剤（2％ホルムアルデヒド、0.25％グルタルアルデヒド/PBS）中に入れ、前眼部および水晶体を除去した。固定の持続時間は、典型的には20分間であった。固定した組織を少なくとも2時間、30％スクロース/PBSに浸漬し、急速凍結し、未固定組織と同様に薄切した。続いて切片をPBSバッファー中に回収し、免疫染色プロセスの間、浮遊したままにした。染色済みの切片は、レーザー走査型共焦点顕微鏡（model TCS SP2；Leica社）で観察および写真撮影した。用いた抗体は、マウスRPGR（S1）、ヒトRPGR C100、抗ルートレチン、1D4（抗ロドプシン）、混合青色/緑色錐体抗オプシン、およびHoechst 33342核色素染色であった。

免疫ブロット分析
網膜組織をRIPAバッファー中でホモジナイズし、Laemmliバッファー中でボイルし、5％SDS-PAGEゲルへと15μg/レーンでロードした。ゲル分離後に、タンパク質を、電気トランスファーによりPVDFメンブレンにブロットした。メンブレンを5％脱脂乳を用いてブロッキングし、室温にて一晩、一次抗体と共にインキュベートした。洗浄後、メンブレンをペルオキシダーゼコンジュゲート化二次抗体と共にインキュベートした。SuperSignal(登録商標) West Pico化学発光基質（Pierce社）を、検出のために用いた。標準化のために、タンパク質サンプルを標準的なSDS-PAGEで分離し、トランスデューシンα抗体（バンダービルト大学のHeidi Hamm博士から寄贈）を用いてプロービングした。

ERG記録
マウスを一晩暗順応させ、試験に先立って腹腔内注入したペントバルビタールナトリウムにより麻酔した。それぞれの動物の両方の瞳孔を、塩酸フェニルエフリンおよび塩酸シクロペントレートを用いて局所的に散大させ、続いてマウスを加温プラットホームに載せた。桿体優勢応答を、ガンツフェルドドームにて1分間の間隔で与えられる白色光の10μsフラッシュ（1.37×10⁵cd/m²）を用いて暗所で引き起こした。明順応錐体応答を、1Hzの間隔で与えられる同じフラッシュ（1.37×10⁵cd/m²）を用いて41cd/m²桿体脱感作白色背景の存在下にて引き起こした。塩酸プロパラカインを用いて局所麻酔し、かつゴニオソール（Goniosol）で湿らせた各角膜と接触する銀線ループ電極を用いて、両方の眼からERGを同時にモニタリングし、このとき、参照として頸部の皮下電極を用い；電気的に遮蔽されたチャンバーをグラウンドとして機能させた。

すべての応答を、ゲイン1000にて示差的に増幅し（-3db、2Hzおよび300Hz；AM502、Tektronix Instruments, Beaverton, OR）、調節可能な頂点間入力振幅を用いて16bitの解像度にて二値化し（PCI-6251、National Instruments, Austin, TX）、カスタムソフトウェアを用いてパソコン上に表示させた（Labview、version 8.2、National Instruments）。それぞれの眼に対して独立に、錐体応答を60Hzノッチフィルターおよび調節可能なアーチファクト除去ウインドウによって調整し、合算し（n＝4〜20）、続いて、時間特性に影響を及ぼさずにシグナル：ノイズ比を改善するために、可変剛性を有する三次スプライン関数に対してフィッティングし；このようにして、本発明者らは、錐体b波応答を2μVまで小さく分解することができた。

統計解析
JMP、version 6（SAS Institute, Cary, NC）を用いて、断面ERG振幅および陰的時間を比較した。PROC MIXED OF SAS、version 9.3（SAS Institute）による反復測定解析を、組織学的比較および処置群と非処置群の眼の時系列ERGデータの比較のために用いた。

患者
ORF15 RPGR突然変異に起因するXLRPを有する111名の患者についてのSharon, et al (2003)により記載されたデータセットから得られる全視野網膜電図（ERG）データを、残存する桿体＋錐体機能を反映する0.5Hz白色光に対するb波振幅と、残存する錐体機能のみを反映する同じ白色光の30Hzフラッシュに対するb波振幅とを比較するために見直した。患者が桿体-錐体または錐体-桿体疾患を有するか否かを決定するために、本発明者らは、ODについておよびOSについての30Hzフラッシュに対するその振幅により除算した0.5Hzフラッシュに対するその振幅の比率を算出し；本発明者らの系での正常の下限に対する同じ比は、350μV/50μV＝7である。0.5Hzフラッシュに対する応答振幅のさらに正確な定量のため、および一次光受容器変性に対する二次的な考えられる影響を最小限にするために、本発明者らは、初期または軽症疾患を反映する50μV超の0.5Hzフラッシュに対する振幅を有する患者（n＝14）に注目した。

