CN102822173A - 杂环化合物和作为抗癌剂的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了被噻唑环取代的、具有稠合双环杂芳环系统的新化合物。该化合物抑制各种类型的癌细胞的生长，并由此可用于治疗癌症。监测细胞生长/迁移的系统证明了这些化合物的效果，显示它们是癌细胞的生长和/或迁移的有效抑制剂。另外，本发明的化合物可体内终止肿瘤生长，并体内减小肿瘤大小。还公开了包含这些化合物的组合物、使用这些化合物的方法和治疗癌症的组合物。

Description

杂环化合物和作为抗癌剂的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时专利申请61/306,416(2010年2月19日申请)和61/314,510(2010年3月16日申请)的优先权，其中公开的内容以引证的方式全部结合到本文中。

本发明的领域

本发明的领域是杂环化合物、药物组合物和方法，尤其涉及治疗和预防癌症和相关疾病的组合物和方法。

本发明的背景

在发达国家，癌症是第二种最大的死亡原因。因此，对于人类来说，癌症仍然是最重要的、不能应付的医学挑战。许多方案可用于治疗肿瘤，包括手术、辐射、化疗或这些方法的任何联用形式。在这些之中，化疗广泛地用于所有类型的癌症，尤其是不宜手术的或具有转移特征的那些癌症。虽然各种化学治疗化合物用于临床以提高各种类型人癌症的存活率，但化疗通常不是治愈性的，只是延迟疾病发展。

通常，化疗难以治疗肿瘤和其转移病变，这是因为肿瘤细胞形成多耐药性的能力。在某些情况下，肿瘤固有地耐受一些种类的化学治疗剂。在其它情况下，在化学治疗干预期间形成针对化学治疗剂的获得性抗性。由此，在治疗各种肿瘤过程中，可利用的化学治疗化合物的效果仍然具有显著的局限性。此外，用于化学治疗肿瘤的许多细胞毒性和细胞生长抑制剂具有严重的副作用，导致一些患者终止化疗。由此，还需要治疗癌症的新的化学治疗剂。

发明概述

本发明涉及具有与苯胺取代的噻唑环连接的双环杂芳基环系统的新化合物、含有这些化合物的药物组合物和使用这些化合物和组合物的方法。本文所描述的化合物显示出抗肿瘤、抗癌、抗炎症、抗感染和抗增殖活性。它们尤其可用于治疗癌症，这可以通过其对癌细胞(包括许多不同类型的癌症)的选择性毒性来证明。本发明还涉及含有这种化合物的药物组合物，其可以用于治疗肿瘤、癌症和感染和/或增殖性疾病。

在本发明主题的一方面，新杂环化合物具有按照式I或II的结构：

其中Z选自但不局限于下列取代的苯基或杂环(在这些结构中，被虚线截开的键代表Z基团与式I或II中的NH的连接点)：

或其可药用盐或酰化的前体药物。

已经报道(WO 2009/023402)了与本文所描述化合物相似的化合物，包括这种化合物治疗癌症的用途。然而，本文所描述的新化合物出人意料地优于本领域已知的化合物。

式I-II的化合物可以以中性化合物或它们与无机和有机反离子成的药学合适的盐的形式使用。它们的盐包括含有可药用反离子的酸加成盐，例如但不局限于：卤离子(Cl-、Br-、I-)，硝酸根，甲磺酸根，对甲苯磺酸根/甲苯磺酸根，草酸根，柠檬酸根，苹果酸根，马来酸根，酒石酸根，富马酸根，甲酸根，乙酸根和与这些类似的阴离子。

如果合适的话，上述杂环化合物包括该化合物本身，以及它们的盐和它们的前体药物。这种盐，例如，可以在化合物上带正电荷的取代基团(例如，质子化了的杂环或芳香环上的氨基)和药学合适的阴离子之间形成，或通过向式I或II化合物的碱性杂环基团中加入酸来形成。合适的阴离子包括但不局限于：氯离子，溴离子，碘离子，硫酸根，硝酸根，磷酸根，柠檬酸根，苯磺酸根，甲磺酸根，三氟乙酸根，马来酸根和醋酸根。类似地，化合物上的带负电荷的取代基(例如，杂环或芳香环上的羧酸根基团)可以与可药用阳离子形成盐。合适的阳离子的非限制性例子是钠离子，钾离子，镁离子，钙离子，和有机铵离子，例如四甲铵离子，四丁铵离子及其它有机阳离子。

合适的前体药物可以由式I或II的NH基团的酰化来形成。示范性的前体药物包括：式I或II的化合物，其中NH被酰化为NC(O)-R*，其中C(O)R*是任选取代的酰基，例如甲酰基，乙酰基，氯乙酰基，三氯乙酰基，三氟乙酰基，等等。其它前体药物包括：式I的化合物，其中NH被磺酰化，形成例如N-SO₂-R'，其中R'可以是例如甲基，氟甲磺酰基或三氟甲磺酰基。

本发明的化合物可以以异构体形态存在，包括旋光异构体，几何异构体，互变异构体和旋转异构体(包括阻转异构体)。本发明包括式I-II化合物的每个这种异构体和其混合物。在化合物具有手性中心的情况下，例如，本发明包括每个单一异构体以及不同数量的两种异构体的混合物，包括具有等数量的两种异构体的消旋混合物。因为本发明的化合物是联芳，所以，它们可以以围绕联芳连接基的旋转异构体形态存在，此外，每个异构体以及这种异构体的混合物包括在本发明范围内。

本发明化合物和含有本发明化合物的组合物用于治疗以不希望有的细胞增殖为特征的病症。尤其是，该化合物用于治疗肉瘤，表皮癌，纤维肉瘤，子宫颈癌，胃癌，皮肤癌，白血病，淋巴瘤，肺癌，非小细胞肺癌，结肠癌，CNS癌，黑素瘤，卵巢癌，肾癌，前列腺癌，乳腺癌，肝癌，头颈癌，胰腺癌，及其它类型的增殖疾病。

附图的简要说明

图1显示了化合物O对MKN45人胃肠癌(通过皮下植入移植在免疫缺陷性裸鼠中的异种移植物)的体内抗肿瘤效果。

图2显示了化合物O对H460人非小细胞肺癌(通过皮下植入移植在免疫缺陷性裸鼠中的异种移植物)的体内抗肿瘤效果。

图3显示了化合物O对A549人非小细胞肺癌(通过皮下植入移植在免疫缺陷性裸鼠中的异种移植物)的体内抗肿瘤效果。

图4显示了利用实时细胞电子感测(RT-CES系统，得自于ACEA Biosciences，其与Roche的xCELLigence系统相同)系统测定的A549人非小细胞肺癌细胞系对各种浓度化合物O(图4A)、太平洋紫杉醇(图4B)和长春花新碱(图4C)的动态响应图。

图5显示了利用xCelligence系统(Roche)(其与实时细胞电子感测(RT-CES)系统(ACEA Biosciences)相同)测定的H596人肺腺鳞癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图6显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的H292人肺癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图7显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的H460人大细胞肺癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图8显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的H1993人非小细胞肺癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图9显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的H1838人非小细胞肺癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图10显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的H2347人非小细胞肺癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图11显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的SW620人结肠癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图12显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的GTL16人胃癌细胞系(其源自于MKN45人胃癌细胞系)对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图13显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的HT29人结肠癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图14显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的A172人脑癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图15显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的U138MG人脑癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图16显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的U118MG人脑癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图17显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的SW1088人脑癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图18显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的HT1080人结缔组织癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图19显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的BxPC3人胰腺癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图20显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的HepG2人肝癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图21显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的SKOV3人卵巢癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图22显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的MCF7人乳腺癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图23显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图24显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的KB人子宫颈癌细胞系(图24A-D)和KB200人子宫颈癌细胞系(表达多耐药性MDR基因)(图24E-H)对各种浓度的化合物O(图24A和E)、太平洋紫杉醇(图24B和F)、长春花碱(图24C和G)和秋水仙碱(图24D和H)的动态响应图。

图25显示了利用xCelligence系统(Roche)测定的NIH3T3正常组织细胞系对各种浓度的化合物O的动态响应图。

图26A显示了化合物O对微管组装的体外影响(使用MAP富集的微管蛋白)。

图26B显示了用化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱治疗20小时对A549细胞中微管结构的抑制效果。

图26C显示了化合物O通过秋水仙碱-结合位点与微管蛋白的相互作用(使用离心柱试验)。

图27A显示了用37 nM化合物O和37 nM太平洋紫杉醇治疗24小时、48小时和72小时所引起的A549人肺癌细胞的细胞程序死亡。

图27B显示了用37 nM化合物O和37 nM太平洋紫杉醇治疗72小时所引起的A549、H596和H292人肺癌细胞的细胞程序死亡。

图28A显示了太平洋紫杉醇和化合物O对A549人肺癌细胞的有丝分裂延滞程度(用分裂指数定量)。

图28B显示了用化合物O治疗24小时之后A549人肺癌细胞的细胞周期分布。

本发明的实施方案

为了明确本公开(但不是为了限制)，提供下列本发明所选择的实施方案的说明书。为方便起见，将其分成小节，但不应该将章节的分开理解为对本发明范围的限制。

A. 定义

除非另外定义，否则，本文使用的所有技术和科学名词具有与本发明所属领域的普通技术人员所通常理解含义的相同含义。本文提到的所有专利、申请、公开的申请及其它出版物，本文以引证的方式结合其全部内容。如果本节列出的定义与本文以引证的方式结合的专利、申请、公开的申请及其它出版物列出的定义矛盾或与其不一致，本节列出的定义优先于本文以引证的方式结合的定义。

本文使用的“一个”是指“至少一个”或“一个或多个”。

本文使用的术语“烷基”是指直链、支链或环构型的饱和烃基团，尤其涉及的烷基包括低级烷基(就是，具有十个或更少碳原子的那些烷基)。示范性的烷基是甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，异戊基，己基，等等。本文使用的术语“烯基”是指具有至少一个双键的上述烷基。由此，尤其涉及的烯基包括具有两个至十个碳原子的直链、支链或环烯基(例如，乙烯基，丙烯基，丁烯基，戊烯基，等等)。类似地，本文使用的术语“炔基”是指具有至少一个三键的上述烷基或烯基。尤其涉及的炔基包括具有两个至十个总碳原子的直链、支链或环炔烃(例如，乙炔基，丙炔基，丁炔基，等等)。

本文使用的术语“环烷基”是指环烷烃(即，其中烃的碳原子链形成环)，优选包括三至八个碳原子。由此，示范性的环烷包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基，环庚基和环辛基。环烷基还包括一或两个双键，形成“环烯基”。环烷基还可进一步被烷基、烯基、炔基、卤代基及其它常规基团取代。

本文使用的术语“芳基”或“芳香部分”是指芳香环系统，其可以进一步包括一个或多个非碳原子。由此，涉及的芳基包括(例如，苯基，萘基，等等)和吡啶基。进一步涉及的芳基可以与一或两个5或6元芳基或杂环基团稠合(即，与第一个芳香环上的2个原子共价结合)，并由此称为“稠合的芳基”或“稠合的芳香基团”。

本文使用的术语“杂环”、“环杂烷基”和“杂环部分”在本文中可互换使用，并且指的是其中多个原子通过多个共价键形成环的任何化合物，其中环包括至少一个非碳原子的原子。尤其涉及的杂环基（heterocyclic bases）包括含有氮、硫或氧(作为非碳原子)的5和6元环(例如，咪唑，吡咯，三唑，二氢嘧啶，吲哚，吡啶，噻唑，四唑等等)。进一步涉及的杂环可以与一或两个环或杂环稠合(即，与第一个杂环上的2个原子共价结合)，并由此称为本文使用的“稠杂环”或“稠合的杂环基（heterocyclic bases）”或“稠合的杂环部分”。

本文使用的术语“卤素”是指氟、氯、溴和碘。

应该进一步认识到，所有上述定义的基团可以进一步被一个或多个取代基取代，该取代基也可以被取代。例如，烷基或芳基上的氢原子被氨基、卤代基或其它基团取代。

本文使用的术语“取代”是指另一个原子或基团取代H原子。烷基、烯基和炔基的取代程度通常使得这种取代具有化学意义。典型的取代基包括但不局限于：卤代基，=O ，=N-CN，=N-OR，=NR，OR，NR₂，SR，SO₂R，SO₂NR₂，NRSO₂R，NRCONR₂，NRCOOR，NRCOR，CN，COOR，CONR₂，OOCR，COR和NO₂，其中每个R独立地是H，C1-C8烷基，C2-C8杂烷基，C1-C8酰基，C2-C8杂酰基，C2-C8烯基，C2-C8杂烯基，C2-C8炔基，C2-C8杂炔基，C6-C10芳基或C5-C10杂芳基，每个R任选被下列取代：卤代基，=O，=N-CN，=N-OR’，=NR’，OR’，NR’₂，SR’，SO₂R’，SO₂NR’₂，NR’SO₂R’，NR’CONR’₂，NR’COOR’，NR’COR’，CN，COOR’，CONR’₂，OOCR’，COR’和NO₂，其中每个R'独立地是H，C1-C8烷基，C2-C8杂烷基，C1-C8酰基，C2-C8杂酰基，C6-C10芳基或C5-C10杂芳基。烷基、烯基和炔基还可以被C1-C8酰基、C2-C8杂酰基、C6-C10芳基或C5-C10杂芳基取代，其每个可以被适合于具体基团的取代基取代。

“杂烷基”、“杂烯基”和“杂炔基”等等类似地定义为相应的烃基(烷基、烯基和炔基)，但术语‘杂’指的是在骨架残基内含有1-3个O、S或N杂原子或其组合的基团；由此，相应的烷基、烯基或炔基的至少一个碳原子被一个具体杂原子替代，形成杂烷基、杂烯基或杂炔基。烷基、烯基和炔基的杂形式的典型和优选的大小通常与相应的烃基相同，并且可以存在于该杂形式上的取代基与上面描述的烃基的取代基相同。由于化学稳定性的原因，还应该理解(除非另作说明)，这种基团不包括两个以上的邻近杂原子，不过，氧代以硝基或磺酰基形式存在于N或S上的情况除外。

