FI107540B - Monitehoinen granulosyyttipesäkkeitä stimuloiva tekijä - Google Patents

Description

107540

Monitehoinen granulosyyttipesäkkeitä stimuloiva tekijä Tämä hakemus on jakamalla erotettu patenttihakemuksesta 871700.

Tämä keksintö koskee nisäkkäiden monitehoisia pesäkkeitä stimuloivia tekijöitä, tarkemmin määriteltynä ihmisen monitehoista granulosyyttipe-5 säkkeitä stimuloivaa tekijää (hpG-CSF), sen fragmentteja ja sen kanssa analogisia polypeptidejä sekä polypeptidiä, joka ei esiinny luonnossa. Lisäksi keksintö koskee määritysmenetelmää.

Ihmisen verta muodostava (hematopoieettinen) järjestelmä korvaa erilaisia valkeita verisoluja (mukaan luettuina neutrofiilit, makrofagit ja basofii-10 lit/syöttösolut), punaisia verisoluja (erytrosyyttejä) ja hyytymiä muodostavia soluja (megakaryosyyttejä/verihiutaleita). Keskiarvomiehen hematopoieettisen järjestelmän on arvioitu tuottavan suunnilleen 4,5 x 1011 granulosyyttiä ja eryt-rosyyttiä vuosittain, joka määrä vastaa koko ruumiinpainon vuosittaista korvautumista [Dexter et ai·. Bio-Essays 2 (1985) 154 -158].

15 Otaksutaan, että pienet määrät tiettyjä hematopoieettisia kasvute kijöitä vastaavat pienten kantasolumäärien erilaistumisesta erilaisiksi verisolu-linjoiksi, näiden linjojen valtavasta lisääntymisestä ja valmiiden verisolujen lopullisesta muodostumisesta näistä linjoista. Koska hematopoieettisia kasvutekijöitä esiintyy äärimmäisen pieninä määrinä, on näiden tekijöiden detektointi 20 ja identifiointi ollut määritysten varassa, joilla pystytään erottamaan erilaiset tekijät toisistaan vain sen perusteella, miten ne stimuloivat viljeltyjä soluja keinotekoisissa olosuhteissa. Tämän tuloksena on annettu suuri määrä nimiä paljon pienemmälle määrälle tekijöitä. Esimerkkinä tuloksena olevasta termien : sekavuudesta mainittakoon IL-3, BPA, multi-CSF, HCGF, MCGF ja PSF, jotka 25 kaikki ovat akronyymejä, joiden nykyisin otaksutaan merkitsevän yhtä hiiren hematopoieettista kasvutekijää [Metcalf, Science 229 (1985) 16-22]. Katso myös julkaisut Burgess et ai., J. Biol. Chem. 252 (1977) 1988, Das et ai. Blood 58 (1980) 600, Ihle et ai., J. Immunol. 129 (1982) 2431, Nicola et ai., J. Biol. Chem. 258 (1983) 9017, Metcalf et ai., Int. J. Cancer 30 (1982) 773 ja Burgess 30 et ai., Int. J. Cancer 26 (1980) 647, jotka käsittelevät hiiren erilaisia kasvua sääteleviä glykoproteiineja.

Yhdistelmägeenitekniikan käyttöönotto on tuonut jonkin verran järjestystä tähän kaaokseen. On esimerkiksi selvitetty ihmisen erytropoietiinin, joka stimuloi erytrosyyttien tuotantoa, aminohappo- ja DNA-sekvenssi. (Katso 35 Lin, PCT-hakemusjulkaisu nro 85/02610, 20. kesäkuuta 1985). Yhdistelmä-menetelmiä on käytetty myös ihmisen granulosyytti-makrofagipesäkkeitä sti- 2 107540 muloivaa tekijää vastaavan cDNA:n eristämiseen. Katso Lee et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82 (1985) 4360 - 4364 ja Wong et ai., Science 228 (1985) 810-814. Katso myös Yokota et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 81 (1984) 1070, Fung et ai., Nature 307 (1984) 233 ja Gough et ai., Nature 309 (1984) 5 763, joissa julkaisuissa käsitellään hiiren geenien kloonausta, samoin kuin

Kawasaki et ai., Science 230 (1985) 291, joka julkaisu käsittelee ihmisen M-CSF:ää.

Erästä ihmisen hematopoieettista kasvutekijää, josta käytetään nimitystä ihmisen monitehoinen pesäkkeitä stimuloiva tekijä (hpCSF) tai pluri-10 poietiini, on osoitettu esiintyvän erään ihmisen virtsarakkokarsinoomasolulin-jan, josta käytetään merkintää 5637 ja joka on rajoittavin ehdoin talletettu the American Type Culture Collectioniin, Rockville, Maryland ATCC-talletusnumerolla HTB-9, kasvualustassa. Tästä solulinjasta puhdistetun hpCSF:n on ilmoitettu stimuloivan monitehoisten kantasolujen lisäänty-15 mistä ja erilaistumista kaikiksi verisolujen päätyypeiksi kokeissa, joissa käytetään ihmisen luuytimen kantasoluja. Katso Welte etä, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82 (1985) 1526-1530. hpCSF:n puhdistukseen on käytetty: (NH4)2S04-saostusta; anioninvaihtokromatografiaa (DEAE selluloosa, DE52); geelisuodatusta (AcA54-kolonni); ja C18-RP-HPLC:tä. hpCSF.ksi identifioidun 20 proteiinin, joka eluoituu toisessa aktiivisuuspiikissä C18-RP-HPLC:ssä, mole-kyylipainon on ilmoitettu olevan 18 000 määritettynä natriumdodekyylisulfaatti (SDS) -polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGErlla), jossa käytetään ho-peavärjäystä. Aiempien raporttien mukaan hpCSFrn isoelektrinen piste on 5,5 [Welte et ai., J. Cell. Biochem., Supp 9A, (1985) 116] ja sillä on voimakas eri-’ 25 laistamisaktiivisuus hiiren myelomonosyyttileukemiasolulinjan WEHI-3B D+ suhteen (Welte et ai., UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, toim. Gale et ai., New Series 28,1985). Alustavat tutkimukset viittaavat siihen, että hpCSF:ksi identifioidulla tekijällä on pääasiassa granylosyyttipesäkkeitä stimuloiva vaikutus ensimmäisten seitsemän päivän aikana ih-30 mis-CFU-GM-kokeessa.

Ihmisen virtsarakkokarsinoomasolulinjasta 5637 on eristetty myös eräs toinen tekijä, josta käytetään merkintää CSF-β, ja jonka on kuvattu kilpailevan hiiren 125l-leimatun granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän (G-CSF:n) kanssa sitoutumisesta WEHI-3B D+ -soluihin annos-vasteriippuvuuden ollessa 35 samanlainen kuin leimaamattomalla hiiren G-CSF:llä [Nicola et ai., Nature 314 (1985) 625 - 628]. Tämän annos-vaste-riippuvuuden on aiemmin ilmoitettu 3 107540 olevan ainutlaatuinen leimaamattomalle hiiren G-CSF:lle ja puuttuvan sellaisilta tekijöiltä kuin M-CSF, GM-CSF ja multi-CSF [Nicola et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 81 (1984) 3765 - 3769]. CSF-β ja G-CSF ovat ainutlaatuisia CSF:ien joukossa myös siinä suhteessa, että niille on yhteistä suuri kyky in-5 dusoida WEHI-3B D+ -solujen erilaistumista. Katso Nicola et ai. Immunology Today 5 (1984) 76 - 80. Suurina pitoisuuksina G-CSF stimuloi granylosyyt-ti/makrofagipesäkkeitä muodostavien solujen seoksia [Nicola et ai., supra (1984)], mikä sopii yhteen alustavien tulosten kanssa, jotka osoittavat granu-losyytti-, monosyytti-, granulosyytti/monosyyttiseos- ja eosinofiilipesäkkeiden 10 (CFU-GEMM) ilmaantumisen, kun ihmisen luuydinviljelmiä on inkuboituu 14 vrk hpCSF:n kanssa. CSF-βιη on kuvattu myös stimuloivan neutrofiilisten gra-nulosyyttipesäkkeiden muodostumista kokeissa, joissa käytettiin hiiren luu-ydinsoluja, jota ominaisuutta on pidetty kriteerinä tekijän identifioimiseksi G-CSF:ksi. Näiden samankaltaisuuksien perusteella ihmisen CSF-β on identi-15 fioitu G-CSF:ksi (granulosyyttipesäkkeitä stimuloivaksi tekijäksi). Katso Nicola et a]., Nature 314 (1985) 625 - 628.

Yhteisten ominaisuuksiensa perusteella ihmisen CSF-β (Nicola et ai., supra) ja hpCSF (Welte et ai., supra) näyttävät olevan sama tekijä, jota voitaisiin hyvin kutsua ihmisen monitehoiseksi granulosyyttipesäkkeitä stimu-20 loivaksi tekijäksi (hpG-CSF). hpG-CSF:n karakterisointi ja tuottaminen yhdis-telmä-DNA-menetelmin olisi erityisen toivottavaa, kun otetaan huomioon hiiren G-CSF:n ilmoitettu kyky kokonaan vaientaa in vitro WEHI-3B D+ -leukemiasolupopulaatio "aivan normaaleina pitoisuuksina" ja injektoitujen hiiren G-CSF-raakapreparaattien ilmoitettu kyky vähentää hiireen istutettuja my-25 eloidileukemioita. Katso Metcalf, Science 229 (1985) 16 - 22. Katso myös Sachs, Scientific American 284(1) (1986) 40-47.

Siinä määrin kuin hpG-CSF saattaa osoittautua terapeuttisesti merkittäväksi ja siten tarpeelliseksi olla saatavana kaupallisina määrinä, ei eristäminen soluviljelmistä todennäköisesti tarjoa riittävää tämän materiaalin läh-30 dettä. On esimerkiksi huomionarvoista, että näyttää olevan olemassa rajoituksia Human Tumor Bankin solujen, kuten ihmisen virtsarakkokarsinoomasolu-linjan 5637 (ATCC HTB9), jotka Welten et ai., (suora. 1985) mukaan ovat luonnosta eristettyjen hpCSF:ien lähteitä, kaupalliselle käytölle .

Keksinnön yhteenveto 35 Tässä kuvataan DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat koko hpG-CSF:ää tai osaa siitä. Tällaiset sekvenssit saattavat sisältää: kodoneja, 4 107540 jotka ovat "edullisia" ilmentymiselle valituissa ei-nisäkäsisännissä; restriktio-entsyymipilkkoutumiskohtia; ylimääräisiä alku-, loppu- tai vä-li-DNA-sekvenssejä, jotka helpottavat helposti ilmentyvien vektoreiden konstruoimista. Tässä kuvataan myös DNA-sekvenssien ilmentymistä mikro-5 beissa, jotka sekvenssit koodaavat hpG-CSF:n polypeptidianalogeja tai johdoksia, jotka eroavat luonnossa esiintyvistä muodoista yhden tai useamman aminohapporyhmän identiteetin tai sijainnin suhteen (ts. deleetioanalogien, jotka sisältävät vähemmän kuin kaikki hpG-CSF:lle ominaiset ryhmät; substi-tuutioanalogien, kuten [Ser17]hpG-CSF:n, joissa yksi tai useampia ryhmiä on 10 korvautunut muilla ryhmillä; ja additioanalogien, joissa polypeptidin päähän tai keskelle on lisätty yksi tai useampia aminohapporyhmiä) ja joiden jotkut tai kaikki ominaisuudet ovat yhteisiä luonnossa esiintyvien muotojen kanssa.

Tässä kuvattaviin uusiin DNA-sekvensseihin sisältyy sekvenssejä, jotka ovat käyttökelpoisia sen varmistamiseen, että prokaryoottisissa tai euka-15 ryoottisissa isäntäsoluissa muodostuu polypeptidituotteita, joilla on ainakin osa luonnossa esiintyvän monitehoisen granylosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän primaarirakenteesta ja yksi tai useampia sen biologisista ominaisuuksista. Tässä kuvattavien DNA-sekvenssien katsotaan sisältävän erityisesti: (a) taulukossa VII ja taulukossa Vili esitetyn DNA-sekvenssin tai sen komplementaari-20 sen säikeen; (b) DNA-sekvenssin, joka hybridisoituu (hybrid isaatio-olosuhteissa, kuten tässä kuvatuissa, tai ankarammissa olosuhteissa) taulukossa VII esitettyjen DNA-sekvenssien tai niiden osien kanssa; ja (c) DNA-sekvenssin, joka - ellei geneettinen koodi olisi degeneroitunut - hybridisoituisi taulukon VII mukaisen DNA-sekvenssin kanssa. Kohdassa (b) tarkoitetaan 25 erityisesti genomi-DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat hpGCSF:n alleelisia va-rianttimuotoja tai muiden nisäkäslajien monitehoisia granylosyyttipesäkkeitä stimuloivia tekijöitä. Kohdassa (c) tarkoitetaan erityisesti valmistettuja DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat hpG-CSF:ää, hpG-CSF:n fragmentteja ja hpG-CSF:n kanssa analogisia polypeptidejä, jotka DNA-sekvenssit voivat si-30 sältää kodoneja, jotka helpottavat lähetti-RNA:n translaatiota mikro-’ bi-isännissä. Tällaisia valmistettuja sekvenssejä on helppo konstruoida Altonin et ai., menetelmien mukaisesti (PCT-hakemusjulkaisu WO 83/04053).

Tämä keksintö koskee sitä polypeptidiryhmää, jota koodaavat osat ihmis-cDNA:n tai tässä esitettyjen taulukoiden VII ja Vili mukaisten geno-35 mi-DNA-sekvenssien ylemmälle säikeelle komplementaarisesta DNA:sta, ts.

5 107540 "komplementaarisesti käännetyt proteiinit", joita kuvaavat Tramontano et a]., [Nucleic Acids Res., 12 (1984) 5049 - 5059].

Keksinnön mukaiselle polypeptidille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 tai 8 esitetään. Keksinnön mukaiselle polypeptidille, joka 5 ei esiinny luonnossa, on tunnusomaista se mitä patenttivaatimuksessa 9 esitetään. Keksinnön mukaiselle määritysmenetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 11 esitetään.

Tämä keksintö tarjoaa käyttöön puhdistettuja ja eristettyjä polypep-tidituotteita, joilla on osittain tai kokonaan luonnossa esiintyvän hpG-CSF:n, 10 sen alleeliset variantit mukaan luettuina, primaarirakenne (ts. aminohappo-ryhmistä koostuva jatkuva sekvenssi) ja yksi tai useampia sen biologisista ominaisuuksista (ts. immunologisia ominaisuuksia ja biologinen aktiivisuus in vitro) ja fysikaalisista ominaisuuksista (esimerkiksi molekyylipaino). Näille po-lypeptideille on tunnusomaista myös se, että ne ovat kemiallisten synteesime-15 nettelyjen tulos tai tulosta genomi-DNA:n tai cDNA:n kloonauksella tai geeni-synteesillä saatujen eksogeenisten DNA-sekvenssien ilmentymisestä prokary-oottisessa tai eukaryoottisessa isännässä (esimerkiksi viljelmässä olevissa bakteeri-, hiiva-, korkeampien kasvien, hyönteis- ja nisäkässoluissa). Tyypillisten hiivaisäntäsolujen (esimerkiksi Saccharomvces cerevisiae) tai prokary-20 ootti-isäntäsolujen [esimerkiksi Escherichia coli (E. coliYl tuotteet ovat vapaita kaikista nisäkkäiden proteiineista. Selkärankaissolujen (esimerkiksi muiden nisäkkäiden kuin ihmisen solujen ja lintusolujen) ilmentymistuotteet eivät sisällä mitään ihmisen proteiineja. Käytetystä isännästä riippuen voivat polypeptidit olla glykosyloituneita nisäkkäiden tai muiden eukaryoottien hiilihydraateilla tai 25 glykosyloitumattomia. Keksinnön mukaiset polypeptidit voivat sisältää myös metioniinialoitusaminohapporyhmän (asemassa -1).

Tässä kuvataan myös farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät vaikuttavia määriä keksinnön mukaisia polypeptidituotteita yhdessä soveltuvien laimennus-, apu- ja/tai kantaja-aineiden kanssa, jotka ovat käyttökelpoisia . 30 hpG-CSF-terapiassa.

Keksinnön mukaiset polypeptidituotteet voidaan "leimata" liittämällä niihin detektoitavissa olevaa merkkiainetta (esimerkiksi radioleimata 125l:llä), jolloin saadaan reagensseja, jotka ovat käyttökelpoisia ihmisen hpG-CSF:n detektointiin ja kvantitatiiviseen määrittämiseen kiinteästä kudoksesta ja nes-35 tenäytteistä, kuten verestä tai virtsasta. Myös tässä kuvatut DNA-tuotteet voidaan leimata detektoitavissa olevilla merkkiaineilla (kuten radioaktiivisilla 6 107540 merkkiaineilla ja ei-isotooppimerkkiaineilla, kuten biotiinilla) ja käyttää DNA-hybridisaatiomenetelmissä ihmisen hpG-CSF-geenin ja/tai siihen mahdollisesti liittyvän geeniryhmän aseman kromosomikartassa määrittämiseksi. Niitä voidaan käyttää myös ihmisen hpG-CSF-geenihäiriöiden identifioimiseksi 5 DNA-tasolla ja geenimarkkereina naapurigeenien ja niiden häiriöiden identi-fiomiseksi.

Tämän keksinnön mukaiset polypeptidituotteet voivat olla käyttökelpoisia yksinään tai yhdistettyinä muihin hematopoieettisiin tekijöihin tai lääkkeisiin verenmuodostushäiriöiden, kuten aplastisen anemian hoidossa. Esi-10 merkiksi luuydinsiirron onnistumista voidaan edistää antamalla hpG-CSF:ää. hpG-CSF voi lisäksi olla käyttökelpoinen leukemian hoidossa sen perusteella, että sillä on ilmoitettu olevan kyky erilaistaa leukemiasoluja. Katso Welte et aL, Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 82 (1985) 1526 -1530 ja Sachs, suora.

Tämän keksinnön lukuisat aspektit ja edut käynevät ilmi alan am-15 mattimiehille seuraavasta yksityiskohtaisesta kuvauksesta, jossa valaistaan tämän keksinnön käytännön toteutusta sen tällä hetkellä edullisissa suoritusmuodoissa.

Piirustusten lyhyt kuvaus

Kuvio esittää hpG-CSF-geenin osittaista restriktioendonukleaasi-20 karttaa, johon on liitetty nuolet, jotka osoittavat genomisekvenssin määrittämiseen käytetyn sekventointistrategian.

Yksityiskohtainen kuvaus Tässä kuvataan DNA-sekvenssien, jotka koodaavat koko hpG-CSF-polypeptidisekvenssiä tai osaa siitä, eristystä ja karakterisointia.

• : 25 Seuraavat esimerkit annetaan keksinnön valaisemiseksi, ja ne kos kevat erityisesti ennen hpG-CSF-cDNA:n ja genomikloonien identifiointia toteutettuja menettelyjä, tällaiseen identifiointiin johtaneita menettelyjä, sekvensointia, cDNA:han, genomiin ja valmistettuihin geeneihin perustuvien ilmenty-misjärjestelmien kehittämistä ja tällaisissa järjestelmissä olevien ilmentyvien . 30 hpG-CSF:n ja analogisten tuotteiden varmistamista.

Tarkemmin määriteltynä esimerkki 1 koskee hpG-CSF:n aminohap-posekventointia. Esimerkki 2 koskee cDNA-kirjaston valmistamista pesäkehy-bridisaatioseulontaa varten. Esimerkki 3 koskee hybridisaatiokoettimien konstruoimista. Esimerkki 4 koskee hybridisaatiotutkimusta, positiivisten kloo-35 nien identifioimista, erään positiivisen kloonin DNA-sekventointia ja polypepti-din primaarirakennetta (aminohapposekvenssiä) koskevien tietojen hankki- 7 107540 mistä. Esimerkki 5 koskee hpG-CSF:ää koodaavan genomikloonin identifiointia ja sekventointia. Esimerkki 6 koskee hpG-CSF:ää koodaavan keinotekoisen geenin, jossa käytetään E. colin kannalta edullisia kodoneja, konstruoimista.

