SA92130186B1 - إنتاج عامل حفاز لتكوين الخلية الحبيية granulocyte متعددة الفعاليه - Google Patents
إنتاج عامل حفاز لتكوين الخلية الحبيية granulocyte متعددة الفعاليه Download PDFInfo
- Publication number
- SA92130186B1 SA92130186B1 SA92130186A SA92130186A SA92130186B1 SA 92130186 B1 SA92130186 B1 SA 92130186B1 SA 92130186 A SA92130186 A SA 92130186A SA 92130186 A SA92130186 A SA 92130186A SA 92130186 B1 SA92130186 B1 SA 92130186B1
- Authority
- SA
- Saudi Arabia
- Prior art keywords
- csf
- hpg
- cells
- cell
- dna
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 28
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims description 18
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 title claims description 10
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 title description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 142
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 57
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 54
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 7
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims abstract 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 47
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 28
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 claims description 27
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 claims description 26
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 claims description 26
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 23
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 20
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 9
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 8
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 6
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 claims 4
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 claims 3
- 102000001324 CD59 Antigens Human genes 0.000 claims 1
- 108010055167 CD59 Antigens Proteins 0.000 claims 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 claims 1
- 230000003190 augmentative effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 claims 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 claims 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims 1
- 210000003370 receptor cell Anatomy 0.000 claims 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 19
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 abstract description 13
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 abstract description 12
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 abstract description 9
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 4
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 abstract description 3
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 abstract description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 abstract description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 abstract 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 41
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 40
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 22
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 18
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 17
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 15
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 12
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 12
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 12
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 11
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 11
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 10
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 10
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 9
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 9
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 9
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 8
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 8
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 8
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 7
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 7
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 7
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 7
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 7
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000000777 hematopoietic system Anatomy 0.000 description 6
- 210000003643 myeloid progenitor cell Anatomy 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 5
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 5
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical group O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 5
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 210000002960 bfu-e Anatomy 0.000 description 4
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 description 4
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 4
- 208000025113 myeloid leukemia Diseases 0.000 description 4
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 3
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K hemin Chemical compound CC1=C(CCC(O)=O)C(C=C2C(CCC(O)=O)=C(C)\C(N2[Fe](Cl)N23)=C\4)=N\C1=C/C2=C(C)C(C=C)=C3\C=C/1C(C)=C(C=C)C/4=N\1 BTIJJDXEELBZFS-QDUVMHSLSA-K 0.000 description 3
- 229940025294 hemin Drugs 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 210000004765 promyelocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108700026495 N-Myc Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 2
- 102100030124 N-myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 2
- 241001028048 Nicola Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 2
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 125000000613 asparagine group Chemical class N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 2
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000913 erythropoietic effect Effects 0.000 description 2
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 2
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 2
- 108010085617 glycopeptide alpha-N-acetylgalactosaminidase Proteins 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 2
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 2
- 230000000242 pagocytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 2
- 235000008001 rakum palm Nutrition 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LCTORNIWLGOBPB-PHYPRBDBSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-2-amino-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol Chemical compound N[C@@]1(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O LCTORNIWLGOBPB-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000023308 Acca Species 0.000 description 1
- 206010000830 Acute leukaemia Diseases 0.000 description 1
- OILNWMNBLIHXQK-ZLUOBGJFSA-N Ala-Cys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OILNWMNBLIHXQK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- 241001136792 Alle Species 0.000 description 1
- 241001093575 Alma Species 0.000 description 1
- 241000134916 Amanita Species 0.000 description 1
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 101100245253 Caenorhabditis elegans pas-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010051152 Carboxylesterase Proteins 0.000 description 1
- 102000013392 Carboxylesterase Human genes 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 101000888533 Conus ochroleucus Conantokin-Oc Proteins 0.000 description 1
- YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N Cys-Ser Chemical group SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YXQDRIRSAHTJKM-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 101100421144 Danio rerio selenoo1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000016680 Dioxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010028143 Dioxygenases Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000611421 Elia Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108090000371 Esterases Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 101000824878 Gallus gallus Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 208000034951 Genetic Translocation Diseases 0.000 description 1
- RYAOJUMWLWUGNW-QMMMGPOBSA-N Gly-Val-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O RYAOJUMWLWUGNW-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical group OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000989913 Gunnera petaloidea Species 0.000 description 1
- 241001466538 Gymnogyps Species 0.000 description 1
- VYUXYMRNGALHEA-DLOVCJGASA-N His-Leu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VYUXYMRNGALHEA-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- 101000632261 Homo sapiens Semaphorin-3A Proteins 0.000 description 1
- 101000918926 Homo sapiens Sphingolipid delta(4)-desaturase/C4-monooxygenase DES2 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- HAEJPQIATWHALX-KQYNXXCUSA-N ITP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 HAEJPQIATWHALX-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- YKZAMJXNJUWFIK-JBDRJPRFSA-N Ile-Ser-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N YKZAMJXNJUWFIK-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000782222 Khadia Species 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 description 1
- 241001103596 Lelia Species 0.000 description 1
- JYOAXOMPIXKMKK-YUMQZZPRSA-N Leu-Gln Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C([O-])=O)CCC(N)=O JYOAXOMPIXKMKK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- NDJSSFWDYDUQID-YTWAJWBKSA-N Met-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)N)O NDJSSFWDYDUQID-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 1
- XYVRXLDSCKEYES-JSGCOSHPSA-N Met-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(O)=O)=CNC2=C1 XYVRXLDSCKEYES-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 229920000426 Microplastic Polymers 0.000 description 1
- 241001275944 Misgurnus anguillicaudatus Species 0.000 description 1
- JJWSNOOGIUMOEE-UHFFFAOYSA-N Monomethylmercury Chemical compound [Hg]C JJWSNOOGIUMOEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100202896 Mus musculus Selenoo gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010052989 Naphthol AS D Esterase Proteins 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 241000288049 Perdix perdix Species 0.000 description 1
- KDYPMIZMXDECSU-JYJNAYRXSA-N Phe-Leu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 KDYPMIZMXDECSU-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- DOXQMJCSSYZSNM-BZSNNMDCSA-N Phe-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DOXQMJCSSYZSNM-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N Pro-Leu-Gly Chemical group OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FXGIMYRVJJEIIM-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102100030852 Run domain Beclin-1-interacting and cysteine-rich domain-containing protein Human genes 0.000 description 1
- GTMJHPZRGBKJFX-UHFFFAOYSA-N SSSSSSSS Chemical compound SSSSSSSS GTMJHPZRGBKJFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000297566 Saula Species 0.000 description 1
- 102100027974 Semaphorin-3A Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N Ser-Leu Chemical group CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO NFDYGNFETJVMSE-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N Ser-Phe Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PPQRSMGDOHLTBE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N Ser-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XZKQVQKUZMAADP-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 102100029473 Sphingolipid delta(4)-desaturase/C4-monooxygenase DES2 Human genes 0.000 description 1
- 208000032005 Spinocerebellar ataxia with axonal neuropathy type 2 Diseases 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N Thr-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- PAPWZOJOLKZEFR-AVGNSLFASA-N Val-Arg-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N PAPWZOJOLKZEFR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- KISFXYYRKKNLOP-IHRRRGAJSA-N Val-Phe-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N KISFXYYRKKNLOP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010044940 alanylglutamine Proteins 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000002249 anxiolytic agent Substances 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000001174 ascending effect Effects 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 description 1
- 208000033361 autosomal recessive with axonal neuropathy 2 spinocerebellar ataxia Diseases 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000009954 braiding Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 208000002458 carcinoid tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OPGYRRGJRBEUFK-UHFFFAOYSA-L disodium;diacetate Chemical compound [Na+].[Na+].CC([O-])=O.CC([O-])=O OPGYRRGJRBEUFK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000037406 food intake Effects 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 210000004565 granule cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000013388 immunohistochemistry analysis Methods 0.000 description 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003041 ligament Anatomy 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N meglumine amidotrizoate Chemical compound C[NH2+]C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO.CC(=O)NC1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I MIKKOBKEXMRYFQ-WZTVWXICSA-N 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 108010034507 methionyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- KRZWEBVPFGCYMY-UHFFFAOYSA-M methylmercury(1+);hydroxide Chemical compound [OH-].[Hg+]C KRZWEBVPFGCYMY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002894 multi-fate stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108700042769 prolyl-leucyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 210000004206 promonocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 238000005086 pumping Methods 0.000 description 1
- 239000012857 radioactive material Substances 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000011451 sequencing strategy Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N tryptophan Chemical compound C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
- C07K16/243—Colony Stimulating Factors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/06—Antianaemics
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
- C07K14/535—Granulocyte CSF; Granulocyte-macrophage CSF
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
الملخص: يتعلق هنا، عديد بيتيدات polypeptides جديدة لها جزء أو كل التكوين البنائي الأساسي، وواحد أو أكثر من الصفات الحيوية للثدييات (مثل الإنسان) كإنتاج عامل حفزي لتكوين الخلية الحبيبية متعددة الفعالية، والتي تتميز بأفضليتها في إنتاج الخلايا البكتيرية المستقبلة prokaryotic أو eukaryotic المعدلة للسلسلة الجينية genomic ل DNA. تشفير سلاسل جزء أو كل متبقيات الحمض الأميني amino acid ل hpG-CSF أو مشابهتها في نفس المصدر، يمكن إدخاله في الكروموسوم الجيني genetic التكراري للجهاز العصبي التشابكي، أو في نواقل فيروسية تستخدم لتعديل الخلايا البكتيرية المستقبلة المناسبة، مثل prokaryotic أو eukaryotic مثل البكتيريا، الخميرة، أو الخلايا cells الفقارية المزرعة. توضح المنتجات المعدلة لسلاسل ال DNA (الحمض النووي)، الخصائص الطبيعية والمناعية والنشاطات الحيوية لمعزولات hpG-CSF المشتقة من مصادرطبيعية خارج الجسم الحي (مخبريا) كما موضح أيضا عديد البيتيدات polypeptides المحضرة كيميائيا chemically والتي لها نصيب فيالخصائص الكيموحيوية والمناعية biochemical and immunological ل hpG-CSF .
Description
Y _ — إنتاج عامل حفاز لتكوين الخلية Granulocyteduusald) متعددة الفعالية الوصف الكامل * 1 واه إلا ١ “eo : يتعلق الاختراع الحالي بصفة عامة بعوامل النمو في نظام تكوين الدم لدى الإنسان (hematopoietic) وبعديد النيكلوتيدات (polyuncleotides) المشفرة (encoding) لهذه العوامل. ويتعلق الطلب الحالي بشكل خاص بعوامل حفز لإنتاج خلية متعددة الفعالية (pluripotene) م للثيدييات وخصوصاً بعامل حفزي لإنتاج الخلية متعددة الفعالية للإنسان (000-257 والأجزاء وأشباه عديد الببتيدات (polypeptide) وكذلك عديد النيكلوتيدات (polyuncleotides) لنفس المصدر . يستبدل نظام تكوين الدم في الإنسان (hematopoietic) مختلف LMA الدم البيضاء (التي تشمل الخلايا المتعادلة ¢(neutrophils) والملتهمة (macrophages) المحبة للماء/ الخلايا البدنية (basophils/mast ٠ وخلايا الدم الحمراء (erythrocytes) والخلايا المكونة للتجلط والصفائح الدموية .(megakaryocytes/platelets) قدر أن نظام تكوين الدم (hematopoietic) لذكر الإنسان المتوسط يعمل بمعدل إنتاج مي "My. خلية حبيبية (granulocytes) وخلايا دم حمراء (erythrocytes) سنوياً والتي تكفئ إحلال الوزن الكلي للجسم سنوياً. ديكستير وزملائه. التحليل الحيوي Y ,10“ ٠٠8 (فخ )(. .)14985( 2,154-158 Dexter et al., BioEssays, \o ويعتقد أن كمية صغيرة من عوامل النمو المحددة في نظام تكوين الدم (hematopoietic) تقدم تفسيراً لتخليق عدد قليل من الأصل والخلايا الجزعية (stem cells) لخطوط متباينة لخلايا الدم؛ للتكاثر الهائل لهذه الخطوط وكذلك للتميز الجوهري لخلايا الدم الناضجة عن هذه الخطوط. ولأن عوامل النمو في نظام تكوين الدم (hematopoietic) توجد بكميات صغيرة؛ فإن كشف وتوصيف
Y — — عدداً كبيراً من الأسماء تم ابتكاره لترمز إلى عدد أصغر من هذه العوامل . وعلى سبيل المثال؛ ناتج دمج المصطلحات ؛ BPA, IL-3 « عديد MCGF, HCGF, CSF— و PSF جميعها كلمات مركبة من الحروف الأولى لكلمات أخرى (acronyms) والتي يعتقد Ws بأنه يمكن استخدامها في أحد عوامل نمو تكوين الدم في الفأر . وكذلك أنظن Metcalf, Scilnce, 229, 116-22 (1985). Burgess, et al.
J.
Biol.
Chem., et al., J.
Immunol., 129, 2431 علطا ,)1980( 600 ,58 Das, et al.
Blood, ,)1977( 1988 ,252 Nicola, et al., J.
Biol.
Chem., 258, 9017 (1983), Metcalf, et al., Int.J.
Cancer, 30, ,)1982( and Burgess, et al.
Int.
J. cancer, 26, 647 (1980), )1982( 773 ٠١ والتي تتعلق بمختلف الجليكوبروتينات (glycoproteins) المنظمة لنمو الجرذ ٠. إن تطبيق تقنيات إعادة الإتحاد الجيني genetic أخرج بعض الحالات من هذا الاختلاط مثال الحمض الأميني amino acid وسلاسل DNA لهرمون (erythropoietin) لنظام تكوين خلايا 5ه الدم الحمراء للإنسان والتي تحث إنتاج كرات الدم الحمراء المتحصل عليها ٠ Jka) (See, lin, PCT published Application No. 85/02610, Published June 20, 1985) لين yo الطلب المنشور 007 رقم YT) JAC المنشورة في Yo يونيو .)١985( كذلك استخدمت طريقة إعادة الاتحاد الجيني genetic لفصل cDNA لعامل الحث لإنتتاج الخلية الحبيبية الملتهممة (©ع212071100716-008000112). أنظر ٠ لي وآخرون وونج وآخرون Proc.
Natl. ملة Lee, et Acad.
Sci- (USA), 82, 4360-4364 (1985) and Wong, et.
Al., Scilnce, 228, 810-814 )1985( . أنظر أيضاً يوكوتا وآخرون ,81 Proc.
Natl.
Acad.
Sci. (USA), لة Yokota, et ٠ ,)1984( 1070 . فنج وآخرون )1984( 307,233 Fung, el al, Nature, . وجوف وآخرون
Gouph et al ., Natre, 309,763 (1984) المتعلقة بإنتاج جينات الفأر بالإضافة إلى كوازاكي وآخرون )1985( 230,291 Kawasaki, et al., Science, المتعلقة بخلايا الإنسان M-CSF - وثبت وجود عامل نمو في نظام تكوين الدم يسمى بعامل الحفز (hp CSF) لإنتاج خلايا متعددة الفعالية لدى الإنسان ويمكن رؤية هذا العامل في وسط لاستزراع الخلايا cells السرطانية ٠ لمثانة الإنسان ويشار إليها بالرقم 57717 وهي مرسبة تحت شروط صارمة في وسط تزريع تجميعي من النوع الأمريكي Rockville, Md.
As A.T.C.C.
Deposit No.
HTB-9 وقد أفادت تقارير بأن هذا العامل (hpCSF) تمت 4585 من خط هذه الخلايا cells لحفز التكاثر والتمايز بين الخلايا المنتجة متعددة الفعالية والتي تؤدي إلى إنتاج جميع أنواع خلايا cells ٠ الدم الرئيسية في تحاليل واختبارات باستخدام نخاع العظام من LAY المنتجة لدى الإنسان. ولت وآخرون )1985( 1526-1530 ,82 Welt, et al., Proc.
Natl.
Acod.
SCI (USA), . تنقية العامل hpCSF المستخدم : ترسيب 504 (NH4)2 ؛ التصوير الكروماتوجرافي chromatography لعملية تبادل الأنيونات ~DEAE ) anion سليولوز DES2 «cellulose وترشيح الهلام gel "الجل" (عمود (ACAS4 ؛ و18 الطور العكسي لكروماتوجرافيا السائل liquid chromatography عالي الأداء. ١ _ البروتين protein المعرف ب phCSF والذي تم سحبه في الذروة الثانية من ذرتي النشاط في أجزاء الطور العكسي ل HPLC (الكروماتوجرافيا السائل عال الأداء) ؛ فقد ورد عنه أن له وزن جزيئي (MW) يبلغ حوالي ١6060١0 تم تقديره بواسطة دوديسيل كبريتات الصوديوم sodium dodecyl sulphate (SDS) وهلام بولي أكريلاميد (polyacrylamide) (الهجرة الكهربية) (PAGE) والتي تستخدم صبغة الفضة. وقد ورد آنفاً لدى العامل hpCSF نقطة تعادل كهربية © بالإضافة إلى نشاط تفاصلي على أولاً لل 0857م تساوي ,© في خطوط عوامل تكوين نمو الدم لدى الفأر [ولت وآخرون 1526-1530 ,82 Welt, et al., Proc.
Natl.
Acod.
SCI (USA), ا ١
Coo النخاعية وحيدة النواة لدى الفأر cell وفاعلية عالية لتمييز لخط خلية سرطان الدم للخلية ])1985(
WEHI-3B D + [Welte, et al., UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology وتشير الدراسات التمهيدية إلى أن العامل Gale, et al, eds., New Series, 28 (1985) 1 وآخرون الحبيبة خلال الأيام السبعة الأولى cells يتميز بنشاط وفاعلية في إنتاج الخلايا hpCSF المحدد . للإنسان CFU-GM م .من تحليل تم فصله أيضاً عن خط الخلايا السرطائية لمثانة (CSE-B خاص بالإنسان «aT وثمة عامل الإنسان (0179) وقد ورد وصفه كعامل حفزي لأنتاج الخلايا الحبيبية للفأر والمكتسبة بواسطة في علاقة جرعة واستجابة مطابقة WEHL-3BD + cells لتتحد مع الخلايا (G-CSF) 2"! إشعاع (نيكولا وأخرون + 114718 "و (G-CSF) لتلك المستخدمة للفأر غير المكتسب للإشعاع وقد سبق وأن تم [Nicola, et al., Nature, 314, 625-628 (1985)] .])١186( TYA 5ح 1. تسجيل العلامة بين الجرعة والاستجابة لتكون محددة خصيصاً وبمفردها للفأر غير المكتسسب (نيكولا CSF - أو عديد GM-CSF, M-CSF ولا تكون ضمن عوامل مثل G-CSF إشعاع . أو متعددة العوامل (YAAE) 7714 6لا (AY proc, Natl. Acad. Sci. (USA), « وآخرون لأنهما تشترك معها بدرجة CSFS فريدة بين عوامل Lind تعد G-CSF, CSF-B ويشار إلى أن نيكولا وآأخرون .WEHI-3BD + كبيرة في القدرة على التمييز والحفز التفاصلي لإنتاج الخلايا ١ تبركيزات G-CSF وعندما يكون عامل النمو (Y4A£) Av مرخاح (Immunology Today
Nicola, et] (144) عالية؛ فإنه يكون محفزاً لإنتاج خلايا حبيبية ملتهمة جديدة (نيكولا وآخرون مع النتائج الأولية التي تشير إلى ظهور الخلايا الحبيبية وحيدة النواة وخليط al, (1984) supra يوماً من تزريع نخاع ١5 بعد (CFU-GEMM) الحبيبية /وحيدة النواة والمحبة للماء cells الخلايا كعامل حفزي لنمو الخلايا CSF-B وصف Lind وقد ورد hpCSF عظام الإنسان بواسطة © والمتعادلة في تحليل خلايا نخاع عظم الفأر وهذه الخاصية أصبحت بمثابة معيار للتعرف على
G-CSF وبناءً على أوجه الشبه المتقدم ذكرها تم التعرف على العامل (G-CSF العامل بحسياته
+ (عامل حفز لإنتاج الحبيبية (نيكولا وآخرون Nicola, (Y4A0) 174-1757 714 NATURE et al., Nature, 314, 625-628 (1985) . ويبدو من واقع الخواص العامة أن العامل لإنتاج خلايا celss الدم لدى الإنسان CSF-B والتي حددها لنيكولا 146118 وآخرون HPCSF 5 SUPRA العامل المحدد من قبل ولت وآخرون Welte, et, al., supra ٠ هما نفس العامل الذي يمكن تفضيله ولت كعامل حفزي لإنتاج الخاديا ٠ الحبيبية ©000-05. وقد يكون من المرغوب فيه بوجه خاص أن يتم تحديد الصفات والخواص للعامل بالاتحاد بين عناسر مختلفة وذلك like على (hpG-CSF) وإنتاجه ما ورد عن وزره -6) CSF) لدى الفأر على الكبت التام والمنع الكامل لانتشار الخلايا cells السرطانية + WEHL-3BD بحيث تكون في معدلات تركيز عادية وطبيعية للغاية وكذا القدرة المدونة لمستحضرات G-CSF ٠ -للفأر في الحقن على الحد من نقل الليوكيميا leukeminas النخاعية في الخلايا cells المزروعة في الفئران. (ميتكلف والعلوم ¢ 779 و153- Metcalf, Scilnce, 229, 16-22 (YA) YY )1985( أنظر Lad ساشضس الأمريكية 784 )1( 6 46- Sachs, Scientific (Y4A1) £Y American, 284(1), 40- 47 (1986) . وإلى الحد الذي يمكن عنده البرهنة على القيمة الدوائية أو الأهمية العلاجية للعامل (BpG-CSF) ومن ثم إثبات ضرورة توفيره بكميات تجارية فإن من غير ١ المرجح أن تقضي عملية فصل WAY من وسائط الاستزراع المخبري إلى توفير كميات LAS وأن تكون مصدراً للمادة المطلوبة ومن الجدير بالملاحظة على سبيل المثال أن القيود والمحاذير تظهر ضد الاستخدام التجاري لبنك خلايا أورام الإنسان Bio خط الخلايا cells السرطانية لمثانة الإنسان 7797© (A.
T. ©. ©. HTBY) والمسجلة كمصدر طبيعي hpCSF المفصولة لدى ولت وآخرين ٠485 زر سوبرا )1985( Welte, et al., Supra ). أ
د - الوصف العام للاختراع يقدم الاختراع الحالي وصفاً للتشفير التسلسلي الجزئي أو الكلي لسلة متبقيات Daan الأميني amino acid ل 100-0517 ويشتمل ذلك على ما يلي : إدماج الشفرات "كخيار مفضل" للتعديل الجيني genetic باختيار مستقبلات من غير التديات © وإمداد مواقع التكسير بإنزيمات الأندونيوكليز (endonuclease enzymes) وتزويد بسلاسل حمض نووي إضافية أولية ونهائية ووسيطة مما يسهل من بناء حوامل التعديل الجيني 88066. ويوفر الاختراع الحالي أيضاً تشفيراً لسلاسل الحمض النووي للتعديل الجيني الميكروبي لعديدة البيبتيدات Polypeptide المشابهة أو مشتقات hpG-CSF والتي تختلف عن الأشكال الموجودة في الطبيعة من حيث التحديد والمطابقة أو من حيث موقع واحد أو أكثر من متبقيات الأحماض ٠ الأمينية Jia) camino acid شطب المشابهات المحتوية على عدد يقل عن المتبقيات في hpG- [Ser 7] hpG-CSF Jia CSF حيث يتم بتعديل واحد أو أكثر من المتبقيات بأخرى. والمشابهات الإضافية؛ وحيث يضاف واحد أو أكثر من متبقيات الأحماض الأمينية amino acid إلى الجزء النهائي أو المتوسط من عديد البيتيدات (Polypeptide والذي له نصيب في جزء أو جميع خواص التكوينات الطبيعية . وتشتمل التسلسلات الجديدة للحمض النووي بموجب هذا الاختراع على سلاسل مفيدة في تأمين التعديل الجيني genetic للخلايا البكتيرية المستقبلة (eukaryotic) of (Procaryotic) لمنتجات عديد البيتيدات Polypeptide والتي لها على الأقل جزء من التكويني النباتي وواحد أو أكثر من واحد من الخواص البيولوجية للعوامل الحفزية لإنتاج الخلايا cells الحبيبية متعددة الفعالية الطبيعية. وتحديداً تشتمل (سلاسل DNA لهذا الاختراع على : ٠ أ- سلسلة DNA الموضحة في شكل (؟) و (©) أو الشرائط المتممة لها.
- A= على نحو ما ورد hybridization (تحت ظروف تهجين hybridizes المهجنة DNA ب- سلسلة أو )١( في شكل DNA شرحه تفصيلاً هنا أو في ظروف وشروط أكثر تحديداً) إلى سلاسل . أجزاء من ذلك المصدر في DNA يجب أن تهجن إلى سلاسل genomic والتي لانحلال الشفرة الجينية DNA ج- سلسلة
Polypeptides شكل (7). وتحديداًء يشتمل الجزء (ب) على التشفير التسلسي لعديد الببتيدات ٠ وهي سلاسل الحمض النووي والمنطوية amino acid والتي لها نفس ترتيب الحمض الأميني والأصناف الأخرى لعامل حفز نمو hpG-CSF على عوامل وراثية في أشكال متقاربة التتوع من الحبيبية متعددة الفعالية للدم في الثدييات وخصوصاً الواردة منها في الجزء (ج) cells الخلايا لمشابهات أجزاء من 100-057. حيث hpG-CSF (encoding) والتي تكون التشفير التسلسلي إلى المستقبلات الميكروبية. RNA تربح تشفيرات سلاسل الحمض النووي لتسهيل ترجمة الناقل ٠ طلب PCT ويمكن بناءً على مثل هذه السلاسل المصنعة مخبرياً حسب طريقة ألتون وآحرين ٠ Alton, et, al., PCT published application WO No. 83/04053 £ +o ¥/AY WO النشر المضمنة في التشفير polypeptides ويشتمل الاختراع الحالي على نوع من عديد الببتيدات للإنسان أو سلاسل CDNA التملسي للحمض النووي المكمل للشريط العلوي من الحمض النووي بطريقة أخرى "المتهم المكمل A أو V لعوامل الوراثة الواردة في الجداول DNA الحمض النووي ١
Tramontano, et al., المقلوبة" كما وصف بواسطة ترامونتانو وآخرين proteins للبروتينات - Nucleic Acids Res., 12, 5049-5059 (1 984) في صورة نقية ومنفصلة تمتلك polypeptids يقدم الاختراع الحالي منتجات تمديد الببتيدات جزء من أو كل التكوينات البنائية الأولية (بطريقة أخرى ترتيب مستمر في متبقيات الأحماض وواحد أو أكثر من الصفات الحيوية (مثل الخواص المناعية وفي خارج (amino acid الأمينية ٠ hpG- الوزن الجزيئي) ل Jie) الجسم الحي والفاعلية الحيوية). والخواص الطبيعية الفيزيائية
— !و - CSF الطبيعية والمشتملة على تنوعات متقاربة من ذلك المصدر. وتتميز عديدات الببتيدات polypeptides المذكورة بإنتاج الخلايا البكتيرية bacterial cells المستقبلة (prokaryotic) cucaryotic J مثل البكتيريا bacterial أو الخميرة أو الخلايا المزرعة وخلايا الحشرات والنباتات بسلاسل الحمض النووي الخارجية التي يتم الحصول عليها بالعوامل الوراثية أو 0178 أو oo بواسطة تخليق الجين 0880005»©. وإن نواتج الخميرة (مثل سكاروميسيس سرقيسيا (Saccaromyces cerevisiae أو الخلايا البكتيرية المستقبلة Jia) (Procaryotic) ايسشيريثبا كولي (Escherichia تكون حرة وغير متحدة مع بروتينات Proteins الثديات. أما منتجات التعديل الجيني genetic الميكروبي للفقاريات مثل (الطيور- الثدييات غير الإنسان) فتكون حرة وغير متحدة مع أي بروتين Protein آدمي. Bly على المستقبل المستخدم ؛ فإن عديد الببتيدات polypeptides ٠ لهذا الاختراع قد تحدث له عملية جليكوزيلين (glycosylated) مع القدييات أو كربوهيدرات (carbohyrated) أيوكربوتيك (الخلايا البكتيرية المستقبلة الداخلية (eucaryotic) أخرى أو قد تكون غير - جليكوزيلين (glycosylated) . وتحتوي عديدة الببتيدات Polypeptides لهذا الاختراع على متبقيات حمض الأمينو ميثونين الأولي (عند الموضع (methionine )١- ٠ amino acid) Vo يشتمل هذا الاختراع أيضاً على التركيبات الدوائية المشتملة على كميات فعالة من منتجبات عديدة الببتيدات polypeptides لهذا الاختراع مع مواد تخفيف مناسبة ومساعدة و/أو حاملات مفيدة في hpG-CSF العلاجي . ويمكن 'تصنيف" منتجات عديدة ببتيدات polypeptides لهذا الاختراع بواسطة المواد المعلمة التي يمكن الكشف عنها بالإشعاع (مثال ذلك PT المشع) لإعطاء مواد مفيدة في التقدير والتعين © الكمي ل hpC-CSF للإنسان في الأنسجة الصلبة والعينات السائلة مثل الدم أو البول. كذلك؛ يمكن أن تصنيف منتجات DNA لهذا الاختراع بواسطة علامات كاشفة (مثل المواد المشعة والنظائر غير المشعة مثل البيوتين (biotin) كما تستخدم في عمليات تهجين hybridization
.و١ - DNA (الحمض النووي) لتحديد موصع جين hpG-CSF (gen) للإنسان أو أي موضع يتعلق بخريطة الكروماسومات chromosomal map . وقد يستخدم هذه المنتجبات أيضاً لتحديد الاضطرابات وأوجه الخلل الوراثية المرتبطة بالعامل 106-0517 عند مستوى DNA ويستخدم كعلامة جينية genomic لتحديد الجينات المجاورة وأوجه الخلل بها . وقد تكون منتجاتن عديد الببتيدات polypeptides للاختراع الحالي مفيدة على إفرادها أو باتحادها مع عوامل نظام تكوين الدم أو أدوية لعلاج حالات عدم الانتظام في تكوين الدم مثل الإنيميا anemia عديمة الحيوية كما أن المنتجات قد تكون مفيدة في علاج العجز في نظام تكوين الدم من خلال المعالجة الكيميائية أو من خلال المعالجة الإشعاعية . وعلى سبيل المثال فإن عملية وزراعة نقل نخاع العظام تزداد احتمالات نجاحها عند استعمال 100-057 ؛ فضلاً عن ٠ هذا فإن Hill) جروح الحروق وعلاج الالتهابات البكتيرية) وتطبيق واستعمال 106-057 قد يكون مفيداً أيضاً في علاج اللوكيميا gla yu) leukeminas الدم) بناءً على القدرة على تمييز خلايا اللوكيميا leukemic cells ولت وآخرون Proc.
Natl.
Acod.