同时，本文使用的“烷基”包括环烷基和环烷基烷基，本文可以使用“环烷基”来描述通过环碳原子连接的碳环的非芳香基，“环烷基烷基”可以描述通过烷基连接基与分子连接的碳环的非芳香基。类似地，“杂环基”可以用于描述含有至少一个杂原子作为环成员并且通过环原子(可以是C或N)与分子连接的非芳香环基团。；“杂环基烷基”可以用于描述通过连接基与另一个分子连接的这种基团。适合于环烷基、环烷基烷基、杂环基和杂环基烷基的大小和取代基与上面描述的烷基的大小和取代基相同。本文使用的这些术语还包括含有一个或两个双键的环，只要该环不是芳香环即可。

本文使用的“酰基”包括含有烷基、烯基、炔基、芳基或芳烷基原子团的基团，这些原子团在羰基碳原子的两个合适化合价位置中的一个位置连接，杂酰基是指相应的基团，在这种基团中，至少一个非羰基碳的碳已被选自N、O和S的杂原子替代。由此，杂酰基包括，例如，-C(=O)OR和-C(=O)NR₂以及-C(=O)-杂芳基。

通常，包含在取代基中的任何烷基、烯基、炔基、酰基或芳基或芳烷基或这些基团之一的任何杂形式本身可以任选被额外的取代基取代。如果不另外描述这些取代基，则这些取代基的性质与原始取代基本身所列举的那些相似。由此，例如，在R⁷是烷基的实施方案的情况下，如果具有化学意义，如果不破坏为烷基本身而设的大小限制，该烷基可以任选被R⁷的实施方案所列的其余取代基取代；例如，被烷基或烯基取代的烷基将会简单地扩大这些实施方案的碳原子的上限，并不包括在本发明范围内。然而，被芳基、氨基、烷氧基、=O等等取代的烷基包括在本发明范围内，并且这些取代基团的原子不计入用于描述烷基、烯基等等基团的数目中。如果没有表示取代基的数目，则按照合适的原子价，每个这种烷基、烯基、炔基、酰基或芳基可以被许多取代基取代；尤其是，这些基团中的任何一个可以在任何或所有它的合适原子价条件下例如被氟原子取代。

尤其涉及的官能团包括亲核基团(例如，-NH₂，-OH，SH，-NC，等等)，亲电子基团(例如，C(O)OR或，C(X)OH，等等)，极性基团(例如，-OH)，非极性基团(例如，杂环，芳基，烷基，烯基，炔基，等等)，离子基(例如，NH₃ ⁺)和卤素(例如，-F，-Cl)，NHCOR，NHCONH₂，OCH₂COOH，OCH₂CONH₂，OCH₂CONHR，NHCH₂COOH，NHCH₂CONH₂，NHSO₂R，OCH₂-杂环，PO₃H，SO₃H，氨基酸，和其所有化学上合理的组合。此外，术语“取代”还包括多取代度，在公开或要求多取代基的情况下，取代的化合物可以独立地被一个或多个公开或要求的取代基部分取代。此外，本文使用的术语“单/二/三/四取代”是指取代到芳香或杂环或稠合芳香或杂环部分上的上述一个或两个或三个或四个官能团，其中这种多官能团在芳香或杂环部分的任何邻位或对位或间位的组合位置被取代。

另外，本文给出的任何化学式代表这种化合物的水合物、溶剂化物和多晶型物和其混合物。

本文使用的“可药用”“药理学可接受的”是指不是生物学或其它方面不合需要的物质，例如，该物质可以结合进给予患者的药物组合物中，不会导致任何显著的不合需要的生物效果或不会以有害方式与含有该物质的组合物的任何其它组分相互作用。可药用载体或赋形剂优选满足毒理学和生产试验所需要的标准，和/或由美国食品与药物管理局所制订的Inactive Ingredient Guide所包括。

“可药用盐”是保持游离(非盐)化合物的至少一些生物活性的那些盐，并且可以以药物或药品形式给予个体。可药用盐意指离子相互作用，不是共价键。因此，认为N-氧化物不是盐。例如，这种盐包括：(1)与无机酸形成的酸加成盐，例如盐酸，氢溴酸，硫酸，硝酸，磷酸，等等；或与有机酸形成的酸加成盐，例如乙酸，草酸，丙酸，琥珀酸，马来酸，酒石酸等等；(2)母体化合物中存在的酸性质子被金属离子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子替代时形成的盐；或与有机碱配位形成的盐。可接受的有机碱包括乙醇胺，二乙醇胺，三乙醇胺等等。可接受的无机碱包括氢氧化铝，氢氧化钙，氢氧化钾，碳酸钠，氢氧化钠，等等。可药用盐的进一步例子包括Berge等人Pharmaceutical Salts，J. Pharm. Sci. 66(1):1-19，1977中所列的那些盐。可药用盐可以在生产过程中原位制备，或单独地使纯化的游离酸或碱形式的本发明化合物分别与合适的有机或无机碱或酸反应，并在随后的纯化期间分离由此形成的盐。应该理解，可药用盐包括其溶剂加合形式或其晶体形式，尤其是溶剂化物或多晶型物。溶剂化物含有化学计量或非化学计量数量的溶剂，并且通常在结晶过程期间形成。当溶剂是水时，形成水合物，或当溶剂是醇时，形成醇化物。多晶型物包括化合物的相同元素组成的各种晶体堆积排列。多晶型物通常具有不同的X射线衍射图，红外光谱，熔点，密度，硬度，晶形，旋光性和电性质，稳定性和溶解性。各种因素，例如重结晶溶剂、结晶速率和储存温度，可以导致单晶形式占优势。

本文使用的术语“赋形剂”是指可以用于制备药物或药品(例如，含有本发明化合物作为活性组分的片剂)的惰性或非活性物质。术语赋形剂可以包括各种物质，包括但不限于用作下列的任何物质：粘合剂，崩解剂，包衣，挤压/包封助剂，乳剂或洗剂，润滑剂,肠胃外给药溶液，嚼片用的材料，甜味剂或调味剂，悬浮/凝胶剂，或湿法造粒剂。粘合剂包括，例如，卡波姆，聚维酮，黄原胶，等等；包衣包括，例如，邻苯二甲酸醋酸纤维素，乙基纤维素，洁冷胶，麦芽糖糊精，肠溶衣，等等；挤压/包封助剂包括，例如，碳酸钙，葡萄糖，果糖dc(dc=“可直接压缩的”)，蜂蜜dc，乳糖(无水或一水合物；任选与阿斯巴甜、纤维素或微晶纤维素组合)，淀粉dc，蔗糖，等等；崩解剂包括，例如，交联羧甲纤维素钠，洁冷胶，羟基乙酸淀粉钠，等等；乳剂或洗剂包括，例如，麦芽糖糊精，卡拉胶，等等；润滑剂包括，例如，硬脂酸镁，硬脂酸，十八烷基富马酸钠，等等；嚼片用的材料包括，例如，葡萄糖，果糖dc，乳糖(一水合物，任选与阿斯巴甜或纤维素组合)，等等；悬浮/凝胶剂包括，例如，卡拉胶，羟基乙酸淀粉钠，黄原胶，等等；甜味剂包括，例如，阿斯巴甜，葡萄糖，果糖dc，山梨糖醇，蔗糖dc，等等；颗粒湿润剂包括，例如，碳酸钙，麦芽糖糊精，微晶纤维素，等等。

除非另作说明，否则，本文使用的术语“患者”在本文中定义包括动物，例如哺乳动物，包括但不限于：灵长类(例如，人)，牛，羊，山羊，马，狗，猫，兔，大鼠，小鼠等等。在具体实施方案中，患者是人。

B. 杂环化合物和其药物组合物

B.1. 代表性的化合物：

一些代表性的本发明的化合物列于表1中。

表1. 代表性的本发明化合物

。

B.2. 示范性的合成方法

示范性的化合物可以利用反应路线I和II所举例说明的路线来合成。可以使用本领域已知的方法和本领域技术人员改进的方法，由合适的起始原料制备本发明的化合物。一些使用的方法公开在公开的PCT申请WO 2009/023402中。可以用于制备本发明范围内化合物的其它合成法公开在例如下列中：Hayakawa等人，Biorg. Med. Chem. Vol. 15, 403-12(2007); Ermolat’ev等人，J. Comb. Chem. Vol. 8, 659-63(2006); Carballares等人，Tetrahedron Lett. vol. 48, 2041-45(2007); 和Rupert等人，Biorg. Med. Chem. Lett., vol. 13, 347-50(2003)。

下面的反应路线提供了制备本文所提供化合物的示范性的合成方法。本领域普通技术人员可以理解，可以使用类似的方法来制备本文提供的化合物。换句话说，本领域普通技术人员将会认识到，可以合适地调整试剂、保护基、反应条件和反应顺序，制备目标实施方案。可以向上或向下调节反应规模，以便适合所制备物质的数量。

制备本文所提供化合物的具体反应路线如下所示。本文下面提供了各个具体实施例的详细反应条件。本领域普通技术人员可以理解，用合适的试剂、保护基、条件、起始原料或反应顺序可以改进下列反应路线，以便适合本文所提供的其它实施方案的制备。

本文以引证的方式结合所有公开的参考文献的全部内容。

用ChemDraw Ultra 10.0形成化合物名称；还用ChemDraw Ultra 10.0形成实施例中使用的中间体和试剂名称。

2a. 式I化合物的常规合成反应路线/方法：

反应路线I

在EtOH中，在回流温度下，用3-氯戊烷-2,4-二酮2处理噻唑-2-胺1，得到环化产物3，将其在HOAc中用溴进一步溴化，得到α-溴酮4。取代的苯胺5与苯甲酰基异硫氰酸酯6在丙酮中反应，制备N-(苯基氨基甲硫酰基（carbamothioyl）)苯甲酰胺7，在80℃，用5% NaOH水溶液使其水解，得到取代的苯硫脲8。然后将两个关键中间体7和8在EtOH中加热，高产率地形成噻唑9(式I)的HBr盐，其可以转变为用于体外和体内研究的其它可药用盐(例如HCl盐)或游离碱形式。

制备本发明化合物所需要的式5的取代的苯胺是商购产品，或可以利用已知的方法合成。

2b. 式II化合物的常规合成反应路线/方法：

反应路线II

在EtOH中，在回流温度下，用3-氯戊烷-2,4-二酮2处理嘧啶-2-胺10，得到环化产物11，将其在HOAc中用溴进一步溴化，得到α-溴酮12。取代的苯胺5与苯甲酰基异硫氰酸酯6在丙酮中反应，制备N-(苯基氨基甲硫酰基)苯甲酰胺7，在80℃，用5% NaOH水溶液使其水解，得到取代的苯硫脲8。然后将两个关键中间体12和8在EtOH中加热，高产率地形成噻唑13(式II)的HBr盐，其可以转变为用于体外和体内研究的其它可药用盐(例如HCl盐)或游离碱形式。

制备本发明化合物所需要的式5的取代的苯胺是商购产品，或可以利用已知的方法合成。

B.3. 实施例：

提供下列实施例，举例说明本发明，但不限制本发明。

按照反应路线I和II所描述的合成方法/反应路线，合成表1中的化合物。本文提供了一些示范性的合成法。

实施例 B(1) ： 2-(4- 乙氧基苯基氨基 )-4-(2- 甲基 - 咪唑并 [1,2-a] 嘧啶 -3- 基 ) 噻唑单氢溴酸盐 (a) 的合成：

化合物a的合成法示于反应路线III中：

反应路线III

1-(2-甲基咪唑并[1,2-a]嘧啶-3-基)乙酮(4)的合成。

将3-氯-2,5-戊二酮(2)(106 mL，119 g，887 mmol，1.2 eq)溶于650 mL无水乙醇中。将2-氨基嘧啶(1)(71.5 g x 97%=69.36 g，729 mmol)加入到上面的搅拌溶液中。将得到的混合物在100-105℃的油浴温度下回流40小时。将该黑色反应混合物冷却，并减压浓缩。用饱和碳酸氢钠溶液(～500 mL)分几份处理残余物，并轻摇烧瓶，以便更好地混合。用二氯甲烷(x 6)提取该混合物。用碳酸氢钠溶液和盐水洗涤提取物。干燥有机相，浓缩。利用硅胶柱(7 x 30 cm)快速色谱纯化残余物，使用正己烷-乙酸乙酯(3:1，2:1，1:1，1:2和0:1)而后二氯甲烷-甲醇(30:1，20:1，10:1和5:1)的梯度进行洗脱。收集产物馏分(TLC，R _f 0.36，100%乙酸乙酯)，浓缩，提供淡黑色固体。收集含有产物的其它馏分，利用相同方法再次纯化。获得27.84 g(21.8%)的最终产物。用少量乙腈将部分产品重结晶，得到红色至浅棕色晶体4，m.p.：255.6-256.6℃。¹H NMR(CDCl₃)δ2.65(s, 3H, 3-COCH₃), 2.86(s, 3H, 2-CH₃), 7.04-7.12(m, 1H, 6-H), 7.70-7.74(m, 1H), 9.96-10.00(m, 1H)。

