BR112020014525A2 - Induzir e intensificar respostas imunes utilizando sistemas de replicon recombinantes - Google Patents

Abstract

A presente invenção de uma forma geral refere-se ao uso de diferentes moléculas de RNA autoamplificadoras para intensificar as respostas imunes, por exemplo, respostas imunes após a vacinação profilática ou administração terapêutica. Algumas modalidades referem-se às composições e métodos para induzir uma resposta imune em um indivíduo utilizando regimes de imunização de início-reforço.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "INDUZIR

E INTENSIFICAR RESPOSTAS IMUNES UTILIZANDO SISTEMAS DE REPLICON RECOMBINANTES",. REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade sob 35 U.S.C. $119(e) da U.S. No. de série 62/619.540, depositado em 19 de janeiro de 2018, cujos conteúdos inteiros são aqui incorporados por referência na sua totalidade.

INCORPORAÇÃO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

[0002] O material na listagem de sequências anexa é incorporado por referência neste pedido. O arquivo de texto da listagem de se- quências anexo, nome SGI2230 1WO Sequence Listing.txt, foi criado em 16 de janeiro de 2019 e possui 3 KB. O arquivo pode ser acessado utilizando o Microsoft Word em um computador que utiliza o sistema operacional Windows.

CAMPO

[0003] Os aspectos da presente invenção referem-se ao campo da virologia, doenças infecciosas e imunologia. Mais particularmente, a divulgação refere-se a composições e métodos para induzir e/ou in- tensificar uma resposta imune em um indivíduo pela administração se- quencial de pelo menos duas composições imunogênicas compreen- dendo diferentes replicons de RNA.

ANTECEDENTES

[0004] A geração de uma grande população de células T CD8 de memória específica de antígeno é um objetivo para o projeto de vacina contra uma variedade de doenças animais e humanas. Numerosos estudos executados em modelos experimentais demonstraram que o número geral de células T CD8 de memória específica de antígeno presentes no momento da infecção se correlaciona fortemente com a capacidade de conferir proteção ao hospedeiro contra uma variedade de patógenos diferentes. Atualmente, uma das abordagens mais con- cebíveis para gerar rapidamente uma grande população de células T CD8 de memória é através do uso da vacinação de reforço primário. De fato, tem sido relatado que as imunizações de múltiplas doses, pa- ra terapia ou prevenção de doenças, são frequentemente mais efica- zes do que as imunizações de dose única. Essa diferença foi observa- da para diferentes tipos de vacinas, incluindo vacinas vivas atenuadas, vacinas inativadas, vacinas de subunidades de proteínas recombinan- tes e vacinas de polissacarídeos. Existe ainda uma necessidade com relação a regimes heterólogos de reforço primário mais eficaz.

SUMÁRIO

[0005] Esta seção fornece um resumo geral do presente pedido e não é abrangente de seu escopo completo ou de todos os seus recur- sos.

[0006] A presente invenção fornece composições e métodos para a liberação de dois replicons de RNA em um indivíduo para várias aplicações. Em algumas modalidades, as composições e métodos aqui divulgados levam em consideração a indução e/ou a intensifica- ção de uma resposta imune no indivíduo. Em algumas modalidades, as composições e métodos aqui divulgados podem ser utilizados para a produção de uma molécula de interesse, tal como, por exemplo, um polipeptídeo terapêutico no indivíduo.

[0007] Em um aspecto, algumas modalidades divulgadas nesta invenção referem-se a um método para induzir uma resposta imune em um indivíduo, o método inclui administrar ao indivíduo pelo menos uma dose de uma composição de início que compreende um primeiro replicon de RNA que codifica um primeiro antígeno; e subsequente- mente administrar ao indivíduo pelo menos uma dose de uma compo- sição de reforço compreendendo um segundo replicon de RNA que codifica um segundo antígeno, em que o primeiro e o segundo repli-

cons de RNA são diferentes um do outro. O primeiro e o segundo re- plicons de RNA podem ser qualquer um aqui descrito.

[0008] Em outro aspecto, algumas modalidades divulgadas nesta invenção referem-se a um método para a liberação de dois replicons de RNA em um indivíduo, o método inclui a administração ao indivíduo de uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica um primeiro replicon de RNA que codifica um primeiro antígeno; e subsequente- mente a administração ao indivíduo de uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica um segundo replicon de RNA que codifica um segundo antígeno, em que o primeiro e o segundo replicons de RNA são diferentes um do outro. O primeiro e o segundo replicons de RNA podem ser qualquer um aqui descrito.

[0009] As implementações de modalidades dos métodos de acor- do com a presente invenção podem incluir um ou mais dos seguintes recursos. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são idênticos entre si. Em algumas modalidades, as sequên- cias de aminoácido do primeiro e do segundo antígenos são homólo- gas entre si. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido do primeiro antígeno apresenta pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido do segundo antígeno. Em algumas modalidades, o primei- ro e o segundo antígenos compreendem pelo menos um determinante antigênico reativo cruzado. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo antígenos induzem substancialmente a mesma resposta imu- ne no indivíduo. Em algumas modalidades, o primeiro replicon de RNA é capaz de ativar um sistema imunológico do indivíduo através de pelo menos um mecanismo imunológico que é diferente de um mecanismo imunológico pelo qual o sistema imunológico é capaz de ser ativado pelo segundo replicon de RNA. Em algumas modalidades, o pelo me- nos um mecanismo imunológico é selecionado do grupo que consiste na ativação diferencial da proteína cinase R (PKR), gene induzível pe- lo ácido retinoico | (RIG-I), vias de autofagia, receptores do tipo Toll (TLRs), grânulos de estresse, RNase R e oligoadenilato sintetases (OEA).

[0010] Em algumas modalidades aqui divulgadas, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é um replicon de RNA modi- ficado. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e se- gundo replicons de RNA é derivado de um vírus de RNA de fita positi- va. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie de vírus pertencente a uma família selecionada do grupo que consiste na família Togaviridae, família Flaviviridae, família Orthomyxoviridae, família Rhabdoviridae, família Arteroviridae, família Picornaviridae, família Astroviridae, família Coronaviridae e família Paramyxoviridae. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de um Alphavirus ou um Arterivirus. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie de alfavírus selecionada do grupo que consiste no vírus da encefalite equina oriental (EEEV), vírus da encefalite equina vene- zuelana (VEEV), vírus Everglades (EVEV), vírus Mucambo (MUCV), vírus da Semliki Forest (SFV), vírus Pixuna (PIXV), vírus Middleburg (MIDV), vírus Chikungunya (CHIKV), vírus O'Nyong-Nyong (ONNV), vírus Ross River (RRV), vírus Barmah Forest (BF), vírus Getah (GET), vírus Sagiyama (SAGV), vírus Bebaru (BEBV), vírus Mayaro (MAYV), vírus Una (UNAV), vírus Sindbis (SINV), vírus Aura (AURAV), vírus Whataroa (WHAV), vírus Babanki (BABV), vírus Kyzylagach (KYZV), vírus da encefalite equina ocidental (WEEV), vírus Highland J (HJV), vírus Fort Morgan (FMV), vírus Ndumu (NDUV), alfavírus Salmonid (SAV) e vírus Buggy Creek (BCRV).

[0011] Em algumas modalidades aqui divulgadas, o primeiro e o segundo replicons de RNA são derivados de espécies de alfavírus. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo replicons de RNA são derivados da mesma espécie de alfavírus ou de duas espécies diferen- tes de alfavírus. Em algumas modalidades, o primeiro replicon de RNA é derivado de um alfavírus e o segundo replicon de RNA é derivado de uma espécie não alfavírus. Em outras modalidades, o primeiro replicon de RNA é derivado de um não alfavírus e o segundo replicon de RNA é derivado de uma espécie de alfavírus. Em algumas modalidades, o primeiro replicon de RNA é derivado de um arterivírus (por exemplo, EAV) e o segundo replicon de RNA é derivado de um alfavírus (por exemplo, VEEV). Em algumas modalidades, pelo menos um dos pri- meiro e segundo replicons de RNA compreende uma 5'-UTR modifica- da com uma ou mais substituições de nucleotídeo na posição 1, 2, 4 ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, pelo menos uma das uma ou mais substituições nucleotídicas é uma substi- tuição nucleotídica na posição 2 da 5-UTR modificada. Em algumas modalidades, a substituição de nucleotídeos na posição 2 da 5-UTR modificada é uma substituição de U-G.

[0012] Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é um replicon de RNA modificado compre- endendo uma 5'-UTR modificada e é desprovido de pelo menos uma parte de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma ou mais proteínas estruturais virais. Em algumas modalidades, o replicon de RNA modificado é desprovido de uma parte substancial da sequência de ácido nucleico que codifica uma ou mais proteínas estruturais vi- rais. Em algumas modalidades, o replicon de RNA modificado não compreende nenhuma sequência de ácido nucleico que codifica prote- Ínas estruturais virais. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é um replicon de alfavírus modi- ficado compreendendo um ou mais alças penduculares de RNA em um elemento estrutural de um intensificador de capsídeo viral. Em al- gumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é um replicon de alfavírus modificado que compreende a se- quência de codificação de uma proteína não estrutural heteróloga nsP3. Em algumas modalidades, a proteína não estrutural heteróloga nsP3 é um vírus Chikungunya (CHIKV) nsP3 ou um vírus Sindbis (SINV) nsP3. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo antígenos é expresso sob o controle de um promotor sub- genômico 26S ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, o promotor subgenômico 26S é um promotor subgenômico SINV 268, promotor subgenômico RRV 268 ou uma variante dos mesmos.

[0013] Em algumas modalidades divulgadas neste documento, pe- lo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie de arterivírus selecionada do grupo que consiste em ví- rus da arterite equina (EAV), vírus da síndrome respiratória e reprodu- tiva suína (PRRSV), vírus de elevação da lactato desidrogenase (LDV) e vírus da febre hemorrágica símia (SHFV). Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo replicons de RNA são derivados de espécies de arterivírus. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo repli- cons de RNA são derivados da mesma espécie de arterivírus ou de duas espécies diferentes de arterivítus. Em algumas modalidades, o primeiro replicon de RNA é derivado de um arterivírus e o segundo re- plicon de RNA é derivado de uma espécie não arterivírus. Em algumas modalidades, o primeiro replicon de RNA é derivado de um arterivírus e o segundo replicon de RNA é derivado de um alfavírus. Em algumas modalidades, o primeiro replicon de RNA é um replicon de RNA não modificado derivado de uma espécie de arterivífus. Em algumas mo- dalidades, o primeiro replicon de RNA é um replicon de RNA modifica- do derivado de uma espécie de arterivírus. Em algumas modalidades, o primeiro replicon de RNA é um replicon de RNA derivado de uma espécie de alfavírus e o segundo replicon de RNA é um replicon de RNA derivado de uma espécie de arterivífus. Em algumas modalida- des, o primeiro replicon de RNA é um replicon de RNA não modificado derivado de uma espécie de alfavírus. Em algumas modalidades, o primeiro replicon de RNA é um replicon de RNA modificado derivado de uma espécie de alfavírus.

[0014] Em algumas modalidades divulgadas nesta invenção, o mé- todo de acordo com este aspecto e outros aspectos da presente in- venção inclui ainda uma ou mais etapas de reforço subsequentes, por exemplo, uma ou mais administrações subsequentes da composição de reforço. Em algumas modalidades, uma ou mais da composição de início e da composição de reforço compreendem ainda um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o indivíduo é um animal aquático. Em algumas modalidades, o indivíduo é uma es- pécie aviária, uma espécie de crustáceo ou uma espécie de peixe. Em algumas modalidades, a espécie aviária é uma espécie aviária para consumo alimentar. Em algumas modalidades, os crustáceos são ca- marões. Em algumas modalidades, a espécie de peixe é uma espécie de peixe utilizada na aquicultura. Em algumas modalidades, o indiví- duo é um mamífero. Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano, cavalo, porco, primata, rato, furão, rato, rato de algodão, ga- do, suíno, ovelha, coelho, gato, cachorro, cabra, burro, hamster ou bú- falo.

[0015] Em um aspecto, algumas modalidades divulgadas nesta invenção referem-se a uma composição que compreende: uma com- posição de início que compreende um primeiro replicon de RNA que codifica um primeiro antígeno; e uma composição de reforço compre- endendo um segundo replicon de RNA que codifica um segundo antí- geno, em que o primeiro e o segundo replicons de RNA são diferentes um do outro.

[0016] Em outro aspecto, algumas modalidades aqui divulgadas referem-se a uma composição que compreende: uma primeira se- quência de ácido nucleico que codifica um primeiro replicon de RNA que codifica um primeiro antígeno; e uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica um segundo replicon de RNA que codifica um segundo antígeno, em que o primeiro e o segundo replicons de RNA são diferentes um do outro, em que o primeiro replicon e o segundo replicon compreendem pelo menos um cassete de expressão compre- endendo um promotor ligado de maneira operável a uma sequência de codificação para uma molécula de interesse. O primeiro replicon de RNA e o segundo replicon de RNA podem ser qualquer um aqui des- crito.

[0017] As implementações de modalidades das composições de acordo com os aspectos acima da presente invenção podem incluir uma ou mais das seguintes características. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo antígenos são idênticos entre si. Em algumas modalidades, as sequências de aminoácido do primeiro e do segundo antígenos são homólogas entre si. Em algumas modalidades, a se- quência de aminoácido do primeiro antígeno apresenta pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de se- quência com a sequência de aminoácido do segundo antígeno. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo antígenos compreen- dem pelo menos um determinante antigênico reativo cruzado. Em al- gumas modalidades, o primeiro e o segundo antígenos induzem subs- tancialmente a mesma resposta imune no indivíduo. Em algumas mo- dalidades, o primeiro replicon de RNA pode ativar um sistema imuno- lógico do indivíduo através de pelo menos um mecanismo imunológico que é diferente de um mecanismo imunológico pelo qual o sistema imunológico pode ser ativado pelo segundo replicon de RNA. Em al- gumas modalidades, o pelo menos um mecanismo imunológico é se-

lecionado do grupo que consiste na ativação diferencial da proteína cinase R (PKR), gene induzível pelo ácido retinoico | (RIG-I), vias de autofagia, receptores do tipo Toll (TLRs), grânulos de estresse, RNase R e oligoadenilato sintetases (OEA).

[0018] Em algumas modalidades aqui divulgadas, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é um replicon modificado. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo re- plicons de RNA é derivado de um vírus de RNA de fita positiva. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo repli- cons de RNA é derivado de uma espécie de vírus pertencente a uma família selecionada do grupo que consiste na família Togaviridae, fa- mília Flaviviridae, família Orthomyxoviridae, família Rhabdoviridae, fa- mília Arteroviridae, família Picornaviridae, família Astroviridae, família Coronaviridae e família Paramyxoviridae. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de um Alphavirus ou um Arterivirus. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie de alfavírus selecionada do grupo que consiste no vírus da encefalite equina oriental (EEEV), vírus da encefalite equina vene- zuelana (VEEV), vírus Everglades (EVEV), vírus Mucambo (MUCV), vírus da Semliki Forest (SFV), vírus Pixuna (PIXV), vírus Middleburg (MIDV), vírus Chikungunya (CHIKV), vírus O'Nyong-Nyong (ONNV), vírus Ross River (RRV), vírus Barmah Forest (BF), vírus Getah (GET), vírus Sagiyama (SAGV), vírus Bebaru (BEBV), vírus Mayaro (MAYV), vírus Una (UNAV), vírus Sindbis (SINV), vírus Aura (AURAV), vírus Whataroa (WHAV), vírus Babanki (BABV), vírus Kyzylagach (KYZV), vírus da encefalite equina ocidental (WEEV), vírus Highland J (HJV), vírus Fort Morgan (FMV), vírus Ndumu (NDUV), alfavírus Salmonid (SAV) e vírus Buggy Creek (BCRV), ou de um grupo que consiste em todas as possíveis combinações ou subcombinações dos vírus. Por exemplo, em algumas modalidades, as espécies de alfavírus podem ser selecionadas do grupo que consiste no vírus da encefalite equina oriental (EEEV), vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) e vií- rus Everglades (EVEV).

[0019] Em algumas modalidades divulgadas nesta invenção, o primeiro e o segundo replicons de RNA são derivados de espécies de alfavírus. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo replicons de RNA são derivados da mesma espécie de alfavírus ou de duas es- pécies diferentes de alfavírus. Em algumas modalidades, o primeiro replicon de RNA é derivado de um alfavírus e o segundo replicon de RNA é derivado de uma espécie não alfavírus. Em algumas modalida- des, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA com- preende uma 5-UTR modificada com uma ou mais substituições de nucleotídeo na posição 1, 2, 4, ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, pelo menos uma das uma ou mais substitui- ções nucleotídicas é uma substituição nucleotídica na posição 2 da 5'- UTR modificada. Em algumas modalidades, a substituição de nucleo- tídeo na posição 2 da 5-UTR modificada é uma substituição de UG.

[0020] Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é um replicon de RNA modificado compre- endendo uma 5'-UTR modificada e é desprovido de pelo menos uma parte de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma ou mais proteínas estruturais virais. Em algumas modalidades, o replicon de RNA modificado é desprovido de uma parte substancial da sequência de ácido nucleico que codifica uma ou mais proteínas estruturais vi- rais. Em algumas modalidades, o replicon de RNA modificado não compreende nenhuma sequência de ácido nucleico que codifica as proteínas estruturais virais. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é um replicon de alfavírus modificado compreendendo uma ou mais alças penduculares de RNA em um elemento estrutural de um intensificador de capsídeo viral ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é um replicon de alfavírus modificado que compreende uma sequência de codificação para uma proteína não estrutural heteróloga nsP3. Em algumas modalidades, a proteína não estrutural heteróloga nsP3 é um vírus Chikungunya (CHIKV) nsP3, um vírus Sindbis (SINV) nsP3 ou uma variante dos mesmos. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo antígenos é expresso sob o controle de um promotor subge- nômico 268 ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, o promotor subgenômico 26S é um promotor subgenômico SINV 268, promotor subgenômico RRV 26S ou uma variante dos mesmos.

[0021] Em algumas modalidades aqui divulgadas, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie de arterivírus selecionada do grupo que consiste em vírus da arterite equina (EAV), vírus da síndrome respiratória e reprodutiva suína (PRRSV), vírus de elevação da lactato desidrogenase (LDV) e vírus da febre hemorrágica símia (SHFV). Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo replicons de RNA são derivados de uma espécie de arte- rivírus. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo replicons de RNA são derivados da mesma espécie de arterivírus ou de duas espé- cies diferentes de arterivírfus. Em algumas modalidades, o primeiro re- plicon de RNA é derivado de um arterivírus e o segundo replicon de RNA é derivado de uma espécie não arterivífus. Em algumas modali- dades, o primeiro replicon de RNA é derivado de um arterivírus e o se- gundo replicon de RNA é derivado de um alfavírus. Em algumas mo- dalidades, o primeiro replicon de RNA é um replicon de RNA não mo- dificado derivado de uma espécie de arterivífus. Em algumas modali- dades, o primeiro replicon de RNA é um replicon de RNA modificado derivado de uma espécie de arterivítus. Em algumas modalidades, o primeiro replicon de RNA é um replicon de RNA derivado de uma es- pécie de alfavírus e o segundo replicon de RNA é um replicon de RNA derivado de uma espécie de arterivífus. Em algumas modalidades, o primeiro replicon de RNA é um replicon de RNA não modificado deri- vado de uma espécie de alfavírus. Em algumas modalidades, o primei- ro replicon de RNA é um replicon de RNA modificado derivado de uma espécie de alfavírus.

