FI105191B - Menetelmä monitehoisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän tuottamiseksi, sitä koodaava DNA-sekvenssi; vektori ja isäntäsolu - Google Patents

Description

, . 105191

Menetelmä monitehoisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän tuottamiseksi, sitä koodaava DNA-sekvenssi; vektori ja isäntäsolu

Tausta 5 Tämä keksintö koskee yleisesti hematopoieettisia kasvutekijöitä koodaavia polynukleotideja. Erityisesti tämä keksintö koskee nisäkkäiden mo-nitehoisia pesäkkeitä stimuloivia tekijöitä, tarkemmin määriteltynä ihmisen mo-nitehoista granulosyyttipesäkkeitä stimuloivaa tekijää (hpG-CSF) koodaavaa eristettyä DNA-sekvenssiä ja sitä sisältävää biologisesti toimintakykyistä plas-10 midi- tai virus-DNA-vektoria ja vektoria sisältävää bakteeri- tai nisäkäsisän-täsolua. Keksintö kohdistuu edelleen menetelmään sellaisen polypeptidin tuottamiseksi, jolla on luonnossa esiintyvän, ihmisen monitehoisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän hematopoieettiset, biologiset ominaisuudet.

15 Ihmisen verta muodostava (hematopoieettinen) järjestelmä korvaa erilaisia valkeita verisoluja (mukaan luettuina neutrofiilit, makrofagit ja basofii-lit/syöttösolut), punaisia verisoluja (erytrosyyttejä) ja hyytymiä muodostavia soluja (megakaryosyyttejä/verihiutaleita). Keskiarvomiehen hematopoieettisen järjestelmän on arvioitu tuottavan suunnilleen 4,5 x 1011 granulosyyttiä ja eryt-20 rosyyttiä vuosittain, joka määrä vastaa koko ruumiinpainon vuosittaista korvautumista [Dexter et ai., Bio-Essays 2 (1985) 154-158],

Otaksutaan, että pienet määrät tiettyjä hematopoieettisia kasvutekijöitä vastaavat pienten kantasolumäärien erilaistumisesta erilaisiksi verisolu-linjoiksi, näiden linjojen valtavasta lisääntymisestä ja valmiiden verisolujen lo-25 pullisesta muodostumisesta näistä linjoista. Koska hematopoieettisia kasvutekijöitä esiintyy äärimmäisen pieninä määrinä, on näiden tekijöiden detektointi ja identifiointi ollut määritysten varassa, joilla pystytään erottamaan erilaiset tekijät toisistaan vain sen perusteella, miten ne stimuloivat viljeltyjä soluja keinotekoisissa olosuhteissa. Tämän tuloksena on annettu suuri määrä nimiä 30 paljon pienemmälle määrälle tekijöitä. Esimerkkinä tuloksena olevasta termien sekavuudesta mainittakoon IL-3, BPA, multi-CSF, HCGF, MCGF ja PSF, jotka kaikki ovat akronyymejä, joiden nykyisin otaksutaan merkitsevän yhtä hiiren hematopoieettista kasvutekijää [Metcalf, Science 229 (1985) 16-22]. Katso myös julkaisut Burgess et ai., J. Biol. Chem. 252 (1977) 1988, Das et ai. Blood 35 58 (1980) 600, Ihle et aL, J. Immunol. 129 (1982) 2431, Nicola gt a]., J. Biol. Chem. 258 (1983)9017, Metcalf et ai., Int. J. Cancer 30 (1982) 773 ja Burgess 2 . 105191 et ai., Int. J. Cancer 26 (1980) 647, jotka käsittelevät hiiren erilaisia kasvua sääteleviä glykoproteiineja.

Yhdistelmägeenitekniikan käyttöönotto on tuonut jonkin verran järjestystä tähän kaaokseen. On esimerkiksi selvitetty ihmisen erytropoietiinin, 5 joka stimuloi erytrosyyttien tuotantoa, aminohappo- ja DNA-sekvenssi. (Katso Lin, PCT-hakemusjulkaisu nro 85/02610, 20. kesäkuuta 1985). Yhdistelmä-menetelmiä on käytetty myös ihmisen granulosyytti-makrofagipesäkkeitä stimuloivaa tekijää vastaavan cDNA:n eristämiseen. Katso Lee et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82 (1985) 4360-4364 ja Wong et a}., Science 228 (1985) 10 810-814. Katso myös Yokota et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 81 (1984) 1070, Fung et ai., Nature 307 (1984) 233 ja Gough et ah, Nature 309 (1984) 763, joissa julkaisuissa käsitellään hiiren geenien kloonausta, samoin kuin Kawasaki et ai., Science 230 (1985) 291, joka julkaisu käsittelee ihmisen M-CSF:ää.

15 Erästä ihmisen hematopoieettista kasvutekijää, josta käytetään ni mitystä ihmisen monitehoinen pesäkkeitä stimuloiva tekijä (hpCSF) tai pluri-poietiini, on osoitettu esiintyvän erään ihmisen virtsarakkokarsinoomasolulin-jan, josta käytetään merkintää 5637 ja joka on rajoittavin ehdoin talletettu the American Type Culture Collectioniin, Rockville, Maryland 20 ATCC-talletusnumerolla HTB-9, kasvualustassa. Tästä solulinjasta puhdistetun hpCSF:n on ilmoitettu stimuloivan monitehoisten kantasolujen lisääntymistä ja erilaistumista kaikiksi verisolujen päätyypeiksi kokeissa, joissa käytetään ihmisen luuytimen kantasoluja. Katso Welte et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82 (1985) 1526-1530. hpCSF:n puhdistukseen on käytetty: (NH4)2S04 25 -saostusta; anioninvaihtokromatografiaa (DEAE selluloosa, DE52); geelisuo-datusta (AcA54 -kolonni); ja C18-RP-HPLC:tä. hpCSF:ksi identifioidun proteiinin, joka eluoituu toisessa aktiivisuuspiikissä C18-RP-HPLC:ssä, molekyylipai-non on ilmoitettu olevan 18 000 määritettynä natriumdodekyylisulfaat-ti(SDS)-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla(PAGE:lla), jossa käytetään ho-30 peavärjäystä. Aiempien raporttien mukaan hpCSF:n isoelektrinen piste on 5,5 :·. [Welte et ai., J. Cell. Biochem., Supp 9A, (1985) 116] ja sillä on voimakas eri- laistamisaktiivisuus hiiren myelomonosyyttileukemiasolulinjan WEHI-3B D* suhteen (Welte et ai., UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, toim. Gale et ai., New Series 28, 1985). Alustavat tutkimukset viittaavat siihen, 35 että hpCSF.ksi identifioidulla tekijällä on pääasiassa granylosyyttipesäkkeitä > * · 3 . 105191 stimuloiva vaikutus ensimmäisten seitsemän päivän aikana ihmis-CFU-GM -kokeessa.

Ihmisen virtsarakkokarsinoomasolulinjasta 5637 on eristetty myös eräs toinen tekijä, josta käytetään merkintää CSF-β, ja jonka on kuvattu kil-5 pailevan hiiren 125l-leimatun granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän (G-CSF:n) kanssa sitoutumisesta WEHI-3B D+ -soluihin an-nos-vasteriippuvuuden ollessa samanlainen kuin leimaamattomalla hiiren G-CSF:llä [Nicola et a|., Nature 314 (1985) 625-628]. Tämän annos-vaste -riippuvuuden on aiemmin ilmoitettu olevan ainutlaatuinen leimaamattomalle 10 hiiren G-CSF:lle ja puuttuvan sellaisilta tekijöiltä kuin M-CSF, GM-CSF ja mul-ti-CSF [Nicola et a]., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 81 (1984) 3765-3769]. CSF-β ja G-CSF ovat ainutlaatuisia CSF:ien joukossa myös siinä suhteessa, että niille on yhteistä suuri kyky indusoida WEHI-3B D+ -solujen erilaistumista. Katso Nicola §t ai. Immunology Today 5 (1984) 76-80. Suurina pitoisuuksina 15 G-CSF stimuloi granylosyytti/makrofagipesäkkeitä muodostavien solujen seoksia [Nicola et a[., supra (1984)], mikä sopii yhteen alustavien tulosten kanssa, jotka osoittavat granulosyytti-, monosyytti-, granulosyytti/monosyyttiseos-ja eosinofiilipesäkkeiden (CFU-GEMM) ilmaantumisen, kun ihmisen luuydin-viljelmiä on inkuboitu 14 vrk hpCSF:n kanssa. CSF-p:n on kuvattu myös sti-20 muloivan neutrofiilisten granulosyyttipesäkkeiden muodostumista kokeissa, joissa käytettiin hiiren luuydinsoluja, jota ominaisuutta on pidetty kriteerinä tekijän identifioimiseksi G-CSF:ksi. Näiden samankaltaisuuksien perusteella ihmisen CSF-β on identifioitu G-CSF:ksi (granulosyyttipesäkkeitä stimuloivaksi tekijäksi). Katso Nicola et ai., Nature 314 (1985) 625-628.

·· 25 Yhteisten ominaisuuksiensa perusteella ihmisen CSF-β (Nicola et ai., supra) ja hpCSF (Welte et ai., supra) näyttävät olevan sama tekijä, jota voitaisiin hyvin kutsua ihmisen monitehoiseksi granulosyyttipesäkkeitä stimuloivaksi tekijäksi (hpG-CSF). hpG-CSF:n karakterisointi ja tuottaminen yhdis-telmä-DNA -menetelmin olisi erityisen toivottavaa, kun otetaan huomioon hii-30 ren G-CSF:n ilmoitettu kyky kokonaan vaientaa in vitro WEHI-3B D+ -leukemiasolupopulaatio "aivan normaaleina pitoisuuksina" ja injektoitujen hiiren G-CSF-raakapreparaattien ilmoitettu kyky vähentää hiireen istutettuja my-eloidileukemioita. Katso Metcalf, Science 229 (1985) 16-22. Katso myös Sachs, Scientific American 284(1) (1986) 40-47.

35 Siinä määrin kuin hpG-CSF saattaa osoittautua terapeuttisesti mer kittäväksi ja siten tarpeelliseksi olla saatavana kaupallisina määrinä, ei eristä- « ·.

4 - 105191 minen soluviljelmistä todennäköisesti tarjoa riittävää tämän materiaalin lähdettä. On esimerkiksi huomionarvoista, että näyttää olevan olemassa rajoituksia Human Tumor Bankin solujen, kuten ihmisen virtsarakkokarsinoomasolu-linjan 5637 (ATCC HTB9), jotka Welten et aj., (supra. 1985) mukaan ovat 5 luonnosta eristettyjen hpCSF:ien lähteitä, kaupalliselle käytölle .

Yhteenveto keksinnöstä Tämän keksinnön mukaisesti tarjotaan käytettäväksi DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat koko hpG-CSF:ää tai osaa siitä. Tällaiset sekvenssit saattavat sisältää: kodoneja, jotka ovat "edullisia" ilmentymiselle 10 valituissa ei-nisäkäsisännissä; restriktioentsyymipilkkoutumiskohtia; ylimääräisiä alku-, loppu- tai väli-DNA-sekvenssejä, jotka helpottavat helposti ilmentyvien vektoreiden konstruoimista. Tämä keksintö koskee myös DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat hpG-CSF:n polypeptidianalogien tai johdosten, jotka eroavat luonnossa esiintyvistä muodoista yhden tai useamman 15 aminohapporyhmän identiteetin tai sijainnin suhteen (ts. deleetioanalogien, jotka sisältävät vähemmän kuin kaikki hpG-CSF:lle ominaiset ryhmät; substi-tuutioanaiogien, kuten [Ser17]hpG-CSF:n, joissa yksi tai useampia ryhmiä on korvautunut muilla ryhmillä; ja additioanalogien, joissa polypeptidin päähän tai keskelle on lisätty yksi tai useampia aminohapporyhmiä) ja joiden jotkut tai 20 kaikki ominaisuudet ovat yhteisiä luonnossa esiintyvien muotojen kanssa,-ilmentymistä mikrobeissa.

Uusiin DNA-sekvensseihin sisältyy sekvenssejä, jotka ovat käyttökelpoisia sen varmistamiseen, että prokaryoottisissa tai eukaryoottisissa isän-täsoluissa muodostuu polypeptidituotteita, joilla on ainakin osa luonnossa · 25 esiintyvän monitehoisen granylosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän primaari- rakenteesta ja yksi tai useampia sen biologisista ominaisuuksista. Keksinnön mukaisten DNA-sekvenssien katsotaan sisältävän erityisesti: (a) taulukossa VII ja taulukossa Vili esitetyn DNAsekvenssin tai sen komplementaarisen säikeen; (b) DNAsekvenssin, joka hybridisoituu (hybridisaatio-olosuhteissa, kuten 30 tässä kuvatuissa, tai ankarammissa olosuhteissa) taulukossa VII esitettyjen v DNA-sekvenssien tai niiden osien kanssa; ja (c) DNA sekvenssin, joka - ellei geneettinen koodi olisi degeneroitunut - hybridisoituisi taulukon VII mukaisen DNA-sekvenssin kanssa. Kohdassa (b) tarkoitetaan erityisesti geno-mi-DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat hpGCSF:n alleelisia varianttimuotoja tai 35 muiden nisäkäslajien monitehoisia granylosyyttipesäkkeitä stimuloivia tekijöitä. Kohdassa (c) tarkoitetaan erityisesti valmistettuja DNA-sekvenssejä, jotka 5 105191 koodaavat hpG-CSF:ää, hpG-CSF:n fragmentteja ja hpG-CSF:n kanssa analogisia polypeptidejä, jotka DNA-sekvenssit voivat sisältää kodoneja, jotka helpottavat lähetti-RNA:n translaatiota mikrobi-isännissä. Tällaisia valmistettuja sekvenssejä on helppo konstruoida Altonin et ai., menetelmien mukaisesti 5 (PCT-hakemusjulkaisu WO 83/04053). Keksinnön mukaiselle DNA-sekvenssille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 1 esitetään. Keksinnön mukaiselle vektorille ja isäntäsolulle on tunnusomaisa se, mitä patenttivaatimuksessa 9 ja 10 esitetään. Keksinnön mukaiselle menetelmälle hpG-(SF:n tuottamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 12 10 esitetään.

Tässä kuvataan myös sitä polypeptidiryhmää, jota koodaavat osat ihmis-cDNA:n tai tässä esitettyjen taulukoiden VII ja Vili mukaisten geno-mi-DNA-sekvenssien ylemmälle säikeelle komplementaarisesta DNA:sta, ts. "komplementaarisesti käännetyt proteiinit", joita kuvaavat Tramontano et ai., 15 [Nucleic Acids Res., 12 (1984) 5049-5059],

Lisäksi tässä kuvataan puhdistettuja ja eristettyjä polypeptid(tuotteita, joilla on osittain tai kokonaan luonnossa esiintyvän hpG-CSF:n, sen ai-leeliset variantit mukaan luettuina, primaarirakenne (ts. aminohapporyhmistä koostuva jatkuva sekvenssi) ja yksi tai useampia sen biologisista ominaisuuk-20 sista (ts. immunologisia ominaisuuksia ja biologinen aktiivisuus In vitro 1 ja fysikaalisista ominaisuuksista (esimerkiksi molekyylipaino). Näille polypeptideille on ominaista myös se, että ne ovat kemiallisten synteesimenettelyjen tulos tai tulosta genomi-DNA:n tai cDNA:n kloonauksella tai geenisynteesillä saatujen eksogeenisten DNA-sekvenssien ilmentymisestä prokaryoottisessa tai eukary-25 oottisessa isännässä (esimerkiksi viljelmässä olevissa bakteeri-, hiiva-, korkeampien kasvien, hyönteis- ja nisäkässoluissa). Tyypillisten hiiva- (esimerkiksi Saccharomvces cerevisiael tai prokaryootti- [esimerkiksi Escherichia coli (E. colill isäntäsolujen tuotteet ovat vapaita kaikista nisäkkäiden proteiineista. Selkärankaissolujen (esimerkiksi muiden nisäkkäiden kuin ihmisen solujen ja 30 lintusolujen) ilmentymistuotteet eivät sisällä mitään ihmisen proteiineja. Käytetystä isännästä riippuen voivat polypeptidit olla glykosyloituneita nisäkkäiden tai muiden eukaryoottien hiilihydraateilla tai glykosyloitumattomia. Polypeptidit voivat sisältää myös metioniinialoitusaminohapporyhmän (asemassa -1).

Edelleen esitetään farmaseuttisia koostumuksia, jotka sisältävät 35 vaikuttavia määriä mainittuja polypeptidituotteita yhdessä soveltuvien laimen- • ·.

e . 105191 nus-, apuja/tai kantaja-aineiden kanssa, jotka ovat käyttökelpoisia hpG-CSF-terapiassa.

Nämä tuotteet voidaan "leimata" liittämällä niihin detektoitavissa olevaa merkkiainetta (esimerkiksi radioleimata 125l:llä), jolloin saadaan rea-5 gensseja, jotka ovat käyttökelpoisia ihmisen hpG-CSF:n detektointiin ja kvantitatiiviseen määrittämiseen kiinteästä kudoksesta ja nestenäytteistä, kuten verestä tai virtsasta. Myös keksinnön mukaiset DNA-tuotteet voidaan leimata detektoitavissa olevilla merkkiaineilla (kuten radionuklideilla ja ei-isotooppimerkkiaineilla, kuten biotiinilla) ja käyttää 10 DNA-hybridisaatiomenetelmissä ihmisen hpG-CSF-geenin ja/tai siihen mahdollisesti liittyvän geeniryhmän aseman kromosomikartassa määrittämiseksi. Niitä voidaan käyttää myös ihmisen hpG-CSF-geenihäiriöiden identifioimiseksi DNA-tasolla ja geenimarkkereina naapurigeenien ja niiden häiriöiden identifioimiseksi.

15 Tässä kuvatut polypeptidituotteet voivat olla käyttökelpoisia yksi nään tai yhdistettyinä muihin hematopoieettisiin tekijöihin tai lääkkeisiin ve-renmuodostushäiriöiden, kuten aplastisen anemian hoidossa. Esimerkiksi luu-ydinsiirron onnistumista voidaan edistää antamalla hpG-CSF:ää. hpG-CSF voi lisäksi olla käyttökelpoinen leukemian hoidossa sen perusteella, että sillä on 20 ilmoitettu olevan kyky erilaistaa leukemiasoluja. Katso Welte et ai., Proc. Natl. Acad. Sei (USA) 82 (1985) 1526-1530 ja Sachs, supra.

Tämän keksinnön lukuisat aspektit ja edut käynevät ilmi alan am-mattimiehille seuraavasta yksityiskohtaisesta kuvauksesta, jossa valaistaan tämän keksinnön käytännön toteutusta sen tällä hetkellä edullisissa suoritus- ·' 25 muodoissa.

Piirrosten lyhyt kuvaus

Kuvio esittää hpG-CSF-geenin osittaista restriktioendonukleaasi-karttaa, johon on liitetty nuolet, jotka osoittavat genomisekvenssin määrittämiseen käytetyn sekventointistrategian.

30 Yksityiskohtainen kuvaus v Tämän keksinnön mukaisesti on eristetty ja karakterisoitu DNA-sekvenssejä, jotka koodaavat koko hpG-CSFpolypeptidisekvenssiä tai osaa siitä.

Seuraavat esimerkit annetaan keksinnön valaisemiseksi, ja ne kos-35 kevät erityisesti ennen hpG-CSF-cDNA:n ja genomikloonien identifiointia toteutettuja menettelyjä, tällaiseen identifiointiin johtaneita menettelyjä, sekven- • · · 7 105191 tointia, cDNA:han, genomin ja valmistettuihin geeneihin perustuvien ilmenty-misjärjestelmien kehittämistä ja tällaisissa järjestelmissä olevien ilmentyvien hpG-CSF:n ja analogisten tuotteiden varmistamista.