2-溴-1-(2-甲基咪唑并[1,2-a]嘧啶-3-基)乙酮单氢溴酸盐(5)(溴化)的合成

通过温和地加热烧瓶，将1-(2-甲基咪唑并[1,2-a]嘧啶-3-基)乙酮(4)(1.75 g，10 mmol)溶于20 mL冰醋酸中，然后将其冷却至室温。在室温下，将溴(0.6 mL，1.85 g，11.5 mmol，1.15 eq)的4 mL乙酸溶液慢慢地加入到上述搅拌反应混合物中，保持30分钟以上。[注意：溴的腐蚀性很强。需要很小心地在通风良好的通风橱中操作溴。操作者需要长手套或双层手套。绝对避免喷溅到皮肤上，或呼吸到蒸汽]。在加入完成之前，沉淀出一些固体。在100-110℃的油浴温度下搅拌该反应混合物3小时，而后在室温下搅拌过夜。过滤固体，用丙酮洗涤若干次，在用丙酮洗涤的过程当中，偶而用无水乙醇洗涤。用含有少量乙醇的丙酮吸收浅棕色固体，并将该混合物在室温下搅拌5小时以上。过滤固体，并将该固体如上所述进行洗涤(对于较大规模的固体，建议再进行一次吸收和洗涤循环)。真空干燥之后，获得2.43 g(72.5%)淡褐色粉末固体产物与单氢溴酸盐。在高于250℃时分解。TLC，R _f 0.42(100%乙酸乙酯)。¹HNMR(DMSO-d₆ )δ2.82(s, 3H, 2-CH₃), 4.83(s, 2H, CH₂Br), 7.40-7.50(m, 1H), 8.80-8.90(m, 1H), 9.82-9.90(m, 1H)。

1-苯甲酰基-3-[4-(乙氧苯基)]硫脲(9)的合成

[参考文献：ARKIVOC 2003, 434-442; Bioorg. Med. Chem. 2000, 2663]。在室温下，将苯甲酰氯(6)(14.0 mL，16.95 g，120 mmol)逐滴加入到硫氰酸铵(10.26 g，135 mmol，1.125 eq)的100 mL丙酮的搅拌溶液中。沉淀出一些白色固体。将该反应混合物加热至回流，保持5分钟(油温度～65-70℃)。由此获得的苯甲酰基异硫氰酸酯(7)不用纯化就直接用于下一步。将4-乙氧基苯胺(8)(17.0 mL，18.1 g，132 mmol，1.1 eq)的25 mL丙酮溶液慢慢地加入到上述搅拌反应混合物中，同时仍然在油浴(65-70℃)中。考虑到放热反应，加入需要进行的非常慢，～1小时。沉淀出许多白色固体。用手摇晃该反应混合物，并进一步回流5分钟。将该冷却的反应混合物倒入冰水中。过滤固体，用水洗涤3次。将该固体用乙醇(～1.6 L)重结晶，提供目标产物浅黄色长针晶，产率36 g(99%)，m.p.：151.0-153.5℃。

(对乙氧苯基)硫脲(10)的合成

将氢氧化钠水溶液(1 M，60 mL，60 mmol，1.2 eq)加入到1-苯甲酰基-3-[4-(乙氧苯基)]硫脲(9)(16.5 g，55 mmol)的350 mL乙醇搅拌混合物中。将该反应混合物回流1小时，冷却，浓缩。用水(～200 mL)处理白色固体。过滤该固体，用水洗涤。将粗品晶体产物用乙醇重结晶，过滤，真空干燥，提供7.66 g(71.0%)目标产物10，m.p.：176.5-178.5℃。TLC, R _f 0.45(正己烷-乙酸乙酯：1:1)。¹HNMR(DMSO-d₆ )δ1.31(t, 3H, J=6.8Hz), 4.00(q, 2H, J=6.8Hz), 6.80-6.90(m, 2H), 7.15-7.25(m, 2H), 9.50(s, 1H, NH)。

2-(4-乙氧基苯基氨基)-4-(2-甲基-咪唑并[1,2-a]嘧啶-3-基)噻唑单氢溴酸盐(a)的合成(环化为噻唑环)

将2-溴-1-(2-甲基咪唑并[1,2-a]嘧啶-3-基)乙酮单氢溴酸盐(5)(2.43 g，7.25 mmol)和(对乙氧苯基)硫脲(10)(1.40 g，7.1 mmol)在140 mL无水乙醇中的混合物、在搅拌下回流15小时(油浴温度～105℃)。然后在室温下搅拌6小时或过夜。过滤固体，用丙酮洗涤。将粗品软晶体用丙酮-乙醇(3:1)吸收，并在室温下再搅拌6小时或过夜。过滤固体，并如上进行洗涤。将粗品用丙酮-乙醇(3:1)吸收，并在室温下再搅拌6小时。将粗品过滤，洗涤，并用甲醇重结晶。趁热过滤该甲醇溶液除去黑色粉末，而后加热变成溶液。过滤黄色晶体，并洗涤。将其用甲醇再重结晶两次，真空干燥，提供目标产物11长的、软的黄色针晶，产率1.55 g(50.5%)，在高于240℃时分解。TLC R _f 0.32(二氯甲烷-甲醇：20:1)；R _f 0.46(二氯甲烷-甲醇，20:1，含有1%氢氧化铵水溶液)；R _f 0.30(100%乙酸乙酯X2)。HPLC纯度：99%。¹HNMR(DMSO-d₆ )δ1.32(t, 3H, J=6.8Hz), 2.67(s, 3H), 4.00(q, 2H, J=6.8Hz), 6.90-6.95(m, 2H), 7.35(s, 1H), 7.49-7.52(m, 2H), 7.61-7.67(m, 1H), 8.94-8.97(m, 1H), 9.57(d, 1H, J=6.8Hz), 10.28(s, 1H, NH)。ESI-MS, m/z 352(M + 1)⁺。

实施例 B(2) ： 2-(4- 溴苯基 ) 氨基 -4-(6- 甲基咪唑并 [2,1-b] 噻唑 -5- 基 )- 噻唑单氢溴酸盐 (u) 的合成

化合物u的合成示于反应路线IV中：

反应路线IV

(对溴苯基)硫脲(14)的合成：

按照与化合物10的合成方法类似的方法，使用对溴苯胺代替对乙氧基苯胺。

1-(6-甲基咪唑并[2,1-b]噻唑-5-基)乙酮(17)的合成

将2-氨基噻唑用无水乙醇重结晶，过滤，干燥，而后使用。将2-氨基噻唑(16)(20.9 g，202.4 mmol)和3-氯-2,5-戊二酮(2)(33.7 g，97%，242.9 mmol，1.2 eq)的180 mL无水乙醇溶液在油浴中回流72小时。将该黑色反应混合物冷却，并减压浓缩。将残余物用几份饱和碳酸氢钠溶液处理，而后用二氯甲烷提取。干燥有机相，浓缩。用硅胶柱快速色谱纯化残余物，使用二氯甲烷-甲醇(80:1)。收集产物馏分(TLC，R _f 0.60中性形式；R _f =0.5盐形式，二氯甲烷-甲醇，40:1)，浓缩，提供白色固体产物17，产率11.7%，1.6 g中性形式和3.2 g盐形式。¹H NMR(CDCl₃)δ2.55(s, 3H, 5-COCH₃), 2.70(s, 3H, 6-CH₃), 6.78(d, 1H, J=4.8 Hz), 8.39(d, 1H, J=4.8 Hz)。

2-溴-1-(6-甲基咪唑并[2,1-b]噻唑-5-基)乙酮氢溴酸盐(18)的合成

将1-(6-甲基咪唑并[2,1-b]噻唑-5-基)乙酮(17)(0.54 g，3.0 mmol)溶于7 mL冰醋酸中。用30分钟将溴(0.18 mL，0.56 g，3.5 mmol)的3 mL冰醋酸溶液慢慢地加入到上述搅拌溶液中。出现一些黄色固体。将该混合物加热至回流，搅拌3小时，而后在室温下搅拌过夜。过滤固体，用丙酮洗涤三次，每次洗涤需要搅拌3-5小时。过滤固体，真空干燥，提供0.73 g(71.6%)白色固体目标产物18。

2-(4-溴苯基)氨基-4-(6-甲基咪唑并[2,1-b]噻唑-5-基)-噻唑单氢溴酸盐(u)的合成

将2-溴-1-(6-甲基咪唑并[2,1-b]噻唑-5-基)乙酮氢溴酸盐(18)(0.73 g，2.0 mmol)和(对溴苯基)硫脲(14)(0.50 g，2.0 mmol)在10 mL无水乙醇中的混合物、在搅拌下回流20小时，而后冷却至室温。过滤固体。将粗品白色固体产物用甲醇重结晶。趁热过滤该甲醇溶液，除去潜在的粉末，而后加热为溶液。将其用甲醇再重结晶两次，真空干燥，提供目标产物u白色固体，产率0.34 g(36%)，HPLC纯度98.49%，mp>250℃。¹HNMR(CD₃OD)δ2.68(s, 3H), 7.45(s, 1H), 7.18(s, 1H), 7.18-7.47(m, 2H), 7.54-7.66(m, 2H), 7.66(d, 1H, J=4.4Hz), 8.94(d, 1H, J=4.4Hz)。

实施例 B(3) ： 2-(4- 乙基苯基 ) 氨基 -4-(6- 甲基咪唑并 [2,1-b] 噻唑 -5- 基 )- 噻唑单氢溴酸盐 (o) 的合成

化合物(o)的合成示于反应路线IV中。

(对溴苯基)硫脲(21)的合成：

按照与化合物10的合成方法类似的方法，使用对乙基苯胺代替对乙氧基苯胺。

2-(4-乙基苯基)氨基-4-(6-甲基咪唑并[2,1-b]噻唑-5-基)-噻唑单氢溴酸盐(o)的合成

将2-溴-1-(6-甲基咪唑并[2,1-b]噻唑-5-基)乙酮氢溴酸盐(18)(20 g，91%，53.5 mmol)和(对乙基苯基)硫脲(10)(10.1 g，56.2 mmol)在40 mL无水乙醇中的混合物回流搅拌3小时，而后冷却至室温。过滤固体，用乙醇洗涤。将粗品白色固体产物用甲醇重结晶。趁热过滤该甲醇溶液，除去可能的粉末，而后加热变成溶液。将其用甲醇再一次重结晶，真空干燥，提供目标产物o白色固体。将该HBr盐转变为游离碱，而后转变为HCl盐，将其用50%乙醇/水重结晶，得到类白色晶体产物(14.8 g，73.4%)。HPLC纯度99%，mp=181-183℃。¹HNMR(CD₃OD)δ1.11(t, 3H, J=7.6 Hz), 2.52(s, 3H), 2.58(m, 2H), 7.11(d, 2H, J=8Hz), 7.22(s, 1H), 7.52(d, 2H, J=8.4Hz), 7.75(d, 1H, J=4.4Hz), 8.42(d, 1H, J=4.4Hz)。ESI-MS m/z 341.5(M + 1)⁺。

由式I或II的化合物(HBr盐)制备游离碱化合物

将HBr盐悬浮在甲醇中，并在强烈搅拌下加入过量的碳酸氢钠，直到悬浮的化合物盐完全溶解为止。滤出过量的无机盐。浓缩该溶液，并将残余物用甲醇或乙醇或乙醇/水或任何其它有机溶剂或溶剂的混合物重结晶，提供游离碱化合物的结晶物质。

各种盐的制备

获得的游离碱化合物和1.1当量的选择的酸。浓缩该溶液，并将残余物用甲醇或乙醇或乙醇/水或任何其它有机溶剂或溶剂的混合物重结晶，提供含有所选择的上述阴离子的目标盐的结晶物质/多晶型物。

本发明包括所描述化合物的游离碱或盐的所有可能的晶体形式/多晶型物。

B.3. 其它活性剂

在本发明的方法和组合物中，本文的化合物可以与其它药理学活性化合物(“其它活性剂”)联用。人们相信，在治疗具体类型的癌症和与不希望有的血管生成相关或以其为特征的某些疾病和病症的过程中，某些联用可以协同起作用。免疫调节化合物还可以减轻与某些第二种活性剂相关的副作用，并且一些第二种活性剂可用于减轻与免疫调节化合物相关的副作用。

一或多种活性组分或活性剂可以在本发明的方法和组合物中一起使用。其它活性剂可以是大分子(例如，蛋白)或小分子(例如，合成的无机、有机金属或有机分子)。

大分子活性剂的例子包括但不局限于：造血生长因子，细胞因子和单克隆和多克隆抗体。典型的大分子活性剂是生物分子，例如，天然存在的或人工制备的蛋白。尤其用于本发明的蛋白包括：体外或体内刺激造血前体细胞和免疫活性造血细胞的存活和/或增殖的蛋白。其它的蛋白体外或体内刺激细胞中红系祖细胞的分裂和分化。具体蛋白包括但不局限于：白介素，例如IL-2(包括重组体IL-II(“rIL2”)和金丝雀痘IL-2)，IL-10，IL-12和IL-18；干扰素，例如干扰素alfa-2a，干扰素alfa-2b，干扰素alfa-n1，干扰素alfa-n3，干扰素β-I a和干扰素γ-Ib；GM-CF和 GM-CSF；和EPO。

可以在本发明的方法和组合物中使用的具体蛋白包括但不局限于：非格司亭，其在美国以商标名Neupogen.RTM.销售(Amgen，Thousand Oaks，Calif.)；沙格司亭，其在美国以商标名Leukine.RTM销售(Immunex，Seattle，Wash.)；和重组体EPO，其在美国以商标名Epogen.RTM.销售(Amgen，Thousand Oaks，Calif.)。

GM-CSF的重组体和突变形式可以按照美国专利US 5,391,485、5,393,870和5,229,496中描述的方法制备，本文以引证的方式将它们结合。G-CSF的重组体和突变形式可以按照美国专利US 4,810,643、4,999,291、5,528,823和5,580,755中描述的方法制备，本文以引证的方式将它们全结合。

本发明包括使用未加修饰的、天然存在的和重组体蛋白。本发明进一步包括天然存在蛋白的突变体和衍生物(例如，修饰形式)，它们体内显示蛋白的至少一些药理学活性，所述蛋白基于这些活性。突变体的例子包括但不局限于：具有一个或多个氨基酸残基的蛋白，这种氨基酸残基不同于天然存在的蛋白形式中的相应的残基。术语“突变体”还包括缺少碳水化合物部分的蛋白，这种碳水化合物部分普通存在于它们的天然存在形式(例如，非糖基化形式)中。衍生物的例子包括但不局限于：PEG化的衍生物和融合蛋白，例如，由IgG1或IgG3与使人感兴趣的蛋白或蛋白的活性部分融合（fusing）形成的蛋白。参见，例如，Penichet, M. L.和Morrison, S. L., J. Immunol. Methods 248:91-101(2001)。