SCI (USA), ملة Welt, et )1985( 1526-1530 ,82 وساش Sachs, supra - ويمكن أن تتضح العديد من المظاهر والمميزات لهذا الاختراع في الوصف التفصيلي الذي 16 يصور ويجسد استعمالات وتطبيقات الاختراع في أمثلة استخدامها المفضلة حالياً . شرح مختصر للرسومات : الشكل )١( عبارة عن خريطة إنزيم enzeme تجزئة لحمض جزئياً للمورث hpG-CSF المصحوب بصفوف (8p لإستراتيجية الترتيب للحصول على سلسلة العوامل الوراثية . الأشكال من (7) إلى )٠١( عبارة عن سلاسل DNA وفقاً للاختراع . 7
١ ١ -— _ الوصف التفصيلي : طبقاً للاختراع الحالي فإن التشغير التسلسي الجزئي أو الكلي لسلسلة عديد بيتيدات polypeptides لل hpG-CSF قد تم فصلها وتميزها . وقد يتم تقديم الأمثلة بطريقة من خلال إبقاء الضوء على مصور الاختراع هي مواجهة oo تحديداً نحو الخطوات والإجراءات التمهيدية المتحدة المترتبة على هذا التعرف والتعيين ونحو ترتيب التسلسل وتطور النظم المعبرة المبينة على cDNA « ومجموعة العوامل الوراثية أو الجينات المصنعة (مخبرياً) وإثبات التكوينات البنائية للعامل hpG-CSF والنتائج المشابهة في هذا النظام وأمثاله . وعلى الأخص ؛ فإن المثال )١( موجه إلى ترتيب الحمض الأميني amino acid ل hpG- CSF. . مثال ) Y ( : موجة نحو تحضير (DNA للفحص الجماعي للتهجين hybridization وإنتاج الخلايا المهجنة. مثال )9( : يتعلق بشكل مجسمات hybridization probes وحدات فحص بنائية التهجين -hybridization Vo مثال ) ¢ ( : يتعلق بالفحص الجماعي والفرز للتهجين hybridization ومطابقة المجموعات الموجبة وسلسلة الحمض النووي DNA لمجموعة cDNA (clones) المستسخة الموجبة وتوليد التكوينات البنائية الأولية لعديدات ببتيدات polypeptides (ترتيب الأحماض الأمينية ٠ (amino acid مثال )0( :
موجه إلى التعرف على التشفير التسلسلسي لمجموعة العوامل الوراثية المشفرة 100-087. وتحديد التسلسل لتلك العوامل . مثال 1( :
موجه إلى التشفير التسلسلي وتصنيع hpG-CSF حيث تستخدم E.coli .
مثال (V) : موجه لخطوات بناء E.coli ناقل مريح مع Jalal مع hpG-CSF مع DNA استعمال الناقل في إنتاج الخلايا البكتيرية المستقبلة والقابلة للتعديل مع 100-057 ولتحليل خواص نواتج الاتحاد
الجيني genetic لهذا الاختراع .
مثال (A) : 1 موجه إلى خطوات إنتاج مشابهات للعامل 000-088 حيث يتم تبديل متبقيات حمض السيستين cysteien acid بمتبقيات حمض أميني آخر بواسطة الطفرة التي تظهر على تسلسل
الحمض النووي DNA في hpG-CSF والتشفير التسلسلي لهذا العامل .
مثال (6) : موجه لخطوات بناء مشتقات الناقل المشتملة على العامل hpG-CSF والترميز التناظري في ١ الحمض النووي المشتق من مجموعة خلايا cDNA الموجب واستخدام الناقل Jail خلايا COS-1
. بالتزريع cells : )٠١( مثال أو منتجات عديد بيتيدات physical and biological يتعلق بالخواص الفيزيائية والبيولوجية . 5م17 المتحدة مرة ثانية وفقاً لهذا الاختراع
y _ \ —- مثال ١ أ- ترتيب المادة بأساليب المسح الأدبي . يتم الحصول على عينة -١( ؟ ميكرو جرام نقية بنسبة 796-48 لل SDS صبغة الفضة (page — من hpG-CSF من معهد سلوان كيتلينج ¢ نيويورك» نيويورك (Sloan Ketering New م York, NY.) وتفضل وتنقى كما ورد في طريقة ولت وآخرين « Welt, et al, Proc.
Natl. -Acod.
SCI (USA), 82, 1526-1530 (1985)
إن تسلسل الحمض الأميني amino acid المنتهي ب العينة للعامل 106-051 يتم تحديده في عملية تشغيل #1 Run بتحليل ذي تسلسل مصغر باستخدام وحدة تسلسل مراحل الغاز 434078 gas phase (النظم الحيوية التطبيقية مدينة «jiu gb كاليفورنيا (Foster City, Calif للحصول على
معلومات عن التسلسل على نحو ما ورد في الجدول ١ أدناه. وفي الجداول من ١ إلى 4؛ تستخدم الرموز أحادية الحروف (المكونة من حرف واحد) Cua أن "72" Jia المتبقيات التي تم تحديدها بطريقة واضحة (غير غامضة) في حين أن المتبقيات بني الأقواس تم تحديدها وتخصيصها بطريقة تبادلية أو تقريبية وتجربية . ١ : > : ا "0 جدول أ 5 0 10 5 1 K-P-L-G-P-A-5-K-L-K~Q- (G,V,5)=6-L-X-X-X . كانت هنالك خلفية واضحة موجودة في كل حلقة من حلقات التشغيل التعاقبي الذي Cand عنه النتائج المسجلة في الجدول )١( والتي تشير إلى أن العينة تحتوي على العديد من الشوائب والعناصر المفسدة للخلايا cells والتي قد تكون في شكل متبقيات كيميائية من عملية التنقية والتسلسل محفوظ للاستخدام كمرجع فقط . في التشغيل رقم 7 #2 Run تم الحصول على العينة
Run#l الثائية ( ه-1 ميكروجرام - 790 نقاوة) من سلوان كينبرينج على غرار ما تم في x.
١ ¢ — _ وخطوات التسلسل أيضاً كما ورد في الشكل 4 )4 (FIG. لولت ؛ وآخرين Welt, et al., Proc. Acod.
SCI (USA), 82, 1526-1530 (1985) .11811. يشتمل جدول ١١ على النتائج . جدول (Y) 20 10 .5 01 (R)=(L)=x~ اسار -M~ (M) =X-K~ )5( حو طحا (3) وجي -1-9-2-ط17 ااا وبرغم أنه تم تحديد المزيد من المتبقيات أكثر فإن التشغيل رقم #2 JRun يقدم تسلسلات بأطوال كافية وغير غامضة تمكن من بناء العدد الكافي من المجسات ليحث تسلسل الحمض التووي DNA والعامل 100-051 وحيث تم حسابه ما تقدم فانضم أنها ينبغي أن لا تقل عن ٠74 مجسماص (Probes) الجديد الأدنى المطلوب لعملية فصل تسلسل الحمض CDNA ٠ بناءً على الترتيب في الجدول 7 ومرة أخرى يعتقد أن AE تكمن في تلوث العيئة ٠ ly, على ذلك تم الحصول على العينة الثالثة (7- © ميكروجرام نقاوة بنسبة ¢ 450 7) وذلك من سلوان كبينرينج Sloan Kettering كما ورد أعلاه. وقد تم هذا الترتيب كهربائياً بعد الفصل عن طريق SDS- PAGE في محاولة لتحقيق المزيد من النقاوة (الحلو من الشوائب) يبدان التحليل التسلسلي لهذا العينة لم يسفر عن أي معلومات . ب- ترتيب المواد بواسطة طرق التنقيح/ الأساليب المنقحة للحصول على كمية كافية من المادة النقية اللازمة لإجراء تحليل صحيح ودقيق لسلسلة الأحماض الأمينية amino acid فقد تم الحصول على خلايا من مثابة مصابة بالسرطان خط الخلية 0177 de gana) الخلايا الفرعية (1A6 المنتجة حسب سلوان كبتيرينج Sloan Kettering وذلك من الدكتور/ إي - بلاترين E.
Platzer . في البداية تم توزيع الخلايا في hwy 1560765 GIBCO) ٠ ؛ ايسلاتدا ر نيويروك (Grand Island, N.Y في دوارق/ زجاجات تحتوي كل واحدة
و١ - منها على 775 من وسط Tscove's المكيف تحت CO, 75 تنمو الخلايا طوال الليل عند YY درجة مئوية عند ١,“ لفة في الدقيقة . تم غسل وتعقيم حبيبات Cytodex-1 (فرمسيا Pharmacia ¢ أو بسالا Uppsala » السويد (Sweden بإتباع الخطوات التالية :-
° تم وضع A جرام من الحبيبات في زجاجة وأضيف إليها 5086 مللي لتر من PBS تحول الحبيبات في محلول عن طريق تدويرها برفق لمدة ؟ ساعات وبعد أن يسمح الحبيبات بالترسيب ويزال PBS وتغسل الحبيبات في PBS ويضاف PBS آخر. تعقم الحبيبات بالبخار لمدة ١١ دقيقة وقبل الاستعمال تغسل في وسط Iscove's مع 7٠ من FCS للحصول على الحبيبات المعالجة.
بعد ALY) الكل ماعدا Yo مللي لتر من وسط المعالجة بكل زجاجة ؛ يضاف ١ مللي لتر
. و40 مللي لتر من الحبيبات المعالجة إلى الزجاجات 708 77٠١0 من الوسط المهجن حديثاً مع ٠ وتزال الفقاعات عن طريق الشفط . توضع co, 75 ويتم تمرير الغاز 885560 في الزجاجات ساعة قبل تقليل السرعة /١ الزجاجات في حامل دوار بمعدل ؟ دورات في الدقيقة وذلك لمدة . دورة في الدقيقة ١7 إلى
وبعد ثلاث ساعات يضاف دورق آخر trypsinized لكل زجاجة مستديرة تحتوي على
vo الحبيبات وعند الوصول على 745٠0 إلى 75٠ من الجبمع تغسل الخلايا المزروعة داخل الزجاجات بواسطة ٠ مللي لتر من PBS ويتم تدويرها بعشر دقائق قبل إزالة -PBS وتزرع الخلايا cells لمدة A ساعة في وسط تزريع Iscove's) المحتوي على FCS 74,Y «
هيدروكورتيزون 4-٠١ hydrocortisone مولر ¢ oY مولر جلوتامين ٠٠١ glutamine وحدة/
مللي لتر بنسيلين Penicillin و١٠٠ جرام/ مللي لتر ستريبتوميسين Jug (streptomycin بعد
ذلك حصد المزرعة بواسطة القوة الطاردة المركزية عند 9000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة
ويحفظ عند - 7١ مثوية. يعاد تغذية المزارع من خلال الوسط A المحتوي على 7٠١ من FCS
١١ - - وتزرع لمدة £4 ساعة في ذات الوسط. وبعد إخلاء الوسط وإزالته تغسل الخلايا بواسطة PBS على نحو ما ورد أعلاه وتزرع لمدة 8؛ ساعة في الوسط م ثم يعاد حصد الصافي ويعالج كما تم وصفه آنفاً .
يتم تركيز حوالي "٠ لتر من الوسط المكيف بواسطة خلايا 18:0 بحيث يكون التركيز ٠ بمعدل AY بوحدة المللي بوربليكون 76111600 المجهزة بعدد ؟ كاسيت يبلغ وزنها oat ٠ وحدة عند سرعة ترشيح تصل إلى ٠٠00 مللي/دقيقة وعند سرعة تجريبية بمعدل ٠٠٠١ مللي لتر/ في الدقيقة الواحدة .ويتم ترشيح المركزات ترشيحاً ثنائياً بواسطة ٠١ لتر من ٠٠ مللي مولر التريس )7.8 (pH باستخدام نفس الجهاز ونفس معدلات السرعة. ويتم تحميل التركيزات المرشحة بمعدل Ma 5٠0 لتر في الدقيقة الواحدة على عمود —DE سيللوز ١ cellulose لتر ٠ مضبوط في © ملي مولر تريس (7.8 (pH . وبعد التحميل يغسل العمود بنفس السرعة بواسطة ١ لترمن ٠٠0 مللي مولر تريس )7.8 (pH ثم بواسطة AY من aoe لتر Ase تريس (PH (7.8؛ وبواسطة ٠*١ مللي مولر من كلوريد البوتاسيوم NaCl وبعد ذلك يشطف العمود بترتيسب تسلسلي بواسطة ست محاليل بمقدار لتر واحد من 00 (Ma مولر تريس (PH 7.8( Tris على أن تشتمل على التركيزات الآثية من كلوريد البرتاسيم NaCl ذا .١ف AYO بق ٠٠١ Very ١ ملي مولر . ويتم تجميع الأجزاء *٠ ملي لتر وتركيز الأجزاء الفعالة إلى معدل 10 مللي لتر على مرشح Amicon مزود بغشاء 7145 . ومن ثم فإن هذه التركيزات تحمل من عمود 4 على ١ لتر مرشح جل معاير في PBS . ويتم تشغيل العمود بمعدل 880 مللي لتر في الساعة. ويجمع ٠١ أجزاء من المللي لتر. أما الأجزاء الفعالة فإنها تجمع وتحمل مباشرة على
عمود 4© HPLC الكروماتوغرافي السائل Me الفعالية . Ye وتم تحميل عينات ؛ تتراوح من حيث الحجم بين ١7694 مللي لتر و٠ 85 مللي لتر وتحتوي على AY مللي جرام من البروتين «Protein يمثل حوالي 7٠١ من JS منها hpG-CSF حيث يتم التحميل على عمود بسرعة سريان تتراوح من ١ إلى ؛ مللي لتر في الدقيقة. وبعد التحميل
١ - - والغسيل الأولي بواسطة ١.١ مولر اسيتات الأمونيوم (pH 6.0-7.0) ammonium acetate في ZA 7- بروبانول Propanol -2 عند سرعة سريان /١ مللي لتر/ دقيقة يتم جمع الأجزاء ١ مللي لتر لكل جزء يتم الكشف ومراقبتها بالنسبة للبروتين Protein عند 71٠ 7١ و7080 نانوميتر .
5 ونتيجة لعملية التنقية يتم الفصل بين جزيئات تحتوي على hpG-CSF (كأجزاء VY 5 VY من٠8) وتميزها بوضوح من الأجزاء المحتوية على البروتين Protein . ويتم عزل hpG-CSF Te 0-١5١( ميكرو جرام) بدرجة نقاوة تتراوح بين 70-48 بناتج يبلغ حوالي ٠ 75 . من هذه المادة النقية تستخدم 9 ميكرو جرام في عملية المعالجة #4 Run عملية تحليل سلسلة متبقيات الأحماض الأمينية amino acid حيث تستخدم عينة البروتين Protein داخل قرص ألياف زجاجية
٠ يتم تنتشيطها عن طريق - TFA بدون بولي برين ©20170©0. ويتم تحليل التسلسل بواسطة وحدة ترتيب متسلسل AB 470A طبقاً لطرق هيويك وآخرين Hewick, et al., J. جريدة الكيمياء الحيورية (You 1460لا لاحل (VAY) ولأي ١-147 «VY Anal.
Chim.
Acata .)١ 4 ناتج #4 Run يظهر في الجدول (؟) ٠ 8 : 0 3 1000 جدول )7( Thr - 'Pro = Leu - Gly - Pre - Ala - Ser = Ser - Leu - Pro- Gln - Ser - Phe - Leu - Leu - Lys ~(Lys)- Leu =(Glu)-. Glus \o ا | 2s oo oo Co "م 0 Gly - Val - Gly = Ala - Ala- -(ج61)- val - ‘Arg - Lys = Ile ) ox oxo وفي عملية المعالجة #4 Run بعد YY دورة (لما يعادل متبقيات جدول ؟) لا يتم الحصول على أي معلومات ذات أهمية عن الترتيب التسلسلي لسلسلة المتبقيات . وللحصول على ترتيب تسلسي أطول وغير غامض في عملية المعالجة #5 Run ؛ يتم تخفيض VE ميكروجرام من »| ©00-05م تمت تقنيتها من وسط ملائم ويتم اختزالها بواسطة ٠١ ميكرولتر من بيتا- ميركبتو إيثاتول mercaptoethanol -8 لمدة ساعة عند )£0 درجة مئوية وتحت وحدة تجفيف خوائية.
A —_ \ _ وبعد ذلك تذاب بقايا البروتين Protein مرة أخرى في 725 من حمض الفورميك formic acid قبل الاستعمال في قرص الألياف الزجاجية بولي برينيزيد .Polybrenized glass يتم إجراء تحليل تسلسلي على غرار ما تم في عملية المعالجة #4 Run أعلاه يشتمل الجدول ؛ على نتائج عملية المعالجة #5 Run . ل ا ا لها اا 1 م جدول 3 ( . Pro =-Ala ~ Ser - Ser = Leu = pro ا “ahr = Pro - Leu — Gly A : 5ه ا : Ser - Phe = ‘Leu = Leu - Lys = Cys = Leu - Glu = Gar - مد val - Arg - Lys = Ile'= Gln = Gly = hsp - Gly - Ala = Ala = 0 07 0 اث لوو TET Lew - Gla 2 Phe - Lys - Leu = Gly - Ala = Thr - Tyr = 06 © ا ا oo Cas ‘Val - Phe - Ser - Thr - (Arg) - (Phe) - (Met) —X- إن سلسلة متبقيات الحمض الأميني amino acid الواردة في جدول ؛ غير غامضة وذات ٠ طول يبلغ )£8 متبقية) وهو طول يكفي لبنتاء مجسمات للحصول على hpG-CSF cDNA كما ورد Adding . مثال ؟ تشتمل الخطوات القياسية Jad سلسلات الحمض cDNA على تحضير مجموعة سلسلات حاملة للبلازميد بورن cDNA libraries’ المشتق من النسخ العكسي لل mRNA في الخلايا cells ١ المائحة والتي يتم انتخابها على تعبيرها عن الاتتقال الجيني genetic المقصود . وعندما تكون الأجزاء الكبرى لسلسلة متبقيات الحمض الأميني amino acid لعديد البيتيدات Polypeptides معروفة ومصنفة ‘ يمكن استخدامها تسلسلات فردية ذات شريط واحد لفحصض الحمض التووي DNA بمضاعفة السلسلة المستهدفة زوجيا في الحمض النووي ¢ وقد يستعمل تسلسل الحمض النووي cDNA في عمليات تهجين DNA/ DNA hybridization المطبقة ٠ - الوحدات المستنسخة من cDNA التي ثم تغيير طبيعتها إلى شكل شريط مفرد . ويسمان وآخرون
- ١
Nucleic Acids Res البراءة الأمريكية رقم 7944857 ولاسي وآخرون Weissman, et al,
Proc. Natl. Acad. Sci. Reyes, وريس وآخرون (VV) YooV © 47,1 Wallace, et al,
Jaye, et وجاي وآخرون (VAAY) YYVE=TYVE —YYV. V4 et al, Reyes, et al., (USA), انظر أيضاً البراءة الأمريكية رقم L(YAAT) 77305 - 778,11 al, Nucleic Aciids Res. فهي فعالة (hybridization) بالنسبة لخطوات تهجين Falkow, et al., لفالكو وآخرون €¥oAoye © كتيب الهندسة الوراثية ؛ الجينات البكتيرية Davis, et al, في التشخيص ودافيس وآخرون
N.Y. Cold ؛ كولد سبرينج هاربر Cold Spring Harbor المتقدمة معمل كولد سبرينج هاربر المتعلق بالمستعمرات وتنقية ١71-١74 ؛ OA —00 عند صفحة (149A) « Spring Harbor التتهجين hybridization . ١ يستخلص كل RNA من حوالي ١ جرام من cells LOAN في سلسلة خلايا سرطانية بالمثانة (1A6) ©77 وذلك باستخدام خطوة الجوانيد بنيم ثيوسينات 1106770316 guanidinium للفصل الكمي RNA . [شير جوين وآخرون ..1ة © Chirgwin, ¢ الكيمياء الحيوي 4,18 874- 2794]. ويحتوي محلول RNA المائي المعقم على كل RNA من خلايا 186 . للحصول على RNA الناقل فقط من محلول RNA الكلي يتم تمرير المحلول في عمود يحتوي على أوليجود يؤكسي - ١٠ ثيميديليت oligodeoxy-thymidylate [oligo(DT)] (بحث متكامل ؛ ولثام ¢ مسائوسيتس Inc, Waltham عديد الأدينيليت Poly-Adenylated (Poly- A+) يتتبع خواص ma إلى الناقل الذي يلتصق بالعمود بينما يشطف RNA إلى ريبوسوم ribosomal ونتيجة لهذه الخطوة فإن حوالي ٠ ميكرو جرام من البولي ادينيليت RNA Poly-adenylated الناقل يتم فصله (Poly-A+ mRNA) البولي - RNA A+ إلى الناقل المفصول يعالج عن طريق بهيدروكسيد مثيل الزئثبق (Alpha Ventron, Danvers, Mass.) methylmercury hydrocide ٠ عند التركيز الأخير ؛ مللي مولي لمدة © دقائق عند درجة حرارة الغرفة مثل استعمال في تفاعل CDNA المعالجة بواسطة هيدروكسيد ميثيل الزئبق methylmercury hydrocide تفسد RNA الناقل في نفسه ومع جزيئات
ءا - التلوث والتي تثبط عملية النقل. بيفي وآخرون J.
Biol.
Chem. ملم Payvar, et فت 1171 ١4 ) 727 ( . طبقاً لطريقة أوكاياما (أوكاياما Okayama, et al., Molecular and Cellular (ys als )١1187( 177 111 7 Biology تم dae) بتك cDNA باستخدام mRNA الذي تم الحصسول © عليه من خلايا 186 المحمولة cDNAs بالتحضين إلى عائل للكائنات الدقيقة E. coli K- 113101 2 للتكبير . مثال )١( : إن مجسمات التهجين hybridization المصممة بناءً على ترتيب سلسلة الأحماض الأمينية ونع amino النهائية في phG-CSF الواردة في الجدول ؛ تحتوي على YE أوليجو نيكلوتين oligonucleotides ٠ بكل منها YY قاعدة في الطول وتحتوي على ثلاثة من متبقيات أينوسين ٠ 68 وصنع الأوليجو نيكلوتين oligonucleotides المجسات بطريقة كاثير ¢ وأخرين Caruthers, et al. الهندسة الورائية فى اح YA ) 7 ويتم Leas بواسطة ATP ,32 باستخدام البولي نيكلوتيد كينين .Polynucleotide kinase يلقي الجدول رقم 0 الضوء على (probe) الأوليجو نيكلوتيد oligonucleotides المجس المعادل الناقل من 0-77 ؟ للسلسلة الواردة Vo في الجدول .+ جدول ه: 000 © Sn hpG-CSF Probes Cm Cr ‘ 0 0 . ٍ ا ge 16¢ rec Arc rec Ere Sar Err '5' ST Tr Tr إن عملية التعادل ل Is تمت بناءً على العمل المنشور (تاكاشي وآخرزن Takahashi, et Y1. J. al, proc.
Natl.
Acad.
Sci (USA) ٠٠ ¢ ماحم AS) 4). ومع ذلك فإن الإينوسين
vy - - 68 قد يكون ذا تأثير يفضي إلى عدم الثبات إذا تمت مزاوجته مع 6 أو 1 . وفي تاكاشي وآخرون Takahashi, et al., قد يكون كمجموعة مقارنة للتعادل للإينوسين 5 تأثير متعادل لأنها تميل إلى التعامل (أي ثلاثة يفضلون المزواجة مع oF واثنين لا يفضلون المزواجة مع 7) لفحص تأثير الحصول على قاعدة 15 متزاوجة مع Gs يتم تصميم تجارب ضابطة ه محكمة باستخدام التسلسل الجيني N-myc (genetic) والاستنساخ . وأن السلسلة التي يتم الحصول عليها من جين Nemye (gen) يكون لها نفس المحتوى 6 و © في الموضعين الأولين من كل كودون codon كما وصف في مجسات hpG-CSF . ولذلك كانتت مجسات الفحص N-mcy كمجسات hp-GCSF سواء بسواء من حيث الطول I's والأماكن الوجود متوسط الجهد Tm (77- YA she 7 تشتمل عملية عدد ؟ أو ؛ متبقيات إينوسين ٠ (inosine ٠١ وتم تصميم مجموعتين من مجسات فحص N-mye لطريقة كروثيرس وآخرون سوبرا Caruthers, et al., supra. كما هو موضح في الجدول + والمشتمل على : Yoemer YYW oY استبدال الموضع الثالث في ¥ C's بواسطة I's يعطي أسوء احتمال استبدال الموضع الثالث في ؛ © بواسطة 18 . أما المجموعة الثانية من مجسات الفحص فقد تم تصميمها لتمثل التوزيع الأكثر عشوائية لقاعدة الإينوسين 10051065 المزدوجة والتي قد تعطي قاعدة عامة متعادلة ذات ١ تأثير مزدوج . أن 586:11 كما هو موضح في جدول ١ . ؛- تحتوي على اثنين I's مزدوجين مع 05 وواحد مع © =o تشير إلى ؛ مع واحداً 6 :1 قاعدة مزدوجة REE . N-myc Test Probes جدول 1 ) 5'cAc AAC TAT Gee Gee ccc cc ccd’ .1 Gee cr ©: cit جه جف Seac AAC .2 أ جح Ee 5 "CAI AAC TAT GCI Gee cer er 5'aac cas £76 7 csc AGT ccz 93 . ب الام | cre TGI GGC AST cer د ' 525 ل
ال تم تسخين خمسة مرشحات استتساخ منطوية تحتوي على سلاسل الحمض النووي 096 DNA وسلاسل الحمض النووي DNA لهرمونات نمو الدجاج (كتحكم سالب) بموضعها في فرن مفرغ من الهواء (خوائي) لمدة ساعتين عند Av درجة مئوية قبل عملية التهجين -hybridization وتم تهجين hybridization جميع المرشحات على نحو ما ورد في مثال ؛ مجسات hpG-CSF م باستثناء مدة التهجين hybridization التي كانت ست ساعات . ويتم غسل (المرشحات) الفلاتر ثلاث مرات عند درجة حرارة الغرفة عند £0 درجة مئوية ٠١ دقائق لكل منها توصل المرشحات بعداد جيجر للمراقبة والرصد . يلاحظ أن المرشح الذي يمثل Nemye ¥ صدرت عنه إشارة ضعيفة بالنسبة للفلاتر الأربعة الأخرى ولم يتم غسله بعد ذلك . بعد غسيل لمدة ٠١ دقائق عند درجة حرارة تبلغ 5٠0 درجة .1 مثوية. أعطى عداد جيجر إشارة بالنسبة المئوية التالية للمجس الأول المعادل بطبيعته إلى نسبة : مجس 77,٠١ ؛ مجس ؟ de) درجة حرارة £0 مئوية) 77 مجس 754,17 ؛ مجبس 0,70 وبعد الغسيل عند 00 درجة مئوية؛ فإن النسبة المئوية كانت على النحو التالي : 77,16 مجس 4 6 7٠٠0 مجس Wl 75,8 ٠ الغسيل النهائي عند في حرارة تبلغ ٠ مثوية فقد أسفر عن النسب التالية : مجس 7 : 71,1 مجس 754,90 ؛ مجس 78,70 . وعليه في وجود ثلاثة T's كما في المجسات 7و؛ ؛ يلاحظ وجود اختلاف في الإشارة يصل إلى نسبة -7١0 ضعفاً T's ) Tr لا يؤخذ في الحساب) يميل إلى [حالة سيئة لازدواج القاعدة ١ (مجس )١ وحالة الازدواج قاعدة متعادلة ١ (مجس 4) ] ٠ إن المعلومات التقنية القياسية التي تم الحصول عليها عن طريق تهجينات hybridizations اختبار N-mey تستخدم في الغسيل كما تستخدم كمرشد لتهجين hpG-CSF hybridization كما x. هو موصوف أدناه وذلك لحساب درجة الثقة التي يمكن بها تقبل النتائج للغسيل غير المحكم. وعليه في وجود ثلاثة (I's) ؛ على غرار ما في المجسين 7 ؛ ؛ يلاحظ هناك اختلافاً في الإشارة
سرب - يصل إلى ما مقداره lia ٠١ عند الاقتراب من حد TM النظري (مع مراعاة عدم تضمين I's في عملية الحساب) وذلك [بناء على أسواً حالة مزواجة للقاعدة ١ (المجس lay (Y مزواجة متعادلة نسبياً (المجس 6)] . مثال ¢ ° طبقاً لطريقة هانهان وآخرين Hanahan, et al., J.
Mol,. Biol., (الأحياء الجزيئية) ©0V, V1 (VIAY) 0A. — يتم إدخال بكتريا تحتوي على عناصر متحدةمع مدخلات CDNA محضرة حسبما ورد في مثال ¥ ويتم توزيعها ونشرها مرشح على YE نيترو nitrocellulose jl ssl أخرى (Millipore, Bedfrom, Mass.) محملة على ألواح أجار . وبعد ذلك يتم تحضين الألواح للحصول على نحو 50000 سلسلة من وتوضع على ألواح لمضاعفتها YE فلتر آخر من ٠ النيترو سليولوز nitrocellulose . تحضن الألواح حتى تظهر السلسللات الجديدة وتتضح معالمها. يتم Ji البكتيريا الموجودة على المرشحات بحيث تضع على ورق الوتمان (Whatman) مقاس © مللي متر المشبع بهيدروكسيد الصوديوم sodium hydroxide )0,+ مولر) وذلك لمدة ٠ دقائق يلطف بعدهل بواسطة تريس ١( مولر) لمدة دقيقتين ويلطف بعد ذلك بتريس Tris )0,+ مولر) يحتوي على كلوريد البوتاسيوم (NaCl) )1,0 مولر) لمدة ٠١ دقيائق أخرى. عندما ١ تصبح المرشحات شبه جافة ؛ يتم تجميعها لمدة ساعتين عند Av درجة مئوية في فرن (خوائي) مفرغ من ol sell وذلك قبل تهجين الحمض النووي [ وال وأخرون Proc.
Natl. ملة Welt, et (USA) [Acod.
SCI حلت هت )٠974( FIAY ومنياتس وآخرون Maniatis, et al, Cell (VAY) VAY AY وتتم عملية تهجين hybridization أولي للمرشح لمدة ساعتين بحرارة تبلغ 65 درجة مئوية © في Vou مللي لتر من SDS 75,7 106 Denhardt's و 6X SSC . ويتم شطف المرشحات في SSC 376 ثم يوضع كل أربعة منها في حقيبة ويتم تهجينها لمدة ١6 ساعة في 62550 و 1036
vs — 05 . هنالك حوالي Yo مللي لتر من المحلول لكل حقيبة تحتوي على يه » cpm 5١ من 32P للمجس (الأوليجو نيكلوتيدات ٠ (oligonucleotides وبعد التهجين hybridization تغسل المرشحات ثلاث مرات في ١( 6 X SSC لتر لكل غسلة) عند درجة حرارة الغرفة ولمدة ٠١ دقائق لكل منها . بعد ذلك تغسل المرشحات مرتين عند oo حرارة تبلغ £0 درجة Ay dhe لمدة ١١ دقيقة لكل منها مرة عند 00 دؤجة مئوية لمدة 10 دقيقة والمرة الثانية عند 00 درجة مئوية لمدة V0 دقيقة باستخدام ١ لتر من X SSC 6 . يتم الكشف آلياً عن المرشح بواسطة تعريضه إلى الإشعاع وفي حرارة تبلغ Vem درجة مئثوية باستخدام شاشة تكثيف ضوء قوية وفيلم كوداك XAR2 وفي هذه الطريقة وهي طريقة المخططات الإشعاعية الآلية الأوتوراد يوجرافي (autoradiograph) هنالك ٠. ؛؟-. ٠ إشارة موجبة تسجيل يتم ٠ الكشف عنها وتسجيلها وهي تشتمل على © إشارات مكثفة جداً . يتم كشف المساحات التي تحتوي على أقوى خمس إشارات وعلى خمس إشارات أخرى إضافية بحيث يتم مسحها من اللوحات الرئيسية ويعاد وضعها على لوحات للفصل الثانوي على شاشة ثانوية وذلك باستخدام نفس مخلوط المجسات وتحت نفس الظروف ووفق ذات الشروط. وتختلف طريقة الغسيل لجهة أن الغسيل عند درجة الحرارة العالية يشتمل على مرتين لواحدة ١ عند 00 درجة مئوية لمدة ١١ دقيقة لكل منها ثم مرة واحدة عند ٠١ درجة حرارة مئوية لمدة ١ دقيقة . وبناءً على دراسة المجس ع««-]1 الوارد في المثال ؟ . كانت درجة الحرارة مرتفعة للغسيل الأخير في عملية الفرز الثانية ويعود ذلك إلى أن تجمع درجة حرارة الاتصهار لكل من ؛-17 mers كانت عند 18-138 dad مئوية وهي مشابهة لدرجات حرارة Glas . وبعد الغسيل عند درجة حرارة تبلغ 00 درجة مئوية يتم تخفيف المرشحات ومن ثم إجراء الرسم © التخطيطي الإشعاعي الآلي (أوتوراديوجرافي) للمرشحات. وبمقارنة هذا الرسم الإشعاعي الآلي مع رسم إشعاعي ثان مأخوذ في نفس الزمن بعد الغسيل الأخير في حرارة تبلغ Te درجة Basie اتضح أن اثنين فقط من الوحدات المستنسخة العشر المفحوصة أي فقد في الإشارة عند حرارة ا
جم Y _ تتراوحبين ١-** درجة متوية. وفيما cans أظهرت هاتان الوحدتان المستنسختان تطابقاً يكاد يكون Ls في الطول وفي إنماط الإيندوكليز endoclease التقييدية. وتم اختيار وحدة مستنسخة واحدة للترتيب التسلسلي . إن الترتيب التسلسلي للوحدات المستنسخة hpG-CSF cDNA ,2002 تم تحقيقه طبقا لطريقة Selo ؛ وتم انجازه بواسطة طريقة سائجير وآخرين ثتائي دي أوكسي Sanger, et al., Natl. ..)١977( 0£1V 0 67,74 Acad.