5 Esimerkki 7 koskee menettelyjä E. coi| -transformaatiovektorin, joka sisältää hpG-CSF:ää koodaavan DNA:n, konstruoimiseksi, tämän vektorin käyttöä hpG-CSF:n tuottamiseen prokaryoottisesti ja yhdistelmätuotteiden ominaisuuksien analysoimista. Esimerkki 8 käsittelee menettelyjä, jolla muodostetaan hpG-CSF:n kanssa analogisia poly peptidejä, joissa kysteiiniryhmät 10 on korvattu muulla soveltuvalla aminohapporyhmällä hpG-CSF:ää koodaavan DNA:n mutageneesin kautta. Esimerkki 9 koskee menettelyjä, joilla konstruoidaan vektori, joka sisältää positiivisesta cDNA-kloonista peräisin olevan, hpG-CSF-analogia koodaavaa DNA:ta, tämän vektorin käyttöä COS-1-solujen transfektointiin ja transfektoitujen solujen kasvatusta viljelmänä. Esimerkki 10 15 koskee keksinnön mukaisten polypeptidituotteiden fysikaalisia ja biologisia ominaisuuksia.

Esimerkki 1 (A) Kirjallisuuden mukaisilla menetelmillä aikaansaadun materiaalin sekventointi 20 hpG-CSF-näytteen (3-4 μg, puhtausaste 85 - 90 % SDS-PAGE, hopeavärjäys) toimitti Sloan Kettering Institute, New York, eristettynä ja puhdistettuna Welte et ai., menetelmällä [Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82 (1985) 1526-1530].

Tämän hpG-CSF-näytteen N-terminaalinen aminohapposekvenssi 25 määritettiin mikrosekvenssianalyysillä, jossa ajossa # 1 käyttämällä AB407A-kaasufaasisekventoijaa (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia), jolloin saatiin jäljempänä taulukossa I esitettävät sekvenssitiedot. Taulukoissa I - IV käytetään yksikirjainkoodeja, "X" tarkoittaa ryhmää, jota ei ole määritetty yksiselitteisesti, ja suluissa olevat ryhmät ovat vaihtoehtoisia tai mahdollisia.

30 Taulukko I

I 5 10 15

K-P-L-G-P-A-S-K-L-K-Q-(G,V,S)-G-L-X-X-X

Joka ajosyklissä, josta esitetään tuloksia taulukossa I, oli korkea 35 tausta, mikä osoittaa, että näytteessä oli monia kontaminoivia komponentteja, todennäköisesti puhdistuksesta jääneiden kemikaalijäännösten muodossa.

8 107540

Ajon # 2 yhteydessä käytetty toinen näyte (5-6 pg, puhtausaste noin 95 %) saatiin Sloan Ketteringista samoin kuin ajon # 1 näytekin, ja sek-ventointi tehtiin kuten ajossa # 1. Tämä näyte oli peräisin samasta materiaali-erästä kuin Welten et ai., julkaisun [Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82 (1985) 5 1526 - 1530] kuvion 4 aikaansaantiin käytetty aine. Tulokset annetaan taulu kossa II.

Taulukko II

1 5 10 15 20 10 T-P-L-G-P-A-S-(S)-L-P-Q-(S)-M-(L)-X-K-(R)-X-X-(R)-(L)-X- X (M)

Vaikka ajossa # 2 identifioitiin useampia ryhmiä, ei se antanut riittävän pitkää varmaa sekvenssiä, josta voitaisiin muodostaa kohtuullinen määrä 15 koettimia hpG-CSF-DNA:n etsimiseen. Laskettiin, että olisi tarvittu vähintään 1536 koetinta, jotta olisi voitu yrittää taulukon II mukaiseen sekvenssiin perustuvan cDNA:n eristämistä. Näytteen epäpuhtauksien uskottiin tälläkin kertaa olevan ongelmana.

Kolmannenkin näytteen (3-5 pg, puhtausaste noin 40 %) toimitti 20 Sloan Kettering. Tälle valmisteelle tehtiin elektroforeettinen täpläsiirto SDS-PAGE:n jälkeen yritettäessä lisäpuhdistusta. Tämän näytteen sekvenssi-analyysistä ei saatu tuloksia.

(B) Korjatuilla menetelmillä saatujen materiaalien sekventointi : Jotta saataisiin riittävä määrä puhdasta materiaalia sopivan tarkan 25 aminohapposekvenssianalyysin tekemiseksi, saatiin tri E. Platzerilta virtsarak-kokarsinomaasolulinjan 5637 (alaklooni 1A6) soluja, jotka oli tuotettu Sloan Ketteringissä. Soluja kasvatettiin aluksi Iscoven alustassa (GIBCO, Grand Island, New York) pulloissa yhtenäiseksi kasvustoksi. Kun viljelmät olivat kasvaneet yhtenäisiksi, ne käsiteltiin trypsiinillä ja siirrostettiin pyörityspulloihin (12 30 pullollista/pyörityspullo), joista kukin sisälsi 25 ml ennalta ilmastoitua Iscoven alustaa 5 % C02:a sisältävässä atmosfäärissä. Soluja kasvatettiin yön yli lämpötilassa 37 °C pyöritysnopeuden ollessa 0,3 min'1.

Cytodex-1-helmet (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) pestiin ja steriloitiin seuraavia menettelyjä käyttämällä. Laitettiin pulloon 8 g helmiä, ja lisättiin 35 400 ml PBS:ää. Helmet suspendoitiin pyörittämällä varovasti 3 tuntia. Kun helmien oli annettu laskeutua, PBS imettiin pois, helmet huuhdottiin PBS:llä, ja g 107540 lisättiin uutta PBS:ää. Ennen käyttöä helmet pestiin Iscoven alustalla, joka sisälsi 10 % naudan sikiöseerumia (FSC), ja lisättiin niille sitten uutta FCS-pitoista (10 %) alustaa, jolloin saatiin käyttövalmiita helmiä.

Kun kustakin pyörityspullosta oli poistettu alusta 30 ml:aa lukuun 5 ottamatta, lisättiin pulloihin 30 ml FCS-pitoista (10 %) tuoretta alustaa ja 40 ml käsiteltyjä helmiä. Pullot kaasukäsiteltiin 5 % C02:a sisältävällä seoksella, ja kaikki kuplat poistettiin imemällä. Pullot laitettiin telasekoittimelle, ja pyöritettiin nopeudella 3 min'1 1/2 tuntia ennen pyöritysnopeuden alentamista arvoon 0,3 min*1. 3 tunnin kuluttua käsiteltiin lisäpullo trypsiinillä ja lisättiin kuhunkin 10 helmiä sisältävään pyörityspulloon.

40 - 50% yhtenäisestä kasvustosta pyörityspulloissa pestiin 50 ml:lla PBS:ää ja pyöritettiin 10 minuuttia ennen PBS:n poistamista. Soluja kasvatettiin 48 tuntia alustassa A (Iscoven alusta, joka käsittää 0,2% FCS, 10"®M hydrokortisonia, 2 mM glutamiinia, 100 yksikköä/ml penisilliiniä ja 100 pg/ml 15 streptomysiiniä). Seuraavaksi viljelmän supernatantti kerättiin sentrifugoimalla nopeudella 3000 min1 15 minuutin ajan ja säilytettiin -70°C:ssa. Viljelmiin lisättiin alustaa A, joka sisälsi 10% FCSiää ja kasvatettiin 48 tuntia. Alustan poistamisen jälkeen solut pestiin PBSillä kuten edellä ja kasvatettiin 48 tuntia alustassa A. Supernatantti kerättiin jälleen ja käsiteltiin kuten edellä on kuvat-20 tu.

Noin 30 I 1A6-solujen käytettyä kasvualustaa konsentroitiin noin 2 l:ksi Millipore Pellicon -yksiköllä, joka oli varustettu 2 kasetilla, joiden läpäisy-raja vastasi molekyylipainoa 10 000, ja jossa suodoksen keräysnopeus oli noin 200 ml/min ja retentaatin keräysnopeus noin 1 000 ml/min. Konsentraatti dia-25 lyysisuodatettiin noin 10 l:n kanssa 50 mM Tris-puskuria (pH 7,8) käyttämällä samaa laitetta ja samoja virtausnopeuksia. Dialyysisuodatettu konsentraatti syötettiin nopeudella 40 ml/min pylväälle, joka sisälsi 1 I 50 mM Tris-puskurilla (pH 7,8) tasapainotettua DE-selluloosaa. Kun konsentraatti oli syötetty pylvääseen, tätä huuhdottiin samalla virtausnopeudella 1 hila 50 mM Tris-puskuria 30 (pH 7,8) ja sitten 2 lilla 50 mM Trispuskuria (pH 7,8), joka sisälsi 50 mmol/l NaClia. Sitten kolonnia eluoitiin peräkkäin kuudella 1 Iin annoksella 50 mM Tris-liuosta (pH 7,8), jotka annokset sisälsivät NaClia seuraavina pitoisuuksina: 75, 100, 125, 150, 200 ja 300 mmol/l. Kerättiin fraktioita (50 ml), yhdistettiin aktiiviset fraktiot ja väkevöitiin ne 65 mliksi sekoituksella varustetulla Ami-35 co-ultrasuodatusyksiköllä, joka oli varustettu YM5-kalvolla. Tämä konsentraatti syötettiin kolonnille, joka sisälsi 1 I AcA54-geelisuodatusainetta, joka oli tasa- 10 107540 painotettu PBSillä. Virtausnopeus kolonnin läpi oli 80 ml/h, ja kerättiin 10 ml:n fraktioita. Aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja syötettiin suoraan C4-HPLC-kolonnille.

Näytteet, joiden tilavuus oli 125 - 850 ml ja jotka sisälsivät 1 - 8 mg 5 proteiinia, josta noin 10 % oli hpG-CSF:ää, syötettiin kolonnille virtausnopeudella 1-4 ml/min. Kun näyte oli syötetty ja kolonnille oli tehty alkuhuuhtelu liuoksella, joka sisälsi 0,1 mol/l ammoniumasetaattia (pH 6,0 - 7,0) 80-%:isessa 2-propanolissa, virtausnopeudella 1 ml/min, kerättiin 1 ml:n fraktioita ja seurattiin proteiineja aallonpituuksilla 220, 260 ja 280 nm.

10 Puhdistuksen seurauksena oli hpG-CSF:ää sisältävien fraktioiden (fraktiot 72 ja 73 80:stä) selvä erottuminen muista proteiinipitoisista fraktioista. Eristettiin hpG-CSF (150 - 300 pg), jonka puhtausaste oli noin 85 ± 5 % ja saanto noin 50 %. Tästä puhdistetusta materiaalista käytettiin 9 μ9 ajoon # 4, aminohapposekvenssianalyysiin, jossa proteiininäyte laitettiin TFA:lla aktivoi-15 tuun lasikuitukiekkoon, jossa ei ollut polybreeniä. Sekvenssianalyysi tehtiin AB 470A -sekventoijalla Hewickin et ai., [J. Biol. Chem. 256 (1981) 7990 - 7997] ja Lain [Anal. Chim. Acta 163 (1984) 243 - 248] menetelmillä. Ajon # 4 tulokset annetaan taulukossa III.

Taulukko III

20 1 5 10

Thr - Pro - Leu - Gly - Pro - Ala - Ser - Ser - Leu - Pro- 15 20

Gin - Ser - Phe - Leu - Leu - Lys -(Lys)- Leu -(Glu)- Glu-25 25 30

Vai - Arg - Lys - Ile -(Gin)- Gly - Vai - Gly - Ala - Ala-

Leu - X - X - ;·' 30

Ajossa # 4 ei 31 syklin (taulukon lii ryhmän 31) jälkeen saatu enää lisää merkittäviä sekvenssitietoja. Jotta ajossa # 5 saataisiin pitempi varmasti määritetty sekvenssi, 14 pg hpG-CSF:ää, joka oli puhdistettu käytetystä alustasta, pelkistettiin 10 piillä β-merkaptoetanolia 1 tunti lämpötilassa 45 °C ja 35 kuivattiin sitten perusteellisesti alipaineessa. Proteiinijäännös liuotettiin sitten 5-%:iseen muurahaishappoon ja laitettiin polybreenikäsiteltyyn lasikuitukiek- 11 107540 koon. Sekvenssianalyysi tehtiin kuten edellä ajon # 4 yhteydessä kuvattiin. Ajon # 5 tulokset esitetään taulukossa IV.

Taulukko IV

15 10 _ Thr - Pro - Leu - Gly - Pro - Ala - Ser - Ser - Leu - Pro -5 15 20

Gin - Ser - Phe - Leu - Leu - Lys - Cys - Leu - Glu - Gln- 25 30 10 Vai - Arg - Lys - Ile - Gin - Gly - Asp - Gly - Ala - Ala - 35 40

Leu - Gin - Phe - Lys - Leu - Gly - Ala - Thr - Tyr - Lys - 45

Vai - Phe - Ser - Thr - (Arg) - (Phe) - (Met) -X- 15 Taulukossa IV annettu aminohapposekvenssi oli riittävän pitkä (44 ryhmää) ja yksiselitteinen koettimien konstruoimiseksi hpG-CSF-cDNA:n aikaansaamiseksi tässä hakemuksessa kuvattavalla tavalla.

Esimerkki 2

Standardimenetelmiin kiinnostuksen kohteena olevien 20 cDNA-sekvenssien eristämiseksi kuuluu plasmidiperäisten cDNA-"kirjastojen" valmistaminen käänteiskopioimalla mRNA:ta, jota esiintyy runsaasti luovutta-jasoluissa, jotka valitaan sen perusteella, että kohdegeeni ilmentyy niissä. Kun tunnetaan oleellisia osia polypeptidin aminohapposekvenssistä, voidaan käyt-tää tunnettuja, leimattuja yksisäikeisiä DNA-koetinsekvenssejä, joissa toistuu 25 "kohde"-cDNA:ssa otaksuttavasti esiintyvä sekvenssi, DNA/DNA-hybridisaa-tiossa, joka tehdään kloonatuille cDNA-kopioille, jotka on denaturoitu yksisäi-keiseen muotoon. Katso Weissman et ai., US-patenttijulkaisu 4 393 443; Wallace et aL, Nucleic Acids Res. 6 (1979) 3543 - 3557; Reyes et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 79 (1982) 3270 - 3274; ja Jaye et ai.. Nucleic Acids Res. 11 30 (1983) 2325-2335. Katso myös US-patenttijulkaisu 4 358 535 (Falkow et ai.,), joka käsittelee DNA/DNA-hybridisaatiomenettelyjen käyttöä diagnosointiin; ja Davis et ai., A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor, N.Y. 1980, s. 55 - 58 ja 174 - 176, jossa käsitellään pesä-kehybridisaatiomenetelmiä.

35 Kokonais-RNA eristettiin noin 1 g:sta virtsarakkokarsinoomasolu- linjan 5637 (1A6) soluja käyttämällä guanidiumtiosyanaattimenettelyä muuttu- 12 107540 mattoman RNA:n eristämiseen [Chirgwin et a]., Biochemistry 18 (1979) 5294 -5299].

Steriili RNA-vesiliuos sisälsi 1A6-solujen kokonais-RNA:n. Lähet-ti-RNA:n erottamiseksi kokonais-RNA-liuoksesta tämä johdettiin kolonnin läpi, 5 joka sisälsi oligodeoksitymidylaattia [oligo(dT)] (Collaborative Research, Inc., Waltham, Massachusetts). Lähetti-RNA:lle tunnusmerkilliset polyadenyloitu-neet (poly-A+) hännät tarttuvat kolonniin, kun taas ribosomi-RNA eluoituu. Tällä menettelyllä eristettiin noin 90 pg polyadenyloitunutta lähetti-RNA.ta (poly-A+-mRNA:ta). Eristetty poly-A+-mRNA esikäsiteltiin metyylielohopeahyd-10 roksidilla (Alpha Ventron, Danvers, Massachusetts), jonka loppupitoisuus oli 4 mmol/-l, 5 min huoneenlämpötilassa ennen käyttämistä cDNA-reaktioon. Metyylielohopeahydroksidikäsittely denaturoi lähetti-RNA:n vuorovaikutukset sekä itsensä kanssa että kontaminoivien molekyylien kanssa, jotka estävät translaatiota. Katso Payvar et ai., J. Biol. Chem. 258 (1979) 7636 - 7642.

15 Valmistettiin cDNA-pankki Okayaman menetelmällä [Okayama et ai-, Molecular & Cellular Biology 2 (1982) 161-170] käyttämällä 1A6-soluista saatua mRNA:ta. cDNA:illa transformoitiin DNA:n lisäämiseen käytetty isäntä-mikro-organismi E. colj K-12 -kanta HB101 tekemällä inkubointi.

Esimerkki 3 20 Taulukon IV mukaisen hpG-CSF:n aminoterminaalisen sekvenssin perusteella suunnitellut hybridisaatiokoettimet koostuivat 24 oligonukleotidista, joista kukin oli 23 emäksen pituinen ja sisälsi kolme inosiiniryhmää. Koetinoli-gonukleotidit valmistettiin Caruthersin et ai., menetelmällä [Genetic Engineering 4 (1982) 1-18] ja leimattiin y-32P-ATP:lla tekemällä kinaasikäsittely polynukleo-• 25 tidikinaasilla. Koetinoligonukleotidit, jotka vastaavat taulukon IV mukaisen sek venssin ryhmiä 23 - 30 vastaavaa RNA:ta, esitetään taulukossa V.

Taulukko V

hpG-CSF-koettimet »30 5' GC IGC ICC §TC ICC £tG j(AT £tT3'

T

l:iden merkitseminen neutraaleiksi perustui Takahashin et ai., [Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 82 ( 1985) 1931 - 1935] ja Ohtsukan et ai., [J. Biol. Chem. 260 (1985) 2605 - 2608] julkaistuihin töihin. Inosiinilla voi kuitenkin olla 35 destabiloiva vaikutus, jos se emäspariutuu G:n tai T:n kanssa. Takahashin et ai., työssä inosiineilla saattaa näyttää olevan neutraali vaikutus, koska ne 13 107540 ryhmänä ovat keskimäärin lähellä neutraalia (esimerkiksi kolme on suosinut pariutumista C:n kanssa, ja kaksi ei pariudu helposti T:n kanssa).

I:iden ja G:iden välisten emäsparien vaikutuksen tutkimiseksi suunniteltiin vertailukokeita, joissa käytettiin N-myc-geenisekvenssiä ja -kloonia.

5 N-myc-geenistä poimituilla sekvensseillä oli sama G:n ja C:n kokonaissisältö kunkin kodonin kahdessa ensimmäisessä asemassa kuin minkä hpG-CSF-koettimet määräsivät. N-myc-testikoettimet olivat siten samanpituisia, sisälsivät l:t samoissa suhteellisissa asemissa, ja niillä oli mahdollisesti sama keskimääräinen Tm (sulamislämpötila) (62 - 66 °C, jakson sisältämien 3 tai 4 inosii-10 niryhmän vaikutusta ei oteta huomioon) kuin hpG-CSF-koettimilla.

Muodostettiin kaksi ryhmää N-myc-testikoettimia Caruthersin et ai., (supral menetelmällä. Ryhmä I, joka esitetään taulukossa VI, sisälsi; 1. täydellisesti yhteensopivan 23-meerin; 23-meerin, jossa kolme kodonin kolmannessa asemassa olevaa C:tä oli korvattu kiliä, jolloin muodostui pahin mahdollinen 15 kiden lisäämistapaus; ja 3. 23-meerin, jossa neljä kodonin kolmannessa asemassa olevaa C:tä oli korvattu kiila. Toinen ryhmä testikoettimia suunniteltiin edustamaan sattumanvaraisempaa inosiiniemäsparien jakautumaa, jolla saattaisi olla neutraali kokonaisvaikutus emäspariutumisen suhteen. Taulukossa VI esitetty ryhmä II sisälsi: 4. 23-meerin, joka sisälsi kaksi C:n kanssa 20 pariutuvaa l.tä ja yhden G:n kanssa pariutuvan l:n; ja 5. 4:n kanssa muuten identtisen 23-meerin, johon oli kuitenkin lisätty vielä yksi kG-emäspari.