可以与本发明的化合物联合使用的抗体包括单克隆和多克隆抗体。抗体的例子包括但不局限于：曲妥珠单抗(Herceptin.RTM.)，美罗华(Rituxan.RTM.)，贝伐单抗(Avastin.TM.)，帕妥珠单抗(Pertuzumab)(Omnitarg.TM.)，托西莫单抗(tositumomab)(Bexxar.RTM.)，依决洛单抗(Panorex.RTM.)和G250。本发明的化合物还可以与抗TNF-.alpha.抗体结合或与其联合使用。

大分子活性剂可以以抗癌症疫苗形式给予。例如，分泌细胞因子(例如IL-2，G-CSF和GM-CSF)或产生细胞因子的分泌物的疫苗可以用于本发明的方法、药物组合物和试剂盒。参见，例如，Emens, L. A.,等人，Curr. Opinion Mol. Ther. 3(1):77-84(2001)。

在本发明的一个实施方案中，大分子活性剂降低、消除或预防与给予免疫调节化合物相关的副作用。根据具体的免疫调节化合物和所开始治疗的疾病或病症，副作用可以包括但不局限于：昏睡和嗜眠，眩晕和立位性低血压，中性白细胞减少，起因于中性白细胞减少的感染，HIV-病毒荷载提高，心动过缓，多形糜烂性红斑和中毒性表皮坏死溶解和癫痫发作(例如，大发作性惊厥)。具体的副作用是中性白细胞减少。

小分子的其它活性剂也可以用于减轻与给予免疫调节化合物相关的副作用。小分子活性剂的例子包括但不局限于：抗癌剂，抗生素，免疫抑制剂和甾体。

抗癌剂的例子包括但不局限于：阿西维辛；阿柔比星；阿考达唑盐酸盐；阿克罗宁；阿多来新；阿地白介素；六甲蜜胺；安波霉素；阿美蒽醌醋酸根；安吖啶；阿那曲唑；安曲霉素；门冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴马司他；苯佐替派；比卡鲁胺；盐酸比生群；甲磺酸双奈法德(bisnafide dimesylate)；比折来新；博来霉素硫酸根；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；西乐葆(COX-2抑制剂)；苯丁酸氮芥；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克雷斯托(crisnatol)；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素；柔红霉素盐酸盐；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；地扎胍宁甲磺酸盐；地吖醌；多西他赛；多柔比星；盐酸多柔比星；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸屈他雄酮；达佐霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；依托泊苷磷酸盐；艾托卜宁(etoprine)；盐酸法屈唑；法扎拉滨；芬维A胺(fenretinide)；氮尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；fluorocitabine；磷喹酮；磷曲星钠；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；异丙铂；依立替康；盐酸依立替康；乙酸兰瑞肽；来曲唑；乙酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠；环己亚硝脲；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸二氯甲二乙胺；醋酸甲地孕酮；十六次甲基甲地孕酮；米尔法兰；美诺立尔；巯基嘌呤；氨甲喋呤；氨甲喋呤钠；氯苯氨啶(metoprine)；美乌替派；米丁度胺；米托卡星(mitocarcin)；丝裂红素；丝林霉素；丝裂马菌素；丝裂霉素；米托司培；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；噻氨酯达唑；诺加霉素；奥马铂；亚磺酰吡啶；太平洋紫杉醇；培加帕酶；佩里霉素；戊氮芥；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；双溴丙基哌嗪；保释芬；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟吩姆钠；波福霉素；松龙苯芥；盐酸甲基苄肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；沙芬戈；盐酸沙芬戈；赛氮芥；二甲二苯四氮烯；磷乙酰天冬氨酸(sparfosate)钠；稀疏霉素；盐酸锗螺胺；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲霉素；磺氯苯脲；他利霉素；替可加兰(tecogalan)钠；泰索帝(taxotere)；替加氟；盐酸替洛蒽醌；替莫卟吩；表鬼臼毒噻吩糖苷；替罗昔隆；睾内酯；硫咪嘌呤；硫鸟嘌呤；硫替派；噻唑呋啉；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬；乙酸曲托龙；磷酸曲西立滨；三甲曲沙；葡糖醛酸三甲曲沙；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；尿嘧啶氮芥；尿烷亚胺；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春碱；硫酸长春花新碱；去乙酰长春酰胺；硫酸去乙酰长春酰胺；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗辛；酒石酸长春瑞宾；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏氯唑；僧尼铂；新制癌菌素；和盐酸左柔比星。

其它抗癌药品包括但不局限于：20-epi-1,25二羟基维生素D3；5-乙炔尿嘧啶(ethynyluracil)；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇(adecypenol)；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；amidox；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；antarelix；抗背侧形态发生蛋白-1；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素药；抗瘤酮(antineoplaston)；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；细胞程序死亡基因调节剂；细胞程序死亡调节剂；无嘌呤酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎司琼；阿扎毒素(azatoxin)；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；benzochlorins；苯甲酰星孢菌素(benzoylstaurosporine)；β内酰胺衍生物；β-alethine；betaclamycin B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；比生群；bisaziridinylspermine；双奈法德；bistratene A；比折来新；breflate；溴匹立明；布度钛；丁硫氨酸(buthionine)磺基肟；卡泊三醇；calphostin C；喜树碱衍生物；卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧基氨基咪唑(carboxyamidotriazole)；CaRest M3；CARN 700；软骨衍生的抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗树精胺；天蚕抗菌肽b；西曲瑞克；克洛林；氯喹噁啉磺酰胺；西卡前列素；顺式-卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；康普瑞汀A4；康普瑞汀类似物；conagenin；crambescidin 816；克雷斯托(crisnatol)；自念珠藻环肽8；自念珠藻环肽A衍生物；curacin A；cyclopentanthraquinones；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷十八烷基磷酸钠；溶细胞因子；cytostatin；达昔单抗；地西他滨；脱氢膜海鞘素B；地洛瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；膜海鞘素B；didox；diethylnorspermine；二氢-5-氮胞苷；二氢紫杉酚，9-；dioxamycin；二苯基螺莫司汀；多西他赛；二十二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；多柔比星；屈洛昔芬；屈大麻酚；duocarmycin SA；依布硒；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；依立雄胺；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；依托泊苷磷酸盐；依西美坦；法屈唑；法扎拉滨；芬维A胺(fenretinide)；非格司亭；非那雄胺；夫拉平度(flavopiridol)；氟卓斯汀(flezelastine)；fluasterone；氟达拉滨；fluorodaunorunicin盐酸盐；福酚美克；福美坦；磷曲星；福莫司汀；钆德卟啉；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；heregulin；六亚甲基二乙酰胺；金丝桃素；依班膦酸；伊达比星；艾多昔芬；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；伊马替尼(例如，Gleevec.RTM.)，咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白介素；硫酸碘苄胍；碘阿霉素；蕃薯宁，4-；伊罗普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrin B；伊他司琼；jasplakinolide；kahalalide F；层状素-N三乙酸盐；兰瑞肽；leinamycin；来格司亭；硫酸蘑菇多糖；leptolstatin；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+黄体酮；亮丙瑞林；左旋四咪唑；利阿唑；直链多胺类似物；亲脂性的二糖肽；亲脂性的铂化合物；噻唑啉海洋.环肽7；乐铂；蚯吲磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛索立宾；勒托替康；镥德卟啉；lysofylline；裂解肽；美坦辛；制甘糖酶素(mannostatin)A；马立马司他(marimastat)；马索罗酚；乳腺丝抑蛋白(maspin)；基质溶素抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；麦尔巴隆；美替瑞林(meterelin)；蛋氨酶(methioninase)；灭吐灵；MIF抑制剂；美服培酮；米特福辛；米立司亭；丙脒腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；mitotoxin成纤维细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；爱必妥(Erbitux)，人绒毛膜促性腺激素；单磷酰脂质A+myobacterium细胞壁sk；莫哌达醇；芥子抗癌剂；mycaperoxide B；分支杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；nagrestip；纳洛酮+镇痛新；napavin；萘萜二醇(naphterpin)；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；尼鲁米特；nisamycin；一氧化氮调节剂；硝基氧抗氧化剂；nitrullyn；奥利默森(oblimersen)(Genasense.RTM.)；O.sup.6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮(onapristone)；昂丹司琼；昂丹司琼；oracin；口服细胞因子诱导剂；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；oxaunomycin；太平洋紫杉醇；太平洋紫杉醇类似物；太平洋紫杉醇衍生物；palauamine；palmitoylrhizoxin；帕米膦酸；人参炔三醇；帕诺米芬；parabactin；帕折普汀；培加帕酶；培地辛(peldesine)；戍聚糖多硫酸钠；喷司他丁；pentrozole；全氟溴烷(perflubron)；培磷酰胺；紫苏子醇；phenazinomycin；苯乙酸盐；磷酸酶抑制剂；溶链菌制剂(picibanil)；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A；placetin B；纤溶酶原激活物抑制剂；铂复合物；铂化合物；铂-三胺复合物；卟吩姆钠；波福霉素；脱氢可的松；丙基二-吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；A蛋白基免疫调节剂；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，微藻(microalgal)；蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；紫红素；吡唑并吖啶；吡哆酸化的(pyridoxylated)血色素聚氧乙烯共轭物；raf拮抗剂；雷替曲塞(raltitrexed)；雷莫司琼；ras法呢基蛋白转移酶抑制剂；ras抑制剂；ras抑制剂；脱甲基雷替尼卜定(retelliptine)；Re 186依替膦酸铼；利索新；核糖酶；RII维甲胺；罗希吐碱(rohitukine)；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；sarcnu；sarcophytol A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；赛氮芥；senescence衍生的抑制剂1；寡意核苷酸；信号转导抑制剂；西佐喃；索布佐生；硼［10B］卡钠；苯基乙酸钠；solverol；促生长因子结合蛋白；索纳明；斯帕福斯酸；穗霉素(spicamycin)D；螺莫司汀；splenopentin；spongistatin 1；角鲨胺(squalamine)；stipiamide；溶基质素抑制剂；sulfinosine；超活性血管活性肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明；苦马豆素；他莫司汀；三苯氧胺甲碘化物；牛磺莫司汀；维生素A酸(tazarotene)；替可加兰(tecogalan)钠；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫卟吩；表鬼臼毒噻吩糖苷；四氯十氧化物(tetrachlorodecaoxide)；tetrazomine；thaliblastine；噻可拉林(thiocoraline)；促血小板生成素；促血小板生成素模拟物；胸腺法新(thymalfasin)；胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；促甲状腺激素；乙基初卟啉锡；替拉扎明；二氯二茂钛；topsentin；枸橼酸托瑞米芬；转译抑制剂；维甲酸；三乙酰尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲(turosteride)；酪氨酸激酶抑制剂；tyrphostins；UBC抑制剂；乌苯美司；泌尿生殖窦-衍生的生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；维拉雷琐；veramine；韦尔丹；维替泊芬；长春瑞宾；vinxaltine；vitaxin；伏氯唑；扎诺特隆；僧尼铂；亚苄维(zilascorb)；和净司他丁斯酯。

具体其它的活性剂包括但不局限于：奥利默森(oblimersen)(Genasense.RTM.)，英夫利昔单抗(remicade)，多西他赛，西乐葆，米尔法兰，地塞米松(Decadron.RTM.)，甾体，吉西他滨，cisplatinum，替莫唑胺，依托泊苷，环磷酰胺，temodar，卡铂，普鲁苄肼，卡莫斯汀，三苯氧胺，托泊替康，氨甲喋呤，Arisa.RTM.，紫杉酚，泰索帝(taxotere)，氟尿嘧啶，亚叶酸，依立替康，希罗达(xeloda)，CPT-11，干扰素α，PEG化的干扰素α(例如，PEG INTRON-A)，卡培他滨，顺铂，硫替派，氟达拉滨，卡铂，脂质体柔红霉素，阿糖胞苷，doxetaxol，pacilitaxel，长春花碱，IL-2， GM-CSF，达卡巴嗪，长春瑞宾，唑来膦酸，palmitronate，biaxin，白消安，脱氢可的松，二膦酸盐，三氧化二砷，长春花新碱，多柔比星(Doxil.RTM.)，太平洋紫杉醇，更昔洛韦，多柔比星，雌莫司汀磷酸钠(Emcyt.RTM.)，舒林酸和依托泊苷。

B.4. 制剂

可以制备本文所描述化合物的任何合适的制剂。如果化合物是可形成稳定的无毒酸或碱盐的充分碱性或酸性化合物，则可以给予该化合物的盐。可药用盐的例子是与酸(能够提供生理学可接受的阴离子)形成的有机酸加成盐，例如，甲苯磺酸盐，甲磺酸盐，乙酸盐，柠檬酸盐，丙二酸盐，酒石酸盐，琥珀酸盐，苯甲酸盐，抗坏血酸盐，α-酮戊二酸盐和α-甘油磷酸盐。也可以形成合适的无机盐，包括盐酸盐，硫酸盐，硝酸盐，碳酸氢盐和碳酸盐。使用本领域众所周知的标准方法获得可药用盐，例如，使充分碱性的化合物(例如胺)与合适的酸接触，得到生理学可接受的盐。还包括羧酸的碱金属(例如，钠、钾或锂)或碱土金属(例如，钙)盐，并且利用常规方法制备。

本发明还包括药物组合物，其含有至少一种本发明化合物以及混合至少一种可药用赋形剂。优选，至少一种这种赋形剂是非水或C1-C3醇或二甲亚砜的赋形剂，。

可以用常规途径给予本发明的化合物，包括口服、局部、透皮或吸入或注射。本领域技术人员可以参考已知的方法来配制本发明的化合物，并可以按照预定给药途径来设计制剂。配制有机化合物的合适方法描述在例如Remington's Pharmaceutical Sciences，18th ed.(1990)中，本文以引证的方式将其结合。