Sci. (USA) وتم استخدام الشريط المفرد من DNA phage M-13 كعامل نقل لتأمين لوحات الشريط المفرد DNA من الشريط المزدوج لغسيلات cDNA المستتسخة. ila وآخرون Sanger, et al, الطريقة المسلسلة في جدول ١ عن طريق ترجمة الحمض الأميني amino acid والشريط المكمل في منطقة تشفير عديد ببتيدات Polypeptides | ٠ . جدول 7 \o
nen oo : ههه Rew وجوه م dpe oan He QO- G0 : : abs ann. nae 0 Ax ano 0 : 0 : مده ano nr. Qo» © هه م "م Hp PdEe Ab oon : : 2و0و0 : a= TE) noc 50 ean 0> 0 : 6 : ْ © .وه جوج Nos ووه << seo 0 5 7 لسلا pas 5و DOB ا Gos Rar. afi ولك oo
Co ٠ جوع one or .وو onc anc. i, قا ا BAR >eio ae SSH. THON 1 : Doc nae. aac Hv nac nas - acowL ووو دوو دوجو دوودكو ZH ro. . . SND ~0 EDO 37320 © O00 CONDOR OQnN = دوه obs oboe Aap dno 60D 5 : از oa» دخووه مم وهم ووو .وه 3 من Sdn AO- هد See Ape 3 ° : Sane 00s = Pe ane nas’. 66000 © a 1 ودود ووو دوه .«وو .وو ا 2PWwn ع : SH | وال Hye Spe coon das 2B لاا ع م ann Qos aan ها Be oo neo ود<د-_ وجوه Qc. جدروو ا ا دو وا بر سا قا ae - طح رارج «ذ| 3< امد ف ون 358 ا ا 552 255 mass aa . . . م ا ا - . . Lo. . سر ب ا noo دوجو ود« Ac دوج aoc g= oo 0 00 Das SE0. دتمم DHA S30 برا 0 © موده يي 0582002 68 noc Bac ae” E 2 > <3 ووو coc + العاحها الاي 2 ا 5S =O. OQ Pes PEED nan o ١ ب" - aoe hac ا aos hoc ane 0 ao a < > am Rew "> ير با للح دد و بي 8 - Doe oboe She nas S5< anh َع ا i . oon nn Sno CP 3م naw >a a ] a on ano دونو na» pao. pas 8 - on سم ب يم 2 3 G0 Now - > =u & م 355 ono . ace رقو وومةه a8.
Co aco on Dee pes gar aco a - : =» Zan 00 ono. 30 => a ~ 2 ABE dae aac ans حو acs 92088 : : > ووو == .وو ووه noo & 5a Sye= سوام زع => “De “pe a :
Ge hoc >30 Sdn abn n&z ادن a a. ندموووه. SPweo O0Te ددهي QoON ar ع CV : OBS لد اد تت لاسا + د ل اعد dbo ORE a.
SH<S ann لان ءات Now Ass aos - ع : ا ooo onc aoc وج 4» . ars a : ann ١ قت درو 2p PS 003 + 8 anc - ans Dac nae par > anRe 8 ‘ => جر anc اا وو ا واد ا حا 0
San 2 20 oon 0> oon can = ann 2c aon can فق ono z : 2 ج ودج =D SPM الموج »4 دودو Zz : 540 232 oa 3 CZ ear aoe S6~ Gon 33% حص z no> anc Pen an oe د١ ودود 9604 ©0605 mac Ease 060602 ane عمقو Gao ooo 4و0 : =p =3 Ea OOD noo ano an 653 ame Eon 252 332 das
SPR oon Gao abe 25 530 : ١٠
—_ fv -
Ca kl ow > HM. .وه .موه HIE لل ووو : . . 7 > OQ. a. © 6 oan F330 > 3n Co زب عا + 3-0 أ" 06 0 3 0 © Gee. Doe pes - --- 0
Co ga 5 8. fn >» .وها oor 00H وون SE ° 7," : قا 0 0 H pds Ban OOF Ke
So 20.١ > ‘E28 =3 B32 -BBa 88% Bas 0 ٍ o Ho fa لوجم وه por ooo one ل 0 : ١ م ل Tt -- << P50 QO 600 230 . :
BE in 5. £0 >. 552 ودود 2 «و<دة DOE. حال 0 0 0 oO = ao> noo .ووه aa . Co و ا v5 0 a > 0605 00 on =~ +3 55 م .
Go a. » 0 300 30 ana. زحي اج هق 00 ىد oo i. a a 0 0 HO QD N00 و م برك ومو ا Cr ى 3 94000 © 0 3 3 HI OO DEL DEM : 0 FA 3 > 660600 0 250 0 OGOco: واد ١ : ب : a a 0 يم 3 oor aoe ano oa» 0 0 ٍ : 4 5 30 © 5 48 >So =>. SH
I] So. oA د 54ac Dw nas dos 000 مه - و0 و > م 0 na» جاو - اليا دوج > 0 ; o و 3 Q 3. GO - Pen OO~ A> a 0 ٍ ااا #0 a a ا Oa 502 هوه cho
Re و I | ono hE >a : : 3.8 0 جد ّي 00 3ه ray حو 233 }
Co Sonn >. 6 43 ans SE. ©0095 548 :
Ln 3 قا a > SRW دوم noo © © << : Co : . 0. © 0١ > CaN SnD HBP» و (© ا © نر : - : 0 6 0 0 0 acca dav obs Gas : : > 0 0 0 Nn »-0 Dem nao 2» = =< : CL a a 58 0 > 50 aos ato oar Soo - . 0 =H = = 35 LQnNn الحوفا O6R
Co ea 0. 3 n o Qo= Dar Sms wo : : La 0 Q 3 => a 5م 5 ODO OG T ١١ : 6 Oo » 35 = 0 >31 806» oor 0 ل 0 2 > > ane EST ED
FOS : 3 > 30 DER Ce سر T > “3 ao nz 2 Boe 2265 = "0 . هه a. © 6 يي oO ano. ووه Seas. ! . 0 6 0 a EB g © ات 5 0 Ton . ١ : 3 > 3 0 acs ago 50-0 ل" se» a 3 » 3 asa oc» ooo So : 5 = Q 5 oO a - con oc — =D — : ا a > > 0 Gon aos. 605 0
Tae ty» “3 0 5 PRT > ono 0 > o 0 = 2 0 PRS 233% => en CL 0 م 99 © >= oo o » coo © ores cose : 3 > دج جو ل © 7د د H>x ا : ٍ CLs 0 3 oO 5 Seb ١٠ 3 Dan : E 3 5 8 8 6 8 gas fae : 0 o- 0 300 : oo " noo
Sz & a a 5 2 288 E85 =» : اج قم > قر 2 5952© 3 > © > 6 جه 0 دج جح : 0. o no< ca> ooo : . = 3 > 0 = >a Cir +35 pe oo 5 5 = > - 0 © ع 5 قر بم ف برق : - <<” <2 الحا 3 © يه Ban الداواى : 30 o 0 » z 3 ane £i3z Sn 0 2 0 0 83 60594 Ono Goce : 0 0 oO Iv > ack) aon . - > 0. 2 > o 34 ES] age g88e . : Vo oo 6 © o Bo G 5 اما ا ans 3 ><
YYEY
سسا رسيس سمتسس سس تا ا السس سس_سسسس تمس سس سست
— YA — oo J 0 o o o دو 0 هد 0 oe نو oo . : mm a "1. a a a 4 0 5 3 ا ٍْ من :0 = « > > = ل“ a 5 EE : o 0 > Q 00 0 0 0. 2 0. 0 : . 3 >» o > > 0 Aa 0 a a }
Co Ne o no 0 7 6 6 ao >. SR 2 8 3 3 82-3 3 8 3 8
Co 5, 0 0 90 a. © oa 00 .- © 0 oo
Co oo Com Te a oO "3. "3 Sm 0 اال سا ا اعلا ° 0“ : om 2 © Q. 5 © 5 a oO 5 ٍ
Co os 0 3 > "3: = CH ا 2 لي ٍ و C0 قا a. فم oO هم و وم و 3 CT 0 ٍ سر a. 3 0ه << A و © =3 i 0 : Co => 5 03 - خم 65 3 6a 03 ْ 00 oa a a نك و oo
BE > B 2&2 8 8 & 8 zr 8&2 1 : og #5: a a Bsa 3 > a 0 So 38 ٍ : : ٍ ٍ : ٍ اا Ee ا 200 قا 3 = Qo = 0 : Le : Com 0 5 <0 3ه 3 3 o 0 =:
CL Co 2 > a, a 3 5 +3 B®» To 3 Loon c o ©0020 يِه "3 nN. © هه = Co : cL Lo oy» > 3 3 2 6 3 ٍ ٍْ ا اب : آ: 5 a 200 3 © n 5. Co : . . بت a. oO Oo م 0 د 0 © Z 0 ٍ : ٍ 0ج 5ج > a 5 3 > > oo on 8 : 35 a 6 a 5 a 0 = - CL © © د ذا > oa a >» a = . : i" Z 3 5 ا( 3 z 0 a نه =< : ol 5 2502 © 7 08 0 © 0 3 م ١ : : ft > >: © © . بج 3 > ا جح ٍ ب 22 0 a ‘a a 6 oo 0 z مسح ما 2 S00 > > a. 3 © 3 « : ْ الا a Oo. a oO 3 = © 2 > [ : ا 5 a 8 a 3 <<” 6. 0 . - © 93 000 > 3 0 = o ع ا ye ب" . } =. ga re. a a o a a a : T > Cc > = 8 & 8 0 0 6 5 : . = ec Oo. a a > oo» a > 8 م 0 او > هم 0ه » 3" 5 اا a : Le oo So ® 5 5+5 = a > 0 2 5 3 0 ٍ : 2226600 > 7 a oo 2-2 0 © 3 0 : ٍ ب o 00 م I و ٍِ na nA. مم > 2 «QQ Ev 3 ف a 0 3 .
Co 2 > £2 > 0 oa لو > 0 0" اا : a ما 0 0 0 3 3 =3 6 A ا ٍ © تت =a 3 8 3902 يج 0 0 Co oo Cw “Cd 6 3 5 قٍِ a a a 03د 3 8 8 8 8 8 2 2 0 "م
So Joe 0 2 0 60 5 ن ٍِِ a : 0. "3 Ie o 3 oO 3 "3 : . . Ld 0 cl ريا © 0 ٠ : a : | . : 8 2 ا 3 Ha 0 eo 8 8 & : So Cer 0 Q 0 0 a : 0 : i Com 0 =] 3000 a 2a 3 8 0 - > a a 7 > 6 a 0 ” ly) ١ 6 oO > 3 a : : لس = >. > 5 : ؛:ة 8: BE 8# 3 : : . ٍ : |ّ 0
SL ul | : 0 r Soom . . - ل“ ©. : . . . I ا :
J i} .
YYEY
يجدر التطرق للخواص الآتية للتسلسل الوارد في الشكل رقم ١ على سبيل تستخدم للتركيز ففي النهاية '5 للسلسلة توجد قواعد موضحة مقابلة لقواعد واصلة عديد cDNA 6. وبالتالي تظهر حوالي خمسة قواعد (يرمز لها برمز "77) لم يتحدد ترتيب تسلسلها بطريقة سهلة وخالية من الغموض بواسطة سانجير وآخرون Sanger, et al, نتيجة لما سبق من عديد G's تظهر م السلسلة بعد ذلك تشفيراً تسلسلياً قوامه VY كودون codons من سلسلة عديد الببتيدات polypeptide . وبناءً على التمائل مع التسلسل الأجيني النهائي لمعزولات hpCSF المشتقة من مصادر طبيعية على نحو ما ورد في المثال رقم ١؛ فإن متبقيات الثريونين threonine الأولية للشكل الناضج hpG-CSF يشار إليه بواسطة +١ وبعد ذلك فإن hpG-CSF الناضجة تتضمن 4 التشفير التسلسلي لمتبقيات الحمض الأميني amino acid على نحو ما تم وضعه. وبعد ٠ شفرة "stop" (شفرة (TGA, OP هنالك حوالي 8576 قاعدة من تسلسل غير مترجم وعدد من A's من عديد A "انها" . أيضاً اشتمل الشكل رقم ؟ على مواقع التعرف على Apals Hii ايندو نيوكليز وكذا الموقعين Stull (تم بحث infra مع النظام المميز الأيوكاريوتيك eukaryotic والبروكاريوتيك (Procaryotic المعتبر عن الخلايا البكتيرية المستقبلة. ونتيجة لنقص متبقيات الأسبارجين (s® asparagines عديد الببتيدات Polypeptide لا تظهر مواقع لل جلوكوزيل N- glycosylation ve أما القواعد الستة المرصودة بالقرب من نهاية “ في السلسلة غير المترجمة فهي تمتل موضع عديد دينيليت Polyadenylation محتمل . ومن الجدير بالملاحظة أن كل من cDNA الإضافين المطابقين بالتهجين حسب الخطوات الموصوفة أعلى من بين ما إجمالية £00,000 فسيلة قد فشلت في أن تحتوي على التشضفير التسلسلي في سلسلة الحمض النووي من خلال استنساخ المواقع الأولية. وفي الواقع فإن الوحدات v. المستتسخة الثلاث من hpG-CSF قد انتهت في المنطقة '5 في نفس الموقع مما يشير إلى أن البناء الثانوي لتسخ RNA المنقولة يعيق بشدة تكوين سلسلة ald cDNA هذه المواقع. وعلى هذاء وكأمر عملي تطبيقي؛ فإن فرز التعبير عن cDNA حسبما هو موصوف (sad أوكاياما ا
الس وآخرين (V4AY) 181-780 7 Okayama, et al., Mol.
And Cell.
Biol, وحسبما هو مستخدم فعلاً لفصل GM-CSF لدى ونج وآخرين Wong, et al, ؛ العلوم 41٠ CYA لم )٠45( لا يمكن تطبيقه بسهولة وسرعة لفصل DNA 00087 لأن أنظمة هذا الفصل تعتمد في العادة على وجود سلسلة كاملة من نسخ CDNA في الوحدات المستنسخة التي تم تحليلها وتقييمها.
° أما التسلسل الوارد أعلاه فإن من غير المحتمل أن ينهض بأعباء للتعبير المباشر عن hpG- 7 في العائل الميكروبي. هذا التعبير ينبغي أن يتم تزويد منتطقة تشفير hpG-CSF بشسفرة 0 أولي كما ينبغي إدراج الترتيب في وحدة نقل المعلومات إلى الموضع الذي يكون تحت التحكم بواسطة وحدة تنظيم/ وحدة تسريع لسلسلة DNA . مثال o
٠١ في هذا المثال يتم استخدام ترميز hpG-CSF على نحو ما تم فصله في المثال السابق لفحص الوحدة المستنسخة للعوامل الوراثية. يتم عزل phage lambda من AS جنين الإتنسان human fetal في مكتبة العوامل الوراثية (والمحضر طبقاً لطريقة لاون وآخرين Lawn, et al.
Coll 1 (YAVA) 1174 17 من ت- ماجنتيز Maniatis .1 تفحص بواسطة مجس مترجم يحتوي
على جزئين من hpG-CSF المفصولين عن طريق الهضم بواسطة : (HgiAl to Suul, 649 b.p., to Stul, 639 bp.) ١٠ 80:1 . يتم وضع ما إجمالية حوالي 00,00 وحدة ملتهمة على أطباق بتري مقاس (pa 10) ١١ وتترك على صفيحة معدنية وتهجن للفحص باستخدام طريقة بنتون /دافيزون Benton/Davison (بينتون وآأخرين YY) YA« ¢Y47 Benton, et al., Science 14 ( . لوحظ وجود ما إجمالية VY وحدة مستنسخة موجبة . وتم EOF ثلاث وحدات مستنسخة أعطت أقوى إشارات على الراديوجرافي autoradiography في الفحص الجماعي الثانوي وذلك بحيث vy. تتمو تلك الوحدات في لتر واحد ويتم عمل خريطة لها بواسطة الهضم بإنزيم enzyme تقييدي وباستعمال أوليجو نيكلوتيد oligonucleotide مشع YE مير (كينيز 8 بواسطة 1-326
(=) 2 = 2 0 8ق؟ 8 2 8 : 58 ض a cg oO Q م 3 يي 3 . ] ~N 3 < <Q Q Es £2 } 2 3. 3 قي a < QQ 1 33 نا مز © نث اع ع يه 4 ا < 2 oJ fe © 2 يي 3 21 9 ٍِِ oD i. 2 < o 3 Q 9 ~ EB 2 © د قا ب < 2 2 ع : ٍ 3 Ee Q 3 0 نع > 9 “a OQ < 2 < 3 3 ٍ : > 3 gS Q Qo = 9 ان 3 7 < tJ 2 9 د ْ آٍ a 3 Ee o 3) نه ٍ > 9 8. ع Q 39 oo <I gE 2 5 8 8 0 } . 3 a o < Q QJ © نا : ee... 3# 9 2 9 2.5 ٍ a0 : QD يك -- 3ه © OQ : 0 : 38 g 93 BB 9 = 5 . 3 . © مع Q ره 03 اح =u o a0 a يم 535 2
So انا ه <8 9 = 3 = ga 2 0 35 ١ © © : 0" Be - 2 ىا QO زح © 2 O°
Low م 3 "0 ل © 8 wu + ٍ gO a قا . نع © ن J - ’ } ce og og 3 3 Q. u Ee } oo = = = 32 = 3 3 ny . =: ‘@ © OQ Q 9 ؟ 0 90 ب © نا ما 4 د > 3 A 2 > 3
I . Ta GO Rip 3 3 يي 29 ’ ١ : ‘
Co 2G © D Go Oo 0 8 =
Co .# امع 3 = 9 = © . : : نا ل 2 Q Q 293 ً ب 3 Lm Q 2 5 ن0 ~~ > : eo O 3 < 3 عدا( ع ب 9 اال معي 3 IQ = gg. £ BQ 9 38 0 : 2. 2 Q = < g 9 To < mg 2 £9 9 = 9 : . - 3 ال ا < »خا 0 لخ 1 : ا يج 3020 Q a 9 : . : : 5 = ors a 5 0 لم : ب ٍ . = OQ Qo oO Q < = 9 %8 5 2 § 5 8 a 2 & 8. 2 9g 0 : U3 - Ee < < 2 2 © : : . . 3B - >> < Q Q- © = . ag 3 8 8 8 ® 8 2 OQ 0g QQ s a8 : i 3 O. So 2 © « > . 0 0 : ٍ 5 wn 2368 3020 9 < = = :
CL م تي > ا د © ا لهم a 2 Des . Co ٠١ 1 + 2 نون "3 8 0 Q 9 4ج ٍ ل ا >< 5 @ ae w با . i - ts بن 3 3 Q £9. oo : CT 4 0 2-3 5 g ا 55 ل : 03 امم ا ا Q 3 7 3 "© ل oo 0 23 98.5 & < ب ب : 0 ٍْ 3 2 3 ٠ يي < u < 9 00 4 3 Mg w a © .
So Z2 Q ‘ou 3 ا 3 كي 3 : : - 29 3 eo 4 ue oo vg 3 8 § 2 = a0 =O ٍ ني ا 8 © م 8 3 2 3 0 9 ة و مع : > © »ع - ا 4ه oO 2 0 جع 0 ا 2 3 Q ب ا : 2385 8 = £3 3 Q re AU ب QQ > ا ا : “© . ET < يت o oO 8 ل اا -* 0 = 3 ١ بل ا م : Co
So 2 بخ 000 0 .2 الا هم مع : a 3 : 30 2.8 go. 9 S > : : ل “© 29 BE 3 3 oo Ee . } a بن Nn له <2 9 . 2 : © 3 23 J QQ I> ] SLD : Pa . . Cod 0 > O Q HOO Ee - 0 - 5 ى ىيى © [T] . Qa . 29 co 5 4 5, 29 : : : . NN < Ce, - Q Qo Co = ’ a 8 pL We > < : 2 3 ٍ ٍِ 4 4 © نا 230 92 © = 5 ٍ م ١ =u ب = ب عي 2 Co : G © ~< 9 GO 9 5 } I] a © 5 3 < or CC
So 5 0 3 £9 3 Q = : . U = on Q 3 Q EB Veo oo : =O ب Q g 8 9 2 : 3.0 Lc = = 0 93 = 5 ٍ 0B - 3 9 بن مع © ١7 مسرم سسبسسسسلسسس.
— YY — ce C3 © 0 سر( 6 ou - ® 3 oo 0 ec > Oe 0 0 = 0 > © ao = [x] 5ط ٠١ oa ا —3 © > - oO 0 © © : 0 3 x 3 ® a 9 3 = > tn 5 =n : + 3 © © w © > a ce
[2] cys >» 0 = © 3 > Ww } > 0 - a oO Q cto : = © سم رج م wi 0 = o > 3 0 > 5 >» 0 n J nrc = ao = 0 = = © 30 9 7 م ص = = 0 =o © . -3 0 3 © > 0 يكذ 0 سا لما زج) 0 nw . ا > > = aon . a nw oQ =e no «- J 0 8 oy dt a 2 8 2 as 22 2 Be 0 0 B : nn > . oo > >> اسم > . 8 © 0 م : o [2] > عم 0 a = 6 oor a 2 = Oo > > > بم ا ao 2 0 = 3 oe 8 ~~ 5 °
Q a «< o 6 : = 3 6c a 3 © & 5 © 0 a £ o > . OE Nn. ©0 © : 3 © Qo لم سم > اج 0 0 3 © -3 0 2 © > 5 ط © 2 Qo : -3 بجا Go > 3 © نه م v3 > = © 0 ثم جم جح 3 0 . a = © 0 Q : ا 23 = o> = 3 . 3 ف > م 0 د . 2 0 © د بخ > : © or 0 0 3 © . - eo -3 ~ : 2 0 Qc 0 [7] . > oo >» 3 5 > > سر x} Q . o أ >» c oO > : a CG oa 0 Q = 3 o — > 0
Co 0 6 £3 = cl > ce B= 0 0 0 3 سر > ; 3 . 5 no 0 0 0 2 = Ww 0 cl > - oo © > > 2 2 83 2 2 z = 8 = 3 > 5 م 2 0 2 2 © 0 © & 2 0 ٍِ جح اا Oo . o oe 3 = ’ 5 م =o rs 2 ب ٠١ د قٍِِ ع © 3 :
Z 2 oe "5 2 N 6 8 0 w= 0 ' 0 . 60 م 7م © © > 0 > 3> © > a > 3 . 5 0 3 5 3 0 on 3 > = 5 no 3 a © 3 > 3 -3 a 2 2 RZ 2 2 ٠ 5 a = = © © ل 0 © "3 2 lel > gs £ 2 > جح o> > o o 0 > © 5 6 5 > 0 wm > > . 3 . 0 > = «Q 5 ل » ا = © > ايا > l= QQ >on 0Q = ته o 5 I) 0m > دم م 0 0 0 - م a Oo > 0 0 59 = C1 = & 0 © O60 , 0 Oo ae & > سر 2 0 4 0n © = ~~ 0 0 اي Oe © = 5 2 © ٍِِ >
[2] o ce © 0 > TE و = »> 0 3- سم يمه © د 8 >’ > Ww le] . C3 mm سم -3 co Ow > -
So = 6 ب = 6 . zr 8 EL 2328 8 Ve 0a 7 [I z = o — ب بي ب سح = ~ on wn & c © =) . © o © = oe > =) © ١7 2 ب ب
+ — يي م > 0 ا »3 gow ام 3 a Z 3 0 يخ 3 nc z c 3 5 2 3 > 3 © CDT م ~3 3 3 ا[ > 2 . 0c 82 on
La Q 0 60 [=] no e . 1 :
Q "3 0 0 0 3 > 8a a : .
Cc © 0 2 > 0 eH 3 o سم Co : > > - م a 3.2 >» © 2 ~ . . .
Cre 2 2 = 3 ص an a » 2 = ao. © IE nn 3 © : ب = 6 a > 3 - عم 0< :3م © + : ©» © 2 3.327 هه > : ١ . 2 0 2 oy 2 0 © © © )( م . R
Lv Q 5 . far © م . 3 3 3 اج So 3 © : 0 wo ب : ل" ٍ 0 اص 0 eg - © oe .0 © o cy =O 0 © oy 2 Oo : 2 ا > = oa ao 3 > = > . : 0 0 a] 0 0200 bE. 0 = 3 fd > 3 >» OO > © © : 0 م ايم م .3 0 ]= ب . Co ا" ey © 2 ©! 0. > C3 ث" " : © = : مم 80 5 © >». ب( Aa oc . oo
Q > > 3 3 L806 0 6) = ’ ب 0 C3 0 og 0 نهد Fo Wo . . > 0. 0 0 ٠ I | . .2 © 6 a > o 0 Pp we a". oo هت > & Q nN 3 n= 0 =~ co 0 د 3 3 i 5 2 0D» 68 © 0 ٍ 00 3 9. Cy - oy > 0m > = 0 . > o = ". 0 nD. Dw 0 م“ : 0 0 3 Q = «TF 0a 0" ب . 0 ©» oo << 0خ DD aw sco i . . 2) > oO © 6 a ا لاض = جم ٍ ّ > CQ 0 0 - 0 ao لها واد د ١ . 09 2 : 0 >= 0 oO ry 2 2 ا © 8a 8 : . . 0 & >> 0 2 5 مس 6). w= . . = GS [=] 020 fa o>» 3 = 6 3 0 3 a. << a. ~ a >» . . = 6-0 ص c 2 £ مم 0 © © ا - . 03 La - © 2 4 0. - 0 = عم n Ww : : 3 SO = n> Foe 3 sx : 0 > 2 0 3 + 00 ة oo 36 - . ’ a 2 3 3 a ». orc. am [=H <Q 0. - 0 > »3 © . 2 ها "9 . : CC [+] 0 0 & م © جح 32 0 ع د 3 > 3 > > د Cc: > oS © : : Lo <3 <2 300 0 a [2] Oe Q > . : : el =] 2 £: a» ow 0 Lo . .
Le] o 6 ا لا nw - = تت > 3 = [2] PF ثم 2 OY م : : > 8 0 oO 0 D 5 © د SZ ب على ٍِ 3 35 o > 6 OT ~~ لد زد © i a «3 ءا = 0 0 on ب co» م" Cc 8 & 4 ¢ BE B 38* 85 5 . . . . رم ال 3 3 a 0 5 a .&a aT. Sh : o a >. 0 3 0 > nor ب : 8 2 ةده |. & 89-8 - 23 o ig - . . ا ce > : . a = 8a 8 ££ 2 e 8 = T = 2 = 0 به 3 > 3 قي : + : o > 8 > = 00 > 3 رح : - 0 0 & 0 0 -3 a. - = 1 : 2 2 nn 0 2 2 2 حي oom - ! © Z 0 0 2 3 © : oo ٠١ 2 > -3 3 on I] سم مج : . 22 5 م 0 oe & 6. يه © © : : > Te2 = 20 =3 oe 0 0 << . 0 3 a > - بد 3 0 6 A }
Ez] 0: & 0 Oo © wv . .
Ce 0 0 4 0 Cx co» 0ق C3 = £3: C3 ا > £ = . 0 ف 0 : = 3» > 3 > ب . . . : 0 oO C63 a I] o 0 a >» . 0 o سو ]م > 0 0 لا 3 بك - 6 : 3 Q © 0 > a 0 : > به £3 Fd £3 > 2 جنا > GQ 0 > Q 3 I] = G+
C0 3 0. cl > 0 3ه 2 > = . 0 0 > - "3 0 - : Q QQ م . oc "3 2 820 8. 3 > 6 ~~ ين . :
Ca 0 50 3 سج - . 0G w © . . > 2 جا > 9 2 0 يج . 69 > : 0-0 3 0 0 2 a = So 5 بع : : i a = oO 0 بو 5 » ا . : > 2 > 2 و 3 or : 0 0 0 = 3 0 2 © a 0 C2. 0 no [=] ١ n » 3 0 > 0 a < . = 3 C3 8 0 3 = a ١ 0 »3 0 Q 0 > م > 0 > a 5 5 3 a >» a 3 I< > a = 3 6 ~~ & 6-0 2 0 0 به © ها >. 2 0 م 0 0 Z 2 # وخ ١ 2 0 0 a = 1 noe 8 2 5 ££ 34 8 3 gt 4 - ——. , - 3 0 IE] Oo oO 5 3 : 8 م : . Vo م ب : ما يب ~ ب ~ ب ب © wn ب اع ته [od & wo © © eo o o oS < oS o o < o o- & < oS ’ : ١7 a ER >92 سس سان اا ee ———— ا ||)
— Yo — : ١ 5 وه a a a . .
Co . . : a a 0 3 > . . 0 © 3 0 . . . : 3 I= 3 3 ف 0 . : a © | Q 5 . الل ٍ ٍ Q > Q 3 . : So 6 bO 3, . } . : "م o & © : 3 oo . ١ : . : o> >= 9 a 3 . Ce oo } 5 I=) 5 a. : . 0 ل . . a. © 3 z >: i . . Sie : Co © = Ed I) . . . . i 0 Oo a a. . i : ol ; ١ اس i oO El | © - © "م . oe : 2 2 0 Hk. © .
Ce ّم : - 0 3 £ > © Co . ب" ل . > > 3 0. a So م : } . : : "م a oa oa ce : ° . : . a oo ©. a > } . : ١ 3 > 300 a0 Lo . CL a © =) ao ‘a }
Co 3 ةا 8B 5 8 . oo . 0 a 8 a 0 . . : . 3 a © © 0 : - . ١ 8 > 0 a3 a BE .
Co e 828 و 8 8 ا : Sa &e - © ow». > . . . 1 : . . > ow ا nn. © ب . } 0 2 . 0 > : : . ب : . . > 0 0 9 3 a3 ما . . 8 >. >. 0 [e . : 2 ب ما : a © 0 © 3 Coe . - : > 8 3 0 م . . . 0 > 0 5 a } : : 2 a I'd >. 0 . . 0 © > 0 3 . . i z 2 =) o . . ١ co : 0 5 £3 i ١ ملا - oo 0 2 3 8 7] 0 z 3.8 8 8 . : Co } : 5 ce > & : : 2 3 مج ةج > . . ee : 0 - © ٍِ oo ب - . i > 8 9 6 a . : ١ ١ Co : : . oO 2 5. >» Q : . : . So» 8 0 a 0 © جا م م 0 a a 05 8 > i
Co . : » © » > ©. > . 00م el 0 8 0 = : : . : © 0 > 3 قم m . 6 8 a & ce ! C
E 2 - © oH a < [rp
So So 7 > 06 Oo ا - . . 3 ا ب 80 © د . 0 a 0 > -~ . - . 3 > i 6 3 - . \ : o ا 0 »3 € : o > & 05. = © : : . > 5 0 0 a. 0 T 0 . } : Q 3 as - >» 0 2. : . . vi 0 > 0. oO ~ Go
Co . 85 > 0 4 >. - : . . a 3 00 بخ 2 2) a : . oe > 3 =] ~3 & - . . . . : o © 8. 2 .c .