ORF15突然変異を有する患者のERG
残存する桿体＋錐体機能を反映する0.5Hz白色フラッシュに対する最も安定した応答を有する14名の患者に関して、当該条件に対する振幅は53μV〜329μV ODおよび59μV〜282μV OSの範囲であった。錐体機能のみを反映し、バンドパスフィルター処理および10μV未満の振幅に対するシグナル平均化を用いてモニタリングされた、同じ白色光の30Hzフラッシュに対する該患者の振幅は、0.98μV〜23.5μV ODおよび0.95μV〜20μV OSの範囲であった。30Hzフラッシュに対する応答振幅により除算した0.5Hzフラッシュに対する応答振幅の比率は、47.0±12.7 ODおよび48.7±13.0 OSの平均±標準誤差を有した。これらの平均値は、正常の下限に基づく比率についての値である7.0とは有意に異なった（ノンパラメトリック符号付き順位検定、p＝0.0004 ODおよびp＝0.001 OS）。言い換えれば、ORF15突然変異を有するこれらの患者は、著しく不均衡な錐体機能の喪失を有した。これらのERGの例を、図6に示す。

実施例1. ヒトRPGR ORF15のAAV媒介発現
本発明者らは、一方は126コドンのインフレーム欠失を有し（長分子型、ORF15-L）、もう一方は314コドンのインフレーム欠失を有する（短分子型、ORF15-S）、2種類のヒトRPGR ORF15置換遺伝子を構築した。両方の遺伝子をヒトロドプシンキナーゼプロモーターの制御下にてAAV8ベクターへと挿入した（図1A）（Khani他 2007；Sun他 2010）。2種類のヒトRPGR ORF15置換遺伝子の網膜下送達（左眼）は、組み換えRPGRタンパク質の産生をもたらした。ウエスタンブロッティングによれば、AAVベクター投与から2週間後に、長分子型のORF15は約160kDタンパク質を産生し、短分子型のORF15は約125kDタンパク質を産生した。両方のタンパク質生成物は、ヒト網膜組織中で見られる生来型ORF15（約200kD）よりも小さかった（図1B、図1C）。置換ORF15の両方の形態が、ヒトRPGRのC末端に対する抗体を用いてプロービングした場合に、単一バンドとして現れた。本発明者らの実験条件および与えた投与量では、ORF15-SおよびORF15-Lの発現レベルは同等であった。対照眼（右眼）にはAAV-GFPを投与した。

ORF15の両方の形態を、未固定凍結切片（網膜下注入から3週間後）の免疫蛍光染色によりRPGR^-/-マウスの網膜で見ることができ、結合繊毛が存在する内節と外節との間の層に正しく局在していた。しかしながら、短分子型（AAV8-ORF15-S）は長分子型（AAV8-ORF15-L）よりもずっと弱いシグナルを生じた（図2A）。十分に形質導入された網膜領域では、長分子型で処置した網膜由来のシグナルは、WTシグナルと見た目には区別がつかなかった（図2Aおよび図2B）。繊毛根毛部（ciliary rootlet）（基底小体の近位端から生じて細胞内部に向かって伸び、それにより繊毛領域に対する良好なマーカーとして機能する（Hong他 2003；Yang他 2002））に対する抗体との二重標識により、結合繊毛への組み換えPRGRの適正な細胞内局在が確認された（図2B）。ウエスタンブロッティングにより決定されたタンパク質発現レベルでの類似性とは対照的に、長分子型のORF15のみが、根毛部の数と一致するすべてのCC中での安定したシグナルを有するようであり、その一方で、短分子型で処置した網膜では、多数の根毛部がその遠位端でRPGRシグナルを有しなかった。図2Cは、ヒトORF15の長分子型または短分子型のいずれかを用いて処置されたRpgr^-/-マウス網膜ならびに未処置野生型マウス網膜での、ルートレチン線維のカウントと比較したRPGR標識カウントを表わす棒グラフを示す。ORF15長分子型と野生型との間には平均比率（ルートレチン線維カウントにより除算したRPGRシグナルカウント）の差異はなかったが（ダネット法、p＝0.24）、ORF15短分子型は野生型に対して有意に低い平均比率を有した（p＝0.0019）。