Taulukko VI

N-myc-testikoettimet : l. 5'cac aac tat gcc gcc ccc tcc cc3' 25 2. 5'cac aac tat gci gcc cci tci cc3’ 3. 5’cai aac tat gci gcc cci tci cc3' Y 30 4. 5'aac gag ctg tgi ggc agi cci gc3' 5. 5’aai gag ctg tgi ggc agi cci gc3'

Viittä replikasuodatinta, jotka sisälsivät N-myc-DNA-sekvenssejä ja 35 kanan kasvuhormonia vastaavia DNA-sekvenssejä (negatiivisena vertailu-näytteenä) pidettiin vakuumiuunissa 80 °C:ssa 2 tuntia ennen hybridisaatiota.

14 107540

Kaikki suodattimet hybridisoitiin esimerkissä 4 hpG-CSF-koettimien yhteydessä kuvattavalla tavalla; hybridisaatioaika oli kuitenkin vain 6 tuntia. Suodattimet pestiin kolmesti huoneenlämpötilassa ja sitten kerran 45 °C:ssa 10 min kerrallaan. Suodattimet tutkittiin Geiger-laskurilla.

5 N-myc-koetinta 3 edustava suodatin antoi hyvin heikon signaalin muihin neljään tutkittuun suodattimeen verrattuna, eikä sitä pesty enää. Kun suodattimia oli pesty 10 min 50 °C:ssa, Geiger-laskurilla saatiin seuraavat prosentuaaliset signaalit merkittäessä koettimen 1 signaalia 100 %:lla: koetin 2, 20 %: koetin 3 (45 °C) 2 %: koetin 4, 92 %; ja koetin 5, 75 %. Kun suodattimia 10 oli pesty 55 °C:ssa, prosenttiluvut olivat: koetin 2, 16 %: koetin 4, 100 %; koetin 5, 80 %. Viimeisen pesun jälkeen (60 °C) saatiin seuraavat prosenttiluvut: koetin 2,1,6 %; koetin 4, 90 %; koetin 5, 70 %.

Kolmen l:n läsnä ollessa, kuten koettimissa 2 ja 4, havaitaan siten jopa 60-kertainen ero signaalissa saavutettaessa teoreettinen Tm (l:itä ei ole 15 otettu mukaan laskussa) [perustuu pahimman tapauksen l-emäspariutumiseen (koetin 2) ja suhteellisen neutraaliin l-emäspariutumiseen (koetin 4)].

N-myc-testihybridisaatioissa saatuja standardisointitietoja käytettiin hyväksi pesussa ja hpG-CSF-hybridisaation seuraamisessa jäljempänä kuvattavalla tavalla sen arvioimiseen, kuinka luotettavina voitaisiin pitää tuloksia, 20 jotka saadaan vähemmän ankarissa pesuolosuhteissa.

Esimerkki 4

Noudattaen Hanahanin et ai., [J. Mol. Biol. 166 (1983) 557 - 580] levitettiin bakteereja, jotka sisälsivät esimerkin 2 mukaisesti valmistettuja cDNA-inserttejä, 24 nitroselluloosasuodattimelle (Millipore, Bedford, Massa-25 chusetts), jotka oli laitettu agarmaljoille. Maljoja inkuboitiin sitten siten, että saatiin noin 150 000 pesäkettä, jotka replikasiirrostettiin toisille 24 nitroselluloosasuodattimelle. Replikamaljoja inkuboitiin, kunnes ilmaantui erottuvia pesäkkeitä. Suodattimilla olevat bakteerit hajotettiin Whatman 3 MM -paperiarkeilla, jotka oli juuri ja juuri kyllästetty natriumhydroksidilla (0,5 M), 10 30 min ja käsiteltiin sitten 2 min Tris-liuokselia (1 M) ja sen jälkeen 10 min Tris-liuoksella (0,5 M), joka sisälsi NaCI:a (1,5 mol/l). Kun suodattimet olivat lähes kuivat, niitä pidettiin 2 tuntia lämpötilassa 80 °C vakuumiuunissa ennen nukle-iinihappohybridisaatiota [Wahl et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76 (1979) 3683 - 3687); Maniatis et ai- Cell 81 (1976) 163 - 182].

35 Suodattimia esihybridisoitiin 2 tuntia lämpötlilassa 65 °C 750 ml:ssa liuosta 10 x Denhardt, 0,2 % SDS.ää ja 6 x SSC. Suodattimet huuhdottiin 6 x 15 107540 SSC:llä, pakattiin sitten pusseihin (4 kpl/pussi) ja hybridisoitiin 14 tuntia liuoksessa 6 x SSC, 10 x Denhardt. Pussissa, joka sisälsi 50 x 106 pulssia/min 32P-leimattua koetinta (oligonukleotideja), oli noin 15 ml liuosta.

Hybridisaation jälkeen suodattimia pestiin kolmesti 10 min 6 x 5 SSC.IIä (1 l/pesukerta) huoneenlämpötilassa. Sitten suodattimia pestiin kahdesti 15 min lämpötilassa 45 °C, kerran 15 min lämpötilassa 50 °C ja kerran 15 min lämpötilassa 55 °C käyttäen kuhunkin pesuun 1 litra 6 x SSC:tä. Suodattimille tehtiin 2 tunnin pituinen autoradiografia-lämpötilassa -70 °C käyttämällä kuvanvahvistuslevyä ja Kodak XAR-2 -filmiä. Tässä autoradiografiassa 10 detektoitiin 40-50 positiivista signaalia, joissa 5 oli hyvin voimakkaita.

Alueet, jotka sisälsivät viisi voimakkainta signaalia, ja viisi muuta positiivista aluetta kaavittiin alkuperäisiltä maljoilta ja siirrostettiin toista tutkimista varten, jossa käytettiin samaa koetinseosta samoissa olosuhteissa. Pe-sumenettely erosi edellisestä siinä suhteessa, että korkeassa lämpötilassa 15 tehdyt pesut koostuivat kahdesta 15 min:n pesusta lämpötilassa 55 °C ja sitten yhdestä 15 min:n pesusta lämpötilassa 60 °C. Esimerkin 3 mukaisen N-myc-koetintutkimuksen perusteella nostettiin viimeisen pesun lämpötilaa toisessa tutkimuksessa, koska aggregaatin sulamislämpötila näillä 24:lla 23-meerillä oli 60-68 °C, sama kuin N-myc-koettimilla. Heti toisen lämpötilassa 55 °C tehdyn 20 pesun jälkeen suodattimet jätettiin märiksi, ja tehtiin autoradiografia. Tämän autoradiogrammin vertaaminen toiseen autoradiogrammiin, joka otettiin samalla säteilytysajalla viimeisen, lämpötilassa 60 °C tehdyn pesun jälkeen, osoitti, että vain kahdella tutkituista 10 kloonista signaali ei heikentynyt oleellisesti lämpötilan noustessa 55:stä 60 °C:seen. Näiden kahden kloonin osoitet-25 tiin myöhemmin olevan lähes identtisiä pituutensa ja restriktioendonukleaasi-karttansa suhteen. Yksi klooni, josta käytetään merkintää Ppo2, valittiin sek-ventoitavaksi.

Edellä kuvatulla menettelyllä saadun yhdistelmä-hpC-CSF-cDNA-kloonin sekventointi tehtiin Sangerin et ai. dideoksimenetelmällä [Proc. Natl.

30 Acad. Sei. (USA) 74 (1977) 5463 - 6467], Yksisäikeistä DNA-faagia M-13 *: käytettiin kloonausvektorina yksisäikeisten DNA-templaattien hankkimiseen kaksisäikeisistä cDNA-klooneista. Sangerin et ai., menetelmällä saatiin sekvenssi, joka esitetään taulukossa VII, jossa näkyy myös vastaava aminohapposekvenssi ja komplementaarinen säie polypeptidiä koodaavalla alueella.

16 107540 O Eh C COO 300 OOO μ Ο Ο m < Eh

M O O J C Eh J C E< MOO >iC£h SZ U O

CUOO OOO OOO 0.0 0 Eh Eh C Eh C Eh >iO O 0)00 OOO WOO 300 0.0 o

J Ο Ο μ H B < MOO >ιΟ O 4) Eh C w C EH

O O O W w C Eh 0.00 O Eh C OOO <00 r—. O- 2 3 O O C WOO WOO MOO 0)00 300 2 0) Eh C >C £h J C Eh 0)00 £ E-ι < 0) E-* < 2 JOO J C Eh K O O W C Eh O. Eh C JE<<

2 OOO " ΟΌO WOO MOO 3 E C MOO

£ moo moo >ιθ ο ωοο 4) Eh c joo ft O U C C Eh O Eh C W C Eh JOO £h<CEh

52 J m O O JOO 300 300 >00 OOO

r. +JOO W Eh C 4) Eh C φ e. c JOO moo g Eh < Eh >00 JOO JOO OOO 0.0 0 £2 WOO C <£ Eh WOO OOO MOO O >, Eh <

g JOO OJ<Eh O >i <C Eh OMOO 00)00 OJOO

g J C O O «N O O O J < Eh iflftOO 00 CQ C Eh JOOO

52 3 C Eh 300 MOO W Eh C W Eh C 300

Π J C Eh J C Eh >iC Eh JOO -m < E-i 4) £h C

g OOO OOO Eh Eh C COO KOO J £h 2 52 COO 3 C Eh MOO 0.00 300 300 g J C Eh 4) £h C JOO MOO 4) Eh C j C Eh

g OOO JE< Eh < Eh ' Eh Eh C JOO OOO

£2 JOO WOO WOO OOO C C Eh OOO

g W Eh C >iO O JOO MOO J C Eh MOO

g >00 O Eh C COO C. O O OOO 0.00

52 m < £h WOO W Eh C 0)00 MOO MOO

g JOO >iC Eh 5-iO O hEC O) O O 4)00 g Eh C Eh J C Eh O Eh C J C Eh CO < Eh Dl E <t

52 0.0 O 3 0 0 3 0 0 >hO O 3 0 0 4) O O

g MOO 4) Eh C 4)Eh< JOO 4)£h< hE<

g EhEh< JOO JOO OOO J E < h < E

H 52 300 300 WOO 300 WOO >iOO

>jg 4) £h C 4) Eh C X Eh 4) £h C >.00 JOO

Jg JOO JOO J C Eh JOO O Eh C OOO

0 M CJ

v O„ W C Eh J 0)00 300 M Eh C >iO O 3 C Eh J O O C J Eh «C J C Eh 4)00 JOO j C Eh

3 J ?5 C O O J (ft. Eh «5 OOO CD Eh C OOO OOO

rH W e. O1 3 g MECK MOO COO WOO W C Eh 300

(rt g 0)00 4)00 J < E J C Eh JOO 4) £h C

Eh § K C Eh O C Eh OOO KOO COO JOO

S OWOO COO 300 >.C E< 3 0 0 WOO

g J-i < Eh J C Eh 0) Eh C JOO 0) Eh< JOO

g IKOO OOO JOO OOO JOO coo 52 0.0 O OOO WOO 300 COO coo ^ MOO OMUO O juo O 0) Eh < OJ<EH O j C Eh

I E E< < J Ο. O O mcoo inJOO Γ" O O O σ\ O O O

300 300 W C Eh 300 300 300

(N4)£hC 4) Eh C JOO « E < 4) Eh C 4) Eh C

^ JJOO JOO COO JOO JOO JOO

• m O O >. O O JOO WOO 300

0)00 JOO WEh< JOO OJEhC

O Eh c OOO >oo COO JOO

MOO CuEhC 300 COO >iOO

• 0)00 WCEh Φ e C JCEh joo

O C EH COO JUO OOO OOO

WOO >UO 300 MOO COO

JOO JOO JCEh 4)00 JCE

COO OOO OOO W C E OOO

17 107540 >i2Eh coo JOO u o o o o o JOO Ή 2 Eh >i2 Eh Eh 0 2 2 0 2 OOO OOO Eh Eh 2 2 0 0 2 0 0 300 ΦΟΟ HOO Eh 2 0 0 0 0 Φ &h 2 J Eh 2 Φ O O Eh 2 2 0 0 0 JOO ft Eh 2 CO Eh < Eh O Eh 2 < £

3 2 Eh <0 Eh 2 --HOO 2 2 O Eh O O

J 2 &h JOO m Eh 2 -Eh O Eh 2 Eh Eh OOO 2 o o >oo O o O 2 < o

3 <5 Eh u Eh 2 300 Eh 2 O 2 O O

J 2 Eh Φ Ο Ο J 2 Eh 2 O O Eh O e£

OOO cn Eh < OOO O 2 E· O O O

JOO (OOO 300 O eC o O EH Eh Φ Eh 2 JOO Φ Eh 2 O 0 0 2 0 2 £ 2 Eh 2 O O JOO Eh O Eh Eh 2 e4 OCOO Ο Φ Ο Ο ΟΦΟΟ 2 o o 2 o o CM J 2 Eh xj. jC £h <C «J3EH«i O 2 Eh O O 2

JOOO H a. EH 2 H ft Eh O O Eh 2 O O

COO moo nuo O 2 2 Eh o 2

H < E Ή Ο Ο ΦΟΟ O O O O EH O

OOO 2 0 0 CO 2 £h Eh 2 EH O 2 Eh CUO O OOO COO O 2 Eh 2 2 Eh

nOO nuo J 2 Eh O 2 Eh O O O

eh eh 2 ixoo ooo o eh o o o o

ΦΟΟ JOO 300 O EH 2 O Eh O

ι-H E < 01 E < OI E C 2 EH O £h O e£

J 2 Eh 2<E JOO 2 < EH O EH O

JOO «JOO WEh< O Eh O 2 O O

JOO JOO J 2 Eh O 2 Eh O O O

Eh 2 Eh 2 0 0 ffiOO O O Eh O O Eh

C JOO >.Eh 2 JOO 2 Eh Eh Eh Eh Eh O

3 JOO JOO Φ O O 0.00 O 2 O O O

•X Eh<CEh OOO CO £h 2 o E < O O O O 2 m m o o coo moo-^ooo o o o o o

-n HCJO H c e JOO O O < Eh CJ O O

^ 2 0 0 OOO 2 O O J (X O O 2 O Eh 2 o

M 0)E< JOO h E <! COO Eh O 2 O O

H J Eh 2 JOO (O E 2 J 2 Eh Eh O O O Eh

> CX Eh 2 Eh < Eh >00 OOO Eh Eh .O O O

O 'CUO O OOO 300 (OOO 2 Eh O O O

X. tn 2 Eh ihOO Φ E C JOO Eh O Eh Eh O

200 (X O O JOO 200 0 0 0 0 2 3

H m O O COO JOO 3 EH 2 EH Eh O O O

.. 3 JOO .n <C E m E 2 0) E 2 O O Eh Eh Eh

m 200 OOO ϊ> O O JOO EH eh O O O

Eh

OJOO 0300 o >iO O O tn O O 2 O Eh 2 O

Ι-ΗΠ3Ε2 M OI E < IDJOO Γ~ J 2 Eh Eh Eh O O En

J>00 JJOO JOOO J ffi O O EH O O EH O

CUO O moo >2EH CPO O Eh Eh Eh 2 O

tn 2 E JOO JOO j-ι O O 2 O O Eh Eh

200 200 OOO 200 Eh O O O O

M

300 O Eh 2 . ¢2 E 3 2 E 2 03 2 2 O

Φ E 2 nuo JOO Q1E2 2 O J 2 Eh O

JOO CUOO 200 JOO EH 2 tn 2 Eh O

·’ COO m O O D>0 O J Eh 2 EH O 2 2 O

• J 2 Eh joo IhOO (HE 2 Eh O 2 En 2

OOO 200 200 >00 2 O O Eh O

3 0 0 JOO ΟΌ O OO O Eh O 2 Eh Eh

Φ Eh 2 0) E 2 nOO JOO O O O 2 O

JOO S 2 Eh 200 200 Eh 2 Eh Eh Eh ie 107540 eh<eh<uu<o eho<u<<<eh

UEh<<00<U

uuu<uoo<

EhEhUO<Eh£hU

uu<uuuou

OUUUUOEhEh O O U U U Eh . O U

ehEhuehuehehu

U Eh £h- U U O O U M

EhUO<OUEhU h <UOUEhOUEh 3 > uuoehuehuo λ U CJ O Eh U Eh O m Eh

CJ Eh Eh Eh U Eh 030 G

u<uoo<<«< c

EhUUOEhUUU<g Ehooeho<ehuu<d OEHO<UOO*<Onj

EhUOU^UEhOEh+J

OU£h<UEh<EhU..

<U<0<UUUUZ

uuuooueh<oq OOOUUU<UEh| <OUEhOEh<UEhIo

UU<EhUOOUEh.,H

<OOEhEhOUUUs -» <<uehu<<ueh£ 3 <Suuuuuouu,-l

3 EH<EH<SOOO<<CL

X

+> eiooooo<o<:(c 3 Eh O O < Eh < U Eh <+j •π <Εη<<00<ΕηΕημ

EhUUEhUUUU<s m <<<EHOO<EH<5 H <OUUEhOUUEh o EHUUEHUOOO<rn 0 EHU0EHEH<<<01

EhOOUEhEhOUOlT)

CM

3 U<EhEhEhEhOU< rH EhUOEhEhEhOEhU + 3 U Eh O Eh Eh Eh ' < U Eh

Eh U U < Eh O Eh O U Eh ^ UUOEhEhUOUUs-EhO<OUEhO<< - < O U U U U Eh U < £ 7 < Eh O Eh Eh < O Eh U t\ < U < U U O Eh O E-'c'fC1 O EH < Eh Eh Eh < £h U S ί < U U < O O O U < J T< < < < < Eh Eh Ο < 2«ο U U O O O U O U Eh|o

< Eh O O U < O U Ο -H

O U Eh Ο < O EH eh Eh 0 +> I’ <UUOOOUUEh^^

O U U Eh U < < O <|C

o u u u u u o < u i £ O < U O < Eh o < < ί 2

EhUOEhUOOOU.ujiL O O O Eh Eh O O O Eh'^ 19 107540

Taulukon VII mukaisen sekvenssin seuraavat ominaispiirteet ovat mainitsemisen arvoisia. Sekvenssin 5-päässä on emäksiä, jotka vastaavat polyG-cDNA-kytkijän emäksiä. Sitten on noin viisi emästä (joista käytetään merkintää "N"), joiden sekvenssiä ei ollut helppo määrittää yksiselitteisesti 5 Sangerin et ai., menetelmällä edeltävien useiden G:iden vuoksi. Sen jälkeen tulee 12 kodonin sarja, joka koodaa osaa polypeptidin oletetusta esijaksosta. Esimerkissä 1 kuvattujen luonnosta eristettyjen hpCSFrien aminoterminaalisen sekvenssin perusteella osoitetaan oletetun "valmiin" hpG-CSF:n ensimmäinen treoniiniryhmä numerolla +1. Sitä seuraa valmis hpG-CSF, joka sisältää kuvi-10 ossa esitetyt 174 ryhmää. "Lopetuskodonin" (OP-kodoni, TGA) jälkeen on noin 856 emäksen verran luetuksi tulematonta 3-pään sekvenssiä ja useista Arista koostuva polyA-"häntä". Taulukossa VII näkyvät myös ainutkertaiset HgiAi- ja Apal-restriktioendonukleaasien tunnistuskohdat samoin kuin kaksi Stul-kohtaa (joita käsitellään tässä hakemuksessa prokaryoottisten ja eukaryoottisten il-15 mentymisjärjestelmien konstruoinnin yhteydessä). Koska polypeptidistä puuttuvat asparagiiniryhmät, ei siinä ole ilmeisiä N-glykosyloitumiskohtia. Alleviivatut 6 emästä lähellä 3-pään luetuksi tulemattoman sekvenssin loppua edustavat mahdollista polyadenylaatiokohtaa.

On huomionarvoista, ettei kumpikaan kahdesta muusta cDNA-20 kloonista, jotka identifioitiin edellä kuvatuilla hybridisaatiomenettelyillä kaikkiaan 450 000 kloonin joukosta, sisältynyt koko esijaksoa koodaavaa DNArta transkription aloituskohdasta eteenpäin. Itse asiassa kaikki kolme hpG-CSF-kloonia päättyivät 5-päässä täsmälleen samassa kohdassa, mikä osoittaa, että kopioidun mRNA sekundaarirakenne estää voimakkaasti cDNArn ·· 25 muodostumisen tästä kohdasta taaksepäin. Käytännössä tämä merkitsee sitä, ettei Okayaman et ai., [Mol. and Cell. Biol. 3 (1983) 280 - 289] kuvaaman kaltaista cDNA-ilmentymistutkimusta, jotka käytettiin GM-CSF:n eristämiseen [Wong et ai., Science 228 (1985) 810 - 814], olisi helposti voitu käyttää hpCSF-DNA:n eristämiseen, koska tällaiset eristysjärjestelmät tavallisesti 30 edellyttävät täyspitkän cDNA-transkriptin läsnäoloa tutkittavissa klooneissa.