Lo. 0 & > > ! : . . . . . 2 Gc 0D 0 . : : 3 - > © . RE . - 0 . be oS 3 ب 2 :
So . 2 2 5 a > . EEE . : : 6 a. 30 © ٍ i > £3 z > . : 0 a a . . : > 2 0 a : co . . 3 6 بي > :
Lo h EE > 8 © o . : ّم 3 a 2 ال . . . 3 > oe : . م . . i a 0 >» Lo. : : > > 3 a . . . 3 a 5 .
LT 0n 0 ‘0 >» م . =| © > = . . . 0 8 0 a 7 ١ . > Ed a »3 ١ : o o > 0 } : © >. a = . : » a , 2 a . Co n 0 a . . - ا = 0 03 . . . 3 با . 0 : : > o 3 . . a 0 . . . 3 "” a "3 . . 0 : . . " ١ . . ب Ww كي N No Li . . oS cw © ب ب 0 0 -J oo oS. c Te . oS o Oo o oD . ب 0 ب _
VE
(حوالي (endonuclease) على تفاصيل خريطة الإيندو نيوكليز المقيدة (V) ويشتمل الشكل .100-087 والمحتوية على مورث DNA لمجموعة العوامل الوراثية بالحمض النووي (kb ؛ Neol, N, Pstl, BamHI, 3, : هي )١( المقيدة في شكل endonucleases والإيندونيوكليزات الموجودة أسفل الخريطة استراتيجية الترتيب المستخدمة agus) Casi Apal, A, Xhol. X, للحصول على تسلسل العوامل الوراثية . أما المناطق الصندوقية (داخل مربعات) فحص المناطق © ذات النهاية المنفصلة المفتوحة التي تمثل التسلسل CDNA الموجودة في الوحدة المستتسخة من
CDNA ولكنها تتطابق مع وحدات الرسم بمجس cDNA غير الموجود في سلسلة الحمض النووي . الأول بواسطة تحليل الرسم الشمالي. ويتم تهجين exon وقد تم تمييو التشفير التسلسلي للإكسون التي تقوم بربط 5. CAGCAGCTGCAGGGCCATCAGCTT3' أوليجونيوكلوتيد mer 7 ؛ في شكل الرسم الشمالي. hpG-CSF mRNA إلى ¥ 5) exon الوصلات المتوقعة للإكسون ٠ بنفس الحجم المحدد بواسطة مجبس (bp ١650( mRNA ويشير الرسم الناتج يبين إلى إكسون. وهذه المعلومات مقترنة مع القدرة على التعبير 7 oligonucleotide الأوليجونيوكلوتيد (مثال 3( باستخدام الضفرة المبدثشة pSVGM-Ppol من العامل الوراثي hpG-CSF المباشر عن
Exons Ld .١ Exon هي التي تحدد التشفير التسلسلي الموجود في (A) الموصوفة في الجدول ”-ه فهي تحدد عن طريق السلاسل الشفرية التي تم الحصول عليها في الوحدة المستنسخة ١ .)7 (جدول hpG-CSF من المورثة (Ppo2) cDNA + مثال يتعلق هذا المثال بتحضير تشفير الجينات كيميائيا أو مخبرياً 100-0287 وتتضمن الشفرات . E. coli المفضلة لل المستخدم هو الموضح بشكل عام في ألتوان protocol وبتحضير مختصر فإن البروتوكول ٠ والمدمجة بواسطة (WOB3/04053) دبليو + £4 0Y [+ AY رقم الطلب Alton, et al., PCT وآخرين \YEY
ع . - £ . - | - مرجع مشار إليه بطيه. وقد تم تصميم الموثات للتجميع الأولي لمكونات الأوليجونيوكلوتيدات Al Ea to 2 ثلاثة أجزاء منفصلة وقد تم oligonucleotides في وحدات مزدوجة والتي بدورها ممع إلى oo ce - . . هو ٠ 1 35 بالتعاقب تصميم هذه المقاطع للتكبير النووي وعند إزالة من نظام | التكبير . ويمكن xy فى, العامل الوراثى, المناسب تشتمل الجداول ١7 oo 1 o> بي \ 7 . * وعلى الثاني أو من خلا ترابط الجزء المتعدد في مل لور لي . < شرج و لجدول Y م إلى 4 على توضيح بناء المقاطع ١؛ في شكل oly المقطع ١ كما هو موضح في الجدول des dad ; ناه VEY مجمعة في 7 أشكال مزدوجة والشكل of نجد أن الأوليجونيوكلوتيدات ١٠-١ oligonucleotides مد في ذه الإزدواجات السبعة تترابط معا (As ) "و ‘ ١ ٠ oY ¢ كو ١ ١ ¢ دوأ ١ 3 1و ١ او 3 0( وهده الإزدو جاتب 7 سر <١ ظ أيضاً فى الشكل ؛ أن المقطع ١ يتضمن لتكون المقطع ١ كما هو موضح في الشكل 4. ويلاحظ أيضا في الشكل ؛ أن . ب . . 2 - ارتفاع لاصقة XBAL وانخفاض نهاية لاصقة BamHI وذلك مفيد لعملية الربط للتكبير وللحوامل ٠ المعبرة عن الوراثة ولربط المقطع . جدول 1 ل SE echpa-csFoNA section T CTAGARAARACCAAGGAGGTARTARA 1 0 TAATGACTCCATTAGGTCCTGETTSTTCT | 2 0 CTGCCGCAARGCTTTCIGCTGAAATGTCTGS 3 AACAGGTTCGTARAATCCAGGGTGACGGT 4 © GCTGCACTGCAAGAARAACTGTGCSCTA 5 ا .CTTACAAACTGTGCCATCCGGAAGAGC 6 © TGGTACTGCTGGSTCATTCICTTCS 7 CATTATTTATTACCTCCTTGSTTTTIT - 8# GCAGAGAAGAAGCAGGACCTAATGGAGT 9 © TGTTCCAGACATTTCAGCAGARAGETTTGCG 000 10 CAGCACCGTCACCSTGGATTTTACGAACC 11 \e mAAGTAGCGCACAGTTTTTCTIGCAGTG 12 ACCAGCICTTCIGGATGGCACAGTTTG 13 GATCCCAAGAGAATGACCCAGTAGT 14 -
- YA -
Ye جدول Lo. : : © ’ 0 0 ا 0 ا أ >a Qn : oo. 0 م0 اب ."م : © 69 + دق oa ٠ Ny] 0 : Le 6 . an 6a. > 0 بر ا ٍ 0 QI > m3 : =>» | > 3 : 0 ا - za . ' ©6900 - ef o 0 c } So oo 0 قم Qn. Cea Cet ذم oa -- © -3 n . Co : 32 . >" . . 53% dad Gy -3 wn Co : =O OO0Ow SE 3 لبا 3 : ane HP 0ه 50 - 3 © g ب 20000 قو . م ع : Se دب 5 ل ا( اا ا Lae « ذا 63 )( Sen - : ~N 3% or eS Qa - tn ! اح Fd ب" Se 3 2+ : oO اذ je lag rm م . EE O60 an 6 ا 3 oo م , © © © م حص 2 3 > : BE oo ١ +9 2 aa. 00 — | "© : C3» Oo : Ln .>= مسر قر ب ب 3م نل ls ل١ © 0 << هدق DON 2 oe nao . - د 2 ne anc اا } } © = مال ب SE = aa => . >» 3 " "ْ . - - . . Qn oo ‘ 3» . 3 : 0 ٍ : > 3 > 2 م 0ق 3 : . . ع م an >» 3 : .
Lo i aa ١ > م : 0 : 32 م . | ooo . -3 So . . > 3 no 0 3 > : : : =D =» > 3 . . ١ ب > = ١ن 1 دم srw : 0 -
A - Pro ane. spo . 3 0 اخ ا ا SE 32> > : 2. Ve
Sl 3 SS no حا م Qn oa. =» Co 16s : i > 3 > v3 . an . c_ oo ل > © م >= wo : . > ea co 0 1 : ب Oa : oo Qn ©
So. > LA» 0 4 2 لق 7 ج ذا ف مه © ا Lo : م Hse قد © د : : > مال Loe 20 3» So ب : an ل Qo : : : . . Lan >a 0 0 Qn ] : © دا on رح ت : ce . - 9 : Q Clee ao : 0 د عابي . =32 Qa oo ١ oe سم )3 634 2 je>e3 : آٍ . [XT Ea ا oor 0c } تم ا "م . HP 00. QOow : . . 4 ا : ooo >See >» o : } : on oo > 3 . ’ . > r3 = . on
Co ‘ na an £3 0 oo oo. no. 5a : م : 23 0a on So . } 3» > م . i . ١ Qn Qo aa . بر قر ا ت-_ QQ > 3 : : : Qo > OOo; : : ane 7 ooo ano . : \o
وكما هو موضح في الجدول A وفي الشكل o في بناء المقطع II تتجمع الأوليجونيوكلوتيدات Ye—\o oligonucleotides فى A وحدات مزدوجة ) ١١ و 6+ او أ لا او A Yo او 1 9 او لا ٠ ١ وم YY "و 4 ٠ oY Y أ( . وترتبط هذه الوحدات المزدوجة معا لتكوين المقطع 11 كما يظهر في الشكل © . وكما هو موضح Lind في هذا الشكل؛ نجد أن المقطع ]1 له نهاية لاصقة صاعدة BamHI ونهاية لاصقة هابطة وهى EcoRI مفيدة للترابط لتكبير الحامل sl وللترابط بالنسبة للمقطع 1 . وبالقرب من نهاية الهبوط نجد أن المقطع TT يتضمن مواقعا هابطا 1 مفيدا في الربط النهائي للمقاطع 7و . جدول ١١ 0 ؛" فى ١١ 3 م 0 0 \ | | ٍِ ل CT EChpG-CSFDNA SECTION II | | GATCCCGTGGGCTCCGCTGTCTTCT 15 00 TGTCCATCTCAAGCICTTCAGCTGGC .. 16 = .~~ TGGTTGTCTGTCTCAACTGCATTCTGGT ~ 37 0 007 .© CTGTTCCTGTATCAGGSTCTTCIG 18 © CAAGCTCTGGAAGGTATCTCTCCGGA 19 | ACTGGGTCCGACTCTGGACACTCTGCA 20 : © GCTAGATGTAGCTGACTTTGCTACTACT 1 ا ATTTGGCAACAGATGGAAGAGCTCAAAG -- 220000 23 ا ACCAGCCAGCTGAAGAGCTTGAGATG 24 0 ve ACAGACCAGAATGCAGTTGAGACAGACA 25 x 2 CTTGCAGAAGACCCTGATACAGGA ~~ 26 CAGTTCCGGAGAGATACCTTCCAGAG ~~. 27 .~ TAGCTGCAGAGIGTCCAGAGTCGGACC 28 0 AARTAGTAGTAGCAAAGTCAGCTACATC > 29 ... AATTCTTTGAGCTCTTCCATCTGTTGCC 0000 0 اناا ل
و جدول ١١ 8 : ٍ اونا .© an >a oe : no o oO } a A . .- ا قح oS ey] 50 3 8 Qo o> 3 EE] = 5 a 3 >> an 0 0 896 an 1 0 32 C00 a - i الج 2000 9080 اا م gar Craw = no QO r= mn : نا 62 20 قا : noe 5 ه قا nas.
H>o ٍ وو - 285 3 © 03 a0 |S 60 0) 00 ] راي jose an ta : 3< »3 oc 895 oO ب ao : QQ Qo > 3 > 3 ua; 3 Oo as 5 ٍ سم رم يج © بر > : = نر > هه Cans OO ب ب بت noo لعا 062 0 hoo . — } ٍ. ٍ gz an > A : .38 on > a3 De } روا 3 . oa 58 براي > EEE oa بت اي . > = ea on no. an. 3 } BEN 02 2 23 oa } : ~ Cr 59 5 ن١ nO Ww Sow os — سر 1 556 © 53 55 3 an o> on. o } 0 3 : : : ع "© >= 33 5 5 Qa ac Qa > tm \ on oe ويم - 3< 3 : Na , 88%. > 5 . x . 3= Gale aa = بج an = ay» and So . > نذا ل QO =~ ey pe a5 10 ano > 590 © ata : 2 >So Bede ass . 2 eA Coa» > > v3 i . 7 : ne en na Z Hie > ل } ro 5S Glen 00 23 : QQ . an 200 : >" 22 = bc 0a > 3 Cas QO > 3 wn . ‘ ec SH has ona an oo . : a0 3 > > . قي a nin oq . SAa- a8 23 ao و3 م 823 ge 24 جح بد = QQ ~00 3 - : gar Qo 0a : Dao Co ه دو وح \o . : ب .
— \ $ — ol yal نجد أن بناء المقطع 7 تم كما هو مبين فى الجدول 9 والشكل 851 هذا البناء يلاحظ أن الأوليجونيوكلوتيدات oligonucleotides ١7-7؛ متجمعة في ست وحدات مزدوجة هي ) ١أوااء SVE 1و١ (YA LYY م AMANITA ¢( . وترتبط هذه الوحدات المزدوجة الست معا لتكون المقطع كما هو مبين في الشكل LT وكما هو مبين في هذا الشكل ه ٠ lad يتضمن المقطع ¥ نهاية لاصقة صاعدة bamHI ونهاية لاصقة هابطة EcoRI مفيدة في الربط لتكبير العامل الوراثي وعلى الأقل في حالة النهاية EcoRI في التعبير عن العامل الوراثي المعدل. وبالإضافة إلى ذلك فإن المقطع 7 له موقع 850 صاعد مفيد في الربط النهائي للمقطعين "وا . جدول ١١ .\ : جديل LY TABLE XIII EChpG-CSFDNA SECTION ITI oo GATCCAAAGAGCTCGGTATGGCACCAG 3100007 CTCTGCAACCGACTCAAGETGCTATGCCG 32 ا GCATTCGCTTCTGCATTCCAGCGTCGTGC. © 3 ل AGGAGGTGTACTGGTTGCTTCTCATCTG 34 © CAATCTTTCCTGGAAGTATCTTACCGTGT = 35 TCTGCGTCATCTGGCTCAGCCGTAATAG 36 م AGAGCTSGTGCCATACCGAGCTCTTTG 37 ve م ATGCCGGCATAGCACCTTGAGTCGGTTGC - . 38 . 0 TCCTGCACGACGCTGGAATGCAGAAGCGA 39 : © ATTGCAGATGAGAAGCARCCAGTACACC 40 - CAGAACACGGTAAGATACTTCCAGGAAAG 41 : “0 AATTCTATTACGGCTGAGCCAGATGACG ~~ 42 .© VEY
\¢ جدول م ا 3 . A o 3 I= ل rs . . Fe واج 5 } oO o }
Qn 20 ia > 2 - «١س ما err - بم a a jaa = a8 7 ' 3 a HP 95 0 2 oa 3 ¥. ترما 0 3< 2 لا حم م ny nae noe و5 5 : ffs 0 بع اج nm ادر > 0 . 39x =5 > vw 50 : 0 83 3 بت an th } : ا gn : . Slit wm >a) 5 ٍْ - : FRR Jo ب إن ب Qa Qu a oo oo =» => Jw OE 3
Qa O06 "Ea g ب . 3 9 . SP ا بي 8 0 060 . ac ac = > 3 oc on. 23 > eZ 3م . on an } 4 Coan oo 7 Qo Ss 53s
Qor~ Lae I _
CoQ w Qo -8 اق os =
SHO => 0 r= = . 22 nc > = & = no =5 = 5 oo = 00 Gry an . i . ; < foo 0 9 59 © r= . 0 1-1-3 23 gq - be = . ب . QoQ on. . on co = 2 ga ZTE gE داج : 23 > eI 200 . 284 06 Co : م ديا Se > o3 : no = 3 S03 ف Co 3 on 55
BE 68 0 58 ٍ 5 « aon aa : 2 "2 aa 0 > aa } = D3 بر 08
Son Goon لجان Hse . - : . . . \o
أما الأجزاء من X bal إلى BamHI المتكونة بواسطة المقطع ١ فقد تم ربطها إلى 31 حامل وراثي ملتهم مفتوح بواسطة BamHI, X bal . ومن ثم أعيد فتح الحامل الوراثئي بالهضم بواسطة EcoRI,BamHI مصحوباً بالربط مع قطع BamHI إلى EcoRI المتكونة بواسطة المقطع 7. وفي هذه المرحلة يتم الربطتين المقطعين ١و7 حسب الإتجاه السليم. وبعد © ذلك؛ يتم فتح Jala وراثي 1 AT M13mpl بهضم BamHI وتحويله إلى ECORI ثم ربطه بالقطع 21د إلى EcoRI المتكونة بواسطة المقطع .٠ يتم هضم الحامل الوراثي المحتوي على المقطعين ١و7 بواسطة Stl, Xbal وبالمثئل؛ يتم هضم الحامل الوراثي المحتوي على المقطع ¥ بواسطة EcoRI, Xbal وكلا الجزئين الصغيرين الناتجين من كل عملية هضم يتم ربطه في البلزميد pCFM VY 01 plasmid والتي قد فتحت قبل ٠ ذلك بواسطة (EcoRI Xbal وناتج هذا التفاعل هو عبارة عن بلزميد plasmid للتعبير عن تسلسل متصل عن الحمض النووي كما هو مبين في الشكل 7 ؛ لتشضفير (conding) عديد الببتيدات hpG-CSF polypeptide الداخلي مع تشفير الأمينو للميثيونين الطرفي amino terminal (ATG) methionine للبدء في ترجمة E. coli . جدول Vo Vo po $$ —
Oo DS وم on بج a> on
T= © نا SR E58 I نب سر 3 0 Wm Dro m0) . 6 © Pro 358 وده coe د مه<”< 000 © . ’ : وم oo» a» aor oo ner an 3 : :
CP n= Qe Hh Qe 3 2 »
Bo بم قم بم قم as. Hx Qc = 7 nwo. ar دو ar. ox. وهم wy» Co ا 05 0 bh اه اج سر خخ | سراما ا ٍ ao 8 © Ha. لق b= ne
SE هود 06 - وه ود 00 me °
Cas ST Be C= aoe. Ze قرح ٍ :
Com 20 £ + Hs Hn be oR 00 Oo 0. HO. ورم wm ومح 0
Be مج QF نج Ho ب 0 a 5a ny He He dg "0 ال 0ج ٍ 00 << BH nr وو Ar ومح > Co رار ns 3ق مم يم 0.22 rm - 3م © © 2 : : .
RS ٠ ولي no Ls ox oc. ca Q : az ma Smt an S Xr} => > Lo ماعن QT Qo on ب دحج نسو م © ٍ
CY Sn Cran rn om on م © : } >x == OW NO وم a> يج = اداح Hl On Sr on بسر <0 > : . arr 3, Qo د ee. Hy دوه > or اجا رج وم 0 قد =a 0 وجح =a . on on Fl د اس an 03 © +3 2 :
Go ov حص ac oo Bsn £0 - o> oo oc n= on وم 0 قد > رابج بر »3 Zoe De FC حرج سم ed د ا Ac Sw وا on cb > لم باجم OO OO وهم Nm 2 on x . oo . -— Za SN Qo no. Dro -“ a NS 30 1 ==
SRS Gb ديد ه s HRo 00° ve soo Q الس يع 2c a> >= ox oo اها الج يع 0< دم حو ٠١ 70 3م an 0 - -5 0 تق oe no + = 3 به Qer Q0 =H [= Qc م سم =m oe دوي 00 Sn و< وق مي دو ow < ٠: 1 3 © سم عر a= 3 © on ox ~ 0 Cn 0 . ص ا 5 QR an Ow. a قا » 0 . cS ووه nm Hw am a= tp Aa ١ :
Oo SD ro 3237 Ar be SE So
EY 2-0 oe 5535 9350 Own eh» Sc .مجه مرح و ىا Or لخ ب ده الوا ao = = Se > ia 30 ب an سم 3 a 5:0 Ac fo oc So Qo aon He
Nez وو > 3 33 ow aa Qn ow
Pre. Gi = ا (<4 On Sx * اح سم ox
C= He و35 Aan > 0. be =a Ho
LF» Att جا ا Aan an. ao oo» 2 095: Aan 3m > Oo > 03 3 = 2a Qe as OSs و Or waa Hoo Co or ar noo oo 00 . يي ىق وح كم
Qn C0) I G3 سر gy 3 © 0 مج 00
Ha >. 05 He 5 Se wa an
Q > Qo Qc Qe a> oO ao itn. الما . On So وات 3 برح تق 8 : لد را > He Hw 5 سر a v3 En ao o> o> oc Go or. So ar
Q = سرج 2 Ho 36 =o -0 «3 Vo > «١٠ Bs 32 32 32 §3 32
— م bd — } ْ 1 تابع جدول lo سس "0 Lo 0 TABLE XV (cont'd.) | | | : ١ | نا Gly Val ‘Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu GTA 016 .GTT GCT TCT CAT CTG CAA TCT TTC CTG Gan b+ TAG co 0 oe pr 601 لاك | | 0 174 000000 7805ل © ب "0 His Leu Ala Gln Pro ’~~ AAT T Co a . © ودع ‘CAT CTG_GCT CAG.
CCG TAR مع أنه يمكن استخدام أى حامل وراثى مناسب للتعبير عن تعديل DNA فإن بلزميد plasmid التعبير عن التعديل الوراثي pCFM Viet يمكن بناؤه ge من البلزميد plasmid تم 4 وفق التركيب الموصوف في طلب البراءة الأوروبية رقم ١7495 ويتم أولا قطع 871 pCFM بواسطة Ndel ثم يتم برد طرفه يحيث يصبح Sala (غير قاطع) النهاية بواسطة poll Vo بحيث يتم تدمير موقعي Ndel الموجودين كليهما. وبعد ذلك يتم هضم الحامل os بواسطة Clal, Sacll وذلك لإزالة أي وصلات ربط متعددة موجودة قبل أن يتم تبديل وصلة الربط z ١ a . 3 - - - المتعددة بأخرى على نحو ما هو مبين في الشكل رقم A وأن وصلة الربط متعدد التوصيلات طبقاً لخطوات ألتون وآحرين Alton, et, al., supra . للتحكم في قدرة أحدى المورثات على sl عن تعديل الكائن الحي (expression) لبلزميد plasmid وهو التعديل الوراثي Vo pCFM ١٠ الذي يتم بواسطة معجل لامدا (حرف لاتيني) PL والذي يكون نفسه تحت تحكم مورته الكبت 01857 (على نحو ما وارد في ساطة Htrp) E. coli 06129 . جدول ١١ ATCGATTTGATTCTAGAAGGAGGAATAACATATGGTTAACCCCTTGGANT TCGGTACCAT 1 TAGCTARACTAAGATCTTCCTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGCCATGGTA XbaI, 29 Ndel, 35 Hincll, Hpal, 39 Mul, 47 EcoRI}, 12 تمع 1 Kpnl, 57 Ncol Styl, 101و 53 * . GGAACCTTACTCGAGGATCCGCGGATARATARGTAACGATCC | 61 CCTTCGAATGAGCTCCTAGGCGCCTATTTATTCATTGCTAGG 1 Xho2, 79 Sac2, تالمع 75 yyy 63 Hindlll, 70 Aval Xhol,
_ $ 4 _
مثال ١7 يتعلق هذا المثال بالتعديل st المعبر عنه بواسطة coli .2 لعديد ببتيدات hpG-CSF polypeptides عن طريق التشفير للحمض النووي الحامل للصفات الوراثية (Me™) hpCSF (en coding) وتكون السلسلة المستخدمة محضرة Lelia في جزء منها ومشتقة من الحمض النووي
٠ 010 في جزء آخر. أما السلسلة المحضرة صناعياً فهي تستخدم الشفرات التفضيلية E. coli . أن البلزميد Ppo2 plasmid المحتوي على المورثة hpG-CSF كما هو مبين في الشكل 7 يتم هضمه بواسطة HgiAl و50:1 مما ينتج die حوالي 45 جزء قاعدي مزدوج يشتمل على المورثة الخاصة ينضج LS) hpCSF هو مبين في الشكل (Y عن طريقة سبعة من رموز DAE ٠ - متبقيات السلسلة القيادية عند النهاية © وحوالي ٠٠١ جزء قاعدي مزدوج عند المنطقة " غير المشفرة. إن الهضم بواسطة HgiAl يترك- نهاية اللاصقة القاعدية © fc مطابقة لنهاية Pstl الطرفية وفي حين أن Stull تترك النهاية ALK (غير حادة). مما يسمح بإدخال القطعة بسهولة في M13 mP 8 (RF) المقطوعة بواسطة PSTL وبواسطة إنزيم التقييد المشكل نهاية الكلية غير الحادة 111021. وعند التكبير في M13 ¢ يتم استشئصال hpG-CSF عن طريق الهيضم بواسطة Apal ٠ و BamHI والتي تتقاطع على التوالي عند موقع Apal الذي يحدد نطاق التشفير للمتبقيات "+ إلى +0 من وصلة الربط متعددة التوصيلات المقيدة mPA 1113 . لكي يسمح بالتعبير عن التعديل الوراثي BE. coli لعديد ببتيدات polypeptide 100-051 تم تحضير مقطع صناعي على نحو ما ورد شرحه Ada gg في الجدول ya أدناه . C TAG AAA AAA CCA AGG AGG TAA TAA ATA - '5 جدول TTT TTT GGT ‘TCC TCC ATT ATT TAT ٠١ = "3 © © X bal | | 0 . 0 : 2 Ye ّم : SL 100+ 10 MET THr Pro leu 0" ٍ : : ب 5° - ATG ACA CCT CTG 6GC C بيب Apal CL
ومن واقع تحليل النتائج في الجدول ٠١ اتضح أن وحدة الربط متعدد الوصلات تتضمن نهاية لاصقة ٠ Apal وشفرات المتبقيات الثلاثة الأولية للأمينو الطرفي amino terminal في Lew’, Pro?, Thr! ("restoring") hpG-CST لتحديد الشغرات المحذوفة عند همضم M13 DNA- Apal الموصوف أعلاه. وتستخدم شفرات التعديل الوراثي المعبر عنها تفاضلياً في coli .1 لبدء
© ترجمة ATG ؛ وهي سلسلة من YE قاعدة مزدوجة توفر موقع الربط الريبوسومي ribosome
والنهاية اللازقة Xbal .
إن حامل التعديل الوراثي المستخدم للتعبير عن E.coli هو ذلك الذي ورد وصفه على أنه 6 في طلب البراءة الأمريكية رقم ١77449٠8 بواسطة موريس المنشورة في ٠١ أبريل + 86 لم (أنظر A. 7. ©. ©. 16060536 114103 E. coli Lad 39934). وباختصار ؛ يتم هضم
(Apal/BamHI) hpG- ومن ثم فإن قطعة . BamHI, Xbal بواسطة pCFM536 plasmid بلزميد ٠
CSF ووحدة الربط (Xbal/Apal) الموصوفة أعلاه تم ربطها لتكوين البلزميد plasmid المحدد في 2 .
ويتحول البلزميد plasmid 05367002 إلى متغير مقاوم الالتهام للسلسلة E. coli AM7 والتي قد تحولت قبل ذلك بواسطة 214371 (.© © ALT. رقم (YAAYY لإيواء المورث 18817؟. لقد
cells أما الخلايا .pCFM536 المورث plasmid ثم التحقيق من عملية التحول على بلزميد ١ مللي لتر) فهي وتحفظ في ١ ميكروجرام © ampicillin (أمبيسلين LB المزروعة في مرق المزروعة بحيث يعبر عنها بما يصسل cells درجة مئوية. وعند نمو الخلايا (YA) حرارة تبلغ قد تم حثه برفع درجة حرارة إلى 7؛ درجة مئوية PhCSF إلى 0,0 = 8600م ؛ فإن التعبير عن . ساعات . 0.0 وأما القطر الخارجي النهائي للمزرعة فهو يساوي ,= 8600م ةدمل
ام - أن مستوى التعديل الوراثي المعبر عن 006-087 بواسطة الخلايا المتحولة تم تقديره على جل البولي أكريلاميد SDS- Poly acrylamide gel المصبوغ بواسطة الكومازين الأزرق coomassie blue ليكون =F 75 من البروتين protein الخلوي الكلي . تحمد الخلايا cells وتجمع بواسطة القوة الطاردة المركزية عند Youu جرام لمدة عشرة دقائق في وحدة تدوير 7,؛- JS . وتتكسر الخلايا عند ©7702 (W/V) في الماء بتمريرها ثلاث مرات خلال خلية cell ضغط فرنسية عند ٠٠٠٠١ رطل لكل بوصة مربعة . يتم إخضاع محلول الخلايا cells المتكسرة لعملية طرد مركزي بمقدار ٠٠.٠٠١ جرام ولمدة ١١ دقيقة في دوار 18-7١ ويعاد تذويب الكريات الصغيرة في الماء بحيث تصبح محلولاً في مقادير © مللي جرام/مللي لتر بروتين protein كلي/إجمالي في 7١ حمض لوريك lauric acid ؛ ٠٠ مللي مول Ve تريس PH =V,Y « Tris . ويتم إجراء عملية طرد مركزي لمادة الكريات المذابة عند Yo, ves جرام لمدة ٠١ دقائق ويضاف إلى المادة الطافية CuSO, إلى مقدار ١٠مللي مول. وبعد حوالي ١ ساعة يتم تحميل هذه العينة على عمود HPLC ب للتنقية طبقاً لخطوات المثال ١ (ب) مع أجزاء بعض التعديلات لضبط الحجم ودرجة التركيز . وتتم عملية تنقية ثانية لإنتاج كمية كبيرة من 000-087 المشكلة في محلول منظم يحتوي No على مواد غير عضوية . وهذه المادة مناسبة للدراسة داخل الجسم الحي. يعاد تذويب عجينة من ٠٠ جرام من الخلايا في حوالي ٠٠١ مللي لتر من ١ مللي مولر DTT ويتم تمريرهها أربع مرات خلال مجانس مانتون جوالين Manton Gualin Homogenizer بمقدار مبلغ حوالي 7٠٠٠١ رطلاً في كل بوصة مربعة . ويتم إجراء طرد مركزي لمحلول cells LAY المتكسرة عند ٠ جرام لمدة Ye دقيقة وكما يعاد تذويب الكريات في محلول 500 la لتر من ZY من ٠ يؤكسبركوليت deoxycholgte » © مللي مولر EDTA © مللي مولر DTT و50 مللي تريس Tris « 9 <11م . ويتم خلط هذا المحلول عند درجة حرارة الغرفة لمدة Yo دقيقة كما يتم إجراء طرد مركزي عند ٠٠,٠٠0١ جرام لمدة 9١0 دقيقة . ويعاد تذويب الكريات في حوالي fev مللي
!و -
لتر من الماء وكما يتم إجراء طرد مركزي عند ٠٠٠٠١ جرام لمدة Ye دقيقة. وتذاب الكريات في ٠٠١ مللي لتر من 77 ساركوسيل Sarkoxyl و٠٠ مللي مولر عند pH=8 ويضاف ٠١ ميكرو مولر يتم تقليب المخلوط لمدة VT ساعة عند درجة حرارة الغرفة كما يتم إجراء طرد مركزي عند ٠٠.٠٠0١ جرام لمدة Yo دقيقة . يضاف إلى المادة الطافية ٠٠١ (supernatant) lao لتر من الأسيتون acetone . يوضح هذا المخلوط في الثلج لمدة Yo دقيقة ويتم إجراء عملية طرد مركزي عند ©00٠0 جرام Ye sad دقيقة تذاب الكريات في You مللي لتر من >" مولر من الجواتيدين guanidine و٠5 مللي مولر من أسيتات الصوديوم sodium acetate عند 4- pH ويوضع على عمود متوازن ٠,٠٠١ مللي لتر 6-50 ويتم تسييره بواسطة ٠١ مللي مولر من أسيتات صوديوم sodium acetate عند ¢,0= pH . يتم تجميع phG-CSF (حوالي 500 مللي (AY. وتوضع على عمود Ma ١5 لتر CM - سليولوز cellulose متوازن في Aa ٠١ مولر أسيتات صوديوم sodium acetate عند ,5< pH . وبعد التحميل يغسل العمود بواسطة ٠١ مللي لتر من ٠١ مللي مولر من Claud الصوديوم sodium acetate عند 8,4 = pH وكلوريد صوديوم YO sodium chloride مللي مولر ومن ثم يشطف العمود بواسطة Aa ٠٠١ لتر رمن ٠ مللي مولر أسيتات صوديوم sodium acetate عند ¢,0= pH وكلوريد صوديوم sodium la YY chloride Ve مولر. يتم تركيز ١5١ مللي لتر من سائل الشطف إلى ٠١ مللي لتر ويستعمل لعمود 900 مللي لتر 6-170 متوازن ومسير بمقدار ٠١ مللي مولر من أسيتات الصوديوم sodium acetate و١٠٠ مللي مولر من كلوريد صوديوم sodium chloride عند £,0= pH يتم تجميع أجزاء القمة المشتملة على Yo مللي لتر كما تم تعقيم المرشح. يساوي التركيز النهائي لل hpG-CSF ما مقداره V,0 مللي جرام/مللي لتر وتزيد النقاوة على £90 من نتسبة ما ٠ تم تحديده بتحليله على الهلام كما أنه يحتوي على أقل من ١,5 نانو جرام من بيروجين pyrogen لكل ١,5 مللي جرام من 100-057 . يتم تعين مستوى البيروجين pyrogen باستخدام شنطة اختيار (KIT) ليملوس أميبوسيت (M. (Limulus Amebocyte Lysate (LAL) test kit) ued
. A.