免疫ブロッティングによる同様のレベルの発現を考慮すれば、結合繊毛でのタンパク質局在でのこの格差（不均衡）は、おそらくは短分子型のORF15の一部分が光受容器内のどこかに誤局在していた可能性があることを示唆した。シグナル強度は犠牲になるが組織のよりよい保存を提供する固定済み網膜切片の免疫染色によるさらなる分析によって、短分子型ORF15に関して光受容器内節および外節へと誤局在したORF15のパターンが明らかになった（図2D）。長分子型ORF15に関しては誤局在は見られず、長分子型はWTと同様の染色パターンを有していた。つまり、CCでの短分子型RPGRについての染色の欠損は、全体的な発現レベルの低下ではなく、局在化能力またはこの細胞内コンパートメントに拘束される能力の低下に起因するものである。

実施例2. RPGRヌルマウスでのヒトORF15-L（長分子型）発現は桿体および錐体の残存を促す
2種類の置換遺伝子の治療効率を調べるために、本発明者らは、桿体および錐体形態学の改善の徴候を探るための免疫染色により、RPGR^-/-マウス光受容器を評価した。13ヵ月齢（処置6ヵ月後）までに、ヒトORF15の短分子型について観察された桿体または錐体形態学での明らかな差異はなく（図3）；対照眼とORF15短分子型処置済みの眼の両方が、この月齢に典型的な変性した見た目を有した。桿体および錐体外節が、WT眼と比較して短くなりかつ無秩序な構造を有し、外核層全体に見られる桿体オプシンの誤局在およびシナプス層でさらにみられる錐体オプシンの誤局在を伴った。対照眼およびORF15短分子型により処置した眼では、外核層は厚さも同程度に低下していた。

対照的に、ヒトORF15の長分子型処置済み眼は、誤局在の明らかな徴候なしに、外節と適正に区分けされた桿体でのロドプシン発現を有した。同様に、錐体オプシン誤局在は、長い方のORF15構築物を用いて処置したこれらの眼では稀であった。さらに、ORF15-L処置眼は、対照またはORF15-S処置眼よりも多数の桿体細胞および錐体細胞（および正常に近い見た目の外節）を有することが明らかになった。

これらの知見に基づいて、長分子型ORF15を用いて処置したマウスでの時系列研究を行なった。ORF15-L処置眼でのレスキューの程度を対照眼と比較して定量するために、本発明者らは、3頭のRpgr^-/-マウスの僚眼での外核層（ONL）の厚みおよび光受容器内節/外節の長さを測定した。これらは上側半球の3箇所の領域および下側半球の3箇所の領域で測定され、各領域は600μmずつ隔たり、垂直子午線に沿った視神経頭（optic nerve head）の両側から600μmのところから出発しており；11ヵ月齢および18ヵ月齢での反復測定全因子回帰を、主作用としての眼、半球、および領域毎の差異を明らかにするために用い、ならびに治療効果が地理的に変化するか否かを決定するために、それらの外積を用いた。11ヵ月齢では、ONL厚は正常に分布したが、内節/外節長は正常に分布せず（Shapiro-Wilk W適合度検定（Shapiro-Wilk W goodness of fit test）、p＝0.016）；18ヵ月齢では、ONL厚と内節/外節長のいずれもが正常に分布しなかった（それぞれ、p＝0.0011およびp＝0.0002）。11ヵ月齢では、平均ONL厚は処置済み眼（48.0μm）に対して対照眼（38.0μm、p＝0.0015）よりも有意に大きく；平均内節/外節長もまた処置済み眼（45.1μm）に対して対照眼（29.5μm、p＜0.0001、標準化順位（normalized rank）に関してp＜0.0001）よりも有意に大きかった。ONL厚およびIS/OS長に関する治療効果は、この月齢では下側および上側半球について同程度であった。18ヵ月齢では、僚眼との間での網膜形態学の差異はより顕著であった：平均ONL厚は処置済み眼に対して22.8μmであり、対照眼に対して13.7μmであり（p＜0.0001、標準化順位に関してp＜0.0001）、平均内節/外節長は処置済み眼に対して19.8μmであり、対照眼に対して7.3μmであった（p＜0.0001、標準化順位に関してp＜0.0001）。この月齢では、本発明者らは、IS/OS長に対する治療効果が18ヵ月では下側網膜よりも上側網膜で有意に大きい（p＝0.0036）ことを最初に観察したが、これは標準化順位に対して長さを変換した後には維持されなかった（p＝0.17）。図4Aは、18ヵ月齢の3頭のマウスでの処置済み眼および対照眼に関する領域毎のONL厚およびIS/OS長を示す。