如果以药理学组合物形式给予这些化合物，则可以将该化合物与可药用载体一起配制在混合物中。例如，所涉及的化合物可以以药理学可接受的盐口服给予或以生理盐溶液形式静脉内给予。为此目的，可以使用常规缓冲剂，例如磷酸盐、碳酸氢盐或柠檬酸盐。当然，在该说明书的教导范围之内，本领域普通技术人员可以改进该制剂，以便为具体给药途径提供许多的制剂。尤其是，可以改变所涉及的化合物，使它们更易溶于水或其它赋形剂中，例如，这利用本领域普通技术人员所熟知的微小改变(盐制剂，酯化，等等)就容易实现。还在本领域普通技术人员知识范围之内的是，改变具体化合物的给药途径和给药方案，以便控制本发明化合物的药物动力学，在患者中获得最大有利效果。

本文所描述的式I或II化合物通常可溶于有机溶剂中，例如，氯仿，二氯甲烷，乙酸乙酯，乙醇，甲醇，异丙醇，乙腈，丙三醇，N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基乙酰胺，二甲亚砜，等等。在一个实施方案中，本发明提供了通过式I-II化合物与可药用载体混合所制备的制剂。在一方面，制剂可以使用包括下列的方法来制备：a)将所描述的化合物溶解在水溶性的有机溶剂、非离子溶剂、水溶性脂质、环糊精、维生素(例如生育酚)、脂肪酸、脂肪酸酯、磷脂或其组合物中，提供溶液剂；和b)加入盐水或含有1-10%碳水化合物溶液的缓冲剂。在一个实施例中，碳水化合物包括葡萄糖。使用本发明方法获得的药物组合物是可用于动物和临床应用的稳定的药物组合物。

用于本发明方法的水溶性的有机溶剂的说明性例子包括并且不局限于：聚乙二醇(PEG)，醇，乙腈，N-甲基-2-吡咯烷酮，N,N-二甲基甲酰胺，N,N-二甲基乙酰胺，二甲亚砜，或其组合物。合适的醇的例子包括但不局限于：甲醇，乙醇，异丙醇，丙三醇或丙二醇。

用于本发明方法的水溶性非离子型表面活性剂的说明性例子包括并且不局限于：CREMOPHOR^® EL，聚乙二醇改性的CREMOPHOR^®(聚氧乙烯甘油三蓖麻醇酸酯35)，氢化CREMOPHOR^® RH40，氢化CREMOPHOR^® RH60，PEG-琥珀酸酯，聚山梨酸酯20，聚山梨酸酯80，SOLUTOL^® HS(聚乙二醇660 12-羟基硬脂酸酯)，单油酸山梨醇酐酯，泊洛沙姆，LABRAFIL^®(乙氧基化杏仁油)，LABRASOL^®(辛酰基-己酰基-聚乙二醇-8-甘油酯)，GELUCIRE^®(甘油酯)，SOFTIGEN^® (PEG 6辛酸甘油酯)，丙三醇，二醇-聚山梨酸酯，或其组合物。

用于本发明方法的水溶性脂质的说明性例子包括但不局限于：植物油（蔬菜油，vegetable oils）,甘油三酯，植物油(plant oils)或其组合物。脂质油的例子包括但不局限于：蓖麻油，聚烃氧基蓖麻油，玉米油，橄榄油，棉子油，花生油，薄荷油，红花油，芝麻油，大豆油，氢化植物油，氢化大豆油，椰子油的甘油三酯，棕榈种子油和其氢化形式，或其组合物。

用于本发明方法的脂肪酸和脂肪酸酯的说明性例子包括但不局限于：油酸，甘油一酯，甘油二酯，PEG的单或二脂肪酸酯，或其组合物。

用于本发明方法的环糊精的说明性例子包括但不局限于：α-环糊精，β-环糊精，羟基丙基-β-环糊精，或磺丁基醚-β-环糊精。

用于本发明方法的磷脂的说明性例子包括但不局限于：大豆卵磷脂，或二硬脂酰磷脂酰甘油和其氢化形式，或其组合物。

在该说明书的教导范围之内，本领域普通技术人员可以改进该制剂，以便为具体给药途径提供许多的制剂。尤其是，可以修饰该化合物，使得它们更易溶于水或其它载体。还在本领域普通技术人员知识范围之内的是，改变具体化合物的给药途径和给药方案，以便控制本发明化合物的药物动力学，在患者中获得最大有利效果。

B.5. 药物组合物

本发明还具有提供用于本发明的新治疗方法的合适的局部、口服、系统和肠胃外药用制剂的目的。含有本发明化合物作为活性组分的组合物可以用各种各样的治疗剂型(在赋形剂中)给予，用于口服、系统或靶向位点给药。

本发明还提供了包含一或多种本发明化合物以及可药用载体的药物组合物。优选，这些组合物在单位剂型中，例如片剂，丸剂，胶囊剂，粉剂，颗粒剂，混悬剂，凝胶剂，软凝胶，无菌的肠胃外溶液剂，乳剂，气雾剂，液体喷雾剂，滴剂，安瓿，自动喷射器或栓剂；用于口服、肠胃外、鼻内、舌下或直肠给药，或通过吸入或隔离材料（insulation）给药。

为了制备固体组合物，例如片剂或胶囊剂，将主要活性组分与药用载体(例如，常规制片组分，例如玉米淀粉，乳糖，蔗糖，山梨糖醇，滑石粉，硬脂酸，硬脂酸镁，磷酸氢钙或树胶)及其它药用稀释剂(例如水)混合，形成含有本发明化合物或其可药用盐的均相混合物的固体组合物。此外，主要活性组分可以与一或多种药用载体混合，提供具有提高的生物利用率或其它药物动力学性能的剂型。这种系统的例子包括但不局限于：喷雾干燥分散体固体剂型，其含有组分，例如羟丙基甲基纤维素(HPMC)羟丙甲纤维素乙酸琥珀酸酯(HPMCAS)；纳米颗粒制剂，其含有组分，例如低粘度羟丙基纤维素(HPC-SL)，多库酯钠，普流罗尼类（pluronics），卵磷脂，磷脂酰胆碱和胆固醇； 脂质基制剂，其含有组分，例如卵磷脂，聚乙烯吡咯烷酮，磷脂酰胆碱和胆固醇；环糊精制剂，其含有组分，例如磺丁基醚-β-环糊精(SBECD)和2-羟基丙基-β-环糊精(HPCD)。当提到这些组合物的均质形式时，是指活性组分均匀地分散在整个组合物中，使得可以将该组合物容易地再分成同等有效单位剂型，例如片剂、丸剂和胶囊剂和脂质基制剂。

可以将新组合物的片剂或丸剂包衣或另外复方，提供具有延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含内剂量和外剂量组分，后者是包覆于前者的包膜形式。肠道层可以分离两个组分。肠道层用来阻碍在胃中的分解，并且使内组分完整通过进入到十二指肠中，或被延迟释放。各种材料可以用于这种肠道层或包衣，这种材料包括许多聚合酸和聚合酸与例如片胶、乙酰基醇和醋酸纤维素的混合物。

结合本发明的新组合物用于口服或注射给药的液体形式包括：水溶液，合适调味的糖浆剂，水或油混悬剂，含有食用油(例如棉子油，芝麻油，椰子油或花生油)的乳剂，含有表面活性剂或共溶剂(例如聚山梨酸酯80，生育酚聚丁二酸乙二醇酯(TPGS)，Cremophor，capmul MCM，聚乙二醇)的微乳剂或自乳化系统；含有组分例如卵磷脂、胆固醇、磷脂酰胆碱、HPC-SL、多库酯钠的脂质体或纳米颗粒制剂；含有增加溶解性的组分例如SBECD、HPCD的环糊精复合物制剂。用于水悬剂的合适的分散或悬浮剂包括：合成和天然树胶，例如葡聚糖，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，聚乙烯吡咯烷酮或凝胶。

本发明的化合物可以在任何上述组合物中给予，并且按照在效果研究中有效的给药方案来给予。

可以单独使用通过常规测试确定的合适剂量的本发明的化合物，以便获得最佳抗癌效果。另外，共同给予或顺序给予其它肿瘤药剂是合乎需要的。

C. 使用新化合物和药物组合物的方法

C.1. 使用新化合物的方法

在治疗癌症或其它类型的增殖疾病过程中，本发明的化合物可以用作细胞毒性和/或细胞生长抑制剂。这些化合物可以通过任何类型的作用机理起作用。例如，该化合物可以抑制分子和/或信号转导途径，导致细胞周期在G2/M期的延滞，这可能最终引起肿瘤细胞的细胞程序死亡(参见，例如，Weung等人(1997)Biochim. Biophys. Res. Comm., vol: 263, pp 398-404)。在另一个实施例中，该化合物可以妨碍微管蛋白组装/分解，这可以抑制细胞有丝分裂，并引起细胞程序死亡(参见，例如，Panda等人，(1997)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol: 94, 10560-10564)。该化合物还可以抑制内皮细胞增殖和血管生成效果(参见，例如，Witte等人，1998, Cancer Metastasis Rev. vol. 17: 155-161)。本发明的化合物对各种癌细胞系显示了活性。

在另一个方面，本发明涉及哺乳动物的所有组织或器官的癌症的治疗方法，包括但不局限于：肉瘤，表皮癌症，纤维肉瘤，子宫颈癌，白血病，淋巴瘤，肺癌，非小细胞肺癌，结肠癌，CNS癌症，黑素瘤，卵巢癌，肾癌，前列腺癌，乳腺癌，头颈癌，胰腺癌及其它类型的增殖疾病，该方法包括：在至少一种治疗中，给予需要这种治疗的所述患者治疗有效量的、作为细胞毒性和/或细胞生长抑制剂的式I-II化合物。

在又一个方面，本发明涉及制备药物制剂的方法，这种药物制剂用于治疗所有组织或器官的癌症，包括但不局限于：白血病，淋巴瘤，肺癌，结肠癌，CNS癌，黑素瘤，卵巢癌，肾癌，前列腺癌或乳腺癌，及其它类型的增殖疾病，该方法包括：将治疗有效量的式I-II化合物与可药用载体混合。

为了实践本发明的方法，可以口服、胃肠外、吸入喷雾剂、局部、直肠、鼻部、口腔内、阴道、植入储器或其它药品给药方法给予式I-II化合物和其药物组合物。本文使用的术语“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌内、关节内、动脉内注射、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输液技术。在一些实施方案中，通过注射(即，胃肠外)递送本发明的化合物。在一些实施方案中，优选的给药途径是静脉内或腹膜内注射给药。

无菌注射组合物(例如，无菌注射水或油悬浮液)可以按照本领域已知技术、使用合适分散或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌注射制剂也可以是无菌注射溶液或悬浮液(在无毒的、胃肠外可接受的稀释剂或溶剂中)。在可药用赋形剂和溶剂之中，可以使用的赋形剂和溶剂包括甘露醇、水、林格溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质(例如，合成的单或甘油二酯)。脂肪酸，例如油酸和它的甘油酯衍生物可有效用于制备注射剂，因为它们是可药用油，例如橄榄油或蓖麻油，特别是它们的聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液还可以含有长链醇稀释剂或分散剂，或羧甲基纤维素或类似的分散剂。通常用于制备可药用固体、液体或其它剂型的各种乳化剂或生物利用率增强剂也可以用于制剂的目的。

口服给药组合物可以是任何口服可接受的剂型，包括但不限于：片剂，胶囊剂，乳剂和水悬剂，分散剂和溶液剂。在口服使用片剂的情况下，通常使用的载体包括乳糖和玉米淀粉。还可以加入例如硬脂酸镁。对于胶囊剂形式的口服给药，使用的稀释剂包括乳糖和干燥的玉米淀粉。当口服给予水悬剂或乳剂时，可以将活性组分在与乳化剂或悬浮剂结合的油相中悬浮或溶解。如果需要的话，可以加入某些甜味剂、调味剂或着色剂。鼻用气雾剂或吸入剂组合物可以按照药物配制领域众所周知的技术来制备，并且可以制备为溶液，例如盐水溶液，使用合适的防腐剂(例如，苄醇)、吸收促进剂(提高生物利用率)和/或本领域已知的其它增溶或分散剂。

可以通过本领域已知的常规实验来测定本发明化合物的有效量。典型地包括：给予显示被较好耐受的数量，逐渐提高剂量，直到获得目标效果为止，例如，减少症状，降低肿瘤大小，或终止肿瘤生长。在一些实施方案中，使用大约5-10 mg/kg的起始剂量，并且按增量提高剂量，每周提高一次，每次提高大约50%，直到观察到目标效果或耐受性出现问题为止。在一些实施方案中，合适的剂量在大约5和250 mg/kg之间；或在大约10和150 mg/kg之间。有时优选10和100 mg/kg之间的剂量。可以给药一次、每周给药一次、每天给药一次或每天给药一次以上。在一些实施方案中，每天给需要治疗的患者递送1-4个剂量。

另外，可以单独给予式I-II化合物，或与治疗各种癌症或病症的其它抗癌剂联合给予。按照本发明的联合治疗包括：给予至少一种本发明的化合物或其功能化衍生物和至少一种其它药学活性组分。活性组分和药学活性剂可以单独或一起给予。为了获得目标联合治疗效果，可以选择活性组分和药学活性剂的数量和给药的相对时间。