[0022] Em algumas modalidades divulgadas nesta invenção, as composições de acordo com a presente invenção compreendem ainda composições para uma ou mais etapas de reforço subsequentes, por exemplo, uma ou mais administrações subsequentes da composição de reforço. Em algumas modalidades, uma ou mais da composição de início e da composição de reforço compreende ainda um veículo far- maceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero. Em algumas modalidades, o mamífero é um ser humano, cavalo, porco, primata, rato, furão, rato, rato de algodão, gado, suíno, ovelha, coelho, gato, cachorro, cabra, burro, hamster ou búfalo.

[0023] O resumo anterior é apenas ilustrativo e não se destina ser de forma alguma limitativo. Além das modalidades e características ilustrativas descritas nesta invenção, outros aspectos, modalidades, objetos e características do pedido se tornarão totalmente evidentes a partir dos desenhos, da descrição detalhada e das reivindicações.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0024] A Figura 1 é uma ilustração esquemática de um exemplo não limitativo de um método de indução de uma resposta imune em um indivíduo de acordo com algumas modalidades da presente inven- ção. Neste exemplo, a magnitude da resposta imune, conforme deter- minada pelo número total de células T CD8 específicas do antígeno, a um regime tradicional de reforço primário (linha tracejada) ou a um re- gime heterólogo de reforço primário (linha sólida) é traçada em gráfico ao longo do tempo.

[0025] As Figuras 2A-2B esquematicamente resumem os resulta- dos de experiências executadas para analisar as respostas imunes em camundongos após vários esquemas de reforço primário de acordo com algumas modalidades da presente invenção. Na Figura 2A, as frequências médias de respostas efetoras de células T CD8 + secreto- ras de IFN-y foram determinadas por ensaios do ponto imune absor- vente ligado à enzima (ELISpot) em esplenócitos derivados de camun- dongos BALB/c imunizados 14 dias após o reforço (a significa replicon de alfavírus). Na Figura 2B, as médias geométricas dos títulos totais de IgG (inverso de ED20%) aos 14 dias após o reforço foram determi- nadas por ensaios imunossorventes ligados à enzima (ELISA). Todas as respostas imunes são mostradas com intervalos de confiança de 95% e as estatísticas apresentadas estão utilizando o teste não para- métrico de Mann-Whitney não pareado.

[0026] As características anteriores e outras da presente invenção se tornarão mais evidentes a partir da seguinte descrição e reivindica- ções anexas, tomadas em conjunto com os desenhos anexos. Enten- dendo que esses desenhos representam apenas várias modalidades de acordo com a presente invenção e não devem ser considerados limitativos de seu escopo, a presente invenção será descrita com es- pecificidade e detalhes adicionais através do uso dos desenhos ane- Xxos.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0027] A presente invenção de uma forma geral refere-se ao uso de diferentes moléculas de mRNA de autoamplificação para melhorar as respostas imunes, por exemplo, respostas imunes após a vacina- ção profilática e/ou administração terapêutica. Algumas modalidades da divulgação referem-se às composições e métodos para induzir uma resposta imune em um indivíduo utilizando regimes de imunização he-

terólogos de reforço primário que podem ser utilizados profilática e/ou terapeuticamente. Em algumas modalidades, as composições e méto- dos aqui divulgados podem ser implantados para a produção de uma molécula de interesse, por exemplo, um polipeptídeo terapêutico, em um indivíduo.

[0028] A geração de uma grande população de células T CD8 de memória específica de antígeno é um objetivo desejável para o projeto de vacina contra uma variedade de doenças animais e humanas. Uma abordagem para gerar eficazmente uma grande população de células T CD8 de memória é através do uso da vacinação de reforço primário em um formato de reforço primário "heterólogo", que envolve o início da geração de células T CD8 de memória com um antígeno liberado em um vetor e depois a administração do mesmo antígeno, ou essen- cialmente o mesmo antígeno, no contexto de um vetor diferente em um momento posterior.

[0029] Algumas modalidades divulgadas nesta invenção referem- se aos regimes de reforço primário heterólogos que envolvem adminis- trações sequenciais do mesmo imunógeno utilizando duas modalida- des diferentes como uma estratégia para obter respostas imunes su- periores em indivíduos. Essa estratégia pode ser empregada para uma variedade de patógenos desafiadores, incluindo, mas não são limita- dos a estes, malária, HIV, TB e Ebola. Os reforços primários heterólo- gos podem resultar em respostas superiores de memória, uma magni- tude mais elevada das respostas das células T CD8+, um aumento dos epítopos de células T reconhecidos pelo sistema imunológico e um aumento na polifuncionalidade das células T. Os replicons deriva- dos de alfavírus (por exemplo, vírus Sindbis, VEÊE e Semliki-forest) fo- ram empregados em configurações heterólogas de reforço primário em combinação com proteínas, DNA e virossomas. Estes provaram ser eficazes em pequenos modelos animais em camundongos para o pa-

pilomavírus humano (HPV) e vírus da imunodeficiência humana (HIV), assim como em primatas não humanos (NHPs) com o replicon sendo liberado na forma de partícula para a dengue. Além do mais, os repli- cons totalmente sintéticos derivados de Alphavirus têm sido ampla- mente utilizados em regimes de reforço primário homólogos. A inven- ção fornece regimes com dois replicons imunologicamente diferentes para uso em regimes de reforço primário heterólogos. A invenção tam- bém fornece regimes tendo administração repetida de replicons deri- vados de Alphavirus que expressam proteínas terapêuticas que podem empregar regimes de administração homólogos ou heterólogos.

[0030] Como divulgado nesta invenção, por início e reforço da ge- ração de células T CD8 de memória com dois replicons de RNA imu- nologicamente diferentes, as respostas imunes podem ser estrategi- camente melhoradas para combater patógenos mais complexos. Por exemplo, com referência às vacinas, as respostas de retorno podem ser negativamente impactadas por anticorpos preexistentes ou respos- tas de células T à plataforma que libera o antígeno (imunidade antive- tor). Da mesma forma, várias administrações do antígeno utilizando a mesma plataforma estimulam o sistema imunológico exatamente da mesma maneira, mas podem ser mais inerentemente autolimitativas devido à sua incapacidade de sinergizar com mecanismos alternativos de detecção imunológica. Sem ser limitado a qualquer teoria em parti- cular, acredita-se que a imunização com reforço primário heterólogo funciona para contornar o primeiro problema, uma vez que pode ser projetada para contornar respostas de anticorpos ou células T preexis- tentes, dependendo do mecanismo causador de respostas reduzidas. Além disso, os reforços heterólogos utilizando dois replicons imunolo- gicamente diferentes podem ser projetados para que as administra- ções subsequentes ativem o sistema imunológico de maneiras diferen- tes que sinergizam com a administração inicial.

[0031] Em outro exemplo, com relação à terapêutica, a resposta de retorno pode reduzir a duração e a magnitude da expressão heteró- loga de proteínas, já que as respostas imunes direcionadas contra o vetor podem resultar na depuração das células que expressam a pro- teína terapêutica. Sem estar limitado a nenhuma teoria em particular, acredita-se que a imunização com reforço primário heterólogo ignore esse problema, através da redução da capacidade do sistema imuno- lógico de reconhecer o replicon que está expressando a proteína após administrações repetidas, atrasando assim a liberação.

[0032] Na seguinte descrição detalhada, referência é feita aos de- senhos anexos, que fazem parte deste documento. Nos desenhos, símbolos semelhantes geralmente identificam componentes semelhan- tes, a menos que o contexto determine o contrário. As alternativas ilus- trativas descritas na descrição detalhada, desenhos e reivindicações não devem ser limitativas. Outras alternativas podem ser utilizadas e outras alterações podem ser feitas, sem se afastar do espírito ou do escopo do assunto aqui apresentado. Será facilmente compreendido que os aspectos, como geralmente descritos nesta invenção e ilustra- dos nas Figuras, podem ser dispostos, substituídos, combinados e projetados em uma ampla variedade de configurações diferentes, to- das explicitamente contempladas e incluídas neste pedido.

[0033] A não ser que de outra maneira definida, todos os termos técnicos, notações e outros termos ou terminologias científicos aqui utilizados, destinam-se a ter os significados comumente entendidos por aqueles de habilidade na técnica a que este pedido pertence. Em alguns casos, termos com significados comumente entendidos são aqui definidos para maior clareza e/ou referência pronta, e a inclusão de tais definições nesta invenção não deve necessariamente ser inter- pretada de representar uma diferença substancial em relação ao que geralmente é entendido na técnica. Muitas das técnicas e procedimen-

tos descritos ou referenciados nesta invenção são bem compreendidos e comumente empregados utilizando metodologia convencional por aqueles versados na técnica.

ALGUMAS DEFINIÇÕES

[0034] A forma singular “um”, “uma”, “o” e “a” incluem as referên- cias plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, o termo "uma célula" inclui uma ou mais células, com- preendendo suas misturas. "A e/ou B" é aqui utilizado para incluir to- das as seguintes alternativas: "A", "B", "Aou Bre"AeB".

[0035] O termo "cerca de", conforme utilizado nesta invenção, possui seu significado comum de aproximadamente. Se o grau de aproximação não estiver de outra forma claro no contexto, “cerca de” significa dentro de mais ou menos 10% do valor fornecido ou arredon- dado para o valor significativo mais próximo, em todos os casos, inclu- sive no valor fornecido. Onde as faixas são fornecidas, elas incluem os valores limites.

[0036] O termo "determinante antigênico" ou "epítopo", como aqui utilizado, refere-se a uma parte de um antígeno (por exemplo, um poli- peptídeo), por exemplo, uma parte da estrutura primária, secundária, terciária ou quaternária do antígeno, que é reconhecido pelo sistema imunológico, por exemplo, anticorpos, células B (por exemplo, linfóci- tos B) e/ou células T. Em algumas modalidades, o determinante anti- gênico é um local na superfície do antígeno. Em algumas modalida- des, o determinante antigênico é um local que uma molécula de anti- corpo se liga ao antígeno. O termo "determinante antigênico reativo cruzado" refere-se à capacidade de um determinante antigênico pre- sente em duas ou mais moléculas de antígeno diferentes (por exem- plo, polipeptídeos) para se ligar ao mesmo anticorpo. Além disso, deve ficar entendido que as duas ou mais moléculas de antígeno que com- preendem o determinante antigênico capaz de se ligar ao mesmo anti-

corpo podem ser, por exemplo, as mesmas moléculas ou seus frag- mentos, variantes umas das outras ou moléculas diferentes. A título de exemplo, com referência aos polipeptídeos que compreendem um de- terminante antigênico reativo cruzado capaz de se ligar ao mesmo an- ticorpo, os polipeptídeos podem ter a mesma ou uma sequência de aminoácido primária diferente, no entanto, os polipeptídeos cada um compreende um determinante antigênico (por exemplo, "reativo cruza- do") que pode ser ligado pelo mesmo anticorpo.

[0037] O termo "derivado de" aqui utilizado refere-se a uma origem ou fonte, e pode incluir moléculas de ocorrência natural, recombinan- tes, não purificadas ou purificadas. As moléculas da presente invenção podem ser derivadas de moléculas virais ou não virais. Uma proteína ou polipeptídeo derivado de uma proteína ou polipeptídeo original po- de compreender a proteína ou polipeptídeo original, em parte ou no todo, e pode ser um fragmento ou variante da proteína ou polipeptídeo original. Em algumas modalidades, o replicon de RNA é substancial- mente um genoma viral, o que significa que a sequência contém in- formações genéticas suficientes para que o replicon se replique auto- nomamente dentro de uma célula hospedeira ou organismo tratado, mas não é um genoma viral completo do tipo selvagem.

[0038] O termo "gene" é amplamente utilizado para se referir a qualquer segmento da molécula de ácido nucleico que codifica uma proteína ou que pode ser transcrito em um RNA funcional. Os genes podem incluir sequências que são transcritas, mas não fazem parte de um transcrito final, maduro e/ou funcional de RNA, e os genes que co- dificam as proteínas podem compreender ainda sequências que são transcritas, mas não traduzidas, por exemplo, regiões não traduzidas 5', regiões não traduzida 3', íntrons, etc. Além disso, os genes podem opcionalmente compreender ainda sequências reguladoras necessá- rias para sua expressão, e essas sequências podem ser, por exemplo,

sequências que não são transcritas ou traduzidas. Os genes podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes, incluindo a clonagem de uma fonte de interesse ou a síntese de informações de sequência conhecidas ou previstas, e podem incluir sequências projetadas para ter os parâmetros desejados.

[0039] Por "resposta imune" ou "imunidade" como os termos são aqui utilizados de modo trocável, significa a indução de uma resposta humoral (por exemplo, célula B) e/ou resposta celular (por exemplo, célula T). Adequadamente, uma resposta imune humoral pode ser avaliada através da medição dos anticorpos específicos de antígeno presentes no soro de animais imunizados em resposta à introdução de um ou mais antígenos no hospedeiro. Em algumas modalidades exemplares abaixo, a resposta imune é avaliada pelos ensaios do pon- to imune absorvente ligado à enzima (ELISpot) em esplenócitos deri- vados de animais imunizados, ou pelo ensaio de imunossorvente liga- do à enzima (ELISA) de soros de animais imunizados, conforme exa- minado no Exemplo 1 abaixo. O termo "imunógeno" ou "imunogênico" refere-se a uma molécula que induz uma resposta imune específica.

[0040] Os termos "modificado" e "modificação de sequência", con- forme aqui utilizados em relação às moléculas de ácido nucleico, poli- peptídeos e replicons de RNA, destinam-se a definir moléculas de áci- do nucleico, polipeptídeos e replicons de RNA que diferem na sequên- cia de nucleotídeos ou na sequência de aminoácido do nativo (por exemplo, do tipo selvagem ou não modificado). Os termos "ocorrência natural" e "tipo selvagem", como aqui utilizados, referem-se a uma forma encontrada na natureza. Por exemplo, uma molécula de ácido nucleico de ocorrência natural, não modificada ou do tipo selvagem, sequência de nucleotídeo, replicon de RNA ou proteína pode estar presente e isolada de uma fonte natural, e não é intencionalmente mo- dificada por manipulação humana. Como descrito em detalhes abaixo,

as moléculas de ácido nucleico, polipeptídeos e replicons de RNA de acordo com algumas modalidades da presente invenção são molécu- las de ácido nucleico modificadas, polipeptídeos e replicons de RNA e, portanto, são replicons de RNA de ocorrência não natural.

[0041] Os termos "início" e "reforço" destinam-se a ter seus signifi- cados comuns na técnica. "Início" refere-se à imunização de um indiví- duo com uma primeira composição antigênica para induzir uma imuni- dade do indivíduo a um antígeno que pode ser recuperado após expo- sições subsequentes ao mesmo antígeno ou antígeno semelhante. Em algumas modalidades, o início induz um nível mais elevado de respos- ta imune ao antígeno após imunização subsequente ("reforço") com a mesma composição antigênica ou com uma composição antigênica relacionada (por exemplo, uma composição compreendendo um antí- geno tendo pelo menos um antígeno reativo cruzado determinante) do que o nível de resposta imune obtido pela imunização com uma única composição antigênica, por exemplo, a composição de início isolada- mente ou a composição de reforço isoladamente. "Dose de reforço" refere-se a uma administração de uma composição antigênica (por exemplo, uma vacina) após uma dose (inicial) anterior. Após a imuni- zação inicial (por exemplo, administração de uma composição de iní- cio) a um indivíduo, em algumas modalidades, uma dose de reforço pode ser administrada uma ou mais vezes ao mesmo indivíduo para reexposição ao mesmo antígeno imunogênico ou um antígeno com pelo menos um determinante antigênico reativo cruzado com o antíge- no utilizado na composição de início.

[0042] Os termos "replicon de RNA" e "RNA replicon" utilizados aqui de modo trocável, referem-se ao RNA que contém todas as in- formações genéticas necessárias para direcionar sua própria amplifi- cação ou autorreplicação dentro de uma célula permissiva. Para dire- cionar sua própria replicação, a molécula de RNA 1) codifica a polime-

rase, replicase ou outras proteínas que podem interagir com as proteí- nas derivadas de células virais ou hospedeiras, ácidos nucleicos ou ribonucleoproteínas para catalisar o processo de amplificação do RNA; e 2) contém sequências de RNA de ação cis necessárias para replica- ção e transcrição do RNA codificado por replicon subgenômico.

Estas sequências podem ser ligadas durante o processo de replicação às suas proteínas autocodificadas ou proteínas derivadas de células não autocodificadas, ácidos nucleicos ou ribonucleoproteínas ou comple- xos entre qualquer um desses componentes.

Em algumas modalida- des, uma molécula de RNA replicon modificada normalmente contém os seguintes elementos ordenados: sequências de RNA viral 5' neces- sárias em cis para replicação, sequências que codificam para proteí- nas não estruturais biologicamente ativas, promotor para o RNA sub- genômico, sequências virais de 3' necessárias em cis para replicação e um trato de poliadenilato.

Além disso, o replicon de RNA pode ser uma molécula de polaridade positiva, ou sentido de "mensagem", e o replicon de RNA pode ser de um comprimento diferente daquele de qualquer vírus de RNA conhecido de ocorrência natural.

Em algumas modalidades da presente invenção, o replicon de RNA pode carecer ou funcionalmente carecer de pelo menos uma das sequências das proteínas virais estruturais presentes nos genomas de vírus do tipo selvagem.

Por funcionalmente carecer, significa que as proteínas virais estruturais não estão presentes em uma quantidade ou em uma forma que lhes permita desempenhar sua função normal e natural.

Em mui- tas modalidades, as sequências que codificam os genes estruturais podem ser substituídas por uma ou mais sequências heterólogas, tais como, por exemplo, uma sequência que codifica um gene de interesse (GOI). Em algumas modalidades, o GOI pode ser, por exemplo, uma sequência que codifica um polipeptídeo que é um antígeno ou deter- minante antigênico para o paciente em questão (tal como um antígeno aqui descrito), um anticorpo ou um fragmento de um anticorpo.

Nos casos em que o replicon de RNA deve ser acondicionado em uma par- tícula de alfavírus recombinante, ele deve conter uma ou mais se- quências, assim chamados sinais de acondicionamento, que servem para iniciar interações com proteínas estruturais de alfavírus que le- vam à formação de partículas.

Os replicons de RNA da invenção po- dem ter a capacidade de autoamplificar e podem autoamplificar dentro de uma célula hospedeira ou célula animal.

Em várias modalidades, os replicons de RNA podem ser de pelo menos 1 kb ou pelo menos 2 kb ou pelo menos 3 kb ou pelo menos 4 kb ou pelo menos 5 kb ou pelo menos 6 kb ou pelo menos 7 kb ou pelo menos 8 kb ou pelo menos 10 kb ou pelo menos 12 kb ou pelo menos 15 kb ou pelo menos 17 kb ou pelo menos 19 kb ou pelo menos 20 kb de tamanho, ou podem ser de 100 bp a 8 kb ou 500 bp a 8 kb ou 500 bp a 7 kbou 1a7kbou1la8 kb ou 2 a 15 kb ou 2 a 20 kb ou 5 a 15 kb ou 5 a 20 kb ou 7 a 15 kb ou 7 a 18 kb ou 7 a 20 kb de tamanho. "Fragmentos" de uma molécula (por exemplo, um ácido nucleico, polipeptídeo ou molécula de anticor- po) podem conter pelo menos 10 ou pelo menos 20 ou pelo menos 30 ou pelo menos 30 ou pelo menos 50 ou pelo menos 75 ou pelo menos 100 ou pelo menos 200 ou pelo menos 300 ou pelo menos 500 ou pelo menos 1 kb ou pelo menos 2 kb ou pelo menos 3 kb ou pelo menos 5 kb de nucleotídeos para um ácido nucleico, ou aminoácidos para uma molécula de polipeptídeo.