Bioproducts, Walkersville, Md)
— Oo a —
مثال A يتعلق هذا الاختراع باستخدام طريقة sale) الاتحاد الجيني genetic لتوليد مشابهات hpG- CSF حيث توجد بقايا السبستين cysteine عند المواضع امف كت EY كك YE والتي يتم
تبديلها بمفردها (كل على حدة) ببقية حمض أميني amino acid مناسب .
o وتحدث خطوات تولد التحول الخلفي (الطفرة) للموقع الموجه طبقاً لما أورده سيوزا وآخرين Souza, et al, رقم الطلب PCT المنشورة دبليو 8197/0788 . منشورة في YA فبراير NAA على ]' [Met تشفير (encoding) لبلزيمد plasmid 05360002 الموصوفة infra باستخدام الأوليجو نيكلوتيدات oligonucleotides صناعية تتراوح في الحجم من ٠١ إلى YY قاعدة وهمي موجودة في الجدول )١١( أدناه . يسمح الأوليجو نيكلوتيدات oligonucleotides رقم )١( بتكوين
1 جين (مورثة مشفرة) مشفر (تشفير الجينات [Ser'’] hpG-CSF كما يسمح الأوليجو نيكلوتيدات oligonucleotides رقم ) ") بتكوين [Ser’®] hpG-CSF وهكذا . جدول ١١ OLIGONUCLEOTIDE ٠ SEQUENCE = SE 5-026 CTC AAG TCC TTA GAG CAA GT-3' 5'~GAG AAG CTG TCT GCC ACC TACA-3' ل 5'-TAC AAG CTG TCC CAC CCC GAG-3' .3 Vo ~ : - . : ; 5'-TGA GCA GCT CCC CCA GCC AG-3' .4 5'~CTG GCA GGC TCC TTG AGC CAA-3" .5 تحدث التقيدات الطفرية لموقع CYS إلى SER الموجه باستخدام mP10 1413 المحتوي على قطعة Xbal-BamHI المفصولة من 05367002 كشريحة نموذجية. يعالج الحمض النووي DNA
١ه - من كل وحدة مستتسخة M13 mP10 محتوية على بديل Cys-Ser وتتم المعالجة بواسطة Xbal و BamHI تتكاثر القطعة الناتجة لاجنسياً في الحامل المعبر عن التعديل الوراثي 080714746 تم فصل نواتج التعديل الوراثي على تمرار ما ورد في مثال CY ويمكن بناء البلزميد pCFM746 plasmid بأحداث إنشقاق في بلزميد pCFM736 plasmid (والذي يتكون من المرسب والمواد المتاحة بصفة عامة كما هو موصوف في موريس رقم الطلب PCT النش دبليو 879/088 . المنشورة في YA فبراير ؛ )١9488 بواسطة BamHi, Clal لإزالة عديد الربط الموجود وبتبديل عديد الربط Jl (polylinker) . جدول ١١ clar Ce ~ CGATTTGATTCTAGAATTCGTTAACGGTACCATGGAA ' 5 TAAACTAAGATCTTAAGCAATTGCCATGGTACCTT oo 0 ,3 GCTTACTCGAGGATCCGSGEATARATAAGTARCS ! ّ CGAATGAGCTCCTASGCGCCTATTTATTCATTGCTAG® ' Ce, oo Saula في طريقة التنقية لمتشابهات Cys إلى Ser طبقاً للاختراع الحالي فإنه يتم تحويل ما ينراوح من ٠ إلى Vo جرام من عجينة الخلية إلى محلول في 5٠ مللي لتر من ١ مللي مولر DTT ويتم ١ تمريره ثلاث مرات خلال خلية ضغط فرنسية بمقدار ٠٠0٠١ رطل لكل بوصة مربعة. ويتم إجراء عملية طرد مركزي لمحلول الخلايا cells المتكسرة بمقدار ٠٠٠٠١ جرام لمدة Ve دقيقة يعاد تحويل الكريات إلى محلول في DOC ZY ؛ © مللي مولر ٠٠ [DTT مللي مولر تريس Tris و = pH ويسمح بالخلط لمدة ٠ دقيقة عند درجة حرارة الغرفة . ويتم إجراء عملية طرد للمخلوط عند ٠٠.٠٠١ لمدة Fe دقيقة ثم يعاد تحويله إلى محلول في 5٠ مللي لتر من الماء Y. ويعاد الطرد المركزي عند ٠٠.٠٠١ لمدة Ye دقيقة . تذاب الكريات في ٠١ مللي لتر من 77
AVE
بعد الخلط . pH= 8 Tris مللي مولر تريس ٠٠ « DTT ؛ +0 مللي مولر Sarkosyl ساركوسيل لمدة 90 دقيقة ويتم استعماله في ٠000٠0 يصفى المخلوط بالطرد المركزي عند del لمدة ؛ © مللي مولر Sarkosyl ساركوسيل 7١ مللي لتر 6-70 متوازن ويتم تسييره في "٠٠0 عمود تصب الأجزاء المحتوية على المشابة ويتم تجميعها ثم يسمح لها بالأكسدة . pH= 8 Tris تريس بالهواء وذلك بتعريضها للهواء لمدة يوم واحد على الأقل . تبلغ درجة التركيزات oxidize ٠ . إلى © مللي جرام/ مللي لتر ٠,9 النهائية ما يتراوح من 4 مثال الثديية وللتحقيق من ناتج عديد cell في هذا المثال تم تصميم نظام التعديل الوراثي للخلية إذا كان بوسعه التحول الوراثي في الخلديا Leas hpG-CSF DNA من polypeptides ببتيدات . (COS-1, A. 1. © © CRL-1650) إفرازه cells قلاه» الثددية وما إذا كان بمقدور تلك الخلايا ٠ phGCSF من polypeptides وقد تم تصميم هذا النظام ليتيح الفرصة إفراز لمشابة عديد بيتيدات المشتق جزئياً cDNA بواسطة التعديل الوراثي وعملية الإفراز الصناعية الجزئية وتشفير بناء القائد بتسلسل متبقيات منسوبة إلى polypeptides والذي يسبقه عدد ببتيدات hpG-CSF [Ala ] سنة 4٠5 -48٠١١ صفحة [YYA Wong, et al., Science في ونج وآخرون GM-CSF الإنسان .)١45( م إن حامل التعبير عن التعديل الوراثي المستخدم في الدراسة الأولية لنواتج عديد ببتيدات ويشتمل على كل من “shuttle” لهذا الاختراع هو عبارة عن ناقل وراثي مكوكي polypeptides
E.coli المصممة بحيث على أن تسمح بأحداث صدى ذاتي في كل من 8740 DNA و 2
DNA والخلايا الثديية يكون التعبير عن التعديل الوراثي للخلية الثديية الداخلة للحمض النتووي الفرعي المعجل/ المنظم. وهذا العامل DNA الخارجي تحت تحكم سلسلة الحمض النووي ve أغسطس YY المخصص 087014-19 أو في المخزون 12.0011118101 تم إيداعه في JI ysl
— oy —_
Parklawn Drive, ١٠١٠ بواسطة وحدة تجميع المواد المستزرعة من النوع الأميركية ١585 . .21م 6 C. 53241 رقم الدخول Rockville, Marylend المرتبطة ببناء حامل التعديل الوراثي فهي كالآتي : تم تصنيع سلسلة doe sill أما المعالجة . أدناه ١“ بتشفير رئيسي على نحو ما هو موضح في الجدول DNA حمض نووي
VY جدول ° 0-17 "م HindIII Met Trp © 5" = AGCT TCC AAC ACC ATG TGG 0 2١ - AGG TTG TGG TAC ACC
CL 1ح
Leu Gln.Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val
CTG CAG AGC CTG CTG CTC TTG GGC ACT GTG
+ GAC GTC TCG GAC GAC GAG AAC CCG TGA CAC : : ل" ’ ’ . to : " ل" ye aE ااا =1 +1 ‘Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Leu
GCC TGC AGC ATC TCT GCA CCC CIG GGC G -3' “CGG ACG TCG TAG AGA CGT GGG GAC -5'
Te - Apal كقطعة كبيرة ثابتة ناتجة من 11700117 المهضومة والمهضومة جزئياً pPo2 plasmid المصنعة في الشكل GM-CSF وترتبط قطعة سلسلة . pVS-Ppol لتكوين بلزميد (Pvull بواسطة Vo plasmid وذلك لإنتاج بلزميد (Apals 11700111 (على آثر انشقاقها بواسطة pSV-Ppol مع ¥ . pSVGM-Ppol
وه -
إن رواسب فوسفات الكالسيوم 0=V) ميكرو جرام) من بلزميد pSVGM-Ppol plasmid
DNA تتحول إلى ألواح مزدوجة مقاس ٠١ مللي متر من ألواح خلايا COS-1 بصفة أساسية كما
هو مبين في ويجلر وآخرين saa 5S 5. (VAVA) ١1-775 ٠4 Cell, Wigler, et al, ضابطة « يتحول بلزميد pSVDM-19 plasmid أيضاً إلى WIA 008-1 . يتم حصد المادة العائمة
© (الطافية) من الأنسجة المستزرعة لمدة © أيام بعد انتقال العدوى ويتم تحليلها وتقييمها بالنسبة لفعالية hpG-CSF . وكانت نواتج [Ala'] hpG-CSF من المواد العائمة بالأنسجة المستزرعة في حدود ١ إلى Yo ميكرو جرام/ مللي لتر على وجه التقريب. وعقب التعبير عن التعديل الوراثي الناجح بخصوص [Ala'] hpG-CSF الناتج عن تشفير لبلزميد pSVGM-Ppol plasmid في خلايا COS-1 . تم بناء حامل وراثي آخر يشتمل على سلسلة GM-CSF للإنسان ولكن مع شفرة
٠ ا لمتبقيات الثريونين threonine (الحادث طبيعياً عند الموضع ١ لل (hpG-CSF والذي سجل محل شفرة الالنين alanine عند ذلك الموقع .
وباختصار ¢ يتم تصنيع أوليجو نيكلوثانيد CAGCATCTCTACACCTCTGGG) 5) للموقع الموجه للطفرة (SDM) (التحول الخلفي). أما قطعة 11100111 إلى BamHI hpG-CSF في pSVGM-Ppol فحص ترتبط في 70210 M13 لل SDM . ويتم فصل عامل توريث (جين (gen
١ 000-088 المصنع حديثاً والمحتوي على شفرة (TH) في الموضع ١- وذلك بالانشقاق بواسطة 1 و EcoRI . وبعد ذلك HSH القطعة المستنسخة في pSVDM-19 المحضرة عن طريق التكسير بنفس عاملي التقييد الاثتين من الإتدونيوكليز endonucleases . ويتم تحويل الحامل الوراثي الناتج pSVGM-Ppo (THI) إلى خلايا COS ويقاس الناتج من 100-087 في الطبقة الطافية بالأنسجة المزروعة والذي أتضح أنه يتراوح من ١ إلى © ميكرو جرام/ مللي لتر .
Y. وأخيراً ؛ فإن سلسلة العوامل الوراثية المفصولة الموصوفة في المثال © تستخدم لتكوين حامل وراثي للتعديل الوراثي للخلية الثديية hpG-CSF . وبمزيد من التحديد ؛ يتم هضم pSVDM-19 بواسطة KpnI و Hind والقطعة الكبيرة المستخدمة في الربط بأربع طرق من
ون - الرابط الصناعي بواسطة 110011 و 11601 للنهايات اللاصقة كما هو مبين في جدول .7١ وتم فصل قطعة Neol-BamHI تحتوي على إكسون ١ عن hpG-CSF) pBR322 8500( ¢ وهي وحدة فرعية مستنسخة للعوامل الوراثية ؛ وتم فصل قطعة BamHIKpnl تحتوي على أكسونات exons '-ه عن بلزميد plasmid 031.322 (وحدة فرعية مستتسخة للعوامل الوراثية 8500 (hpG-CSF © . إن التعبير عن ناتج الحامل الوراثي للثديات pSV/ghG-CSF قد ينتج ما يتراوح من ١ إلى 7,8 ميكرو جرام /مللي لتر hpG-CSF من خلايا COS المحولة . جدول VE | : HINDIII CL AGCTTCCAACAC '§ © 5° 76076و وي ا مثال NCO 1 ٠ Ye 0 | 3 Ve يتعلق هذا المثال بالخواص الفزيائية physical and viological أو بمنتجات عديد بيبتدات sale) 5 polypeptide الترتيب التسلسلي الجيني 880602 للأختراع . -١ الوزن الجزيئي أظهرت نواتج الاتحاد الجيني genetic لل phG-CSF للتعديل الوراثي المعبر عنه في 11 بالمثال ١ وجود وزن Laie KD YALA Ada تم تحديده باختزال LS) SDC-PAGE هو ٠ متوقع من تحليل الحمض الأميني amino acid المستخرج في جدول (VY بينما يتم إجراء عملية فصل طبيعي وتنقية على نحو ما تم وصفه في المثال )١( حيث Cell وجود وزن جزيثفي بمقدار 14,7 KD . أن وجود 7<- جليكانات Noglycans متجمعة مع المعزولات الطبيعية يمكن استبعاده بصورة فعالتبناءً على نقص متبقيات الأسبارجين asparagines في الترتيب التسلسلي الأولي لكل من hpG-CSF على نحو ما ورد في الجدول 7 ولذا تم تصميم طريقة لتقدير ما إذا © كان =o جليكانات O-glycans مسئولاً عن اختلاف الوزن الجزيئي بين المعزولات الطبيعية ل
اه - ومنتجات إعادة الاتحاد غير الجليكوزيلية glycosylated -000 . يتم معالجة حوالي * ميكرو جرام من المادة المعزولة م المفصولة بواسطة لورامييديز (Calbiochem, LaJolla, Calif) neuraminidase وتتم إزالة ميكرو جرام من العينة كما يتم تحضين المادة المتبقية بواسطة ؛ 0- جليكاتيز O-Glycanase (إندو - » - ير أسيتيل جليككتو سيامينيديز endo-x- (Bostion, Massachusetts ميزنإ © + nacetylgalactoseaminidase ٠ عند حرارة تبلغ YY درجة مئوية. ومن ثم تزال الأليكونات (Aliquots) بعد نصف ساعة وساعتين وأربع ساعات من التحضين . يتم تعريض العينات إلى Lis SPS-PAGE إلى جنب بواسطة مادة إعادة الاتحاد المشتق لل coli .8. وبعد معالجة النيور أمينيدين neuraminidase ¢ فإن الوزن الجزيثي الظاهري المفصول مزاح من ١5,6 إلى KD ١9,7 ويزال بقيمة حمض السيليك salic acid . ٠ وبعد حوالي ساعتين من المعالجة ب ©- جليكايز ©8ه«:هه/1ع-0 يزاح الوزن الجزيئي من ١8,8 وهو ما يتطابق مع وزن الجزيئي الظاهري للمادة المشتقة من coli .8 . إن حساسية شكل الكربوهيدرات carbohydrate بالنسبة للنيور أمينيديز neuraminidase و*- جليكايز O- glycanase تدل على الشكل الجديد للعنصر الكربو هيدراتي N: carbohydrate - اسيتيل نيورأمينيم أسيد (1—Y) — N-acetylneuraminic (جلكتوز =N )-١( 8 galactose اسيتيل ١ جلكتو سيامين N-acetylgalactoseamine-R حيث R تمثل السيرين serine أو الثريونين threonine .
: امتصاص 113- ثيميدين —Y على زيادة *13- ثيميدين Sly نخاع عظم الإنسان cells تم تحليل التكاثر الحثي لخلايا المدمج . وتم تعريض نخاع عظام إنسان من متبرعين أصحاء لقطع مكثف بواسطة thymidine ويتم تحويل الكثافة (pharmacia « جرام/مللي لتر ٠.١ VV) Ficoll Hypaque فيكول هبياكى ٠ من سائل 7٠١ المحتوي على (GIBCO) (Iscove's) المنخفضة إلى محلول في وسط إسكوف ٠١ XY وبناءً عليه يتم تحضين .pen-strep glutamine وجلوتامين bovine serum جنين بقري
oy — - من خلايا نخاع عظام الإنسان أما في وسط تحت التحكم (وسط ضابط) أوفي مواد E.coil التي أعيد اتحادها الجيني genetic وفقاً للمثال ١ في 976 طبق ذو قاع مسطح عند TY درجة مئوية في CO, 69 في الهواء لمدة يومين. ثم تحليل وتقييم العينات بالمضاعفة وقد تراوحت درجة التركيز على مدى lim ٠٠٠٠١ بعد ذلك تم تزويد الأنسجة المستزرعة بنبضات لمدة ؛ ساعات ٠ بواسطة 0,+ ميكرو كوري/ Well من 13 (New England Nuclear, Boston, Mass.) (padi thymidine وتم قياس 113 ثيميدين thymidine المأخوذ كما هو مبين لدى فينتيوا وآخرين .)١987( YAY, TY Ventua, et al.
Blood في هذا التحليل التقييمي يمكن لمعزولات hpG-CSF للإنسان أن تقوم باستحثاث HY ثيميدين thymidine المذمج في خلايا نتخاع عظام الإنسان عند مستويات تزيد بما يتراوح بين حوالي 4 إلى ٠١ مرات عن المواد الطافية الضابطة ٠١ (التحكم) Supematots وللمادة 100-057 المشتقة من 1.0011 في المثقال ) 1( نفس الخواص والصفات . تم إجراء دراسة ثانية لتكاثر خلايا plas عظام الإنسان باستخدام وسط تزريع لتقل العدوى trans fected 005-1 من خط السرطائنية على غرار ما هو محضر في المثال )9( وتم التوصل إلى نفس النتائج والتي تشير إلى أن تشفير نواتج عديد ببتيد polypeptide قد تعزز ded في وسط vo التزريع كمواد فعالة . *- استحثاث تميز + WEHI-3B D إن سعة المواد المشتقة E.coil التي aed اتحادها لاستحثاث تمييز خط الخلية السرطانئية اللوكيمية النخاعية وأحادية الخلية للفأر + WEHI3B D وقد تم تحليلها في وسط آجار شبه صلب كالموصوف في ميتكلف .)١1/88( YY0,Y0 Metcalf, Int.
J.
Cancer وقد تم تحضين ناتج ٠ | 100-058 من إعادة الاتحاد الجيني genetic وضابطات وسط التحكم عن طريق+ WEHI-3B Well/LDA ٠ في حرارة بلغت VV درجة مئوية في 75 ,60 في الهواء ١ sad أيام. وتم
اه - تحضين العينات في YE طبق من الأطباق ذات القاع المفلطح بينما تراوحت درجات التركيز على نطاق مداه 70٠ ضعفاً. وقد تم تصنيف السلسلة على Led مميزة جزئياً أو ؛ مميزة كلياً. وتم عد وإحصاء خلايا cells السلسلة بواسطة المجهر الميكروسكوب microscopically وقد ثبت أن 38.0011 الذي أعيد اتحاده جينياً يقوم باستحثاث عملية التميز والتفاضل .
GFU-GM, BFU-E and CFU-GEMM تحاليل -4 ٠ للجينات G-CSF (RHPG-CSF) و G-CSF (hpG-CSF) أتضح أن المعزولات الطبيعية المتعددة الفعالية لدى الإنسان تسبب في تميز وتكاثر الخلايا التخاعية لعظام الإنسان وتقاس وهذه
Exp. Hematol Broxmeyer, et al. (بروكسيمير وآخرين CFU-GM الفاعلية والأنشطة في
Lu, et ملة Blood (لو وآخرين CFU-GEMM, PFU-E واختبارات تحاليل (YAVY) 8 باستخدام خلايا نخاعية للعظام غير اللاصقة ومنخفضة الكثافة لمتطوعين (YAAY) 78,110 ٠ أدناه على المقارنة بين الفاعلية والأنشطة Yo أصحاء من بني الإنسان. ينطوي الجدول أو hpG-CSF باستخدام + +0 وحدة من CFU-GEmm 3 PFU-E and CFU-GE البيولوجية لدى . thpG-CSF . وقد تم إجراء معظم تحاليل سلسلات خلايا النخاغ العظام غير لاصقة ومنخفضة الكثافة ٠.١/7 ZX) Ficoll-Hypaque بواسطة AUS وتم تعريض خلايا نخاع عظام الإنسان إلى قطع Vo وكانت الخلايا منخفضة الكثافة قد أعيد تحويلها محلول وسط . (pharmacia 7 جرام/ سم معدل بوسط 0010060005 يحتوي على مصل لجنين الحجل للالتصاق على أطباق 58 لمدة ساعة إلى (Yo oY رقم ¢ Becton Dickenson, Cockeysville, MD) تزريع أنسجة فالكون . درجة مئوية YY ساعة ونصف عند
X.
VY EY
q _ 0 — جدول YY RETR.
CFU-GM.
BFU-E ~~ CFU-GEMM ‘MEDIUM 0+0 00 26+1 0+0 NATURAL 0 | . SR hPG-CSF ems 83+6.7 440 rhPG-CSF 0 - 8745 8140.1 6+2 0 ويتكون وسط التحكم من وسط Dulbecco المعدل Iscove's مع ٠ Y « FCS / Ys مللي مولر هيمين hemin ووحدة واحدة من نظام تكوين الكرات الحمراء . ولتحليل 770-014© ؛ توضع الخلايا المستهدفة عند "٠١ XY) في ١ مللي لتر من ٠,7 وسط تزريع اجار والذي يتضمن وسط McCoy's SA و ٠١ من مصل جنين العجل . تم Jind ٠ وسائط التزريع بالنسبة للتكاثئر (أكثر من 46 خلية لكل تجمع) وتم تقسيم الشكل على مدى سبعة أيام وقد ظهر عدد السلاسل كمتوسط SEM + كما في طريقة المقدرة من واقع ألواح المضاعفة الرباعية اللواج quadruplicate . ولتحليل BFU-E and CSF-GEMM ؛ تضاف ٠١ XV) ) من الخلايا إلى مللي لتر واحد من مخلوط وسط Dulbecco المعدل (Gibco) Iscove's و +,A 7 ميثيل سليولوز methyl cellulose AY 5¢ ١ مصل جنين عجل fetal calf serum 0 ,+ نانومولر —Y ميركيتو dsl -2 ١.7 ¢ mercaptoethanol مللي مولر هيمين Schemin واحدة من عناصر نظام تكوين كرات الدم الحمراء المعاد اتحاده. ويتم تحضين الأطباق في جو رطب من / CO, و م اوكسجين oxygen من أجهزة الكيمياء الحيوية ريمينق .(Syracuse, N.Y.) (Reming Bioinstruments) ويتم تسجيل عدد السلاسل يعد VE ساعة من التحضين . ويمكن رؤية عدد السلاسل بطريقة SEM Y. + حسب تحديدها من ألواح المضاعفة .