Tarkemmin määriteltynä esimerkki 1 koskee hpG-CSF:n aminohap-5 posekventointia. Esimerkki 2 koskee cDNA-kirjaston valmistamista pesäkehy-bridisaatioseulontaa varten. Esimerkki 3 koskee hybridisaatiokoettimien konstruoimista. Esimerkki 4 koskee hybridisaatiotutkimusta, positiivisten kloonien identifioimista, erään positiivisen kloonin DNA-sekventointia ja polypepti-din primaarirakennetta (aminohapposekvenssiä) koskevien tietojen hankki-10 mistä. Esimerkki 5 koskee hpG-CSF:ää koodaavan genomikloonin identifiointia ja sekventointia. Esimerkki 6 koskee hpG-CSF.ää koodaavan keinotekoisen geenin, jossa käytetään E. colin kannalta edullisia kodoneja, konstruoimista.

Esimerkki 7 koskee menettelyjä E. coji -transformaatiovektorin, joka 15 sisältää hpG-CSF:ää koodaavan DNA:n, konstruoimiseksi, tämän vektorin käyttöä hpG-CSF:n tuottamiseen prokaryoottisesti ja yhdistelmätuotteiden ominaisuuksien analysoimista. Esimerkki 8 käsittelee menettelyjä, jolla muodostetaan hpG-CSF:n kanssa analogisia polypeptidejä, joissa kysteiiniryhmät on korvattu muulla soveltuvalla aminohapporyhmällä hpG-CSF:ää koodaavan 20 DNA:n mutageneesin kautta. Esimerkki 9 koskee menettelyjä, joilla konstruoidaan vektori, joka sisältää positiivisesta cDNA-kloonista peräisin olevan, hpG-CSFanalogia koodaavaa DNA.ta, tämän vektorin käyttöä COS-1-solujen transfektointiin ja transfektoitujen solujen kasvatusta viljelmänä. Esimerkki 10 koskee keksinnön mukaisten polypeptidituotteiden fysikaalisia ja biologisia 25 ominaisuuksia.

Esimerkki 1 (A) Kirjallisuuden mukaisilla menetelmillä aikaansaadun materiaalin sekventointi hpG-CSF-näytteen (3-4 pg, puhtausaste 85-90 % SDS-PG-E, ho-30 peavärjäys) toimitti Sloan Kettering Institute, New York, eristettynä ja puhdistettuna Welte gt ai., menetelmällä [Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82 (1985) 1526-1530].

Tämän hpG-CSF-näytteen N-terminaalinen aminohapposekvenssi määritettiin mikrosekvenssianalyysillä jossa #1 käyttämällä 35 AB407A-kaasufaasisekventoijaa (Applied Biosystems, Foster City, Kalifornia), jolloin saatiin jäljempänä taulukossa I esitettävät sekvenssitiedot. Taulukoissa • · 8 105191 l-IV käytetään yksikirjainkoodeja, "X" tarkoittaa ryhmää, jota ei ole määritetty yksiselitteisesti, ja suluissa olevat ryhmät ovat vaihtoehtoisia tai mahdollisia.

Taulukko I 5 1 5 10 15

K-P-L-G-P-A-S-K-L-K-Q-(G,V,S)-G-L-X-X-X

Joka ajosyklissä, josta esitetään tuloksia taulukossa I, oli korkea 10 tausta, mikä osoittaa, että näytteessä oli monia kontaminoivia komponentteja, todennäköisesti puhdistuksesta jääneiden kemikaalijäännösten muodossa.

Ajon # 2 yhteydessä käytetty toinen näyte (5-6 pg), puhtausaste noin 95 %) saatiin Sloan Ketteringista samoin kuin ajon # 1 näytekin, ja sek-ventointi tehtiin kuten ajossa # 1. Tämä näyte oli peräisin samasta materiaali-15 erästä kuin Welten et ai., julkaisun [Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 82 ( 1985) 1526-1530] kuvion 4 aikaansaantiin käytetty aine. Tulokset annetaan taulukossa II.

Taulukko II

20 ! 5 10 15 20 T-P-L-G-P-A-S-(S)-L-P-Q-(^-M-[J(J-X-K-(R)-X-X-(R)-(L)-X-

Vaikka ajossa # 2 identifioitiin useampia ryhmiä, ei se antanut riittä-.! 25 vän pitkää varmaa sekvenssiä, josta voitaisiin muodostaa kohtuullinen määrä koettimia hpG-CSFDNA:n etsimiseen. Laskettiin, että olisi tarvittu vähintään 1536 koetinta, jotta olisi voitu yrittää taulukon II mukaiseen sekvenssiin perustuvan cDNA:n eristämistä. Näytteen epäpuhtauksien uskottiin tälläkin kertaa olevan ongelmana.

30 Kolmannenkin näytteen ( 3-5 pg, puhtausaste noin 40 %) toimitti

Sloan Kettering. Tälle valmisteelle tehtiin elektroforeettinen täpläsiirto SDS-PAGE:n jälkeen yritettäessä lisäpuhdistusta. Tämän näytteen sekvenssi-analyysistä ei saatu tuloksia.

(B) Korjatuilla menetelmillä saatujen materiaalien sekventointi 35 Jotta saataisiin riittävä määrä puhdasta materiaalia sopivan tarkan aminohapposekvenssianalyysin tekemiseksi, saatiin tri E. Platzerilta virtsarak- 9 . 105191 kokarsinomaasolulinjan 5637 (alaklooni 1A6) soluja, jotka oli tuotettu Sloan Ketteringissä. Soluja kasvatettiin aluksi Iscoven alustassa (GIBCO, Grand Island, New York) pulloissa yhtenäiseksi kasvustoksi. Kun viljelmät olivat kasvaneet yhtenäisiksi, ne käsiteltiin trypsiinillä ja siirrostettiin pyörityspulloihin (12 5 pullollista/pyörityspullo), joista kukin sisälsi 25 ml ennalta ilmastoitua Iscoven alustaa 5 % C02:a sisältävässä atmosfäärissä. Soluja kasvatettiin yön yli lämpötilassa 37 °C pyöritysnopeuden ollessa 0,3 min*1.

Cytodex-1 -helmet (Pharmacia, Uppsala, Ruotsi) pestiin ja steriloitiin seuraavia menettelyjä käyttämällä. Laitettiin pulloon 8 g helmiä, ja lisättiin 400 10 ml PBS:ää. Helmet suspendoitiin pyörittämällä varovasti 3 tuntia. Kun helmien oli annettu laskeutua, PBS imettiin pois, helmet huuhdottiin PBSillä, ja lisättiin uutta PBS:ää. Ennen käyttöä helmet pestiin Iscoven alustalla, joka sisälsi 10 % naudan sikiöseerumia (FSC), ja lisättiin niille sitten uutta FCS-pitoista (10 %) alustaa, jolloin saatiin käyttövalmiita helmiä.

15 Kun kustakin pyörityspullosta oli poistettu alusta 30 ml:aa lukuun ottamatta, lisättiin pulloihin 30 ml FCS-pitoista (10 %) tuoretta alustaa ja 40 ml käsiteltyjä helmiä. Pullot kaasukäsiteltiin 5 % C02:a sisältävällä seoksella, ja kaikki kuplat poistettiin imemällä. Pullot laitettiin telasekoittimelle, ja pyöritettiin nopeudella 3 min*1 1 /2 tuntia ennen pyöritysnopeuden alentamista arvoon 0,3 20 min*1. 3 tunnin kuluttua käsiteltiin lisäPullo trypsiinillä ja lisättiin kuhunkin helmiä sisältävään pyörityspulloon.

Noin 30 I 1A6-solujen käytettyä kasvualustaa konsentroitiin noin 2 l.ksi Millipore Pellicon -yksiköllä, joka oli varustettu 2 kasetilla, joiden läpäisy-raja vastasi molekyylipainoa 10 000, ja jossa suodoksen keräysnopeus oli noin ' 25 200 ml/min ja retentaatin keräysnopeus noin 1000ml/min. Konsentraatti dia- lyysisuodatettiin noin 10 l:n kanssa 50 mM Tris-puskuria (pH 7,8) käyttämällä samaa laitetta ja samoja virtausnopeuksia. Dialyysisuodatettu konsentraatti syötettiin nopeudella 40 ml/min pylväälle, joka sisälsi 1 I 50 mM Tris-puskurilla (pH 7,8) tasapainotettua DE-selluloosaa. Kun konsentraatti oli syötetty pylvää-30 seen, tätä huuhdottiin samalla virtausnopeudella 1 lilla 50 mM Tris-puskuria (pH 7,8) ja sitten 2 lilla 50 mM Trispuskuria (pH 7,8), joka sisälsi 50 mmol/1 NaCI:a. Sitten kolonni eluoitiin peräkkäin kuudella 1 l:n annoksella 50 mM Tris-liuosta (pH 7,8), jotka annokset sisälsivät NaCI:a seuraavina pitoisuuksina: 75, 100, 125, 150, 200 ja 300 mmol/l. Kerättiin fraktioita (50 ml), yhdistet-35 tiin aktiiviset fraktiot ja väkevöitiin ne 65 mliksi sekoituksella varustetulla Ami-co-ultrasuodatusyksiköllä, joka oli varustettu YM5-kalvolla. Tämä konsentraatti 10 - 105191 syötettiin kolonnille, joka sisälsi 1 I AcA54-geelisuodatusainetta, joka oli tasapainotettu PBS:llä. Virtausnopeus kolonnin läpi oli 80 ml/h, ja kerättiin 10 ml:n fraktioita. Aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja syötettiin suoraan C4-HPLC-kolonnille.

5 Näytteet, joiden tilavuus oli 125-850 ml ja jotka sisälsivät 1-8 mg proteiinia, josta noin 10 % oli hpG-CSF:ää, syötettiin kolonnille virtausnopeudella 1-4 ml/min. Kun näyte oli syötetty ja kolonnille oli tehty alkuhuuhtelu liuoksella, joka sisälsi 0,1 mol/l ammoniumasetaattia (pH 6,0-7,0) 80 %:isessa 2-propanolissa, virtausnopeudella 1 ml/min, kerättiin 1 ml:n fraktioita ja seurat-10 tiin proteiineja aallonpituuksilla 220, 260 ja 280 nm.

Puhdistuksen seurauksena oli hpG-CSF:ää sisältävien fraktioiden (fraktiot 72 ja 73 80:stä) selvä erottuminen muista proteiinipitoisista fraktioista. Eristettiin phGCSF (150-300 pg), jonka puhtausaste oli noin 85 + 5 % ja saanto noin 50 %. Tästä puhdistetusta materiaalista käytettiin 9 pg ajoon # 4, 15 aminohapposekvenssianalyysiin, jossa proteiininäyte laitettiin TFA:lla aktivoituun lasikuitukiekkoon, jossa ei ollut polybreeniä. Sekvenssianalyysi tehtiin AB 470A -sekventoijalla Hewickin et ai., [J. Biol. Chem. 256 (1981) 7990-7997] ja Lain [Anal. Chim. Acta 163 (1984) 243-248] menetelmillä. Ajon # 4 tulokset annetaan taulukossa III.

20

Taulukko III

15 10

Thr - Pro - Leu - Gly - Pro - Ala - Ser - Ser - Leu - Pro- 25 15 20

Gin - Ser - Phe - Leu - Leu - Lys -(Lys)- Leu -(Glu)- Glu- 25 30 30 .· Vai - Arg - Lys - Ile -(Gin)- Gly - Vai - Gly - Ala - Ala-

Leu - X - X - 35 11 105191

Ajossa # 4 ei 31 syklin (taulukon III ryhmän 31) jälkeen saatu enää lisää merkittäviä sekvenssitietoja. Jotta ajossa # 5 saataisiin pitempi varmasti määritetty sekvenssi, 14 μ9 hpG-CSF:ää, joka oli puhdistettu käytetystä alustasta, pelkistettiin 10 pl:lla β-merkaptoetanolia 1 tunti lämpötilassa 45 °C ja 5 kuivattiin sitten perusteellisesti alipaineessa. Proteiinijäännös liuotettiin sitten 5 %:iseen muurahaishappoon ja laitettiin polybreenikäsiteltyyn lasikuitukiekkoon. Sekvenssianalyysi tehtiin kuten edellä ajon # 4 yhteydessä kuvattiin. Ajon # 5 tulokset esitetään taulukossa IV.

Taulukko IV

10 - 15 10

Thr - Pro - Leu - Gly - Pro - Ala - Ser - Ser - Leu - Pro - 15 20

Gin - Ser - Phe - Leu - Leu - Lys - Cys - Leu - Glu - Gln- 15 25 30

Vai - Arg - Lys - Ile - Gin - Gly - Asp - Gly - Ala - Ala - 35 40

Leu - Gin - Phe - Lys - Leu - Gly - Ala - Thr - Tyr - Lys - 20 45

Vai - Phe - Ser - Thr - (Arg) - (Phe) - (Met) -X-

Taulukossa IV annettu aminohapposekvenssi oli riittävän pitkä (44 ryhmää) ja yksiselitteinen koettimien konstruoimiseksi hpG-CSF-cDNA:n ai-25 kaansaamiseksi tässä hakemuksessa kuvattavalla tavalla.

Esimerkki 2

Standardimenetelmiin kiinnostuksen kohteena olevien cDNA-sekvenssien eristämiseksi kuuluu plasmidiperäisten cDNA -"kirjastojen" valmistaminen käänteiskopioimalla mRNA:ta, jota esiintyy runsaasti luovutta-30 jasoluissa, jotka valitaan sen perusteella, että kohdegeeni ilmentyy niissä. Kun tunnetaan oleellisia osia polypeptidin aminohapposekvenssistä, voidaan käyttää tunnettuja, leimattuja yksisäikeisiä DNA-koetinsekvenssejä, joissa toistuu "kohde" -cDNA.ssa otaksuttavasti esiintvvä sekvenssi, DNA/DNA -hybridisaatiossa, joka tehdään kloonatuille cDNA-kopioille, jotka on denatu-35 roitu yksisäikeiseen muotoon. Katso Weissman et ai., US-patenttijulkaisu 12 . 105191 4 393 443; Wallace §t a]., Nucleic Acids Res. 6 (1979) 3543-3557; Reyes et aL, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 79 (1982) 3270-3274; ja Jaye et al.. Nucleic Acids Res. 11 (1983) 2325-2335. Katso myös US-patenttijulkaisu 4 358 535 (Falkow et al.,), joka käsittelee DNA/DNA -hybridisaatiomenettelyjen käyttöä 5 diagnosointiin; ja Davis et al., A Manual for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor, N.Y. 1980, s. 55-58 ja 174-176, jossa käsitellään pesäkehybridisaatiomenetelmiä.

Kokonais-RNA eristettiin noin 1 g:sta virtsarakkokarsinoomasolu-linjan 5637 (1A6) soluja käyttämällä guanidiumtiosyanaattimenettelyä muuttu-10 mattoman RNA:n eristämiseen [Chirgwin et al., Biochemistry 18 (1979) 5294-5299].

Steriili RNA-vesiliuos sisälsi 1A6-solujen kokonais-RNA:n. Lähet-ti-RNA:n erottamiseksi kokonais-RNAliuoksesta tämä johdettiin kolonnin läpi, joka sisälsi oligodeoksitymidylaattia [oligo(dT)] (Collaborative Research, Inc., 15 Waltham, Massachusetts). Lähetti-RNA:lle tunnusmerkilliset polyadenyloitu-neet (poly-A+) hännät tarttuvat kolonniin, kun taas ribosomi-RNA eluoituu. Tällä menettelyllä eristettiin noin 90 pg polyadenyloitunutta lähetti-RNA:ta (poly-A+ -mRNA:ta). Eristetty poly-A+ -mRNA esikäsiteltiin metyylielohopeahyd-roksidilla (Alpha Ventron, Danvers, Massachusetts), jonka loppupitoisuus oli 4 20 mmol/-l, 5 min huoneen lämpötilassa ennen käyttämistä cDNA-reaktioon. Me-tyylielohopeahydroksidikäsittely denaturoi lähetti-RNA:n vuorovaikutukset sekä itsensä kanssa että kontaminoivien molekyylien kanssa, jotka estävät translaatiota. Katso Payvar et al., J. Biol. Chem. 258 (1979) 7636-7642.

Valmistettiin cDNA-pankki Okayaman menetelmällä [Okayama et 25 al., Molecular & Cellular Biology 2 (1982) 161-170] käyttämällä 1A6-soluista saatua mRNA:ta. cDNA:illa transformoitiin DNA:n lisäämiseen käytetty isäntä-mikroorganismi E. coli K-12 -kanta HB101 tekemällä inkubointi.

Esimerkki 3

Taulukon IV mukaisen hpG-CSF:n aminoterminaalisen sekvenssin 30 perusteella suunnitellut hybridisaatiokoettimet koostuivat 24 oligonukleotidista, joista kukin oli 23 emäksen pituinen ja sisälsi kolme inosiiniryhmää. Koetinoli-gonukleotidit valmistettiin Caruthersin et al., menetelmällä [Genetic Engineering 4 (1982) 1-18] ja leimattiin y-32P-ATP:lla tekemällä kinaasikäsittely polynu-kleotidikinaasilla. Koetinoligonukleotidit, jotka vastaavat taulukon IV mukaisen 35 sekvenssin ryhmiä 23-30 vastaavaa RNA.ta, esitetään taulukossa V.

13 105191

Taulukko V

hpG-CSF-koettimet 5' GC IGC ICC §TC ICC JEtG ^AT JtT3 '

5 T

l:iden merkitseminen neutraaleiksi perustui Takahashin §t al., [Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 82 ( 1985) 1931-1935] ja Ohtsukan et a]., [J. Biol. Chem. 260 (1985) 2605-2608] julkaistuihin töihin. Inosiinilla voi kuitenkin olla destabiloiva vaikutus, jos se emäspariutuu G:n tai T:n kanssa. Takahashin et 10 ai., työssä inosiineilla saattaa näyttää olevan neutraali vaikutus, koska ne ryhmänä ovat keskimäärin lähellä neutraalia (esimerkiksi kolme on suosinut pariutumista C:n kanssa, ja kaksi ei pariudu helposti T:n kanssa).

kiden ja G:iden välisten emäsparien vaikutuksen tutkimiseksi suunniteltiin vertailukokeita, joissa käytettiin N-myc-geenisekvenssiä ja -kloonia. 15 N-myc-geenistä poimituilla sekvensseillä oli sama G:n ja C:n kokonaissisältö kunkin kodonin kahdessa ensimmäisessä asemassa kuin minkä hpG-CSF-koettimet määräsivät. N-myc-testikoettimet olivat siten samanpituisia, sisälsivät !:t samoissa suhteellisissa asemissa, ja niillä oli mahdollisesti sama keskimääräinen Tm (62-66 °C, jakson sisältämien 3 tai 4 inosiiniryhmän 20 vaikutusta ei oteta huomioon) kuin hpG-CSF-koettimilla.

Muodostettiin kaksi ryhmää N-myc-testikoettimia Caruthersin a]., (supra) menetelmällä. Ryhmä I, joka esitetään taulukossa VI, sisälsi; 1. täydellisesti yhteensopivan 23-meerin; 23-meerin, jossa kolme kodonin kolmannessa asemassa olevaa C:tä oli korvattu kiliä, jolloin muodostui pahin mahdollinen 25 l:iden lisäämistapaus; ja 3. 23-meerin, jossa neljä kodonin kolmannessa asemassa olevaa C:tä oli korvattu kiila. Toinen ryhmä testikoettimia suunniteltiin edustamaan sattumanvaraisempaa inosiiniemäsparien jakautumaa, jolla saattaisi olla neutraali kokonaisvaikutus emäspariutumisen suhteen. Taulukossa VI esitetty ryhmä II sisälsi: 4. 23-meerin, joka sisälsi kaksi C:n kanssa 30 pariutuvaa ktä ja yhden G:n kanssa pariutuvan kn; ja 5. 4:n kanssa muuten identtisen 23-meerin, johon oli kuitenkin lisätty vielä yksi kG-emäspari.