Um fragmento também pode ser um domínio de ligação de uma molécula de ligação específica.

Em algumas moda- lidades, os replicons de RNA não são vetores virais, os quais utilizam proteínas virais (por exemplo, uma proteína capsídica codificada no vetor viral) para liberar seu ácido nucleico em uma célula hospedeira.

Os replicons de RNA da invenção podem carecer, funcionalmente ca- recer, ou não ter uma partícula da cápside ou viral, ou não podem ser encapsidados em uma cápside ou compreendidos em uma partícula viral.

[0043] Os replicons de RNA da invenção podem ser derivados de um vírus de ocorrência natural ou do tipo selvagem (por exemplo, um vírus ou retrovírus de RNA descrito nesta invenção), significando que o replicon foi modificado a partir de um genoma viral do tipo selvagem. Os replicons de RNA da invenção podem incluir sequências não pre- sentes em um genoma viral do tipo selvagem, por exemplo, uma ou mais sequências heterólogas (por exemplo, um ou mais genes de inte- resse) e/ou outras sequências ou modificações, conforme aqui des- crito. Os replicons de RNA também podem ter uma ou mais sequên- cias excluídas ou funcionalmente excluídas de um genoma do tipo sel- vagem (por exemplo, proteínas estruturais virais). Uma sequência é excluída funcionalmente quando não está presente em uma quantida- de ou em uma forma que permita executar sua função normal e natu- ral. Por exemplo, uma sequência pode ser excluída completa substan- cialmente, ou de outro modo abreviada de modo que ela não desem- penhe sua função normal e natural. Em diferentes modalidades, os replicons de RNA da invenção podem ter pelo menos 50% ou pelo menos 60% ou pelo menos 70% ou pelo menos 80% ou pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou 80 a 99% ou 90 a 95% ou 90 a 99% ou 95 a 99% ou 97 a 99% ou 98 a 99% de Identidade de sequência com uma sequência de um genoma do tipo selvagem. Em algumas modalida- des, a porcentagem de identidade de sequência pode ser calculada sem contar uma ou mais sequências heterólogas que podem estar presentes no replicon (por exemplo, um gene de interesse) e/ou sem contar a exclusão de uma ou mais sequências que estaria naturalmen- te presente no genoma do tipo selvagem (por exemplo, um ou mais genes estruturais).

[0044] Em algumas modalidades, os replicons de RNA aqui divul- gados são replicons de RNA manipulados, sintéticos ou recombinan-

tes. Como aqui utilizado, o termo recombinante significa qualquer mo- lécula (por exemplo, DNA, RNA, etc.), que é, ou resulta, de qualquer forma indireta, da manipulação humana de um polinucleotídeo. Como exemplos não limitativos, um cDNA é uma molécula de DNA recombi- nante, assim como é qualquer molécula de ácido nucleico que foi ge- rada por reações de polimerase in vitro, ou à qual ligantes foram ane- xados ou que foram integrados a um vetor, tal como um vetor de clo- nagem ou vetor de expressão. Como exemplos não limitativos, um re- plicon de RNA recombinante pode ser um ou mais dos seguintes: 1) sintetizado ou modificado in vitro, por exemplo, utilizando técnicas químicas ou enzimáticas (por exemplo, pelo uso de síntese química de ácidos nucleicos ou pelo uso de enzimas para replicação, polimeriza- ção, digestão exonucleolítica, digestão endonucleolítica, ligação, transcrição reversa, transcrição, modificação de bases (incluindo, por exemplo, metilação) ou recombinação (incluindo recombinação homó- loga e específica do sítio) de moléculas de ácido nucleico); 2) sequên- cias nucleotídicas conjugadas que não são conjugadas na natureza; 3) planejado utilizando técnicas de clonagem molecular de tal modo que carece de um ou mais nucleotídeos em relação à sequência de nu- cleotídeo de ocorrência natural; e 4) manipulado utilizando técnicas de clonagem molecular de tal modo que tenha uma ou mais alterações ou rearranjos de sequência em relação à sequência nucleotídica de ocor- rência natural.

[0045] O termo "variante" de uma proteína utilizada nesta invenção refere-se a um polipeptídeo que possui uma sequência de aminoácido que é igual ou essencialmente igual àquela da proteína de referência, exceto que pelo menos um aminoácido foi modificado, por exemplo, excluído, inserido ou substituído, respectivamente. A substituição de aminoácidos pode ser uma substituição conservadora de aminoácido, de preferência em um resíduo de aminoácido não essencial na proteí-

na. Uma "substituição conservadora de aminoácido" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de amino- ácidos tendo cadeias laterais semelhantes são conhecidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina e histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina , tirosina e cisteína), cadeias laterais não polares (por exem- plo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina e triptofano), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina e isoleucina) e aromáticas cadeias laterais (por exemplo, tirosi- na, fenilalanina, triptofano e histidina). Uma variante de uma proteína pode ter uma sequência de aminoácido pelo menos ao redor de 80%, 90%, 95%, 98% ou 99%, de preferência pelo menos ao redor de 90%, mais preferivelmente pelo menos ao redor de 95%, idêntica à sequên- cia de aminoácido da proteína. De preferência, uma variante é uma variante funcional de uma proteína que retém a mesma função que a proteína.

[0046] Também de interesse da presente invenção são as varian- tes dos polinucleotídeos aqui descritos. Tais variantes podem ser de ocorrência natural, incluindo polinucleotídeos homólogos da mesma espécie ou de uma espécie diferente, ou podem ser variantes não na- turais, por exemplo, polinucleotídeos sintetizados utilizando métodos de síntese química ou gerados utilizando técnicas de DNA recombi- nante. No que refere-se às sequências nucleotídicas, a degeneração do código genético fornece a possibilidade de substituir pelo menos uma base da sequência de codificação de proteínas de um gene por uma base diferente sem provocar alteração na sequência de aminoá- cido do polipeptídeo produzido a partir do gene. Portanto, os polinu-

cleotídeos da presente invenção também podem ter qualquer sequên- cia de base que foi alterada de qualquer sequência de polinucleotídeo aqui divulgada através da substituição de acordo com a degeneração do código genético. As referências que descrevem o uso de códon es- tão facilmente disponíveis ao público. Em outras modalidades, varian- tes de sequência de polinucleotídeo podem ser produzidas por uma variedade de razões, por exemplo, para otimizar a expressão de có- dons para um hospedeiro específico (por exemplo, alterar os códons no mRNA viral para aqueles preferidos por outros organismos, tais como mamíferos ou espécies de peixes).

[0047] Como será entendido por uma pessoa de habilidade na técnica, para qualquer um e todos os propósitos, tal como em termos de fornecer uma descrição escrita, todas as faixas divulgadas nesta invenção também abrangem qualquer uma e todas as possíveis sub- faixas e suas combinações de subfaixas. Qualquer faixa listada pode ser facilmente reconhecida como suficientemente descrevendo e per- mitindo que a mesma faixa seja dividida em metades pelo menos iguais, terços, quartos, quintos, décimos, etc. Como um exemplo não limitativo, cada faixa aqui examinada pode ser facilmente dividida para um terço inferior, terço médio e terço superior, etc. Como também fica- rá entendido por uma pessoa versada na técnica toda a linguagem como "até", "pelo menos", "maior do que", "menor do que" e seus se- melhantes de incluir o número recitado e referir-se a faixas que podem ser posteriormente divididas em subfaixas conforme debatido acima. Finalmente, como será compreendida por uma pessoa versada na técnica, uma faixa inclui cada membro individual. Assim, por exemplo, um grupo tendo de 1 a 3 artigos refere-se a grupos tendo 1, 2 ou 3 ar- tigos. Da mesma forma, um grupo tendo de 1 a 5 artigos refere-se a grupos tendo 1, 2, 3, 4 ou 5 artigos, e assim por diante.

[0048] Em algumas modalidades dos métodos ou processos aqui descritos, as etapas podem ser realizadas em qualquer ordem, exceto quando uma sequência temporal ou operacional for explicitamente re- citada. Além disso, em algumas modalidades, as etapas especificadas podem ser realizadas simultaneamente, a menos que a linguagem ex- plícita de reivindicação recite que elas sejam realizadas separadamen- te. Por exemplo, em algumas modalidades, uma etapa reivindicada de produzir X e uma etapa reivindicada de produzir Y pode ser conduzida simultaneamente dentro de uma única operação, e o processo resul- tante ficará dentro do escopo literal do processo reivindicado.

[0049] Como utilizado nesta invenção, "compreendendo" é sinôni- mo de "incluindo", "contendo" ou "caracterizado por" e é inclusivo ou aberto e não exclui elementos ou etapas do método adicionais não re- citados. Como aqui utilizado, "consistindo em" exclui quaisquer ele- mentos, etapas ou ingredientes não especificados na composição ou método reivindicado. Como aqui utilizado, "consistindo essencialmente em" não exclui materiais ou etapas que não afetam materialmente as características básicas e novas da composição ou método reivindica- do. Qualquer recitação nesta invenção do termo "compreendendo", por exemplo, em uma descrição de componentes de uma composição ou em uma descrição de etapas de um método, deve compreender aque- las composições e métodos consistindo essencialmente e consistindo nos componentes ou etapas recitadas.

[0050] Os tópicos, por exemplo, (a), (b), (c), etc., são apresenta- dos apenas para facilitar a leitura do relatório descritivo e reivindica- ções, e não limitam de forma alguma o escopo da presente invenção Ou suas alternativas. O uso de tópicos no relatório descritivo ou reivin- dicações não exige que as etapas ou elementos sejam executados em ordem alfabética ou numérica ou na ordem em que são apresentados. MÉTODOS PARA IMUNIZAÇÃO HETEROLÓGA DE INÍCIO-

REFORÇO

[0051] A imunização com múltiplas doses, para terapia ou preven- ção de doenças, foi relatada de ser frequentemente mais eficaz do que a imunização com dose única. Acredita-se de uma forma geral que a geração de um número alto de células T CD8 de memória específica do antígeno após a vacinação é um objetivo desejável para o projeto de vacina contra uma variedade de doenças animais e humanas, visto que esse número se correlaciona fortemente com a imunização e pro- teção do hospedeiro. Uma abordagem para gerar esse número eleva- do de células é utilizar um processo de imunização inicial-reforço, que depende da re-estimulação de células imunes específicas do antígeno após a formação da memória primária. Nesse processo, existe uma composição de "início" que é administrada em primeiro lugar ao indiví- duo e uma composição de "reforço" que é subsequentemente adminis- trada uma ou mais vezes. Sem estar limitado a nenhuma teoria em particular, acredita-se amplamente que a regulação das respostas imunes pelas vacinas resulta na geração de um número maior de célu- las efetoras necessárias para atuar como mediador da proteção contra patógenos no momento da infecção.

[0052] Imunizações homólogas de início-reforço que utilizam a re- administração do mesmo agente de imunização têm sido utilizadas desde o desenvolvimento inicial das vacinas. As abordagens clássicas de vacinação baseavam-se em um regime homólogo de início-reforço e tradicionalmente são incapazes de obter respostas imunes fortes o suficiente para combater doenças mais desafiadoras. Por exemplo, embora esse método seja geralmente eficaz na regulação da resposta humoral ao antígeno, foi de uma forma geral considerado muito menos eficaz na geração de números aumentados de células T CD8 devido à rápida depuração do agente de reforço homólogo pelo sistema imuno- lógico inicial, e ainda falha no reforço da imunidade celular (CMI).

[0053] Por outro lado, a imunização heteróloga de início-reforço,

ou a administração do mesmo imunógeno utilizando duas modalidades diferentes, foi recentemente desenvolvida como uma estratégia para obter respostas imunes superiores em indivíduos.

Em particular, novas modalidades de vacina, tais como heterólogas de início-reforço, foram empregadas com sucesso contra patógenos complexos tais como ma- lária, tuberculose (TB), vírus da imunodeficiência humana (HIV) e Ebo- la.

Respostas superiores de memória resultantes da imunização hete- róloga de início-reforço incluem, mas não são limitados a estas, uma magnitude mais elevada das respostas de células T CD8+, uma ampli- ação dos epítopos das células T reconhecidos pelo sistema imunológi- co e um aumento na polifuncionalidade das células T.

Em algumas modalidades, os métodos de início-reforço da invenção resultam em um aumento significativo nas células T CD8+ secretoras de IFN-y no indivíduo tratado.

Em várias modalidades, o aumento significativo pode ser um aumento de pelo menos 25% ou pelo menos 50% ou pelo me- nos 100% ou pelo menos 150% ou pelo menos 200% ou pelo menos 250% ou pelo menos 300% versus a administração de dose única ou versus um regime homólogo de início-reforço.

Além disso, é relatado que uma abordagem heteróloga de início-reforço reforça efetivamente o CMI, especialmente quando candidatos de vacina baseados em ve- tores são utilizados, visto que minimiza a interferência da imunidade antivetor gerada após a iniciação.

Além de intensificar quantitativa- mente as células efetoras, diferenças qualitativas também são obser- vadas nas células de memória secundária após o reforço.

As células T CD8 de memória secundária, em contraste com as células de memória primária, trafegam com muito mais eficiência para os tecidos periféri- cos e apresentam citólise aprimorada, que facilita a reação eficaz de patógenos no local de entrada.

Adicionalmente, uma estratégia de iní- cio-reforço heteróloga pode resultar em aprimoramento sinérgico da resposta imune, resultando em um número aumentado de células T específicas do antígeno, enriquecimento seletivo de células T de alta avidez e aumento da largura e profundidade da resposta imune. A titu- lo de exemplo, a Figura 1 esquematicamente representa os benefícios de regimes de início-reforço heterólogos, na medida em que podem resultar na melhora tanto da magnitude, comprimento quanto da quali- dade da resposta da memória imune (figura adaptada de Nolz JC and Harty JT, Adv. Exp. Med. Biol., 2011). Neste exemplo, as vacinas de reforço são utilizadas para gerar um número maior de células T CD8 de memória. A magnitude da resposta imune a um regime tradicional de início-reforço ou a um regime heterólogo de início-reforço, conforme determinado pelo número total de células T CD8 específicas do antí- geno, é traçada em gráfico ao longo do tempo. Após o estímulo da va- cina primária, as células T CD8 sofrem expansão, contração e formam uma população de memória primária. Quando essa população de me- mória primária de células T CD8 é exposta a um desafio secundário da mesma vacinação (reforço homólogo, linha tracejada), ocorre outra rodada de expansão, contração e formação de uma população de memória secundária maior. Em contraste com uma vacinação de re- forço homóloga, a administração de um antígeno de célula T CD8 libe- rado no contexto de um vetor diferente (reforço heterólogo, linha sóli- da) promove uma maior expansão das células T CD8 de memória pri- mária, resultando em uma população de memória secundária maior do que aquela observada com vacinas de reforço homólogas.

[0054] Embora o início-reforço heterólogo tenha sido relatado de aumentar as respostas em determinadas situações, nem todas as combinações demonstram imunidade aprimorada, o que mostra a im- portância de determinar quais combinações são eficazes. Encontrar combinações de vacina que induzam imunidade ampla, durável e du- radoura, é importante para conferir proteção robusta. Mais especifica- mente, os replicons derivados do Alphavirus tais como, por exemplo, o vírus Sindbis, o vírus VEE e o vírus da Semliki Forest, foram todos empregados em configurações heterólogas de início-reforço em com- binação com as proteínas, DNA e virossomos. Estes provaram ser efi- cazes na imunização de modelos de pequenos animais, tais como ca- mundongos, com relação ao papilomavírus humano (HPV) e vírus da imunodeficiência humana (HIV), assim como em NHPs com o replicon sendo liberado na forma de partícula para a dengue. Além disso, repli- cons totalmente sintéticos derivados de alfavírus têm sido amplamente empregados em regimes homólogos de início-reforço. Anteriormente, o único sistema de replicon totalmente sintético que foi amplamente empregado era derivado da família Alpbhavirus de vírus, em que as pro- teínas não estruturais foram retidas e as proteínas estruturais foram substituídas por um gene de interesse. No entanto, os recentes avan- ços na engenharia de novos replicons resultaram na produção de no- vos tipos de replicons e permitiram descobrir novas modalidades de vacina utilizando apenas replicons sintéticos.

[0055] Da mesma forma, as abordagens clássicas da administra- ção terapêutica de proteínas tradicionalmente se baseiam na injeção exógena de proteínas em doses bastante altas para obter o efeito clí- nico desejado. Mais recentemente, ácidos nucleicos ou vetores base- ados em vírus foram utilizados para liberar uma sequência a uma célu- la hospedeira resultando na expressão de uma proteína desejada de interesse. No entanto, métodos de liberação estritamente baseados em ácidos nucleicos tais como o mMRNA, embora relativamente não imunogênicos, não possuem expressão durável e persistente da prote- ína. Por outro lado, os métodos derivados de vírus são capazes de ex- pressão proteica mais durável e persistente, mas também são ineren- temente imunogênicos. Isso pode resultar em respostas imunes contra as células produtoras da proteína e, às vezes, a própria proteína na forma de anticorpos antifármacos. Os métodos virais de liberação de proteínas também tendem a ter custos mais altos e manufatura mais complexa, limitando como amplamente essa técnica pode ser empre- gada. Por esse motivo, o uso de replicons com mecanismos imunolo- gicamente diferentes de ativação do sistema imunológico pode permitir um número maior ou mais variado de injeções repetidas, levando em conta a expressão mais persistente de proteínas terapêuticas. Espera- se também que essa abordagem ajude a limitar a formação de anti- corpos antifármacos que reduzem o nível de proteína terapêutica sen- do produzida.

[0056] Em um aspecto, várias modalidades da divulgação geral- mente se referem a métodos para a liberação de dois replicons de RNA em um indivíduo para aplicações terapêuticas e/ou profiláticas, tais como, por exemplo, aplicações de vacinação e/ou imunização. Em um aspecto, algumas modalidades divulgadas nesta invenção referem- se a um método para induzir uma resposta imune em um indivíduo, o método inclui administrar ao indivíduo pelo menos uma dose de uma composição de início compreendendo um primeiro replicon de RNA que codifica um primeiro antígeno; e subsequentemente administrar ao indivíduo pelo menos uma dose de uma composição de reforço com- preendendo um segundo replicon de RNA que codifica um segundo antígeno, em que o primeiro e o segundo replicons de RNA são dife- rentes um do outro. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são idênticos entre si. Em algumas modalidades, as sequências de aminoácido do primeiro e do segundo antígenos são homólogas entre si. Em algumas modalidades, o primeiro replicon de RNA e o segundo replicon de RNA são derivados de genomas de vírus de RNA de diferentes gêneros. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido do primeiro antígeno apresenta pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido do segundo antígeno. Em algumas modali-

dades, o primeiro e o segundo antígenos compreendem pelo menos um determinante antigênico reativo cruzado. Em algumas modalida- des, o primeiro e o segundo antígenos induzem substancialmente a mesma resposta imune no indivíduo.