図4Bは、18ヵ月齢での代表的なORF15-L処置済み眼および僚眼対照から取得した代表的な光学顕微鏡写真を示す。対照網膜では、最もよく保存された区域は、短くなりかつ構造が崩れた光受容器内節/外節を伴う、まばらに配列した約2〜3列の光受容器核のみを有する。内節および外節の辺縁はもはや明らかでないことに留意されたい。一方で、処置済み眼は、より長く、よりしっかりした構造を有しかつ明白な内節および外節を有する光受容細胞を全体にわたって約5〜6列有する。

実施例3. ヒトRPGR ORF15長分子型の発現が桿体および錐体機能を改善する
全視野桿体および錐体ERGによりモニタリングする場合の網膜機能を、9ヵ月〜18ヵ月齢のRPGR^-/-マウスのコホート（n＝22）で評価した。マウスは3〜7ヵ月齢で処置を受け、追跡ERGが注入6ヵ月後から記録された。図5Aは、11〜14ヵ月齢で試験された16頭のマウスからの眼毎の桿体および錐体ERG振幅を示す。対照眼（OD）は、野生型マウスに対する下限と比較して、桿体b波振幅に対して錐体b波振幅の不均衡な喪失を示し、このことはRPGR^-/-マウスのこのマウスモデルで以前に観察された通りであり、かつ錐体-桿体変性を証明した。1つを除いてすべての症例で、処置済み眼（OS）は対照眼（OD）と比較して大きなERG a波およびb波振幅を有し、このことは、桿体および錐体光受容器機能の改善を実証した。実際に、処置済み眼の半数以上（9/16）が、月齢マッチングしたWT値の下限（点線）以上の桿体b波振幅を有した。桿体ERG a波およびb波振幅についての幾何平均値は、a波について121μV OSおよび65μV ODであり、b波について482μV OSおよび267μV ODであった。平均錐体ERG b波振幅は22μV OSおよび11μV ODであった。これらのデータは、この月齢範囲での、AAV-ORF15処置による桿体機能の81〜86％の改善および錐体機能の100％の改善を示す。

22頭のマウスコホート全体で、本発明者らは、眼毎の桿体および錐体b波振幅に関する変化率を比較するために、反復測定時系列回帰を用いた（図5B）。推定平均変化率は、対照眼の桿体b波振幅に関して−8.6％/月および処置済み眼の桿体b波振幅に関して−3.8％/月であり；これら2つの平均値の差異は有意であった（p＝0.0001）。推定平均変化率は、対照眼の錐体b波振幅に関して−5.8％/月および処置済み眼の錐体b波振幅に関して−0.8％/月であり；これら2つの平均値の差異もまた有意であった（p＜0.0001）。また、処置済み眼に関する錐体b波振幅の減少はゼロと有意に異ならないことが見出され（p＝0.54）、このことは、観察可能な進行を有しない錐体機能の安定性を示した。

代表的な桿体および錐体ERGを、18ヵ月齢（最終時点）での処置済み眼およびWTを含む対照眼での波形を例示するために、図5Cに示す。この月齢の対照眼での桿体機能は重度に低下しており（平均で75％低下）、その一方で、錐体機能は最小限かつ一部の症例ではほとんど検出不可能である。対照的に、この時点での処置済み眼は、WT眼で見られるものよりは低いものの、桿体および錐体機能をかなり保っている。