14 105191

Taulukko VI N-myc-testikoettimet 1. 5'cac AAC TAT GCC GCC CCC TCC CC3' 5 2. 5'CAC AAC TAT GCI GCC CCI TCI CC3' 3. S'CAI AAC TAT GCI GCC CCI TCI CC3' 10 4. 5'aac GAG CTG TGI GGC AGI CCI GC3' 5. 5'aAI GAG CTG TGI GGC AGI CCI GC3'

Viittä replikasuodatinta, jotka sisälsivät N-myc-DNA-sekvenssejä ja 15 kanan kasvuhormonia vastaavia DNA-sekvenssejä (negatiivisena vertailu-näytteenä) pidettiin vakuumiuunissa 80 °C:ssa 2 tuntia ennen hybridisaatiota. Kaikki suodattimet hybridisoitiin esimerkissä 4 hpG-CSF-koettimien yhteydessä kuvattavalla tavalla; hybridisaatioaika oli kuitenkin vain 6 tuntia. Suodattimet pestiin kolmesti huoneen lämpötilassa ja sitten kerran 45 °C:ssa 10 min 20 kerrallaan. Suodattimet tutkittiin Geiger-laskurilla.

N-myc-koetinta 3 edustava suodatin antoi hyvin heikon signaalin muihin neljään tutkittuun suodattimeen verrattuna, eikä sitä pesty enää. Kun suodattimia oli pesty 10 min 50 °C:ssa, Geiger-laskurilla saatiin seuraavat prosentuaaliset signaalit merkittäessä koettimen 1 signaalia 100 %:lla: koetin 2, 25 20 %: koetin 3 (45 °C) 2 %: koetin 4, 92 %; ja koetin 5, 75 %. Kun suodattimia oli pesty 55 °C:ssa, prosenttiluvut olivat: koetin 2, 16 %: koetin 4, 100 %; koetin 5, 80 %. Viimeisen pesun jälkeen (60 °C) saatiin seuraavat prosenttiluvut: koetin 2,1,6 %; koetin 4, 90 %; koetin 5, 70 %.

Kolmen l:n läsnä ollessa, kuten koettimissa 2 ja 4, havaitaan siten 30 jopa 60-kertainen ero signaalissa saavutettaessa teoreettinen Tm (l:itä ei ole otettu mukaan laskussa) [perustuu pahimman tapauksen l-emäspariutumiseen (koetin 2) ja suhteellisen neutraaliin l-emäspariutumiseen (koetin 4)].

N-myc-testihybridisaatioissa saatuja standardisointitietoja käytettiin hyväksi pesussa ja hpG-CSF-hybridisaation seuraamisessa jäljempänä ku-35 vattavalla tavalla sen arvioimiseen, kuinka luotettavina voitaisiin pitää tuloksia, jotka saadaan vähemmän ankarissa pesuolosuhteissa.

15 .

105191

Esimerkki 4

Noudattaen Hanahanin et §l., [J. Mol. Bio!. 166 (1983) 557-580] menetelmää levitettiin bakteereja, jotka sisälsivät esimerkin 2 mukaisesti valmistettuja cDNA-inserttejä, 24 nitroselluloosasuodattimelle (Millipore, Bedford, 5 Massachusetts), jotka oli laitettu agarmaljoille. Maljoja inkuboitiin sitten siten, että saatiin noin 150 000 pesäkettä, jotka replikasiirrostettiin toisille 24 nitroselluloosasuodattimelle. Replikamaljoja inkuboitiin, kunnes ilmaantui erottuvia pesäkkeitä. Suodattimia olevat bakteerit hajotettiin Whatman 3 MM -paperiarkeilla, jotka oli juuri ja juuri kyllästetty natriumhydroksidilla (0,5 M), 10 10 min ja käsiteltiin sitten 2 min Tris-liuoksella (0,5 M) ja sen jälkeen 10 min Tris-liuoksella (0,5 M), joka sisälsi NaCI:a (1,5 mol/l) . Kun suodattimet olivat lähes kuivat, niitä pidettiin 2 tuntia lämpötilassa 80 °C vakuumiuunissa ennen nukleiinihappohybridisaatiota [Wahl et aj., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 76 (1979) 3683-3687); Maniatis et aj., Cell 81 (1976) 163-182], 15 Suodattimia eslhybridisoitiin 2 tuntia lämpötlilassa 65 °C 750 ml:ssa liuosta 10 x Denhardt, 0,2 % SDS:ää ja 6 x SSC. Suodattimet huuhdottiin 6 x SSC.IIä, pakattiin sitten pusseihin (4 kpl/pussi) ja hybridisoitiin 14 tuntia liuoksessa 6 x SSC, 10 x Denhardt. Pussissa, joka sisälsi 50 x 106 pulssia/min 32P-leimattua koetinta (oligonukleotideja), oli noin 15 ml liuosta.

20 Hybridisaation jälkeen suodattimia pestiin kolmesti 10 min 6 x SSC:llä (1 l/pesukerta) huoneen lämpötilassa. Sitten suodattimia pestiin kahdesti 15 min lämpötilassa 45 °C, kerran 15 min lämpötilassa 50 °C ja kerran 15 min lämpötilassa 55 °C käyttäen kuhunkin pesuun 1 litra 6 x SSC:tä .

Suodattimelle tehtiin 2 tunnin pituinen autoradiografia-lämpötilassa ·· 25 -70 °C käyttämällä kuvanvahvistuslevyä ja Kodak XAR-2 -filmiä. Tässä auto- radiografiassa detektoitiin 40-50 positiivista signaalia, joissa 5 oli hyvin voimakkaita.

Alueet, jotka sisälsivät viisi voimakkainta signaalia, ja viisi muuta positiivista aluetta kaavittiin alkuperäisiltä maljoilta ja siirrostettiin toista tutki-30 mistä varten, jossa käytettiin samaa koetinseosta samoissa olosuhteissa. Pe- - · v sumenettely erosi edellisestä siinä suhteessa, että korkeassa lämpötilassa tehdyt pesut koostuivat kahdesta 15 min.n pesusta lämpötilassa 55 °C ja sitten yhdestä 15 min.n pesusta lämpötilassa 60 °C. Esimerkin 3 mukaisen N-myc-koetintutkimuksen perusteella nostettiin viimeisen pesun lämpötilaa toi-35 sessa tutkimuksessa, koska aggregaatin sulamislämpötila näillä 24 23-meerillä oli 60-68 °C, sama kuin N-myc-koettimilla. Heti toisen lämpötilassa 55 °C teh- ie . 105191 dyn pesun jälkeen suodattimet jätettiin märiksi, ja tehtiin autoradiografia. Tämän autoradiogrammin vertaaminen toiseen autoradiogrammiin, joka otettiin samalla säteilytysajalla viimeisen, lämpötilassa 60 °C tehdyn pesun jälkeen, osoitti, että vain kahdella tutkituista 10 kloonista signaali ei heikentynyt oleelli-5 sesti lämpötilan noustessa 55:stä 60 °C:een. Näiden kahden kloonin osoitettiin myöhemmin olevan lähes identtisiä pituutensa ja restriktioendonukleaasikart-tansa suhteen. Yksi klooni, josta käytetään merkintää Ppo2, valittiin sekven-toitavaksi.

Edellä kuvatulla menettelyllä saadun yhdistelmä-10 hpC-CSF-cDNA-kloonin sekventointi tehtiin Sangerin et ai. dideoksimenetel-mällä [Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 74 (1977) 5463-6467]. Yksisäikeistä DNA-faagia M-13 käytettiin kloonausvektorina yksisäikeisten DNA-templaattien hankkimiseen kaksisäikeisistä cDNA-klooneista. Sangerin et ai-, menetelmällä saatiin sekvenssi, joka esitetään taulukossa VII, jossa näkyy 15 myös vastaava aminohapposekvenssi ja komplementaarinen säie polypeptidiä koodaavalta alueella.

• 9

9 I

• · 1 t « 17 105191 O Eh <C COU 3UU OUO UUO < Eh

UUU r-H < E-< h < H u cj O >< Eh £UU

ftUU UUU UUU Q< U U E« Eh <C Eh «C Eh >iU o muu ouu muu suu au u ή u u m m eh <c uuu >. u u nh< m «c eh

U U U «J m «C Eh 0)00 U eh < JUU «CUU

„ a ~ 3UU<1 muu muu uuu <u u u suu Ξ ¢1 h < >i«C E-ι m < Eh (UUU .C E-< <C QjE-i<; 5 JUU J < Eh KUU Ui «C Eh K Eh «C J Eh < S o u u σ>υ u muu uuu ob< < uuu ~ uuu uuu >iU u a» u u <u eh 1c x: u u

Z KUU < «C Eh U Eh «C Ui «C E< JUU Eh «C EH

g H l<uu r—i U U SUU 3UU >.uu ouu

h, + £ U U «J Eh «C <U Eh «C Φ Eh «C MUU u U U

g E" < E-· >UU JUU JUU uuu auu g «JUU C «C Eh muu OUU UUU O >,Eh <

g MUU O iH <3, E-t O >.<£ Eh O u U O Od)UU OrHUU

g H<uu <N u U U ht J «£ Eh vo K U U co m < E1 1-fUUU

g 3 «C Eh 3 U U UUO «J Ei «C m El «C 3UU

g Ή<Ε-1 M «£ Eh >i«C Eh m U U m < £h o) En «£ g UUU UUU Eh £h <C «CUU KUU J Et < g CUU 3 «C Eh UUU KUU 3 U U 3 u u g H<E) 41Eh<£ -CUU uuu <U Eh «£ h < Eh

g UUU J El < E-1 «C Ei Ei Ei «C JUU UUU

g MUU muu «JUU OUU C<Eh ouu

g «I E-l <C >,u U r-ιυυ uuu m <£ E-. UUU

g >uu ue< «CUU KUU UUU KUU

g i-<Eh muu m E-> «C a>uu u u U uuu

g JZ U U >1< Ei >iU U Hfn< CU U U (UUU

g eh<eh j <c e< ue-<< m<eh co<e-i m h <

g (KUU 3UU 3 U U >iU U 3UU (UUU

g uuu a>E-<< <UE-1< <—i U U <U Eh «C h E< < g Eh Eh < JUU JUU UUU JEh< 1-1 < Eh m g 3 U U 3 U U muu 3UU muu >iU u

> UH g <U Eh < 0) Eh < 5n«C Eh <U Eh < >,U U i—H U U

Mg JUU JUU J «C EH JUU U Eh < UUU

S ό g m<EHM muu 3 u u u eh <c >.u u 3 < eh x cg M U U «C J£Eh<£ m <C Eh (UUU MUU m<£h

3 'H δ <υυ·Η Λ Eh i UUU C/i Eh «C UUU UUU

M K r. CT

3 F] u Eh «C K uuu CUU muu «J < E-h 3UU

(0 ,< (UUU (UUU m«<Eh 1h<Eh mUU <UEh<; £h 3 U<EH W<Eh uuu kuu <uu juu

. g O m U U CUU 3 U U Su«C El 3UU «JUU

SJ M —I < Eh m<Eh 0) EH < MUU <U Eh «C mUU

g IKUU UUU JUU UUU JUU <UU

g au U OUU «JUU 3UU CUU CUU

^ UUU O u U U o M u U O <U Eh < OM<E O m < Ph

, Eh E< «C m k U U n<uu in JUO r^uUU σ» U U U

„ 3 U U 3 U U «J1CEh CUU 3UU 3 U u fN0»EH< (UEh< muu <UEh< Oi Eh «C (UEh<

MJUU JUU «CUU JUU JUU JUU

uuu >iU U MUU «JUU 3 u u a>UU MUU «JEh< muu 4>£h<

, . Ui Eh «C UUU >UU «CUU JUU

' UUU aEn «C 3UU CUU >,u u (UUU m <£ Eh 0> Eh «C m<Eh muu W«£Eh <uu juu uuu uuu

«JUU >iU U 3 U U u, u u CUU

MUU MUU M < Eh (UUU M < Eh «CUU UUU UUU Ui < Eh uuu 2 2 · .

18 105191

>iC Eh COU UUU U U U U U U

r-ι U U .h C E-* >iC Eh E-* U C < U C

OUU UUU Eh Eh C c u u e u u

3 U U (UUU u U U Eh C U U U U

ojec sz eh e α> u u Eh c < u u u ►JUU K Eh C WE C EH U EH C C Eh 3 C Eh m Eh C HUU C C u Eh u cj <-H<Eh i-hUU m Eh C -Eh U Eh < Eh Eh uuu cuu > u u u U U C < u 3 C Eh u Eh C 3 U U Eh C U C U u

i-h C Eh (DUO «-Η C Eh C U U Eh U C

UUU WE< UUU U C Eh U U U

JJ U U muu 3 u U U < U U Eh Eh

Φ Eh C >-h U U 0)Eh< U U U C U C

Σ C Eh CUU JUU Eh U Eh Eh < E- ocUUOOJUUOdJUO c u u e u u

NH<E W£E«i U C Eh U U C

HUUU HO.E4 HftE< U U Eh C U U

euu muu ^uu U C c Eh u c

^h<Eh <-h U U «JUU U U U U eh U

UUU CUU W C Eh Eh C Eh U C Eh

DuU U OUU CUU U C Eh C *C Eh

>h U U u U U i-h C Eh CJ C Eh U U U

Eh Eh C KUU UUU U Eh u U U U

OJUU JJUU 3UU U eh C U Eh U

,HEh< 0) Eh < ΦΕη< < Eh U Eh U C

hh<Eh K C Eh JUU C C Eh cj Eh CJ

UUU mUU W Eh C U Eh U C U U

•CUU --HUU -h<Eh U C Eh U U U

Eh C Eh CUU KUU U U Eh U U Eh

3 UUU >< Eh C UUO C Eh Eh Eh Eh Eh U

3 -CUU .HOU OJUU KUU U < U U U

a: eh<eh uuu weh< o e < u u u u c m muu cuu muu^ouu u u u u u

•π r-HCJU <-h C Eh —(UUr'UCJU < Eh U U U

- CUU UUU C U U H K U U C U Eh < U

H CJ Eh C u U U -hEh<T CUU Eh CJ C U U

m .Π Eh C .CUU m Eh C H<E< Eh U U U Eh

> K Eh C Eh C Eh >UU UUU Eh Eh .U U U

O ftu U OUU 3 U U muu C Eh u u u

a: W«CEh uuu a»En< I-HUU Eh u Eh Eh O

a« cuu a. u u juu cuu u u u u c 3 • >H muu CUU <HUU 3Eh«£ Eh Eh u u u ·· 3 r-HUU li < Eh m E < O Eh C U U Eh Eh Eh m cuu uuu >uu juu eh eh u u u

Eh o i—I U U ocuu o >,u uocnuu < U Eh < cj h mE< η 4) E < Ln >H U U r- -u c£ E-ι Eh Eh U U Eh H > U U M J U U -H u U U r-ι K U U Eh U U Eh u au u muu >.< eh συ u e< eh eh e u tn < Eh r-H U U I-HUU u o u C U U Eh Eh CUU CUU UUU CUU Eh u u u u

M

3UU O E C . me E 3 C Eh C U 3 C C U

(DEC uUU I—t U U O) E C C U-uC Eh U

, JUU KUU CUU JUU Eh C (Λ C Eh U

·. cuu muu συ u he<{ Eh u c c u H e E --HUU UUU m Eh C Eh U C Eh c UUU CUU CUU >UU C U U Eh U 1 • · t u u jj u u συ u συ u Eh u c eh eh 1) e < HlE< u U U u u U U u u c u JUU SCEh CUU CUU Eh c Eh Eh Eh 19 105191

CJEH<<CJCJ<CJ

cjcjcj<cjcjcj<

EhEhCJCJ<EhEhCJ

cjcj<cjcjcjcjcj

CJCJCJCJCJCJEhEh CJ CJ CJ CJ CJ Eh . CJ CJ

EhEhCJEhCJEhEhCJ

CJEhEhUCJCJCJCJ H

EhCJCJ<CJCJEhCJ H

<CJCJCJEhCJCJEh 3 > UCJCJEhCJEhCJCJ ft

U CJ CJ Eh CJ E-ι Ot-tEH

CJEhEhEhCJEhCJ3CJ C

u<ucjcj<<cn< c

EhCJCJCJEhCJCJCJ<g

EhCJCJEhCJ<EhCJCJ<d

CJEhCJ<CJCJCJ<CJoJ

E-iUOU<UE-iUE^4J

CJCJEh<CJEh<EhCJ..

<CJ<CJ<CJCJCJCJZ

CJCJCJCJCJCJEh<CJq CJCJCJCJCJCJ<CJEh| <θυΕΗθΕΗ<ΟΕΗ'-π CJCJ<EhCJCJCJCJEh.h <CJCJEh£hCJCJCJCJ£ ~<<CJEhCJ<<CJEh£ 3 «icjCJCJCJCJCJCJCJ,^ 3 Eh<Eh<CJCJCJ<<£< P EhCJCJCJCJCJ<CJ«£:(0 OS Ειθυ«ΐΕΗ<υΗ«ίφΐ

•r-i<EH<<CJCJ<EHEHM

EhCJCJEhCJCJCJCJ<e η <<<εηοο<εη<§ h <CJCJCJEhCJCJCJEh > EhCJCJEhCJCJCJCJ<° 0 EhCJCJEhEh<<<CJ.

Ji EhCJCJCJEhEhCJCJCJ^ 3 CJ<EhEhEhEhCJCJ< »H EhCJCJEhEhEhCJEhCJ + 3 CJEhCJEhEhEh<CJEh • ' Ε^ CJCJ<EhCJEhCJCJEh< CJCJCJEhEhCJCJCJCJ·^ e CJ < CJ CJ Eh cj < < CJ CJ CJ CJ CJ eh u < rv T*

< Eh CJ EH Eh < CJ Eh CJ

< CJ < CJ CJ CJ Eh CJ ^q'mi CJ EH < Eh Eh Eh < Eh U $ .2 < CJ CJ < CJ CJ CJ CJ <2 7« 3 <C < < Eh Eh CJ < <^5 0 CJ CJ CJ CJ CJ CJ CJ CJ Εη§·£

< Eh CJ CJ CJ < CJ U CJ .H

CJ CJ eh a < CJ Eh Eh Eh 0 £ <cjucjcjouuehS^ cj a u eh cj < < cj < Y Π

CJ CJ CJ CJ CJ CJ CJ < ui+J

CJ < CJ CJ < Eh CJ < < £ ίβ eh CJ CJ Eh CJ CJ CJ CJ CJ £

CJ CJ CJ EH Eh CJ CJ CJ Eh'-QW

20 . 105191

Taulukon VII mukaisen sekvenssin seuraavat ominaispiirteet ovat mainitsemisen arvoisia. Sekvenssin 5'-päässä on emäksiä, jotka vastaavat polyG-cDNA-kytkijän emäksiä. Sitten on noin viisi emästä (joista käytetään merkintää "N"), joiden sekvenssiä ei ollut helppo määrittää yksiselitteisesti 5 Sangerin §t aL, menetelmällä edeltävien useiden G:iden vuoksi. Sen jälkeen tulee 12 kodonin sarja, joka koodaa osaa polypeptidin oletetusta esijaksosta. Esimerkissä 1 kuvattujen luonnosta eristettyjen hpCSF:ien aminoterminaalisen sekvenssin perusteella osoitetaan oletetun "valmiin" hpG-CSF:n ensimmäinen treoniiniryhmä numerolla +1. Sitä seuraa valmis hpG-CSF, joka sisältää kuvi-10 ossa esitetyt 174 ryhmää. "Lopetuskodonin" (OP-kodoni, TGA) jälkeen on noin 856 emäksen verran luetuksi tulematonta 3-pään sekvenssiä ja useista Alista koostuva polyA-"häntä". Taulukossa VII näkyvät myös ainutkertaiset HgiAi- ja Apalrestriktioendonukleaasien tunnistuskohdat samoin kuin kaksi Stul-kohtaa (joita käsitellään tässä hakemuksessa prokaryoottisten ja eukaryoottisten il-15 mentymisjärjestelmien konstruoinnin yhteydessä). Koska polypeptidistä puuttuvat asparagiiniryhmät, ei siinä ole ilmeisiä N-glykosyloitumiskohtia. Alleviivatut 6 emästä lähellä 3'-pään luetuksi tulemattoman sekvenssin loppua edustavat mahdollista polyadenylaatiokohtaa.