[0057] Em algumas modalidades, a composição de início é admi- nistrada ao indivíduo em uma dose única. Em algumas modalidades, a composição de início é administrada ao indivíduo em múltiplas doses. Em algumas modalidades, a composição de reforço é administrada ao indivíduo em uma dose única. Em algumas modalidades, a composi- ção de reforço é administrada ao indivíduo em múltiplas doses. Em algumas modalidades, a composição de início e/ou a composição de reforço é administrada ao sujeito por pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4, pelo menos 5 ou pelo menos 10 dosagens consecutivas ou qualquer número de doses entre elas. Em algumas modalidades, a composição de início e/ou a composição de reforço é administrada ao indivíduo por pelo menos 10, pelo menos 12, pelo menos 14, pelo me- nos 16 ou pelo menos 20 dosagens consecutivas ou qualquer número de dosagem entre elas. Sem estar vinculado a nenhuma teoria em par- ticular, acredita-se que doses mais elevadas de antígeno no início ge- ralmente favorecem a indução de células efetoras, enquanto que do- ses mais baixas podem preferivelmente direcionar a indução de me- mória imune. Portanto, uma dose mais elevada de uma composição de início, embora desejável para respostas imediatas, pode afetar o de- senvolvimento das células de memória e dificultar adversamente o efeito de altas doses. Ao contrário da dose de início, uma dose mais elevada da composição de reforço foi demonstrada de induz uma magnitude mais alta da resposta imune, pois a maior disponibilidade de antígeno pode estar levando a um número maior de células B de memória à diferenciação, desse modo a amplificação da resposta. Em algumas modalidades, a composição de início e/ou a composição de reforço podem ser administradas ao indivíduo em múltiplas dosagens variando de cerca de 0,001 mg/kg de peso corporal a cerca de 50 mg/kg de peso corporal.

Esta faixa de dose é equivalente a cerca de 0,025 ug a 50 ug de replicon de RNA no estado formulado para um camundongo de 25 g.

Em algumas modalidades, as doses preferidas da composição de início e/ou composição de reforço compreendem menos do que 1 ug de replicon de RNA no estado formulado.

Em al- gumas modalidades, as doses preferidas da composição de início e/ou composição de reforço compreendem ao redor de 100 ug, ao redor de 200 ug, ao redor de 300 ug, ao redor de 400 ug, ao redor de 500 ug, ao redor de 600 ug, ao redor de 700 ug de replicon de RNA no estado não formulado (por exemplo, RNA puro em solução salina). Em várias modalidades, cada um ou tanto o primeiro quanto o segundo replicons de RNA podem ser administrados como RNA puro (por exemplo, em solução salina) ou cada um ou ambos podem ser administrados com- preendidos em uma nanopartícula; ou cada um pode ser administrado como RNA puro e o outro administrado em uma nanopartícula.

Em al- gumas modalidades em que modelos de pequenos animais estão en- volvidos, a composição de início e/ou a composição de reforço podem ser administradas ao indivíduo em uma ou mais dosagens que variam de cerca de 0,01 ug a cerca de 30 ug.

Em algumas modalidades em que grandes modelos animais e seres humanos estão envolvidos, a composição de início e/ou a composição de reforço podem ser admi- nistradas ao indivíduo em uma ou mais dosagens que variam de cerca de 0,1 ug a cerca de 100 ug.

Em algumas modalidades, doses ade- quadas para modelos de pequenos animais variam de cerca de 5 x 10º S ug/100 mg a cerca de 0,15 ug/100 mg.

Esta faixa de dose é equiva- lente a cerca de 0,01 ug a cerca de 30 ug para um camundongo de 20 9g.

Em algumas modalidades, a composição de início e/ou a composi- ção de reforço é administrada ao indivíduo em múltiplas doses ao re-

dor de 15 ug por dose para um camundongo de 20 g. Em algumas modalidades, para modelos de animais grandes, tais como, por exem- plo, seres humanos, as dosagens adequadas variam de cerca de 1,25 x 107 ug/100 mg a 1,25 x 10º ug /100 mg. Esta faixa de dose é equi- valente a doses de cerca de 0,1 ug a cerca de 100 ug para um hospe- deiro de 80 kg. Em algumas modalidades, a composição de início e/ou a composição de reforço é administrada ao indivíduo em múltiplas do- ses ao redor de 0,001 ug, ao redor de 0,01 ug, ao redor de 0,1 ug, ao redor de 1 ug, ao redor de 10 ug, ao redor de 100 ug, ao redor de 200 ug, ao redor de 300 ug de RNA por dose de corpo inteiro no estado formulado. Em algumas modalidades, a composição de início e/ou a composição de reforço é administrada ao indivíduo em múltiplas doses ao redor de 50 ug de RNA por dose de corpo inteiro. Em algumas mo- dalidades, a composição de início e/ou a composição de reforço é ad- ministrada em dosagens gradualmente crescentes ao longo do tempo. Em algumas modalidades, a composição de início e/ou a composição de reforço é administrada em dosagens gradualmente decrescentes ao longo do tempo.

[0058] Em algumas modalidades dos métodos aqui divulgados, o cronograma de imunização pode ser importante. Por exemplo, um au- mento retardado será útil para evitar interferências nas respostas pri- márias induzidas pelo início. Embora doses de vacina rigorosamente espaçadas (por exemplo, 1 a 2 semanas) possam provocar uma rápi- da indução da resposta imune, em algumas modalidades, a resposta pode ser menos persistente do que quando o mesmo número de do- ses de vacina foi administrado em intervalos mais longos (por exem- plo, 1 a 2 meses). Um intervalo mínimo de 1 a 2 semanas também po- de garantir a maturação por afinidade ideal das células B da memória. Em algumas modalidades dos métodos aqui divulgados, a pelo menos uma dose da composição de início e da composição de reforço é ad-

ministrada ao indivíduo em intervalos de cerca de 1 semana, ou 2,3, 4,5,6,7 ou 8 ou 1a20u2ad4ou3ad semanas. Em algumas moda- lidades dos métodos divulgados nesta invenção, a pelo menos uma dose da composição de início e da composição de reforço é adminis- tradas ao indivíduo em intervalos de cerca de 4 semanas. Uma pessoa de habilidade na técnica irá observar ainda que para qualquer indiví- duo particular, os regimes de dosagem específicos podem ser ajusta- dos ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e a avaliação profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições. Por exemplo, as doses podem ser ajustadas com base nos efeitos clínicos das composições administra- das tais como efeitos tóxicos e/ou valores laboratoriais. Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer o efeito desejado ideal. Por exemplo, como debatido acima, uma dose única pode ser adminis- trada, várias doses divididas podem ser administradas ao longo do tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. A deter- minação de dosagens e regimes apropriados para administração das composições aqui divulgadas é bem conhecida na técnica relevante e deve ser entendida de ser incluída pelo especialista versado na técni- ca, uma vez fornecidos os ensinamentos aqui divulgados.

[0059] Assim, uma pessoa de habilidade na técnica irá observar, com base na divulgação aqui fornecida, que a dose e o regime de do- sagem são ajustados de acordo com os métodos bem conhecidos nas técnicas terapêuticas. Isto é, a dose máxima tolerável pode ser facil- mente estabelecida e a quantidade eficaz que fornece um benefício terapêutico detectável a um indivíduo também pode ser determinada, assim como os requisitos temporais para administrar cada agente para fornecer um benefício terapêutico detectável ao paciente. Consequen- temente, embora certos regimes de dose e administração sejam exemplificados nesta invenção, esses exemplos de forma alguma limi- tam o regime de dose e administração que pode ser fornecido a um paciente na prática da presente invenção.

[0060] A administração das composições de início e reforço aqui divulgadas pode ser afetada por qualquer método que permita a libe- ração das composições no local da ação. Esses métodos incluem vias orais, vias intraduodenais, injeção parenteral (compreendendo intrave- nosa, subcutânea, intramuscular, intravascular ou infusão), administra- ção tópica e administração retal. As infusões podem ser administradas por gotejamento, infusão contínua, bomba de infusão, bomba dosado- ra, formulação de depósito ou qualquer outro meio adequado. Em al- gumas modalidades, pelo menos uma dose da composição de início é administrada por via intramuscular ao indivíduo. Em algumas modali- dades, pelo menos uma dose da composição de reforço é administra- da por via intramuscular ao indivíduo.

[0061] Em algumas modalidades, a pelo menos uma dose da composição de reforço compreende diferentes tipos de antígeno com- preendendo pelo menos um epítopo reativo cruzado. Em algumas mo- dalidades, o método para a imunização de início-reforço heteróloga aqui divulgado pretende abranger regimes de imunização nos quais uma das múltiplas composições de reforço compreende o mesmo re- plicon de RNA utilizado na composição de início e, portanto, um "refor- ço homólogo", das mesmas doses ou diferentes, contanto que pelo menos uma das múltiplas administrações da composição de reforço compreenda um replicon de RNA que seja diferente daquele utilizado na composição de início.

[0062] Em algumas modalidades, o primeiro antígeno na composi- ção de início pode ser o mesmo antígeno como o segundo antígeno na composição de reforço. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno possuem a mesma sequência de aminoácido.

Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido do primeiro an- tígeno é uma parte (por exemplo, pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99%) da sequência de aminoácido do segundo an- tígeno.

Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo antígenos compreendem sequências de aminoácido que são homólogas (por exemplo, substancialmente idênticas) entre si.

O termo "idêntico" ou "percentual de identidade", conforme aqui utilizado no contexto de du- as ou mais moléculas poliméricas, por exemplo, sequências de amino- ácido de polipeptídeos, refere-se à semelhança de sequência entre as moléculas poliméricas.

Duas sequências de aminoácido são homólo- gas (por exemplo, substancialmente idênticas) se houver uma identi- dade parcial ou completa entre suas sequências.

Por exemplo, 80% idêntica significa que 80% dos aminoácidos são idênticos quando as duas sequências estão alinhadas para a correspondência máxima.

Como tal, o termo "substancialmente idêntico" refere-se a um primeiro aminoácido que contém um número suficiente ou mínimo de aminoá- cidos idênticos ou equivalentes (por exemplo, com cadeia lateral se- melhante) a uma segunda sequência de aminoácido, de tal modo que a primeira e a segunda sequências de aminoácido possuem um domí- nio comum, tal como um determinante imunologicamente antigênico (por exemplo, epítopo). Por exemplo, a sequência de aminoácido do primeiro antígeno pode apresentar 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% ou uma faixa entre dois desses valores, identidade da sequência com a sequência de aminoácido do segundo antígeno.

Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido do primeiro an- tígeno apresenta pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido do segundo antígeno.

Em algumas modalidades, a sequência de ami- noácido do primeiro antígeno apresenta pelo menos 80% de identida-

de de sequência com a sequência de aminoácido do segundo antíge- no. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido do primeiro antígeno apresenta pelo menos 90% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido do segundo antígeno. Em algumas moda- lidades, a sequência de aminoácido do primeiro antígeno apresenta pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido do segundo antígeno. Em algumas modalidades, a se- quência de aminoácido do primeiro antígeno apresenta pelo menos 98% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido do segundo antígeno. Em algumas modalidades, a sequência de aminoá- cido do primeiro antígeno apresenta pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido do segundo antígeno. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido do primeiro antíge- no apresenta pelo menos 100% de identidade de sequência com a se- quência de aminoácido do segundo antígeno. Em algumas modalida- des, a sequência de aminoácido do primeiro antígeno é idêntica à se- quência de aminoácido do segundo antígeno.

[0063] Como aqui usado, os termos "identidade" ou "idêntica" per- centual, no contexto de duas ou mais sequências de ácido nucleico ou sequências polipeptídicas, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências iguais ou com uma porcentagem especificada de resí- duos de aminoácido ou nucleotídeos iguais, quando comparados e ali- nhados com relação à correspondência máxima sobre uma janela de comparação. A não ser que de outra maneira especificada, a janela de comparação para uma sequência selecionada, por exemplo, "SEQ ID NO: X" é todo o comprimento da SEQ ID NO: X e, por exemplo, a jane- la de comparação para "100 bp da SEQ ID NO: X" é o 100 pb mencio- nado. O grau de identidade da sequência de aminoácido ou ácido nu- cleico pode ser determinado por vários programas de computador para alinhar as sequências a serem comparadas com base nos parâmetros de programa designados. Por exemplo, as sequências podem ser ali- nhadas e comparadas utilizando o algoritmo de homologia local de Smith & Waterman Adv. Appl. Math. 2:482-89, 1981, o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch JyJ. Mol. Biol. 48:443-53, 1970, ou a pesquisa pelo método de similaridade de Pear- son & Lipman Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444-48, 1988, e pode ser alinhado e comparado com base na inspeção visual ou pode utili- zar programas de computador para a análise (por exemplo, GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI).

[0064] Além de calcular a identidade de sequência percentual, o algoritmo BLAST também executa uma análise estatística da similari- dade entre duas sequências (ver, por exemplo, Karlin & Altschul, Proc. Nat'. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993). A menor probabilidade de soma (P(N)) fornece uma indicação da probabilidade pela qual uma correspondência entre duas sequências de nucleotídeo ou aminoácido ocorreria por acaso. Por exemplo, um ácido nucleico é considerado semelhante a uma sequência de referência se a menor probabilidade de soma em uma comparação do ácido nucleico de teste com o ácido nucleico de referência for menor do que cerca de 0,1, de preferência menor do que cerca de 0,01 e mais preferivelmente menor do que cer- ca de 0,001.

[0065] Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo antíge- nos compreendem pelo menos um determinante antigênico reativo cruzado. O termo "epítopo" ou "determinante antigênico", como aqui utilizado de modo trocável, refere-se à estrutura primária, secundária, terciária ou quaternária de uma molécula antigênica (por exemplo, um polipeptídeo) reconhecida pelas células B (por exemplo, linfócitos B) e pelos anticorpos secretados pelas células B. Os epítopos podem ser lineares ou conformacionais. Geralmente, um epítopo inclui pelo me-

nos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos consecuti- vos ou não consecutivos em uma conformação espacial única.

Abran- gidos pelos termos "epítopo" e "determinante antigênico" estão os epí- topos simples, que compreendem apenas alguns resíduos de aminoá- cido contíguos, além de epítopos complexos que abrangem resíduos descontínuos de aminoácido.

Em alguns casos, os epítopos comple- xos compreendem resíduos de aminoácido separados na sequência primária, mas muito próximos na estrutura dobrada tridimensional de um antígeno.

O termo "determinante antigênico reativo cruzado" ou "epítopo reativo cruzado" refere-se à capacidade de um determinante antigênico presente em duas ou mais moléculas de antígeno (por exemplo, polipeptídeos) de se ligar ao mesmo anticorpo.

Além disso, deve ficar entendido que as duas ou mais moléculas que compreen- dem o determinante antigênico capaz de se ligar ao mesmo anticorpo podem ser, por exemplo, as mesmas moléculas ou seus fragmentos, variantes entre si ou moléculas diferentes.

A título de exemplo, com referência aos polipeptídeos compreendendo um determinante antigê- nico capaz de se ligar ao mesmo anticorpo, os polipeptídeos podem ter a mesma sequência de aminoácido primária ou uma diferente, no entanto, cada polipeptídeo compreende um determinante antigênico (por exemplo, "reatividade cruzada") que pode ser ligado pelo mesmo anticorpo.

Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo antíge- nos induzem substancialmente a mesma resposta imune no indivíduo.

Em algumas modalidades, o termo "substancialmente a mesma res- posta imune" pode se referir, por exemplo, onde a concentração de anticorpos induzidos contra o primeiro antígeno é aproximadamente a mesma, ou pelo menos ao redor de 75%, ou pelo menos ao redor de 80%, ou pelo menos ao redor de 90%, ou pelo menos ao redor de 95%, ou pelo menos ao redor de 99% da concentração de anticorpos induzidos contra o segundo antígeno testado nas mesmas condições.

Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo antígenos induzem a mesma resposta imune no indivíduo, por exemplo, a concentração de anticorpos induzidos contra o primeiro antígeno é idêntica à con- centração de anticorpos induzidos contra o segundo antígeno testado nas mesmas condições.

[0066] Em algumas modalidades, o termo "substancialmente a mesma resposta imune" pode se referir a, por exemplo, onde o tipo de perfil de anticorpo induzido contra o primeiro antígeno é aproximada- mente o mesmo, ou pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99% idêntico ao tipo de perfil de anticorpo in- duzido contra o segundo antígeno testado nas mesmas condições. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo antígenos induzem a mesma resposta imune no indivíduo, por exemplo, o tipo de perfil de anticorpo induzido contra o primeiro antígeno é idêntico ao tipo de per- fil de anticorpo induzido contra o segundo antígeno testado nas mes- mas condições.

[0067] Em algumas modalidades divulgadas nesta invenção, o primeiro e o segundo replicons de RNA são capazes de ativar um sis- tema imune do indivíduo através de diferentes mecanismos imunológi- cos, por exemplo, empregar ou ativar diferencialmente o sistema imu- nológico de um paciente em questão. Por exemplo, em algumas mo- dalidades, o primeiro replicon de RNA pode ativar o sistema imunoló- gico do indivíduo através de um mecanismo imunológico que é diferen- te de um ou mais, ou de qualquer um, dos mecanismos imunológicos em que o segundo replicon de RNA é capaz de ativar o sistema imu- nológico no indivíduo. Em algumas modalidades, cada um dos primei- ro e segundo replicons de RNA pode ser capaz de ativar independen- temente o sistema imune do indivíduo através de um, dois, três ou mais mecanismos imunológicos. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo replicons de RNA podem ativar o sistema imune através de um, dois, três ou mais mecanismos imunológicos comuns; no en- tanto, pelo menos um dos mecanismos imunológicos utilizados pelo primeiro replicon de RNA é diferente de cada um dos mecanismos imunológicos utilizados pelo segundo replicon de RNA. Exemplos não limitativos de mecanismos imunológicos através dos quais o primeiro e/ou o segundo replicons podem ativar o sistema imunológico incluem (1) diferentes mecanismos ativos de evasão imunológica da célula hospedeira codificados por proteínas não estruturais de um replicon distinto ou relacionado; (2) mecanismos passivos diferentes para a imunidade da célula hospedeira reconhecer o próprio replicon; e (3) cocodificação de proteínas imunomoduladoras que funcionam para empregar ou ativar diferencialmente o sistema imune durante a primei- ra e a segunda injeção. Em algumas modalidades da presente inven- ção, o pelo menos um dos dois ou mais mecanismos imunológicos é selecionado do grupo que consiste na ativação diferencial da proteína cinase R (PKR), gene induzível por ácido retinoico | (RIG-I), vias de autofagia, receptores do tipo Toll (TLRs), grânulos de estresse, RNase R e oligoadenilato sintetases (OEA).

[0068] Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é um replicon modificado. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo replicons de RNA são derivados de um vírus de RNA de fita positiva. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie de vírus pertencente a uma família selecionada do grupo que consiste na família Togaviridae, família Flaviviridae, família Or- thomyxoviridae, família Rhabdoviridae, família Arteroviridae, família Picornaviridae, família Astroviridae, família Coronaviridae e família Pa- ramyxoviridae. Em conformidade, em algumas modalidades, pelo me- nos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de um vírus de RNA de fita negativa. As espécies de vírus de RNA de fita ne- gativa adequadas incluem, mas não são limitadas a estas, espécies virais das famílias Orthomyxoviridae, Rhabdoviridae e Paramyxoviri- dae. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segun- do replicons de RNA é derivado de uma espécie de vírus pertencente à família Orthomyxoviridae. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie de vírus pertencente a um gênero Orthomyxovirus selecionado do gru- po que consiste no vírus da Influenza A, vírus da Influenza B, vírus da Influenza C, vírus da Influenza D, /savirus, Thogotovirus e Quaranjavi- rus. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de um vírus da influenza. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de um vírus da Influenza A.