« ·

Edellä esitetyn sekvenssin ei voida helposti odottaa varmistavan hpG-CSF-geenin suoraa ilmentymistä mikrobi-isännässä. Tällaisen ilmentymisen varmistamiseksi hpG-CSF:ää koodaava alue tulisi varustaa aloituskodo-nilla ATG, ja sekvenssi tulisi insertoida transformaatiovektoriin kohtaan, joka 35 on sopivan promoottori-/regulaattori-DNA-sekvenssin ohjauksen alaisena.

20 107540

Esimerkki 5 Tässä esimerkissä käytettiin edellisessä esimerkissä eristettyä hpG-CSF:ää koodaavaa cDNA:ta genomikloonin etsimiseen. Ihmissikiön maksasta valmistettu lambdafaagigenomikirjasto [valmistettu Lawnin et ai., mene-5 telmällä [Cell 15 (1978) 1157 - 1174] ja saatu T. Maniatisilta] tutkittiin käyttämällä nick-luettua koetinta, joka koostui kahdesta hpG-CSF-fragmentista, jotka oli eristetty pilkkomalla HgiAkllä ja Stulillä (HgiAl - Stul, 649 emäsparia; Stul -Stul, 639 emäsparia). Kaikkiaan noin 500 000 faagia siirrostettiin petrimaljoille (12 kpl, 15 cm), kasvatettiin pesäkkeet ja hybridisoitiin ne koettimen kanssa 10 käyttämällä Benton/Davison-menettelyä [Benton et ai., Science 196 (1977) 180], Kolme kloonia (1 - 3), jotka antoivat toisessa tutkimuksessa voimakkaimmat autoradiografiasignaalit, kasvatettiin 1 litran viljelminä ja kartoitettiin pilkkomalla restriktioentsyymeillä ja tekemällä Southern-täpläanalyysi, jossa käytettiin radioleimattua 24-meerioligonukleotidia (merkkiaineena γ-32Ρ-ΑΤΡ) 15 5'CTGCACTGTCCAGAGTGCACTGTG3'. Kartoitustulokset osoittivat, että eristetyt kloonit 1 ja 3 olivat identtisiä ja klooni 2 sisälsi 2 000 lisäemästä hpG-CSF-geenin 5’-puolella. Kloonia 2 käytettiin sen vuoksi jatkokarakterisointiin.

Kloonin 2 DNA pilkottiinEcoRI :llä hpG-CSF-geenin sisältävän 8 500 20 emäsparin (ep) pituisen fragmentin vapauttamiseksi, joka sitten alakloonattiin pBR322:een ja kartoitettiin tarkemmin pilkkomalla restriktioentsyymeillä, tekemällä Southern Blotting -tutkimus, M13-alakloonaus ja sekventointi. Saatu sekvenssi esitetään taulukossa Vili.

• •I

> · « « 21 107540 o O O O O O o O O O O O O © <~i «n tn *r m vo Γ

ΟΟ O El X 2 fr* JO

cj ο o o οα o 3 o CJ 2 O O ViU & OB* e* u o o a o H Ju E* O 2 O w O o co cj o 2 e· «o o ^2 2002 en 2 o 00 o o o o co o ve a o o Et E* o ·-)< u «h « e·

O O E-t E* O O E« IJO

E* O O U WO 2 Iti O

O O E-t O JC O O ΉΟ q e* e· o e< 2 o o 2 U E· _ O «no o 2

CJ O E· 2 -to O O

E< O E* U <0 H o

yoou O Et O O

<<00 U O O O

O O 2 E-t AO O Et CJ Et O O >.2 o o CJ E« 2 CJ -to O Ei JJ 2 2 00 2 o O O 2 Et «j E-t O Et 2 O O E-t -to 2 o

000«£ <0 O O

2 O O 2 o -u o 2 o

O O E· E· »n «> E< O O

U O E« O J S 2 H O

O Et Et O O O O

2002 o e-i < q e* 2 cj o o o 2 υ 2 o 2 o e-· a 2 2 o o e-· o

2 CJ 2 O 2 O CJ

cj 2 q o o o s-· y 5 2 o o o o 2 2 O E-· o 2 E-t

O O E-t O 2 O O

2 E* E· O o O E-t

o E* f E* O O S

u o «5 o o 2 o O Et 2 2 o O o

Sr· O CJ e-t O O" 2

CJ E* 2 E-t 2 o O

H E-t E-t O U o e« 2 M o o o o o 2 3 H < ^ E-t o o a o > 2 O Et 2 o O o 0022 2 o o n CJ 2 O E-ι O H 2 ^ CJ CJ 2 CJ o O E-t

-J CJ E· O 2 B> O O

O E· 2 E-t O CJ O

DOOCJE-t O O Et

1—t CJ E-t E-t <5 O E-t O

3 O E-t 2 E-* 2 O· O

(C E^ E-· O E-t O O 2

E-tCJOOO CJ CJ O

2 O 2 <, O O E-· q o o 2 o o cj

2 2 CJ O CJ O CJ

o CJ trf o CJ 2 o a E-t < cj 2 o cj .. 2 U 2 E-« o 2 o 2 o cj o 2 o 2 2 o E< o 2 o o CJ O O E-* 2 o 2 0 0 0 2 2 E-t o o 2 2 2 o 2 o

O CJ O 2 O O CJ

CJ H CJ E-t O O CJ

2 2 CJ 2 o 2 o CJ E-t O CJ O CJ E-t 2 a 2 o cj o cj CJ E-t 2 E-t CJ CJ Sr·

CJ O O ε-t Et O CJ

2 CJ O E-t CJ o 2

2 CJ CJ 2 O E-t O

2 0 0 2 2 E-t CJ

*· CJ 2 O 2 O CJ O

• CJ O O CJ 2 Et 2

CJ O O O E> O CJ

E-t Et 2 < CJ E-· O

2 E-t O CJ O O CJ

2 O E-· 2 O 2 2 O O Et O O O 2 2 CJ E-* O O Et 2 O O O E-t O O E< E< O 2 E-t O 20 E-< E-· E-t O CJ O CO -ui O 2

CJOOE-i 2rW(UEt O

ocjocj 2 1 a: 2 o

O Et 2 E-t 2 30 O

2U2Et E< » E O

CJ O O 2 2 iJO E-t 200CJ Et O a O 2 0220 O (N >, 2 2

O CJ O E· E-< I >J 2 O

020CJ 2 jJ O O

OCJOCJ E· aiE-t o 22 107540 O O O o o o o o o o o O © r-i <N m

® Οΐ rH rH rH rH

,5 £ OHOO 4 0 > O O O H O au o e 4 OOOO u ö ™ >-i 4 o 4 o o h h uu 4 o o 4 o o 30 «5000 u u —< 4 H 4 O O 0.0 OO O O H O 0)0 3 «5 ooou ri en a)H 4 4 4 0 M <

JEH OOOO >i O

MO- *5 0 «5 0 rHO

>tO O O O «5 OO

OH U0«50 30

MO OHOO <UH

>< 4 O H H O JO

J 4 H O «5 O u £h

30 O «5 O O <U O

(UH 0 0 4 0 CO H

JO 000*5 MO

30 OOHO <

(UH 0*500 SO

JO O 4 H 4 >1*5 (UO *500*5 r-io

JS H *5000 OO

O* H 00 00030

v. O OHOOmaH

IUO OOOO JO

0*5 *5000 30

CO OOOO (UH

r-· *5 O <5 *5 *5 JO

OO H 4 4 O «-(O

. O O O OOOU (OH

3 Ή u u H O O 4 S»0 3 D.O OOOO 30

v 30 00-00 41 H

+3 (UH O H *C O JO

(rt JO 0 0 4 0 30 .5* * O 4 0 4 0 rH 4

~ (UO O «5 O H OO

^ OH <50*50 30 u O 000*5 r-t <

H <UO HHOU OO

H 0*5 00*5*5 O O

H (OO 0400 u CJ

> rH O O O H 4 0.0

<50 HOHO MO

n OH 0440 --(4

h! u O 0004 SO

•S 0.0 <040 MO

>. O 0404 >i O

3 r-t o- H H H 4 OH

>H OO O H < 4 30

3 30 4400 (UH

(O (UH OHOO JO

Fh jo H<ooomo OO O 4 4 O >i 4 u O 1030 O O 4 J 4 0.0 rn <u H 4 o O u o rH k. O JO O H O >4

+ JO MO O O O HH

H4 >i 4 O 4 4 u o

rrtrtjU J4HOO £ O

IrHU 30 4 O O H4

40 r-t«5UOH «JO

34 0 0 4 H 4 rHO

rH 4 CO O 4 O 40

OO rH 4 O O 4 VOMH

CU OO O O O Π > O

*-· 4 304 00 OH

OO (UH 4 H 4 O

rHO JOOOO 4

«JHomou OO O

>U n rH O H O O O

ή 4 4 0 O H H O

JO M 4 H O O O

E-1 4 rH o O O O H

au 4 0 O O O 4

• o >i O H O 4 O

• HH rH0440 O

30 00004 H

(UH aH<04 H

JO M 4 4 O O O

m 4 4 0 O O H O

rHO >i O O H O H

40 .1 0 0 0 4 4

ή H 00004 O

(UO CUUHO O

W4 rH 4 4 O U 4

O M O 00044 O

γΗ~η4 a» o O O O H

ISO rH H H 4 < O

ao !-t 4 O O O 4

uo MO 4 O 4 O

HH >1*5400 H

30 J4uoo O

(UH Di O O H O H

JO uoHOO O

30 44404 4

(UH rHOOHO O

23 107540

O O O O O

O O o o o vo r- ao

»H pH »H pH pH

o e «s «s o o o o o rt < © .h u O 3 «£ O O U pHflE-1 E-· <-·«:

Eh HU rt S> O «S O O

«S φ u Q« U E H il C3 U en < en «s o <n a> e« a 3 o < o e-*phs< a <u h 3 o o o «S iJ fr V fr Eh < cj oi u j cj u o «S >1 O CO U < «s u fr ph < o a

O >f CJ O CJ O CJ

O Ή o 3 0 CJ CJ

«S O O a)E* U CJ

O<^»<0< JO o u O Γ» pH CJ u < O E-t «s «s o j u «s e-· O O H < O fr

< «S Op O «S CJ

o o m «s O o O «S «SO u «s

< CJ 3 0 < CJ

«S Eh «H O «S

O CJ J EH O CJ

O fr HU O Eh

O O £ U O «S

O &H fr < fr O

O U O U U Eh «S fr HO fr u o u eu o eh «s

O O O >1 Eh «S U

._. «S CJ o ι-h O o o h O O ή o o o «s

3 EH Sh 3 0 O «S

*S EH « EH EH O

3 fC U J Eh o O

3 EH Eh 3 O O U

<0 U U rt «s Eh O

•fi O «S O O O O

'H O < O O O O

«5 Eh HO Eh < H >S U CU o o <

H Eh CJ HO O O

H < CJ «O «S «S

5 O O en Eh «S O

O O Φ O O Eh

< «S Ή Eh U O

o < o rt «e o «s

ä «S O >1 O O O

X O < iH O fr O

3 O O O O O O

rH < O 3 «£ O O

3 O O «H «S O O

h Eh < O O «S «S

p° O U 3 0 O < ^ Eh Eh Φ fr O Eh

O O JO O «S

«S EH m o o «s O «S pH O Eh fr

fr fr < O EH O

O o o e O O fr

<H 3 CJ O cv pH < Eh EH

Γ* QJ £h < OO Eh Eh

JO O 3 0 O «S

OCO Eh ΦΕη U O

r-HpH«S O JO O Eh

O O O 3 0 «S O

3 0 O 01 Eh O O

Φ Eh O JO Eh Eh JO O >< O O Eh «JO O pH O OCO Eh pH CJ o O O N H < <

«SO Eh COHOCJ O

CO O pH «e CO o

pH «S O OO pH «s «S

OU «S HO OO o u cj «s >p«c a a o

UJO O Eh Eh HO U

en «s o 30 EhEh o ou eh φεη φ υ υ

HO EH JU rt Eh O

a. ο o Φυ ph < pc 01U O J £h HU u

>iO < Op Eh JU EH

U Eh o 3 EH Eh«S O

HU U ΦΕη HU Eh

ΦΟ fr JU JU U

cn«< u >iu Eh«s o

HU Eh rt O «JU EH

ΦΟ O OO rt U «S

C/l< EH OHO «SO O

30 «S 00ΦΟ ΦΕη O

ΦΕη O tn«S JEh Eh

JU U a fr Op Eh O

O O CJ U .H «s QpU Eh

LO H o U SO 05 < O

CUU O 3 U «SU u

«JEh Eh ΦΕη «JU U

rt CJ U JU rt CJ O

24 107540

O O O O O O O O

O OOQOOOO

σ\ o -h m m in \a

r-l (N Γ4 <N <N CN C4 {N

•w*c e· o o o fr· u fr· * au «2 u o · < e· <c o h U fr· O fr· *2 U O fr·

<U U <£ fr· U U U «£ U

w fr· <2 o u < o «2 <: <n u e· u u u u &· o ^ ο e· &· o «c &· fr* o < O fr· U < O «2 O < ^· e· <2 fr· u o u &· u «e·· e· &· u o o e· e· > o u < u fr· &· u o

3 0 fr· U U O U fr· O

4) H 'UHfriUUfr^O

jo &· fr· u «2 u &· <

-HU «2 fr· O U U fr· O

ra h E-· O fr· U O fr· U

> O fr· < U U O O < o > o e· o «2 fr· o u u in-no < e· o u o fr· u

^ O O fr· U E· fr· < O U

>< o e· < o u e· u -ho e· e· e· o < < o

OO < E· U «2 U < O

<a < U «2 »2 U O O fr·

•HU U U fr· fr· fr· O U

«2 0 U O E· *2 U O U

OO fr· fr· < fr· «2 O U

ho <2 u e· o o e· o 2 u U U fr· <2 U U fr· σ’ u uue-iouou

HO U fr· «2 «2 O E· U

<2 U O fr· fr· O <2 fr· *2 co e· u o fr· u fr· o —s ή < U U fr· fr· c c

3 OU U E· < U U 2 O

3 συ uouuuoo d s. fr o E* u u o u o 3 o* E" «2 o «2 < o 2 o t: 2 fr· «2 E· fr· O fr· O fr·

-HU U U «2 O O U O

*r-> 2 O U fr· «2 O E· O O

— Hfrt O U <2 fr· U E· O

συ «2 o e· u 2 o o h w fr· aoooouoE· I—I rau Ofr· o o -e E-· o o au -»OU 2 <2 u u o o

ΙΓ 2 0 C- h U . O E- U U fr· O

h* οσυ -nau u 2 u u u fr· H· 4= fr< cououuuu 0 »H CU fr· rH<iU<fr*<Ufr· M » U OUOE-iOUOfr· M iHU 2U 2 00 O O fr· 3 2 0 iHU O O O fr· E-· fr· H OO 2 0 O «2 «2 fr· 2 fr·

3 HU 3E-IUOOUUO

1 au oE-*2ofr«oofr·

£ -UU JU<OUE-*OU

^ σ fr· otnu o e-· o o 2 u S 2 r--H< «2 u £-. o o fr! rau -H B U u «2 o o o u -H U O’UOOOE-'Ufr·

·· «2 O H0<OE-iUfr*O

·· >. fr· 2UOE-*UE>Ufr·

-ho 32«2UO«2UO

OU OEi*2UUU2U

co juouooo2 r-t < -Hfr<OUOU<0 ou ·αΕ·υΕ·2ουυ

HU >0220 E"UU

.CU a>UUUEiE-<0<

fr· *5 H0 2UOOOU

OU 2υουΕ·Ε·Ε·Ε· HU HU«£frUOO<

au >.2 «2 u o 2 o U

OCO fri-fr· «2 u u u 2 2 <H -4 < H o fr· fr· u o o <2 •που συ fr< o o < 2 o ·. 30 M fr· fr· fr· 2 u u u σΕ-· Ήθ<υο«ίου

J U «JE»E-*UEi«2 2U

e u >o 2 e· < «2 <2 . fr·

.-40 3UUUOE-UU

«2 o ή< fr· cj o &· 2 «2

Ofr· 00U20fr<00 HU 30 U 2 fr· «2 0 E· au σΕ·ο«2υΕ·Ε·Ε-· •au j u 2 «2 < «2 u fr· -Hu o a* u «2 «2 u <2 u o

«2 0 U3 .C fr· fr· O O fr· u O

•jo -Hat· &· < o fr· u fr· 0) E· hU E· O O fr· O 2 Σ < σο2Ε·Ε·οου >, < ο2&«υ2&·22 »h o coo<2uoo OO a 2 &· u u u fr· o 30 ouooouoo

OjE· 30 &· 2 E· fr· &· E· d U QJfr4«it4(J<2Ufr· 3 <2 JO fr· O fr· *2 O fr· a <2 OTE· E· fr· U «2 O E· 25 107540

O O O O O

o o o o r> Γ' co σ\ o o <n cn <n m m £-< O E-· £*

O < CJ CJ

Eh < CJ «< O < < fr.

cj eh cj cj

CJ < CD CJ

cj < cj < < Eh < a

CJ < CJ CJ

f O < < cj cj cj cj eh < cj eh «£ o cj o CJ" Eh CJ Eh EH EH < < CJ CJ Eh 3 < c t· cd < o eh CJ CJ CJ < < e a eh CJ CJ Eh < cj < cj cj < < CJ < a Eh o cj . «c cj < cj cj eh < < < Eh CJ Eh CJ < Eh Eh cj cj o cj

< < CJ U

CJ CJ C3 CJ cj CJ Eh Eh e-· c CJ O CJ EH o

C Eh CJ < CJ

O CJ < CJ EH

O < CJ EH CJ

s CJ U CD Eh <

3 Eh CJ CJ < CJ

5 cj eh cj υ cj

S Eh U EH <i &H

nj < cj cj cj cj (0 CJ CJ CJ Eh Eh -n O CJ CJ U < — CJ Eh CJ Eh t£

CJ CJ CJ CJ CJ

H Eh Eh < CJ CJ

m a a a eh eh

Lj < < CJ EH <

Γ CJ CJ CD CD CJ

cj cj cj < <

_ a < EH < O

O CJ CJ CJ CJ <4

M Eh Eh CJ EH CJ

Jui < CJ CJ CJ O

3 CJ < EH Eh CJ

.H O CJ CJ Eh <5

3 Eh CJ CJ CJ <C

m U CJ EH <£ U

S CJ CJ CJ 2 < ^ Eh CJ CJ < <

Eh CJ < CJ CJ

... CJ < CJ CJ CJ

CJ CJ CJ < CJ

CJ Eh eh CJ <£

EH EH CJ CJ CJ

Eh CJ < < CJ

EH Eh O CJ <

<C CJ Eh O CJ

CJ CJ Eh < <

< < CJ CJ CJ

CJ CJ EH CJ < cj a eh o cj

Eh £h CJ < CJ

cj cj o a cj CJ CJ Eh CJ cj CJ .CJ CJ Eh Eh eh < a cj cj

CJ CJ E· cj CJ

.. CJ EH EH < E·

< O U CJ CJ

CJ Eh CJ CJ «£ CJ CJ Eh < < CJ < CJ O Eh

«S O CJ CJ CJ

a cj < cj cj a Eh CJ cj cj

CJ CJ Eh Eh CJ

CJ CJ CJ CJ EH

CJ < < EH CJ

< «C CJ CD CJ

Eh CJ CJ O CJ

Eh CJ Eh < <

Eh «C CJ CJ CJ

Eh < U CJ «<

Eh < O < CJ

CJ CJ Eh CJ CJ

Eh Eh Eh CJ Eh

CJ CJ Eh CJ CJ

< Eh CJ CJ Eh

CJ CJ Eh CJ CJ

26 107540 hpG-CSF-geenin sisältävän genomi-DNA:n restriktioendonukleaasi-kartta (noin 3,4 kiloemäsparia) esitetään yksityiskohtaisesti kuviossa 1. Kuviossa 1 näkyvät restriktioendonukleaasit ovat: Ncol, N; Pstl, P; BamHI, B; Apal, A; Xhol, X; Kpn, K. Kartan alapuolella olevat nuolet osoittavat genomisek-5 venssin selvittämiseen käytetyn sekventointistrategian. Laatikoilla merkityt alueet ovat cDNA-kloonissa esiintyviä alueita, ja varjostettu päästä avoin laatikko edustaa sekvenssiä, joka ei esiinny cDNA-kloonissa, mutta identifioitiin tutkimalla mRNA-täpliä koettimilla. Eksonille n:o 1 ehdotettujen koodaavien sekvenssien identifiointi tehtiin Northern-täpläanalyysillä. 24-meerinen oligo-10 nukleotidikoetin. 5'CAGCAGCTGCAGGGCCATCAGCTT3', joka kattaa ennustetut eksonien 1 ja 2 silmukoitumiskohdat, hybridisoitiin hpG-CSF-mRNA:n kanssa Northern-täplämuodossa. Tuloksena olevassa täplässä näkyy samankokoinen (noin 1 650 ep) mRNA kuin eksoni 2-oligonukleotidikoettimella. Nämä tulokset yhdistettyinä kykyyn ohjata pSVGM-Ppol-vektorista peräisin ole-15 van hpG-CSF-geenin ilmentymistä (esimerkki 9), jossa käytetään taulukossa Vili esitettyä Met-aloituskodonia, määrittelevät eksonin 1 sisältämät koodaavat sekvenssit. Eksoneille 2 - 5 ovat ominaisia hpG-CSF-geenin (taulukko VII) cDNA-kloonista (Ppo2) saadut koodaavat jaksot.