在又一个方面，本发明涉及用式I-II化合物治疗对患有冠状动脉疾病的患者的进行冠状动脉支架之后的再狭窄的方法。

患有冠状动脉病患者的冠状动脉支架后的再狭窄的主要原因是新内膜增生，其起因于平滑肌细胞的增殖和迁移和胞外基质产生(参见，例如， “Pathology of acute and chronic coronary stenting in humans”, by Farb, A., Sangiorgi, G., Certer, A.J.,等人，in Circulation, vol. 99, pp 44-52, 1999)。当用合适的方法递送具有抗增殖能力的化合物时，这种化合物可以具有降低临床上和血管造影再狭窄的危险的效果(参见，例如， “A polymer-based, paclitaxel-eluting stent in patients with coronary artery disease”, by Stone, G.W., Ellis, S.G., Cox, D.A,等人，in New England Journal of Medicine, vol. 350: pp 221-231, 2004)。由此，在治疗肿瘤过程中，式I-IX化合物还可以用于抑制涉及到新内膜增生的细胞的增殖，并由此降低新内膜增生和再狭窄的发生率。可以使用各种方法给这些细胞有效递送该化合物。例如，可以口服、胃肠外或通过植入的储器给予包含上述式I-X化合物的组合物。在其它实施例中，还可以使用下面文章中所描述的方法： “A polymer-based, paclitaxel-eluting stent in patients with coronary artery disease”, by Stone, G.W., Ellis, S.G., Cox, D.A.等人，in New England Journal of Medicine, vol. 350: pp 221-231, 2004; “A randomized comparison of a sirolimus-eluting stent with a standard stent for coronary revascularization”, by Morice, M.-C., Serruys, P.W., Sousa, J.E.,等人，in New England Journal of Medicine, vol. 346: pp 1773-1780, 2002; “Sirolimus-eluting stents versus standard stents in patients with stenosis in a native coronary artery”, by Moses, J.W., Leon, M.B., Popma, J.J.,等人，in New England Journal of Medicine, vol. 349: pp 1315-1323, 2003。

治疗和预防方法

本发明的方法包括治疗、预防和/或控制各种型式癌症的方法。除非另作说明，否则，本文使用的术语“治疗”是指给予本发明的化合物或其它额外的活性剂。除非另作说明，否则，本文使用的术语“预防”是指在症状开始之前尤其对处于癌症危险之中的患者给药。术语“预防”包括抑制具体疾病或病症的症状。具有癌症家族史的患者是预防方案的优选候选者。除非另有陈述，否则，本文使用的术语“控制”包括预防患有具体癌症的患者的具体癌症复发，和/或延长患有癌症患者保持症状缓解的时间。

本文使用的术语“癌症”包括但不局限于：实质固态瘤和血液携带的肿瘤。术语“癌症”是指皮组织、器官、血液和血管的疾病，包括但不限于：膀胱癌，骨或血癌，脑癌，乳房癌，宫颈癌，胸癌，结肠癌，子宫内膜癌，食道癌，眼癌，头癌，肾癌，肝癌，淋巴结癌，肺癌，口腔癌，颈癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，直肠癌，胃癌，睾丸癌，喉癌和子宫癌。具体癌症包括但不局限于：晚期恶性肿瘤，淀粉样变性，神经母细胞瘤，脑膜瘤，血管外皮细胞瘤，多发性脑转移，恶性胶质瘤多态，恶性胶质瘤，脑干胶质瘤，预后差恶性脑肿瘤，恶性胶质瘤，复发性的恶性胶质瘤，退行性星形细胞瘤，退行性寡枝神经胶质细胞瘤，神经内分泌的肿瘤，直肠腺癌，Dukes C & D结肠直肠癌，不可切除的结肠直肠癌，转移性的肝细胞癌，皮肤多发性出血性肉瘤，染色体组型急性髓母细胞性白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，皮肤B细胞淋巴瘤，扩散性大B细胞淋巴瘤，低级滤泡性淋巴瘤，恶性黑色素瘤，恶性间皮瘤，恶性胸膜积液间皮瘤综合症，腹膜癌，乳突状的浆液性癌，妇科肉瘤，软组织肉瘤，硬皮病，皮肤血管炎，朗氏细胞组织细胞增多症，平滑肌肉瘤，进行性肌肉骨化症，激素难治疗的前列腺癌，切除的高危险软组织肉瘤，不可切除性肝细胞癌，Waldenstrom's巨球蛋白血症，冒烟性骨髓瘤，惰性骨髓瘤，输卵管癌，雄激素非依赖性前列腺癌，雄激素依赖性IV期非转移性前列腺癌，激素不敏感性前列腺癌，化疗不敏感性前列腺癌，乳突状的甲状腺癌，滤泡性甲状腺癌，甲状腺髓样癌和平滑肌瘤。在一个具体实施方案中，癌是转移性癌。在另一个实施方案中，癌是难治疗的或对化疗或辐射具有抗性的癌；尤其是，反应停难治疗的癌。

C.2. 治疗和预防方法

本发明的方法包括治疗、预防和/或控制各种型式癌症的方法。除非另作说明，否则，本文使用的术语“治疗”是指给予本发明的化合物或其它额外的活性剂。除非另作说明，否则，本文使用的术语“预防”是指在症状开始之前尤其对处于癌症危险之中的患者给药。术语“预防”包括抑制具体疾病或病症的症状。具有癌症家族史的患者是预防方案的优选候选者。除非另有陈述，否则，本文使用的术语“控制”包括预防患有具体癌症的患者的具体癌症复发，和/或延长患有癌症患者保持症状缓解的时间。

本文使用的术语“癌症”包括但不局限于：实质固态瘤和血液携带的肿瘤。术语“癌症”是指皮组织、器官、血液和血管的疾病，包括但不限于：膀胱癌，骨或血癌，脑癌，乳房癌，宫颈癌，胸癌，结肠癌，子宫内膜癌，食道癌，眼癌，头癌，肾癌，肝癌，淋巴结癌，肺癌，口腔癌，颈癌，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，直肠癌，胃癌，睾丸癌，喉癌和子宫癌。具体癌症包括但不局限于：晚期恶性肿瘤，淀粉样变性，神经母细胞瘤，脑膜瘤，血管外皮细胞瘤，多发性脑转移，恶性胶质瘤多态，恶性胶质瘤，脑干胶质瘤，预后差恶性脑肿瘤，恶性胶质瘤，复发性的恶性胶质瘤，退行性星形细胞瘤，退行性寡枝神经胶质细胞瘤，神经内分泌的肿瘤，直肠腺癌，Dukes C & D结肠直肠癌，不可切除的结肠直肠癌，转移性的肝细胞癌，皮肤多发性出血性肉瘤，染色体组型急性髓母细胞性白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，皮肤B细胞淋巴瘤，扩散性大B细胞淋巴瘤，低级滤泡性淋巴瘤，恶性黑色素瘤，恶性间皮瘤，恶性胸膜积液间皮瘤综合症，腹膜癌，乳突状的浆液性癌，妇科肉瘤，软组织肉瘤，硬皮病，皮肤血管炎，朗氏细胞组织细胞增多症，平滑肌肉瘤，进行性肌肉骨化症，激素难治疗的前列腺癌，切除的高危险软组织肉瘤，不可切除性肝细胞癌，Waldenstrom's巨球蛋白血症，冒烟性骨髓瘤，惰性骨髓瘤，输卵管癌，雄激素非依赖性前列腺癌，雄激素依赖性IV期非转移性前列腺癌，激素不敏感性前列腺癌，化疗不敏感性前列腺癌，乳突状的甲状腺癌，滤泡性甲状腺癌，甲状腺髓样癌和平滑肌瘤。在一个具体实施方案中，癌是转移性癌。在另一个实施方案中，癌是难治疗的或对化疗或辐射具有抗性的癌；尤其是，反应停难治疗的癌。

C.3. 生物筛选和抗癌活性：

使用实时细胞电子感测(RT-CES)的体外细胞基筛选

使用ACEA Biosciences, Inc的实时细胞电子感测(RT-CES^®)系统，检测并描绘本文所公开化合物的生物活性。RT-CES系统使用细胞基质阻抗技术，检测细胞在微孔板型的组织培养孔内的行为。该技术的特征在于：用微电子技术整合分子和细胞生物学，并且基于生物试验过程的电子测量技术。这种细胞电子感测技术和相关装置、系统和使用方法的详细内容描述在美国专利US 7,167,585、US 7,468,255、PCT出版物WO 2004/010102、美国专利US 7,470,533和美国专利US 7,459,303中，本文以引证的方式结合它们中的每一个。RT-CES技术的补充细节进一步公开在美国专利US 7,468,255中。

为了使用RT-CES技术测定细胞基质或细胞电极阻抗，将具有合适几何形状的微电极加工到微孔滴定板或类似装置的底面上(面对孔)。将细胞引入到该装置的孔中，使它们接触并附着于电极表面。细胞性能的存在、缺乏或改变影响电极传感器表面上的电子和离子通道。测定电极之间或电极当中的阻抗，可以提供关于存在于传感器上的细胞的生物状态的重要信息。当细胞的生物状态出现变化时，自动并实时地测定模拟电子读出信号，并且转变为用于处理和分析的数字信号。在RT-CES系统中，基于测定的电极阻抗数值，自动得到和提供细胞指数(任意（arbitrary）表达阻抗变化)。给定孔所获得的细胞指数反映了：1)在该孔中有多少细胞附着于电极表面；2)在该孔中细胞附着于电极表面的好坏程度如何。由此，在类似的生理条件下，附着电极表面的同型细胞越多，细胞指数越大。细胞附着电极表面越好(例如，细胞扩散更多，具有更大的接触面积，或细胞与电极表面附着更紧密)，细胞指数越大。

RT-CES系统包括三个组成部分：电子传感器分析仪、装置工作站和16X或96X微量滴定装置。用平版印刷微组装方法，将微电极传感阵列加工到载玻片上，并将包含电极的载玻片组装到塑料盘上，形成包含电极的孔。装置工作站容纳16X或96X微孔滴定板装置，并且能够用电子学方法将任何一个孔转换到检测分析仪上，进行阻抗测量。在操作中，将含有在孔中培养的细胞的装置放入位于培养箱内部的装置工作站中。用电缆连接该装置工作站与传感器分析仪。在RT-CES软件控制下，传感器分析仪可以自动选择所测定的孔，并连续进行阻抗测量。将得自于分析仪的阻抗数据转入电脑，利用组合软件分析和处理。

在单一孔中电极之间测定的阻抗取决于电极形状、孔中的离子浓度和是否存在附着于电极的细胞。在没有细胞的情况下，电极阻抗主要通过在电极/溶液界面和本体溶液两者中的离子环境来测定。在细胞的存在下，附着于电极传感器表面的细胞改变电极/溶液界面的局部离子环境，导致阻抗提高。电极上存在的细胞越多，细胞-电极阻抗的提高越大。此外，阻抗变化还取决于细胞形态和细胞附着于电极的程度。

为了基于测定的细胞-电极阻抗来测定细胞状态，衍生出称为细胞指数的参数。细胞指数是在包含电极的孔中细胞状态的定量标准。在相同生理条件下，附着在电极上的细胞越多，导致细胞-电极电阻数值越大，引起更大的细胞指数值。此外，如果存在于孔中的细胞数目相同，细胞状态例如形态的变化将会引起细胞指数的变化。例如，细胞附着或细胞扩散增加，可以引起细胞-电极接触面积更大，这将导致细胞-电极电阻提高，并由此产生更大的细胞指数值。

生物活性化合物与生长在E-板的孔内部的细胞相互作用，导致独特的活性模式(即，响应于化合物处理的独特的细胞阻抗曲线或细胞指数曲线)，其取决于化合物本身的生物机理、浓度、培养持续时间和细胞类型。每个化合物的“特征”细胞响应模式与具体生物现象有关，例如，细胞周期停滞、形态变化和细胞死亡。描绘在RT-CES系统上的细胞反应证明是有效的，并且我们已经证明，具有类似作用机理的化合物表现出相似模式。由此，细胞对化合物处理的响应模式的相似性可以表明作用机理、抗性模式和可能的分子靶向的相似性。我们已经确定了在对抗有丝分裂药剂处理响应过程中经历有丝分裂延滞的细胞的独特的RT-CES特征模式。例如，图4B和4C显示了用不同浓度的众所周知的抗有丝分裂药剂太平洋紫杉醇和长春花新碱处理的A549肺癌细胞的具体特性。

我们使用RT-CES系统(ACEA Biosciences)或xCelligence系统(Roche)，评价了许多癌细胞系对一些新化合物的反应。注释：RT-CES系统和xCelligence系统基本上相同，使用相同的ACEA实时细胞阻抗测量技术。一些本发明化合物的时间依赖性、细胞响应模式(在某些浓度下)的情况有点类似于太平洋紫杉醇和长春花新碱(在某些浓度下)。由此，这些化合物可以具有的抗癌作用机理与太平洋紫杉醇和长春花碱的相似。另一方面，尽管这些本发明化合物的时间依赖性、细胞响应模式与太平洋紫杉醇和长春花新碱的时间依赖性、细胞响应模式相似，但这些化合物可以通过不同于太平洋紫杉醇和长春花碱的其它作用机理作用于癌细胞。还可能的是，这些化合物通过多种作用机理作用于癌细胞，包括与太平洋紫杉醇和长春花碱相似的作用机理。

我们利用本文所描述的RT-CES方法进行测定，已经试验了本发明化合物的活性。数据表明，本发明化合物对许多癌细胞系具有活性，并且对正常细胞活性小得多。本文中，例如，我们使用一种活性化合物作为实例，化合物O。图4-24显示了在加入各种浓度的化合物O之前和之后对许多人癌细胞系的时间依赖性细胞指数。这些细胞系包括A549(非小细胞肺癌细胞系)，NCI-H460(大细胞肺癌细胞系)，H1993细胞(非小细胞肺癌细胞系)，H1838细胞(非小细胞肺癌细胞系)，H2347细胞(非小细胞肺癌细胞系)，SW620细胞(结肠癌细胞系)，GTL16细胞(胃癌细胞系)，HT29细胞(结肠癌细胞系)，A172细胞(脑癌细胞系)，U138细胞(脑癌细胞系)，U118细胞(脑癌细胞系)，SW1088细胞(脑癌细胞系)，HT1080细胞(结缔组织癌细胞系)，BxPC3细胞(胰腺癌细胞系)，HepG2细胞(肝癌细胞系)，SKOV3细胞(卵巢癌细胞系)，MCF7细胞(乳腺癌细胞系)，MDA-MB-231(乳腺癌细胞系)和KB(子宫颈癌细胞系)。结果表明，化合物O对这些癌细胞系的增殖显示了抑制效果。化合物O针对这些细胞系的IC50值与常规化疗药品太平洋紫杉醇和长春花新碱的IC50值相似。