- oq. واتضح تكون كلورو اسيتيك استريز CFU-GM ومن واقع تحليل السلاسل المتكونة في موجب واستيريز 6 غير نوعي (ألغا- نفثيل اسيتيت استيرين chloracetate esterase . سالب متكونة من سلاسل للخلايا الحبيبية من حيث النوع (alpha- naphthyl acetate esterase وحدة/ميكرو "٠١ 7١ فاعلية نوعية تبلغ حوالي thpG-CSF 5 hpG-CSF وقد وجد أن لكل من نقي عند تحليلها بسلسلة من التخفيضات في تحليل 01717-614. وإن بيانات protein جرام بروتين © تمثل ثلاث تجارب منفصلة وهي مشابهة للمعلومات YO الموجودة في جدول BFU-E and CSF الطبيعية. ومن المهم أن تتذكر أن 000-087 يكون نقياً للغاية hpG-CSF الواردة سابقاً عن وذلك فإن Ecoil تأثير إنتاجها في Cun الثدييات المحتملة من gal وخالياً من عوامل النمو عند إضافته في وجود BFU-E (CFU-GEMM) القدرة على حمل مخلوط السلاسل rhpG-CSF ٠ genetic الاتحاد الجيني sale] عنصر من نظام تكوين كرات الدم الحمراء الناتج من ٠ ْ : تحليل رباط الخلية -© والخلايا السرطانية لدى الإنسان والمشتقة من الخلايا 772111338 (D4) ورد آنفاً أن خلايا
CSF-B غير مكتسب للإشعاع أو G-CSF مع aii fi السرطانية التي تم تشخيصها متوفراً في 1251 hpG-CSF الطبيعية على إتمام الارتباط thpG-CSF 5 hpG-CSF للإنسان كما أن قدرة إلى iodinated قد تم اختبارها . أضيف أيودين al لدى الإنسان وفي Anta dl cells خلايا ve ميكرو جرام [تجيدور وآخرين ١ الطبيعي عالي النقاوة تزيد نسبة نقاوته على 7908 ؛ hpG-CSF وتم عزله من المتفاعلات بواسطة [(YAAY) ١٠7,17١ Tejedor, et. ,لظ Anal. Biochem, 125]. الرسم الكروماتوجرافي جل الترشيح والمبادل الأيوني. وبلغ النشاط والفاعلية النوعية لل حوالي ميكرو كوري/ ميكرو جرام بروتين 0:00 . يتم اختيار تحضيرات خلايا hpG-CSF النخاعية للدم Jeukeminas الليوكيميا LDA للفأر وخليتين من 172511138 (D4) سرطانية Y. نسبة لقدرتها على الارتباط (MOB فصل واحد ك 4 14 والآخر ANLL) المحيطي للإنسان) . 271 hpG-CSF والاتحاد مع ل
- +١ - تغسل خلايا (سرطان الدم) النخاعية المستخرجة حديثاً من الدم المحيطي للإنسان والفأر 3 مرات بواسطة خلايا PBS /١ /BSA .WEHI-3B (D+) خلايا )'٠١ x0) أو خلايا سرطان الدم الليوكيما loukeminas المحضرة حديثاً حيث تحضن على هذا ٠٠١( ميكرو لتر) BSA 71 PBS/ في وجود أو غياب درجات تركيز مختلفة (الحجم: ٠١ ميكرو لتر) من , 100-087 ١ م أو ٠٠٠٠٠١٠ (حوالي PI hpG-CSF غير المشعة في وجود GM-CSF أو hpG-CSF ٠ ميكرو لتر). بعد ذلك ١7١ : جرام) عند درجة صفر مئوية لمدة 0 دقيقة (الحجم الكلي sl
FCS ميكرو لتر من الثلج البارد Yoo يعاد تحويل الخلايا إلى محلول وتفرد على طبقات مقاس ٠٠٠١( ميكرو لتر للطرد المركزيء ويتم إجراء الطرد المركزي You في أنبوب بلاستيكي دقيقة). ويتم تجميع الكريات يقطع نهاية الأنبوبة ثم يتم إحصاء عدد الكريات والمادة ١ » جرام . (Packard) gamma الطافية كل على حده في عداد الجاما ٠ يتم تعين الارتباط النوعي (cpm) كارتباط كلي في غياب منافس (متوسط المضاعفات) مطروحاً من الاتحاد (cpm) في وجود زيادة بمقدار ٠٠3١ ضعف 100-087 بدون إشعاع (ارتباط غير نوعي). إن الحد الأفقي للارتباط غير النوعي هو 7507 سم لخلايا 17811133 cpm ٠١77 5 (D+) لخلايا cpm VV Yo 5 (ANLL (M4) لخلايا .ANLL (MOB) يتم إجراء ve التجربتين ١و؟ في أيام منفصلة باستخدام نفس تحضير PL hpG-CSF وتظهر التكوين الداخلي المضطرد في نسبة التثبيط المذكورة بخصوص ٠٠٠١ وحدة من hpG-CSF يشتمل الشكل ١ على المعلومات التي تم الحصول عليها . Ye VY EY
YY الجدول o as =m . " 2 ©2220 ]( ا ذا © © 2ج 3 © © Ix ©ا = =5 8 0 5 . rr 3 3 2 الم cE © | Q Te ا م 0 7 on Co) os &
Lom aw be 2 اللا ل ow 0 gr oo a . - 3 le »» 1 * n حا مم > © تح كم بم - Cw . - - . - - : > = ب © © بد © © B
C8 5 © © © c © © = © .© © © ©١© coc © : ° w a مر رم سر يم on : - ] - - - R - - - wo; ها هه هه صم بيع > ص 18 - - ا ل سر | فج wv oo اا = ®& © So 0 ه . Fn u oe BE } 1 . عه لجا 3 ب د 2 = ohn JW 2 ec © © v9 Oo © a © ٠ ا . — e . } = 3 ا ن ١ د ~ 2 ١ ٍ oe 0 Ww اب : 2 . oo Co : yo . 3 ’ . 2 : “x i اليا © ٍ ل“ ~ oo = : 5 0 ٍ ل اك a . i x) = 2 oo ١ ~ الم ٍ ٍ . o on د 23 : . . ا« i. : . or
Co : ” xX - . 0 . ’ ! م 1 ا ته ب ما ا قلس 1 ٍ 1 . . = ع So . c o i ! = 0 ٍ 3 . . 3 po
Sn oT
دس - وكما هو موضح في الشكل 9 فإن hpG-CSF -2”1! أظهر التطور التسلسلي لخلايا سرطان الدم 178111-338. يتم تثبيط الارتباط بطريقة تعتمد على الجرعات بواسطة hpG-CSF الطبيعي غير المشبع وليس .GM-CSF بالإضافة إلى ذلك؛ يلاحظ وجود ارتباط hpG-CSF الطبيعية مع الخلايا سرطان الدم النخاعية وحديدة النواة لدى الإنسان J(ANLL, M4) ويلاحظ أن الارتباط © بهذه الخلايا متوازي في استجابته مع hpG-CSF الطبيعي في المستزرعات السائلة بالتمييز إلى ملتهمات ناضجة محكومة بمقتضيات على الشكل والتشكل. وإن غياب ارتباط 100-087 1251 الطبيعي بخلايا الليوكيميا cells leukeminas (سرطان الدم) النخاعية المأخوذة من المريض الآخر (ANLL, M5B) تدل على أن سرطانات دم معينة (leukemias) قد تعبر عن أو تفتقر إلى وحدات استقبال .hpG-CSF كما أن قدرة thpG-CSF على التنافس لإتمام ارتباط hpG-CSF .1251 ٠ الطبيعي على غرار hpG-CSF على التنافس لإتمام ارتباط PL hpG-CSF الطبيعي على غرار . الطبيعية؛ وتدل على أن وحدات الاستقبال تدرك كلا الشكلين hpG-CSF سرطان الدم LDA الطبيعي مع "1 hpG-CSF وأن هذه الدراسات التي توضح أن ارتباط الطبيعي على استحثاث الخلايا الحبيبية hpG-CSF قدرة Cus تتوازى مع وسائط الاستزراع من ووحيدة النواة لتميز كثافة الضوء لخلايا نخاع العظام التي تم الحصول عليها من مريض مصاب وتتم زراعة من .042( myeloblastic مصاب بسرطان دم AT ومريض (M3) بسرطان دم حاد ١
ThpG-CSF وحدة من Vo XY كل مريض لكل ؛ أيام في وسط تزريع بمفردها أو في وجود المحضنة بمفردها لا تزال في سط من M3 أن الخلايا المأخوذة من وسائط التزريع الضابطة أظهرت وجود خلايا thpG-CSF في حين أن الخلايا المزرعة في وجود promyelocyte نوع ناضجة من نوع النخاعي متضمنة خلية نخاعية متبدلة على شكل شريط كبير وقطع من خلايا خلية تم )٠٠١( وحيدة النواة وفنانام000ع. وأن التميزات الفعلية لهذا المريض تتمثل في مئة ٠ المعالجة » و1777 thpG-CSF ولخلايا promyelocyte ZY «+ + تقييمها لأغراض الضبط بنسبة
+ - جرثومة زائدة ZV « promyelocyte خلايا نخاعية؛ و78 خلايا نخاعية متبدلة 77١ شريط زائد كثيرات الخلايا «cells 714 خلايا وحيدة النواة ZY خلايا ملتهمة . ولعل ما يجدر ملاحظته هو أنه لا تزال واحدة من عديدة الأنوية الحبيبية للخلايا تحتوي على prominent aver rod ونشر على أقل تقدير إلى أن هذه الخلية Jus خلية متميزة تنتمي ٠ لخلايا سرطان الدم. أما الخلايا المأخوذة من المريض الثاني المصساب بسرطان الدم (M2) myelobloslic فقد تم أيضاً تزريعها لمدة 4 أيام في وجود أو غياب .thpG-CSF وأما ْ التحليل الضوئي/المرئي لخلايا 142 المزروعة بمفردها في وسط تزريع فقد أسفر عن وجود خلايا كبرى "شبه جرثومة" ؛ وبعضها نووي وعند معالجة بعض الخلايا M2 بواسطة 1ph-CSG نجد أنها تتميز إلى سلسلة تجمعات LA متعادلة بيضاء ناضجة لتظهر متيقيات قضبان auer Ye عام في مركز (لب) الخلايا المتعادلة البيضاء مما يدل على تميز يحدث في الخلايا بجانب الوحدة المستنسخة من سرطان الدم. وأن التمييز الفعلي لحوالي ٠٠١ خلية قد أسفر عن ظهور خلايا ضابطة متحكمة يتكون من قوام جرثومي بنسبة 7٠٠8 . أما الخلايا المعالجة من -000: CSF فهي تتكون من جراثيم بنسبة 747 وخلايا نخاعية بنسبة 771 وخلايا elas بديلة بنسبة ove وأشكال شريطة بنسبة 2748 مع خلايا متعادلة بيضاء متجمعة ؛ promoncytes بنسبة 7/ ١ وخلايا وحيدة النواة بنسبة .71١ تم أيضاً اختبار خلايا سرطان الدم (leukeminas eS sll) للتميز عند أربعة درجات أخرى لتركيز 087و رفي TV x0) انك مر +( وهي ٠١ x0 وحدة/ملي لتر (البيانات غير موضحة). حتى أنه عند الاختبار في تركيز ل thpG-CSF بأقل درجة )0 "yx وحدة/ملي لتر) اتضح أن هناك تميز ملحوظ (الخلديا cells تتميز فيما وراء الخلايا النخاعية) لل M3 )£0( و M2 (7797) لخلايا سرطان الدم . © +- التحليل المناعي
- qo —
لتحضير أجسام مضادة عديدة الاستتساخ (polyclonal) للتحليل المناعي يستعمل مولد مضاد (antigen) انتيجين من G-CSF متعددة الفعالية تتم تنقيته من خط خلية سرطان المثانة للإنسان 7177© (186) على نحو ما هو محضر في المثال ١ (ب). وتتم تتقية هذه المادة بنسبة تصل إلى ly 8 على نترات الفضة الصابغة لجل البولي أكريلاميد «(polyzerylamide gels) يتم ٠ تحضين ورفع صناعة فأر ily Balb/2 عمرة ستة أسابيع بحقنه بالأنتيجين antigen في مواقع عديدة تحت الجلد (subcutaneous) يعاد تحويل الأنتيجين antigen إلى معلق في PBS ويتم استحلابه بأحجام متساوية من Freund's المساعد التام. وتتراوح جرعة الأنتيجين antigen من © إلى ١ ميكرو جرام وتعطي للفأر بالحقن. وتعطي جرعة المنشط المناعي لمدة VA يوماً آخر بكمية متساوية من مستحلب الأنتيجين antigen وبنفس الحجم من المساعد غير freunds alll لمدة
٠ ؟ أيام أخرى ثم يؤخذ مصل الفأر للاختبار بالنسبة ل G-CSF ومتعددة الفعالية لدى الإنسان. وتغطي أشرطة Dynatech Lmmulon II Removawell بواسطة © ميكرو جرام/ملي لتر من hpG-CSF في ٠5٠ مللي مولر محلول منظم من كربونات أو بيكربونات carbonate-bicarbon ph <7 وتغطى الفتحات بواسطة ٠١,75 ميكرو جرام في حجم ٠ © ميكرو لتر. ويتم تحضين ألواح الأنتيجين antigen المغطاة sad ¥ ساعة عند درجة حرارة الغرفة وأثناء الليل عند ؛ ١ درجة مئوية. ويصفى المحلول وتحضن الألواح لمدة Vo دقيقة بواسطة PBS المحتوي على 75 BSA لوقف السطح الفعال. يصفى المحلول ثم يضاف preimmune المخفف أو مصل الاختبار إلى الفتحات وتحضن لمدة ساعة عند درجة حرارة الغرفة. تخفف الأمصال بواسطة PBS رقمها الهيدروجيني pH 7.١ المحتوية على 71 BSA يصفى محلول المصل وتغسل الألواح ؟ مرات بمحلول غسيل (KPL, Gaithersburg, Md) يضاف cpm ٠٠٠٠٠١ Ma من مضاد الفأر IgG ٠ الأرنب الأيوديني (NEN, Boston, Mass) في ٠٠ ميكرو لتر PBS عند رقم هيدروجيني -١7, ٠ pH المحتوية على BSA 7١ إلى كل فتحة (WELL) بعد التحضين لمدة ١١/١7 ساعة عند درجة حرارة dial يصفى المحلول وتغسل الألواح 0 مرات بمحلول غسيل. تزال الفتحات
_ 4 4 -—
(WELLS) من Jal gall ويتم elias) عددها بعداد .Beckman gamma ©0+ + Lala ويظهر مصل الفأر عالي العيارية فاعلية Alle أكبر ب ١١ جزء من مصل Preimmune القابل عند تخفيفه ٠٠١ :١ .
كما يتم تحديد الخواص المناعية لل hpG-CSF المشتق من 1.0011 بفاعليتها لمصل الفأر
© عالي العيارية وخاصة بالنسبة ل الخلية الثديية المشتقة من hpG-CSF .
وب ١,75 ميكرو جرام من بروتين protein نفي 749٠8 ومشتق من 1.0011 يتم تغطية لل Immulon II Removawells في حجم ٠ ميكرو لتر مصل فأر كما هو موصوف أعلاه . ويظهر مصل الفأر عالي العيارية YE جزءاً من الفعالية بالنسبة للمادة المشتقة من E.coil وبالنسبة لمصل Preimmune المقابل عند تخفيفه ٠٠١ :١ .
(Serine) التحليل الحيوي لنظير السيرين -7# ٠
حض_رت ¢ بق-مما7 ه15 » رتقه-ممطلا نمق hpG- « [Ser*]hpG-CSF, [Ser™]CSF, و [Ser"lhpG-CSF, وفقاً لما في المثال )3( ويتم فحصها بالنسبة لفاعلية hpG- CSF في ألتقاط- ثيميدين *H-thymidine وتحاليل CFU-GM و WEHI3B D+ في كل تحليل مشابه [Ser] له فاعلية مقارنة بالجزيئات الناتجة من sale) الإتحاد الجيني genetic والتي لها
١ تركيب طبيعي. المشابهات المتبقية الترتيب لها فاعلية أقل ب ٠٠١ جزء في ألتقاط 211- ثيميدين ٠٠ « *Hothymidine 7- جزءاً أقل فاعلية في تحليل -*٠ ٠١و CFU-GM جزءاً JF فاعلية في تحليل D+ 177211133 هذه المعلومات تسائد الافتراض الذي يقول أن الأحماض الأمينية amino 0 المتبلورة (Cyteines) عند المواضع 7 47؛ TE و؛7 قد تحتاج إلى فاعلية حيوية ALIS —A التحليل الحيوي في داخل جسم الإنسان
- ay — توصل مضخات Alzet® الإسموزية )2001 (Alzet Corp., Palo Alto, CA , Model بالوريد الوراجي وبواسطة أنبوبة التفريغ المثانة تحت الجلد في سبعة من ذكور من الهمستر hamster (حيوان شبيه بالجرد) الذهبي السورية. تحتوي أربع من المضخات على محلول منظم من ٠١( مللي مولر من أسيتات الصوديوم (pH =0,¢ sodium acetate و77 مللي مولر من كلوريد ٠ الصوديوم sodium chloride و ٠, مجلم/مللي لتر من phG-CSF المضتق من E.coil بيتما تحتوي الثلاث مضخات الأخرى على المحلول المنظم (Buffer) فقط. معدل الضخ للمضخات الإسموزية يكن ١ ميكرو لتر/ساعة لمدة 7 أيام. وفي اليوم الثالث بعد إدخال المضخات يكون متوسط عدد الخلايا المحببة للجرذات (الهلمتر) الأربعة المعالجة 7- أجزاء أعلى من الثلاث المحتوية على (محلول منظم) وهذه الزيادة في عدد الخلايا المحببة تتعكس في زيادة ؛ أجزاء في ٠ الخلايا الليمفاوية الإجمالية. لا يتغير عدد خلايا الدم الحمراء بالمعالجة. تشير هذه النتائج إلى أن المواد الناتجة من إعادة الاتحاد الجيني genetic تحدث زيادة في الإنتاج و/أو تحرير الخلايا . في الثدييات cells ؛ فإن الاختراع الحالي يشمل hpG-CSF بالإضافة إلى التواجد الطبيعي لجينات يشتمل وأجزاء من hpG-CSF من polypeptide منتجات أخرى ل 100-087 مشابهات البولي ببتيد في التالي ثاني خطوات الطلب المتشور المذكور أعلاه ل ألتون وآخرون hpG-CSF ١٠ بتعبير genes يمكن بسهولة تصميم وصناعة شفرة جينية (WO/83/04053) Alton, et al. ميكروبي له تكوين أولي يختلف عن الموضح هنا في خواصه موقعه لواحد أو أكثر التي لها من
DNA الاستبدالات والإضافات والوسطية والحذف). وخياراً يمكن تعديل ال Jie) التبقيات وجينات العوامل الوراثية بواسطة التقنية المعروفة بالموقع المباشر للجينات الطفرية والذي تشارك هذه النواتج على الأقل واحدة من الخواص Jue يستخدم لتوليد مشابهات ومشتقات مماثلة Yo ولكنها تختلف في الخواص الأخرى. على سبيل المثال منتجات hpG-CSF البيولوجية لل بواسطة الشطب أو تلك التي لا foreshortened موضوع الاختراع ؛ تتضمن التي لها قصور
- tA
تتحلل بالماء (إثبات نحو (Saal (ولذلك فإن تأثيرها يدوم أكثر من تلك ذات الوجود الطبيعي) أو تلك التي تتغير لشطب واحد أو أكثر من المواقع الفاعلة لل 7- جليكوسايلاشن 2-glycosylation (والتي تكون لها فاعلية أكثر للمنتجات الناتجة من الخميرة) أو تلك التي لها بقايا سيستين (Cysteine) واحدة أو أكثر مشطوبة أو مستبدلة بواسطة بقايا الانين (alanine) أوسيرين (Serine) © والتي تكون سهلة الفصل في شكل فعال من النظام الميكروبي أو التي لها بقايا تيروسين (Tyrosine) واحدة أو أكثر مستبدلة بالفينيل الاتين (phenylalanine) والتي بسهولة تقريباً ترتبط بمستقبلات hpG-CSF عند الخلايا المستهدفة. وكذلك Join أجزاء من البولي ببتيد (Polypeptide) تحمل أجزاء ثنائية مستمرة من سلاسل الحمض الأميني amino acid أو التكوينات الثانوية من خلال hp-CSF ؛ والتي تكون لأجزائها فاعلية واحدة مثل ؛ (ربط ٠ المستقبلات) وليست الأخرى (مثل ؛ فاعلية الضفر الإنتاجي) . والملاحظة المهمة أن الفعالية ض ليست ضرورية لأي واحدة أو أكثر من منتجات الاختراع لكي يكون لها استخدام علاجي [أنظر ويلاند وزملائه بيلوت ££( 76-1177 Blut, 44, 173-175 (1985) (Y4A0) ملة [Weiland, et أو الاستخدام في مجالات أخرى كما في تحليل مضادت hpG-CSF ؛ المضادات المنافسة قد
تكون مفيدة في حالات زيادة إنتاج phG-CSF . vo ووفقاً لتصو آخر للاختراع الحالي فإن سلسلة DNA الموصوفة هنا والمشفرة للبولي ببتيدات hpG-CSF (polypeptides) ذات أهمية بالنسبة للمعلومات ذات العلاقة بسلسلة الحمض الأميني amino 40 لبروتين protein الثدييات والتي ليست متوفرة حتى الآن بالرغم من عمليات تحليل فصل المنتجات المتاحة في الطبيعة. سلاسل DNA لها Lind قيمة واضحة كمنتجات مؤثرة في التشييد الميكروبي على المستوى الصناعي لإنتاج 100-087 بمختلف تقنيات إعادة الاتحاد ve الجيني 860600. ولكن بطريق AT فإن سلاسل DNA المتوفرة في هذا الاختراع مفيدة في توليد فيروس مفيد جديد وناقل كروموسومات DNA الدائرية « وخلايا بكتيرية مستتقبلة داخلية (eukaryotic) وخلايا بكتيرية مستقبلة(الحاضنة لنواة خلية معززة) (prokaryotic) (يتضمن خلايا
- qq - البكتريا bacterial cells والخميرة وخلايا الثدييات المزروعة في مزرعة) وطرق جديدة ومفيدة لزراعة Jue تلك الخلايا البكتيرية المستقبلة القادرة على التعديل الجيني genetic لل hpG-CSF والمنتجات المتعلقة به. سلاسل DNA للاختراع هي مواد مناسبة بوضوح للاستخدام كمجسات (probes) مشعة لفصل 106-0517 والبروتين protein المشفرة للجينات genomic الوراثية DNA م للإنسان بالإضافة cDNA J وسلاسل DNA للعوامل الوراثية للأصناف الأخرى من الثدييات. وقد تكون سلاسل DNA مفيدة في مختلف طرق تصنيع البروتين protein (خلايا الحتشرات) أو في العلاج الجيني genetic للإنسان والثدييات الأخرى. يتوقع أن تكون سلاسل DNA لهذا الاختراع مفيدة في التطوير الجيني genetic لأصناف الثشييات والتي قد تكون مفيدة كعوائل لها نواة حقيقية مستقبلة (eukaryotic) لإنتاج hpG-CSF ومنتجات 100-057 بكميات كبيرة. عموماً . Palmiter, et al., Science, 222 (4625), 809-814 (1983) أنظر » بالميتر وزملادئثه ٠ يصف الاختراع الفاعلية Polypeptide ومشابهات البولي ببتيدات hpG-CSF لتطبيق أجزاء ثنائية في amino acid المصنعة والتي تحصل سلسلة الحمض الأميني peptide المناعية للبتيدات النيكلوبروتينات » glycoprpteins الموجود في الطبيعة . الجليكوبروتينات protein البروتين ذات الوزن الجزيئشي polypeptide وقد اتضح بشكل خاص أن البولي ببتيدات .nucleoproteins المنخفض نسبياً تشارك في تفاعلات المناعة والتي تكون مشابهة في الفترة الزمنية وتمتد إلى ve مقل مضادات proteins الهامة للبروتينات physiologically تفاعلات المناعة الفسيولوجية وما شابه ذلك. ومن بين تفاعلات polypeptide hormones الفيبروسات هورمونات البولي ببتيد هو إثارة تكوين الأجسام المضادة في حيوانات نشطة polypeptide المناعة لهذه البولي ببتيدات
Sce, مع Lemer, et al., Cell, 23,309-310 (1981), Ross, et al., Nature, 294,654- . مناعياً 656 (1981), Walter, et al., Proc. Nalt/Acad. Sci. (USA), 77,5197-5200 (1980), Leer, et ٠٠ al., Proct. Nati. Acad. Sci. (USA), 78,3403-3407 (1981), Walter, et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. (USA), 78,4882-4886 (1981), Wong, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 78,7412-
VY. - — Green, et al., Cell, 28,477-487 (1982), Nigg, et al., Proc.
Natl.
Acad.Sci. ,)1981( 7416 (USA), 79,5322-5326 (1982), Baron, et al., Cell, 28,395-404 (1982), Dreesman, et al., Nature, 295,185-160 (1982), and Lerner, Scientific American, 248, No. 2,66-74 (1983). See, also, Kaiser, et al., Science, 233,249-255 (1984) . المتعلق بالفعالية والبيولوجية 0 للبتيدات peptide المشيدة والتي تشارك في التركيب الثانوي لهرمونات hormones الببتيد 6 ولكن قد يكون لها مشاركة في التركيب الأساسي . بينما يتم وصف الاختراع Jal في شكل تجسيدات ؛ يكون معلوماً أن التغيرات والتعديلات يمكن توفرها بالنسبة للخبراء في هذا المجال. لذلك كان القرض من عناصر الحماية أن تغطي مثل كل هذه التغيرات المتكافئة والتي جاءت في مجال الاختراع كعناصر محمية . ١ \o
Claims (1)
- - ١ -عناصر الحماية ١ ١ - جزيئٌ DNA منقى ومعزول ليستخدم في تأمين التعديل الجيني genetic في الخلية البكتيرية المستقبلة prokaryotic (الحاضنة لنواة خلية معززة) أو الخلية ؤ البكتيرية المستقبلة الداخلية eukaryotic ولمنتج عديد ببتيدات polypeptide الذي له 3 على الأقل جزء من التكوين البنائي الأساسي ؛ والنشاط الحيوي لتكوين الدم hematopoietic ° من مصدر طبيعي لإنتاج عامل حفزي لتكوين الخلية الحبيبية 1 متعددة الفعالية — يتم اختيار DNA المذكورة من بين : ١ (أ) جزيئات DNA الموضحة في الشكل YoY أو الأشكال المكملة لها ؛ + (ب) جزيئات DNA المهجنة hybridize إلى جزيئات DNA المعروفة في )1( أو 4 جزيئات من ذلك المصدر . ye )©( جزيئات DNA التي أختلت شفرتها الجينية genomic » يتم تهجيتها hybridize ١١ لجزيئات DNA والمعروفة في )1( و (ب) ٠ —Y ١ جزئي DNA نقي ومعزول والمشفر للتعديل الجيني genetic في الخلية Y البكتيرية المستقبلة prokaryotic (الحاضنة لنواة خلية معززة) أو الخلية البكتيرية 1 المستقبلة الداخلية (eukaryotic) ولمنتج عديد ببتيدات polypeptide الذي له على ¢ الأقل جزء من التكوين البنائي الأساسي ؛ والنشاط الحيوي لتكوين الدم (hematopoietic) 5 من مصدر طبيعي لإنتاج عامل حفزي لتكوين الخلية الحبيبية 1 متعددة الفعالية . =F ١ جزيئ cDNA وفقاً لعنصر الحماية ١ . ١ ؟- جزيئية DNA وفقاً لعنصر الحماية ٠ . \ ©- جزيئ DNA مصنع lB لعنصر الحماية 7 . ١ 1— جزيئ DNA مصنع وفقاً لعنصر الحماية ¢0 وتشتمل مستعمرة (codons) Y واحدة أو أكثر مفضلة للتعديل الجيني genetic في خلايا E.coli .yy - - -١/ ١ جزيئ DNA مصنع وفقاً لعنصر الحماية 0 تشتمل مستعمرة واحدة أو أكثر 7 مفضلة للتعديل الجيني genetic في خلايا الخميرة . =A ١ جزيئ DNA وفقاً لعنصر الحماية ¥ ؛ يرتبط بالتكافؤ التساهمي بالمادة الكاشفة Y المرقمة . ١ 4- جزيئ DNA وفقاً لعنصر الحماية A ¢ حيث المادة الكاشفة هي مشعة مرقمة radiolabel Y . DNA £252 -٠ ١ ذو تشكيل منفرد وفقاً لعنصر الحماية 8 . -١١ ١ جزيئ DNA نقي ومعزول ومشفر لجزء من عديد الببتيد polypeptide أو Y عديد الببتيد polypeptide المشابهة طبيعي المصدر لإنتاج عامل حفزي لتكوين AY Y الحبيبية متعددة الفعالية ولها نشاط حيوي لتكوين الدم من ذلك المصدر . -١ \ جزيئ DNA منقى ومعزول وفقاً لعنصر الحماية ١١ لتشفير hpG- [Ala']CSF Y . IY) بلازميد plasmid وظيفي حيوي أو فيروسي ناقل ل DNA يشتمل على 7 جزيئ Ga, DNA لأحد عناصر الحماية ٠ ؟ أو ١١ . ١ 64- خلية بكتيرية مستقبلة prokaryotic أو الخلية البكتيرية المستقبلة الداخلية (cukaryotic) |" تم تعديلها بواسطة ناقل DNA وفقاً لعنصر الحماية VW بطريقة 3 تسمح التعديل الجيني genetic لجزء من عديد الببتيد polypeptide المذكور أو ؛ - شبيهة . ١ - طريقة لإنتاج عديد الببتيد polypeptide له جزء من التكوين البنائي Y الأساسي أو كل التكوين الأساسي وله نشاط حيوي لتكوين الدم بواسطة عامل YF حفزي حث لتكوين الخلية الحبيبية متعددة الفعالية من مصدر طبيعي والطريقة ُ المذكورة تشتمل على : sell - © في ظروف تغذية مناسبة للخلايا البكتيرية (prokaryotic) ALE weal- س0 1 (الحاضنة لنواة خلية معززة) أو الخلية البكتيرية المستقبلة الداخلية (eukaryotic) Alaa VY بواسطة جزيئ DNA وفقاً لعنصر الحماية ١٠ ؟ أو ١١ ؛ بطريقة تسمح A بالتعديل الجيني genetic لمنتج عديد الببتيد polypeptide المذكور وعزل منتج 4 عديد الببتيد polypeptide من التعديل الجيني genetic لجزيئ DNA المذكور . ١ 7- جزيئ DNA منقى ومعزول Gay لعنصر الحماية ١١ ؛ لتشفير phG-] [Ser'"]CSF Y . -١١ ١ منتج عديد polypeptide afin للتعديل الجيني genetic في الخلية البكتيرية المستقبلة prolaryotic (حاضنة لنواة خلية معززة) أو الخلية البكتيرية المستقبلة ¥ الداخلية (eukaryotic) ل DNA وفقاً لعنصر الحماية 10 . VA) بلازميد وظيفي حيوي أو ناقل DNA فيروسي viral يشتمل على جزيئ Y 220 وفقاً لعنصر الحماية 1١ . ١ - خلية بكتيرية مستقبلة (a prokaryotic) (حاضنة لنواة خلية معززة) أو الخلية البكتيرية المستقبلة الداخلية (eukaryotic) خلية cell عدلت جينياً بواسطة ناقل ل a, 2218 0" لعنصر الحماية ١١7 . -7١ ١ جزيئ DNA منقى ومعزول By بعنصر الحماية ١١ ؛ لتشفير مشابهات ل hpG-CSF Y تم اختيارها من المجموعة المتكونة من : و [Met- '] hpG-CSF [Met- **] hpG-CSF ¢ [Met- *] hpG-CSF ° [Met- **] hpG-CSF 1 ل [Met- "*] hpG-CSF [Met-!, Ser'’] hpG-CSF A [Met-!, Ser*] hpG-CSF 9yi - - [Met-!, Ser*] hpG-CSF Ye [Met-', Ser*] hpG-CSF ١١ [Met-', Ser™] hpG-CSF VY -7١ ١ خلية بكتيرية (a prokaryotic) (حاضنة لنواة خلية معززة) أو الخلية ¥ البكتيرية المستقبلة الداخلية (eukaryotic) عدلت جينياً بواسطة جزيئ DNA وفقاً * - لعنصر الحماية ١؛ بطريقة تسمح لخلية مستقبلة بتعديل منتج عديد البيتيد polypeptide ¢ المذكور . —YY ١ خلية An E.coli مستقبلة وفقاً لعنصر الحماية 7١ . YY) خلية خميرة مستقبلة وفقاً لعنصر الحماية 7١ . ١ 4؛؟- خلية ثديية مستقبلة وفقاً لعنصر الحماية 7١ . —Yo ١ خلية 1ه».2 مستقبلة وفقاً لعنصر الحماية ١4 . -7١ ١ خلية خميرة مستخدمة وفقاً لعنصر الحماية ١4 . ١ 77- خلية ثديية مستقبلة لعنصر الحماية ٠4 . —YA ١ طريقة وفقاً لعنصر الحماية 10 ؛ حيث LAY المستقبلة المذكورة هي خلاياE.coli Y . —Y 4 ١ طريقة وفقاً لعنصر الحماية V0 ؛ حيث LAY المستقبلة المذكورة هي خلايا خميرة . ١ ©- طريقة وفقاً لعنصر الحماية 10 ؛ حيث LAY المذكورة هي خلايا ثديية . د
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US76895985A | 1985-08-23 | 1985-08-23 | |
| US06/835,548 US4810643A (en) | 1985-08-23 | 1986-03-03 | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| EP86905530A EP0237545B2 (en) | 1985-08-23 | 1986-08-22 | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SA92130186B1 true SA92130186B1 (ar) | 2006-09-09 |
Family
ID=27118107
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SA92130186A SA92130186B1 (ar) | 1985-08-23 | 1992-10-21 | إنتاج عامل حفاز لتكوين الخلية الحبيية granulocyte متعددة الفعاليه |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US4810643A (ar) |
| EP (1) | EP0237545B2 (ar) |
| JP (11) | JP2527365B2 (ar) |
| KR (1) | KR880700071A (ar) |
| CN (1) | CN1020924C (ar) |
| AT (1) | ATE332375T1 (ar) |
| AU (1) | AU6334686A (ar) |
| CA (1) | CA1341537C (ar) |
| CY (1) | CY1642A (ar) |
| DE (1) | DE3650788T2 (ar) |
| DK (1) | DK174980B1 (ar) |
| ES (1) | ES2001883A6 (ar) |
| FI (3) | FI105191B (ar) |
| GR (1) | GR862185B (ar) |
| HK (1) | HK1029600A1 (ar) |
| IL (1) | IL79805A (ar) |
| MX (1) | MX9202992A (ar) |
| NL (1) | NL930127I1 (ar) |
| NO (6) | NO303544B1 (ar) |
| NZ (1) | NZ217334A (ar) |
| PT (1) | PT83242B (ar) |
| SA (1) | SA92130186B1 (ar) |
| SG (2) | SG48964A1 (ar) |
| WO (1) | WO1987001132A1 (ar) |
Families Citing this family (339)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU594014B2 (en) * | 1984-03-21 | 1990-03-01 | Research Corporation Technologies, Inc. | Recombinant DNA molecules |
| US5718893A (en) * | 1984-04-15 | 1998-02-17 | Foster; Preston F. | Use of G-CSF to reduce acute rejection |
| EP0215126B1 (en) * | 1985-02-08 | 1991-07-31 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Human granulocyte colony stimulating factor |
| US5532341A (en) | 1985-03-28 | 1996-07-02 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Human pluripotent hematopoietic colony stimulating factor |
| US5078996A (en) * | 1985-08-16 | 1992-01-07 | Immunex Corporation | Activation of macrophage tumoricidal activity by granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
| US4810643A (en) * | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| US6004548A (en) | 1985-08-23 | 1999-12-21 | Amgen, Inc. | Analogs of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| NZ218336A (en) * | 1985-12-09 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Monoclonal antibodies to human pluripotent granulocyte colony stimulating factor (hpg-csf) |
| DK203187A (da) * | 1986-04-22 | 1987-10-23 | Immunex Corp | Human g-csf proteinekspression |
| GR871067B (en) * | 1986-07-18 | 1987-11-19 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Process for producing stable pharmaceutical preparation containing granulocyte colony stimulating factor |
| US5186931A (en) * | 1986-08-06 | 1993-02-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Composition and method for supporting bone marrow transplantation |
| JPH01500483A (ja) * | 1986-08-11 | 1989-02-23 | シタス コーポレイション | Ｇ‐ｃｓｆ及びそのミューテインの発現 |
| JPH0618781B2 (ja) * | 1986-10-18 | 1994-03-16 | 中外製薬株式会社 | 感染症治療剤 |
| US6238889B1 (en) * | 1986-12-16 | 2001-05-29 | Dsm N.V. | Molecular cloning and expression of the Pro8 isoform of human IL-3 |
| US5362853A (en) * | 1986-12-23 | 1994-11-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| US5214132A (en) * | 1986-12-23 | 1993-05-25 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| JP2618618B2 (ja) * | 1988-03-04 | 1997-06-11 | 協和醗酵工業株式会社 | 抗ｇ−ｃｓｆ誘導体、ｎｄ２８モノクローナル抗体 |
| DK174044B1 (da) | 1986-12-23 | 2002-05-06 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Polypeptid afledt fra human granulocytkolonistimulerende faktor, og fremgangsmåde til fremstilling deraf, DNA kodende for nævnte polypeptid, rekombinant plasmid indeholdende nævnte DNA, og mikroorganismer indeholdende nævnte rekombinante plasmid....... |
| US5194592A (en) * | 1986-12-23 | 1993-03-16 | Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. | Monoclonal antibodies to novel polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| US5714581A (en) * | 1986-12-23 | 1998-02-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Polypeptide derivatives of human granulocyte colony stimulating factor |
| US6384194B1 (en) * | 1987-12-16 | 2002-05-07 | Dsm N.V. | Expression and purification of human interleukin-3 and muteins thereof |
| GB2213821B (en) * | 1987-12-23 | 1992-01-02 | British Bio Technology | Synthetic human granulocyte colony stimulating factor gene |
| US5599690A (en) * | 1988-02-01 | 1997-02-04 | Amgen Inc. | Control of norleucine incorporation into recombinant proteins |
| CA1329119C (en) * | 1988-03-29 | 1994-05-03 | Milton David Goldenberg | Cytotoxic therapy |
| US20030232010A2 (en) * | 1988-03-29 | 2003-12-18 | Immunomedics, Inc. | Improved cytotoxic therapy |
| EP0347041A3 (en) * | 1988-05-13 | 1990-11-22 | Amgen Inc. | Compositions and method for treating or preventing infections in animals |
| US5070013A (en) * | 1988-05-31 | 1991-12-03 | Schering Corporation | Immunochemical assay for human granulocyte-macrophage colony stimulating factor |
| US5082774A (en) * | 1988-08-30 | 1992-01-21 | The General Hospital Corporation | Recombinant human nerve growth factor |
| US5218092A (en) * | 1988-09-29 | 1993-06-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Modified granulocyte-colony stimulating factor polypeptide with added carbohydrate chains |
| US5104651A (en) * | 1988-12-16 | 1992-04-14 | Amgen Inc. | Stabilized hydrophobic protein formulations of g-csf |
| US20020177688A1 (en) * | 1988-12-22 | 2002-11-28 | Kirin-Amgen, Inc., | Chemically-modified G-CSF |
| US6166183A (en) * | 1992-11-30 | 2000-12-26 | Kirin-Amgen, Inc. | Chemically-modified G-CSF |