On huomionarvoista, ettei kumpikaan kahdesta muusta 20 cDNA-kloonista, jotka identifioitiin edellä kuvatuilla hybridisaatiomenettelyillä kaikkiaan 450 000 kloonin joukosta, sisältynyt koko esijaksoa koodaavaa DNA:ta transkription aloituskohdasta eteenpäin. Itse asiassa kaikki kolme hpG-CSF-kloonia päättyivät 5'-päässä täsmälleen samassa kohdassa, mikä osoittaa, että kopioidun mRNA sekundaarirakenne estää voimakkaasti cDNA:n ;· 25 muodostumisen tästä kohdasta taaksepäin. Käytännössä tämä merkitsee sitä, ettei Okayaman et ai., [Mol. and Cell. Biol. 3 (1983) 280-289] kuvaaman kaltaista cDNA-ilmentymistutkimusta, jotka käytettiin GM-CSF:n eristämiseen [Wong et ai., Science 228 (1985) 810-814], olisi helposti voitu käyttää hpCSF-DNA:n eristämiseen, koska tällaiset eristysjärjestelmät tavallisesti edellyttävät 30 täyspitkän cDNA-transkriptin läsnäoloa tutkittavissa klooneissa.

.. Edellä esitetyn sekvenssin ei voida helposti odottaa varmistavan hpG-CSF-geenin suoraa ilmentymistä mikrobiisännässä. Tällaisen ilmentymisen varmistamiseksi hpG-CSF:ää koodaava alue tulisi varustaa aloituskodo-nilia ATG, ja sekvenssi tulisi insertoida transformaatiovektoriin kohtaan, joka 35 on sopivan promoottori-/regulaattori-DNA-sekvenssin ohjauksen alaisena.

21 105191

Esimerkki 5 Tässä esimerkissä käytettiin edellisessä esimerkissä eristettyä hpG-CSF:ää koodaavaa cDNAita qenomikloonin etsimiseen. Ihmissikiön maksasta valmistettu lambdafaagigenomikirjasto [valmistettu Lawnin et ai., mene-5 telmällä [Cell 15 (1978) 1157-1174] ja saatu T. Maniatisilta] tutkittiin käyttämällä nick-luettua koetinta, joka koostui kahdesta hpG-CSF-fragmentista, jotka oli eristetty pilkkomalla HgiAkllä ja Stukllä (HgiAl - Stul, 649 emäsparia; Stul -Stul, 639 emäsparia). Kaikkiaan noin 500 000 faagia siirrostettiin petrimaijoille (12 kpl, 15 cm), kasvatettiin pesäkkeet ja hybridisoitiin ne koettimen kanssa 10 käyttämällä Benton/Davison-menettelyä [Benton et ai., Science 196 (1977) 180]. Kolme kloonia (1-3), jotka antoivat toisessa tutkimuksessa voimakkaimmat autoradiografiasignaalit, kasvatettiin 1 litran viljelminä ja kartoitettiin pilkkomalla restriktioentsyymeillä ja tekemällä Southem-täpläanalyysi, jossa käytettiin radioleimattua 24-meerioligonukleotidia (merkkiaineena γ-32Ρ-ΑΤΡ) 15 5'CTGCACTGTCCAGAGTGCACTGTG3\ Kartoitustulokset osoittivat, että eristetyt kloonit 1 ja 3 olivat identtisiä ja klooni 2 sisälsi 2000 lisäemästä hpG-CSF-geenin 5-puolella. Kloonia 2 käytettiin sen vuoksi jatkokarakterisointiin.

Kloonin 2 DNA pilkottiin R1:llä hpG-CSF-geenin sisältävän 8500 20 emäsparin (ep) pituisen fragmentin vapauttamiseksi, joka sitten alakloonattiin pBr322:een ja kartoitettiin tarkemmin pilkkomalla restriktioentsyymeillä, tekemällä Southern Blotting -tutkimus, M13-alakloonaus ja sekventointi. Saatu sekvenssi esitetään taulukossa Vili.

« • t

• I

• · 1 · 105191 o o o o o o o O O O O O O o f-t <n n ra· m Ό r1

U O U E· S < f J U

u o u o o u y so

U 4! u O h u fr «H

E-1 U U O CU U £4 J U

E-· O < O HU O CO

U O 2 E< «O U rH<

< O U < « < U OO

U O U U CO U 1ö 3 O

U Eh Eh U r-l < O rH <D E1

O O Et E1 OU E< I J U

HOC3CJ no < IQU

U O Et U JS U o <-· u

O E· Et O E· < U O

CUElO <0 U O <

U U E· < .H U O O

E-· O E·· U < O f· U

uouu o e< u u << V U HU o u

O U < Eh PUU O EH

υ e« u u >» c o o uEu«:u r-ι a o h

U«<«5E1 OO < U

uu<eh <oh o e·

<UUEH rHU < U

o o o <; < o u o < o u 2 o .u o < u

O O Eh E< <n « E· O U

O O §η O I S «S Eh U

O H H O U O O

< U U «S U Et «C

O EH rf u u o o < u 2 u < o e<

O < 2 U O El U

< u 2 u < u u u < u o u o e· o 2 < o u o u

< 2 U E· U < H

O U E-i o < o o

< E· H U U O E-I

U E· E< Et U O < u o < o u < u

O H 2 < U O O

e-> u u e-« o o < U Et < E· < o u M Eh E· U U U E- < H OOUU u < 2 m<EhHO u u o

> 2 U E< < O O O

u o < 2 < o o O U < O Et U Eh <

~ U U < U O U E-I

U Eh O < E-· U O

U Et < E· u u o 3 U O U E· U O E1

-HU E< E· < O Et O

3 O E· < Et < U O

m Eh Eh O Eh o u <

FhUUOO o o u <U<«£ U U E-· u o o 2 u u u < < o o u o u o u < o o < o O E· «5 o < o o

«£ U 2 Eh U < O

2 o u u < o < 2 o e· u «5 o o U U O El < O < o o u <: 2 eh o o < < 2 u < u O U O 2 U o u

O E· U Et O O U

< < o < u < u

O E< O U O U EH

< u < o o u o O E< «5 EH O U Et

o o U Eh EH o O

«£ u O EH U O <

2 o C3 < O EH U

2 o o «2 < E· u - u < o 2 o u u : u u o u < e· <

u U O U E· O U

E· Et < < U Et O

2 Eh O U U O O

2 U EH «C U < < o O Et o u o 2 < u e o υ Et 2 O U O Eh o O Eh

Et O < Eh O << O Eh E· E1 O U O 00 jj O <

UOUEt <fH«EH O

o u o o 2 · 1 2 o OEh<Eh 2 30 u

<u2Eh E1 «Et U

UOOC «< JU Eh • <OOU E· o n o 2 0<<0 O cn >, <£ 2 ouuEt ehij2 o

02UU < -H O O

OUUU EH «EH O

23 105191 o o o o o o o o o o

O O O Ι-l ΡΊ PO

CO σ\ r—« f—« Ή «H

«OH O H O U < O

> o o u h u au

O C < o O O O HU

«N h < O «< O U HH

O U , <£004 O U

3 O < O O U HU

*4 < H < O U AU

o u u o H u o u

3 < O O O O >-* H

0) H <£ < < U M<

OH O O O U >. U

® U 4 O 4 U «- O

>i O 0 0 0 4 CU

UH O O 4 U 30

«n O OHUU UH

>4 O H H O O U

O «£ H U C O u £-.

3 u o 4 o u u u

U H 0 0 4 0 CD H

o u u o o < mu 30 U O H O -H 4

UH U 4 O O X U

O U O 4 H 4 >.< UU <OU< ΉΟ

JS H <OUO OO

AH O O U O O 3 U

n U OHUOmuH

UO OUOU O U

CD 4 4 O O U 30

CO OOOU UH

-i< 0 4 4 4 O U

ou h 4 4 u o

OOU OOUO «OH

3 i-ij-iU H O O < >0 n AU UOOO 30

ύ 30 00-00 UH

Tj UH O H < O OU

Z. OU O U 4 O 30 10 h U 4 o 4 U i-h 4

•1“» UU u <c o h OO

^ CD H 4 O < O 30 h U O O U 4 -h <£

M UO H H O O OO

M en 4 oo<< ou

M «ou o 4 u u n CJ

·> ·-< U O U H 4 AU

^ < O HUHU m U

o OH O < «£ U -«<

U h U O O U <£ SU

-X au 4 o 4 o mu

J«i >iU O 4 U 4 >U

3 -« O- H H H 4 UH

.H OO O H 4 4 30

3 30 4 4 U U UH

rrt UH OHOO OU

c., ou h 4 o o o «n o c OU 0<<0'P>^< u U m 3 O O O < O <

AU PDUH 4 O O u U

>-f h U OU O H O >i <

• + £ U mo O O O HH

·· H 4 >1«£U<< >-U

-« <0 U 0 4 H O O -CU

I «h U 30 4 O O H 4

4 O «-« 4 U O H «OU

3< O O «£ H 4 i-> U

4 C O O 4 U <o

OU —«< O O 4 vo m H

CO OU O O O «n >, O

ή < 3 U 4 O U UH

OU U H 4 H 4 O

O OUUUU 4

«OH 0(00 O O O U

>0 pd «-h U H O O U

n 4 < O U H H U

•CU «O < H U U U

H 4 <h U U O U H

AO 4 O U O O 4

n O >i U H O 4 U

HH ·-< O 4 4 U U

3 y y o u o 4 h UH a. h 4 o 4 h . ou m < 4 o u u

U 4 4 0 U U H U

>-i U >i U U H U H

< o <-« o o u 4 <

. h H O O O O 4 U

UO CUUHO O

CD <£ r-« 4 4 o O 4 omu o u u 4 4 u

<-« ~h 4 UUOUO H

ISU <-« h h 4 4 u a o mcuoo < no m o 4 o 4 u

·· HH ?»i 4 4 O U H

30 o 4 o o o u

UH O' O O H U H

OU HUHUU U

30 < 4 < O 4 4

UH <-· O O H U U

24 105191 O O O O o O O O O o m ό r- ®

rH rH rH <H rH

o c < < o u o o O rH < O t-i u o 3 <.

O U O r-l HJ E-l H rH <

Eh W.U rn > o < o o *c <u o au h u u U in < m < o n» φ eh U 3 0 < o Eh rH X < υ Φ Eh 3 0 O o < J Eh Φ Eh Eh < U mu J u u u < >1 O CO u < «2 u Eh j < o u o u o u o u

O H ΰ 3 0 O U

< o o ai e-· u u o«m<tj< j u u u

O Γ» j U h < O E-I

< < O £ U < Eh O O El < U El < < au < u O U m < u o o < < o u < < U 3 0 < u <2 eh ai Eh u <

O U J El O U

O Ei u U O Eh O O £ U O «i

O E-· E-ι < E-· O

O U O U U Eh

< Eh U U Eh U

O U ft. U Eh c

O O O >, Eh < U

_ < U o >-h O U U

rj O U-HOO O < 7, EH Eh 3 0 O «2

R < EH <U Eh EH U

* < U J Eh U U

P H Eh 3 0 O U

(Ö U U rl C Eh O

•n o «f O O O O

h-' o «2 o u u o < Eh u U Eh <£ M < U CU U O <

i_j Eh U U U o O

LJ < U Φ O < «C

!r O U in Eh < u ·> O U (DU U Eh

_ < < rH Eh U U

O «2 u I-H < O < λ; «2 o > o o u

M O «C rH o Eh U

3 O U O O O U

,-H < O 3 «5 o o r-j U O rH «2 o u 7, Eh C O O < < £ O U 3 0 u «2 ^ Eh Eh 0) Eh O Eh O U J U O *£ < Eh flj U O «2 o < rH u Eh Eh

Eh Eh < O Eh O

O O o C O O Eh rH 3 O U il H < Eh Eh ΓηΟΙΕη < OU Eh Eh

J U O 3 0 U «C

OCO Eh Φ Eh U U

(" rH < U J U O Eh

O U U 3 U < U

3 0 O Q) Eh O U

Φ Eh O J U Eh Eh J U O Sh O O Eh ig u O rH o OCO Eh rH CJ O O O ΓΗ H < <

«SO Eh C O ή O U U

CO U h < CO o rH< O OU rH< < OU < u U OU u ucj «2 >, < a o u : ΦΟ U EE “O u

in < U 3 U Eh Eh U

OU Eh ΦΕη Φυ U

I- U Eh JU rH Eh O

Q.U O Φυ ph< <

MU O £ Eh u O U

>* O < CU E £ U Eh

UEh U 3 Eh Eh< O

MU U Φ Eh Ui U Eh

ΦΟ Eh JU £ U U

W< U Sh U Eh < O

HU Eh rH O «U Eh ΦΟ O OO rH U <

C0< EH O H u < O U

30 < CO Φ O Φ Eh U

ΦΕη U tn< £ Eh EH

JU U «Eh ft E O

O o U U ·*Η< au Eh io h u u su m «e u CUU U 3U < o u

«JEh eh ΦΕη <0U U

rH U U JU rH U O

25 105191

o o O O o O O O

o O o o o o o o

c\ O M (N CO m· W VO

M <N IN ΓΊ fN <N CN fN

m < Eh U U O fn U Ei

KU < U U < Eh < O

£ u EH O Eh < U U Eh

¢1 U < £h U U U < U

W E· < U U < O < < mu e· u u u y h o mu e· e· u < h h o <U E< U < U < y < m e· < e· u o u eh y

m E· E· E· U U O Eh H

>u U < U E E· U O

30 E· U U U U E· O

<1)EH U E" Eh U U Eh U

►ju e· e· u < u h <

MU < Eh U U U E· O

m e· e« o e< u o e< u >o Eh < U U U U <

o>iU E< O < Eh U U U

in m o < E« O U U E· U

MUU E· U E· E< < U U

>i < U E- < O U Eh U

MU E· E· E· O < < U

ου < e· u < u < u m < U < < U O U E·

MU UUEhE->E->UU

< U U U Eh < U O U

U U E· Eh < Eh < U U

ι-u < u e· o u e< o

< U U U E· < U U E

συ U U E· O U U U

»-iO U E· < < U E· U

< U U E· £h U < E· <

CU Eh U U E· U E· U

m < U U < E Eh < < uu u e < u u < o d φ u uuuuuuu

3 -C E U E-1 U U U U U

* CU E < O < < U < U

m E < E E O E U E

/0 mu U U < U U U U

•ri CU U E < O E U U

h- HE-· U U < E U E U

<uu < U E U < U O

m W E 0* O U U U U U E

M m U OEUU<EUO

LJ mu O U < < U U U U

Γ1 CU Γ" u U U E U U E U

·> oaiu m cu u u < u u u E" ht .c H cuuuuuuu

o M O. E M<U<E<UE

M mu UUUEUUOE

Λί mu mu<ouuuE

3 < O MU U U U E-· E-· E-·

r—l 0U <UU<<E1<EH

- HU 3EUUUUUO

d a, u oje<ueuue

£ JJU JU<UUEUU

** <UEOWUUEUU<U

SE< (" -h < < U Eh U U Eh mu m se u u < u u u u

« MU OvUUUUEUE

<U hu<UEhUEhU

>i E <U U Eh U Eh U Eh

MU 3 < < U U < O U

UU «E<UUU<U

CU JUUUUUU<

M < mEh U U U U < U

uu <oeue<uuu

HU >U<<UEhUU

-CU συυυΕΕΟ<

Eh< hu<UUUUU

0U <UUUEhEhEhEh HU hU<EhUUU<

Cu U >i<<UU<UU

OCU E E < U u u < < n M < HU Eh Eh u U U <

. MUU 11 U Eh u U < < O

30 WEEE<UUU

Φ E MU<UU<OU

kJU mEEUE<<U

mu >u<e<<<e

MU 3U U U U Eh U U

* <U M<EHUUEH<<

O Eh OUU<UEUO

HU 3UU<H<UE

Λ U <X>EU<UEEE

mu ju<<<<ue mu o « u < < u < u u

<U VO JS E Eh o U Eh U U

hJ u MCUEh Eh < U EH U Eh tl H HU Eh U U Eh O <

X < <DU < Eh Eh U U U

>,< W<EHU<EH<<

MU CUU<<UUU

---- UU M< Eh U U U Eh U

3 U uuuuuuuu

<0 Eh 3UE<EEEE

JU 0>E<EU<UE

3 < JUEhUEh<UEh M < (ΠΕΗ Eh Eh U < U Eh 26 105191 o o o o o 0 0 0 0 1" t" CO o\ o o <N in fN n m E-ι u E* Eh

U < q U

Eh 2 q <

U 2 < H

q Eh q u o < o q q 2 o < < eh c u q *c q q

H O C C

q q q q

Eh < q Eh

< U U U

u e· U EH

Eh Eh <! <| y q Eh o 2 q h o q q < < eh q h U U eh < q < q u «c 2 q <

O Eh q CJ

< q < q q eh 2 c < Eh q Eh O < Eh Eh q q q q < < q q q q q q q q Eh Eh Eh < q q q Eh q < EH q c u q u < u h Λ q < q eh q 3 q u q Eh < 3 Eh u q < u $ q eh q q q

•f\ H U EH < EH

ti < u u q u <3 q U q Eh Eh -n q q q q «c H- q Eh q Eh 2 q q q q q M Eh Eh < u q

M U q q EH EH

h <C < U Eh < tr q U q q u ^ q u q <. < n q «c eh 2 q o q u u u < X Eh EH U Eh υ Λί < u q q q 3 q <C Eh Eh q ,h q o q EH < 3 Eh u q q 2 m u U Eh «£ u £ q q q 2 < ^ Eh q q 2 <

Eh q < q q q < q q q q q q < q q Eh Eh q <

Eh Eh q q q

Eh q < «< q

Eh Eh q q < < q Eh q q q q Eh < < < «< q q q q q Eh q < q q Eh q q

Eh Eh q < q q q q q q q q Eh q q o q q eh eh

Eh «c q q q q u Eh q q O EH EH < Eh <£ q q q q : q E- q q «£ q q eh < 2 q < q q Eh < q q q q q q <c q q u H u q q q q Eh Eh q q q q q eh q < < Eh q < 2 q q q

Eh q q q q

Eh q Eh

Eh < q q q

Eh 2 q q <

Eh 2 q < q • q q Eh q q

Eh EH Eh q Eh q q Eh q q «i Eh q q Eh q q Eh q q 27 . 105191 hpG-CSF-geenin sisältävän genomi-DNA:n restiktioendonukleaasi-kartta (noin 3,4 kiloemäsparia) esitetään yksityiskohtaisesti kuviossa 1. Kuviossa 1 näkyvät restriktioendonukleaasit ovat: Ncol, N; Pstl, P; BamHI, B; Apal, A; Xhol, X; Kpn, K. Kartan alapuolella olevat nuolet osoittavat genomisek-5 venssin selvittämiseen käytetyn sekventointistrategian. Laatikoilla merkityt alueet ovat cDNA-kloonissa esiintyviä alueita, ja varjostettu päästä avoin laatikko edustaa sekvenssiä, joka ei esiinny cDNA-kloonissa, mutta identifioitiin tutkimalla mRNA-täpliä koettimillä. Eksonille n:o 1 ehdotettujen koodaavien sekvenssien identifiointi tehtiin Northern-täpläanalyysillä. 24-meerinen oligo-10 nukleotidikoetin. 5GAGCAGCTGCAGGGCCATCAGCTT3’, joka kattaa ennustetut eksonien 1 ja 2 silmukoitumiskohdat, hybridisoitiin hpG-CSF-mRNA:n kanssa Northern-täplämuodossa. Tuloksena olevassa täplässä näkyy samankokoinen (noin 1650 ep) mRNA kuin eksoni 2-oligonukleotidikoettimella. Nämä tulokset yhdistettyinä kykyynohjata pSVGM-Ppol-vektorista peräisin olevan 15 hpG-CSF-geenin ilmentymistä (esimerkki 9), jossa käytetään taulukossa Vili esitettyä Met-aloituskodonia, määrittelevät eksonin 1 sisältämät koodaavat sekvenssit. Eksoneille 2-5 ovat ominaisia hpG-CSF-geenin (taulukko VII) cDNA-kloonista (Ppo2) saadut koodaavat jaksot.