[0069] Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie de vírus per- tencente à família Rhabdoviridae. Em algumas modalidades, pelo me- nos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie de vírus pertencente a um gênero Rhabdovírus selecionado do grupo que consiste em Curiovirus, Cytorhabdovirus, Dichorhavirus, Ephemerovirus, Hapavirus, Ledantevirus, Lyssavirus, Novirhabdovirus, Nucleorhabdovirus, Perhabdovirus, Sigmavirus, Sprivivirus, Sripuvirus, Tibrovirus, Tupavirus, Varicosavirus, Vesiculovirus. Exemplos não limi- tativos de espécies preferidas de Rhabdovirus incluem, entre outros, vírus da septicemia hemorrágica viral (VHSV), vírus da estomatite ve- sicular (VSV) e vírus da raiva (RABV).

[0070] Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie de vírus per- tencente à família Paramyxoviridae. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie de vírus Paramyxovirus pertencente à subfamília Pneu- movirinae ou subfamília Paramyxovirinae. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie de vírus pertencente a um gênero Paramyxovirus se- lecionado do grupo que consiste em Aquaparamyxovirus, Avulavirus, Ferlavirus, Henipavirus, Metapneumovirus, Morbillivirus, Pneumovirus, Respirovirus e Rubulavirus. Exemplos não limitativos de espécies pre- feridas de Paramyxovirus incluem, mas não são limitados a estes, vi- rus sincicial respiratório humano (hRSV, subgrupo A), vírus sincicial respiratório bovino (bRSV), metapneumovírus humano (hMPV), vírus da parainfluenza bovino-humano 3 (b/hPIV3), vírus da parainfluenza humano 1 (hPIV1), vírus da parainfluenza bovino-humano recombinan- te 3 (rB/HPIV3), vírus Sendai (SeV), vírus Andes (ANDV), vírus da ca- xumba (MuV), vírus Simian 5 (SV5) e vírus do sarampo (MeV).

[0071] Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie de vírus de fita positiva pertencente à família Togaviridae ou à família Flaviviridae. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo repli- cons de RNA é derivado de uma espécie de vírus pertencente à famí- lia Flaviviridae, tal como, por exemplo, os vírus pertencentes aos gêne- ros Flavivirus e Pestivirus. Exemplos não limitativos de vírus perten- centes ao gênero Flavivirus incluem vírus da febre amarela (YFV), vi- rus da dengue, vírus da encefalite japonesa (JEV), vírus do Nilo Oci- dental (WNV) e vírus da Zika. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado do vírus da febre amarela ou do vírus da dengue. As cepas de flavivírus virulentas e não virulentas são ambas adequadas. Exemplos não limitativos de cepas preferidas de flavivírus incluem, mas não são limitados a estes, YFV (17D), DENA4 (814669 e derivados), DEN2 (PDK-53), vírus Kunjin (KUN), JEV (SA14-14-2), vírus da encefalite de Murray Valley (MVEV,

com IRES atenuado), WNV (SCFV), vírus da diarréia viral bovina (BVDV) CP7, BVDV-SD1, BVDV-NADL e vírus da febre suína clássica (CSFV).

[0072] Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie de vírus de fita positiva, por exemplo, uma espécie de vírus pertencente ao gênero Alphavirus da família Togaviridae. Em algumas modalidades, pelo me- nos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie de vírus de fita positiva pertencente ao gênero Arterivirus da família Arteriviridae. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie de vírus de fita positiva pertencente ao gênero Arterivirus da família Arte- riviridae e o outro replicon de RNA é derivado de uma espécie perten- cente ao gênero Alphavirus da família Togaviridae.

ALPHAVIRUSES

[0073] Alphavirus é um gênero de vírus genética, estrutura e soro- logicamente relacionado da família Togaviridae do grupo IV que inclui pelo menos 30 membros, cada um tendo genomas de RNA de fita simples de polaridade positiva, encerrados em um nucleocapsídeo cercado por um envoltório contendo proteínas de pico viral. Atualmen- te, o gênero Alphavirus compreende, entre outros, o vírus Sindbis (SIN), o vírus da Semliki Forest (SFV), o vírus Ross River (RRV), o ví- rus da encefalite equina venezuelana (VEEV) e o vírus da encefalite equina oriental (EEEV), os quais são todos intimamente relacionados e são capazes de infectar vários vertebrados, tais como mamíferos, roe- dores, peixes, espécies aviárias e mamíferos maiores, tais como seres humanos e cavalos, além de invertebrados, tais como crustáceos e insetos. A transmissão entre espécies e indivíduos ocorre principal- mente por meio de mosquitos, que tornam os Alphaviruses um contri- buinte para a coleta de arbovírus - ou vírus transmitidos por artrópo-

des. Por exemplo, os vírus Sindbis e Semliki Forest foram amplamente estudados e o ciclo de vida, modo de replicação, etc., desses vírus são bem caracterizados. Por exemplo, demonstrou-se que os Alphavirus se replicam de maneira muito eficiente nas células animais, o que os torna valiosos como vetores para a produção de proteínas e ácidos nucléicos em tais células.

[0074] As partículas de Alphavirus são envelopadas, possuem um diâmetro de 70 nm, tendem a ser esféricas (embora ligeiramente ple- omórficas) e possuem um nucleocapsídeo isométrico de aproximada- mente 40 nm. O genoma de Alphavirus é um RNA de fita simples de polaridade positiva de aproximadamente 11 a 12 kb de comprimento, compreendendo uma membrana 5', uma cauda poli-A 3' e duas estru- turas de leitura abertos com uma primeira estrutura que codifica as proteínas não estruturais com função enzimática e uma segunda estru- tura que codifica as proteínas estruturais virais (por exemplo, a proteí- na do capsídeo C, glicoproteína E1, glicoproteína E2, proteína E3 e proteína 6K).

[0075] Os dois terços 5' do genoma do Alphavirus codificam um número de proteínas não estruturais necessárias para a transcrição e replicação do RNA viral. Essas proteínas são traduzidas diretamente do RNA e, juntamente com as proteínas celulares, formam a RNA po- limerase dependente de RNA essencial para a replicação do genoma viral e transcrição do RNA subgenômico. Quatro proteínas não estrutu- rais (nsP1-4) são produzidas como uma única poliproteína e constitu- em o mecanismo de replicação do vírus. O processamento da polipro- teína ocorre de uma maneira altamente regulada, com a clivagem na junção P2/3 influenciando o uso do padrão de RNA durante a replica- ção do genoma. Este sítio está localizado na base de uma fenda es- treita e não é facilmente acessível. Uma vez clivado, a nsP3 cria uma estrutura em anel que circunda a nsP2. Essas duas proteínas possu-

em uma interface extensa. Mutações em nsP2 que produzem vírus não citopáticos ou um agrupamento de fenótipos sensíveis à tempera- tura na região da interface P2/P3. As mutações P3 opostas à localiza- ção das mutações não citopáticas de nsP2 impedem a clivagem efici- ente de P2/3. Por sua vez, isso pode afetar a possibilidade de conta- minação do RNA, alterando os níveis de produção de RNA viral.

[0076] O terço 3' do genoma compreende RNA subgenômico que serve como um padrão para a translação de todas as proteínas estru- turais necessárias para formar partículas virais: a proteína nucleocap- sídica do núcleo C e as proteínas do envoltório P62 e E1 que se asso- ciam como um heterodímero. As glicoproteínas de superfície ancora- das na membrana viral são responsáveis pelo reconhecimento do re- ceptor e entrada nas células-alvo através da fusão da membrana. O RNA subgenômico é transcrito a partir do promotor subgenômico p26S presente na extremidade 3' da sequência de RNA que codifica a prote- ína nsp4. A maturação proteolítica de P62 em E2 e E3 provoca uma alteração na superfície viral. Juntos, os "spikes" de glicoproteínas E1, E2 e às vezes E3 formam um dímero E1/E2 ou um trímero E1/E2/E3, onde E2 se estende do centro até os vértices, E1 preenche o espaço entre os vértices e E3, se presente, está na extremidade distal do spi- ke. Após a exposição do vírus à acidez do endossoma, o E1 se disso- cia do E2 para formar um homotrímero E1, necessário para a etapa de fusão pra acionar as membranas celular e viral entre si. A glicoproteína E1 alfaviral é uma proteína de fusão viral de classe Il, que é estrutu- ralmente diferente das proteínas de fusão de classe | encontradas no vírus influenza e no HIV. A glicoproteína E2 funciona para interagir com o nucleocapsídeo através de seu domínio citoplasmático, enquan- to seu ectodomínio é responsável pela ligação a um receptor celular. À maioria dos Alphavirus perde a proteína periférica E3, enquanto nos vírus Semliki permanece associada à superfície viral. Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo replicons de RNA não codifi- cam para nenhuma proteína estrutural viral, ou não codificam para E1 ou E2 ou E3, ou qualquer um deles ou qualquer combinação deles. Por exemplo, quando o replicon de RNA é derivado de um Alphvirus, ele não pode codificar para E1 ou E2 ou E3, nem qualquer combina- ção ou subcombinação deles.

[0077] A replicação de Alphavirus é um processo associado à membrana dentro da célula hospedeira. Na primeira etapa do ciclo in- feccioso, a extremidade 5' do RNA genômico é trasladada em uma po- liproteína (nsP1-4) com atividade da RNA polimerase que produz uma cadeia negativa complementar ao RNA genômico. Em uma segunda etapa, a cadeia negativa é utilizada como modelo para a produção de dois RNAs, respectivamente: (1) um RNA genômico positivo corres- pondente ao genoma dos vírus secundários, produzindo, por transla- ção, outras proteínas nsp e que atuam como genoma para o vírus; e (2) RNA subgenômico que codifica as proteínas estruturais do vírus que formam as partículas infecciosas. A relação RNA genômico positi- vo/RNA subgenômico é regulada pela autoclivagem proteolítica da po- liproteína para nsp 1, nsp 2, nsp 3 e nsp 4. Na prática, a expressão do gene viral ocorre em duas fases. Em uma primeira fase, há uma sínte- se principal de filamentos genômicos positivos e de filamentos negati- vos. Durante a segunda fase, a síntese do RNA subgenômico é prati- camente exclusiva, resultando assim na produção de grande quanti- dade de proteína estrutural.

[0078] Em algumas modalidades aqui divulgadas, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie Alphavirus. Em algumas modalidades, o replicon de RNA do Alphavi- rus é derivado de um Alphavirus pertencente ao grupo VEEV/EEEV, ou ao grupo SF, ou ao grupo SIN (para revisão, ver, por exemplo, Strauss and Strauss. Microbiol. Rev., 58:3 p 492-562, 1994). Exemplos não limitativos de Alphavirus do grupo SF incluem o vírus Semliki Fo- rest, o vírus O'Nyong-Nyong, o vírus Ross River, o vírus Middelburg, o vírus Chikungunya, o vírus Barmah Forest, o vírus Getah, o vírus Ma- yaro, o vírus Sagiyama, o vírus Bebaru e o vírus Una. Exemplos não limitativos de Alphavirus do grupo SIN incluem o vírus Sindbis, o vírus Girdwood S.A., o arbovírus sul-africano No. 86, o vírus Ockelbo, o vií- rus Aura, o vírus Babanki, o vírus Whataroa e o vírus Kyzylagach. Exemplos não limitativos de Alphavirus do grupo VEEV/EEEV incluem vírus da encefalite equina oriental (EEEV), vírus da encefalite equina ocidental (WEEV), vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV), , vírus Everglades (EVEV), vírus Mucambo (MUCV), vírus Semliki Fo- rest (SFV), vírus Pixuna (PIXV), vírus Middleburg (MIDV), vírus Chikungunya (CHIKV), vírus O'Nyong-Nyong (ONNV), vírus Ross Ri- ver (RRV), vírus Barmah Forest (BF), vírus Getah (GET) ), Vírus Sagi- yama (SAGV), vírus Bebaru (BEBV), vírus Mayaro (MAYV) e vírus Una (UNAV). As cepas de Alphavirus virulentas e não virulentas são ambas adequadas para os métodos e composições aqui divulgados. Em al- gumas modalidades particulares, o replicon de RNA do Alphavirus é derivado de um vírus Sindbis (SIN), um vírus Semliki Forest (SFV), um vírus Ross River (RRV), um vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV) ou um vírus da encefalite equina oriental (EEEV). Em algumas modalidades, o replicon de RNA do alfavírus é derivado de um vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV).

[0079] Em algumas modalidades, tanto o primeiro quanto o se- gundo replicons de RNA são derivados de espécies de Alphavirus. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo replicons de RNA são derivados da mesma espécie de Alphavirus ou de duas espécies dife- rentes de Alphavirus. Em algumas modalidades, o primeiro replicon de RNA é derivado de um Alphavirus e o segundo replicon de RNA é de- rivado de uma espécie não Alphavirus. Exemplos não limitativos de replicons de RNA não Alphavirus incluem replicons de RNA derivados de espécies de vírus pertencentes a uma família selecionada do grupo que consiste na família Togaviridae, família Flaviviridae, família Or- thomyxoviridae, família Rhabdoviridae, família Arteroviridae, família Picornaviridae, família Astroviridae, família Coronaviridae e família Pa- ramyxoviridae. Em conformidade, em algumas modalidades, o replicon de RNA não Alphavirus é derivado de um vírus de RNA de fita negati- va. As espécies de vírus de RNA de fita negativa adequadas incluem, mas não são limitadas a estas, espécies virais das famílias Ortho- myxoviridae, Rhabdoviridae e Paramyxoviridae. Em algumas modali- dades, o replicon de RNA não Alphavirus é derivado de uma espécie de vírus de RNA de fita negativa pertencente à família Orthomyxoviri- dae. Em algumas modalidades, o replicon de RNA não Alphavirus é derivado de uma espécie de vírus pertencente a um gênero Ortho- myxovirus selecionado do grupo que consiste no vírus da Influenza A, vírus da Influenza B, vírus da Influenza C, vírus da Influenza D, /savi- rus, Thogotovirus e Quaranjavirus. Em algumas modalidades, o repli- con de RNA não Alphavirus é derivado de um vírus da influenza. Em algumas modalidades, o replicon de RNA não Alphavirus é derivado de um vírus da Influenza A.

[0080] Em algumas modalidades, o replicon de RNA não Alphavi- rus é derivado de uma espécie de vírus de RNA de fita negativa per- tencente à família Rhabdoviridae. Em algumas modalidades, o replicon de RNA não Alphavirus é derivado de uma espécie de vírus pertencen- te a um gênero Rhabdovírus selecionado do grupo que consiste em Curiovirus, Cytorhabdovirus, Dichorhavirus, Ephemerovirus, Hapavi- rus, Ledantevirus, Lyssavirus, Novirhabdovirus, Nucleorhabdovirus, Perhabdovirus, Sigmavirus, Sprivivirus, Sripuvirus, Tibrovirus, Tupavi- rus, Varicosavirus, Vesiculovirus. Exemplos não limitativos de espécies preferidas de Rhabdovirus incluem, entre outros, vírus da septicemia hemorrágica viral (VHSV), vírus da estomatite vesicular (VSV) e vírus da raiva (RABV).

[0081] Em algumas modalidades, o replicon de RNA não Alphavi- rus é derivado de uma espécie de vírus de RNA de fita negativa per- tencente à família Paramyxoviridae. Em algumas modalidades, o repli- con de RNA não Alphavirus é derivado de uma espécie de vírus Pa- ramyxovirus pertencente à subfamília Pneumovirinae ou subfamília Paramyxovirinae. Em algumas modalidades, o replicon de RNA não Alphavirus é derivado de uma espécie de vírus pertencente a um gê- nero Paramyxovirus selecionado do grupo que consiste em Aquapa- ramyxovirus, Avulavirus, Ferlavirus, Henipavirus, Metapneumovirus, Morbillivirus, Pneumovirus, Respirovirus e Rubulavirus. Exemplos não limitativos de espécies preferidas de Paramyxovirus incluem, mas não são limitados a estes, vírus sincicial respiratório humano (hRSV, sub- grupo A), vírus sincicial respiratório bovino (bRSV), metapneumovírus humano (hMPV), vírus da parainfluenza bovino-humano 3 (b/hPIV3), vírus da parainfluenza humano 1 (hPIV1), vírus da parainfluenza bovi- no-humano recombinante 3 (rB/HPIV3), vírus Sendai (SeV), vírus An- des (ANDV), vírus da caxumba (MuV), vírus Simian 5 (SV5) e vírus do sarampo (MeV).

[0082] Em algumas modalidades, o replicon de RNA não Alphavi- rus é derivado de uma espécie de vírus de fita positiva pertencente à família Togaviridae ou à família Flaviviridae. Em algumas modalidades, o replicon de RNA não Alphavirus é derivado de uma espécie de vírus pertencente à família Flaviviridae, tal como, por exemplo, os vírus per- tencentes aos gêneros Flavivirus e Pestivirus. Exemplos não limitati- vos de vírus pertencentes ao gênero Flavivirus incluem vírus da febre amarela (YFV), vírus da dengue, vírus da encefalite japonesa (JEV), vírus do Nilo Ocidental (WNV) e vírus da Zika. Em algumas modalida- des, pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é deri-

vado do vírus da febre amarela ou do vírus da dengue. As cepas de flavivírus virulentas e não virulentas são ambas adequadas. Exemplos não limitativos de cepas preferidas de flavivírus incluem, mas não são limitados a estes, YFV (17D), DEN4 (814669 e derivados), DEN2 (PDK-53), vírus Kunjin (KUN), JEV (SA14-14-2), vírus da encefalite de Murray Valley (MVEV, com IRES atenuado), WNV (SCFV), vírus da diarréia viral bovina (BVDV) CP7, BVDV-SD1, BVDV-NADL e vírus da febre suína clássica (CSFV).

[0083] Em algumas modalidades, o replicon de RNA não Alphavi- rus é derivado de uma espécie de vírus de fita positiva pertencente à família Arteriviridae, que pode ser um vírus do gênero Arterívirus. As espécies de Arterivirus adequadas incluem, mas não são limitadas a estas, espécies de vírus da arterite equina (EAV), vírus da síndrome respiratória e reprodutiva suína (PRRSV), vírus de elevação da lactato desidrogenase (LDV), vírus da febre hemorrágica símia (SHFV) e vírus da doença do gambá instável (WPDV).

[0084] Em algumas modalidades, o pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA compreende uma 5'-UTR modificada com uma ou mais substituições de nucleotídeos na posição 1, 2, 4 ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, pelo menos uma das substituições de nucleotídeo é uma substituição de nucleotídeo na posição 1 da 5-UTR modificada. Em algumas modalidades, pelo me- nos uma das substituições de nucleotídeo é uma substituição de nu- cleotídeo na posição 2 da 5-UTR modificada. Em algumas modalida- des, pelo menos uma das substituições de nucleotídeo é uma substi- tuição de nucleotídeo na posição 4 da 5-UTR modificada. Em algumas modalidades, as substituições de nucleotídeo na posição 2 da 5-UTR modificada são uma substituição de U->G. Em algumas modalidades, a substituição de nucleotídeo na posição 2 da 5-UTR modificada é uma substituição de USA. Em algumas modalidades, a substituição de nucleotídeo na posição 2 da 5-UTR modificada é uma substituição de UC.