参考文献

他の実施形態
本発明をその詳細な説明との関連で説明してきたが、上記の説明は例示を意図するものであり、本発明の範囲を限定することを意図せず、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲により規定される。他の態様、利点および改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
本発明は例えば以下の実施形態を包含する：
１．網膜色素変性症GTPase調節因子（RPGR）タンパク質をコードする遺伝子中の機能喪失突然変異に起因するX連鎖性網膜色素変性症（XLRP）または別の眼科的症状を有するヒト被験体を治療する方法であって、該被験体の眼に短縮型ヒトRPGR cDNAを含むアデノ随伴ウイルスベクターを含む核酸を投与することを含み、該短縮型ヒトRPGR cDNAが、配列番号2の全長に対して少なくとも80％同一であり、任意により配列番号2の欠失領域周囲の領域に最大で合計200個の追加のアミノ酸の欠失を有するタンパク質をコードする、上記方法。
２．網膜色素変性症GTPase調節因子（RPGR）タンパク質をコードする遺伝子中の機能喪失突然変異に起因するX連鎖性網膜色素変性症（XLRP）または別の眼科的症状を有するヒト被験体の治療での使用のための、短縮型ヒトRPGR cDNAを含むアデノ随伴ウイルスベクターを含む核酸であって、該短縮型ヒトRPGR cDNAが、配列番号2の全長に対して少なくとも80％同一であり、任意により配列番号2の欠失領域周囲の領域に最大で合計200個の追加のアミノ酸の欠失を有するタンパク質をコードする、上記核酸。
３．前記RPGR cDNAがヒトロドプシンキナーゼ（hRK）プロモーターの制御下にある、実施形態1に記載の方法または実施形態2に記載の使用。
４．前記アデノ随伴ウイルスベクターが、AAV-2、血清型8（AAV2/8）またはAAV-8である、実施形態1に記載の方法または実施形態2に記載の使用。
５．前記hRKプロモーターが配列番号5を含むかまたは実質的に配列番号5からなる、実施形態1に記載の方法または実施形態2に記載の使用。
６．前記RPGR cDNAが配列番号1に対して少なくとも80％同一である配列を含むかまたは実質的に該配列からなる、実施形態1に記載の方法または実施形態2に記載の使用。
７．前記ヒトRPGR cDNAが、配列番号2の全長に対して少なくとも95％同一であるかまたは配列番号2を含むタンパク質をコードする、実施形態1に記載の方法または実施形態2に記載の使用。
８．約2×10¹⁰vg/mLの低用量、約2×10¹¹vg/mLの中間用量、または約2×10¹²vg/mLの高用量で前記核酸を投与することを含む、実施形態1に記載の方法または実施形態2に記載の使用。
９．前記核酸が網膜下腔へと投与される、実施形態1に記載の方法または実施形態2に記載の使用。
１０．ミクロ注入カニューレを、視神経の側頭側かつ主要アーケード血管（major arcade vessel）の直上にて、網膜下腔へと挿入し、それにより液流が黄斑へと向かうことができるようにする、実施形態9に記載の方法または使用。
１１．短縮型ヒトRPGRをコードする核酸であって、該短縮型ヒトRPGR cDNAが、配列番号2の全長に対して少なくとも80％同一であり、任意により配列番号2の欠失領域周囲に最大で200個の追加のアミノ酸の欠失を有するタンパク質をコードする、上記核酸。
１２．前記RPGR cDNAがヒトロドプシンキナーゼ（hRK）プロモーターの制御下にある、実施形態11に記載の核酸。
１３．前記hRKプロモーターが配列番号5を含む、実施形態11に記載の核酸。
１４．前記hRKプロモーターが実質的に配列番号5からなる、実施形態11に記載の核酸。
１５．前記ヒトRPGR cDNAが、配列番号2の全長に対して少なくとも95％同一であるかまたは配列番号2を含むタンパク質をコードする、実施形態11に記載の核酸。
１６．前記ヒトRPGR cDNAが、配列番号1の全長に対して少なくとも80％同一であり、任意により欠失領域周囲に最大で200個の追加のアミノ酸をコードするヌクレオチドの欠失を有する、実施形態11に記載の核酸。
１７．網膜色素変性症GTPase調節因子（RPGR）タンパク質をコードする遺伝子中の機能喪失突然変異に起因するX連鎖性網膜色素変性症（XLRP）または別の眼科的症状を有するヒト被験体の治療での使用のための、実施形態11〜16のいずれかに記載の核酸。
１８．実施形態11〜16のいずれかに記載の核酸を含む、ウイルスベクター。
１９．アデノ随伴ウイルスベクターである、実施形態18に記載のウイルスベクター。
２０．前記アデノ随伴ウイルスベクターが、AAV-2、血清型8（AAV2/8）またはAAV-8である、実施形態19に記載のウイルスベクター。
２１．網膜色素変性症GTPase調節因子（RPGR）タンパク質をコードする遺伝子中の機能喪失突然変異に起因するX連鎖性網膜色素変性症（XLRP）または別の眼科的症状を有するヒト被験体の治療での使用のための、実施形態18〜20のいずれかに記載のウイルスベクター。
２２．実施形態18〜20のいずれかに記載のウイルスベクター、または実施形態11〜16のいずれかに記載の核酸を含む、単離された宿主細胞。
２３．短縮型ヒトRPGRタンパク質を発現する、実施形態22に記載の単離された宿主細胞。