Esimerkki 6 20 Tämä esimerkki koskee keinotekoisen geenin, joka koodaa hpG-CSF:ää ja sisältää E. colin kannalta etusijalla olevia kodoneja, valmistusta.

Lyhyesti ilmaistuna noudatettiin yleisesti ottaen tämän hakemuksen tekijän nimissä olevan PCT-julkaisun W083/04053 (Alton et ai.), joka maini- ·· 25 taan tässä viitteenä, mukaista menettelyä. Geenit suunniteltiin sillä tavalla, että komponenttioligonukleotideista koottiin ensin useita kaksoissäikeitä, joista puolestaan koottiin kolme erillistä jaksoa. Nämä jaksot suunniteltiin helposti lisättäviksi, ja ne voitiin amplifikaatiojärjestelmästä poistamisen jälkeen sijoittaa sopivaan ilmentymisvektoriin peräkkäin tai usean fragmentin samanaikaisella 30 ligaatiolla.

v Jaksojen I, Il ja III konstruointia valaistaan taulukoissa IX-XIV. Muo dostettaessa jakso I, mitä valaistaan taulukoissa IX ja X, oligonukleotideista 1-14 koottiin 7 kaksoissäiettä (1 ja 8; 2 ja 9; 3 ja 10; 4 ja 11; 5 ja 12; 6 ja 13; 7 ja 14). Nämä 7 kaksoissäiettä ligatoitiin sitten taulukon X mukaiseksi jaksoksi I. 35 Taulukosta X on myös havaittavissa, että jakso I sisältää jakson alussa olevan tarttuvan Xbal-pään ja sen lopussa olevan tarttuvan BamHI-pään, jotka ovat • ·« 28 105191 käyttökelpoisia tehtäessä ligaatio amplifikaatio- ja ilmentymisvektoreihin ja jaksoon II.

Taulukko IX 5

EChpG-CSFDNA -JAKSO I

CTAGAAAAAACCAAGGAGGTAATAAA 1 TAATGACTCCATTAGGTCCTGCTTCTTCT 2 10 CTGCCGCAAAGCTTTCTGCTGAAATGTCTGG 3 AACAGGTTCGTAAAATCCAGGGTGACGGT 4 GCTGCACTGCAAGAAAAACTGTGCGCTA 5 CTTACAAACTGTGCCATCCGGAAGAGC 6 TGGTACTGCTGGGTCATTCTCTTGG 7 15 CATTATTTATTACCTCCTTGGTTTTTT 8 GCAGAGAAGAAGCAGGACCTAATGGAGT 9 TGTTCCAGACATTTCAGCAGAAAGCTTTGCG 10 CAGCACCGTCACCCTGGATTTTACGAACC 11 TAAGTAGCGCACAGTTTTTCTTGCAGTG 12 20 ACCAGCTCTTCCGGATGGCACAGTTTG 13 GATCCCAAGAGAATGACCCAGCAGT 14 29 105191 ο υ o ©ου o u o vo o υ <n gH < oo o u

Eh <2 -h U o Hgi< u o ου u o E-< «2 Eh «2 < Ei u o ου e-· < eh <£ o u o υ E-· «2 u o ου U O < EH Eh dj

Eh < ου U O

O Eh dj o Eh dj o O O

inuo HOU r- < Eh ου -που .που

Eh < ©I OUHl «2 Eh U O *2 Eh .Hl «2 &H col U O HT|U O OUh| eh dj U O volO υ γμιο υ eh < υ o ου < eh u o dj EH dj Eh eh dj ©Eh< o<Eh o *2 Eh

"T Eh <2 O < Eh vo υ O

<Eh -h Eh dj .-H U O

υ o o υ o u υ o u o Eh <

EH dj Eh dJ O U

υ O EH «2 EH dj < eh o u υ o o υ ου eh

Eh < < Eh < Eh O dj Eh O u O 0<£h ro < £h σν dj Eh muu EH C dj £h rH «2 Eh «2 Eh υ υ Eh <2 < Eh ου Eh <2

<5 Eh Eh dj υ O

EH dj U O < E' < Eh Eh < Eh dj «2 eh o u υ o

Eh < Eh < OU

M

O O U o if Eh o u O ©OK

lv; CM O U 00 < Eh vrou o dj E

dj Eh «2 Eh h E< < γΗΕη<0 o u υ ου ου u m

2 oucol Eh< Eh «2 OU

2 < eh υ o υ o ου 3 >h|«2 Eh Γ0ΙΟ U o! < EH Eh <2 UO EHiCrHl «^EHiNl Eh «2 3 _ υ o υ o ir>i«2 eh ^ u o n < Eh < <2eh eh<c

L· Z

. Q o dj Eh ©Eh<2 o «2 EH o υ O

h <£ Eh γη Eh «2 ro o U en Eh < en < Eh UO H «£ Eh H Eh <2 U <2 EH OU *2 Eh «2 Eh

I <2 Eh m «f EH UO υ O

0 O <0! «2 Eh OU Εη<2-η|

01 dj Xl < Eh Eh «2 MUU

jz Eh xl uo υο ου υ υ ου <εη ου ω υ ο υ ο Εη «2 30 . 105191

Kuten taulukoista XI ja XII ilmenee, jaksoa II muodostettaessa oli-gonukleotidit 15-30 yhdistettiin 8 kaksoissäikeeksi (15 ja 23; 16 ja 24; 17 ja 25; 18 ja 26; 19 ja 27; 20 ja 28; 21 ja 29; 22 ja 30). Nämä 8 kaksoissäiettä ligatoi-5 tiin sitten jaksoksi II taulukon XII mukaisesti. Kuten taulukosta XII lisäksi ilmenee, jakson II alussa on tarttuva BamHI-pää ja lopussa tarttuva EcoRI-pää, jotka ovat käyttökelpoisia ligaatiosssa amplifikaatiovektoriin ja jaksoon I. Jaksossa Il on loppupään lähellä myös Sstl-kohta, joka on käyttökelpoinen mahdollisessa ligaatiossajaksoihin Ilja III.

10

Taulukko XI EChpG-CSFDNA -JAKSO II

15 GATCCCGTGGGCTCCGCTGTCTTCT 15 TGTCCATCTCAAGCTCTTCAGCTGGC 16 TGGTTGTCTGTCTCAACTGCATTCTGGT 17 CTGTTCCTGTATCAGGGTCTTCTG 18 CAAGCTCTGGAAGGTATCTCTCCGGA 19 20 ACTGGGTCCGACTCTGGACACTCTGCA 20 GCTAGATGTAGCTGACTTTGCTACTACT 21 ATTTGGCAACAGATGGAAGAGCTCAAAG 22 GACAAGAAGACAGCGGAGCCCACGG 23 ACCAGCCAGCTGAAGAGCTTGAGATG 24 ·* 25 ACAGACCAGAATGCAGTTGAGACAGACA 25 CTTGCAGAAGACCCTGATACAGGA 26 CAGTTCCGGAGAGATACCTTCCAGAG 27 TAGCTGCAGAGTGTCCAGAGTCGGACC 28 AAATAGTAGTAGCAAAGTCAGCTACATC 29 30 AATTCTTTGAGCTCTTCCATCTGTTGCC 30 31 105191 o U U O < E-ι o < E-h vOEh< «NE-1< co Eh «< U U HUU H u o

Eh <£ O U r-| u U ,

Eh <C o|1£ E-· rsij H O. o U U E-ι Eh < (N| U U O O m|Eh <

En < O O cn|U O

U U Eh < < Eh u u u u u u o U U o Eh < o E 4

1/1 fH < rH u U Γ" U O

U U i—I CD C_) rH U U

U U < Eh < Eh < Eh < Eh Eh <

U CD ·» CJ O U U

iOIEh < CNl CD CJ Eh < i-hIE-i «3. En < <1 Eh

CJ CD U CD CD U

Eh <C EH < < Eh

M

O CJ CD O E-H < oEh< CC

•C CD CJ O CJ CD O U U O

<E-i r-(EH< H C3 CJ O

<Eh CD CJ voi <Eh < W

U CD oolCD CJ <n| CJ CD «£

Eh < r-lICD CJ U U Eh CJ CD < Eh Eh <S Eh

Eh< U U U U U U

<Eh Eh< Eh<< < Eh H U U < Eh CJCD <CEh X O CJ CD O E-h < O < E-ι O < Eh n Eh C σι CD CJ in CJ CD -H CJ CD m

O u U Eh < ^h < E-ι cn £h < j-j I

X Eh<£ CJCD CD CJ O CD «

Eh «2 UCD CDUOOI uu en I

3 UCD Eh«£ Eh < <n( <Eh

h Eh < EH < OlU U CDU OI

3 Eh < UU Cn|Eh < «N|<c£ Eh m| Λ uu Eh< UU fM|< Eh

Eh Eh< UU <Eh UU

w o u u oeh< o u u o u u (NEC 00 CD U ht CJ CD O £-H < 0 uu UU »-fUU CN<Eh CO UUMI Eh< EhC uu

X irilCJ U<N| UU UU < EH

< «-H |u U Eh < U U U U

^ Eh< Eh< UU <Eh 1 UU < E-h in] E-ι «i <Eh

UU r~|U U cn| UU UU

< UU n!uu <Eh uu z Q o U U o Eh e o < E-ι ouu t H £h < r~ U U mUU Oi E < en UU < Eh 1-4 U U H E h : uuu «iEn uu Eh1£ • · I UU UU UU <Eh U U M EH <C E-h < Eh< a ehkuu uu uu .e <&Eh< eh < ceh U U (OUU UU Eh< « W CQEh< Eh<C uu 32 - 105191

Lopuksi valmistettiin jakso III taulukoissa XIII ja XIV esitettävällä tavalla. Tätä varten oligonukleotideista 31-42 koottiin 6 kaksoissäiettä (31 ja 37; 32 ja 38; 33 ja 39; 34 ja 40; 35 ja 41; 36 ja 42). Nämä 6 kakoissäiettä ligatoitiin sitten taulukossa XIV esitettäväksi jaksoksi III. Kuten taulukosta myös ilmenee, 5 jakson III alkupäässä on tarttuva BamHI-pää ja lopussa tarttuva EcoRI-pää, jotka ovat käyttökelpoisia ligaatiossa amplifikaatiovektoriin, ja ainakin Eco-Rl-pään kyseessä ollessa, ilmentymisvektoriin. Jaksossa III on lisäksi alkupäässä Sstl-kohta, joka on käyttökelpoinen mahdollisessa ligaatiossa jaksoihin Ilja III.

10

Taulukko XIII

EChpG-CSFDNA -JAKSO III 15 GATCCAAAGAGCTCGGTATGGCACCAG 31 CTCTGCAACCGACTCAAGGTGCTATGCCG 32 GCATTCGCTTCTGCATTCCAGCGTCGTGC 33 20 AGGAGGTGTACTGGTTGCTTCTCATCTG 34 CAATCTTTCCTGGAAGTATCTTACCGTGT 35 TCTGCGTCATCTGGCTCAGCCGTAATAG 36 AGAGCTGGTGCCATACCGAGCTCTTTG 37 ATGCCGGCATAGCACCTTGAGTCGGTTGC 38 : 25 TCCTGCACGACGCTGGAATGCAGAAGCGA 39 ATTGCAGATGAGAAGCAACCAGTACACC 40 CAGAACACGGTAAGATACTTCCAGGAAAG 41 AATTCTATTACGGCTGAGCCAGATGACG 42 30 33 . 105191

O < Eh OHC

vo U U INUU

au h^< m au < Eh k u a < eh o u a u a < u au au < w

Eh < E-» < Eh «C E< U O Eh H < Eh < au O u a 0<Eh O C Eh un a U iHUU Eh <

Eh <J »-I Eh <1 Oi H tf Eh au u o Ή Eh a U OOI 'HEh < Eh <

tN|< Eh ro] n|EH < UU

ρί|< EH u a u a u a au u a

Eh < Eh <C UUNI

U U Eh < < Eh Ή o < eh ouu o u a vt a U OUU VO Eh < UU -H Eh < H u a u a u u au

< Eh < Eh U U

< Eh Eh < OIEh < u a au n|u a

au EH < Eh <C

Eh < U U < EH

u o a u u a OIEh < O < Eh O Eh < m|u a ouu muu a u au ή u a

<C Eh < Eh UU

u a u a £h < u o au u a > < Eh Eh <C Eh < H U U UU Eh < X- au u a au h au eh< eh< 1 ä o Eh < ouu oau cn < eh co u a ht u a 3 o EH < r-l UU i-HUa H m aun < Eh , CEh 3 y H la U U U o EH <

Z 2 rolu a m|U U ml EH

S S Eh < M n Eh <£ U a ^ ? υα-U Eh < Eh < U U 03 < Eh «ΐ Eh .. < <EhWUU Eh< • z ’ a ouu ouu ouu

Cu H «£ Eh EH < Π < Eh C/J <Eh UU <-H «£ Eh

U «SEh Eh*£ UUHI

i u a eh < a u a u m u a m |eh <

Qj eh a a u rn|a a j= < e u a u o u a m Eh <C Eh *£ w m eh|«! eh «2 105191 34 ·

Jakson I muodostama Xbal - BamHI -fragmentti ligatoidaan Xbal.llä ja BamHkllä avattuun M13mp11-faagivektoriin. Vektori avataan sitten uudestaan pilkkomalla BamHkllä ja EcoRkllä, minkä jälkeen tehdään ligaatio jakson Il muodostaman BamHI - EcoRI -fragmentin kanssa. Tässä vaiheessa jaksot I 5 ja II on yhdistetty oikein orientoituneina. Seuraavaksi avataan toinen M13mp11 -vektori pilkkomalla BamHkllä ja EcoRkllä ja ligatoidaan jakson III muodostaman BamHI - EcoRI -fragmentin kanssa.

Jaksot I ja II sisältävä vektori pilkotaan Xbakllä ja Sstkllä. Jakson III sisältävä vektori pilkotaan vastaavasti Sstkllä ja EcoRkllä. Kummassakin piilo konnassa saaduista kahdesta fragmentista pienemmät ligatoidaan plasmidiin pCFM1156, joka on ennalta avattu Xbakllä ja EcoRkllä. Tämän reaktion tuloksena on ilmentymisplasmidi, joka sisältää jatkuvan, taulukossa XV esitettävän DNA-sekvenssin, joka koodaa koko hpG-CSF-polypeptidiä ja jossa on amino-terminaalinen metioniinikodoni (ATG) translaation aloittamiseksi E. colissa.

« 105191 35 3(3 Eh «3 3(3 3 Eh 30 CXEh nj Eh >-C r-r, QJ Eh U H OJ Eh 4> Eh 4) Eh W C --1 U H(3

JU U C JO JU J U C O CO UO % Q

U Eh Eh>- H C (OEh 3 Eh 3 C O C (0 C - rn

01 U U H (0 Eh rHCJ <U Eh 4) Eh u U H(J (TE

W Eh OU >0 CU JU JU CU U CO

μ Eh UQ. 3 U CC >iEh CO <0 C 3>Eh ^ t, (DU C t0 ιυ Eh H C HU H < -HU U o Bh W Eh UC JU OU OO OU CO CU >3 <tj Eh Eh >1 30 U Eh CO 30 -HO O-Eh mpn -HU o-Η HC <l)U h C 4) Eh 4) Eh u U lh CU OO OO WE OU Hl U SC C U Ö OEh oc 3 C O C HE- h£h 3>i Eh CO - m π U < h h C w U >,< -C U HO h <

0-U UO OO O- U Eh Eh Eh C OO OU

>iEh U 4) OO w Eh 30 au 3 U 4) u HO Eh H U u >iO 4) E- t/1 < Φ Eh X Eh /Γ, Γ, OO <H 0. U U Eh Hl U C O HU CU Eh $ ^

3 C CM V) £h hEh 4) U 30 30 43 C

4) Eh C >! H C 4) U XI Eh 4) Eh h< h U

HIEh C J CCU WE Hl U OO CO

O C E O' WU H Eh 30 w Eh 3 C ^ E .,-.

HU Oh >,0 4) U 4) Eh SZ U h C qjU Zt 3

MJ UC U E WE Hl U Eh C OO WE

h h Eh EH 30 30 >Eh OO -u U 43 Eh -,-

H- X: U Eh 43 4) Eh 4) Eh h O hU 4) Eh h U ί S

Eh C O > Hl U JU OO 0.0 SC CO j H XJ o OOC OW<£ OOO O H Eh O >.Eh OCO O 41 U o „

I 4) Eh <N < H TT >, C Xl V. u 00 4) U OHO <N Η < -Γ £ Eh ΓΧ ϊί H

Σ < UO HI C 0.U CO Eh HOO h O U <h Oh Eh ^ ^ C C 3 HU 43 Eh n E 30 C C 43 C ., - .

Eh C H >i -3( HU -ή <£ tl E H <; HU Airi > C OO Eh Eh »0 0 ecu JU OU C o 1¾ ^ n C 0 3 H Eh 0.(3 3 0 3C 0.0 OU c <£

3 C E 41 JCU HO 4) Eh h C h u u U

2 Eh UJ Eh < Eh Eh hU OO Eh Eh 0. U Eh 3 C E 111 <OEh OO C C OO 4) Eh 4JO -, r- p.

^ < O >1 HU HU H ti H u HH 4) Eh eg 5 ^ Eh EhU CO 0<U OU Q.U Μί-SC JU < . ^ O CW M U 4>U h E H E h £h (OEh m p. m O C >n >iO H Eh 4) U 4) U £ U HU ^ C CHJ UE h < CO Eh CO Eh Eh< < U ^ g g U 0 3 30 >iO 30 4) U H Eh >i Eh ^ p, U E 4l 4) Eh HU 4>Eh hEh Γ. U HO 5 C UJ JU OO JU h< Eh C OO £h C 03 WC 3 Eh ö3Eh >i Eh »OEh CC men —nr·) U End) >,3 4) Eh >-0 h O HU h C ^Γ) t)

U UJ JC JU U Eh UO CO OU HP^U

C Eh 4) 3 C H Eh >-E- 3C 4>Eh H Eh _,p. cn C Eh SZ H C 4) U HU H C SZ Eh SZ U Si C Eh cu OO WE OO OO CU Eh EC £ g C u H C«f 10 Eh m Eh 30 O.U O O - r- - p^ C 04) hC HC HU 4) Eh toe I.U jSri C e tn ou ecu eo ju co λ u ,¾¾ 5o U CC 3 0 >iEh 30 »tJEH <0 Eh C t£ -.-

' e CH 4) Eh ho 4) Eh h O H U H C „ S

Eh UO JU OO JU CO CO OU -5¾ ,¾¾ U OOO o 43 < 030 OCO O C C o H c 0 3 0 „ .

hu>h tnnu tn 4) h r^HC ohC h nj e- n 4i E

UC» CO JU OU OU H>U H J U juo HSU

• · 36 .