[0085] Em algumas modalidades da presente invenção, uma parte ou toda a sequência de codificação para uma ou mais proteínas estru- turais virais está ausente e/ou modificada no replicon de RNA como aqui divulgado. Assim, em algumas modalidades particulares, o repli- con de RNA conforme divulgado nesta invenção inclui uma 5-UTR modificada e é desprovido de pelo menos uma parte de uma sequên- cia de ácido nucleico que codifica uma ou mais proteínas estruturais virais, por exemplo, desprovido do primeiro de um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou mais nucleotídeos da sequência de ácido nucleico que codifica as proteínas estruturais virais. Em algumas modalidades, o replicon de RNA modificado pode ser desprovido de cerca de 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais da sequência que codifica um ou mais dos polipeptídeos estrutu- rais E1, E2, E3, 6K e proteína C de capsídeo, ou uma ou mais de ou- tras sequências que codificam polipeptídeos estruturais. Em algumas modalidades, o replicon de RNA modificado é desprovido de uma par- te substancial ou de toda a sequência que codifica um ou mais dos polipeptídeos estruturais E1, E2, E3, 6K e proteína C do capsídeo, ou uma ou mais de outras sequências que codificam os polipeptídeos es- truturais. Como aqui utilizado, uma "parte substancial" de uma se- quência de ácido nucleico que codifica uma proteína estrutural viral compreende o suficiente da sequência de ácido nucleico que codifica a proteína estrutural viral para fornecer identificação putativa dessa pro- teína, através da avaliação manual da sequência por uma pessoa ver- sada na técnica ou através da comparação e identificação de sequên- cia automatizada por computador utilizando algoritmos como o BLAST (ver, por exemplo, Karlin & Altschul, 1993, supra). Em algumas moda- lidades, o replicon de RNA modificado é desprovido de pelo menos parte ou toda a sequência que codifica um ou mais dos polipeptídeos estruturais E1, E2, E3, ou de qualquer combinação ou subcombinação deles. O replicon de RNA modificado também pode ser desprovido de pelo menos uma parte ou toda a sequência de proteína 6K e/ou prote- ína C de capsídeo.

SEQUÊNCIAS DO INTENSIFICADOR DE CAPSÍDEO VIRAL

[0086] Em algumas modalidades divulgadas nesta invenção, o pe- lo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é um replicon de Alphavirus modificado compreendendo uma ou mais alças pendu- culares de RNA em um elemento estrutural de um intensificador de capsídeo viral.

[0087] Alguns vírus possuem sequências capazes de formar um ou mais elementos/estruturas de alça penducular que podem ser utili- zados, por exemplo, em um genoma viral heterólogo para intensificar a translação de uma sequência de codificação localizada a jusante. Por exemplo, o mMRNA subgenômico do vírus Sindbis possui uma alça em formato de grampo de cabelo de RNA estável localizado a jusante do códon iniciador AUG do tipo selvagem para a proteína do capsídeo do vírus (por exemplo, intensificador do capsídeo). Essa estrutura de RNA de alça penducular é geralmente referida como Downstream LooP (ou motivo DLP). A estrutura de DLP foi caracterizada pela primeira vez no mMRNA do vírus Sindbis (SINV) 26S e também detectada no vírus Semliki Forest (SFV). Recentemente, estruturas de DLP similares fo- ram relatadas em pelo menos 14 outros membros do gênero Alphavi- rus, incluindo os membros do Novo Mundo (MAYV, UNAV, EEEV (NA), EEEV (SA), AURAV) e do Velho Mundo (SV, SFV, BEBV, RRV, SAG, GETV, MIDV, CHIKV, ONNV). As estruturas previstas desses MRNAs do Alphavirus 268 foram construídas com base nos dados de SHAPE (acilação seletiva de 2'-hidroxila e extensão do iniciador) (Tori- bio et al., Nucleic Acids Res. May 19;44(9):4368-80, 2016, cujo conte-

údo é aqui incorporado por referência). No caso do vírus Sindbis, o motivo de DLP é encontrado nos primeiros -150 nucleotídeos do RNA subgenômico de Sindbis.

O formato grampo de cabelo está localizado a jusante do códon de iniciação de AUG do capsídeo de Sindbis (AUG no nucleotídeo 50 do RNA subgenômico de Sindbis) e resulta no re- tardo de um ribossomo, de tal modo que o gene correto do capsídeo AUG seja utilizado para iniciar a translação.

Visto que o formato de grampo de cabelo faz com que os ribossomos pausem, o elF2a não é necessário para apoiar o início da translação.

Sem estar vinculado a nenhuma teoria em particular, acredita-se que a colocação do motivo de DLP a montante de uma sequência de codificação para qualquer gene de interesse (GOI) normalmente resulta em uma proteína de fu- são de aminoácidos do capsídeo N-terminal que são codificados na região em formato de grampo de cabelo à proteína codificada por GOI porque a iniciação ocorre no capsídeo AUG e não no GOI AUG.

Além disso, os replicons de RNA não modificados são frequentemente sen- síveis ao estado inicial do sistema imunológico das células em que são introduzidos.

Se as células/indivíduos estiverem em um estado do sis- tema imunológico inato altamente ativo, o desempenho do replicon de RNA (por exemplo, replicação e expressão de um GOI) pode ser im- pactado negativamente.

Ao projetar uma DLP para controlar o início da translação de proteínas, particularmente de proteínas não estruturais, o impacto do estado de ativação preexistente do sistema imunológico inato para influenciar a replicação eficiente do replicon de RNA é re- movido ou diminuído.

O resultado é uma expressão mais uniforme do GOI que pode afetar a eficácia da vacina ou o impacto terapêutico de um tratamento.

Informações adicionais sobre a DLP de Alphavirus po- dem ser encontradas, por exemplo, no Pedido de Patente U.S. 15/831.230. Em algumas modalidades, o intensificador do capsídeo viral compreende um motivo de alça a jusante (DLP) das espécies de vírus, e em que o motivo de DLP compreende pelo menos um dos uma ou mais alças penduculares de RNA. Por exemplo, em algumas modalidades, o intensificador de capsídeo viral compreende uma se- quência de ácido nucleico que apresenta pelo menos 80%, pelo me- nos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100% de identida- de de sequência para qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 2a 9. Em algumas modalidades, o intensificador do capsídeo viral compre- ende uma sequência de ácido nucleico que apresenta ao redor de 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100% ou uma faixa entre dois destes valores, identidade de sequência para qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 2 a 9. Em algumas modalidades, a sequência de ácido nucleico apresenta pelo menos 95% de identidade de se- quência com qualquer uma ou mais das SEQ ID NOs: 2a 9.

[0088] Em algumas modalidades, um ou ambos dos primeiro e se- gundo replicons de RNA é um replicon de Alphavirus modificado com- preendendo pelo menos ao redor de 50, ao redor de 75, ao redor de 100, ao redor de 150, ao redor de 200, ao redor de 300 ou mais nucle- otídeos da sequência de codificação 5' com relação a uma proteína do capsídeo viral. Em algumas modalidades, o intensificador do capsídeo viral é derivado de um gene do capsídeo de uma espécie de Alphavi- rus selecionada do grupo que consiste no vírus da encefalite equina oriental (EEEV), vírus da encefalite equina venezuelana (VEEV), vírus Everglades (EVEV), vírus Mucambo (MUCV), Vírus Pixuna (PIXV), vií- rus Middleburg (MIDV), vírus Chikungunya (CHIKV), vírus O'Nyong- Nyong (ONNV), vírus Ross River (RRV), vírus Barmah Forest (BF), vírus Getah (GET), Vírus Sagiyama (SAGV), vírus Bebaru (BEBV), vi- rus Mayaro (MAYV), vírus Una (UNAV), vírus Sindbis (SINV), vírus Au- ra (AURAV), vírus Whataroa (WHAV), vírus Babanki (BABV), vírus Ky- zylagach (KYZV), vírus da encefalite equina ocidental (WEEV), vírus

Highland J (HJV), vírus Fort Morgan (FMV), vírus Ndumu (NDUV) e vírus Buggy Creek (BCRV). Em algumas modalidades particulares, o intensificador do capsídeo viral é derivado de um gene do capsídeo de uma espécie de vírus Sindbis ou uma espécie de vírus Semliki Forest. Em ainda algumas modalidades particulares, o intensificador do capsí- deo viral é derivado de um gene do capsídeo de uma espécie de vírus Sindbis. Além disso, uma pessoa de habilidade prática na técnica irá observar que modificações podem ser feitas nas sequências de codifi- cação 5' da proteína do capsídeo viral sem reduzir substancialmente suas atividades de intensificação (ver, por exemplo, Frolov et al., J. Virology 70:1182, 1994; Frolov et a/., J. Virology 68:8111, 1994). Prefe- rivelmente, essas mutações substancialmente preservam a estrutura em formato de grampo de cabelo do RNA formada pelas sequências de codificação do capsídeo 5'.

[0089] Em algumas modalidades, a sequência de intensificador do capsídeo viral não contém todas as sequências de codificação 5' da proteína do capsídeo viral que estão a montante da estrutura em for- mato de grampo de cabelo. Em algumas modalidades, a sequência intensificadora do capsídeo viral pode codificar toda ou parte da prote- ína do capsídeo. Em conformidade, em algumas modalidades divulga- das nesta invenção, a região intensificadora do capsídeo não codifica toda a proteína do capsídeo viral. Em algumas modalidades, a se- quência intensificadora do capsídeo viral codifica um fragmento amino terminal da proteína do capsídeo viral. Nessas modalidades em que um capsídeo funcional diferente é codificado pela sequência intensifi- cadora do capsídeo, pode ser desejável eliminar a atividade da auto- protease do capsídeo.

[0090] Em algumas modalidades, a sequência intensificadora do capsídeo viral incluída nos replicons de RNA da presente invenção pode ser de qualquer outra sequência variante, tal como, por exemplo,

uma sequência sintética ou uma sequência heteróloga, que pode for- mar um RNA em formato de grampo de cabelo funcional ou estrutu- ralmente equivalente a uma ou mais das alças penduculares de RNA previstos para um intensificador de capsídeo viral e que podem atuar para melhorar a translação de sequências de RNA ligadas de maneira operável a jusante (por exemplo, sequência de codificação para um gene de interesse).

[0091] Em algumas modalidades, o pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é um replicon de Alphavirus modificado que inclui a sequência de codificação de pelo menos uma, pelo menos du- as, pelo menos três ou pelo menos quatro proteínas não estruturais heterólogas. Em algumas modalidades, o replicon de Alphavirus modi- ficado inclui a sequência de codificação para uma proteína não estru- tural heteróloga nsP3. Em algumas modalidades, a proteína não estru- tural heteróloga nsP3 é um vírus Chikungunya (CHIKV) nsP3 ou um vírus Sindbis (SINV) nsP3. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo antígenos é expresso sob o controle de um promotor subgenômico 268 ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, pelo menos um dos primeiro e segundo antígenos é ex- presso sob controle de um promotor subgenômico de Alphavirus 26S ou uma variante do mesmo. Em algumas modalidades, o promotor subgenômico 26S é um promotor subgenômico SINV 268, promotor subgenômico RRV 26S ou uma variante dos mesmos.

ARTERIVIRUSES

[0092] Os Arteriviruses (Família Arteriviridae, Gênero Arterivirus) abrangem um grupo importante de vírus de RNA de sentido positivo de fita simples envelopados que infectam animais domésticos e selva- gens. Os Arteriviruses compartilham uma estratégia de organização e replicação genômica semelhante àquela dos membros da família Co- ronaviridae (gêneros Coronavirus e Torovirus), mas diferem conside-

ravelmente em sua complexidade genética, comprimento do genoma, propriedades biofísicas, tamanho, arquitetura e composição proteica estrutural das partículas virais (por exemplo, vírion). Atualmente, o gê- nero Arterivirus é considerado para incluir o vírus da arterite equina (EAV), o vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV), o vírus de elevação da lactato desidrogenase (LDV) de camundongos, o vírus da febre hemorrágica símia (SHFV) e o vírus da doença do gambá instável (WPDV). Estudos recentes relataram que o vírus da doença do gambá instável (WPDV) recentemente identificado também pertence ao gênero Arterivirus.

[0093] Um genoma típico de Arterivirus varia entre 12,7 e 15,7 kb de comprimento, mas sua organização do genoma é relativamente consistente com algumas variações menores. O genoma do Arterivirus é um RNA de cadeia positiva policistrônica, com regiões 5' e 3' não trasladadas (NTRs) que flanqueiam uma matriz de 10 a 15 ORFs co- nhecidas. As grandes ORFs replicase 1a e 1b ocupam os três quartos proximais a 5' do genoma, com o tamanho de ORF1a sendo muito mais variável do que o da ORF1b. A translação de ORF1a produz po- liproteína replicase (pp) 1a, enquanto que a ORF1b é expressa por deslocamento da matriz de leitura ribossômico programado -1 (PRF), que C-terminalmente prolonga pp1a em pp1iab. Além disso, uma ORF TransFrame curto foi relatada de sobrepor a região de codificação nsp2 da ORF1a no estrutura +1 e deve ser expresso pelo -2 PRF. À parte do genoma 3'-proximal possui uma organização compacta e con- tém de 8 a 12 genes relativamente pequenos, a maioria dos quais se sobrepõe aos genes próximos. Essas ORFs codificam as proteínas estruturais e são expressas a partir de um conjunto aninhado de 3'- coterminal de MRNAs subgenômicos. A organização dessas ORFs é conservada, mas a jusante de ORF1b, SHFV e todos os vírus seme- lhantes ao SHFV recentemente identificados contêm três ou quatro

ORFs adicionais (-1,6 kb) que podem ser derivadas de uma duplica- ção antiga das ORFs 2-4. Juntamente com a variação de tamanho na ORF1a, essa duplicação presumida explica as diferenças de tamanho do genoma entre os Arteríviruses.

[0094] No que refere-se ao vírus da arterite equina (EAV), o ge- noma do EAV do tipo selvagem é de aproximadamente 12,7 kb de ta- manho. Os três quartos 5' do genoma codificam para duas grandes proteínas replicase 1a e 1ab; as sequências de aminoácido das duas proteínas são idênticas ao N-terminal, mas devido a um deslocamento da matriz de leitura ribossômico, a sequência de aminoácido da região C-terminal de 1ab é única. O um quarto 3' do genoma do EAV codifi- cam os genes proteicos estruturais do vírus, todos expressos a partir de RNAs subgenômicos. Os RNAs subgenômicos formam um conjunto aninhado de RNAs coterminais 3' que são gerados por meio de um mecanismo de transcrição descontínua. Os RNAs subgenômicos são preparados de sequências que não são contíguas ao RNA genômico. Todos os RNAs subgenômicos do EAV compartilham uma sequência líder 5' comum (156 a 221 nucleotídeos de comprimento) que é idênti- ca à sequência genômica 5'. O líder e as partes do corpo dos RNAs subgenômicos são conectados por uma sequência conservada deno- minada sequência reguladora da transcrição (TRS). A TRS é encon- trada na extremidade 3' do líder (TRS do líder), assim como nas regi- ões promotoras subgenômicas localizadas a montante de cada gene da proteína estrutural (TRS do corpo). Os RNAs subgenômicos são gerados à medida que o RNA intermediário de replicação de cadeia negativa é transcrito. Quando a transcrição ocorre, o complexo de re- plicação pausa quando se trata de cada TRS do corpo e, em seguida, o RNA de fita negativa nascente se associa à TRS do líder de fita posi- tiva complementar, onde a transcrição de RNA de fita negativa conti- nua. Esse mecanismo de transcrição descontínua resulta em RNA subgenômico com sequências conservadas em EAV 5' e 3. Os RNAs subgenômicos da fita negativa tornam-se o modelo para a produção do mRNA de sentido positivo subgenômico.

[0095] Clones infecciosos de cDNA, representando todo o genoma do EAV, foram relatados van Dinten 1997; de Vries et a/l., 2000, 2001; Glaser et al., 1999) e foram utilizados para estudar a replicação e transcrição do RNA do EAV por quase duas décadas (van Marle 1999, van Marle 1999a, Molenkamp 2000, Molenkamp 2000a, Pasternak 2000, Tijms 2001, Pasternak 2001, Pasternak 2003, Pasternak 2004, van den Born 2005, Beerens & Snijder 2007, Tijms 2007, Kasteren 2013). Além disso, os clones infecciosos foram gerados os quais con- têm o gene da cloranfenicol acetiltransferase (CAT) inserido no lugar da ORF2 e ORF7 e a proteína CAT mostrou-se expressa em células submetidas à eletroporação com esses RNAs (van Dinten 1997, van Marle 1999). As modificações do clone infeccioso por meio da muta- gênese direcionada ao local e supressão das regiões gênicas das pro- teínas estruturais foram utilizadas para determinar a necessidade de cada gene estrutural em suporte à replicação do RNA (Molenkamp 2000). O estudo relatado por Molenkamp 2000 concluiu que os genes estruturais não são necessários para sustentar a replicação do RNA. À análise dos requisitos de homologia de sequência para a atividade TRS na produção de RNA subgenômico foi conduzida e utilizada para melhor definir como a transcrição descontínua ocorre mecanicamente (van Marle 1999, Pasternak 2000, Pasternak 2001, Pasternak 2003, van den Born 2005) e RNAs interferentes defeituosos foram utilizados para compreender as sequências genômicas mínimas necessárias pa- ra a replicação e acondicionamento de RNA em partículas virais (Mo- lenkamp 2000a). Mais informações a este respeito podem ser encon- tradas, por exemplo, no Pedido de Patente U.S. 15/486131, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

[0096] Em algumas modalidades aqui divulgadas, o pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma es- pécie de Arterivirus.

As espécies de Arterivirus adequadas incluem o vírus da arterite equina (EAV), o vírus da síndrome respiratória e re- produtiva suína (PRRSV), o vírus da elevação de lactato desidroge- nase (LDV), o vírus da febre hemorrágica símia (SHFV) e o vírus da doença do gambá instável (WPDV). Em algumas modalidades divul- gadas nesta invenção, o pelo menos um dos primeiro e segundo repli- cons de RNA é derivado de uma espécie de Arterivirus selecionada do grupo que consiste no vírus da arterite equina (EAV), vírus da síndro- me respiratória e reprodutiva suína (PRRSV), vírus da elevação de lac- tato desidrogenase ( LDV) e vírus da febre hemorrágica símia (SHFV). Em algumas modalidades, o replicon de RNA do Arterivirus é derivado de um vírus de arterite equina (EAV). As cepas de Arterivirus virulen- tas e não virulentas são ambas adequadas.

Exemplos não limitativos de cepas de Arterivirus preferidas incluem, mas não são limitados a estes, cepa de Bucyrus (VBS) virulenta ao EAV, LDV-Plagemann, LDV-C, tipo 1 do PRRSV e tipo 2 do PRRSV.