| ATE135370T1 (de) * | 1988-12-22 | 1996-03-15 | Kirin Amgen Inc | Chemisch modifizierte granulocytenkolonie erregender faktor |
| AU5355790A (en) * | 1989-04-19 | 1990-11-16 | Cetus Corporation | Multifunctional m-csf proteins and genes encoding therefor |
| US6254861B1 (en) * | 1989-05-23 | 2001-07-03 | Chandra Choudhury | Hematopoietic growth factor derived from T lymphocytes |
| US5635386A (en) * | 1989-06-15 | 1997-06-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods for regulating the specific lineages of cells produced in a human hematopoietic cell culture |
| US5605822A (en) * | 1989-06-15 | 1997-02-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods, compositions and devices for growing human hematopoietic cells |
| US5763266A (en) * | 1989-06-15 | 1998-06-09 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods, compositions and devices for maintaining and growing human stem and/or hematopoietics cells |
| WO1990015877A2 (en) * | 1989-06-15 | 1990-12-27 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods, compositions and devices for growing cells |
| US6203976B1 (en) | 1989-07-18 | 2001-03-20 | Osi Pharmaceuticals, Inc. | Methods of preparing compositions comprising chemicals capable of transcriptional modulation |
| US5776502A (en) | 1989-07-18 | 1998-07-07 | Oncogene Science, Inc. | Methods of transcriptionally modulating gene expression |
| US5665543A (en) * | 1989-07-18 | 1997-09-09 | Oncogene Science, Inc. | Method of discovering chemicals capable of functioning as gene expression modulators |
| US5580722A (en) * | 1989-07-18 | 1996-12-03 | Oncogene Science, Inc. | Methods of determining chemicals that modulate transcriptionally expression of genes associated with cardiovascular disease |
| EP0648501A1 (en) * | 1989-10-10 | 1995-04-19 | Amgen Inc. | Compositions comprising G-CSF for treating or preventing infections in canine and feline animals |
| CA2025181A1 (en) * | 1989-10-12 | 1991-04-13 | William G. Weisburg | Nucleic acid probes and methods for detecting fungi |
| US20040181044A1 (en) * | 1989-10-16 | 2004-09-16 | Zsebo Krisztina M. | Method of stimulating growth of epithelial cells by administering stem cell factor |
| HU220234B (hu) * | 1989-10-16 | 2001-11-28 | Amgen Inc. | Eljárás stem sejtek működését befolyásoló faktorok előállitására |
| ZA907921B (en) | 1989-10-16 | 1991-08-28 | Amgen Inc | Stem cell factor |
| US6852313B1 (en) | 1989-10-16 | 2005-02-08 | Amgen Inc. | Method of stimulating growth of melanocyte cells by administering stem cell factor |
| US7144731B2 (en) * | 1989-10-16 | 2006-12-05 | Amgen Inc. | SCF antibody compositions and methods of using the same |
| EP1241258A3 (en) * | 1989-10-16 | 2003-12-10 | Amgen Inc. | Stem cell factor |
| US5214133A (en) * | 1989-11-17 | 1993-05-25 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | SCL: a hematopoietic growth and differentiation factor |
| US5132212A (en) * | 1989-11-17 | 1992-07-21 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Scl gene, and a hematopoietic growth and differentiation factor encoded thereby |
| JPH04218000A (ja) * | 1990-02-13 | 1992-08-07 | Kirin Amgen Inc | 修飾ポリペプチド |
| US5147799A (en) * | 1990-04-25 | 1992-09-15 | Isia Bursuker | Repopulation of macrophages and granulocytes using transforming growth factor-beta |
| GB9107846D0 (en) * | 1990-04-30 | 1991-05-29 | Ici Plc | Polypeptides |
| US5399345A (en) * | 1990-05-08 | 1995-03-21 | Boehringer Mannheim, Gmbh | Muteins of the granulocyte colony stimulating factor |
| US5258367A (en) * | 1990-06-29 | 1993-11-02 | University Of Florida | Uteroferrin and rose proteins for stimulating hematopoietic cells |
| IE912365A1 (en) * | 1990-07-23 | 1992-01-29 | Zeneca Ltd | Continuous release pharmaceutical compositions |
| JPH05506673A (ja) * | 1991-02-22 | 1993-09-30 | アムジエン・インコーポレーテツド | 迅速な創傷の治癒を促進するためのｇｍ―ｃｓｆ及びｇ―ｃｓｆの使用 |
| DE69233336T2 (de) * | 1991-02-26 | 2005-03-31 | Astrazeneca Ab | Vektor |
| US6565841B1 (en) | 1991-03-15 | 2003-05-20 | Amgen, Inc. | Pulmonary administration of granulocyte colony stimulating factor |
| FR2686899B1 (fr) * | 1992-01-31 | 1995-09-01 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant. |
| US5772992A (en) * | 1992-11-24 | 1998-06-30 | G.D. Searle & Co. | Compositions for co-administration of interleukin-3 mutants and other cytokines and hematopoietic factors |
| US7091319B1 (en) | 1992-11-24 | 2006-08-15 | Bauer S Christopher | IL-3 variant hematopoiesis fusion protein |
| US6361976B1 (en) | 1992-11-24 | 2002-03-26 | S. Christopher Bauer | Co-administration of interleukin-3 mutant polypeptides with CSF'S for multi-lineage hematopoietic cell production |
| US6153183A (en) * | 1992-11-24 | 2000-11-28 | G. D. Searle & Company | Co-administration of interleukin-3 mutant polypeptides with CSF's or cytokines for multi-lineage hematopoietic cell production |
| US6361977B1 (en) | 1992-11-24 | 2002-03-26 | S. Christopher Bauer | Methods of using multivariant IL-3 hematopoiesis fusion protein |
| US6057133A (en) * | 1992-11-24 | 2000-05-02 | G. D. Searle | Multivariant human IL-3 fusion proteins and their recombinant production |
| US6413509B1 (en) | 1992-11-24 | 2002-07-02 | S. Christopher Bauer | Methods of ex-vivo expansion of hematopoietic cells using interleukin-3 mutant polypeptides with other hematopoietic growth factors |
| US5738849A (en) * | 1992-11-24 | 1998-04-14 | G. D. Searle & Co. | Interleukin-3 (IL-3) variant fusion proteins, their recombinant production, and therapeutic compositions comprising them |
| US6403076B1 (en) | 1992-11-24 | 2002-06-11 | S. Christopher Bauer | Compositions for increasing hematopoiesis with interleukin-3 mutants |
| AU2007200247B2 (en) * | 1993-01-28 | 2011-03-10 | Amgen Inc. | G-CSF analog compositions |
| US5581476A (en) * | 1993-01-28 | 1996-12-03 | Amgen Inc. | Computer-based methods and articles of manufacture for preparing G-CSF analogs |
| DE69435224D1 (de) | 1993-09-15 | 2009-09-10 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Rekombinante Alphavirus-Vektoren |
| US5874075A (en) * | 1993-10-06 | 1999-02-23 | Amgen Inc. | Stable protein: phospholipid compositions and methods |
| US20050059149A1 (en) * | 1993-11-22 | 2005-03-17 | Bauer S. Christopher | Methods of ex-vivo expansion of hematopoeitic cells using multivariant IL-3 hematopoiesis chimera proteins |
| CA2139385C (en) * | 1994-02-04 | 2001-12-25 | Gottfried Alber | Products containing g-csf and tnf binding protein |
| US6242417B1 (en) | 1994-03-08 | 2001-06-05 | Somatogen, Inc. | Stabilized compositions containing hemoglobin |
| US5631219A (en) * | 1994-03-08 | 1997-05-20 | Somatogen, Inc. | Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin |
| EP0755263A4 (en) * | 1994-03-31 | 2005-02-09 | Amgen Inc | COMPOUNDS AND METHODS FOR STIMULATING MEGAKARYOCYTE GROWTH AND THEIR DIFFERENTIATION |
| US5795569A (en) * | 1994-03-31 | 1998-08-18 | Amgen Inc. | Mono-pegylated proteins that stimulate megakaryocyte growth and differentiation |
| US5536495A (en) * | 1994-04-15 | 1996-07-16 | Foster; Preston F. | Use of G-CSF to reduce acute rejection |
| US20030053982A1 (en) * | 1994-09-26 | 2003-03-20 | Kinstler Olaf B. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| US5824784A (en) | 1994-10-12 | 1998-10-20 | Amgen Inc. | N-terminally chemically modified protein compositions and methods |
| US6100070A (en) * | 1995-10-05 | 2000-08-08 | G. D. Searle & Co. | G-CSF receptor agonists |
| US6066318A (en) * | 1995-10-05 | 2000-05-23 | G.D. Searle & Co. | Multi-functional hematopoietic fusion proteins between sequence rearranged C-MPL receptor agonists and other hematopoietic factors |
| JP4383530B2 (ja) | 1996-04-05 | 2009-12-16 | ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス， インコーポレーテッド | 細胞巨大分子合成の阻害が減少したアルファウイルスベクター |
| CA2266656A1 (en) | 1996-09-17 | 1998-03-26 | Chiron Corporation | Compositions and methods for treating intracellular diseases |
| US6162426A (en) * | 1997-05-05 | 2000-12-19 | La Gamma; Edmund F. | Use of G-CSF to enhance the immune system in neonates |
| US7153943B2 (en) | 1997-07-14 | 2006-12-26 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof |
| US20080076706A1 (en) | 1997-07-14 | 2008-03-27 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivatives of Growth Hormone and Related Proteins, and Methods of Use Thereof |
| US7495087B2 (en) | 1997-07-14 | 2009-02-24 | Bolder Biotechnology, Inc. | Cysteine muteins in the C-D loop of human interleukin-11 |
| ES2297889T3 (es) * | 1997-07-14 | 2008-05-01 | Bolder Biotechnology, Inc. | Derivados de hormona de crecimiento y proteinas relacionadas. |
| US6753165B1 (en) * | 1999-01-14 | 2004-06-22 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
| US6017876A (en) | 1997-08-15 | 2000-01-25 | Amgen Inc. | Chemical modification of granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) bioactivity |
| JP4891477B2 (ja) * | 1997-10-02 | 2012-03-07 | マックス−プランク−ゲゼルシャフト ツール フォーデルング デル ヴィッセンシャフテン エー．ヴェー． | 血管新生及び／または既存細動脈網から側枝動脈及び／または他の動脈の発達の調節に関する方法 |
| US20020034819A1 (en) * | 1998-02-23 | 2002-03-21 | Alan K. Smith | Human lineage committed cell composition with enhanced proliferative potential, biological effector function, or both; methods for obtaining same; and their uses |
| US6541033B1 (en) | 1998-06-30 | 2003-04-01 | Amgen Inc. | Thermosensitive biodegradable hydrogels for sustained delivery of leptin |
| CN1101403C (zh) * | 1998-07-13 | 2003-02-12 | 金磊 | 粒细胞集落刺激因子的制备 |
| US6979442B1 (en) | 1998-08-17 | 2005-12-27 | Pfizer Inc. | Stabilized protein compositions |
| US5999474A (en) | 1998-10-01 | 1999-12-07 | Monolithic System Tech Inc | Method and apparatus for complete hiding of the refresh of a semiconductor memory |
| US6420339B1 (en) | 1998-10-14 | 2002-07-16 | Amgen Inc. | Site-directed dual pegylation of proteins for improved bioactivity and biocompatibility |
| US6245740B1 (en) | 1998-12-23 | 2001-06-12 | Amgen Inc. | Polyol:oil suspensions for the sustained release of proteins |
| US6451346B1 (en) * | 1998-12-23 | 2002-09-17 | Amgen Inc | Biodegradable pH/thermosensitive hydrogels for sustained delivery of biologically active agents |
| CA2360347C (en) | 1998-12-31 | 2013-05-07 | Chiron Corporation | Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles |
| US7935805B1 (en) | 1998-12-31 | 2011-05-03 | Novartis Vaccines & Diagnostics, Inc | Polynucleotides encoding antigenic HIV Type C polypeptides, polypeptides and uses thereof |
| JP4092081B2 (ja) | 1999-01-06 | 2008-05-28 | ゼンコー・インコーポレイテッド | 顆粒球形成活性を有するｇ−ｃｓｆ変異体相当核酸およびタンパク質 |
| US7208473B2 (en) * | 1999-01-06 | 2007-04-24 | Xencor, Inc. | Nucleic acids and protein variants of hG-CSF with granulopoietic activity |
| US8288126B2 (en) | 1999-01-14 | 2012-10-16 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods for making proteins containing free cysteine residues |
| DE60041386D1 (de) | 1999-01-19 | 2009-03-05 | Molecular Insight Pharm Inc | Konjugate des granulozyten-kolonie stimulierenden faktors zur gezielten bildgebung von infektionen und entzündungen |
| HU228488B1 (en) * | 1999-01-29 | 2013-03-28 | Amgen Inc | Gcsf conjugates |
| US6365583B1 (en) | 1999-02-02 | 2002-04-02 | Anormed, Inc. | Methods to enhance white blood cell count |
| KR100356140B1 (ko) * | 1999-07-08 | 2002-10-19 | 한미약품공업 주식회사 | 인간 과립구 콜로니 자극인자 변이체 및 이의 생산 방법 |
| US8106098B2 (en) * | 1999-08-09 | 2012-01-31 | The General Hospital Corporation | Protein conjugates with a water-soluble biocompatible, biodegradable polymer |
| AU784195B2 (en) | 1999-11-12 | 2006-02-16 | Baxter Biotech Technology S.A.R.L. | Reduced side-effect hemoglobin compositions |
| US6646110B2 (en) * | 2000-01-10 | 2003-11-11 | Maxygen Holdings Ltd. | G-CSF polypeptides and conjugates |
| US6831158B2 (en) * | 2000-01-10 | 2004-12-14 | Maxygen Holdings Ltd. | G-CSF conjugates |
| US6555660B2 (en) * | 2000-01-10 | 2003-04-29 | Maxygen Holdings Ltd. | G-CSF conjugates |
| AR027509A1 (es) | 2000-01-10 | 2003-04-02 | Maxygen Aps | Conjugados g-csf |
| CA2337661A1 (en) | 2000-02-29 | 2001-08-29 | Pfizer Products Inc. | Stabilized granulocyte colony stimulating factor |
| CN1420776A (zh) * | 2000-03-31 | 2003-05-28 | 塞尔基因公司 | 环氧合酶－2活性的抑制 |
| US6926898B2 (en) | 2000-04-12 | 2005-08-09 | Human Genome Sciences, Inc. | Albumin fusion proteins |
| US8435939B2 (en) | 2000-09-05 | 2013-05-07 | Biokine Therapeutics Ltd. | Polypeptide anti-HIV agent containing the same |
| CA2421760A1 (en) * | 2000-09-08 | 2002-03-14 | Massachusetts Institute Of Technology | G-csf analog compositions and methods |
| US20020150979A1 (en) * | 2000-10-04 | 2002-10-17 | Naokazu Naitou | Process for producing a protein |
| DE60130799T2 (de) * | 2000-11-30 | 2008-07-17 | Children's Medical Center Corp., Boston | Synthese von 4-aminothalidomid enantiomeren |
| EP1229045A1 (en) * | 2001-02-01 | 2002-08-07 | Institut Curie | Universal carrier for targeting molecules to Gb3 receptor expressing cells |
| WO2002069232A2 (en) | 2001-02-19 | 2002-09-06 | Merck Patent Gmbh | Method for identification of t-cell epitopes and use for preparing molecules with reeduced immunogenicity |
| FR2820979B1 (fr) | 2001-02-22 | 2004-03-12 | Didier Pourquier | Nouvelle application therapeutique du g-csf |
| US6956023B1 (en) | 2001-04-19 | 2005-10-18 | University Of Florida | Materials and methods for providing nutrition to neonates |
| EP2280074A3 (en) | 2001-07-05 | 2011-06-22 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Polynucleotides encoding antigenic HIV type B and/or type C polypeptides, polypeptides and uses thereof |
| US7211659B2 (en) | 2001-07-05 | 2007-05-01 | Chiron Corporation | Polynucleotides encoding antigenic HIV type C polypeptides, polypeptides and uses thereof |
| JP4444652B2 (ja) | 2001-07-11 | 2010-03-31 | マキシゲン・ホールディングズ・リミテッド | Ｇ−ｃｓｆ結合体 |
| US7169750B2 (en) * | 2001-07-31 | 2007-01-30 | Anormed, Inc. | Methods to mobilize progenitor/stem cells |
| US6987102B2 (en) | 2001-07-31 | 2006-01-17 | Anormed, Inc. | Methods to mobilize progenitor/stem cells |
| US20030104996A1 (en) * | 2001-08-30 | 2003-06-05 | Tiansheng Li | L-methionine as a stabilizer for NESP/EPO in HSA-free formulations |
| CN102180944A (zh) | 2001-10-10 | 2011-09-14 | 诺和诺德公司 | 肽的重构和糖缀合 |
| AU2004236174B2 (en) | 2001-10-10 | 2011-06-02 | Novo Nordisk A/S | Glycopegylation methods and proteins/peptides produced by the methods |
| ZA200700168B (en) | 2001-10-10 | 2010-02-24 | Novo Nordisk As | Remodeling and glycoconjugation of peptides |
| SI21102A (sl) | 2001-12-19 | 2003-06-30 | LEK, tovarna farmacevtskih in kemi�nih izdelkov, d.d. | Postopek za izolacijo biološko aktivnega granulocitne kolonije stimulirajočega dejavnika |
| ES2500918T3 (es) | 2001-12-21 | 2014-10-01 | Human Genome Sciences, Inc. | Proteínas de fusión de albúmina e interferón beta |
| KR20030062854A (ko) * | 2002-01-21 | 2003-07-28 | 주식회사 엘지생명과학 | 분비형 벡터를 이용한 효모에서의 재조합 단백질의 제조방법 |
| KR100508358B1 (ko) * | 2002-03-20 | 2005-08-17 | 주식회사 바이오폴리메드 | 생체적합성 고분자가 시스테인 잔기에 화학양론적으로 결합된 ｇ-ｃｓｆ의 제조 방법 |
| US20030191056A1 (en) | 2002-04-04 | 2003-10-09 | Kenneth Walker | Use of transthyretin peptide/protein fusions to increase the serum half-life of pharmacologically active peptides/proteins |
| EP1497437A4 (en) | 2002-05-01 | 2005-11-16 | Cell Genesys Inc | LENTIVIRAL VECTOR PARTICLES RESISTANT TO THE INACTIVATION OF A COMPLEMENT |
| US7323479B2 (en) * | 2002-05-17 | 2008-01-29 | Celgene Corporation | Methods for treatment and management of brain cancer using 1-oxo-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-4-methylisoindoline |
| US20100129363A1 (en) * | 2002-05-17 | 2010-05-27 | Zeldis Jerome B | Methods and compositions using pde4 inhibitors for the treatment and management of cancers |
| US7393862B2 (en) | 2002-05-17 | 2008-07-01 | Celgene Corporation | Method using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for treatment of certain leukemias |
| USRE48890E1 (en) | 2002-05-17 | 2022-01-11 | Celgene Corporation | Methods for treating multiple myeloma with 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydroisoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione after stem cell transplantation |
| NZ536908A (en) | 2002-05-17 | 2008-09-26 | Celgene Corp | Treating or preventing cancer comprising administering an effective amount of cytokine inhibitory drug plus a second active ingredient |
| EP1505973B1 (en) | 2002-05-17 | 2010-03-03 | Celgene Corporation | Combinations for treating multiple myeloma |
| US7968569B2 (en) | 2002-05-17 | 2011-06-28 | Celgene Corporation | Methods for treatment of multiple myeloma using 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione |
| US7081443B2 (en) | 2002-05-21 | 2006-07-25 | Korea Advanced Institutes Of Science And Technology (Kaist) | Chimeric comp-ang1 molecule |
| AU2002345829A1 (en) * | 2002-06-24 | 2004-01-06 | Dr. Reddy's Laboratories Ltd. | Process for preparing g-csf |
| SI21273A (sl) * | 2002-07-31 | 2004-02-29 | LEK farmacevtska dru�ba d.d. | Priprava inkluzijskih teles z visokim deležem pravilno zvitega prekurzorja heterolognega proteina |
| WO2004020462A1 (ja) | 2002-08-27 | 2004-03-11 | Fujii, Nobutaka | Ｃｘｃｒ４拮抗薬およびその用途 |
| WO2004022593A2 (en) * | 2002-09-09 | 2004-03-18 | Nautilus Biotech | Rational evolution of cytokines for higher stability, the cytokines and encoding nucleic acid molecules |
| US8404717B2 (en) * | 2002-10-15 | 2013-03-26 | Celgene Corporation | Methods of treating myelodysplastic syndromes using lenalidomide |
| US11116782B2 (en) | 2002-10-15 | 2021-09-14 | Celgene Corporation | Methods of treating myelodysplastic syndromes with a combination therapy using lenalidomide and azacitidine |
| US7189740B2 (en) | 2002-10-15 | 2007-03-13 | Celgene Corporation | Methods of using 3-(4-amino-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione for the treatment and management of myelodysplastic syndromes |
| US8404716B2 (en) | 2002-10-15 | 2013-03-26 | Celgene Corporation | Methods of treating myelodysplastic syndromes with a combination therapy using lenalidomide and azacitidine |
| EP1900369A1 (en) | 2002-10-15 | 2008-03-19 | Celgene Corporation | Methods of using and compositions comprising immunomodulatory compounds for the treatment and management of myelodysplastic syndromes |
| KR20050056247A (ko) * | 2002-10-15 | 2005-06-14 | 셀진 코포레이션 | 골수형성이상증후군의 치료 및 관리를 위한 선택적인사이토킨 저해 약물의 사용 방법 및 이를 포함하는 조성물 |
| KR20090048520A (ko) | 2002-11-06 | 2009-05-13 | 셀진 코포레이션 | 암 및 다른 질환의 치료 및 관리를 위한 선택적 시토킨 억제 약물의 사용 방법 및 그 조성물 |
| KR20050086780A (ko) * | 2002-11-26 | 2005-08-30 | 안트로제네시스 코포레이션 | 세포요법제, 세포요법제 단위 및 이를 이용한 치료방법 |
| US7785601B2 (en) * | 2002-12-31 | 2010-08-31 | Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg | Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors |
| US7695723B2 (en) * | 2002-12-31 | 2010-04-13 | Sygnis Bioscience Gmbh & Co. Kg | Methods of treating neurological conditions with hematopoietic growth factors |
| WO2004058287A2 (en) * | 2002-12-31 | 2004-07-15 | Axaron Bioscience Ag | Methods of treating neurological conditions with hematopoeitic growth factors |
| EP1601248A4 (en) * | 2003-02-13 | 2010-01-27 | Anthrogenesis Corp | USE OF UMBILICAL CORD BLOOD FOR TREATING INDIVIDUALS WITH DISEASE, DISORDER OR PATHOLOGY |
| ES2436606T3 (es) | 2003-03-12 | 2014-01-03 | Celgene Corporation | Compuestos de 7-amido-isoindolilo y sus usos farmacéuticos |
| CA2521979A1 (en) * | 2003-04-09 | 2004-10-28 | University Of Utah Research Foundation | Compositions and methods related to production of erythropoietin |
| MXPA05011353A (es) * | 2003-04-22 | 2005-11-28 | Anormed Inc | Compuestos heterociclicos que se unen al receptor de quimiocina con eficacia mejorada. |
| US7501518B2 (en) * | 2003-04-22 | 2009-03-10 | Genzyme Corporation | Methods of making 2,6-diaryl piperidine derivatives |
| WO2005018663A1 (en) * | 2003-08-22 | 2005-03-03 | The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research | G-csf derivative for inducing immunological tolerance |
| UA83504C2 (en) | 2003-09-04 | 2008-07-25 | Селджин Корпорейшн | Polymorphic forms of 3-(4-amino-1-oxo-1,3 dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione |
| US7220407B2 (en) * | 2003-10-27 | 2007-05-22 | Amgen Inc. | G-CSF therapy as an adjunct to reperfusion therapy in the treatment of acute myocardial infarction |
| OA13284A (en) * | 2003-11-06 | 2007-01-31 | Corporation Celgene | Methods and compositions using thalidomide for thetreatment and management of cancers and other dis eases. |
| EP1694328A4 (en) * | 2003-12-02 | 2010-02-17 | Celgene Corp | METHOD AND COMPOSITIONS FOR THE TREATMENT AND SUPPLY OF HEMOGLOBINOPATHY AND ANEMIA |
| CA2552241C (en) | 2003-12-30 | 2013-10-01 | Durect Corporation | Co-polymeric devices for controlled release of active agents |
| US8906676B2 (en) * | 2004-02-02 | 2014-12-09 | Ambrx, Inc. | Modified human four helical bundle polypeptides and their uses |
| SE0400942D0 (sv) * | 2004-04-08 | 2004-04-08 | Henrik Arnberg | Composition and method |
| US20080213213A1 (en) * | 2004-04-14 | 2008-09-04 | Zeldis Jerome B | Method For the Treatment of Myelodysplastic Syndromes Using (+)-2-[1-(3-Ethoxy-4-Methoxyphenyl)-2-Methylsulfonylethyl]-4-Acetylaminoisoindoline-1,3-Dione |
| US20080199422A1 (en) * | 2004-04-14 | 2008-08-21 | Celgene Corporation | Method for the Treatment of Myelodysplastic Syndromes Using 1-Oxo-2-(2,6-Dioxopiperidin-3-Yl-)-4-Methylisoindoline |
| EP1586334A1 (en) * | 2004-04-15 | 2005-10-19 | TRASTEC scpa | G-CSF conjugates with peg |
| AU2005273968A1 (en) * | 2004-08-09 | 2006-02-23 | Alios Biopharma Inc. | Synthetic hyperglycosylated, protease-resistant polypeptide variants, oral formulations and methods of using the same |
| US7597884B2 (en) * | 2004-08-09 | 2009-10-06 | Alios Biopharma, Inc. | Hyperglycosylated polypeptide variants and methods of use |
| CA2577046A1 (en) * | 2004-08-13 | 2006-02-23 | Anormed Inc. | Chemokine combinations to mobilize progenitor/stem cells |
| US20120225044A9 (en) * | 2004-09-07 | 2012-09-06 | Zymequest, Inc. | Compositions and methods for prolonging survival of platelets |
| ES2376777T3 (es) | 2004-09-07 | 2012-03-16 | Velico Medical, Inc. | Aparato para prolongar la supervivencia de plaquetas |
| US7691365B2 (en) | 2004-09-28 | 2010-04-06 | Aprogen, Inc. | Methods of using chimeric coiled coil molecule to treat ischemic disease |
| GB0505353D0 (en) | 2005-03-16 | 2005-04-20 | Chem Technologies Ltd E | Treatment process for concrete |
| EP1814583A2 (en) | 2004-11-01 | 2007-08-08 | Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. | Combination approaches for generating immune responses |
| EP1817047B1 (en) | 2004-11-05 | 2012-02-08 | Northwestern University | Use of scf and g-csf in the treatment of cerebral ischemia and neurological disorders |
| WO2006067170A1 (en) * | 2004-12-23 | 2006-06-29 | Laboratoires Serono S.A. | G-csf polypeptides and uses thereof |
| EP1858543B1 (en) | 2005-01-10 | 2013-11-27 | BioGeneriX AG | Glycopegylated granulocyte colony stimulating factor |
| WO2006081249A2 (en) | 2005-01-25 | 2006-08-03 | Cell Therapeutics, Inc. | Conjugates of biologically active proteins having a modified in vivo half-life |
| US20060270707A1 (en) * | 2005-05-24 | 2006-11-30 | Zeldis Jerome B | Methods and compositions using 4-[(cyclopropanecarbonylamino)methyl]-2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)isoindole-1,3-dione for the treatment or prevention of cutaneous lupus |
| CN101193658B (zh) * | 2005-06-01 | 2011-08-31 | 马克西根控股公司 | 聚乙二醇化g-csf多肽及其产生方法 |
| EP1739179A1 (en) | 2005-06-30 | 2007-01-03 | Octapharma AG | Serum-free stable transfection and production of recombinant human proteins in human cell lines |
| DE102005033250A1 (de) | 2005-07-15 | 2007-01-18 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | Verfahren zur Reinigung von G-CSF |
| KR100735784B1 (ko) * | 2005-07-20 | 2007-07-06 | 재단법인 목암생명공학연구소 | 인간 과립구콜로니자극인자 변이체 및 이의 화학적 접합물 |
| WO2007019331A2 (en) * | 2005-08-04 | 2007-02-15 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Conjugates of a g-csf moiety and a polymer |
| US8580814B2 (en) * | 2006-04-03 | 2013-11-12 | Sunesis Pharmaceuticals, Inc. | Methods of using (+)-1,4-dihydro-7-[(3S,4S)-3-methoxy-4-(methylamino)-1-pyrrolidinyl]-4- oxo-1-(2-thiazolyl)-1,8-naphthyridine-3-carboxylic acid for treatment of cancer |
| US20080138295A1 (en) * | 2005-09-12 | 2008-06-12 | Celgene Coporation | Bechet's disease using cyclopropyl-N-carboxamide |
| US20070155791A1 (en) * | 2005-12-29 | 2007-07-05 | Zeldis Jerome B | Methods for treating cutaneous lupus using aminoisoindoline compounds |
| US20100035941A1 (en) * | 2006-02-24 | 2010-02-11 | Bridger Gary J | Methods for increasing blood flow and/or promoting tissue regeneration |
| DE202006020194U1 (de) | 2006-03-01 | 2007-12-06 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | G-CSF-Flüssigformulierung |
| WO2007102814A2 (en) * | 2006-03-07 | 2007-09-13 | Regenetech, Inc. | Recombinant mammalian molecules and method for production thereof |
| GB0605684D0 (en) * | 2006-03-21 | 2006-05-03 | Sicor Biotech Uab | Method For Purifying Granulocyte-Colony Stimulating Factor |
| US20100196336A1 (en) | 2006-05-23 | 2010-08-05 | Dongsu Park | Modified dendritic cells having enhanced survival and immunogenicity and related compositions and methods |
| US8124773B2 (en) | 2006-06-12 | 2012-02-28 | Sunesis Pharmaceuticals, Inc. | 1,8-naphthyridine compounds for the treatment of cancer |
| HUE026693T2 (hu) * | 2006-08-02 | 2016-07-28 | Sunesis Pharmaceuticals Inc | (+)-1,4-dihidro-7-[(3S,4S)-3-metoxi-4-(metilamino)-1-pirrolidinil]-4-oxo-1-(2-tiazolil) -1,8-naftiridin-3-karbonsav és cytarabin (Ara-C) kombinált alkalmazása leukémia kezelésére |
| CL2007002218A1 (es) * | 2006-08-03 | 2008-03-14 | Celgene Corp Soc Organizada Ba | Uso de 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihidro-isoindol-2-il)-piperidina 2,6-diona para la preparacion de un medicamento util para el tratamiento de linfoma de celula de capa. |
| US20100178271A1 (en) * | 2006-08-07 | 2010-07-15 | Genzyme Corporation | Combination Therapy |
| EP2094274A4 (en) | 2006-12-21 | 2011-05-11 | Biokine Therapeutics Ltd | T-140 PEPTIDE ANALOGUE WITH CXCR4 SUPERAGONIST ACTIVITY FOR BONE MARROW RECOVERY |
| WO2008096370A2 (en) * | 2007-02-05 | 2008-08-14 | Natco Pharma Limited | An efficient and novel purification method of recombinant hg-csf |
| AU2008247815B2 (en) * | 2007-05-02 | 2012-09-06 | Ambrx, Inc. | Modified interferon beta polypeptides and their uses |
| CN101801942B (zh) * | 2007-07-17 | 2013-03-27 | 美国艾森生物科学公司 | 杂环化合物和作为抗癌剂的用途 |
| US7893045B2 (en) | 2007-08-07 | 2011-02-22 | Celgene Corporation | Methods for treating lymphomas in certain patient populations and screening patients for said therapy |