Esimerkki 6 20 Tämä esimerkki koskee keinotekoisen geenin, joka koodaa hpG-CSF:ää ja sisältää E. colin kannalta etusijalla olevia kodoneja, valmistusta.

Lyhyesti ilmaistuna noudatettiin yleisesti ottaen tämän hakemuksen tekijän nimissä olevan PCT-julkaisun WO 83/04053 (Alton et ai.), joka maini-25 taan tässä viitteenä, mukaista menettelyä. Geenit suunniteltiin sillä tavalla, että komponenttioligonukleotideista koottiin ensin useita kaksoissäikeitä, joista puolestaan koottiin kolme erillistä jaksoa. Nämä jaksot suunniteltiin helposti lisättäviksi, ja ne voitiin amplifikaatiojärjestelmästä poistamisen jälkeen sijoittaa sopivaan ilmentymisvektoriin peräkkäin tai usean fragmentin samanaikaisella 30 ligaatiolla.

Jaksojen I, Il ja III konstruointia valaistaan taulukoissa IX - XIV. Muodostettaessa jakso I, mitä valaistaan taulukoissa IX ja X, oligonukleoti-deista 1 -14 koottiin 7 kaksoissäiettä (1 ja 8; 2 ja 9; 3 ja 10; 4 ja 11; 5 ja 12; 6 ja 13; 7 ja 14). Nämä 7 kaksoissäiettä ligatoitiin sitten taulukon X mukaiseksi 35 jaksoksi I. Taulukosta X on myös havaittavissa, että jakso I sisältää jakson alussa olevan tarttuvan Xbal-pään ja sen lopussa olevan tarttuvan 27 107540

BamHI-pään, jotka ovat käyttökelpoisia tehtäessä ligaatio amplifikaatio- ja il-mentymisvektoreihin ja jaksoon II.

Taulukko IX

5 EChpG-CSFDNA -JAKSO I

CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAA 1 TAATGACTCCATTAGGTCCTGCTTCTTCT 2 CTGCCGCAAAGCTTTCTGCTGAAATGTCTGG 3 1Q AACAGGTTCGTAAAATCCAGGGTGACGGT 4 GCTGCACTGCAAGAAAAACTGTGCGCTA 5 CTTACAAACTGTGCCATCCGGAAGAGC 6 TGGTACTGCTGGGTCATTCTCTTGG 7 .

CATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT 8 GCAGAGAAGAAGCAGGACCTAATGGAGT 9 15 TGTTCCAGACATTTCAGCAGAAAGCTTTGCG 10 CAGCACCGTCACCCTGGATTTTACGAACC 11 TAAGTAGCGCACAGTTTTTCTTGCAGTG 12 ACCAGCTCTTCCGGATGGCACAGTTTG 13 GATCCCAAGAGAATGACCCAGCAGT 14 28 107540 ouo © u o o a u

VO U U <n Eh < CO U U

ζ-> < .H U U rH Eh < au u a au E-* < < < Eh au u a eh < fr < u a u a E-* < au u a au < E-< fr < fr < u a au

OE-t< o B < o U U

un a U r-HUU Γ' < E-I

ua rt u a πύα

Eh < ©I u a r-)| *£ En au < fr rH| *< E-v ml au '»ia u uuh| fr < au voioa «niu a Ei < au u a < eh au < fr <fr fr < o Eh < o < Eh o<Eh eh < © < eh vo a u << Eh rH Eh <3 i—iau au u a u a au au fr < E-· c fr < u a au E-ι < EH < < fr u a au u a u a < e- fr < < Eh < Eh © < Eh o a u o<e-<

m < B-ι σν<Επ in a U

EH < < Eh «H < £h < Eh U a Eh «£ < Eh U U Eh <

< Eh fr < UU

fr < a U < EH

< fr fr < Eh < <fr u a a u £h <£ fr < u a

M

©ua ©<eh ©au ouffi V< CNOU ©<Eh Tf uu © < e < Eh < Eh H fi <! rH Eh <fl o aa ua ua am S uacoi eh< fr < ua 5 <eh au au ua 3 >h|< fr niuaoi *C Eh Eh < h a u eh<m| sEhcni fr£ 3 au au m ι*2 eh -i au Jö < <Eh fr c < fr fr < ^ Q ©<£h ©Eh< o C Eh ©au

. 6« iH *C Eh Γ"Εη< muu © £h *C

en <C fr UU r-lCEH H EH < a < fr ua <eh <eh i <c eh h *cch au au'»| U U <« < £h UU EH<rH|

a < < Eh Eh < MU O

x: Επχαυ uu ua a a uu <eh uu 63 au au EH < 29 107540

Kuten taulukoista XI ja XII ilmenee, jaksoa II muodostettaessa oli-gonukleotidit 15-30 yhdistettiin 8 kaksoissäikeeksi (15 ja 23; 16 ja 24; 17 ja 25; 18 ja 26; 19 ja 27; 20 ja 28; 21 ja 29; 22 ja 30). Nämä 8 kaksoissäiettä ligatoi-tiin sitten jaksoksi II taulukon XII mukaisesti. Kuten taulukosta XII lisäksi ilme-5 nee, jakson II alussa on tarttuva BamHI-pää ja lopussa tarttuva EcoRI-pää, jotka ovat käyttökelpoisia ligaatiosssa amplifikaatiovektoriin ja jaksoon I. Jaksossa Il on loppupään lähellä myös Sstl-kohta, joka on käyttökelpoinen mahdollisessa ligaatiossa jaksoihin II ja III.

Taulukko XI

10

EChpG-CSFDNA -JAKSO II

GATCCCGTGGGCTCCGCTGTCTTCT 15 TGTCCATCTCAAGCTCTTCAGCTGGC 16 15 TGGTTGTCTGTCTCAACTGCATTCTGGT 17 CTGTTCCTGTATCAGGGTCTTCTG 18 CAAGCTCTGGAAGGTATCTCTCCGGA 19 ACTGGGTCCGACTCTGGACACTCTGCA 20 2Q GCTAGATGTAGCTGACTTTGCTACTACT 21 ATTTGGCAACAGATGGAAGAGCTCAAAG 22- GACAAGAAGACAGCGGAGCCCACGG 23 ACCAGCCAGCTGAAGAGCTTGAGATG 24 ACAGACCAGAATGCAGTTGAGACAGACA 25 CTTGCAGAAGACCCTGATACAGGA 26 CAGTTCCGGAGAGATACCTTCCAGAG 27 TAGCTGCAGAGTGTCCAGAGTCGGACC 28 AAATAG T AG TAG C AAAGTCAGCTACATC 29 AATTCTTTGAGCTCTTCCATCTGTTGCC 30 « 30 107540 Ο ζ_) O' O < Eh O < Eh vo Eh «ί CN E-t < C0Eh<

CD O rHOO H CJ O

Eh < CD U (">1 CD O

Eh cn|«£ Eh tN| Eh < Ol CD O rH|< Eh Eh «C tN| CD O CD U rHlEH <

Eh C CD U cn|CJ CD

O CD Eh C C Eh cd u a cd cd o O u (J o£h< o e <4

in Eh < r-HCJO r- O CD

U CD HOU HOU

CD CJ < Eh < Eh < Eh < Eh £h <

CJ CD "3· CJ CD CD CJ

voIEh < cm| CD U EH < ih|Eh dj Eh <J «C £h

O CD CJ CD CD CJ

Eh < Eh < < Eh

M

O CJ CD O Eh < OEh< OS

^ CD CJ O CJ CD vo CJ CD O

<Eh rHEH< H CD CJ O

*5 Eh CDCJVOI < Eh CJ CD colCD CJ cn| CJ CD <3 Εη< <h|cD O CD CJ Eh CJ CD < Eh Eh C Eh

Eh< OCD CJ CD CD CJ

CEh Eh C Eh< <Eh H CJ CD <Eh a CD <Eh

M

X o CJ CD O Eh < O C Eh O < Eh „ n E < σν CD CJ in o CD HUO h

o CD U EH«C H < E cnEh<-U

Eh «3 CJ CD CD CJ CJ CD CQ

X eh <3 U CD CDCJOOl · CD CJ CD

3 OCD Eh< Eh<(n| <Eh -H Eh «3 Eh <3 olo CD CDCJol 3 Eh <3 CD a CM | Eh < CNlrf Eh n| fö O CD Eh «3 CJ CD cn|<'Eh

Eh Eh «3 OCD «3 Eh CDCJ

HH

H o CD CJ o E < o CD CJ o CD CJ

S CN Eh < co CD CJ vf O CD o E < 0 OCD CD CJ riOCD (N<£h

ω acjnl Eh< Eh <3 CD O

!*. inlOCDCN] O CD CDCJ <Eh

< *"H |o CD Eh «3 CD CJ CJ CD

^ Eh< Eh< CDCJ eCEH

1 U CD < Eh ml Eh< «5 Eh

CD CJ r»lO CD cm I O CD CJ CD

<3 CDCJ rHlOO <Eh CD O

2S

Q O CD CJ O E < 0<Eh O CD CJ

1¾ h E 4 r'UCD ncDU σι Eh <3 CO CDCJ <Eh rH CD CJ H E s 0 CJ CD <3 Eh OCD Eh «3 1 O CD CJ CD CJ CD <3 Eh CD CJ M Eh < Eh< Eh <3

a Eh K U CD OCD OCD

Δ < EEh< Eh< <Eh U CD 3 CD O OCD Eh<

M CQEh< Eh <3 OCD

31 107540

Lopuksi valmistettiin jakso III taulukoissa XIII ja XIV esitettävällä tavalla. Tätä varten oligonukleotideista 31-42 koottiin 6 kaksoissäiettä (31 ja 37; 32 ja 38; 33 ja 39; 34 ja 40; 35 ja 41; 36 ja 42). Nämä 6 kakoissäiettä ligatoitiin sitten taulukossa XIV esitettäväksi jaksoksi III. Kuten taulukosta myös ilmenee, 5 jakson III alkupäässä on tarttuva BamHI-pää ja lopussa tarttuva EcoRI-pää, jotka ovat käyttökelpoisia ligaatiossa amplifikaatiovektoriin, ja ainakin EcoRI-pään kyseessä ollessa, ilmentymisvektoriin. Jaksossa III on lisäksi alkupäässä Sstl-kohta, joka on käyttökelpoinen mahdollisessa ligaatiossa jaksoihin II ja III.

Taulukko XIII

10

EChpG-CSFDNA -JAKSO III

GATCCAAAGAGCTCGGTATGGCACCAG 31 CTCTGCAACCGACTCAAGGTGCTATGCCG 32 15 GCATTCGCTTCTGCATTCCAGCGTCGTGC 33 AGGAGGTGTACTGGTTGCTTCTCATCTG 34 CAATCTTTCCTGGAAGTATCTTACCGTGT 35 TCTGCGTCATCTGGCTCAGCCGTAATAG 36 AGAGCTGGTGCCATACCGAGCTCTTTG 37 20 ATGCCGGCATAGCACCTTGAGTCGGTTGC 38 TCCTGCACGACGCTGGAATGCAGAAGCGA 39 ATTGCAGATGAGAAGCAACCAGTACACC 40 CAGAACACGGTAAGATACTTCCAGGAAAG 41 AATTCTATTACGGCTGAGCCAGATGACG 42 32 107540 O < Eh O Eh ei

vo CJ O (NUO

U U rH &H < H

U U < Eh « UO o au aa < o aa aa < « EH < En < Eh

< EH aa EH

eh < eh < aa o a a o c Eh o < Eh in a a r-ι a a γ^εη<

Eh «33 rH Eh <^3 o! i—I <33 Eh aa uovl <c eh a U oo I «srlEH <33 Eh < iN|< Eh a| n|EH «< aa nk eh aa aa aa au aa

Eh < Eh «£ a a mi aa eh ai < eh 's·! o < eh o a u o a a vfuu o a a voeh< aa h eh < -n a a u a aa aa < EH «C Eh aa < EH Eh < VOIEH < aa au Ha a

Ua Eh < Eh < EH < au < Eh aa aa a a OIEh c O < Eh O Eh < n la a en o a maa aa aa ή u a

«S3 Eh < Eh a U

aa aa Eh e aa u a aa ►> < Eh Eh «3 Eh < lj aa aa eh < □ a a aa aa * h aa eh< eh< S tl o eh < o a a o a a v oh < eh co a a ^ a a ~ n Enecr>| aa ή a a i s a a a| <eh <eh a “ n a a a a σ» eh < * 3 m|aa alaani eh < S S eh < m π|εη 5 au ^ V aa -h eh< eh< 1 U U 03 ei Eh < Eh ei eiEncn aa Eh< 2 a o a a o a a o a a

En H C E r» En *33 n < Eh en <eh ua hceh a <εη Επ«ί aa-Hi i au eh ei aa^l a a m au miEn < a eh k aa n la a δ < e a o aa a a m Eh <s. Eh w m EH|*i Eh ei 33 107540

Jakson I muodostama Xbal - BamHI -fragmentti ligatoidaan Xbal:llä ja BamHkllä avattuun M13mp11-faagivektoriin. Vektori avataan sitten uudestaan pilkkomalla BamHUIä ja EcoRUIä, minkä jälkeen tehdään ligaatio jakson Il muodostaman BamHI - EcoRI -fragmentin kanssa. Tässä vaiheessa jaksot I 5 ja II on yhdistetty oikein orientoituneina. Seuraavaksi avataan toinen M13mp11-vektori pilkkomalla BamHIJIä ja EcoRkllä ja ligatoidaan jakson III muodostaman BamHI - EcoRI -fragmentin kanssa.

Jaksot I ja II sisältävä vektori pilkotaan Xbakllä ja Sstkllä. Jakson III sisältävä vektori pilkotaan vastaavasti SStl:llä ja EcoRUIä. Kummassakin pil-10 konnassa saaduista kahdesta fragmentista pienemmät ligatoidaan plasmidiin pCFM1156, joka on ennalta avattu Xbakllä ja EcoRkllä. Tämän reaktion tuloksena on ilmentymisplasmidi, joka sisältää jatkuvan, taulukossa XV esitettävän DNA-sekvenssin, joka koodaa koko hpG-CSF-polypeptidiä ja jossa on amino-terminaalinen metioniinikodoni (ATG) translaation aloittamiseksi E. colissa.

34 107540 30 Eh «J 30 3 E-t 30 OuEh W E-* >,<£ —, r.

3 Eh O rH 3 Eh 3 Eh 3 Eh w < jo ho JO O< JO JO JO <£ o <O OO £ g h eh Eh > iH <£ W Eh 3 Eh 3 <£ O < W «£ -.- ωο o -h mei -no «tn 3 eh ho ho SS W eh OO >0 <0 JO JO 0.0 <0 H Eh O Q. 30 C <£ >iEh CO <0 < ΟΈη . c-

30 < W 3 Eh ' J <2 HO J < .—I O ho «E

W Eh o< JO OO OO oo <o < o n Eh Eh >, 30 H Eh CO 30 w O σ>Επ HO O J -H <£ 30 rH <£ 3£H 3&H HO CV Ti < O OO OO W Eh OO JO S <£ <£ O £ g O Eh OC 3 «£ 0 <£ π £h h £h >,Eh CO «. r, Ή O < rH J <£ Hl O >1 <£ JO ΓΗ o rH < Γ. 3

PiO OO OO Oh O Eh Eh Eh <£ OO OO

>i£h 03 OO W Eh 30 0.0 3 0 3 0 w r.

Ή o Eh i-H HO >iO 3 Eh W <£ 3 Eh J £h m r, OO < J 0.0 O Eh JO <£ O rH o CU£h ,¾ ^ 3 <£ «£ W td El H Eh 30 30 30 W <£ 3 Eh <£ >i -H <£ 3 O X Eh 3£h rH <£ HO -§

JEH < J K O CO Eh Oh Eh JO OO <£ O

O «£ Eh 0» WO H Eh 30 η £h 3 «£ H Eh --.

ή Ο Ο π >ιϋ 30 3 Eh JO J <£ 30 ,5 2» 0.0 Ο <£ O Eh C/3 Eh JO Eh <£ OO 03 Eh gg H H Eh Eh H 30 30 >i Eh OO -u> O W Eh _ r-

+ J O Eh «J 3 Eh 3Eh HU HO 3Eh HO

Eh< 0> JO JO OO 0.0 3S < <£ O ju H4JO OOC O W <£ O o O .OUEh 0>.Eh OCO 0 3 0 — ηι n I 3 Eh CN < rH >i <£ U3 1h o 030 OrHO NH< ^ £ E S r c.

2 < OO J <2 0.0 03 Eh rHOO -Η ο Ο -H P. Eh <£ *£ 3 HO W Eh W Eh 30 C «£ W -2 ,.-.

^ Eh -2 rH >i <£ JO J < 3Eh J e£ J O if, g <£ OO Eh£h 030 K O JO OO < O oeh n < 03 u Eh 0.0 30 3 «2 au OO cal 2 «2 Eh 3 JO' >hO 3£h J 2 HO v. O h £ 2 Eh OJ Eh < Eh Eh JO OO Eh Eh 0.0 qQ ^ 3 «2 E ra W Eh OO C <£ OO 3£h jj o - r. r, d <2 O >i JO H O J -2 HO J H 3 £h d

Eh Eh O 20 0.0 OO 0.0 J2-- S 2 ^ ^ 6-1 O «C W WO 3 0 H Eh h Eh v. E (TJ£h m t, n O < >i >0 JEh 30 30 JO JO 3! < <J OE . WE WE Eh< <0 j g ^ O 0 3 30 >iO DO 30 h Eh >iEh u p. -.

O Eh 3 3 Eh JO 3Eh JEh .CO JO Γ, Γ, S1 < OJ JO OO JO j< Eh < OO g <C 03 W >£ 3 Eh W Eh >,Eh WEh Ctf — no O EH 3 3 EH >iO HO JO J < r) ^ un

O OJ J < JO O Eh OO < O OO J (¾ O

<£ Eh 3 3 <£ u Eh >,E< 3 <£ 3£h u Eh co

*2 EhJ J< 30 JO J < JEh JO

<2 Eh a. OO W Eh OO OO CU Eh Eh < UO

< Oh Crf WEh WEh 30 0.0 O O - r- - r.