我们还试验了化合物O对过表达多耐药性(MDR)基因的KB200的效果。这种基因决定化疗药品例如太平洋紫杉醇和长春花新碱/长春花碱在临床中的耐受性。图24A-D表明，母体KB细胞系的生长受到化合物O(IC50=33.1 nM)、太平洋紫杉醇(IC50=7.19 nM)、长春花碱(IC50=4.74 nM)和秋水仙碱(IC50=8.20 nM)的抑制。这4种化合物的IC50值的范围相似。图24E表明，KB200细胞的生长对化合物O的抑制敏感(IC50=9.84 nM)。与此相反，KB200细胞的生长对太平洋紫杉醇(IC50 > 1 uM)、长春花碱(IC50=135 nM)和秋水仙碱(IC50=116 nM)的抑制明显地更不敏感(如图24F-H所示)。这说明，化合物O针对太平洋紫杉醇和长春花碱治疗失败的患者具有巨大的二线治疗效果。

图25表明，非癌性的细胞系NIH-3T3对化合物O的抑制明显地更不敏感(IC50=6 uM)。因此，相对于正常细胞，化合物O对癌细胞表现出更高的细胞毒性效果。

抗癌活性的体内筛选

为了评价化合物O的体内抗癌效果，使用三个人肿瘤异种移植物模型。包括：MKN45人胃肠癌、H460人非小细胞肺癌和A549人肺癌异种移植物模型(在免疫缺陷裸鼠中)。化合物O的体内抗癌效果的详细内容提供于实施例1-3中。

实施例1

化合物 O 在裸鼠中对 MKN45 人胃肠癌的体内抗癌活性

为了评价化合物O的体内抗癌效果，在免疫缺陷裸鼠中试验MKN45人胃肠癌异种移植物模型。所有小鼠模型保存在Pharmacology Lab of ACEA Bio(Hangzhou)CO., Ltd.中。BALB/c免疫缺陷裸鼠购买于Shanghai SLAC Laboratory Animal，证书编号：SCXKA(Shanghai)2007-0005。小鼠重量是19±1 g。在该研究中只使用雌性小鼠。试验的动物数目如下：每个给药组7只，阳性对照组7只，阴性对照组7只。

试验对照

对于阴性对照，口服给予每个小鼠溶剂，溶剂的体积和浓度与化合物O试验中使用的溶剂的体积和浓度相同，每次给予120 mg/kg，每隔一天(qod)给予一次，经历18天。对于阳性对照，口服给予抗癌化合物依托泊苷，50 mg/kg，每4天给予一次，经历18天。

制备用于给药的试验化合物

将化合物O溶于25%磷脂(S75)和75%聚乙烯吡咯烷酮(PL-PVP)中，然后在0.9% NaCl水溶液中进一步稀释至8 mg/ml。在该研究中，使用120 mg/kg qod(每隔一天一次)和160 mg/kg q3d(每三天一次)之间的不同剂量的化合物O。

制备移植用的肿瘤细胞和测定化合物效果

为了制备MKN45人胃肠癌异种移植物模型的肿瘤细胞，首先从移植肿瘤的小鼠中取出快速生长的肿瘤，将肿瘤组织切割至1-2 mm³的规格。然后将这些微小肿瘤皮下注入到每个小鼠的辅助区域(右侧)。接种的肿瘤在裸鼠中生长至一定大小(60-80 mm³)之后，将小鼠随机分到不同的给药组中，并进行化合物治疗。第一次给药之后的2-3周之间，杀死小鼠，并从实验小鼠中取出移植的肿瘤。将每个取出的实质固态瘤称重；按照下式计算每个剂量组的肿瘤抑制率：

肿瘤抑制率%=(阴性对照组的肿瘤的平均重量-化合物治疗组的肿瘤的平均重量)/阴性对照组的肿瘤的平均重量x100 (1)。

将所有使用的材料高压消毒，包括动物接触的动物饲料、动物笼、承载材料和装置。在SPF条件下，将裸鼠保留在层流架中。肿瘤移植之后，动态地检测每个化合物剂量组中小鼠重量和肿瘤大小，并制图。通过测定肿瘤的长轴(a)和短轴(b)来测定肿瘤大小，并按照下式计算肿瘤体积：

肿瘤体积=axb ²/2 (2)。

结果

在MKN45人胃肠癌异种移植裸鼠模型中，在120 mg/kg qod和160 mg/kg q3d剂量组中，化合物O分别显示了58.0%和55.7%的平均体内肿瘤抑制率。在相同实验中，依托泊苷在常规给药剂量为50 mg/kg q3d时显示了48.4%的平均体内肿瘤抑制率。详细内容提供于表2中。肿瘤大小的动态变化概括在图1中。带病小鼠的体重的动态变化概括在表3中。在MKN45异种移植物模型中，在相同给药途径下，化合物O(120 mg/kg qod)的抗癌效果与依托泊苷(30 mg/kg q3d)的抗癌效果相似。

实施例2

化合物 O 在裸鼠中对 H460 人非小细胞肺癌的体内抗癌活性

为了评价化合物O的体内抗癌效果，使用免疫缺陷裸鼠中的H460人非小细胞肺癌异种移植物模型。将细胞系和小鼠保存在Pharmacology Lab of ACEA Bio(Hangzhou)CO., Ltd.中。BALB/c免疫缺陷裸鼠购买于Shanghai SLAC Laboratory Animal，证书编号：SCXKA(Shanghai)2007-0005。小鼠重量在19±2 g之间。在该研究中只使用雌性小鼠。试验的动物数目如下：每个给药组7只，阳性对照组7只，阴性对照组7只。

试验对照

对于阴性对照，只口服给予每个小鼠溶剂，溶剂的体积和浓度与化合物O试验中使用的溶剂的体积和浓度相同，每次给予120 mg/kg，每隔一天(qod)给予一次，经历25天。对于阳性对照，口服给予抗癌化合物依托泊苷，30 mg/kg qod，经历25天。

制备用于给药的试验化合物

将化合物O溶于25%磷脂(S75)和75%聚乙烯吡咯烷酮(PL-PVP)中，然后在0.9% NaCl水溶液中进一步稀释至8 mg/ml。口服给予每个小鼠该化合物溶液。在该研究中，使用不同剂量的化合物O(120 mg/kg qod和160 mg/kg q3d)。

制备移植用的肿瘤细胞并测定化合物效果

为了制备H460人非小细胞肺癌异种移植物模型的癌细胞，在烧瓶中，将对数期生长的细胞胰蛋白酶化，并将细胞重新悬浮在PBS(pH7.2)中(1.5 x 10⁷个细胞/ml)。然后将该细胞悬浮液(3 x 10⁶个细胞)皮下注入到每个小鼠的辅助区域(右侧)。接种的癌细胞在裸鼠中生长至一定大小(150 mm³)的肿瘤之后，将小鼠随机分到不同的给药组中，并进行化合物治疗。第一次给药之后的3-4周之间，杀死小鼠，并从实验小鼠中取出移植的肿瘤。将每个取出的实质固态瘤称重；按照实施例1中的方程式(1)计算每个剂量组的肿瘤抑制率。

将所有使用的材料高压消毒，包括动物接触的动物饲料、动物笼、承载材料和装置。在SPF条件下，将裸鼠保留在层流架中。肿瘤移植之后，动态地检测每个化合物剂量组中小鼠重量和肿瘤大小，并制图。通过测定肿瘤的长轴(a)和短轴(b)来测定肿瘤大小，并按照实施例1中的公式(2)计算肿瘤体积。

结果

在H460人非小细胞肺癌异种移植裸鼠模型中，在120 mg/kg qod和160 mg/kg q3d剂量组中，化合物O分别显示了47.1%和31.3%的平均体内肿瘤抑制率。在相同实验中，依托泊苷显示了48.4%的平均体内肿瘤抑制率，常规给药剂量为30 mg/kg qod。详细内容提供于表4中。肿瘤大小的动态变化概括在图2中。带病小鼠的体重的动态变化概括在表5中。在H460人非小细胞肺癌异种移植物模型中，在相同给药方法下，化合物O(120 mg/kg)的抗癌效果与依托泊苷(30 mg/kg)的抗癌效果相似。

实施例3

化合物 O 在裸鼠中对 A549 人非小细胞肺癌的体内抗癌活性

为了评价化合物O的体内抗癌效果，使用免疫缺陷裸鼠中的A549人非小细胞肺癌异种移植物模型。将细胞系和小鼠保存在Pharmacology Lab of ACEA Bio(Hangzhou)CO., Ltd.中。BALB/c免疫缺陷裸鼠购买于Shanghai SLAC Laboratory Animal，证书编号：SCXKA(Shanghai)2007-0005。小鼠重量在21±1 g之间。在该研究中只使用雌性小鼠。试验的动物数目如下：每个给药组7-8只，阳性对照组6只，阴性对照组7只。

试验对照

对于阴性对照，只口服给予每个小鼠溶剂，溶剂的体积和浓度与化合物O试验中使用的溶剂的体积和浓度相同，每次给予120 mg/kg，每隔一天(qod)给予一次，经历25天。对于阳性对照，口服给予抗癌化合物依托泊苷，30 mg/kg qod，经历25天。

制备用于给药的试验化合物

将化合物O溶于25%磷脂(S75)和75%聚乙烯吡咯烷酮(PL-PVP)中，然后在0.9% NaCl水溶液中进一步稀释至8 mg/ml。口服给予每个小鼠该化合物溶液。在该研究中，使用不同剂量的化合物O(120 mg/kg qod和160 mg/kg q2*2(连续2天给药，然后连续中止2天))。

制备移植用的肿瘤细胞并测定化合物效果

为了制备A549人非小细胞肺癌异种移植物模型的癌细胞，在烧瓶中，将对数期生长的细胞胰蛋白酶化，并将细胞重新悬浮在PBS(pH7.2)中(2.5 x 10⁷个细胞/ml)。然后将该细胞悬浮液(5 x 10⁶个细胞)皮下注入到每个小鼠的辅助区域（auxiliary region）(右侧)。接种的癌细胞在裸鼠中生长至一定大小(50-60 mm³)的肿瘤之后(接种后大约15天)，将小鼠随机分到不同的给药组中，并进行化合物治疗。第一次给药之后的3-4周之间，杀死小鼠，并从实验小鼠中取出移植的肿瘤。将每个取出的实质固态瘤称重；按照实施例1中的方程式(1)计算每个剂量组的肿瘤抑制率。

将所有使用的材料高压消毒，包括动物接触的动物饲料、动物笼、承载材料和装置。在SPF条件下，将裸鼠保留在层流架中。肿瘤移植之后，动态地检测每个化合物剂量组中小鼠重量和肿瘤大小，并制图。通过测定肿瘤的长轴(a)和短轴(b)来测定肿瘤大小，并按照实施例1中的公式(2)计算肿瘤体积。

结果

在A549人非小细胞肺癌异种移植裸鼠模型中，在120 mg/kg qod和160 mg/kg q2*2剂量组中，化合物O分别显示了67.8%和62.5%的平均体内肿瘤抑制率。在相同实验中，依托泊苷显示了59.9%的平均体内肿瘤抑制率，常规给药剂量为30 mg/kg qod。详细内容提供于表6中。肿瘤大小的动态变化概括在图3中。带病小鼠的体重的动态变化概括在表7中。在A549人非小细胞肺癌异种移植物模型中，在相同给药方法下，化合物O(120 mg/kg)的抗癌效果与依托泊苷(30 mg/kg)的抗癌效果相似。

实施例4

化合物 O 、太平洋紫杉醇和长春花新碱在 A549 细胞中抑制细胞增殖

将A549细胞(人肺癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用RT-CES系统(ACEA Biosciences)，检测细胞状态。RT-CES系统与xCelligence系统(目前得自于Roche)相同。图4A-C显示了加入化合物之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)分别是10.9 nM、5.3 nM和61.8 nM。

实施例5

化合物 O 在 H596 细胞中抑制细胞增殖

将H596细胞(人肺腺鳞癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。xCelligence系统与RT-CES系统(得自于ACEA Biosciences)相同。图5显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是37.9 nM。比较来说，太平洋紫杉醇和长春花新碱的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)分别是12.5 nM和36.9 nM。

实施例6

化合物 O 在 H292 细胞中抑制细胞增殖

将H292细胞(人肺癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图6显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是10.8 nM。比较来说，太平洋紫杉醇和长春花新碱的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)分别是2.59 nM和2.63 nM。

实施例7

化合物 O 在 H460 细胞中抑制细胞增殖

将NCI-H460细胞(人大细胞肺癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图7显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是10.9 nM。比较来说，太平洋紫杉醇和长春花新碱的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)分别是2.68 nM和10.4 nM。

实施例8

化合物 O 在 H1993 细胞中抑制细胞增殖

将H1993细胞(人非小细胞肺癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图8显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是60.2 nM。比较来说，太平洋紫杉醇和长春花新碱的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)分别是5.12 nM和2.43 nM。

实施例9

化合物 O 在 H1838 细胞中抑制细胞增殖

将H1838细胞(人非小细胞肺癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图9显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是11.8 nM。比较来说，长春花新碱的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是3.16 nM。

实施例10

化合物 O 在 H2347 细胞中抑制细胞增殖

将H2347细胞(人非小细胞肺癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图10显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是1.76 nM。比较来说，长春花新碱的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是5.05 nM。

实施例11

化合物 O 在 SW620 细胞中抑制细胞增殖

将SW620细胞(人结肠癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图11显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是2.65 nM。比较来说，太平洋紫杉醇的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是0.998 nM。

实施例12

化合物 O 在 GTL16 细胞中抑制细胞增殖

将GTL16细胞(人胃癌细胞系，源自于MKN45人胃癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图12显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是67.0 nM。比较来说，太平洋紫杉醇和长春花新碱的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)分别是1.02 nM和3.75 nM。