105191

Vaikka tämän DNA:n ilmentämiseen voidaan käyttää mitä tahansa soveltuvaa vektoria, voidaan ilmentymisplasmidi pCFM1156 helposti muodostaa plasmidista pCFM836, jonka konstruoimista kuvataan EP-hakemus julkaisussa 136 490. pCFM836 pilkotaan ensin Ndekllä ja tehdään sitten tylppä-5 päiseksi Po1l:llä, niin että molemmat olemassa olevat Ndel-kohdat tuhoutuvat. Seuraavaksi vektori pilkotaan Clakllä ja Sacl lilla olemassa olevan polykytkijän poistamiseksi ennen ligaatiota tilalle tulevan polykytkijän kanssa taulukon XVI mukaisesti. Tämä korvaava polykytkijä voidaan muodostaa Altonin et ai., (supra) menetelmällä. Ilmentymisplasmidissa pCFM1156 tapahtuvaa ilmenty-10 mistä säädellään lambda-PL-promoottorilla, joka puolestaan voi olla C,857 -repressorigeenin oh jauksessa (jollainen on E. coli -kannassa K12 AHtrp).

37 . 105191 v

»H

M

E-ι < oä < Eh o

U O O

U U W

< Eh Eh < U U ΓΟΟ u H3 U a E" < E-l < rl < En 3 1·

< H I—I CN

O U E O

U U (0

Eh <£ σ\ en

En <5 m a u o\ U o «1 U U r1

U U .H U U

U U <0 EH < «£ Eh a C EH «n <2 eh ki au o

Eh <3 U U Ja

Eh < 1 < Eh X

U U rH < Eh O U >H Eh < m

Eh < OI O U K

< Eh e «£ EH E

Eh «£ ·η| < £h Π3 < Eh cal Eh < m U U o < Eh «£ Eh in iH <. Eh m «i Eh m >J «i EH Γ~ EH < -ui Eh «£ < Eh - CO I < Eh

< Eh M U U 1"H

H a U OJlrH O U O

> au ό oi u a ja

X < Eh 210 U U X

Λ U U 21 U U

0 a u σι u a ή

Ai < Eh CN Γ" Eh < Π3

Ai < Eh in < Eh > s au1 a u <

IH < Eh M «. a U

01 EH < I5|rl < E O

lö U a Λ cl O U r1

EH EH <c XI Oi U U

EH 3 51 EC

< Eh CN O a r-i

a U H r-H dl E H

., Eh U Eh r—I

• Eh <£ 1 2H I £h «ί Ό

Eh < Hd UO C

< eh iqisbI au -h au -h <i e k U a ulro «2 Eh E-i < in OU ro

< Eh M O U VO

rH r-H

VO

· 2 « 38 .

105191

Esimerkki 7 Tämä esimerkki koskee hpG-CSF-polypeptidin tuottamista E. colis-sa [Met'1 ]-hpCSF:ää koodaavan DNA-sekvenssin avulla. Käytetty sekvenssi oli osittain synteettinen ja osittain cDNA-peräinen. Synteettisessä sekvenssis-5 sä käytettiin E. coiin suosimia kodoneja.

Plasmidi Ppo2, joka sisältää taulukon VII mukaisen hpG-CSF-geenin, pilkottiin HgiAkllä ja Stulillä, jolloin saatiin noin 645 emäspa-rin fragmentti, joka sisältää valmista hpCSF:ää vastaavan geenin (taulukko VII), seitsemän esijaksoryhmiä vastaavaa kodonia 5'-päässä ja noin 100 10 emäsparia 3-pään koodaamatonta aluetta. Pilkottaessa HgiAkllä jää neli· emäksinen tarttuva 5'-pää, joka on identtinen Pstl-kohdan kanssa, ja Stul-pilkonnassa jää tylppä pää. Tämä mahdollistaa fragmentin helpon sijoittamisen M13mp8(Rf):ään, joka on pilkottu Pstkllä ja tylpän pään muodostavalla restriktioentsyymillä Hindi. Kun oli tehty amplifikaatio M13:ssa, 15 hpG-CSF-DNA irrotettiin pilkkomalla Apakllä ja BamHkllä, jotka katkaisevat ketjun Apal-kohdasta, joka kattaa hpCSF:n ryhmiä +3 - +5 vastaavat kodonit, ja vastaavasti BamHI-kohdasta, joka sijaitsee M13mp8-restriktiopolykytkijässä olevan Hincll-kohdan jälkeen. hpG-CSF-polypeptidin tuottamisen mahdollistamiseksi E. colissa valmistettiin alla olevassa taulukossa XVII esitetty syn-20 teettinen fragmentti.

Taulukko XVII

5’ - C TAG AAA AAA CCA AGG AGG TAA TAA ΑΤΑ

3 i _ TTT TTT GGT Tcc TCC ATT ATT TAT

Xbal : 25 -1 +1

Met Thr Pro Leu ATG ACA CCT CTG GGC C - 5' TAC TGT GGA GAC -3’

Apal 30 Kuten taulukkoa XVII analysoimalla voidaan todeta, kytkijä sisältää tarttuvan Apal-pään, kodonit, jotka vastaavat hpG-CSF:n kolmea ensimmäistä aminopään ryhmää (jolloin "saadaan takaisin" edellä kuvatussa M13-DNA:n Apal-pilkonnassa poistuneet Thr1:ä, Pro2:a ja Leu3:a vastaavat kodonit ja käytetään E. colissa ensisijaisesti ilmentyviä kodoneja), translaation aloituskodo-35 nin ATG, 24 emäsparin pituisen sekvenssin, joka toimii ribosomisitoutumis-kohtana, ja tarttuvan Xbal-pään.

* 39 · 105191 E. co|i -ilmentämisessä käytetty ilmentymisvektori oli vektori, jota kuvataan pCFM536:na EP-hakemusjulkaisussa 136 490 (Morris, 10. huhtikuuta 1985). (Katso myös ATCC 39934, E. £oK JM103, joka sisältää pCFM536:n). Lyhyesti ilmaistuna plasmidi pCFM536 pilkottiin Xbal.llä ja 5 BamH.llä. Sitten siihen ligatoitiin edellä kuvatut hpGCSF-fragmentti (Apal/BamHI) ja kytkijä (Xba/Apal), jolloin saatiin plasmidi, josta käytetään merkintää p536Ppo2.

Plasmidilla p536Ppo2 transformoitiin E. cgli AM7 -kannan faagin-kestävä variantti, joka oli ennalta transformoitu plasmidilla pMW1 (ATCC-nro 10 39933), joka sisältää Cl857 -geenin. Transformoituminen varmistettiin kantap-lasmidin pCSF536 sisältämän antibioottiresistenssimarkkerigeenin (amp) avulla. Soluviljelmiä pidettiin yllä LB-liemessä (50 pg/ml ampisilliinia) lämpötilassa 28 °C, ja kun soluviljelmä oli kasvanut tiheyteen joka vastasi aallonpituudella 600 nm mitattua absorbanssia 0,5 (A600 = 0,5), indusoitiin 15 hpCSF-ilmentyminen nostamalla viljelmän lämpötila 42 °C:ksi kolmen tunnin ajaksi. Viljelmän lopullinen optinen tiheys vastasi A600-arvoa 1,2.

hpG-CSF-geenin ilmentymistaso transformoiduissa soluissa oli Coomassie-sinisellä värjätystä SDS-polyakryyliamidigeelistä arvioituna 3-5 % solun kokonaisproteiinista.

20 Solut otettiin talteen sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 3500 x g 10 min JS-4.2-roottorissa. Veteen sekoitetut solut [25 % (paino/tilavuus)] rikottiin johtamalla seos kolmesti French Pressure Cell -laitteen läpi, jossa vallitsi paine 69 000 kPa. Rikotut solut sisältävää suspensiota sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 x g 15 min JA-20-roottorissa. Pelletti suspendoitiin takaisin veteen ja : 25 liuotettiin kokonaisproteiinipitoisuutena noin 5 mg/ml 1 %:iseen lauriinihap- poon, joka sisälsi 50 mmol/l Trisiä, pH 8,7. Liuotettua pellettimateriaali sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 15 000 x g 10 min, ja lisättiin supernatanttiin CuS04:a pitoisuudeksi 20 mmol/l. Tunnin kuluttua tämä näyte syötettiin C4-HPLC-kolonnille puhdistettavaksi esimerkin 1(B) mukaisella menettelyllä, 30 jolloin tehtiin tarvittavat tilavuus- ja pitoisuussäädöt.

.« . Toinen puhdistusmenettely kehitettiin, jotta saataisiin suurempia määriä hpG-CSF:ää formuloituna orgaanisia aineita sisältämättömään puskuriin. Tämä materiaali soveltuu in vivq -tutkimuksiin. 150 g solutahnaa suspendoitiin noin 600 ml:aan 1 mM DTT-liuosta, ja johdettiin neljästi Manton Gualin 35 -homogenaattorin läpi, jossa vallitsi noin 48 000 kPa:n paine. Rikottuja soluja sisältävää suspensiota sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 x g 30 min, ja pel- 40 105191 letti suspendoitiin 400 ml:aan liuosta, joka sisälsi 1 % deoksikolaattia (DOC), 5 mmol/1 EDTAa, 5 mmol/l DTT:tä ja 50 mmol/l Trisiä, pH 9. Tätä suspensiota sekoitettiin huoneen lämpötilassa 30 min ja sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 x g 30 min. Pelletti suspendoitiin takaisin noin 400 ml:aan vettä ja sentrifugoi-5 tiin kiihtyvyydellä 10 000 x g 30 min. Pelletti liuotettiin 100 ml:aan liuosta, joka sisälsi 2 % Sarkosyliä ja 50 mmol/l Trisiä, pH 8. Lisättiin CuS04:a pitoisuudeksi 20 mmol/l, ja seosta sekoitettiin 16 tuntia huoneen lämpötilassa ja sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 20 000 x g 30 min. Supernatanttiin lisättiin 300 ml asetonia. Tämä seos laitettiin jäähauteeseen 5000 x g 30 min. Pelletti liuotettiin 250 10 ml:aan liuosta, joka sisälsi 6 mol/l guanidiinia ja 40 mmol/l natriumasetaattia, pH 4, ja laitettiin liuos 1200 ml:n G-25-kolonnille, joka tasapainotettiin ja eluoi-tiin 20 mM natriumasetaattiliuoksella, pH 5,4. hpG-CSF-piikki (noin 400 ml) yhdistettiin ja laitettiin 15 ml:n CM-selluloosakolonnille, joka oli tasapainotettu 20 mM natriumasetaattiliuosta, pH 5,4. Näytteen lisäämisen jälkeen kolonni 15 huuhdottiin 60 ml:lla liuosta, joka sisälsi 20 mmol/natriumasetaattia (pH 5,4) ja 25 mmol/l natriumkloridia, ja eluoitiin sitten 200 ml:lla liuosta, joka sisälsi 20 mmol/l natriumasetaattia (pH 5,4) ja 37 mmol/l natriumkloridia. 150 ml tätä eluenttia väkevöitiin 10 ml;ksi ja syötettiin 300 ml:n G-75-kolonniin, joka tasapainotettiin ja eluoitiin liuoksella, joka sisälsi 20 mmol/l natriumasetaattia ja 20 100 mmol/l natriumkloridia (pH 5,4). Piikin sisältävät fraktiot, jota oli 35 ml, yh distettiin ja steriloitiin suodattamalla. Lopullinen hpG-CSF-pitoisuus oli 1,5 mg/ml, tuotteen puhtausaste on yli 95 % geelillä analysoituna, ja se sisälsi alle 0,5 ng pyrogeeniä 0,5 mg:aa kohden hpG-CSF:ää. Pyrogeenipitoisuus määritettiin käyttämällä Limulus Amebocyte Lysate (LAL) -testivälineistöä (M.A. Βίοι 25 products, Walkersville,Maryland).

Esimerkki 8 Tämä esimerkki koskee yhdistelmämeneteimien käyttöä hpG-CSF:n kanssa analogisten polypeptidien valmistamiseen, joissa asemissa 17, 36, 42, 64 ja 74 olevat kysteiiniryhmät korvattiin yksilöllisesti sopivilla aminohappo-. 30 ryhmillä.

.· . Souzan §jt ai., (PCT-hakemusjulkaisu W085/00817, 28. helmikuuta 1985) mukaiset paikkaohjattu mutageneesi -menettelyt tehtiin plasmidin p536Ppo2 [Met'1] -ryhmää koodaavalle DNA:lle, jota kuvataan tässä hakemuksessa, käyttämällä seuraavassa taulukossa XVIII kuvattuja synteettisiä oligo-35 nukleotideja, joiden koko on 20-23 emästä. Oligonukleotidi nro 1 mahdollisti 41 · 105191 [Ser17]hpG-CSF:ää koodaavan geenin muodostumisen; oligonukleotidilla nro 2 saatiin [Ser^jhpG-CSF, jne.

Taulukko XVIII 5

Oligonukleotidi Sekvenssi 1. 5'-CTG CTC AAG TCC TTA GAG CAA GT-3' 2. i'-GAG AAG CTG TCT GCC ACC TACA-3' 10 3. 5'-TAC AAG CTG TCC CAC CCC GAG-3' 4. 5'-TGA GCA GCT CCC CCA GCC AG-3' 5. 5'-CTG GCA GGC TCC TTG AGC CAA-31

Cys-Ser-paikkaohjattu mutageneesi -restriktiot tehtiin käyttämällä 15 templaattina M13mp10:ä, joka sisälsi p536Ppo2:sta eristetyn hpG-CSF-fragmentin Xbal-BamHI. Kunkin Cys-Ser-substituution sisältävän M13mp10-kloonin DNA käsiteltiin Xbakllä ja BamHIrllä. Saatu fragmentti kloonattiin ilmentymisvektoriin pCFM746, ja ilmentymistuotteet eristettiin esimerkissä 7 kuvatulla tavalla.

20 Plasmidi pCFM746 voidaan konstruoida pilkkomalla plasmidi pCFM736 (jonka muodostamista talletetuista ja julkisesti saatavilla olevista materiaaleista kuvaa Morris PCT-hakemusjulkaisussa W085/00829, 28. helmikuuta 1985) Clakllä ja BamHl.llä olemassa oleva polykytkijän poistamiseksi ja seuraavan polykytkijän tuomiseksi tilalle.

• ·

25 Taulukko XIX

Clal 5'CGATTTGATTCTAGAATTCGTTAACGGTACCATGGAA 3' TAAACTAAGATCTTAAGCAATTGCCATGGTACCTT 30 ' GCTTACTCGAGGATCCGCGGATAAATAAGTAAC3' CGAATGAGCTCCTAGGCGCCTATTTATTCATTGCTAG 5'

Sau3a

Puhdistettaessa Cys-Seranalogeja suspendoitiin noin 10-15 g so-35 lutahnaa 40 ml:aan 1 mM DTT-liuosta, ja johdettiin seos French Pressure Cell -laitteen läpi (paine 69 000 kPa). Rikotut solut sisältävää suspensiota sentrifu- • · 42 . 105191 goitiin kiihtyvyydellä 1000 x g 30 min. Pelletti suspendoitiin liuokseen, joka sisälsi 1 % DOC:ta, 5 mmol/l EDTAa, 5 mmol/l DTT:tä ja 50 mmol/l Trisiä (pH 9), ja annettiin sekoittua 30 min huoneen lämpötilassa. Seosta sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 10 000 x g 30 min, suspendoitiin 40 ml:aan vettä ja sentrifugoitiin 5 uudelleen kiihtyvyydellä 10 000 x g 30 min. Pelletti liuotettiin 10 ml:aan liuosta, joka sisälsi 2 % Sarkosyliä, 50 mmol/l DTT:ä ja 50 mmol/l Trisiä, pH 8. Kun seosta oli sekoitettu 1 tunti, se selkeytettiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 20 000 x g 30 min ja laitettiin sitten 300 ml:n G-75-kolonniin, joka tasapainotettiin ja eluoitiin liuoksella, joka sisälsi 1 % Sarkosyliä ja 50 mmol/l Trisiä, pH 8. 10 Analogista polypeptidiä sisältävät fraktiot yhdistettiin, ja niiden annettiin hapettua seisottamalla niitä ilman vaikutuksen alaisina vähintään 1 vrk. Loppu-pitoisuudet vaihtelivat alueella 0,5-5 mg/ml.

Esimerkki 9 Tässä esimerkissä muodostettiin nisäkässoluilmentymisjärjestelmä 15 sen toteamiseksi, voisivatko nisäkässolut (COS-1, ATCC CRL-1650) tuottaa ja erittää hpG-CSF-DNA:n koodaamaa aktiivista polypeptidituotetta. Tämä järjestelmä suunniteltiin sellaiseksi, että saataisiin aikaan hpGCSF:n kanssa analogisen polypeptidin erittyminen osittain synteettisen ja osittain cDNA-peräisen rakenteen, joka koodaa [Ala1]hpG-CSF:ää, jota edeltää esipo-20 lypeptidi, jolla on Wongin §1 ai., [Science 228 (1985) 810-815] ja Leen et ai., [Proc. Natl. Acad. Sci.(USA) 82 (1985) 4360-4364]mukaan ihmis-GM-CSF:ään liittyvä sekvenssi, ilmentymisja erittymisprosessoinnin kautta.

Ilmentymisvektori, jota käytettiin keksinnön mukaisten polypeptidi-tuotteiden muodostumisen alustavaan tutkimiseen, oli "sukkulavektori", joka 25 sisältää sekä pBR322:n että SV40:n DNA:n ja joka on suunniteltu mahdollistamaan autonominen replikaatio sekä E. coliettä nisäkässoluissa, jolloin in-sertoidun eksogeenisen DNA:n ilmentyminen nisäkässoluissa on viruksen promoottori/säätely-DNA-sekvenssin ohjauksen alainen. Tämä vektori, josta käytetään merkintää pSVDM-19 ja joka on E. coli HB101:ssä, on talletettu 23. 30 elokuuta 1985 the American Type Culture Collectioniin, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, numerolla ATCC 53241.

Ilmentymisvektorin muodostamiseen liittyvät erityistoimenpiteet olivat seuraavat. Syntetisoitiin alla olevan taulukon XX mukainen esijaksoa koo-daava DNA-sekvenssi.