Claims (18)

1. 配列番号2からなる短縮型ヒト網膜色素変性症GTPase調節因子（RPGR）タンパク質をコードする核酸。
2. （a）前記短縮型ヒトRPGRタンパク質をコードする核酸がヒトロドプシンキナーゼ（hRK）プロモーターの制御下にある、および/または
   （b）前記短縮型ヒトRPGRタンパク質をコードする核酸が配列番号5を含むhRKプロモーターの制御下にある、および/または
   （c）前記短縮型ヒトRPGRタンパク質をコードする核酸が実質的に配列番号5からなるhRKプロモーターの制御下にある、
   請求項1に記載の核酸。
3. 前記短縮型ヒトRPGRタンパク質をコードする核酸が配列番号1の全長を含むかまたは配列番号1の全長からなる、請求項1または2に記載の核酸。
4. 網膜色素変性症GTPase調節因子（RPGR）タンパク質をコードする遺伝子中の機能喪失突然変異に起因するX連鎖性網膜色素変性症（XLRP）または別の眼科的症状を有するヒト被験体の治療のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸を含む医薬組成物。
5. 請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸を含む、ウイルスベクター。
6. アデノ随伴ウイルスベクターである、請求項5に記載のウイルスベクター。
7. 前記アデノ随伴ウイルスベクターがAAV-2またはAAV-8である、請求項6に記載のウイルスベクター。
8. 前記アデノ随伴ウイルスベクターがAAV2/8である、請求項6に記載のウイルスベクター。
9. 網膜色素変性症GTPase調節因子（RPGR）タンパク質をコードする遺伝子中の機能喪失突然変異に起因するX連鎖性網膜色素変性症（XLRP）または別の眼科的症状を有するヒト被験体の治療のための、請求項5〜8のいずれか1項に記載のウイルスベクターを含む医薬組成物。
10. 請求項5〜8のいずれか1項に記載のウイルスベクター、または請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸を含む、単離された宿主細胞。
11. 前記短縮型ヒトRPGRタンパク質を発現する、請求項10に記載の単離された宿主細胞。
12. 網膜色素変性症GTPase調節因子（RPGR）タンパク質をコードする遺伝子中の機能喪失突然変異に起因するX連鎖性網膜色素変性症（XLRP）または別の眼科的症状を有するヒト被験体の治療での使用のための、短縮型ヒトRPGRタンパク質をコードする核酸を含むウイルスゲノムを含むアデノ随伴ウイルスベクターを含む医薬組成物であって、該核酸が、配列番号2からなるタンパク質をコードする、上記医薬組成物。
13. 前記短縮型ヒトRPGRタンパク質をコードする核酸がヒトロドプシンキナーゼ（hRK）プロモーターの制御下にある、請求項12に記載の医薬組成物。
14. （a）前記hRKプロモーターが配列番号5を含むかまたは実質的に配列番号5からなる、および/または
    （b）前記短縮型ヒトRPGRタンパク質をコードする核酸が配列番号1を含むかまたは配列番号1からなる、
    請求項12または13に記載の医薬組成物。
15. 前記アデノ随伴ウイルスベクターが、AAV-2またはAAV-8である、請求項12〜14のいずれか1項に記載の医薬組成物。
16. 前記アデノ随伴ウイルスベクターが、AAV2/8である、請求項12〜14のいずれか1項に記載の医薬組成物。
17. （a）前記使用が、約2×10¹⁰vg/mLの用量、約2×10¹¹vg/mLの用量、または約2×10¹²vg/mLの用量で前記ウイルスベクターを投与することを含む、および/または
    （b）前記ウイルスベクターが網膜下腔へと投与される、
    請求項12〜16のいずれか1項に記載の医薬組成物。
18. ミクロ注入カニューレを、視神経の側頭側かつ主要アーケード血管（major arcade vessel）の直上にて、網膜下腔へと挿入し、それにより液流が黄斑へと向かうことができるようにする、請求項17に記載の医薬組成物。

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