| EP2185689A2 (en) | 2007-08-09 | 2010-05-19 | Genzyme Corporation | Method of treating autoimmune disease with mesenchymal stem cells |
| RS53404B (en) | 2007-08-27 | 2014-10-31 | Ratiopharm Gmbh | LIQUID FORMULATION OF G-CSF CONJUGATES |
| BRPI0815280A2 (pt) | 2007-08-27 | 2018-11-27 | Biogenerix Ag | medicamento que compreende uma formulação líquida aquosa de g-csf, receptáculo para a administração de medicamentos líquidos, seringa ou ampola, kit para a administração parenteral de g-csf |
| WO2009046015A2 (en) * | 2007-09-30 | 2009-04-09 | University Of Florida Research Foundation, Inc. | Combination therapies for treating type 1 diabetes |
| KR100921226B1 (ko) | 2007-10-04 | 2009-10-12 | 학교법인 선목학원 | 사람 혈액의 과립구집락자극인자(ｈＧ-ＣＳＦ) 유전자를 내장하는 레트로바이러스 발현벡터 및 이에 의해 형질전환된 가금 |
| GB2455204B (en) * | 2007-11-28 | 2010-07-14 | Smart Tube Inc | Devices, systems and methods for the collection, stimulation, stabilization and analysis of a biological sample |
| WO2009075841A2 (en) | 2007-12-10 | 2009-06-18 | Sunesis Pharmaceuticals, Inc. | Methods of using (+)-1,4-dihydro-7-[(3s,4s)-3-methoxy-4-(methylamino)-1-pyrrolidinyl]-4-oxo-1-(2-thiazolyl)-1,8-naphthyridine-3-carboxylic acid for treatment of antecedent hematologic disorders |
| CN103694337B (zh) | 2008-02-08 | 2016-03-02 | Ambrx公司 | 经修饰瘦素多肽和其用途 |
| RU2010148803A (ru) * | 2008-04-30 | 2012-06-10 | Ньютрон Роу (Bm) | Способы применения кортикотропин-рилизинг фактора для лечения рака |
| NZ623495A (en) | 2008-05-15 | 2015-08-28 | Celgene Corp | Oral formulations of cytidine analogs and methods of use thereof |
| UA118536C2 (uk) * | 2008-07-23 | 2019-02-11 | Амбркс, Інк. | Модифікований поліпептид бичачого гранулоцитарного колонієстимулювального фактора та його застосування |
| WO2010092571A2 (en) | 2009-02-11 | 2010-08-19 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Short beta-defensin-derived peptides |
| CN102448472A (zh) | 2009-05-25 | 2012-05-09 | 国立大学法人东京工业大学 | 包含与中枢神经细胞的增殖和分化相关的核因子的药物组合物 |
| JP5715622B2 (ja) | 2009-06-14 | 2015-05-07 | バイオカイン セラピューティックス リミテッド | 血小板レベルを増大させるためのペプチド療法 |
| EP3366692A1 (en) | 2009-06-22 | 2018-08-29 | Amgen, Inc | Refolding proteins using a chemically controlled redox state |
| KR20120124353A (ko) | 2009-06-24 | 2012-11-13 | 스티븐 에반스-프레케 | 암 치료를 위해 코르티코트로핀 방출인자를 사용하는 방법 |
| EP2445924B2 (en) | 2009-06-25 | 2023-12-13 | Amgen Inc. | Capture purification processes for proteins expressed in a non-mammalian system |
| TW201120037A (en) * | 2009-10-26 | 2011-06-16 | Sunesis Pharmaceuticals Inc | Compounds and methods for treatment of cancer |
| US20110129858A1 (en) * | 2009-11-27 | 2011-06-02 | Changhua Christian Hospital | Prognosis Biomarker for Evaluating the Cure Level of Stroke Patient and a Method thereof |
| CN107674121A (zh) | 2009-12-21 | 2018-02-09 | Ambrx 公司 | 经过修饰的牛促生长素多肽和其用途 |
| PT2341061E (pt) | 2009-12-31 | 2013-11-05 | Arven Ilac Sanayi Ve Ticaret As | Um processo novo para a preparação de g-csf (fator de estimulação de colónias de granulócitos) |
| CA2789249A1 (en) * | 2010-02-19 | 2011-08-25 | Long Mao | Heterocyclic compounds and uses as anticancer agents |
| ES2639398T3 (es) | 2010-03-04 | 2017-10-26 | Pfenex Inc. | Método para producir proteína de interferón recombinante soluble sin desnaturalización |
| JP2013522236A (ja) | 2010-03-12 | 2013-06-13 | セルジーン コーポレイション | レナリドミドを使用する非ホジキンリンパ腫の治療方法、並びに予測因子としての遺伝子及びタンパク質バイオマーカー |
| US8455218B2 (en) | 2010-04-01 | 2013-06-04 | Pfenex, Inc. | Methods for G-CSF production in a Pseudomonas host cell |
| EP2600901B1 (en) * | 2010-08-06 | 2019-03-27 | ModernaTX, Inc. | A pharmaceutical formulation comprising engineered nucleic acids and medical use thereof |
| AR083006A1 (es) | 2010-09-23 | 2013-01-23 | Lilly Co Eli | Formulaciones para el factor estimulante de colonias de granulocitos (g-csf) bovino y variantes de las mismas |
| PT2621519T (pt) | 2010-09-28 | 2017-10-04 | Aegerion Pharmaceuticals Inc | Polipéptido de fusão de leptina-abd com duração de ação melhorada |
| US20140031325A1 (en) | 2010-12-06 | 2014-01-30 | Celgene Corporation | Combination therapy with lenalidomide and a cdk inhibitor for treating multiple myeloma |
| MX2013006020A (es) | 2011-01-31 | 2013-10-01 | Celgene Corp | Composicion farmaceutica de analogos de citidina y metodos para su uso. |
| CN103561744A (zh) | 2011-03-11 | 2014-02-05 | 细胞基因公司 | 3-(5-氨基-2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4h)-基)哌啶-2,6-二酮在治疗免疫相关性和炎症性疾病中的用途 |
| TWI601722B (zh) | 2011-03-11 | 2017-10-11 | 西建公司 | ３-（５-胺基-２-甲基-４-氧基-４ｈ-喹唑啉-３-基）-六氫吡啶-２，６-二酮之固體型式及其醫藥組合物及用途 |
| US9365640B2 (en) | 2011-04-29 | 2016-06-14 | Celgene Corporation | Methods for the treatment of cancer and inflammatory diseases using cereblon as a predictor |
| US9320777B2 (en) | 2011-05-13 | 2016-04-26 | Bolder Biotechnology, Inc. | Methods and use of growth hormone supergene family protein analogs for treatment of radiation exposure |
| EP2771294B1 (en) | 2011-10-25 | 2017-12-13 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
| US10350139B2 (en) | 2011-10-25 | 2019-07-16 | Corning Incorporated | Pharmaceutical glass packaging assuring pharmaceutical sterility |
| JP6162709B2 (ja) | 2011-11-01 | 2017-07-12 | セルジーン コーポレイション | シチジンアナログの経口製剤を使用して癌を治療する方法 |
| US8889630B2 (en) | 2011-12-23 | 2014-11-18 | Carlos Lopez | Method for hair regrowth using Granulocyte-Colony Stimulating Factor |
| HUP1200171A1 (hu) | 2012-03-19 | 2013-09-30 | Richter Gedeon Nyrt | Módszerek polipeptidek elõállítására |
| HUP1200172A2 (en) | 2012-03-19 | 2013-10-28 | Richter Gedeon Nyrt | Methods for refolding g-csf from inclusion bodies |
| WO2013155347A1 (en) | 2012-04-11 | 2013-10-17 | Izumi Raquel | Bruton's tyrosine kinase inhibitors for hematopoietic mobilization |
| EP2841084B1 (en) | 2012-04-24 | 2018-05-30 | Biokine Therapeutics Ltd. | Cxcr4 antagonist peptide for use in the treatment of large cell lung cancer |
| JP6318152B2 (ja) | 2012-06-29 | 2018-04-25 | セルジーン コーポレイション | セレブロン関連タンパク質を利用して薬物効能を決定する方法 |
| US9732144B2 (en) | 2012-07-05 | 2017-08-15 | Ohio State Innovation Foundation | Infectious bursal disease (IBDV) vaccine compositions |
| WO2014022759A1 (en) | 2012-08-03 | 2014-02-06 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Agents that modulate immune cell activation and methods of use thereof |
| MX359508B (es) | 2012-08-09 | 2018-09-28 | Celgene Corp | Sales y formas solidas de (s)-3-(4-((4-(morfolinometil) bencil) oxi)-1-oxoisoindolin-2-il) piperidin-2,6-diona y composiciones que comprenden y metodos para utilizar las mismas. |
| NZ628078A (en) | 2012-08-09 | 2017-01-27 | Celgene Corp | Methods of treating cancer using 3-(4-((4-(morpholinomethyl)benzyl)oxy)-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione |
| US9587281B2 (en) | 2012-08-14 | 2017-03-07 | Celgene Corporation | Cereblon isoforms and their use as biomarkers for therapeutic treatment |
| US9694015B2 (en) | 2012-09-10 | 2017-07-04 | Celgene Corporation | Methods for the treatment of locally advanced breast cancer |
| US9968627B2 (en) | 2013-03-26 | 2018-05-15 | Celgene Corporation | Solid forms comprising 4-amino-1-β-D-ribofuranosyl-1,3,5-triazin-2(1H)-one and a coformer, compositions and methods of use thereof |
| AU2014248263A1 (en) | 2013-04-02 | 2015-10-15 | Celgene Corporation | Methods and compositions using 4-amino-2-(2,6-dioxo-piperidine-3-yl)-isoindoline-1,3-dione for treatment and management of central nervous system cancers |
| US9717648B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-08-01 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
| US9713572B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-07-25 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
| US9603775B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-03-28 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
| US9717649B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-08-01 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
| US9707154B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-07-18 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
| US9700486B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-07-11 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
| US9707153B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-07-18 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
| US9839579B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-12-12 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
| US9849066B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-12-26 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
| US9700485B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-07-11 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
| US9707155B2 (en) | 2013-04-24 | 2017-07-18 | Corning Incorporated | Delamination resistant pharmaceutical glass containers containing active pharmaceutical ingredients |
| CA2913490A1 (en) | 2013-06-06 | 2014-12-11 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for identification, assessment, prevention, and treatment of cancer using pd-l1 isoforms |
| EP2815749A1 (en) | 2013-06-20 | 2014-12-24 | IP Gesellschaft für Management mbH | Solid form of 4-amino-2-(2,6-dioxopiperidine-3-yl)isoindoline-1,3-dione having specified X-ray diffraction pattern |
| EP3757130A1 (en) | 2013-09-26 | 2020-12-30 | Costim Pharmaceuticals Inc. | Methods for treating hematologic cancers |
| WO2015057992A1 (en) | 2013-10-16 | 2015-04-23 | Izumi Raquel | Btk inhibitors for hematopoietic mobilization |
| WO2015073727A1 (en) | 2013-11-13 | 2015-05-21 | Aequus Biopharma, Inc. | Engineered glycoproteins and uses thereof |
| CA2935804A1 (en) | 2014-01-14 | 2015-07-23 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for identification, assessment, prevention, and treatment of melanoma using pd-l1 isoforms |
| US20150359810A1 (en) | 2014-06-17 | 2015-12-17 | Celgene Corporation | Methods for treating epstein-barr virus (ebv) associated cancers using oral formulations of 5-azacytidine |
| ES2843973T3 (es) | 2014-06-27 | 2021-07-21 | Celgene Corp | Composiciones y métodos para inducir cambios conformacionales en cereblon y otras ubiquitina ligasas E3 |
| US9499514B2 (en) | 2014-07-11 | 2016-11-22 | Celgene Corporation | Antiproliferative compounds and methods of use thereof |
| HUE061382T2 (hu) | 2014-08-22 | 2023-06-28 | Celgene Corp | Eljárás myeloma multiplex kezelésére immunomoduláló vegyületekkel, antestekkel kombinálva |
| US20180086808A1 (en) | 2015-03-16 | 2018-03-29 | Arven Ilac Sanayi Ve Ticaret A.S. | A process for preparing g-csf (granulocyte colony stimulating factor) |
| WO2016167291A1 (ja) | 2015-04-13 | 2016-10-20 | 国立研究開発法人産業技術総合研究所 | 環状化サイトカイン及びその製法 |
| EP3313818B1 (en) | 2015-06-26 | 2023-11-08 | Celgene Corporation | Methods for the treatment of kaposi's sarcoma or kshv-induced lymphoma using immunomodulatory compounds, and uses of biomarkers |
| KR20180063881A (ko) | 2015-07-16 | 2018-06-12 | 바이오카인 테라퓨틱스 리미티드 | 암 치료용 조성물 및 방법 |
| WO2017040387A2 (en) | 2015-08-31 | 2017-03-09 | Technovax, Inc. | Human respiratory syncytial virus (hrsv) virus-like particles (vlps) based vaccine |
| US11229683B2 (en) | 2015-09-18 | 2022-01-25 | Bolder Biotechnology, Inc. | Hematopoietic growth factor proteins and analogs thereof and angiotensin converting enzyme inhibitors for treatment of radiation exposure |
| EP3362074B1 (en) | 2015-10-16 | 2023-08-09 | President and Fellows of Harvard College | Regulatory t cell pd-1 modulation for regulating t cell effector immune responses |
| EP3365359A1 (en) | 2015-10-19 | 2018-08-29 | Sandoz AG | Method for producing a recombinant protein with reduced impurities |
| EP3365360A1 (en) | 2015-10-19 | 2018-08-29 | Sandoz AG | Improved coding sequence for human g-csf |
| CN109069486A (zh) | 2015-12-14 | 2018-12-21 | X4 制药有限公司 | 治疗癌症的方法 |
| WO2017106328A1 (en) | 2015-12-14 | 2017-06-22 | X4 Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating cancer |
| EP3393468B1 (en) | 2015-12-22 | 2022-09-14 | X4 Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating immunodeficiency disease |
| US10830762B2 (en) | 2015-12-28 | 2020-11-10 | Celgene Corporation | Compositions and methods for inducing conformational changes in cereblon and other E3 ubiquitin ligases |
| CN108712904B (zh) | 2016-01-08 | 2022-08-02 | 细胞基因公司 | 2-(4-氯苯基)-n-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-5-基)甲基)-2,2-二氟乙酰胺的固体形式以及其药物组合物和用途 |
| ES2832475T3 (es) | 2016-01-08 | 2021-06-10 | Celgene Corp | Compuestos antiproliferativos y sus composiciones farmacéuticas y usos |
| EA037508B1 (ru) | 2016-01-08 | 2021-04-06 | Селджин Корпорейшн | Композиции 2-(4-хлорфенил)-n-((2-(2,6-диоксопиперидин-3-ил)-1-оксоизоиндолин-5-ил)метил)-2,2-дифторацетамида |
| KR102033920B1 (ko) | 2016-02-23 | 2019-10-18 | 바이오라인알엑스 리미티드 | 급성 골수성 백혈병을 치료하는 방법 |
| US20210309965A1 (en) | 2016-03-21 | 2021-10-07 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | T-cell exhaustion state-specific gene expression regulators and uses thereof |
| AU2017240050B2 (en) | 2016-04-01 | 2021-12-16 | Signal Pharmaceuticals, Llc | Solid forms of (1s,4s)-4-(2-(((3S4R)-3-fluorotetrahydro-2H-pyran-4-yl) amino)-8-((2,4,6-trichlorophenyl) amino)-9H-purin-9-yl)-1-methylcyclohexane-1-carboxamide and methods of their use |
| WO2017173206A1 (en) | 2016-04-01 | 2017-10-05 | Signal Pharmaceuticals, Llc | Substituted aminopurine compounds, compositions thereof, and methods of treatment therewith |
| WO2017177230A1 (en) | 2016-04-08 | 2017-10-12 | X4 Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating cancer |
| EP3443107A1 (en) | 2016-04-13 | 2019-02-20 | Synthetic Genomics, Inc. | Recombinant arterivirus replicon systems and uses thereof |
| ES2870920T3 (es) | 2016-06-21 | 2021-10-28 | X4 Pharmaceuticals Inc | Inhibidores de CXCR4 y usos de los mismos |
| WO2017223229A1 (en) | 2016-06-21 | 2017-12-28 | X4 Pharmaceuticals, Inc. | Cxcr4 inhibitors and uses thereof |
| JP6994767B2 (ja) | 2016-06-21 | 2022-01-14 | エックス４ ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド | Ｃｘｃｒ４阻害剤およびその使用 |
| WO2018013689A1 (en) | 2016-07-13 | 2018-01-18 | Celgene Corporation | Solid dispersions and solid forms comprising 4-amino-2-(2,6-dioxopiperidine-3-yl)isoindoline-1,3-dione, method of preparation and use thereof |
| WO2018013693A1 (en) | 2016-07-13 | 2018-01-18 | Celgene Corporation | Solid dispersions and cocrystals comprising 3-(4-amino-1-oxo-1,3-dihydro-isoindol-2-yl)-piperidine-2,6-dione compositions and methods of use thereof |
| WO2018075235A1 (en) | 2016-10-17 | 2018-04-26 | Synthetic Genomics, Inc. | Recombinant virus replicon systems and uses thereof |
| EP3548625B1 (en) | 2016-12-05 | 2024-06-26 | Janssen Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for enhancing gene expression |
| WO2018165142A1 (en) | 2017-03-07 | 2018-09-13 | Celgene Corporation | Solid forms of 3-(5-amino-2-methyl-4-oxo-4h-quinazolin-3-yl)-piperidine-2,6-dione, and their pharmaceutical compositions and uses |
| SG11201911929XA (en) | 2017-06-21 | 2020-01-30 | SHY Therapeutics LLC | Compounds that interact with the ras superfamily for the treatment of cancers, inflammatory diseases, rasopathies, and fibrotic disease |
| RS64029B1 (sr) | 2017-06-30 | 2023-03-31 | Celgene Corp | Kompozicije i postupci za upotrebu 2-(4-hlorfenil)-n-((2-(2,6-dioksopiperidin-3-il)-1-oksoizoindolin-5-il)metil)-2,2-difluoracetamida |
| AU2018345647A1 (en) | 2017-10-04 | 2020-04-16 | Celgene Corporation | Compositions and methods of use of cis-4-(2-{((3S,4R)-3-fluorooxan-4-yl) amino}-8-(2,4,6-trichloroanilino)-9H-purin-9-yl)-1-methylcyclohexane-1-carboxamide |
| CN111417634A (zh) | 2017-10-04 | 2020-07-14 | 细胞基因公司 | 用于制备顺式-4-[2-{[(3s,4r)-3-氟噁烷-4-基]氨基}-8-(2,4,6-三氯苯胺基)-9h-嘌呤-9-基]-1-甲基环己烷-1-甲酰胺的方法 |
| CA3077215A1 (en) * | 2017-10-11 | 2019-04-18 | Elanco Us Inc. | Porcine g-csf variants and their uses |
| BR112020009055A2 (pt) | 2017-11-06 | 2020-11-03 | Rapt Therapeutics, Inc. | moduladores de receptor de quimiocina para tratamento de câncer positivo para vírus epstein barr |
| US11389531B2 (en) | 2017-12-19 | 2022-07-19 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Methods and apparatus for the delivery of hepatitis B virus (HBV) vaccines |
| US11021692B2 (en) | 2017-12-19 | 2021-06-01 | Janssen Sciences Ireland Unlimited Company | Hepatitis B virus (HBV) vaccines and uses thereof |
| EA202091516A1 (ru) | 2017-12-19 | 2020-11-03 | Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани | Способы и композиции для индукции иммунного ответа против вируса гепатита b (hbv) |
| CN111902163B (zh) | 2018-01-19 | 2024-02-13 | 杨森制药公司 | 使用重组复制子系统诱导和增强免疫应答 |
| US10548889B1 (en) | 2018-08-31 | 2020-02-04 | X4 Pharmaceuticals, Inc. | Compositions of CXCR4 inhibitors and methods of preparation and use |
| US20230078755A1 (en) | 2018-12-19 | 2023-03-16 | Shy Therapeutics, Llc | Compounds that Interact with the RAS Superfamily for the Treatment of Cancers, Inflammatory Diseases, Rasopathies, and Fibrotic Disease |
| WO2020234742A1 (en) | 2019-05-20 | 2020-11-26 | Lupin Limited | Granulocyte colony stimulating factor purification |
| MX2022005371A (es) | 2019-11-05 | 2022-08-04 | Celgene Corp | Terapia de combinacion con 2-(4-clorofenil)-n-((2-(2,6-dioxopiperi din-3-il)-1-oxoisoindolin-5-il)metil)-2,2-difluoroacetamida. |
| US20230227466A1 (en) | 2020-06-18 | 2023-07-20 | Shy Therapeutics, Llc | Substituted thienopyrimidines that interact with the ras superfamily for the treatment of cancers, inflammatory diseases, rasopathies, and fibrotic disease |
| AR129053A1 (es) | 2022-04-14 | 2024-07-10 | Bristol Myers Squibb Co | Nuevos compuestos gspt1 y métodos de uso de los nuevos compuestos |
| WO2024064646A1 (en) | 2022-09-20 | 2024-03-28 | Celgene Corporation | Salts and solid forms of (s)- or racemic 3-(4-((4-(morpholinomethyl)benzyl)oxy)-1-oxoisoindolin-2-yl)piperidine-2,6-dione and methods of using the same |
Family Cites Families (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4358535A (en) * | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
| US4394443A (en) * | 1980-12-18 | 1983-07-19 | Yale University | Method for cloning genes |
| US6936694B1 (en) * | 1982-05-06 | 2005-08-30 | Intermune, Inc. | Manufacture and expression of large structural genes |
| FI82266C (fi) * | 1982-10-19 | 1991-02-11 | Cetus Corp | Foerfarande foer framstaellning av il-2 -mutein. |
| JPS6023777A (ja) * | 1983-07-15 | 1985-02-06 | 鶴海合成炉材株式会社 | 低融点金属用溶解保持手許炉 |
| WO1985000817A1 (en) * | 1983-08-10 | 1985-02-28 | Amgen | Microbial expression of interleukin ii |
| US4710473A (en) * | 1983-08-10 | 1987-12-01 | Amgen, Inc. | DNA plasmids |
| NZ210501A (en) * | 1983-12-13 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Erythropoietin produced by procaryotic or eucaryotic expression of an exogenous dna sequence |
| JPS60206066A (ja) * | 1984-03-29 | 1985-10-17 | Toshiba Corp | 固体撮像装置 |
| JPS60209638A (ja) * | 1984-04-03 | 1985-10-22 | Diesel Kiki Co Ltd | デイ−ゼル機関用電子式ガバナ |
| JPS60217150A (ja) * | 1984-04-13 | 1985-10-30 | マツダ株式会社 | 塗装を施した繊維強化ウレタン成形品 |
| JPS61227526A (ja) * | 1984-07-25 | 1986-10-09 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 新規なコロニー刺激因子 |
| EP0215126B1 (en) * | 1985-02-08 | 1991-07-31 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Human granulocyte colony stimulating factor |
| JPH0615477B2 (ja) * | 1985-02-08 | 1994-03-02 | 中外製薬株式会社 | 感染防禦剤 |
| JPH01110629A (ja) * | 1985-04-05 | 1989-04-27 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 感染防禦剤 |
| US4810643A (en) * | 1985-08-23 | 1989-03-07 | Kirin- Amgen Inc. | Production of pluripotent granulocyte colony-stimulating factor |
| JPS63500636A (ja) * | 1985-08-23 | 1988-03-10 | 麒麟麦酒株式会社 | 多分化能性顆粒球コロニー刺激因子をコードするｄｎａ |
| JPS62236497A (ja) * | 1985-09-17 | 1987-10-16 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 顆粒球コロニー刺激因子活性を有する糖蛋白質の製造方法 |
| ATE67517T1 (de) * | 1985-09-30 | 1991-10-15 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Menschlicher granulozyten-colony stimulierender faktor. |
| US4904584A (en) * | 1987-12-23 | 1990-02-27 | Genetics Institute, Inc. | Site-specific homogeneous modification of polypeptides |
| JP2976258B2 (ja) * | 1992-07-07 | 1999-11-10 | 株式会社名機製作所 | ホットプレスの断熱材取付け構造 |
-
1986
- 1986-03-03 US US06/835,548 patent/US4810643A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-22 KR KR870700352A patent/KR880700071A/ko not_active Application Discontinuation
- 1986-08-22 AU AU63346/86A patent/AU6334686A/en not_active Abandoned
- 1986-08-22 NZ NZ217334A patent/NZ217334A/en unknown
- 1986-08-22 SG SG1996004322A patent/SG48964A1/en unknown
- 1986-08-22 EP EP86905530A patent/EP0237545B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-22 IL IL79805A patent/IL79805A/xx not_active IP Right Cessation
- 1986-08-22 WO PCT/US1986/001708 patent/WO1987001132A1/en active IP Right Grant
- 1986-08-22 AT AT00101091T patent/ATE332375T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-08-22 GR GR862185A patent/GR862185B/el unknown
- 1986-08-22 PT PT83242A patent/PT83242B/pt unknown
- 1986-08-22 DE DE3650788T patent/DE3650788T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-23 CN CN86106234A patent/CN1020924C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1986-08-23 ES ES8601318A patent/ES2001883A6/es not_active Expired
- 1986-08-25 CA CA000516737A patent/CA1341537C/en not_active Expired - Lifetime
-
1987
- 1987-04-16 FI FI871700A patent/FI105191B/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-04-22 DK DK198702044A patent/DK174980B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-04-22 NO NO871679A patent/NO303544B1/no not_active IP Right Cessation
-
1989
- 1989-05-02 JP JP1113512A patent/JP2527365B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-02 JP JP1113513A patent/JPH0231675A/ja active Granted
-
1991
- 1991-05-17 JP JP3141402A patent/JP2660178B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-09-27 JP JP3277149A patent/JP2660179B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-03-26 SG SG358/92A patent/SG35892G/en unknown
- 1992-06-18 MX MX9202992A patent/MX9202992A/es unknown
- 1992-10-21 SA SA92130186A patent/SA92130186B1/ar unknown
- 1992-11-06 CY CY1642A patent/CY1642A/xx unknown
-
1993
- 1993-07-01 NL NL930127C patent/NL930127I1/nl unknown
-
1995
- 1995-05-26 US US08/452,135 patent/US5582823A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-02 US US08/459,298 patent/US5580755A/en not_active Expired - Lifetime
-
1996
- 1996-03-12 JP JP8055077A patent/JP2718426B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-07-11 US US08/678,692 patent/US5676941A/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-07-15 US US08/679,897 patent/US5830705A/en not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-02-18 JP JP9033849A patent/JP2952203B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-05-11 NO NO19982132A patent/NO314902B1/no active Protection Beyond IP Right Term
-
1999
- 1999-02-12 JP JP11034848A patent/JP3115561B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-01-04 FI FI20000014A patent/FI107540B/fi not_active IP Right Cessation
- 2000-03-08 JP JP2000064219A patent/JP2000279185A/ja active Pending
- 2000-12-12 HK HK00107970A patent/HK1029600A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-02-21 FI FI20010334A patent/FI110576B/fi not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-03-28 JP JP2002092947A patent/JP2002315578A/ja active Pending
-
2003
- 2003-05-19 NO NO20032250A patent/NO318755B1/no not_active IP Right Cessation
- 2003-11-13 NO NO2003008C patent/NO2003008I1/no unknown
- 2003-11-26 JP JP2003394905A patent/JP2004041242A/ja not_active Withdrawn
- 2003-12-09 NO NO2003010C patent/NO2003010I2/no not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-12-17 NO NO20045548A patent/NO20045548L/no unknown
-
2006
- 2006-01-11 JP JP2006004052A patent/JP2006101889A/ja active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SA92130186B1 (ar) | إنتاج عامل حفاز لتكوين الخلية الحبيية granulocyte متعددة الفعاليه | |
| Dissen et al. | An autosomal dominant locus, Nka, mapping to the Ly-49 region of a rat natural killer (NK) gene complex, controls NK cell lysis of allogeneic lymphocytes. | |
| Jackson et al. | Isolation of a cDNA encoding the human CD38 (T10) molecule, a cell surface glycoprotein with an unusual discontinuous pattern of expression during lymphocyte differentiation. | |
| Metcalf | The molecular control of blood cells | |
| DE69021456T2 (de) | Monoklonale Antikörper gegen aktivierte endotheliale Zellen. | |
| KR100241863B1 (ko) | 아포토시스를 야기시키는 모노클론성항체 | |
| CN102482324B (zh) | 能够抑制自身免疫、炎症和癌症进程的新型趋化因子结合多肽 | |
| Youn et al. | A novel chemokine, macrophage inflammatory protein-related protein-2, inhibits colony formation of bone marrow myeloid progenitors. | |
| US20030157577A1 (en) | Method of screening apoptosis inducing substances | |
| JPH03502453A (ja) | 免疫エフェクター細胞の活性化および化学誘引を誘導するタンパク質 | |
| KR900013978A (ko) | 세포간 점착 분지-2 및 이의 결합 리간드 | |
| JPH09124697A (ja) | ペプチド及びモノクローナル抗体 | |
| DE69031914T2 (de) | Rezeptor für granulozyten-macrophagen-koloniestimulierungsfaktor und seine derivate | |
| FI91542C (fi) | Hybridoomia ihmisen monitehoisia granulosyyttipesäkkeitä stimuloivia tekijöitä vastaan | |
| JPH0657156B2 (ja) | 新糖蛋白質の製法 | |
| JPH0753407A (ja) | 免疫応答の制御方法並びに免疫細胞および内皮細胞に関連する薬剤 | |
| Trembicki et al. | Monoclonal antibodies reactive with chicken peritoneal macrophages: identification of macrophage heterogeneity | |
| WO1995020400A1 (fr) | Anti-inflammatoire contenant des anticorps monoclonaux ayant une reactivite avec les chaines de sucre sialyl-lewis x prenant naissance dans la membrane des cellules hemangioendotheliales | |
| Sorg et al. | The molecular complex of macrophage migration inhibitory activity (MIF) and its role in inflammatory reactions | |
| Yamin et al. | Anti-RMA: a murine monoclonal antibody that activates rat macrophages. I. Distribution and characterization of the RMA antigen | |
| Fong et al. | Experimental and clinical applications of molecular cell biology in nutrition and metabolism | |
| DD272473B3 (de) | Verfahren zur herstellung monoklonaler antikoerper gegen die epsilon-kettedes cd 3-antigens humaner t-lymphozyten | |
| DK175466B1 (da) | DNA-sekvens kodende for en polypeptidanalog af hpG-CSF, i hvilken en eller flere cysteinrester er slettet eller erstattet med alanin- eller serinrester, plasmider indeholdende sekvensen, hermed ...... | |
| DE69233623T2 (de) | Plättchen-transfusion | |
| Kincade et al. | Blood cell precursors in context. Composition of the bone marrow microenvironment that supports B lymphopoiesis |