« 43 . 105191

Taulukko XX

-17

Hindlll Met Trp 5 --

5’ - A GCT TCC AAC ACC ATG TGG 3' - AGG TTG TGG TAC ACC

-10

Leu Gin Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Vai

CTG CAG AGC CTG CTG CTC TTG GGC ACT GTG

GAC GTC TCG GAC GAC GAG AAC CCG TGA CAC

-1 +1

Ala Cys Ser Ile Ser Ala Pro Leu GCC TGC AGC ATC TCT GCA CCC CTG GGC G -3' CGG ACG TCG TAG AGA CGT GGG GAC -5'

Apal 20

Kuten taulukosta XX ilmenee, sekvenssi sisältää tarttuvat Hindlll- ja Apal-päät ja kodonit, jotka vastaavat ihmis-GM-CSF:n "esijaksoon" sisältyviksi katsottua 17 aminohapporyhmää. Sen jälkeen tulevat alaniini-, proliinija leusii-niryhmiä vastaavat kodonit. Proliini- ja leusiiniryhmät toistavat hpG-CSF:n ·’ 25 asemissa +2 ja +3 olevat aminohapot, kun taas alaniiniryhmä toistaa GM-CSF:n aminoterminaalisen (+1) ensimmäisen kodonin, eikä hpG-CSF:n vastaavaa kodonia. Treoniinin korvaamisen alaniinilla suunniteltiin helpottavan GM-CSF-esijakson asianmukaista "prosessoitumista pois" isäntäsolussa GM-CSF:n erittymiskäsittelyyn tavallisesti osallistuvien solumekanismien 30 kautta.

Plasmidi pSVDM-19 pilkottiin Kpnkllä, ja katkaisukohta tehtiin tylppäpäiseksi Klenow-entsyymillä. Sen jälkeen DNA pilkottiin Hindlll.lla. Tuloksena oleva suuri fragmentti yhdistettiin ja ligatoitiin taulukossa VII esitettyyn Hin-dlll-Pvulll-fragmenttiin (eritetty plasmidista Ppo 2 Hindlll-pilkonnalla ja osittai-35 sella Pvulll-pilkonnalla saatuna toiseksi suurimpana fragmenttina), jolloin muodostui plasmidi pSV-Ppol. Taulukon Vili mukainen keinotekoinen

• » I

44 105191 GM-CSF-esijaksosekvenssifragmentti ligatoitiin sitten pSV-Ppol:een (kun tämä oli pilkottu Hindllklla ja Apahllä), jolloin saatiin plasmidi pSVGM-Ppol.

Plasmidin pSVGM-Ppol DNA:n kalsiumfosfaattisakoilla (1-5 μg) transformoitiin kahdella 60 mm:n maljalla olevat COS-1-solut suurin piirtein 5 Wiglerin et ai., mukaisesti [Cell 14 (1978) 725-731]. Vertailunäytteeksi transformoitiin COS-1-solut myös plasmidilla pSVDM-19. Soluviljelmien superna-tantit otettiin talteen 5 vrk:n kuluttua transfektoinnista, ja niistä tutkittiin hpG-CSF-aktiivisuus. [Ala’JhpG-CSF-saannot viljelmäsupernatanteissa olivat suuruusluokkaa 1-2,5 μg/ml.

10 Kun [Ala1]hpG-CSF-tuotetta koodaava plasmidi pSVGM-Ppol oli menestyksellisesti saatettu ilmentymään COS-1-soluissa, konstruoitiin toinen vektori, joka sisälsi ihmis-GM-CSF-esijakson, mutta jossa oli treoniiniryhmää (esiintyy luonnossa hpG-CSF:n asemassa 1) vastaava kodoni vastaavassa asemassa olevan alaniinikodonin tilalla. Lyhyesti ilmaistuna syntetisoitiin oli-15 gonukleotidi (5'CAGCATCTCTACACCTCTGGG3') paikkaohjattua mutaqe-neesiä (SDM, siten-directed mutagenesis) varten. pSVGM-Ppol:n sisältämä hpG-CSF-fragmentti Hindlll-BamHI ligatoitiin M13mp10:een SDM:ää varten. Syntetisoitu hpG-CSF-geeni, joka sisälsi Thr-kodonin asemassa 1, eristettiin pilkkomalla Hindlll.lla ja EcoRLIlä. Tämä fragmentti kloonattiin sitten 20 pSVDM-19:ään, joka oli preparoitu pilkkomalla samoilla kahdella restriktioen-donukleaasilla. Saadulla vektorilla pSVGM-Ppo(Thr) transformoitiin COS-solut, ja viljelmäsupernatanttien hpG-CSF-pitoisuuksiksi mitattiin 1-5 pg/ml.

Lopuksi käytettiin genomisekvenssiä, jonka eristämistä kuvataan esimerkissä 5, ilmentymisvektorin muodostamiseen hpG-CSF:n tuottamiseksi 25 nisäkässoluissa. Tarkemmin ilmaistuna pSVDM-19 pilkottiin Kpnhllä ja Hin-dllklla,. ja käytettiin suurta fragmenttia nelitieligaatiossa taulukossa XXI esitetyn synteettisen kytkijän kanssa, jossa oli tarttuvat Hindlll- ja Ncol-päät. Ncol-samHI-fragmentti, joka sisälsi eksonin 1 ja joka oli eristetty psR322:sta (8500 hpG-CSF), genomialaklooni ja eksonit 2-5 sisältävä 30 samHI-Kpnl-fragmentti, joka oli eristetty plasmidista pBR322 (8500 hpG-CSF -genomialaklooni). Saatu nisäkäsilmentymisvektori, pSV/ghG-CSF, tuotti 1-2,5 pg/ml hpG-CSF:ää transformoiduista COS-soluista.

• · m « 105191 45

Taulukko XXI

Hindlll

5'AGCTTCCAACAC

AGGTTGTGGTAC5'

O

Ncol

Esimerkki 10 Tämä esimerkki koskee yhdistelmäpolypeptidituotteiden fysikaalisia ja biologisia ominaisuuksia.

10 1. Molekyylipaino

Esimerkissä 7 kuvatun E. coli -ilmentymisen tuotteena olevan yhdistelmä hpG-CSF:n näennäinen molekyylipaino oli 18,8 kD määritettynä pelkistävällä SDS-PAGE:lla (kuten voitaisiin ennustaa taulukon VII mukaisesta päätellystä aminohappokoostumuksesta), kun taas esimerkin 1 mukaisesti 15 puhdistettujen luonnosta eristettyjen polypeptidien näennäinen molekyylipaino oli 19,6 kD. Luonnosta eristettyihin polypeptideihin liittyvien N-glykaanien läsnäolo voitiin varmuudella sulkea pois, koska taulukon VII mukainen hpG-CSF-primaarisekvenssi ei sisällä asparagiiniryhmiä, ja siksi suunniteltiin menettely sen määrittämiseksi, aiheuttivatko O-glykaanit luonnosta eristettyjen 20 polypeptidien ja glykosyloimattomien yhdistelmätuotteiden väliset molekyyli-painoerot. Noin 5 pg luonnosta eristettyä materiaalia käsiteltiin neuraminidaa-silla (Calbiochem.LaJolla, Kalifornia), erotettiin 0,5 pg:n näyte, ja inkuboitiin loppu materiaali 4 milliyksikön kanssa O-Glycanasea (endo-x-n-asetyyligalaktoosiaminidaasi, Genzyme, Boston, Massachusetts) 37 ” 25 °C:ssa. Seoksesta otettiin näytteet !4, 2 ja 4 tunnin inkuboinnin jälkeen. Näille näytteille tehtiin SDS-PAGE £. coji -peräisen yhdistelmämateriaalin rinnalla. Neuraminidaasikäsittelyn seurauksena eristetyn materiaalin näennäinen molekyylipaino muuttui 19,6 kD:sta 19,2 kD:ksi, mikä viittaa sialiinihapporyhmän poistumiseen. Kun näytettä oli käsitelty 2 tuntia O-glykanaasilla, molekyylipai-30 no oli 18,8 kD -identtinen E. cqI» -peräisen materiaalin molekyylipainon kanssa. Hiilihydraattirakenteen herkkyys neuraminidaasille ja O-glykanaasille viittaa hiilihydraattikomponentin seuraavaan rakenteeseen: N-asetyylineuramiinihappo-p(2-6)galaktoosi-p(1 -3)-N-asetyyligalaktoosiamiini-R, jossa R on seriini tai treoniini.

•« « 46 . 105191 2.3H-tymidiinin vastaanotto

Ihmisen luuydinsolujen proliferation indusoitumista tutkittiin 3H-tymidiinin lisääntyneen vastaanoton perusteella. Terveiltä luovuttajilta saaduille ihmisen luuydinsoluille tehtiin tiheyserotus Ficoll-Hypaquella (1,077 g/ml, 5 Pharmacia), ja pienitiheyksiset solut suspendoitiin Iscoven alustaan (GIBCO), joka sisälsi 10 % naudan sikiöseerumia ja glutamiinia, penisilliiniä ja streptomysiiniä. Sen jälkeen 2 x 104 ihmisen luuydinsolua inkuboitiin joko vertailu-alustan tai esimerkin 7 mukaisen E. co{i -yhdistelmämateriaalin kanssa 96 tasapohjaista syvennystä sisältävissä maljoissa lämpötilassa 37 °C 5 % C02:a 10 sisältävässä ilmassa 2 vrk. Mitattiin pitoisuudet kahdesta rinnakkaisnäytteestä; erot olivat 10 000 -kertaisia. Viljelmiä käsiteltiin sitten 4 tuntia 3H-tymidiinillä (0,5 pCi/syvennys, New England Nuclear, Boston, Massachusetts). 3H-tymidiinin vastaanotto mitattiin Ventuan et ai., [Blood 61 (1983) 781] kuvaamalla menetelmällä. Tässä kokeessa eristetyt ihmis-hpG-CSF-näytteet 15 pystyvät indusoimaan 3H-tymidiinin sisällytystä ihmisen luuydinsoluihin noin 4-10 kertaa voimakkaammin kuin vertailusupematantit. Esimerkin 6 mukaisella E. cd] -peräisellä hpG-CSF-materiaalilla oli samanlaiset ominaisuudet.

Toinen ihmisen luuydinsolujen proliferaatiotutkimus tehtiin käyttämällä esimerkin 9 mukaisesti valmistettua transfektoitujen COS-1-solujen kas-20 vualustaa, ja siinä saatiin samankaltaisia tuloksia, mikä osoittaa, että koodatut polypeptidituotteet todella erittyivät kasvualustaan aktiivisina materiaaleina.

3. WEHI-3B D+ -solujen erilaistumisen indusointi E. coli -peräisten yhdistelmämateriaalien kykyä indusoida hiiren myelomonosyyttileukemiasolulinjan WEHI-3B D+ erilaistumista tutkittiin puoli-25 kiinteässä agaralustassa Metcalfin [Int. J. Cancer 15 (1980) 225] kuvaamalla tavalla. Yhdistelmä hpG-CSF-tuotetta ja alustavertailunäytteitä inkuboitiin WEHI-3B D -solujen (noin 60/syvennys) kanssa lämpötilassa 37 °C ilmassa, joka sisälsi 5 % C02:a, 7 vrk. Näytteitä inkuboitiin 24 tasapohjaista syvennystä sisältävillä maljoilla, ja pitoisuuserot olivat 2000-kertaisia. Pesäkkeet luokiteltiin 30 erilaistumattomiksi, osittain erilaistuneiksi ja kokonaan erilaistuneiksi, pesäk-keiden solut laskettiin mikroskoopin avulla. E. coli -yhdistelmämateriaalien havaittiin indusoivan erilaistumista.

4. CFU-GM, BFU-E ja CFU-GEMM -määritykset

Luonnosta eristettyjen monitehoisten ihmis-G-CSF:ien 35 (hpG-CSF:ien) ja yhdistelmämenetelmillä valmistetun monitehoisen ih-mis-G-CSF:n (rhpG-CSF:n) havaittiin aiheuttavan ihmisen luuydinsolujen pro- • · 47 . 105191 liferaation ja erilaistumisen. Nämä vaikutukset mitattiin CFU-GM [Broxmeyer et a[ Exp. Hematol. 5 (1971) 87], BFU-E ja CFU-GEMM -määrityksillä [Lu et ai., Blood 61 (1983) 250], joissa käytettiin terveiltä ihmisluovuttajilta saatuja pieni-tiheyksisiä tarttumattomia luuydinsoluja. Seuraavassa taulukossa XXII verra-5 taan-CFU-GM, BFU-E ja CFU-GEMM -aktiivisuuksia, jotka saatiin käyttämällä 500 yksikköä hpG-CSF:ää ja rhpGCSF:ää.

Kaikki pesäketutkimukset tehtiin käyttämällä pienitiheyksisiä tarttumattomia luuydinsoluja. Ihmisen luuydinsoluille tehtiin tiheyserotus Fi-coll-Hypaquella (tiheys 1,077 g/cm3; Pharmacia). Pienitiheyksiset solut sus-10 pendoitiin sitten Iscoven muunnettuun Dulbecco-alustaan, joka sisälsi naudan sikiöseerumia, ja sijoitettiin Falcon -kudosviljelymaljoille (nro 3004, Becton Dickenson, Cockeysville, MD.) 1/2 tunniksi lämpötilassa 37 °C.

Taulukko XXII 15--

CFU-GM BFU-E CFU-GEMM

Alusta 0±0 26+1 0t0 2Q luonnon hpG-CSF 83+5.4 83+6.7 4+0 rhpG-CSF 87±5 81+0.1 6+2

Alustavertailunäyte koostui Iscoven muunnetusta Dulbecco 25 -alustasta, johon oli lisätty 10 % FCS:ää, 0,2 mmol/l hemiiniä ja 1 yksikköä yh-distelmäerytropoietiinia.

CFU-GM-määritysta varten 1 x 105 kohdesolua siirrostettiin 1 ml:aan 0,3 %:ista agarkasvualustaa, joka sisälsi täydennettyä McCoyn 5A-alustaa ja 10 % lämmöllä inaktivoitua naudan sikiöseerumia. Viljelmistä laskettiin pesäk-. 30 keet (yli 40 solua/aggregaattia) ja todettiin muoto 7. viljelypäivänä. Ilmoitettu pesäkemäärä on neljältä rinnakkaismaljalta laskettujen määrien keskiarvo + keskivirhe. Kaikkien CFU-GM-määrityksessä muodostuneiden pesäkkeiden havaittiin olevan klooriasetaattiesteraasipositiivisia ja negatiivisia epäspesifisen esteraasin (alfanaftyyliasetaattiesteraasin) suhteen, mikä sopii yhteen sen 35 kanssa, että pesäkkeet ovat tyypiltään granylosyyttejä. Sekä luonnon hpG-CSF:n että rhpG-CSF.n ominaisaktiivisuuden havaittiin olevan suunnil- • · 48 . 105191 leen 1x10® yksikköä/mg puhdasta proteiinia määritettynä sarjalaimennusme-netelmällä CFU-GM -kokeella. Taulukossa XXIII esitettävät BFU-E ja CFU-GEMM -tulokset edustavat kolmea erillistä koetta, ja ne vastaavat luonnon hpG-CSF:lle kirjallisuudessa annettuja arvoja. On tärkeätä huomata, että 5 rhpG-CSF on äärimmäisen puhdasta ja vapaa muista mahdollisista nisäkkäiden kasvutekijöistä sen ansiosta, että se tuotetaan E. colissa. Siten rhpGCSF.IIä on kyky tukea sekapesäkemuodostusta (CFU-GEMM) ja BFU-E:ta lisättynä yhdistelmäerytropoietiinin länsä ollessa.

5. Solusitoutumismääritykset 10 Kirjallisuudessa on kuvattu, että WEHI-3B(D+) -solut ja äskettäin diagnosoiduista leukemioista peräisin olevat ihmisen leukemiasolut sitovat 1 5l-leimattua hiiren GCSF:ää ja että tästä sitoutumisesta voidaan kilpailla lisäämällä leimaamatonta G-CSF:ää tai ihmis-CSF-p:aa. Testattiin luonnon hpG-CSF:n ja rhpG-CSF:n kyky kilpailla 125l-gpG-CSF:n kanssa sitoutumisesta 15 ihmisen ia hiiren leukemiasoluihin. Hyvin puhdas luonnon hpG-CSF (puhtausaste > 95 %; 1 μg) jodattiin [Tejedor, et ai., Anal. Biochem. 127 (1982) 1437 ja erotettiin reagensseista geelisuodatuksella ja ioninvaihtokro-matografialla. Luonnon 125l-hpG-CSF:n ominaisaktiivisuus oli noin μφ^ proteiinia. Tutkittiin hiiren WEHI-3B(D+) -soluista ja kahdesta ihmisen ääreisveren 20 myeloidileukemiasolupreparaatista (ANLL, toinen luokiteltu M4:ksi ja toinen M5B:ksi) kyky sitoa 125l-hpG-CSF:aä.

Hiiren leukemiasolut ja juuri eristetyt ihmisen ääreisveren myeloidi-leukemiasolut pestiin kolmesti PBS:llä, joka sisälsi 1 % BSA:ta. WEHI-3B(D*) -soluja (5 x 106) tai tuoreita leukemiasoluja (3 x 10®) inkuboitiin kahtena rinnak-25 kaisnäytteenä PBS:ssä, joka sisälsi 1 % BSA:ta, (100 μΙ) leimaamattomien hpG-CSF:n, rhpG-CSF:n tai GM-CSF:n poissa ollessa tai ollessa läsnä erilaisina pitoisuuksina (tilavuus 10 μΙ) ja 125l-hpG-CSF:n (noin 100 000 pulssia/min eli 1 ng) läsnä ollessa lämpötilassa 0 °C 90 min (kokonaistilavuus 120 μΙ). Sitten solut suspendoitiin uudelleen, laitettiin kerrokseksi 200 μΙ:ΙΙβ jääkylmää 30 FCS:ää 350 μΙ:η muovisessa sentrifugiputkessa, ja sentrifugoitiin (1000 x g; 1 min). Pelletti otettiin talteen leikkaamalla pois putken pää, ja tehtiin pelletille ja supernatantille erikseen laskenta gammalaskurissa (Packard).

Ominaissitoutuminen (pulssia/min) määritettiin mittaamalla koko-naissitoutuminen kilpailijan poissa ollessa (kahden rinnakkaismäärityksen kes-35 kiarvo) ja vähentämällä siitä sitoutuminen (pulssia/min) leimaamattoman hpG-CSF:n ollessa läsnä 100-kertaisena ylimääränä (epäspesifinen sitoutumi- •« « 49 . 105191 nen). Epäspesifinen sitoutuminen oli korkeimmillaan 2504 pulssia/min WE-HI-3B(D*) -solujen, 1072 pulssia/ min ANLL (M4 ) -solu jen ja 1125 pulssia/min ANLL (M5B) -solujen ollessa kyseessä. Kokeet 1 ja 2 tehtiin eri päivinä käyttämällä samaa 125l-hpG-CSF-valmistetta, ja todettiin prosentuaalisen inhibition 5 yhtenäisyys käytettäessä 2000 yksikköä hpG-CSF:ää. Saadut tulokset annetaan ta kossa XXIII.

f · a .