As cepas de EAV prefe- ridas exemplares incluem, mas não são limitadas a estas, EAV VB53, EAV ATCC VR-796, EAV HK25, EAV HK116, EAV ARVAC MLV, cepa de EAV Bucyrus (Ohio), EAV Bucyrus modificado, cepa não virulenta CAS95, Red Mile (Kentucky), 84KY-A1 (Kentucky), Wroclaw-2 (Poland), Bibuna (Switzerland) e Vienna (Australia). Exemplos preferidos não limitativos de cepas PRRSV incluem PRRSV LV4.2.1, PRRSV 16244B, PRRSV HB-1(sh)/2002, PRRSV HB-2(sh)/2002, PRRSV HN1, PRRSV SD 01-08, PRRSV SDO0802, PRRSV SDO0803, PRRSV VR2332. Exemplos preferidos não limitativos de cepas de SHFV e va- riantes incluem variantes de SHFV SHFV-krtgia e -krtg1b (SHFV- krtg1a/b)) SHFVkrtg2a/b (GenBank accession À JX473847 a JX473850), SHFV-LVR, a variante do protótipo de SHFV LVR 42-

O/M6941 (NC 003092), SHFV-krc1 e SHFVkrc2 de colobo vermelho Kibale (HQ845737 e HQ845738, respectivamente). Outros exemplos não limitativos de Arteriviruses preferidos incluem PRRSV-Lelystad, a cepa do tipo Europeu (tipo 1) (M96262); PRRSVVR2332, a cepa do tipo da América do Norte (tipo 2) (U87392) EAV-Bucyrus (NC 002532); EAV-s3685 (GQ903794); LDV-P, a cepa Plagemann (U15146); e LDV-C, a cepa neurovirulenta tipo C (L13298).

[0097] [097] Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo re- plicons de RNA são derivados da mesma espécie de Arterivirus ou de duas espécies diferentes de Arterivirus. Em algumas modalidades, o primeiro replicon de RNA é derivado de um Arterivirus e o segundo replicon de RNA é derivado de uma espécie não Arterivirus. Em algu- mas modalidades, o primeiro replicon de RNA é derivado de um Arteri- virus e o segundo replicon de RNA é derivado de um Alphavirus. Em algumas modalidades, o primeiro replicon de RNA é um replicon de RNA não modificado derivado de uma espécie de Arterivirus. Em al- gumas modalidades, o primeiro replicon de RNA é um replicon de RNA modificado derivado de uma espécie de Arterivirus.

[0098] Em algumas modalidades divulgadas nesta invenção, o primeiro replicon de RNA é um replicon de RNA derivado de uma es- pécie de Alphavirus e o segundo replicon de RNA é um replicon de RNA derivado de uma espécie de Arterivirus. Em certas modalidades, o primeiro replicon de RNA é um replicon de RNA não modificado deri- vado de uma espécie de Alphavirus. Em outras modalidades, o primei- ro replicon de RNA é um replicon de RNA modificado derivado de uma espécie de Alphavirus.

[0099] Em algumas modalidades aqui divulgadas, os métodos da presente invenção incluem ainda uma ou mais administrações de re- forço subsequentes. Em algumas modalidades, os métodos da presen- te invenção ainda incluem pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4,

pelo menos 5 ou pelo menos 10 administrações de reforço consecuti- vas ou qualquer número de administração entre estas. Em algumas modalidades, as administrações de reforço subsequentes são execu- tadas em dosagens gradualmente crescentes ao longo do tempo. Em algumas modalidades, as administrações de reforço subsequentes são executadas em doses gradualmente decrescentes ao longo do tempo.

[00100] Em algumas modalidades, uma ou mais da composição de início e a composição de reforço compreendem ainda um veículo far- maceuticamente aceitável. Como aqui utilizado, o termo "veículo far- maceuticamente aceitável" significa um veículo que é útil na prepara- ção de uma composição ou formulação farmacêutica que é geralmente segura, não tóxica e nem biologicamente nem de outra maneira inde- sejável, e inclui um veículo que é aceitável para uso veterinário assim como para uso farmacêutico humano. Em algumas modalidades, um veículo farmaceuticamente aceitável é tão simples quanto a água, mas também pode incluir, por exemplo, uma solução de concentração de soro fisiológico ou solução salina. Também pode ser uma nanopartícu- la lipídica. Os materiais adequados incluem dendrímeros de poliami- doamina (PAMAM) c12 e/ou 1,2-dimiristoiil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina-N-[metóxi(polietileno glicol)-2000]. Dendrímeros de polietilenoimina (PEI) e/ou G5 e G9 NH2 PAMAM também podem ser utilizados. Em algumas modalidades, um veículo farmaceuticamente aceitável pode ser, ou incluir, estabilizantes, diluentes e tampões. Os estabilizantes adequados são, por exemplo, SPGA, carboidratos (tal como leite em pó, albumina sérica ou caseína) ou seus produtos de degradação. Tampões adequados são, por exemplo, fosfatos de me- tais alcalinos. Os diluentes incluem água, tampões aquosos (tais como solução salina tamponada), álcoois e polióis (tais como glicerol). Para administração a animais ou seres humanos, a composição de acordo com o presente pedido pode ser dada, inter alia, por via parenteral, por via intranasal, através de pulverização, por via intradérmica, por via subcutânea, por via oral, através de aerossol ou por via intramuscular.

[00101] Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo replicons de RNA compreendem pelo menos um cassete de expressão compre- endendo um promotor ligado de maneira operável a uma sequência de codificação para um gene de interesse (GOI). Como aqui utilizado, o termo "cassete de expressão" refere-se a uma construção de material genético que contém sequências de codificação para uma proteína ou RNA funcional ligado de maneira operável a elementos de controle de expressão, tais como um promotor, com informações regulatórias sufi- cientes para direcionar a transcrição e/ou translação apropriada das sequências de codificação em uma célula receptora, in vivo e/ou ex vivo.

[00102] O termo "ligado de maneira operável", como aqui utilizado, significa uma ligação funcional entre duas ou mais sequências. Por exemplo, uma ligação operável entre um polinucleotídeo de interesse e uma sequência reguladora (por exemplo, um promotor) é uma cone- xão funcional que permite a expressão do polinucleotídeo de interesse. Nesse sentido, o termo "ligado de maneira operável" refere-se ao po- sicionamento de uma região reguladora e uma sequência de codifica- ção a ser transcrita, de modo que a região reguladora seja eficaz para regular a transcrição ou translação da sequência de codificação de in- teresse. Em algumas modalidades divulgadas nesta invenção, o termo "ligado de maneira operável" significa uma configuração na qual uma sequência reguladora é colocada em uma posição apropriada em rela- ção a uma sequência que codifica um polipeptídeo ou RNA funcional, de tal modo que a sequência de controle direcione ou regule a expres- são ou localização celular do mMRNA que codifica o polipeptídeo, do polipeptídeo e/ou do RNA funcional. Assim, um promotor está em liga- ção gênica operável com uma sequência de ácido nucleico se puder mediar a transcrição da sequência de ácido nucleico. Os elementos ligados de maneira operável podem ser contíguos ou não contíguos.

[00103] As técnicas para ligar de maneira operável duas ou mais sequências de DNA entre si são conhecidas de uma pessoa de habili- dade na técnica, e essas técnicas foram descritas em vários textos pa- ra manipulação biológica molecular padrão (ver, por exemplo, Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; e Gibson et al., Nature Methods 6:343-45, 2009).

[00104] Em algumas modalidades divulgadas nesta invenção, os replicons de RNA aqui divulgados podem incluir mais de um cassete de expressão. Em princípio, os replicons de RNA aqui divulgados po- dem geralmente incluir qualquer número de cassetes de expressão. Em algumas modalidades particulares, os replicons de RNA compre- endem pelo menos dois, três, quatro, cinco ou seis cassetes de ex- pressão. Em algumas modalidades, pelo menos um dos um ou mais cassetes de expressão está de maneira operável posicionado a jusan- te de uma sequência reguladora da transcrição (TRS) de um replicon de RNA de Arterivirus, em que a TRS é selecionada do grupo que consiste em TRS1, TRS2, TRS3, TRS4, TRS5, TRS6 e TRS7. Em al- gumas modalidades particulares, pelo menos um dos um ou mais cas- setes de expressão está de maneira operável posicionado a jusante do TRS7 de um replicon de RNA de Arterivirus.

[00105] Em algumas modalidades, a sequência de codificação do GOI é otimizada para expressão em um nível superior ao nível de ex- pressão de uma sequência de codificação de referência. Em algumas modalidades, a sequência de codificação de referência é uma sequên- cia que não foi otimizada. Em algumas modalidades, a otimização da sequência de codificação de GOI pode incluir a otimização de códon. Em relação à otimização de códons de sequências de nucleotídeo, a degenerescência do código genético fornece a possibilidade de substi- tuir pelo menos uma base da sequência de codificação da proteína de um gene por uma base diferente sem fazer com que a sequência de aminoácido do polipeptídeo produzido a partir do gene seja alterado. Portanto, os polinucleotídeos do presente pedido também podem ter qualquer sequência de bases que tenha sido alterada de qualquer se- quência de polinucleotídeo aqui descrita através da substituição de acordo com a degeneração do código genético. As referências que descrevem o uso do códon são facilmente disponíveis ao público. Em algumas modalidades adicionais da presente invenção, variantes da sequência de polinucleotídeo podem ser produzidas por uma varieda- de de motivos, por exemplo, para otimizar a expressão de códons para um hospedeiro particular (por exemplo, alteração de códons no MRNA do Arterivirus para aqueles preferidos por outros organismos, tais co- mo ser humano, hamster, camundongos ou macacos).

[00106] Em algumas modalidades divulgadas nesta invenção, o GOI pode codificar uma sequência de aminoácido de um polipeptídeo. O polipeptídeo pode de uma forma geral ser qualquer polipeptídeo e pode ser, por exemplo, um polipeptídeo terapêutico, um polipeptídeo profilático, um polipeptídeo de diagnóstico, um polipeptídeo nutracêuti- co, uma enzima industrial e um polipeptídeo repórter. Em algumas modalidades, o GOI codifica um polipeptídeo selecionado do grupo que consiste em um anticorpo, um antígeno, um modulador imunológi- co e uma citocina. Em algumas modalidades, o GOI codifica um poli- peptídeo selecionado do grupo que consiste em um polipeptídeo tera- pêutico, um polipeptídeo profilático, um polipeptídeo de diagnóstico, um polipeptídeo nutracêutico, uma enzima industrial e um polipeptídeo repórter.

[00107] Em algumas modalidades, os replicons de RNA aqui divul- gados compreendem ainda uma sequência de codificação para um sítio de clivagem proteolítico ligado de maneira operável a jusante à terceira sequência de nucleotídeo e a montante da sequência de codi- ficação para o GOI.

Geralmente, qualquer sítio de clivagem proteolítico conhecido na técnica pode ser incorporado nos polinucleotídeos e re- plicons de RNA da divulgação e pode ser, por exemplo, sequências de clivagem proteolítica que são clivadas após a produção por uma pro- tease.

Outros sítios de clivagem proteolíticos adequados também in- cluem sequências de clivagem proteolíticas que podem ser clivadas após a adição de uma protease externa.

Em algumas modalidades, os replicons de RNA aqui divulgados compreendem ainda uma sequência de codificação para um peptídeo de autoprotease ligado de maneira operável a jusante da terceira sequência de nucleotídeo e a montante da sequência de codificação para o GOI.

Como aqui utilizado, o termo "autoprotease" refere-se a um peptídeo de "autoclivagem" que possui atividade autoproteolítica e é capaz de se separar de uma fração poli- peptídica maior.

Identificadas pela primeira vez no vírus da febre afto- sa (FMDV), que é um membro do grupo dos picornavírus, várias auto- proteases foram subsequentemente identificadas tais como, por exemplo, peptídeos "tipo 2A" do vírus da rinite equina A (E2A), o tes- chovirus-1 suíno (P2A) e o vírus Thosea asigna (T2A), e suas ativida- des na clivagem proteolítica, foram demonstrados em vários sistemas eucarióticos in vitro e in vivo.

Como tal, o conceito de autoproteases está disponível para uma pessoa de habilidade na técnica, com muitos sistemas de autoprotease de ocorrência natural tendo sido identifica- dos.

Os sistemas de autoprotease bem estudados incluem, mas não são limitados a estes, proteases virais, proteínas de desenvolvimento (por exemplo, HetR, proteínas Hedgehog), domínio de autoprotease RumA (UmuD, etc.). Exemplos não limitativos de peptídeos de auto- protease adequados para as composições e métodos da presente in- venção incluem as sequências de peptídeo do teschovirus-1 2A suíno

(P2A), um vírus da febre aftosa (FMDV) 2A (F2A), um vírus da rinite equina A (ERAV) 2A (E2A), um vírus de Thosea asigna 2A (T2A), um vírus de poliedrose citoplasmático 2a (BMCPV2A), um vírus de Flache- rie 2A (BmMIFV2A) ou uma combinação dos mesmos.

COMPOSIÇÕES DA DESCRIÇÃO

[00108] Algumas modalidades aqui divulgadas referem-se a uma composição que inclui: uma composição de início que compreende um primeiro replicon de RNA que codifica um primeiro antígeno; e uma composição de reforço que compreende um segundo replicon de RNA que codifica um segundo antígeno, em que o primeiro e o segundo re- plicons de RNA são diferentes um do outro. Em algumas modalidades, as sequências de aminoácido do primeiro e do segundo antígenos são homólogas entre si. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo antígenos são idênticos entre si. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo antígenos compreendem pelo menos um determinante antigênico reativo cruzado. Em algumas modalidades, a composição é para induzir uma resposta imune em um indivíduo. Em algumas moda- lidades, o primeiro e o segundo antígenos induzem substancialmente a mesma resposta imune no indivíduo. A composição pode ser, por exemplo, uma composição profilática ou uma composição farmacêuti- ca compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável, ou uma mistura dos mesmos. Em algumas modalidades, as composições do presente pedido podem ser utilizadas como uma vacina.

[00109] Algumas modalidades divulgadas nesta invenção referem- se a uma composição que inclui: uma primeira sequência de ácido nu- cleico que codifica um primeiro replicon de RNA que codifica um pri- meiro antígeno; e uma segunda sequência de ácido nucleico que codi- fica um segundo replicon de RNA que codifica um segundo antígeno, em que o primeiro e o segundo replicons de RNA são diferentes um do outro, em que o primeiro replicon e o segundo replicon compreendem pelo menos uma cassete de expressão compreendendo um promotor ligado de maneira operável a uma sequência de codificação para uma molécula de interesse. Em algumas modalidades, as sequências de aminoácido do primeiro e do segundo antígenos são homólogas entre si. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo antígenos são idênticos entre si. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo antígenos compreendem pelo menos um determinante antigênico rea- tivo cruzado. Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido do primeiro antígeno apresenta pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácido do segundo antígeno. Em algumas modalidades, a com- posição é para a produção de uma molécula de interesse. Em algumas modalidades, a molécula de interesse é um polipeptídeo. O polipeptí- deo pode geralmente ser qualquer polipeptídeo e pode ser, por exem- plo, um polipeptídeo terapêutico, um polipeptídeo profilático, um poli- peptídeo de diagnóstico, um polipeptídeo nutracêutico, uma enzima industrial e um polipeptídeo repórter. Em algumas modalidades, a mo- lécula de interesse é um polipeptídeo selecionado do grupo que con- siste em um anticorpo, um antígeno, um modulador imunológico e uma citocina. Em algumas modalidades, a molécula de interesse é um poli- peptídeo selecionado do grupo que consiste em um polipeptídeo tera- pêutico, um polipeptídeo profilático, um polipeptídeo de diagnóstico, um polipeptídeo nutracêutico, uma enzima industrial e um polipeptídeo repórter.

MÉTODOS PARA A PRODUÇÃO DE MOLÉCULAS DE INTERESSE

[00110] As composições e métodos da presente invenção podem ser utilizados para produzir (por exemplo, expressar) uma molécula de interesse tal como, por exemplo, um polipeptídeo, codificado em uma estrutura de leitura aberta de um gene de interesse (GOI) como aqui divulgado. Assim, o presente pedido fornece ainda composições e mé-

todos para a produção de uma molécula de interesse tal como, por exemplo, um polipeptídeo. Mais informações a este respeito podem ser encontradas, por exemplo, nos Pedidos de Patente U.S. Nos. 15/486131; 15/723658 e 15/831.230.

[00111] —Consequentemente, algumas modalidades se referem a métodos para a produção de um polipeptídeo de interesse em um indi- víduo, incluindo a administração sequencial ao indivíduo do primeiro e do segundo replicons de RNA de acordo com qualquer um dos aspec- tos e modalidades.

[00112] Os métodos e composições aqui divulgados podem ser uti- lizados, por exemplo, em questões que são importantes ou de interes- se para a aquicultura, agricultura, pecuária e/ou para aplicações tera- pêuticas e medicinais, incluindo a produção de polipeptídeos utilizados na fabricação de vacinas, produtos farmacêuticos, produtos industriais, produtos químicos e similares. Em algumas modalidades, as composi- ções e métodos aqui divulgados podem ser utilizados com indivíduos que são hospedeiros naturais de Alphaviruses, tais como roedores, ratos, peixes, pássaros e mamíferos maiores, tais como seres huma- nos, cavalos, porco, macaco e chipanzés, assim como invertebrados. Espécies particularmente preferidas, em algumas modalidades do pe- dido, são espécies de animais vertebrados e espécies de animais in- vertebrados. Em princípio, qualquer espécie animal pode ser de uma forma geral utilizada e pode ser, por exemplo, espécies de mamífero tais como ser humano, cavalo, porco, primata, camundongo, furão, ra- to, rato de algodão, gado, suíno, ovelha, coelho, gato, cachorro, cabra, asno, hamster ou búfalo. Em algumas modalidades, o indivíduo é uma espécie aviária, uma espécie de crustáceo ou uma espécie de peixe. Em algumas modalidades, a espécie aviária é uma espécie aviária pa- ra consumo alimentar. Exemplos não limitativos de espécies aviárias adequadas incluem frango, pato, ganso, peru, avestruz, ema, codorna,

pombo, cisne, pavão, faisão, perdiz e galinha da angola. O termo "crustáceo" como aqui utilizado inclui todas as espécies de crustáceos, por exemplo, aquelas comumente referidas como "camarão", "lagosta", "lagostim" e "caranguejo", tais como Penaeus, Litopenaeus, Marsupe- naeus, Fenneropenaeus e Farfantepenaeus. Em algumas modalida- des, as espécies de crustáceo são espécies de camarão, particular- mente aquelas que são criadas na aquicultura tais como Litopenaeus vannamei, Penaeus vannamei, Penaeus styllirostris, Penaeus mono- don, Pandalus borealis, Acetes japonicas, Trachysalambria curvirostris e Fenneropenaeus chinensis. Em algumas modalidades, os peixes são peixes ornamentais ou espécies de peixe utilizadas na aquicultura pa- ra consumo, tais como enguia, salmão, truta, carpa, peixe-gato, robalo e tilápia. Em algumas modalidades, as espécies de peixe estão na fa- mília Salmonidae.

[00113] Técnicas para transformar ou transfectar uma ampla varie- dade dos indivíduos acima mencionados que são conhecidas na espe- cialidade e descritas na literatura técnica e científica.

[00114] Todas as publicações e pedidos de patente mencionados nesta invenção são aqui incorporados por referência na mesma medi- da como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse es- pecífico e individualmente indicado para ser incorporado por referên- cia.

[00115] Será claramente entendido que, embora várias fontes de informação, incluindo artigos de periódicos científicos, documentos de patentes e livros didáticos, sejam referidas nesta invenção; esta refe- rência não constitui uma admissão de que qualquer um desses docu- mentos faça parte do conhecimento geral comum na técnica.