· <2 03 J< -h< JO 3 £h W< ho "if] • < <£03 OO 5B O «£ O JO < O P. O j q O «£ C 3 0 >iEh DO WEh cOEh C<£ .- - r-

< <£-H 3 Eh jo 3 Eh JO -HO J<£ dS SpL

Eh OO JO OO JO <£ Ο < O OO jU

O O O 0 OW< 030 OCO O C < OJ<£ OCOr-^c n m (j

j O H JJO in (D-H C^J< OJ.2 HWEn (H3Eh S-Γ j S.hS

o a. <o jo oo oo η > o jjo ^00 j s 0 35 107540

Vaikka tämän DNA:n ilmentämiseen voidaan käyttää mitä tahansa soveltuvaa vektoria, voidaan ilmentymisplasmidi pCFM1156 helposti muodostaa plasmidista pCFM836, jonka konstruoimista kuvataan EP-hakemusjulkaisussa 136 490. pCFM836 pilkotaan ensin Ndelillä ja teh-5 dään sitten tylppäpäiseksi Pöllillä, niin että molemmat olemassa olevat Ndel-kohdat tuhoutuvat. Seuraavaksi vektori pilkotaan Clalillä ja Sacllilla olemassa olevan polykytkijän poistamiseksi ennen ligaatiota tilalle tulevan poly-kytkijän kanssa taulukon XVI mukaisesti. Tämä korvaava polykytkijä voidaan muodostaa Altonin et ai., (supra) menetelmällä. Ilmentymisplasmidissa 10 pCFM1156 tapahtuvaa ilmentymistä säädellään lambda-PL-promoottorilla, joka puolestaan voi olla C|857-repressorigeenin oh jauksessa (jollainen on E. coji -kannassa K12 AHtrp).

• · . · · 36 107540 *

rH

M

Eh < PS

< Eh OI

U O Oi U U Wl

< H Eh «C

O U r~ O U ^ U U Eh «£ E1 ί i-h < Eh 3

< Eh i—f CM

UUS o u u m

Eh <£ en cn EH <£ m U U en O U - U U r*

U U rH u U

U U 3 Eh <C *

< Eh & <C Eh CN

< Eh nsl U U O

Eh < U U JS

Eh <3 * < Eh X

O U --H «C Eh

U U -H Eh < M

Eh < OI O U S3

< Eh C <£ Eh E

£h <S ·η d. Eh 3 < eh nsl Eh < m

U U * < EH

jC Eh LO *H Eh LO

«ί Eh Π >J < Eh t"

Eh <C -U| Eh «C

< Eh - Cn| C Eh

«< EH rH U O rH

H O U OH U U O

> UU Ό OI U U -C

X < Eh Zloi U U X

O O SI U U

O U U a\ U U rH

X < Eh CN Γ" EH < 3 X <c EH id e EH > 3 U U - U U <

rH < EH h - O U

3 Eh< O H «CS"10 3 U U Λ Cl O U Γ"

Eh Eh < xl OJ U U

Eh < Xl Eh < < Eh cn U O Ή

-- U U <—! i—! Eh i—I

: En «ΐ U Eh <£ rH

Eh <5 *·Η Ei «5 T3

EH < rH d U U C

< EH oinsl O U -rH

U U rH <£ Eh K

U U uin <i Eh

Eh < tn U U n < Eh rH U U Ό

rH »H

VO

37 107540

Esimerkki 7 Tämä esimerkki koskee hpG-CSF-polypeptidin tuottamista E. colis-sa [Met'1 ]-hpCSF:ää koodaavan DNA-sekvenssin avulla. Käytetty sekvenssi oli osittain synteettinen ja osittain cDNA-peräinen. Synteettisessä sekvenssis-5 sä käytettiin E. coNn suosimia kodoneja.

Plasmidi Ppo2, joka sisältää taulukon VII mukaisen hpG-CSF-geenin, pilkottiin HgiAkllä ja Stukllä, jolloin saatiin noin 645 emäsparin fragmentti, joka sisältää valmista hpCSF:ää vastaavan geenin (taulukko VII), seitsemän esijaksoryhmiä vastaavaa kodonia 5-päässä ja noin 100 emäsparia 10 3'-pään koodaamatonta aluetta. Pilkottaessa HgiAUIä jää neli-emäksinen tarttuva 5'-pää, joka on identtinen Pstl-kohdan kanssa, ja Stul-pilkonnassa jää tylppä pää. Tämä mahdollistaa fragmentin helpon sijoittamisen M13mp8(Rf):ään, joka on pilkottu Pstlillä ja tylpän pään muodostavalla restriktioentsyymillä Hindi. Kun oli tehty amplifikaatio M13:ssa, hpG-CSF-DNA irrotettiin pilkko-15 maila Apakllä ja BamHkllä, jotka katkaisevat ketjun Apal-kohdasta, joka kattaa hpCSF:n ryhmiä +3 - +5 vastaavat kodonit, ja vastaavasti BamHI-kohdasta, joka sijaitsee M13mp8-restriktiopolykytkijässä olevan Hindi-kohdan jälkeen. hpG-CSF-polypeptidin tuottamisen mahdollistamiseksi E. colissa valmistettiin alla olevassa taulukossa XVII esitetty synteettinen fragmentti.

20 Taulukko XVII

5* - C TAG AAA AAA CCA AGG AGG TAA TAA ΑΤΑ 31 _ TTT.TTT GGT TCC TCC ATT ATT TAT Xbal -1 +1

Met Thr Pro Leu 25 ATG ACA CCT CTG GGC C - 5' TAC TGT GGA GAC -3’

APaI

Kuten taulukkoa XVII analysoimalla voidaan todeta, kytkijä sisältää tarttuvan Apal-pään, kodonit, jotka vastaavat hpG-CSF:n kolmea ensimmäistä 30 aminopään ryhmää (jolloin "saadaan takaisin" edellä kuvatussa M13-DNA:n Apal-pilkonnassa poistuneet Thr1:ä, Pro2:a ja Leu3:a vastaavat kodonit ja käytetään E. colissa ensisijaisesti ilmentyviä kodoneja), translaation aloituskodo-nin ATG, 24 emäsparin pituisen sekvenssin, joka toimii ribosomisitoutumis-kohtana, ja tarttuvan Xbal-pään.

35 E. cpji -ilmentämisessä käytetty ilmentymisvektori oli vektori, jota kuvataan pCFM536:na EP-hakemusjulkaisussa 136 490 (Morris, 10. huhti- 38 107540 kuuta 1985). (Katso myös ATCC 39934, E. coH JM103, joka sisältää pCFM536:n). Lyhyesti ilmaistuna plasmidi pCFM536 pilkottiin XbaLllä ja BamH:llä. Sitten siihen ligatoitiin edellä kuvatut hpGCSF-fragmentti (Apal/ BamHI) ja kytkijä (Xba/Apal), jolloin saatiin plasmidi, josta käytetään merkintää 5 p536Ppo2.

Plasmidilla p536Ppo2 transformoitiin E. col| AM7 -kannan faagin-kestävä variantti, joka oli ennalta transformoitu plasmidilla pMW1 (ATCC-nro 39933), joka sisältää Cl857-geenin. Transformoituminen varmistettiin kantap-lasmidin pCSF536 sisältämän antibioottiresistenssimarkkerigeenin (amp) 10 avulla. Soluviljelmiä pidettiin yllä LB-liemessä (50 pg/ml ampisilliinia) lämpötilassa 28 °C, ja kun soluviljelmä oli kasvanut tiheyteen joka vastasi aallonpituudella 600 nm mitattua absorbanssia 0,5 (A600 = 0,5), indusoitiin hpCSF-ilmentyminen nostamalla viljelmän lämpötila 42 °C:ksi kolmen tunnin ajaksi. Viljelmän lopullinen optinen tiheys vastasi A600-arvoa 1,2.

15 hpG-CSF-geenin ilmentymistaso transformoiduissa soluissa oli

Coomassie-sinisellä värjätystä SDS-polyakryyliamidigeelistä arvioituna 3 - 5 % solun kokonaisproteiinista.

Solut otettiin talteen sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 3 500 x g 10 min JS-4.2-roottorissa. Veteen sekoitetut solut [25 % (paino/tilavuus)] rikottiin joh-20 tamalla seos kolmesti French Pressure Cell -laitteen läpi, jossa vallitsi paine 69 000 kPa. Rikotut solut sisältävää suspensiota sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 x g 15 min JA-20-roottorissa. Pelletti suspendoitiin takaisin veteen ja liuotettiin kokonaisproteiinipitoisuutena noin 5 mg/ml 1-%:iseen lauriinihappoon, joka sisälsi 50 mmol/l Trisiä, pH 8,7. Liuotettua pellettimateriaali sentrifugoitiin 25 kiihtyvyydellä 15 000 x g 10 min, ja lisättiin supernatanttiin CuS04:a pitoisuudeksi 20 mmol/l. Tunnin kuluttua tämä näyte syötettiin C4-HPLC-kolonnille puhdistettavaksi esimerkin 1(B) mukaisella menettelyllä, jolloin tehtiin tarvittavat tilavuus-ja pitoisuussäädöt.

Toinen puhdistusmenettely kehitettiin, jotta saataisiin suurempia 30 määriä hpG-CSF:ää formuloituna orgaanisia aineita sisältämättömään pusku-:* riin. Tämä materiaali soveltuu in vivo -tutkimuksiin. 150 g solutahnaa suspen doitiin noin 600 ml:aan 1 mM DTT-liuosta, ja johdettiin neljästi Manton Gualin -homogenaattorin läpi, jossa vallitsi noin 48 000 kPa:n paine. Rikottuja soluja sisältävää suspensiota sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 x g 30 min, ja pel-35 letti suspendoitiin 400 ml:aan liuosta, joka sisälsi 1 % deoksikolaattia (DOC), 5 mmol/l EDTAa, 5 mmol/l DTT:tä ja 50 mmol/l Trisiä, pH 9. Tätä suspensiota se- 39 107540 koitettiin huoneenlämpötilassa 30 min ja sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 x g 30 min. Pelletti suspendoitiin takaisin noin 400 mkaan vettä ja sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 x g 30 min. Pelletti liuotettiin 100 ml:aan liuosta, joka sisälsi 2 % Sarkosyliä ja 50 mmol/l Trisiä, pH 8. Lisättiin CuS04:a pitoisuudeksi 5 20 mmol/l, ja seosta sekoitettiin 16 tuntia huoneenlämpötilassa ja sentrifugoi tiin kiihtyvyydellä 20 000 x g 30 min. Supernatanttiin lisättiin 300 ml asetonia. Tämä seos laitettiin jäähauteeseen 5 000 x g 30 min. Pelletti liuotettiin 250 rnkaan liuosta, joka sisälsi 6 mol/l guanidiinia ja 40 mmol/l natriumasetaattia, pH 4, ja laitettiin liuos 1 200 mkn G-25-kolonnille, joka tasapainotettiin ja eluoi-10 tiin 20 mM natriumasetaattiliuoksella, pH 5,4. hpG-CSF-piikki (noin 400 ml) yhdistettiin ja laitettiin 15 mkn CM-selluloosakolonniin, joka oli tasapainotettu 20 mM natriumasetaattiliuoksella, pH 5,4. Näytteen lisäämisen jälkeen kolonni huuhdottiin 60 mklla liuosta, joka sisälsi 20 mmol/l natriumasetaattia (pH 5,4) ja 25 mmol/l natriumkloridia, ja eluoitiin sitten 200 mklla liuosta, joka sisälsi 15 20 mmol/l natriumasetaattia (pH 5,4) ja 37 mmol/l natriumkloridia. 150 ml tätä eluenttia väkevöitiin 10 mkksi ja syötettiin 300 mkn G-75-kolonniin, joka tasapainotettiin ja eluoitiin liuoksella, joka sisälsi 20 mmol/l natriumasetaattia ja 100 mmol/l natriumkloridia (pH 5,4). Piikin sisältävät fraktiot, jota oli 35 ml, yhdistettiin ja steriloitiin suodattamalla. Lopullinen hpG-CSF-pitoisuus oli 1,5 mg/ml, 20 tuotteen puhtausaste on yli 95 % geelillä analysoituna, ja se sisälsi alle 0,5 ng pyrogeeniä 0,5 mg.aa kohden hpG-CSF:ää. Pyrogeenipitoisuus määritettiin käyttämällä Limulus Amebocyte Lysate (LAL) -testivälineistöä (M.A. Biopro-ducts, Walkersville,Maryland).

Esimerkki 8 25 Tämä esimerkki koskee yhdistelmämenetelmien käyttöä hpG-CSF:n kanssa analogisten polypeptidien valmistamiseen, joissa asemissa 17, 36, 42, 64 ja 74 olevat kysteiiniryhmät korvattiin yksilöllisesti sopivilla aminohappo-ryhmillä.

Souzan et ak, (PCT-hakemusjulkaisu W085/00817, 28. helmikuuta 30 1985) mukaiset paikkaohjattu mutageneesi -menettelyt tehtiin plasmidin “ p536Ppo2 [Met1] -ryhmää koodaavalle DNA:lle, jota kuvataan tässä hakemuk sessa, käyttämällä seuraavassa taulukossa XVIII kuvattuja synteettisiä oligo-nukleotideja, joiden koko on 20 - 23 emästä. Oligonukleotidi nro 1 mahdollisti [Ser17]hpG-CSF:ää koodaavan geenin muodostumisen; oligonukleotidilla nro 2 35 saatiin [Ser^hpG-CSF, jne.

40 107540

Taulukko XVIII

Oligonukleotidi Sekvenssi 1. 51-CTG CTC AAG TCC TTA GAG CAA GT-3' 5 2. 51-GAG AAG CTG TCT GCC ACC TACA-3' 3. 51-TAC AAG CTG TCC CAC CCC GAG-3' 4. 5'-TGA GCA GCT CCC CCA GCC AG-3' 5. 5'-CTG GCA GGC TCC TTG AGC CAA-3'

Cys-Ser-paikkaohjattu mutageneesi -restriktiot tehtiin käyttämällä io templaattina M13mp10:ä, joka sisälsi p536Ppo2:sta eristetyn hpG-CSF-fragmentin Xbal-BamHI. Kunkin Cys-Ser-substituution sisältävän M13mp10-kloonin DNA käsiteltiin Xbakllä ja BamHkllä. Saatu fragmentti kloonattiin il-mentymisvektoriin pCFM746, ja ilmentymistuotteet eristettiin esimerkissä 7 kuvatulla tavalla.

15 Plasmidi pCFM746 voidaan konstruoida pilkkomalla plasmidi pCFM736 (jonka muodostamista talletetuista ja julkisesti saatavilla olevista materiaaleista kuvaa Morris PCT-hakemusjulkaisussa WO 85/00829, 28. helmikuuta 1985) Clahllä ja BamHkllä olemassa oleva polykytkijän poistamiseksi ja seuraavan polykytkijän tuomiseksi tilalle.

20 Taulukko XIX

Clal

5'CGATTTGATTCTAGAATTCGTTAACGGTACCATGGAA

3' TAAACTAAGATCTTAAGCAATTGCCATGGTACCTT

25 GCTTACTCGAGGATCCGCGGATAAATAAGTAAC3' CGAATGAGCTCCTAGGCGCCTATTTATTCATTGCTAG5'

Sau3a

Puhdistettaessa tämän keksinnön mukaisia Cys-Ser-analogeja sus-30 pendoitiin noin 10 -15 g solutahnaa 40 mkaan 1 mM DTT-liuosta, ja johdettiin seos French Pressure Cell -laitteen läpi (paine 69 000 kPa). Rikotut solut sisältävää suspensiota sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 1 000 x g 30 min. Pelletti suspendoitiin liuokseen, joka sisälsi 1 % DOC:ta, 5 mmol/l EDTAa, 5 mmol/l DTT:tä ja 50 mmol/l Trisiä (pH 9), ja annettiin sekoittua 30 min huoneenlämpö-35 tilassa. Seosta sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 x g 30 min, suspendoitiin 41 107540 40 ml:aan vettä ja sentrifugoitiin uudelleen kiihtyvyydellä 10 000 x g 30 min. Pelletti liuotettiin 10 ml:aan liuosta, joka sisälsi 2 % Sarkosyliä, 50 mmol/l DTT:ä ja 50 mmol/l Trisiä, pH 8. Kun seosta oli sekoitettu 1 tunti, se selkeytettiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 20 000 x g 30 min ja laitettiin sitten 300 ml:n 5 G-75-kolonniin, joka tasapainotettiin ja eluoitiin liuoksella, joka sisälsi 1 % Sarkosyliä ja 50 mmol/l Trisiä, pH 8. Analogista polypeptidiä sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja niiden annettiin hapettua seisottamalla niitä ilman vaikutuksen alaisina vähintään 1 vrk. Loppupitoisuudet vaihtelivat alueella 0,5 - 5 mg/ml.

Esimerkki 9 10 Tässä esimerkissä muodostettiin nisäkässoluilmentymisjärjestelmä sen toteamiseksi, voisivatko nisäkässolut (COS-1, ATCC CRL-1650) tuottaa ja erittää hpG-CSF-DNA:n koodaamaa aktiivista polypeptidituotetta. Tämä järjestelmä suunniteltiin sellaiseksi, että saataisiin aikaan hpGCSF:n kanssa analogisen polypeptidin erittyminen osittain synteettisen ja osittain 15 cDNA-peräisen rakenteen, joka koodaa [Ala1]hpG-CSF:ää, jota edeltää esipo-lypeptidi, jolla on Wongin et ai., [Science 228 (1985) 810 - 815] ja Leen et ai., [Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 82 (1985) 4360 - 4364] mukaan ih-mis-GM-CSF:ään liittyvä sekvenssi, ilmentymis- ja erittymisprosessoinnin kautta.

20 llmentymisvektori, jota käytettiin keksinnön mukaisten polypeptidi- tuotteiden muodostumisen alustavaan tutkimiseen, oli "sukkulavektori", joka sisältää sekä pBR322:n että SV40:n DNA:n ja joka on suunniteltu mahdollistamaan autonominen repiikaatio sekä E. Coli- että nisäkässoluissa, jolloin in-sertoidun eksogeenisen DNA:n ilmentyminen nisäkässoluissa on viruksen ·* 25 promoottori/säätely-DNA-sekvenssin ohjauksen alainen. Tämä vektori, josta käytetään merkintää pSVDM-19 ja joka on E. co]i HB101:ssä, on talletettu 23. elokuuta 1985 the American Type Culture Collectioniin, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, numerolla ATCC 53241.

Ilmentymisvektorin muodostamiseen liittyvät erityistoimenpiteet oli-. 30 vat seuraavat. Syntetisoitiin alla olevan taulukon XX mukainen esijaksoa koo- . daava DNA-sekvenssi.

42 107540

Taulukko XX

-17

Hindlll Met Trp

5' - A GCT TCC AAC ACC ATG TGG 5 3' - AGG TTG TGG TAC ACC

-10

Leu Gin Ser Leu Leu Leu leu Gly Thr Vai

CTG CAG AGC CTG CTG CTC TTG GGC ACT GTG

10 GAC GTC TCG GAC GAC GAG AAC CCG TGA CAC

-1 +1

Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Leu GCC TGC AGC ATC TCT GCA CCC CTG GGC G -3' 15 CGG ACG TCG TAG AGA CGT GGG GAC -5'

Apal

Kuten taulukosta XX ilmenee, sekvenssi sisältää tarttuvat Hindlll- ja Apal-päät ja kodonit, jotka vastaavat ihmis-GM-CSF:n "esijaksoon" sisältyviksi 20 katsottua 17 aminohapporyhmää. Sen jälkeen tulevat alaniini-, proliini- ja leusiiniryhmiä vastaavat kodonit. Proliini-ja leusiiniryhmät toistavat hpG-CSF:n asemissa +2 ja +3 olevat aminohapot, kun taas alaniiniryhmä toistaa GM-CSF:n aminoterminaalisen (+1) ensimmäisen kodonin, eikä hpG-CSF:n vastaavaa kodonia. Treoniinin korvaamisen alaniinilla suunniteltiin helpottavan 25 GM-CSF-esijakson asianmukaista "prosessoitumista pois" isäntäsolussa GM-CSF:n erittymiskäsittelyyn tavallisesti osallistuvien solumekanismien kautta.