实施例13

化合物 O 在 HT29 细胞中抑制细胞增殖

将HT29细胞(人结肠癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图13显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是25.4 nM。比较来说，太平洋紫杉醇和长春花新碱的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)分别是2.52 nM和12.7 nM。

实施例14

化合物 O 在 A172 细胞中抑制细胞增殖

将A172细胞(人脑癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图14显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)分别是11.6 nM、4.46 nM和1.30 nM。

实施例15

化合物 O 在 U138MG 细胞中抑制细胞增殖

将U138MG细胞(人脑癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图15显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)分别是3.41 nM、18.1 nM和0.641 nM。

实施例16

化合物 O 在 U118MG 细胞中抑制细胞增殖

将U118MG细胞(人脑癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图16显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)分别是13.1 nM、12.3 nM和4.31 nM。

实施例17

化合物 O 在 SW1088 细胞中抑制细胞增殖

将SW1088细胞(人脑癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图17显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)分别是21.2 nM、13.1 nM和4.96 nM。

实施例18

化合物 O 在 HT1080 细胞中抑制细胞增殖

将HT1080细胞(人结缔组织癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图18显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O和长春花新碱的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)分别是7.63 nM和2.01 nM。

实施例19

化合物 O 在 BxPC3 细胞中抑制细胞增殖

将BxPC3细胞(人胰腺癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图19显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是6.60 nM。比较来说，太平洋紫杉醇和长春花新碱的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)分别是8.86 nM和4.06 nM。

实施例20

化合物 O 在 HepG2 细胞中抑制细胞增殖

将HepG2细胞(人肝癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔10，000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图20显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是25.9 nM。

实施例21

化合物 O 在 SKOV3 细胞中抑制细胞增殖

将SKOV3细胞(人卵巢癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔3000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图21显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是5.47 nM。比较来说，太平洋紫杉醇的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是5.34 nM。

实施例22

化合物 O 在 MCF7 细胞中抑制细胞增殖

将MCF7细胞(人乳腺癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图22显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是74.4 nM。比较来说，太平洋紫杉醇的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是11.3 nM。

实施例23

化合物 O 在 MDA-MB-231 细胞中抑制细胞增殖

将MDA-MB-231细胞(人乳腺癌细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇和长春花新碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图23显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是32.4 nM。

实施例24

化合物 O 在过表达多耐药 (MDR) 基因的 KB200 细胞中抑制细胞增殖

首先试验母体子宫颈癌细胞系KB细胞。将KB细胞播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇、长春花碱和秋水仙碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图24A-D显示了加入化合物之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O、太平洋紫杉醇、长春花碱和秋水仙碱的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)分别是33.1 nM、7.19 nM、4.74 nM和8.20 nM。

还试验了这些化合物抵御过表达多耐药(MDR)基因的KB200细胞的效果。类似地，将KB200细胞播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O、太平洋紫杉醇、长春花碱和秋水仙碱(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图24E-H显示了加入化合物之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O、长春花碱和秋水仙碱的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)分别是9.84 nM、0.135µM和0.116µM。太平洋紫杉醇的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)大于1µM。化合物O针对耐受常规化疗(例如，太平洋紫杉醇和长春花碱)的细胞系显示了良好的效果。这说明，化合物O针对太平洋紫杉醇和长春花碱治疗失败的患者可作为重要的二线治疗。

实施例25

化合物 O 在 NIH 3T3 正常组织细胞系中抑制细胞增殖

将NIH 3T3细胞(正常组织细胞系)播种到96孔E-板装置(Roche)的孔中，初始播种密度为每孔5000个细胞，在标准细胞培养条件下、在培养箱中预先培养大约24小时。培养期之后，将不同浓度的化合物O(在DMSO中)加入到孔中。在加入化合物之前和之后，使用xCelligence系统(Roche)，检测细胞状态。图25显示了加入化合物O之前和之后的随时间而变化的归一化细胞指数。该细胞指数相对于刚好在加入化合物之前的时间点的细胞指数值归一化。化合物O的计算的IC50值(化合物治疗后72小时)是6.0µM。与此相反，化合物O针对所有试验癌细胞系的IC50值在低nM范围内。相对于正常细胞，化合物O对癌细胞表现出更高的细胞毒性效果。

实施例26

化合物 O 体外和体内抑制微管蛋白聚合

当复制的染色体在细胞分裂为两个子细胞之前分离为两个相同组时，微管在许多细胞过程(包括有丝分裂)中都很重要。微管在有丝分裂和细胞分裂中的关键作用和它们的动态使得微管成为抗癌药的重要靶向。在分裂间期期间的细胞中，微管将它们的微管蛋白与胞质池中溶解的微管蛋白互换，半衰期为～3分钟至几小时。随着有丝分裂的开始，分裂间期微管网分解并被高动态微管群替代，形成有丝分裂纺锤体，并移动染色体。有丝分裂纺锤体微管的动态是分裂间期细胞中的微管的动态的20-50倍，并且更多的纺缍体微管将它们的微管蛋白与溶解池中的微管蛋白互换，半衰期为15秒钟。

有丝分裂纺锤体微管的动态对调节剂的调节和对微管活性药品的破环极其敏感。靶向微管的药品可以用各种各样的途径改变微管聚合和动态。本文中，我们证明了化合物O的作用机理：(1)它体外抑制微管组装，(2)它在培养细胞中影响微管网，和(3)它通过与秋水仙碱相似的机理抑制微管蛋白组装。

方法

体外微管组装试验

基于HTS-微管蛋白聚合试验试剂盒方案(Cytoskeleton)，在含有MAP富集微管蛋白和各种浓度化合物O(在缓冲剂中)的96孔微孔滴定板中进行微管聚合，缓冲剂中包含80 mM PIPES(pH6.9)、0.5 mM EGTA、2 mM MgCl₂、1 mM GTP、10%甘油和4%(v/v)二甲亚砜(DMSO)。在37℃，在Beckman Multimode DTX880板读数器中，在405 nm，测定吸光度的提高，每60秒钟记录一次，记录30分钟。

离心柱试验

在不同浓度的未标记的长春花碱、秋水仙碱或化合物O的存在下，在包含0.05M PIPES(pH6.9)、1 mM MgCl₂和1 mM GTP的缓冲剂中，用[³H]长春花碱或[³H]秋水仙碱培养微管蛋白。将该反应混合物在37℃下培养1小时。将样品加载到预先用缓冲溶液平衡的illustra^TM™ MicroSpin^TM™ G-50柱(GE Healthcare)上。将该柱放入1.5 ml试管中，在室温下、在750g下离心2分钟，并利用闪烁计数器分析流过物中的放射性。

结果

图26A显示了化合物O对微管组装的体外影响(使用MAP富集的微管蛋白)。在阴性对照样品中，405 nM时的吸光度(A₄₀₅)随时间而提高。A₄₀₅在10分钟内提高到平台期。在5µM长春花新碱的存在下，与对照样品情况相比较，微管蛋白聚合被抑制50%以上。在化合物O的存在下，微管蛋白聚合以浓度依赖性方式受到抑制。0.04µM的化合物O没有显示出抑制作用，与阴性对照相似。5µM的化合物O显示了与阳性对照(5µM长春花新碱)相似的抑制模式。在5µM太平洋紫杉醇(微管蛋白聚合增强剂)的存在下，相比于阴性对照的情况，微管蛋白聚合进一步增加。

图26B显示了用化合物O治疗20小时对A549细胞中微管结构的抑制效果。对照细胞中的微管网显现出正常结构和排列(图24B，DMSO)。与此相反，太平洋紫杉醇治疗导致微管聚合，同时细胞微管的密度提高(图24B，太平洋紫杉醇)。此外，化合物O治疗导致与长春花新碱引起的微管变化的情况相似的发现(图24B，化合物O &长春花新碱)。

图26C表明，化合物O通过秋水仙碱结合位点与微管蛋白相互作用(使用离心柱试验)。如图26C(上部画面)所示，在未标记的秋水仙碱的存在下，用[³H]秋水仙碱培养微管蛋白以浓度依赖性方式降低存在于流过物中的[³H]秋水仙碱的数量。类似地，化合物O以浓度依赖性方式降低流过物中的[³H]秋水仙碱的数量。对于阴性对照，长春花碱不影响流过物中的[³H]秋水仙碱的数量。我们还检验了化合物O是否通过与微管蛋白上的长春花碱结合位点结合来与微管蛋白相互作用(使用离心柱试验)。如图26C(下部画面)所示，在未标记的长春花碱的存在下，用[³H]长春花碱培养微管蛋白以浓度依赖性方式降低存在于流过物中的[³H]长春花碱的数量。相反，秋水仙碱和化合物O都不影响流过物中的[³H]长春花碱的数量。

实施例27

化合物 O 在癌细胞中引起细胞程序死亡

为了试验是否化合物O在癌细胞中引起细胞程序死亡，用37 nM化合物O和37 nM太平洋紫杉醇处理A549人肺癌细胞。按照试剂盒的试验方案，用细胞死亡检测ELISA试剂盒(Roche Applied Sciences)测定细胞程序死亡和死亡检测。简要地说，将5000个细胞播种到96孔板的每个孔中。培养24小时之后，用37 nM化合物O和太平洋紫杉醇处理细胞，浓度接近细胞增殖的IC50值。药品处理后24小时、48小时或72小时，采集并溶解细胞。取出20微升溶胞产物，并转入链霉亲和素涂渍的微板中，而后用抗组蛋白-生物素和抗DNA-POD抗体培养2小时，随后加入2,2'-连氮基二-3-乙基苯并噻唑啉-磺酸基质，进行显色。在Beckman Multimode DTX880板读数器中，在405和490 nm的吸光度下测定该板。

如图27A所示，用37 nM化合物O和37 nM太平洋紫杉醇处理的细胞显示了强烈的凋亡信号(从药品处理后48小时开始)，而只用DMSO处理的对照细胞显示了最小的信号。这表明，化合物O在A549肺癌细胞中引起时间依赖性细胞程序死亡。另外，我们还试验了两个其它癌细胞系：H596和H292。图27B表明，在这两个细胞系中，37 nM化合物O引起与37 nM太平洋紫杉醇相似的细胞程序死亡水平。结合在一起，化合物O在癌细胞中引起细胞程序死亡。

实施例28

化合物 O 在癌细胞中引起 G2/M 细胞循环延滞

微管在有丝分裂过程中极其重要，在此期间，细胞的复制的染色体在细胞分裂为两个子细胞之前分离为两个相同组。靶向微管的化合物，例如太平洋紫杉醇和长春花碱，可以抑制微管动态并阻断有丝分裂过程。因此，细胞在G2/M期受到延滞。为了试验化合物O是否影响癌细胞分化中的有丝分裂的过程，将A549人肺癌细胞用33 nM化合物O和太平洋紫杉醇或起阴性对照作用的0.2% DMSO处理。将处理的细胞用抗磷酸化组蛋白H3的抗体(进行有丝分裂和有丝分裂延滞的细胞的标志物)染色。图28A显示了太平洋紫杉醇和化合物O延滞有丝分裂的程度(用有丝分裂指数定量)。对于太平洋紫杉醇、化合物O和DMSO处理的A549，它分别是44±8%、45±3%和3±1%。

另外，我们还试验了化合物O对细胞循环的效果(使用流式细胞术)。简要地说，将A549细胞播种在6孔组织培养板中，密度为400,000个细胞/孔。大约24小时之后，用37 nM化合物O处理细胞，并进一步培养24小时。用PBS洗涤该细胞，胰蛋白酶化，计数，并用冰冷的70%甲醇固定，在4℃保存。用PBS洗涤细胞，用碘化丙啶染色，保持在冰上，直到流式细胞术分析为止。如图28B所示，相比于只用DMSO处理的细胞，在用化合物O处理的细胞中，G2/M期的细胞群显著增加。

所有参考文献(例如出版物)、专利、专利申请和公开的专利申请，本文以引证的方式结合其全部内容。

虽然为了明确理解而通过举例说明和实施例相当详细地描述了上述发明，但对本领域技术人员显而易见的是，可以实践某些微小的改变和修饰。因此，不应该将该说明书和实施例看作是对本发明范围的限制。

Claims (13)

1. 式(I)或式(II)的化合物：

其中Z选自但不局限于下列取代的苯基或杂环：

或其可药用盐。

2. 权利要求1的化合物，其是式(I)的化合物。

3. 权利要求1的化合物，其是式(II)的化合物。

4. 式(I)的化合物，选自

。

5. 式(II)的化合物，选自

。

6. 药物组合物，其包含权利要求1-5的任一项的化合物和可药用赋形剂或载体。

7. 权利要求6的药物组合物，其进一步包含其它活性剂。

8. 治疗、预防或控制癌症的方法，包括：给予需要这种治疗的患者有效量的权利要求1-5的化合物或权利要求6或权利要求7的药物组合物。

9. 权利要求8的方法，其中癌症是肉瘤，表皮癌症，纤维肉瘤，子宫颈癌，胃癌，皮肤癌，白血病，淋巴瘤，肺癌，非小细胞肺癌，结肠癌，CNS癌症，黑素瘤，卵巢癌，肾癌，前列腺癌，乳腺癌，肝癌，头癌，颈癌或胰腺癌。

10. 权利要求8的方法，其中患者是人。

11. 按照权利要求1至7的任一项的化合物，用于治疗癌症。

12. 按照权利要求1至7的任一项的化合物或其可药用盐在制备药物中的用途，该药物用于治疗癌症。

13. 权利要求11或12的化合物，其中癌是肉瘤，表皮癌，纤维肉瘤，子宫颈癌，胃癌，皮肤癌，白血病，淋巴瘤，肺癌，非小细胞肺癌，结肠癌，CNS癌，黑素瘤，卵巢癌，肾癌，前列腺癌，乳腺癌，肝癌，头癌，颈癌或胰腺癌。

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