[00116] O debate dos métodos gerais aqui apresentados destina-se apenas para propósitos ilustrativos. Outros métodos e opções alterna- tivos serão evidentes para aqueles de habilidade na técnica após a revisão desta invenção e devem ser incluídos dentro do espírito e campo de ação deste pedido.

EXEMPLOS

[00117] Alternativas adicionais são divulgadas com mais detalhes nos exemplos que se seguem, que não têm a intenção de limitar o es- copo das reivindicações. EXEMPLO 1 AUMENTO DA RESPOSTA IMUNE APÓS O INÍCIO-REFORÇO HE-

TERÓLOGO UTILIZANDO DIFERENTES REPLICONS DE RNA

[00118] Este exemplo resume as experiências que ilustram a indu- ção de uma resposta imune após a imunização heteróloga de início- reforço executada com replicons de RNA que ativam o sistema imuno- lógico de um indivíduo através de mecanismos imunologicamente dis- tintos. Como descrito acima, acredita-se que a imunização heteróloga de início-reforço gere respostas imunes intensificadas através de (1) evitar a imunidade antivetor e (2) ativação diferencial e sinérgica da resposta imune. Embora os cronogramas heterólogos de início-reforço demonstrem eficácia utilizando plataformas distintas para liberação, essa abordagem não está disponível no planejamento racional dos re- plicons. Até o momento, os replicons que envolvem diferencialmente o sistema imunológico não foram empregados para melhorar as respos- tas das células T ou B. Além disso, o uso de dois sistemas distintos para evitar respostas antivetoriais contra os replicons que codificam uma proteína terapêutica não foi anteriormente possível como um mé- todo para inensificar a magnitude ou durabilidade da expressão da proteína.

[00119] É aqui descrito o uso de dois sistemas de replicon totalmen- te sintéticos diferentes como um meio de intensificar a resposta imune em um formato de início-reforço heterólogo. Embora o uso de dois sis- temas diferentes para o início-reforço heterólogo tenha sido eficaz pa-

ra outras vacinas devido à prevenção da imunidade antivetor e ativa- ção diferencial do sistema imunológico, isso anteriormente não era possível ou demonstrado o uso de replicons. As razões para isso são duplas. Primeiro, os replicons de Alphavirus são o único sistema de replicons atualmente disponível em uso, e a nova engenharia do EAV permitiu esse método de imunização ou administração de proteínas. Em segundo lugar, a falta de planejamento racional dentro da mesma família viral para alterar significativamente o mecanismo de ativação imune entre dois replicons diferentes para conduzir respostas imunes diferenciais em um formato heterólogo de início-reforço não foi de- monstrada.

[00120] Nas experiências descritas neste Exemplo, os replicons de RNA derivados de dois vírus diferentes: um vírus de arterite (vírus de arterite equina - EAV) e um alfavírus (vírus da encefalite equina vene- zuelana - VEEV) foram utilizados como representante da abordagem de início-reforço por replicon de RNA heterólogo. Os replicons de RNA recombinantes baseados em EAV e em VEEV foram projetados e sub- sequentemente utilizados para vacinar camundongos em um regime de vacinação heterólogo de início-reforço. Conforme descrito co maio- res detalhes abaixo, esses replicons de RNA recombinantes foram tes- tados in vivo em modelos de camundongo e demonstraram uma res- posta imune diferenciada e intensificada em comparação com animais de controle que recebem um regime de início-reforço homólogo. Por exemplo, o Requerente demonstrou em formulações de solução salina que um regime de início-reforço heterólogo produz uma resposta supe- rior das células T após uma etapa de reforço quando comparado com a imunização de EAV-EAV ou imunização de VEEV-VEEV utilizando um antígeno de hemaglutinina (HA) derivado da cepa de Influenza AlVietnam/1203/2003 (HSN1).

[00121] Para analisar o efeito de início-reforços heterólogos na imunogenicidade dos replicons, os camundongos foram imunizados com combinações de replicon de EAV ou replicon de VEE contendo uma sequência Downstream LooP (ou motivo DLP). Cada replicon in- clui sequências de codificação para hemaglutinina (HA) da Influenza AlVietnam/1203/2004 (H5N1). Nessas experiências, camundongos BALB/c foram imunizados com uma dose de 15 ug formulada em solu- ção salina e injectados por via intramuscular em intervalos de 4 sema- nas. Quatorze dias após a injeção final, o baço e o soro foram coleta- dos para analisar as respostas imunes à HA. Um resumo dos resulta- dos dessas experiências é apresentado na Figura 2A-2B.

[00122] Como mostrado na Figura 2A, os esplenócitos foram esti- mulados com epítopo de célula T conservado (H-2 Kd: INYNSTVASSL; SEQ ID NO: 1) e revelaram um aumento significativo nas células T CD8+ secretoras de IFN-y no grupo que recebeu um regime de início- reforço heterólogo, em que a composição de início inclui um replicon de EAV e a composição de reforço inclui um replicon de VEEV, quan- do comparado ao grupo iniciado de forma homóloga ou ao grupo de dose única.

[00123] A observação acima difere dos animais que receberam um regime de início-reforço heterólogo, em que a composição de início incluía um replicon de VEEV e a composição de reforço incluía um re- plicon de EAV, demonstrando os efeitos diferenciais de um regime de início-reforço em comparação com um regime de início-reforço homó- logo. Sem estar limitado por qualquer teoria em particular, uma expli- cação possível para o aumento da resposta das células T CD8+ no grupo de administração de EAV-VEEV heterólogo versus o grupo de VEEV-VEEV homólogo é uma imunidade antivetor diminuída das pro- teínas virais não estruturais codificadas pelo replicon. Como debatido acima, a imunidade antivetor resultaria em uma eliminação mais rápida das células que expressam o replicon e, portanto, resultaria em restri-

ção do antígeno expresso no momento do reforço.

[00124] Os dados apresentados acima também sugerem que a or- dem de administração de cada replicon possui um efeito nas respostas das células T geradas. Especificamente, um esquema de início-reforço heterólogo com um replicon baseado em VEEV seguido em primeiro lugar por um replicon baseado em EAV não gerou a mesma frequência de células T CD8+ específicas para o antígeno IFNy+ do que um regi- me de início-reforço heterólogo com um início de EAV seguido em primeiro lugar por um reforço de VEEV. De acordo com a observação acima, a ordem de administração também demonstrou fornecer res- postas diferenciais de células T em outros sistemas de modelo de va- cinas heterólogos de início-reforço. Por exemplo, para proteção contra a malária utilizando vetores virais, o início com um vetor baseado em adenovírus que codifica o antígeno da malária ME.TRAP, seguido de um reforço com um vetor modificado à base de Vaccinia Ankara que codifica o mesmo antígeno, resultou em melhores respostas de memó- ria de células T e proteção aprimorada do que a ordem inversa de ad- ministração.

[00125] Como mostrado na Figura 2B, as respostas de células B em vários regimes heterólogos de início-reforço também foram exami- nadas. O soro dos animais foi coletado aos catorze (14) dias após a injeção final e avaliado quanto às respostas de IgG totais específicas da HA. Em contraste com as respostas elevadas de células T CD8+, as respostas de células B de animais que receberam um regime hete- rólogo de início-reforço de EAV-VEEV apresentaram um nível marginal e ligeiramente reduzido de IgG total específica de antígeno quando comparado com o grupo de regime homólogo de VEEV-VEEV. No en- tanto, as respostas de células B observadas em ambos os grupos he- terólogos de início-reforço (isto é, EAV-VEEV e VEEV-EAV) foram sig- nificativamente maiores do que os animais que receberam uma dose única. Deste modo, o início-reforço heterólogo pode ser utilizado para obter respostas de células B com respostas de células T CD8+ efeto- ras significativamente melhoradas.

[00126] Foiinesperado que as respostas de células T 14 dias após o reforço fossem melhoradas utilizando dois replicons diferentes em contraste com um regime homólogo de início-reforço. No entanto, quaisquer diferenças nas respostas imunes foram conceitualmente inesperadas, visto que isso não foi tentado anteriormente. Especifi- camente, foi inesperado que um replicon de VEEV de início seguido de um replicon de EAV de reforço produzisse uma resposta de célu- las T inferior para um replicon de EAV de início e um replicon de VEEV de reforço. Além disso, também foi inesperado que o início- reforço heterólogo intensificasse as respostas de células Te B quando comparado com um início-reforço homólogo do replicon de EAV-EAV, mas apenas respostas superiores das células T quando comparado com um início-reforço homólogo do replicon de VEEV- VEEV. Finalmente, em contraste com outras demonstrações de iní- cio-reforços heterólogos, a observação de que mMRNAs capazes de autoamplificação, que são quimicamente semelhantes, poderia afe- tar diferencialmente as respostas imunes a jusante após a adminis- tração também é inesperada.

[00127] Em particular, uma vez que uma imunização inicial com um replicon baseado em EAV seguido de uma imunização de reforço com um replicon baseado em Alphavirus demonstrou as melhores respos- tas de células T, experiências adicionais também são executadas para iniciar o sistema imune com um replicon baseado em EAV seguido por uma imunização de reforço utilizando cada um dos replicons baseados em Alphavirus listados abaixo na Tabela 1. TABELA 1: Combinações exemplares não limitativas de regimes de início-reforço heterólogos da presente invenção.

[res eo A ; Mutante de ponto nt2 do replicon de Replicon de EAV Alphavirus* 2 Mutante de ponto nt2 do replicon de Replicon de EAV Alphavirus 3 Replicon de Alphavirus contendo o | Mutante de ponto nt2 do replicon de motivo de DLP Alphavirus 4 Mutante de ponto nt2 do replicon de | Replicon de Alphavirus contendo o Alphavirus motivo de DLP ; Replicon de Alphavirus variante de | 5 Replicon de EAV CHIKV nsP3 : Replicon de Alphavirus variante de 16 | replicon de EAV SINV nsP3 : Alphavirus variante do promotor de replicon de EAV RRV 268 : Alphavirus variante do promotor de 16 | replicon de EAV SINV 268 Replicon de Alphavirus contendo | Replicon de Alphavirus variante de motivo de DLP CHIKV nsP3 Replicon de Alphavirus contendo | Replicon de Alphavirus variante de motivo de DLP SINV nsP3 "1 Replicon de Alphavirus variante de | Replicon de Alphavirus contendo CHIKV nsP3 motivo de DLP 12 Replicon de Alphavirus variante de | Replicon de Alphavirus contendo SINV nsP3 motivo de DLP 13 Alphavirus variante do promotor de | Replicon de Alphavirus contendo RRV 26S motivo de DLP 14 Replicon de Alphavirus contendo | Alphavirus variante do promotor de motivo de DLP RRV 26S Alphavirus variante do promotor de | Replicon de Alphavirus contendo SINV 26S motivo de DLP 16 Replicon de Alphavirus contendo | Alphavirus variante do promotor de motivo de DLP SINV 26S : " Replicon de Alphavirus contendo Replicon de Alphavirus de WT motivo de DLP Replicon de Alphavirus contendo ; motivo de DLP Replicon de Alphavirus de WT * replicon de Alphavirus compreendendo uma 5'-UTR modificada com uma substi- tuição de nucleotídeo na posição 2. ** Replicon de Alphavirus do tipo selvagem / não modificado.

[00128] Experiências adicionais também são executadas para de- monstrar o seguinte: (1) superioridade das respostas imunes de EAV-

VEEV ou VEEV-EAV, em formulações de solução salina ou de LNP (nanopartícula lipídica catiônica), (2) superioridade de dois replicons de VEEV com mecanismos imunológicos de ativação imune e (3) su- perioridade do início-reforço heterólogo em um ambiente terapêutico.

[00129] Embora alternativas particulares da presente invenção te- nham sido divulgadas, deve-se entender que várias modificações e combinações são possíveis e são contempladas dentro do verdadeiro espírito e escopo das reivindicações anexas. Portanto, não há inten- ção de limitar o resumo exato e a divulgação aqui apresentados.

[00130] Embora a invenção tenha sido descrita com referência aos exemplos acima, ficará entendido que modificações e variações estão incluídas no espírito e escopo da invenção. Consequentemente, a in- venção é limitada apenas pelas reivindicações que se seguem.

Claims (33)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para a indução de uma resposta imune em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar ao indivíduo pelo menos uma dose de uma composição de início compreendendo um primeiro replicon de RNA que codifica um primeiro antígeno; e administrar subsequentemente ao indivíduo pelo menos uma dose de uma composição de reforço compreendendo um segun- do replicon de RNA que codifica um segundo antígeno, em que o primeiro e o segundo replicons de RNA são dife- rentes um do outro.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o primeiro e o segundo antígenos compreendem pelo menos um determinante antigênico reativo cruzado.

3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro replicon de RNA ativa um sistema imune do indivíduo através de pelo menos um mecanismo imunológico que é diferente de um mecanismo imunológico pelo qual o segundo replicon de RNA ativa o sistema imune.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de um vírus de RNA de fita posi- tiva.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA é derivado de uma espécie de vírus per- tencente a uma família selecionada do grupo que consiste na família Togaviridae, família Flaviviridae, família Orthomyxoviridae, família Rhabdoviridae, família Arteroviridae, família Picornaviridae, família As- troviridae, família Coronaviridae e família Paramyxoviridae.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a5, caracterizado pelo fato de que o primeiro replicon de RNA é de- rivado de um não Alphavirus e o segundo replicon de RNA é derivado de uma espécie Alphavirus.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a6, caracterizado pelo fato de que o primeiro replicon de RNA é de- rivado de um Arteríivirus.

8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o segundo replicon de RNA é de- rivado de uma espécie Alphavirus selecionada do grupo que consiste no vírus da encefalite equina oriental (EEEV), vírus da encefalite equi- na venezuelana (VEEV), vírus Everglades (EVEV), vírus Mucambo (MUCV), vírus Semliki Forest (SFV), vírus Pixuna (PIXV), vírus Mid- dleburg (MIDV), vírus Chikungunya (CHIKV), vírus O'Nyong-Nyong (ONNV ), vírus Ross River (RRV), vírus Barmah Forest (BF), vírus Ge- tah (GET), vírus Sagiyama (SAGV), vírus Bebaru (BEBV), vírus Maya- ro (MAYV), vírus Una (UNAV), vírus Sindbis (SINV), vírus Aura (AU- RAV), vírus Whataroa (WHAV), vírus Babanki (BABV), vírus Kyzyla- gach (KYZV), vírus da encefalite equina ocidental (WEEV), vírus Highland J (HJV), vírus Fort Morgan (FMV), vírus Ndumu (NDUV), al- favírus Salmonid (SAV) e vírus Buggy Creek (BCRV).

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o segundo replicon de RNA é de- rivado de uma espécie de Arterivirus selecionada do grupo que consis- te em: vírus da arterite equina (EAV), vírus da síndrome reprodutiva e respiratória suína (PRRSV), vírus de elevação da lactato desidroge- nase (LDV) de camundongos, vírus da febre hemorrágica símia (SHFV) e vírus da doença do gambá instável (WPDV).

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos primeiro e segundo replicons de RNA compreende uma 5'-UTR modificada com uma ou mais substituições de nucleotídeo na posição 1, 2, 4, ou uma combinação dos mesmos.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracteriza- do pelo fato de que pelo menos uma das uma ou mais substituições nucleotídicas é uma substituição nucleotídica na posição 2 da 5-UTR modificada.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracteriza- do pelo fato de que a substituição nucleotídica na posição 2 da 5-UTR modificada é uma substituição UG.

13. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos primei- ro e segundo replicons de RNA é um replicon de RNA modificado compreendendo uma 5'-UTR modificada e é desprovido de pelo me- nos uma parte de uma sequência de ácido nucleico que codifica uma ou mais proteínas estruturais virais.

14. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 13, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos primei- ro e segundo replicons de RNA é um replicon de Alphavirus modifica- do que compreende uma ou mais alças penduculares de RNA em um elemento estrutural de um intensificador de capsídeo viral ou uma va- riante do mesmo.

15. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um dos pri- meiro e segundo replicons de RNA é um replicon de Alphavirus modifi- cado que compreende uma sequência de codificação para uma proteí- na não estrutural heteróloga nsP3.

16. Método de acordo com a reivindicação 15, caracteriza- do pelo fato de que a proteína não estrutural heteróloga nsP3 é um vírus Chikungunya (CHIKV) nsP3, um vírus Sindbis (SINV) nsP3 ou uma variante do mesmo.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 16, caracterizado pelo fato de que pelo menos um dos primei- ro e segundo antígenos é expresso sob controle de um promotor sub- genômico 268 ou uma variante do mesmo.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracteriza- do pelo fato de que o promotor subgenômico 26S é um promotor sub- genômico SINV 268, um promotor subgenômico RRV 268 ou uma va- riante do mesmo.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o primeiro replicon de RNA é derivado de uma espécie Arterivirus e o segundo replicon de RNA é derivado de uma espécie não Arterivirus.

20. Método de acordo com a reivindicação 19, caracteriza- do pelo fato de que a espécie Arteriviruses é selecionada do grupo que consiste em vírus da arterite equina (EAV), vírus da síndrome respira- tória e reprodutiva suína (PRRSV), vírus de elevação da lactato desi- drogenase (LDV) e vírus da febre hemorrágica símia (SHFV).

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 20, caracterizado pelo fato de que o segundo replicon de RNA é derivado de um Alphavirus.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 21, caracterizado pelo fato de que o primeiro replicon de RNA é derivado de EAV e o segundo replicon de RNA é derivado de um A/- phavirus.

23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracteriza- do pelo fato de que o Alphavirus é derivado do VEEV.

24. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o primeiro replicon de RNA e o segundo replicon de RNA compreendem uma sequência que codi-

fica um gene de interesse.

25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracteriza- do pelo fato de que o gene de interesse codifica um polipeptídeo que é um determinante antigênico para o indivíduo.

26. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 25, caracterizado pelo fato de que o método compreende a administração de duas ou mais doses da composição de reforço ao indivíduo.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 26, caracterizado pelo fato de que uma ou mais da composi- ção de início e da composição de reforço compreende um veículo far- maceuticamente aceitável.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é uma espécie aviária, uma espécie de crustáceo ou uma espécie de peixe.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um mamífero.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 27, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um animal aquático ou uma espécie aviária.

31. Método para a liberação de dois replicons de RNA em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende administrar ao indivíduo uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica um primeiro replicon de RNA que codifica um primeiro antígeno; e administrar subsequentemente ao indivíduo, uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica um segundo replicon de RNA que codifica um segundo antígeno, em que o primeiro e o segundo replicons de RNA são dife- rentes um do outro.

32. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de: uma composição de início compreendendo um primeiro re- plicon de RNA que codifica um primeiro antígeno; e uma composição de reforço compreendendo um segundo replicon de RNA que codifica um segundo antígeno em que o primeiro e o segundo replicons de RNA são diferentes um do outro.

33. Composição, caracterizada pelo fato de que compreen- de: uma primeira sequência de ácido nucleico que codifica um primeiro replicon de RNA que codifica um primeiro antígeno; e uma segunda sequência de ácido nucleico que codifica um segundo replicon de RNA que codifica um segundo antígeno, em que o primeiro e o segundo replicons de RNA são dife- rentes um do outro, em que o primeiro replicon e/ou o segundo replicon com- preende pelo menos um cassete de expressão que compreende um promotor ligado de maneira operável a uma sequência de codificação para uma molécula de interesse.