Plasmidi pSVDM-19 pilkottiin Kpnkllä, ja katkaisukohta tehtiin tylppäpäiseksi Klenow-entsyymillä. Sen jälkeen DNA pilkottiin Hindllklla. Tuloksena oleva suuri fragmentti yhdistettiin ja ligatoitiin taulukossa VII esitettyyn 30 Hindlll-Pvulll-fragmenttiin (eritetty plasmidista Ppo 2 Hindlll-pilkonnalla ja osittaisella Pvulll-pilkonnalla saatuna toiseksi suurimpana fragmenttina), jolloin muodostui plasmidi pSV-Ppol. Taulukon Vili mukainen keinotekoinen GM-CSF-esijaksosekvenssifragmentti ligatoitiin sitten pSV-Ppol:een (kun tämä oli pilkottu Hindllklla ja Apakllä), jolloin saatiin plasmidi pSVGM-Ppol.

35 Plasmidin pSVGM-Ppol DNA:n kalsiumfosfaattisakoilla (1-5 pg) transformoitiin kahdella 60 mm:n maljalla olevat COS-1-solut suurin piirtein 43 107540

Wiglerin et ah. mukaisesti [Cell 14 (1978) 725 - 731]. Vertailunäytteeksi transformoitiin COS-1 -solut myös plasmidilla pSVDM-19. Soluviljelmien superna-tantit otettiin talteen 5 vrk:n kuluttua transfektoinnista, ja niistä tutkittiin hpG-CSF-aktiivisuus. [Ala1]hpG-CSF-saannot viljelmäsupernatanteissa olivat suu-5 ruusluokkaa 1 - 2,5 pg/ml.

Kun [Ala1]hpG-CSF-tuotetta koodaava plasmidi pSVGM-Ppol oli menestyksellisesti saatettu ilmentymään COS-1-soluissa, konstruoitiin toinen vektori, joka sisälsi ihmis-GM-CSF-esijakson, mutta jossa oli treoniiniryhmää (esiintyy luonnossa hpG-CSF:n asemassa 1) vastaava kodoni vastaavassa 10 asemassa olevan alaniinikodonin tilalla. Lyhyesti ilmaistuna syntetisoitiin oli-gonukleotidi (5’CAGCATCTCTACACCTCTGGG3') paikkaohjattua mutaqe-neesiä (SDM, siten-directed mutagenesis) varten. pSVGM-Ppohn sisältämä hpG-CSF-fragmentti Hindlll-BamHI ligatoitiin M13mp10:een SDM:ää varten. Syntetisoitu hpG-CSF-geeni, joka sisälsi Thr-kodonin asemassa 1, eristettiin 15 pilkkomalla Hindllhlla ja EcoRkllä. Tämä fragmentti kloonattiin sitten pSVDM-19:ään, joka oli preparoitu pilkkomalla samoilla kahdella restriktioen-donukleaasilla. Saadulla vektorilla pSVGM-Ppo(Thr) transformoitiin COS-solut, ja viljelmäsupernatanttien hpG-CSF-pitoisuuksiksi mitattiin 1-5 pg/ml.

Lopuksi käytettiin genomisekvenssiä, jonka eristämistä kuvataan 20 esimerkissä 5, ilmentymisvektorin muodostamiseen hpG-CSF:n tuottamiseksi nisäkässoluissa. Tarkemmin ilmaistuna pSVDM-19 pilkottiin Kpnhllä ja Hindllhlla, ja käytettiin suurta fragmenttia nelitieligaatiossa taulukossa XXI esitetyn synteettisen kytkijän kanssa, jossa oli tarttuvat Hind III- ja Ncol-päät. Ncol-BamHI-fragmentti, joka sisälsi eksonin 1 ja joka oli eristetty pBR322:sta (8500 • ‘ 25 hpG-CSF), genomialaklooni ja eksonit 2-5 sisältävä BamHI-Kpnl-fragmentti, joka oli eristetty plasmidista pBR322 (8500 hpG-CSF -genomialaklooni). Saatu nisäkäsilmentymisvektori, pSV/hpG-CSF, tuotti 1 - 2,5 pg/ml hpG-CSF:ää transformoiduista COS-soluista.

Taulukko XXI

30

Hindin

5'AGCTTCCAACAC

AGGTTGTGGTAC5'

Ncol 44 107540

Esimerkki 10 Tämä esimerkki koskee keksinnön mukaisten yhdistelmäpolypepti-dituotteiden fysikaalisia ja biologisia ominaisuuksia.

1. Molekyylipaino 5 Esimerkissä 7 kuvatun E. coli -ilmentymisen tuotteena olevan yh distelmä hpG-CSF:n näennäinen molekyylipaino oli 18,8 kD määritettynä pelkistävällä SDS-PAGE:lla (kuten voitaisiin ennustaa taulukon VII mukaisesta päätellystä aminohappokoostumuksesta), kun taas esimerkin 1 mukaisesti puhdistettujen luonnosta eristettyjen polypeptidien näennäinen molekyylipaino 10 oli 19,6 kD. Luonnosta eristettyihin polypeptideihin liittyvien N-glykaanien läsnäolo voitiin varmuudella sulkea pois, koska taulukon VII mukainen hpG-CSF-primaarisekvenssi ei sisällä asparagiiniryhmiä, ja siksi suunniteltiin menettely sen määrittämiseksi, aiheuttivatko O-glykaanit luonnosta eristettyjen polypeptidien ja glykosyloimattomien yhdistelmätuotteiden väliset molekyylipainoerot. 15 Noin 5 pg luonnosta eristettyä materiaalia käsiteltiin neuraminidaasilla (Calbiochem, LaJolla, Kalifornia), erotettiin 0,5 pg:n näyte, ja inkuboitiin loppu materiaali 4 milliyksikön kanssa O-Glycanasea (endo-x-n-asetyyligalaktoosi-aminidaasi, Genzyme, Boston, Massachusetts) 37 °C:ssa. Seoksesta otettiin näytteet 1/2, 2 ja 4 tunnin inkuboinnin jälkeen. Näille näytteille tehtiin 20 SDS-PAGE E. coK -peräisen yhdistelmämateriaalin rinnalla. Neuraminidaasi-käsittelyn seurauksena eristetyn materiaalin näennäinen molekyylipaino muuttui 19,6 kD:sta 19,2 kD:ksi, mikä viittaa sialiinihapporyhmän poistumiseen. Kun näytettä oli käsitelty 2 tuntia O-glykanaasilla, molekyylipaino oli 18,8 kD-identtinen E. coji -peräisen materiaalin molekyylipainon kanssa. Hiilihyd-25 raattirakenteen herkkyys neuraminidaasille ja O-glykanaasille viittaa hiilihyd-raattikomponentin seuraavaan rakenteeseen: JN-asetyylineuramiinihappo-P(2-6)galaktoosi-p(1-3)-N-asetyyligalaktoosiamiini-R, jossa R on seriini tai tre-oniini.

2.3H-tymidiinin vastaanotto 30 Ihmisen luuydinsolujen proliferaation indusoitumista tutkittiin 3H-tymidiinin lisääntyneen vastaanoton perusteella. Terveiltä luovuttajilta saaduille ihmisen luuydinsoluille tehtiin tiheyserotus Ficoll-Hypaquella (1,077 g/ml, Pharmacia), ja pienitiheyksiset solut suspendoitiin Iscoven alustaan (GIBCO), joka sisälsi 10 % naudan sikiöseerumia ja glutamiinia, penisilliiniä ja strepto-35 mysiiniä. Sen jälkeen 2 x 104 ihmisen luuydinsolua inkuboitiin joko vertailu-alustan tai esimerkin 7 mukaisen E. coli -yhdistelmämateriaalin kanssa 96 ta- 45 107540 sapohjaista syvennystä sisältävissä maljoissa lämpötilassa 37 °C 5 % C02:a sisältävässä ilmassa 2 vrk. Mitattiin pitoisuudet kahdesta rinnakkaisnäytteestä; erot olivat 10 000-kertaisia. Viljelmiä käsiteltiin sitten 4 tuntia 3H-tymidiinillä (0,5 pCi/syvennys, New England Nuclear, Boston, Massachusetts).

5 3H-tymidiinin vastaanotto mitattiin Ventuan et a}., [Blood 61 (1983) 781] kuvaamalla menetelmällä. Tässä kokeessa eristetyt ihmis-hpG-CSF-näytteet pystyvät indusoimaan 3H-tymidiinin sisällytystä ihmisen luuydinsoluihin noin 4 -10 kertaa voimakkaammin kuin vertailusupernatantit. Esimerkin 6 mukaisella E. coH -peräisellä hpG-CSF-materiaalilla oli samanlaiset ominaisuudet.

10 Toinen ihmisen luuydinsolujen proliferaatiotutkimus tehtiin käyttä mällä esimerkin 9 mukaisesti valmistettua transfektoitujen COS-1-solujen kasvualustaa, ja siinä saatiin samankaltaisia tuloksia, mikä osoittaa, että koodatut polypeptid(tuotteet todella erittyivät kasvualustaan aktiivisina materiaaleina.

3. WEHI-3B D+ -solujen erilaistumisen indusointi 15 E. coli -peräisten yhdistelmämateriaalien kykyä indusoida hiiren myelomonosyyttileukemiasolulinjan WEHI-3B D+ erilaistumista tutkittiin puoli-kiinteässä agaralustassa Metcalfin [Int. J. Cancer 15 (1980) 225] kuvaamalla tavalla. Yhdistelmä hpG-CSF-tuotetta ja alustavertailunäytteitä inkuboitiin WEHI-3B D+-solujen (noin 60/syvennys) kanssa lämpötilassa 37 °C ilmassa, 20 joka sisälsi 5 % C02:a, 7 vrk. Näytteitä inkuboitiin 24 tasapohjaista syvennystä sisältävillä maljoilla, ja pitoisuuserot olivat 2 000-kertaisia. Pesäkkeet luokiteltiin erilaistumattomiksi, osittain erilaistuneiksi ja kokonaan erilaistuneiksi, pesäkkeiden solut laskettiin mikroskoopin avulla. E. coli -yhdistelmämateriaalien havaittiin indusoivan erilaistumista.

25 4. CFU-GM-, BFU-E- ja CFU-GEMM-määritykset

Luonnosta eristettyjen monitehoisten ihmis-G-CSF:ien (hpG-CSF:ien) ja yhdistelmämenetelmillä valmistetun monitehoisen ihmis-G-CSF:n (rhpG-CSF:n) havaittiin aiheuttavan ihmisen luuydinsolujen proliferaation ja erilaistumisen. Nämä vaikutukset mitattiin CFU-GM [Broxmeyer et a] Exp. Hematol. 5 30 (1971) 87], BFU-E- ja CFU-GEMM-määrityksillä [Lu et ai., Blood 61 (1983) 250], joissa käytettiin terveiltä ihmisluovuttajilta saatuja pienitiheyksisiä tarttu-mattomia luuydinsoluja. Seuraavassa taulukossa XXII verrataan-CFU-GM-, BFU-E- ja CFU-GEMM-aktiivisuuksia, jotka saatiin käyttämällä 500 yksikköä hpG-CSF:ää ja rhpGCSF:ää.

35 Kaikki pesäketutkimukset tehtiin käyttämällä pienitiheyksisiä tarttu- mattomia luuydinsoluja. Ihmisen luuydinsoluille tehtiin tiheyserotus Ficoll- 46 107540

Hypaquella (tiheys 1,077 g/cm3; Pharmacia). Pienitiheyksiset solut suspendoi-tiin sitten Iscoven muunnettuun Dulbecco-alustaan, joka sisälsi naudan sikiö-seerumia, ja sijoitettiin Falcon-kudosviljelymaljoille (nro 3003, Becton Dickenson, Cockeysville, MD.) 1/2 tunniksi lämpötilassa 37 °C.

5 Taulukko XXII

CFU-GM BFU-E CFU-GEMM

Alusta 0+0 26+1 0+0 luonnon 10 hpG-CSF 83+5,4 83+6,7 4+0 rhpG-CSF 87+5 81+0,1 6+2

Alustavertailunäyte koostui Iscoven muunnetusta Dulbec-co-alustasta, johon oli lisätty 10 % FCS:ää, 0,2 mmol/l hemiiniä ja 1 yksikköä 15 yhdistelmäerytropoietiinia.

CFU-GM-määritysta varten 1 x 105 kohdesolua siirrostettiin 1 mliaan 0,3-%:ista agarkasvualustaa, joka sisälsi täydennettyä McCoyn 5A-alustaa ja 10 % lämmöllä inaktivoitua naudan sikiöseerumia. Viljelmistä laskettiin pesäkkeet (yli 40 solua/aggregaattia) ja todettiin muoto 7. viljelypäivänä. Ilmoitettu 20 pesäkemäärä on neljältä rinnakkaismaljalta laskettujen määrien keskiarvo +/-keskivirhe.

BFU-E-ja CFU-GEMM-määrityksiä varten soluja (1 x 105) lisättiin 1 ml:aan seosta, joka sisälsi Iscoven muunnettua Dulbecco alustaa (Gibco), 0,8% metyyliselluloosaa, 30% naudan sikiöseerumia, 0,05 nM 2-25 merkaptoetanolia, 0,2 mM hemiiniä ja 1 yksikkö yhdistelmäerytropoietiinia. Astioita inkuboitiin kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% C02 ja 5% 02. Matala happipaine saatiin aikaan käyttämällä Reming Bioinstrumentsin (Syracuse, N.Y.) hapenvähentäjää. Pesäkkeet laskettiin 14 päivän inkubaation jälkeen. Rinnakkaisilta maljoilta laskettujen pesäkkeiden määrä on maljoilta :* 30 laskettujen määrien keskiarvo ±keskivirhe.

Kaikkien CFU-GM-määrityksessä muodostuneiden pesäkkeiden havaittiin olevan klooriasetaattiesteraasipositiivisia ja negatiivisia epäspesifisen esteraasin (alfanaftyyliasetaattiesteraasin) suhteen, mikä sopii yhteen sen kanssa, että pesäkkeet ovat tyypiltään granylosyyttejä. Sekä luonnon hpG-35 CSF:n että rhpG-CSF:n ominaisaktiivisuuden havaittiin olevan suunnilleen 1 x 108 yksikköä/mg puhdasta proteiinia määritettynä sarjalaimennusmenetelmällä 47 107540 CFU-GM-kokeella. Taulukossa XXIII esitettävät BFU-E- ja CFU-GEMM-tulokset edustavat kolmea erillistä koetta, ja ne vastaavat luonnon hpG-CSF:lle kirjallisuudessa annettuja arvoja. On tärkeätä huomata, että rhpG-CSF on äärimmäisen puhdasta ja vapaa muista mahdollisista nisäkkäi-5 den kasvutekijöistä sen ansiosta, että se tuotetaan E. colissa. Siten rhpG-CSF:llä on kyky tukea sekapesäkemuodostusta (CFU-GEMM) ja BFU-E:ta lisättynä yhdistelmäerytropoietiinin länsä ollessa.

5. Solusitoutumismääritykset

Kirjallisuudessa on kuvattu, että WEHI-3B(D+)-solut ja äskettäin 10 diagnosoiduista leukemioista peräisin olevat ihmisen leukemiasolut sitovat 125l-leimattua hiiren GCSF:ää ja että tästä sitoutumisesta voidaan kilpailla lisäämällä leimaamatonta G-CSF:ää tai ihmis-CSF-p:aa. Testattiin luonnon hpG-CSF:n ja rhpG-CSF:n kyky kilpailla 125l-hpG-CSF:n kanssa sitoutumisesta ihmisen ja hiiren leukemiasoluihin. Hyvin puhdas luonnon hpG-CSF 15 (puhtausaste > 95 %; 1 pg) jodattiin [Tejedor, et ai·, Anal. Biochem. 127 (1982) 1437 ja erotettiin reagensseista geelisuodatuksella ja ioninvaihtokro-matografialla. Luonnon 125l-hpG-CSF:n ominaisaktiivisuus oli noin pCi/pg proteiinia. Tutkittiin hiiren WEHI-3B(D+) -soluista ja kahdesta ihmisen ääreisveren myeloidileukemiasolupreparaatista (ANLL, toinen luokiteltu M4:ksi ja toinen 20 M5B:ksi) kyky sitoa 125l-hpG-CSF:ää.

Hiiren leukemiasolut ja juuri eristetyt ihmisen ääreisveren myeloidi-leukemiasolut pestiin kolmesti PBS:llä, joka sisälsi 1 % BSA:ta. WEHI-3B(D+)-soluja (5 x 106) tai tuoreita leukemiasoluja (3 x 106) inkuboitiin kahtena rinnak-kaisnäytteenä PBS:ssä, joka sisälsi 1 % BSA:ta, (100 pl) leimaamattomien 25 hpG-CSF:n, rhpG-CSF:n tai GM-CSF:n poissa ollessa tai ollessa läsnä erilaisina pitoisuuksina (tilavuus 10 pl) ja 125l-hpG-CSF:n (noin 100 000 pulssia/min eli 1 ng) läsnä ollessa lämpötilassa 0 °C 90 min (kokonaistilavuus 120 pl). Sitten solut suspendoitiin uudelleen, laitettiin kerrokseksi 200 piille jääkylmää FCSiää 350 piin muovisessa sentrifugiputkessa, ja sentrifugoitiin (1000 x g; 30 1 min). Pelletti otettiin talteen leikkaamalla pois putken pää, ja tehtiin pelletille ja supernatantille erikseen laskenta gammalaskurissa (Packard).

Ominaissitoutuminen (pulssia/min) määritettiin mittaamalla koko-naissitoutuminen kilpailijan poissa ollessa (kahden rinnakkaismäärityksen keskiarvo) ja vähentämällä siitä sitoutuminen (pulssia/min) leimaamattoman 35 hpG-CSF:n ollessa läsnä 100-kertaisena ylimääränä (epäspesifinen sitoutuminen). Epäspesifinen sitoutuminen oli korkeimmillaan 2 504 pulssia/min 48 107540 WEHI-3B(D+)-solujen, 1 072 pulssia/min ANLL (M4 ) -solujen ja 1 125 puls-sia/min ANLL (M5B) -solujen ollessa kyseessä. Kokeet 1 ja 2 tehtiin eri päivinä käyttämällä samaa 125l-hpG-CSF-valmistetta, ja todettiin prosentuaalisen inhibition yhtenäisyys käytettäessä 2 000 yksikköä hpG-CSF:ää. Saadut tulokset 5 annetaan taulukossa XXIII.

« • · 49 107540 5

-P

•H

Ä 5 ' ° °

CQ A

LD H

g

A J

i < m

CM VO O

g CM r* W «H tn äP .

3

-H

•H I Γ" m 5 σ» co ·** ·£ s -5

Hl -1 P1 < % 4

tn co -m· CM

«h m o

3 CM CN

H E ' S 5 X -P i o Ν' σν o cm in oco o h o\ r> «3 o CO VO [—

O .— 5 · i—I

•X + A '

Λί S S

iH PQ

S ΓΟ (C I 5 E"* H g ffi \

WJ3 COintMrH O tn O OCO rH

!2 O CO ÖV CO -com X CN rH

Jo vo vo vo. o rH m eri VO m ”, g VO rH CN rH CN CN Π

rH

g oooo ooo oo o \ o © o o o o oo

• o O (N O O CN O O

Ö3 ^ »h *» ^ »I. V

^ O CN O 04 CN (N

>1 rH rH

<β (Ö (Ö (Ö

Cd -I—1 ·Γ*1

.. ·ΓΊ · iH -H

. iH rH ** rH ·· 1-H -H fo ·· -H Cu •H (C W h (0 en

(0 1- & CU w CN dl G O

Oi rH O I U rH O I

rH CU -H βΰ I a) -H e O w

-ΗΟ,ώβΛ O O Λί £ CU U

««o-c a x o a i •HS a -HS g 0) H H <D H o 50 107540

Kuten taulukosta XXIII ilmenee, 125l-hpG-CSF sitoutui WEHI-3B(D+)-leukemiasoluihin. Sitoutumista inhiboi annoksesta riippuvalla tavalla leimaa-maton luonnon hpG-CSF tai rhpG-CSF, muttei GM-CSF. Lisäksi havaittiin luonnon hpG-CSF:n sitoutumista ihmisen myelomonosyyttileukemiasoluihin 5 (ANLL, M4). Näihin soluihin sitoutumisen rinnakkaisilmiönä tapahtuu reaktiona luonnon hpG-CSF:lle nesteviljelmissä erilaistuminen valmiiksi makrofageiksi, joka voidaan todeta solujen muodosta. Se, ettei luonnon 125l-hpG-CSF sitoutunut toiselta potilaalta saatuihin monosyyttileukemiasoluihin (ANLL, M5B), viittaa siihen, että tietyissä leukemioissa voi olla eroja hpG-CSF-reseptorien 10 esiintymisessä. rhpG-CSF:n kyky kilpailla luonnon hpG-CSF:n kanssa samalla tavalla sitoutumisesta 125l-hpG-CSF:n kanssa viittaa siihen, että reseptorit tunnistavat molemmat muodot yhtä hyvin.

Näiden kokeiden, jotka osoittavat luonnon 125l- leimatun hpG-CSF:n kyvyn sitoutua leukemiasoluihin, rinnakkaisilmiönä on luonnon hpG-CSF:n ky-15 ky indusoida viljelmässä akuuttia promyelosyyttileukemiaa (M3) ja akuuttia myeloblastileukemiaa (M2) sairastavien potilaiden pienitiheyksisten luuydin-solujen granulosyytti- ja monosyyttierilaistumista. Kummankin potilaan soluja viljeltiin 4 vrk alustassa joko yksinään tai rhpG-CSF:n läsnä ollessa (1 x 105 yksikköä). Pelkässä alustassa inkuboitujen M3-vertailuviljelmien solut olivat 20 edelleen tyypiltään promyelosyyttejä, kun taas rhpG-CSF:n läsnä ollessa viljellyissä soluissa näkyi myeloidityyppisiä valmiita soluja mukaan luettuna me-tamyelosyytit, jättiläisnauhamuotoiset ja segmentoituneet neutrofiilit ja mo-nosyytit. Tämän potilaan kohdalla todelliset erot tutkittaessa 100 solua olivat seuraavat: vertailunäyte, 100 % promyelosyyttejä; rhpG-CSF-käsitellyt solut, 25 22 % emosoluja ja promyelosyyttejä, 7 % myelosyyttejä, 35 % metamy- elosyyttejä, 20 % nauhamuotoja ja segmentoituneita neutrofiilejä, 14 % mo-nosyyttejä ja 2 % makrofageja. Huomionarvoinen on se seikka, että yksi poly-morfonukleaarisista granulosyyteistä sisälsi edelleen voimakkaan au-er-sauvan, mikä viittaa siihen, että ainakin tämä solu oli erilaistunut leukemi-30 aklooniin kuuluva solu. Toisen myeloblastileukemiapotilaan soluja (M2) viljeltiin T myös 4 vrk rhpG-CSF:n läsnä tai poissa ollessa. Pelkässä alustassa kasva tettujen M2-solujen visuaalinen analyysi osoitti suuria "emosolun kaltaisia" soluja, joista joissakin oli nukleoleja. Jotkut rhpG-CSF:llä käsitellyistä M2-soluista erilaistuivat valmiiksi segmentoituneiksi neutrofiileiksi, joissa oli jäljellä auer-35 sauvoja keskusneutrofiilissä, mikä viittaa erilaistumisen tapahtumiseen leuke-miaklooniin kuuluvassa solussa. Tutkittaessa morfologisesti 100 solun todelli- 51 107540 nen erilaistuminen, todettiin, että vertailusolut olivat 100-%:isesti emosoluja. RhpG-CSF-käsitellyistä soluista oli 43 % emosoluja, 1 % myelosyyttejä, 15 % metamyelosyyttejä, 28 % nauhamuotoja ja segmentoituneita neutrofiilejä, 2 % promonosyyttejä ja 11 % monosyyttejä. Leukemiasolujen erilaistumista tutkit-5 tiin myös neljällä muulla rhpG-CSF-pitoisuudella (5 x 103, 1 x 104, 2,5 x 104 ja 5 x 104 yksikköä/ml, tuloksia ei esitetä). Jopa pienimmällä tutkitulla rhpG-CSF-pitoisuudella (5 x 103 yksikköä/ml) tapahtui merkittävä erilaistuminen (solut erilaistuivat myelosyyttivaiheen ohi) sekä M3- (50 %) että M2 (37 %) -leukemia-solujen kohdalla.

10 6. Immuunimääritys

Polyklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi immuunimäärityk-sessä käytettäviksi käytettiin antigeeninä esimerkin 1(B) mukaisesti preparoidusta ihmisen virtsarakkokarsinoomasolulinjasta 5637 (1A6) puhdistettua mo-nitehoista G-CSF:ää. Tämän materiaalin puhtausasteen todettiin olevan 85 % 15 polyakryyliamidigeelien hopeanitraattivärjäyksen mukaan. Kuuden viikon ikäiset Balb/C-hiiret immunisoitiin injektoimalla ihonalaisesti useaan kohtaan antigeeniä. Antigeeni suspendoitiin PBS:ään ja emulgoitiin yhtä suurten tilavuuksien kanssa Freundin täydellistä apuainetta. Annos oli 5 - 7 pg antigee-nia/hiiri/injektio. Tehosteimmunisointi tehtiin 18 vrk:n kuluttua samalla määrällä 20 antigeeniä emulgoituna yhtä suureen määrään Freundin epätäydellistä apuainetta. 4 vrk:n kuluttua otettiin hiirestä seeruminäyte ihmisen monitehoiselle G-CSF:lle spesifisen vastaaineen testaamista varten.

Pitimissä olevat Dynatech Immulon II Removawell -liuskat (Dynateck Lab., Inc., Alexandria, Virginia) päällystettiin seoksella, joka sisälsi • · 25 5 pg/ml hpG-CSF:ää 50 mM karbonaatti-bikarbonaattipuskurissa, pH 9,2. Sy vennykset päällystettiin 0,25 pgilla materiaalia 50 μΙ tilavuudessa. Antigeenillä päällystettyjä maljoja inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa ja yön yli lämpötilassa 4 °C. Liuos dekantoitiin, ja levyjä inkuboitiin 30 min 5 % BSA:ta sisältävän PBS:n kanssa reaktiivisen pinnan suojaamiseksi. Tämä liuos kaadet-30 tiin pois, lisättiin syvennyksiin laimennettua ennen immunisointia otettua tai T testiseerumia, ja inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Seerumit laimen

nettiin 1 % BSA:ta sisältävällä PBS:llä, pH 7,0. Seerumiliuos dekantoitiin, ja maljat pestiin kolmesti Wash Solution -liuoksella (KPL, Gaithersburg, Maryland). Kuhunkin syvennykseen lisättiin noin 200 000 pulssia/min jodattua ka-35 niinin anti-hiiri-lgG:tä (NEN; Boston, Massachusetts) 50 piissä PBSiää, pH

7,0, joka sisälsi 1 % BSA:ta. Kun maljoja oli inkuboitu 1 1/2 tuntia huoneen- 107540 52 lämpötilassa, liuos dekantoitiin, ja levyt pestiin viidesti Wash Solukonilla. Syvennykset poistettiin pitimestä ja niille tehtiin laskenta Beckman 5500 -gammalaskurissa. Hiiren seerumit, joissa pitoisuudet olivat suuria, osoittivat yli 12-kertaista reaktiivisuutta vastaaviin ennen immunisointia otettuihin see-5 rumeihin nähden laimennussuhteen ollessa 1:100.

E. coli -peräisen hpG-CSF:n immunologiset ominaisuudet määritettiin mittaamalla reaktiivisuus hiiren seerumin kanssa, joka sisälsi suurena pitoisuutena nisäkässoluperäiselle hpG-CSF:lle spesifistä vasta-ainetta. 0,25 pg E. cgjj -peräistä proteiinia (puhtausaste 90 %) laitettiin Immulon II Removawell 10 -syvennyksiin 50 μΙ:η tilavuudessa, ja tutkittiin hiiren seerumi edellä kuvatulla tavalla.

Hiiren seerumien, joissa pitoisuus oli suuri, reaktiivisuus E. coli -peräisen materiaalin kanssa oli 24-kertainen vastaavaan ennen immunisointia otettuun seerumiin nähden laimennussuhteen ollessa 1:100.

15 7. Seriinianalogien biologiset määritykset

Esimerkin 9 mukaisesti valmistetuista [Ser17]hpG-CSF-, [Ser36]-hpG-CSF-, [Ser^hpG-CSF-, [Ser^jhpG-CSF- ja [Ser74]hpG-CSF-tuotteista tutkittiin hpG-CSF-aktiivisuus 3H-tymidiinin vastaanotto, CFU-GM ja WEHI3B D+ -määrityksillä. Kussakin määrityksessä [Ser17]-analogilla oli rakenteeltaan 20 luontaisten yhdistelmämolekyylien kanssa vertailukelpoinen aktiivisuus. Muiden analogien aktiivisuus oli noin 100 kertaa pienempi 3H-tymidiinin vastaanotto -kokeessa, 250 kertaa pienempi CFU-GM-määrityksessä ja 500 kertaa pienempi WEHI-3B D" -määrityksessä. Nämä tulokset tukevat sitä olettamusta, että asemissa 36, 42, 64 ja 74 olevia kysteiiniryhmiä saatetaan tarvita täyden 25 biologisen aktiivisuuden saavuttamiseksi.

8. In vivo -biologinen määritys

Alzet®-osmoottiset pumput (Alzet Corp., Palo Alto, CA; malli 2001) kytkettiin oikean kaulavaltimon sisäisiin katetreihin ja istutettiin ihon alle seitsemään Syyrian kultahamsteriurokseen. Neljä pumpuista sisälsi puskuria [20 30 mmol/l natriumasetaattia (pH 5,4) ja 37 mmol/l natriumkloridia] ja 1,5 mg/ml E.

'1 coli -peräistä hpG-CSF:ää, kun taas 3 sisälsi pelkkää puskgria. Osmoottisten pumppujen ilmoitettu pumppausnopeus oli 1 μΙ/h korkeintaan 7 vrk:n ajan. Kolmantena päivänä pumppujen istutuksen jälkeen neljän käsitellyn hamsterin keskimääräinen granulosyyttiluku oli kuusinkertainen kolmeen vertailueläi-35 meen nähden (puskuria saaneet), ja kohonnut granulosyyttiluku heijastui ko-konaislymfosyyttimäärään, joka nelinkertaistui. Käsittely ei muuttanut eryt- 53 107540 rosyyttien määrää. Nämä tulokset osoittavat, että yhdis elmämateriaali edistää spesifisesti granulosyyttien tuotantoa ja/tai vapautumista nisäkkäässä.

Luonnossa esiintyvien hpG-CSF:n alleelisten muotojen lisäksi tämä keksintö koskee myös muita hpG-CSF-tuotteita, kuten hpG-CSF:n kanssa 5 analogisia polypeptidejä ja hpG-CSF-fragmentteja. Noudattamalla edellä mainitun Altonin et ai., nimissä olevan hakemusjulkaisun (WO 83/04053) mukaisia menettelyjä on helppo suunnitella ja valmistaa geenejä, joiden mikrobi-ilmentymistuotteina on polypeptidejä, joiden primaarirakenne on erilainen kuin tässä määritelty yhden tai useamman ryhmän identiteetin tai sijainnin suhteen 10 (esimerkiksi substituutiot, lisäykset ketjun päihin tai keskelle ja deleetiot). cDNA- ja genomigeenejä voidaan vaihtoehtoisesti helposti muuntaa käyttämällä tunnettuja paikkaohjattu mutageneesi -menetelmiä, ja käyttää näitä muunnettuja geenejä analogisesti polypeptidien ja polypeptidijohdosten muodostamiseen. Tällaisilla tuotteilla olisi ainakin yksi yhteinen biologinen ominai-15 suus hpGCSF.n kanssa, mutta muut ominaisuudet voivat olla erilaisia. Esimerkkeinä keksinnön mukaisista johdoksista mainittakoon tuotteet, joita on lyhennetty esimerkiksi deleetioiden kautta; hydrolyysiä paremmin kestävät tuotteet (joiden vaikutukset voivat siksi olla voimakkaampia tai pitempään kestäviä kuin luonnossa esiintyvillä tuotteilla); tuotteet, joista on poistettu yksi tai use-20 ampia mahdollinen o-glykosylaatiokohta (mikä saattaa johtaa hiivassa tuotettujen tuotteiden suurempiin aktiivisuuksiin); tuotteet, joista on poistettu yksi tai useampia kysteiiniryhmiä tai joissa ne on korvattu esimerkiksi alaniini- tai se-riiniryhmillä ja jotka on mahdollisesti helpompi eristää aktiivisessa muodossa mikrobijärjestelmistä; tuotteet, joissa yksi tai useampia tyrosiiniryhmiä on kor-25 vattu fenyylialaniinilla ja jotka voivat enemmän tai vähemmän helposti sitoutua kohdesoluilla oleviin hpG-CSF-reseptoreihin. Keksinnön piiriin kuuluvat myös polypeptidifragmentit, jotka sisältävät vain osan hpG-CSF:n jatkuvasta aminohapposekvenssistä tai sekundaarirakenteesta, joilla fragmenteilla voi olla yksi hpG-CSF:n vaikutuksista (esimerkiksi sitoutuminen reseptoreihin) mutta ei 30 muita (esimerkiksi pesäkkeiden kasvua stimuloivaa aktiivisuutta). On huomionarvoista, että tuotteiden ei välttämättä tarvitse olla aktiivisia ollakseen terapeuttisesti käyttökelpoisia [katso Weiland et ai., Blut 44 (1982) 173 - 175] tai käyttökelpoisia muissa yhteyksissä, kuten hpG-CSF-antagonismimäärityksis-sä. Kompetitiiviset antagonistit voivat olla sangen käyttökelpoisia esimerkiksi 35 hpG-CSF:n ylituotantotapauksissa.

54 107540 Tässä kuvattu hpG-CSF-polypeptidejä koodaava DNA-sekvenssi on arvokas sen informaation ansiosta, jonka se antaa tämän nisäkäsproteiinin aminohapposekvenssistä ja jota ei tähän asti ole ollut saatavissa muulla tavalla kuin analysoimalla luonnosta eristettyjä tuotteita. Nämä DNA-sekvenssit 5 ovat myös huomattavan arvokkaita tuotteina, jotka ovat käyttökelpoisia suurimittaisen hpG-CSF-mikrobisynteesin aikaansaantiin erilaisilla yhdistelmäme-netelmillä. Toisin sanoen tässä kuvatut DNA-sekvenssit ovat käyttökelpoisia muodostettaessa uusia ja käyttökelpoisia virus- ja rengasplasmi-di-DNA-vektoreita, uusia ja käyttökelpoisia transformoituja ja transfektoituja 10 prokaryoottisia ja eukaryoottisia mikrobi-isäntäsoluja (mukaan luettuina bakteeri- ja hiivasolut ja viljelmässä kasvatettavat nisäkässolut), ja uusia ja käyttökelpoisia menetelmiä tällaisten, hpG-CSF:ää ja sen sukulaistuotteita tuottamaan kykenevien mikrobi-isäntäsolujen kasvattamiseksi viljelmässä. Tässä kuvatut DNA-sekvenssit ovat myös huomattavan käyttökelpoisia materiaaleja 15 käytettäviksi leimattuina koettimina ihmisen genomi-DNA-sekvenssien samoin kuin muiden nisäkäslajien cDNA- ja genomi-DNA-sekvenssien, jotka koodaa-vat hpG-CSF:ää ja sen sukulaisproteiineja, eristämisessä. DNA-sekvenssit voivat olla käyttökelpoisia myös erilaisissa vaihtoehtoisissa proteiinisynteesi-menetelmissä (esimerkiksi hyönteissolumenetelmissä) tai ihmisen ja muiden 20 nisäkkäiden geeniterapiassa. Tässä kuvattujen DNA-sekvenssien odotetaan olevat käyttökelpoisia kehitettäessä transgeenisiä nisäkäslajeja, jotka voivat toimia eukaryoottisina "isäntinä" suurten hpG-CSF-määrien ja hpGCSF-tuotemäärien tuottamiseksi. Katso yleisesti Palmiter et ai., Science 222(4625) (1983) 809-814.

25 Keksinnön mukaisten hpG-CSF:n fragmenttien ja sen kanssa ana logisten polypeptidien kannalta käyttökelpoisia ovat raportit, jotka koskevat synteettisten peptidien, jotka suurin piirtein toistavat luonnossa esiintyvien proteiinien, glykoproteiinien ja nukleoproteiinien sisältämän aminohapposekvenssin, immunologista aktiivisuutta. Tarkemmin määriteltynä suhteellisen 30 pienimolekyylisten polypeptidien on osoitettu osallistuvan immuunireaktioihin, jotka pituudeltaan ja laajuudeltaan vastaavat fysiologisesti merkittävien proteiinien, kuten virusantigeenien, polypeptidihormonien tms. aikaansaamia immuunireaktioita. Tällaisten polypeptidien immuunireaktioiden joukkoon kuuluu spesifisten vasta-aineiden muodostumisen provosointi immunologisesti aktiivi-35 sissa eläimissä. Katso esimerkiksi Lerner et ai., Cell 23 (1981) 309 - 310; Ross et ai., Nature et ai 294 (1981) 654 - 656; Walter et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.

55 107540 (USA) 77 (1980) 5197 - 5200; Lerner et al·, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78 (1981) 3403 - 3407; Walter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78 (1981) 4882 -4886; Wong et aL. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78 (1981) 7412 - 7416; Green et al., Cell 28 (1982) 477 - 487; Nigg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79 5 (1982) 5322 - 5326; Baron et al., Cell 28 (1982) 395 - 404; Dreesman et al·,

Nature 295 (1982) 185 - 160; ja Lerner, Scientif-ic American 248, nro 2 (1983) 66 - 74. Katso myös Kaiser et al·, Science 223 (1984) 249 - 255, joka julkaisu koskee synteettisten peptidien, joilla on suurinpiirtein samanlainen sekundaari-rakenne kuin peptidihormoneilla muttei välttämättä niiden kanssa yhteistä pri-10 maarirakennetta, biologisia ja immunologisia vaikutuksia.

Vaikka tätä keksintöä on kuvattu edullisten suoritusmuotojen suhteen, ymmärrettäneen, että alan ammattimiehelle tulee mieleen variaatioita ja modifikaatioita. Siksi on tarkoitus, että liitteenä olevat patenttivaatimukset kattavat kaikki tällaiset ekvivalenttiset variaatiot, jotka kuuluvat keksinnön piiriin.

Claims (11)

107540 Patentti vaatim u kset

1. Polypeptidi, tunnettu siitä, että: a) sillä on taulukossa VII esitetyn aminohapposekvenssin omaavan, 5 luonnossa esiintyvän ihmisen monitehoisen granuiosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän (hpG-CSF) koko primaarirakenne tai osa siitä, ja yksi tai useampia sen biologisista ominaisuuksista; b) se on polypeptidi, joka ei esiinny luonnossa, ja c) se on eksogeenisen DNA-sekvenssin prokaryoottisen tai eukary-10 oottisen ekspression tuote.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että eksogeeninen DNA-sekvenssi on cDNA-sekvenssi.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että eksogeeninen DNA-sekvenssi on genominen DNA-sekvenssi.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että eksogeeninen DNA-sekvenssi sijaitsee itsenäisesti replikoituvassa DNA-plasmidissa tai virusvektorissa.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että se edelleen on kovalenttisesti sidottu havaittavaan merkkiaineeseen.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että havaittava merkkiaine on radioleima.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen polypeptidi, tunnettu siitä, että sitä edeltää metioniiniryhmä.

8. Polypeptidi, tunnettu siitä, että sillä on luonnossa esiinty-25 vän monitehoisen granuiosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän hematopoieetti- set biologiset ominaisuudet ja aminohapposekvenssi, joka on taulukossa VII esitetty polypeptidisekvenssi tai sen mikä tahansa alleelinen muunnos, johdannainen, deleetioanalogi, substituutioanalogi tai additioanalogi ja että se ei esiinny luonnossa ja että se on eksogeenisen DNA-sekvenssin prokaryootti-30 sen tai eukaryoottisen ekspression tuote. • ·

9. Polypeptidi, joka ei esiinny luonnossa, tunnettu siitä, että se koostuu vain taulukossa VII esitetystä aminohapposekvenssistä 1-174. 107540

10. Jonkin patenttivaatimuksen 1,8 tai 9 mukaisen polypeptidin tai sitä koodaavan DNA:n käyttö diagnostiikassa tai hpG-CSF-antagonismimäärityksessä.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen käyttö, tunnettu siitä, 5 että käytetään detektoitavissa olevaan merkkiaineeseen kovalenttisesti liittynyttä polypeptidiä tai DNA:ta. • · 107540