50 . 105191

ÖP

-P

-H

_ 3 I ° ° (S £ m 5 5

J

I 3

< CQ

® CN VO O

*3 cm r* ö -H ^

dP

s H | r*·* m ^ o oo

«=r -G

S ·*

Hl -3 £ < < 43

W 00 ·<τ CN

® <h n o

g CM CN

» i—l"

H E

£ 5 X +j i o «τ o\ o cn m o co o •h oi > o ocoio r* o ~ 5 -1

Ai + r

Ai S S

H CQ

g co —, ns i -g E-l H g fr| \ W <0 co m cn .-i o in o O co r-t

5 ^ O M Oi O COCO -—I (N rH

$ vokjioo F-ico a\ io co H' - -· - ·

g O rl CN «H CN CM CO

»H

E ο o o o ooo oo o

\ OOOOOO OO

. O O CN O O CN O O

tn ' ' » - -

V· O CN O CN CN CN

>i i-< 1-1 g « g ns <0 -ro ·η

l -ro -H -H

H |H ·· <H

H -H 6-< ·· -H ti -H (¾ CO Ey (0 Cfl e f & cV w ^ a cu a o i u ri o i en 0) -H cU I CD -h G O en

-H O A G u O Ai G ^ U

xx o -e a x o -e i •H g -C Ή g 21 CD rl >-> 0) -H o » si . 105191

Kuten taulukosta XXIII ilmenee, 125l-hpG-CSF sitoutui WEHI-3B(D+) -leukemiasoluihin. Sitoutumista inhiboi annoksesta riippuvalla tavalla leimaa-maton luonnon hpGCSF tai rhpG-CS, muttei GM-CSF. Lisäksi havaittiin luonnon hpG-CSF:n sitoutumista ihmisen myelomonosyyttileukemiasoluihin (ANLL, 5 M4). Näihin soluihin sitoutumisen rinnakkaisilmiönä tapahtuu reaktiona luon non hpG-CSF:lle nesteviljelmissä erilaistuminen valmiiksi makrofageiksi, joka voidaan todeta solujen muodosta. Se, ettei luonnon 125l-hpGCSF sitoutunut toiselta potilaalta saatuihin monosyyttileukemiasoluihin (ANLL, M5B), viittaa siihen, että tietyissä leukemioissa voi olla eroja hpG-CSF-reseptorien esiinty-10 misessa. rhpG-CSF:n kyky kilpailla luonnon hpGCSF:n kanssa samalla tavalla sitoutumisesta 125l-hpGCSF:n kanssa viittaa siihen, että reseptorit tunnistavat molemmat muodot yhtä hyvin.

Näiden kokeiden, jotka osoittavat luonnon 125l- leimatun hpG-CSF:n kyvyn sitoutua leukemiasoluihin, rinnakkaisilmiönä on luonnon hpG-CSF:n ky-15 ky indusoida viljelmässä akuuttia promyelosyyttileukemiaa (M3) ja akuuttia myeloblastileukemiaa (M2) sairastavien potilaiden pienitiheyksisten luuydin-solujen granulosyytti- ja monosyyttierilaistumista. Kummankin potilaan soluja viljeltiin 4 vrk alustassa joko yksinään tai rhpG-CSF:n läsnä ollessa (1 x 105 yksikköä). Pelkässä alustassa inkuboitujen M3vertailuviljelmien solut olivat 20 edelleen tyypiltään promyelosyyttejä, kun taas rhpG-CSF:n läsnä ollessa viljellyissä soluissa näkyi myeloidityyppisiä valmiita soluja mukaan luettuna me-tamyelosyytit, jättiläisnauhamuotoiset ja segmentoituneet neutrofiilit ja mo-nosyytit. Tämän potilaan kohdalla todelliset erot tutkittaessa 100 solua olivat seuraavat: vertailunäyte, 100 % promyelosyyttejä; rhpG-CSF-käsitellyt solut, 25 22 % emosoluja ja promyelosyyttejä, 7 % myelosyyttejä, 35 % metamy- elosyyttejä, 20 % nauhamuotoja ja segmentoituneita neutrofiilejä, 14 % mo-nosyyttejä ja 2 % makrofageja. Huomionarvoinen on se seikka, että yksi poly-morfonukleaarisista granulosyyteistä sisälsi edelleen voimakkaan au-er-sauvan, mikä viittaa siihen, että ainakin tämä solu oli erilaistunut leukemi-30 aklooniin kuuluva solu. Toisen myeloblastileukemiapotilaan soluja (M2) viljeltiin myös 4 vrk rhpG-CSF:n läsnä tai poissa ollessa. Pelkässä alustassa kasvatettujen M2-solujen visuaalinen analyysi osoitti suuria "emosolun kaltaisia" soluja, joista joissakin oli nukleoleja. Jotkut shpG-CSF:llä käsitellyistä M2-soluista erilaistuivat valmiiksi segmentoituneiksi neutrofiileiksi, joissa oli 35 jäljellä auersauvoja keskusneutrofiilissä, mikä viittaa erilaistumisen tapahtumiseen leukemiaklooniin kuuluvassa solussa. Tutkittaessa morfologisesti 100

• I

« 52 105191 solun todellinen erilaistuminen, todettiin, että vertailusolut olivat 100 %:isesti emosoluja. rhpG-CSFkäsitellyistä soluista oli 43 % emosoluja, 1 % my-elosyyttejä, 15 % metamyelosyyttejä, 28 % nau ha muotoja ja segmentoituneita neutrofiilejä, 2 % promonosyyttejä ja 11 % monosyyttejä. Leukemiasolujen 5 erilaistumista tutkittiin myös neljällä muulla rhpG-CSF-pitoisuudella (5 x 103, 1 x 104, 2,5 x 104 ja 5 x 104 yksikköä/ml, tuloksia ei esitetä). Jopa pienimmällä tutkitulla rhpG-CSF-pitoisuudella (5 x 103 yksikköä/ml) tapahtui merkittävä erilaistuminen (solut erilaistuivat myelosyyttivaiheen ohi) sekä M3(50 %) että M2-(37 %) leukemiasolujen kohdalla.

10 6. Immuunimääritys

Polyklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi immuunimäärityk-sessä käytettäviksi käytettiin antigeeninä esimerkin 1(B) mukaisesti preparoidusta ihmisen virtsarakkokarsinoomasolulinjasta 5637 (1A6) puhdistettua mo-nitehoista G-CSF:ää. Tämän materiaalin puhtausasteen todettiin olevan 85 % 15 polyakryyliamidigeelien hopeanitraattivärjäyksen mukaan. Kuuden viikon ikäiset Balb/C-hiiret immunisoitiin injektoimalla ihonalaisesti useaan kohtaan antigeeniä. Antigeeni suspendoitiin PBS:ään ja emulgoitiin yhtä suurten tilavuuksien kanssa Freundin täydellistä apuainetta. Annos oli 5-7 μg antigee-nia/hiiri/injektio. Tehosteimmunisointi tehtiin 18 vrk:n kuluttua samalla määrällä 20 antigeeniä emulgoituna yhtä suureen määrään Freundin epätäydellistä apuainetta. 4 vrk:n kuluttua otettiin hiirestä seeruminäyte ihmisen monitehoiselle G-CSF:lle spesifisen vastaaineen testaamista varten.

Pitimissä olevat Dynatech Immulon II Removawell -liuskat (Dynateck Lab., Inc., Alexandria, Virginia) päällystettiin seoksella, joka sisälsi 5 " 25 Mg/ml hpG-CSF:ää 50 mM karbonaatti-bikarbonaattipuskurissa, pH 9,2. Sy vennykset päällystettiin 0,25 μ9'.Ιΐ3 materiaalia (tilavuus 50 μΙ). Antigeenillä päällystettyjä maljoja inkuboitiin 2 tuntia huoneen lämpötilassa ja yön yli lämpötilassa 4 °C. Liuos dekantoitiin, ja levyjä inkuboitiin 30 min 5 % BSA:ta sisältävä PBS:n kanssa reaktiivisen pinnan suojaamiseksi. Tämä liuos kaadettiin 30 pois, lisättiin syvennyksiin laimennettua ennen immunisointia otettua tai testi-seerumia, ja inkuboitiin 2 tuntia huoneen lämpötilassa. Seerumit laimennettiin 1 % BSA:ta sisältävällä PBS:llä, pH 7,0. Seerumiliuos dekantoitiin, ja maljat pestiin kolmesti Wash Solution -liuoksella (KPL, Gaithersburg, Maryland). Kuhunkin syvennykseen lisättiin noin 200 000 pulssia/min jodattua kaniinin an-35 ti-hiiri-lgG:tä (NEN; Boston, Massachusetts) 50 μΐιβεβ PBS:ää, pH 7,0, joka sisälsi 1 % BSA:ta. Kun maljoja oli inkuboitu 1 1/2 tuntia huoneen lämpötilassa, • 9 9 53 . 105191 liuos dekantoitiin, ja levyt pestiin viidesti Wash Solukonilla. Syvennykset poistettiin pitimestä ja niille tehtiin laskenta Beckman 5500 -gammalaskurissa. Hiiren seerumit, joissa pitoisuudet olivat suuria, osoittivat yli 12 kertaista reaktiivisuutta vastaaviin ennen immunisointia otettuihin seerumeihin nähden laimen-5 nussuhteen ollessa 1:100.

E. coH -peräisen hpG-CSF:n immunologiset ominaisuudet määritettiin mittaamalla reaktiivisuus hiiren seerumin kanssa, joka sisälsi suurena pitoisuutena nisäkässoluperäiselle hpG-CSF:lle spesifistä vasta-ainetta. 0,25 pg E. coli -peräistä proteiinia (puhtausaste 90 %) laitettiin Immulon II Removawell 10 -syvennyksiin 50 μΙ:η tilavuudessa, ja tutkittiin hiiren seerumi edellä kuvatulla tavalla.

Hiiren seerumien, joissa pitoisuus oli suuri, reaktiivisuus E. coli -peräisen materiaalin kanssa oli 24-kertainen vastaavaan ennen immunisointia otettuun seerumiin nähden laimennussuhteen ollessa 1:100.

15 7. Seriinianalogien biologiset määritykset

Esimerkin 9 mukaisesti valmistetuista [Ser17]hpG-CSF, [Ser36]-hpG-CSF, [Ser^hpG-CSF, [SeOhpG-CSF ja [Ser74]hpG-CSF -tuotteista tutkittiin hpG-CSF-aktiivisuus 3H-tymidiinin vastaanotto, CFU-GM ja WEHI3B D* -määrityksillä. Kussakin määrityksessä [Ser17]-analogilla oli rakenteeltaan 20 luontaisten yhdistelmämolekyylien kanssa vertailukelpoinen aktiivisuus. Muiden analogien aktiivisuus oli noin 100 kertaa pienempi 3H-tymidi'inin vastaanotto -kokeessa, 250 kertaa pienempi CFU-GM-määrityksessä ja 500 kertaa pienempi WEHI-3B D* -määrityksessä. Nämä tulokset tukevat sitä olettamusta, että asemissa 36, 42, 64 ja 74 olevia kysteiiniryhmiä saatetaan tarvita täyden " 25 biologisen aktiivisuuden saavuttamiseksi.

8. In vivo -biologinen määritys

Alzet® -osmoottiset pumput (Alzet Corp., Palo Alto, CA; malli 2001) kytkettiin oikean kaulavaltimon sisäisiin katetreihin ja istutettiin ihon alle seitsemään Syyrian kultahamsteriurokseen. Neljä pumpuista sisälsi puskuria [20 30 mmol/l natriumasetaattia (pH 5,4) ja 37 mmol/l natriumkloridia] ja 1,5 mg/ml E. coli -peräistä hpG-CSF:ää, kun taas 3 sisälsi pelkkää puskuria. Osmoottisten pumppujen ilmoitettu pumppausnopeus oli 1 μΙ/h korkeintaan 7 vrk:n ajan. Kolmantena päivänä pumppujen istutuksen jälkeen neljän käsitellyn hamsterin keskimääräinen granulosyyttiluku oli kuusinkertainen kolmeen vertailueläi-35 meen nähden (puskuria saaneet), ja kohonnut granulosyyttiluku heijastui ko-konaislymfosyyttimäärään, joka nelinkertaistui. Käsittely ei muuttanut eryt- V .

54 . 105191 rosyyttien määrää. Nämä tulokset osoittavat, että yhdistelmämateriaali edistää spesifisesti granulosyyttien tuotantoa ja/tai vapautumista nisäkkäässä.

Luonnossa esiintyvien hpG-CSF:n alleelisten muotojen lisäksi tämä keksintö koskee myös muita hpG-CSF-tuotteita, kuten hpG-CSF:n kanssa 5 analogisia polypeptidejä ja hpG-CSFfragmentteja. Noudattamalla edellä mainitun Altonin et aj., nimissä olevan hakemusjulkaisun (WO/83/04053) mukaisia menettelyjä on helppo suunnitella ja valmistaa geenejä, joiden mikro-bi-ilmentymistuotteina on polypeptidejä, joiden primaarirakenne on erilainen kuin tässä määritelty yhden tai useamman ryhmän identiteetin tai sijainnin 10 suhteen (esimerkiksi substituutiot, lisäykset ketjun päihin tai keskelle ja delee-tiot). cDNA- ja genomigeenejä voidaan vaihtoehtoisesti helposti muuntaa käyttämällä tunnettuja paikkaohjattu mutageneesi -menetelmiä, ja käyttää näitä muunnettuja geenejä analogisesti polypeptidien ja polypeptidijohdosten muodostamiseen. Tällaisilla tuotteilla olisi ainakin yksi yhteinen biologinen 15 ominaisuus hpGCSF:n kanssa, mutta muut ominaisuudet voivat olla erilaisia. Esimerkkeinä johdoksista mainittakoon tuotteet, joita on lyhennetty esimerkiksi deleetioiden kautta; hydrolyysiä paremmin kestävät tuotteet (joiden vaikutukset voivat siksi olla voimakkaampia tai pitempään kestäviä kuin luonnossa esiintyvillä tuotteilla); tuotteet, joista on poistettu yksi tai useampia mahdollinen 20 o-glykosylaatiokohta (mikä saattaa johtaa hiivassa tuotettujen tuotteiden suurempiin aktiivisuuksiin); tuotteet, joista on poistettu yksi tai useampia kysteiini-ryhmiä tai joissa ne on korvattu esimerkiksi alaniini- tai seriiniryhmillä ja jotka on mahdollisesti helpompi eristää aktiivisessa muodossa mikrobijärjestelmistä; tuotteet, joissa yksi tai useampia tyrosiiniryhmiä on korvattu fenyylialaniinilla ja 25 jotka voivat enemmän tai vähemmän helposti sitoutua kohdesoluilla oleviin hpG-CSF-reseptoreihin. Keksinnön piiriin kuuluvat myös polypeptidifragmentit, jotka sisältävät vain osan hpG-CSF:n jatkuvasta aminohapposekvenssistä tai sekundaarirakenteesta, joilla fragmenteilla voi olla yksi hpG-CSF:n vaikutuksista (esimerkiksi sitoutuminen reseptoreihin) mutta ei muita (esimerkiksi pe-, 30 säkkeiden kasvua stimuloivaa aktiivisuutta). On huomionarvoista, että tuottei- den ei välttämättä tarvitse olla aktiivisia ollakseen terapeuttisesti käyttökelpoisia [katso Weiland et ai., Blut 44 (1982) 173-175] tai käyttökelpoisia muissa yhteyksissä, kuten hpG-CSF-antagonismimäärityksissä. Kompetitiiviset antagonistit voivat olla sangen käyttökelpoisia esimerkiksi hpG-CSF:n ylituotanto-35 tapauksissa.

• I

55 . 105191 Tämän keksinnön erään toisen aspektin mukaisesti tässä kuvattu hpG-CSF-polypeptidejä koodaava DNA-sekvenssi on arvokas sen informaation ansiosta, jonka se antaa tämän nisäkäsproteiinin aminohapposekvenssistä ja jota ei tähän asti ole ollut saatavissa muulla tavalla kuin analysoimalla luon-5 nosta eristettyjä tuotteita. Nämä DNA-sekvenssit ovat myös huomattavan arvokkaita tuotteina, jotka ovat käyttökelpoisia suurimittaisen hpG-CSF-mikrobisynteesin aikaansaantiin erilaisilla yhdistelmämenetelmillä. Toisin sanoen tämän keksinnön mukaiset DNA-sekvenssit ovat käyttökelpoisia muodostettaessa uusia ja käyttökelpoisia virus- ja rengasplasmi-10 di-DNA-vektoreita, uusia ja käyttökelpoisia transformoituja ja transfektoituja prokaryoottisia ja eukaryoottisia mikrobi-isäntäsoluja (mukaan luettuina bakteeri- ja hiivasolut ja viljelmässä kasvatettavat nisäkässolut), ja uusia ja käyttökelpoisia menetelmiä tällaisten, hpG-CSF:ää ja sen sukulaistuotteita tuottamaan kykenevien mikrobi-isäntäsolujen kasvattamiseksi viljelmässä. Keksin-15 nön mukaiset DNA-sekvenssit ovat myös huomattavan käyttökelpoisia materiaaleja käytettäviksi leimattuina koettimina ihmisen genomi-DNA-sekvenssien samoin kuin muiden nisäkäslajien cDNA- ja genomi-DNA-sekvenssien, jotka koodaavat hpG-CSF:ää ja sen sukulaisproteiineja, eristämisessä. DNA-sekvenssit voivat olla käyttökelpoisia myös erilaisissa vaihtoehtoisissa 20 proteiinisynteesimenetelmissä (esimerkiksi hyönteissolumenetelmissä) tai ihmisen ja muiden nisäkkäiden geeniterapiassa. Keksinnön mukaisten DNA-sekvenssien odotetaan olevat käyttökelpoisia kehitettäessä transgeenisiä nisäkäslajeja, jotka voivat toimia eukaryoottisina "isäntinä" suurten hpG-CSF-määrien ja hpGCSF-tuotemäärien tuottamiseksi. Katso yleisesti 25 Palmiter et ai., Science 222(4625) (1983) 809-814.

hpG-CSF:n fragmenttien ja sen kanssa analogisten polypeptidien kannalta käyttökelpoisia ovat raportit, jotka koskevat synteettisten peptidien, jotka suurin piirtein toistavat luonnossa esiintyvien proteiinien, glykoproteiinien ja nukleoproteiinien sisältämän aminohapposekvenssin, immunologista aktiivi-30 suutta. Tarkemmin määriteltynä suhteellisen pienimolekyylisten polypeptidien on osoitettu osallistuvan immuunireaktioihin, jotka pituudeltaan ja laajuudeltaan vastaavat fysiologisesti merkittävien proteiinien, kuten virusantigeenien, polypeptidihormonien tms. aikaansaamia immuunireaktioita. Tällaisten polypeptidien immuunireaktioiden joukkoon kuuluu spesifisten vasta-aineiden 35 muodostumisen provosointi immunologisesti aktiivisissa eläimissä. Katso esimerkiksi Lerner et ai., Cell 23 (1981) 309-310; Ross et ai., Nature et ai 294 • » 56 . 105191 (1981) 654-656; Walter et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 77 (1980) 5197-5200; Lemer et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 78 (1981) 3403-3407; Walter et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 78 (1981) 4882-4886; Wong et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 78 (1981) 7412-7416; Green et ai., Cell 28 (1982) 5 477-487; Nigg et ai-, Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 79 (1982) 5322-5326; Baron et ai.. Cell 28 (1982) 395-404; Dreesman et ai, Nature 295 (1982) 185-160; ja Lerner, Scientif-ic American 248, nro 2 (1983) 66-74.

Katso myös Kaiser et ai., Science 223 (1984) 249-255, joka julkaisu koskee synteettisten peptidien, joilla on suurinpiirtein samanlainen sekundaari-10 rakenne kuin peptidihormoneilla muttei välttämättä niiden kanssa yhteistä pri-maarirakennetta, biologisia ja immunologisia vaikutuksia.

Vaikka tätä keksintöä on kuvattu edullisten suoritusmuotojen suhteen, ymmärrettäneen, että alan ammattimiehelle tulee mieleen variaatioita ja modifikaatioita. Siksi on tarkoitus, että liitteenä olevat patenttivaatimukset kat-15 tavat kaikki tällaiset ekvivalenttiset variaatiot, jotka kuuluvat keksinnön piiriin.

• * t

Claims (12)

1. 57 · 105191
2. 1. Eristetty DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se ilmennettäessä proka-ryoottisessa tai eukaryoottisessa isäntäsolussa koodaa luonnossa esiintyvän, 5 ihmisen monitehoisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän hematopoi-eettiset, biologiset ominaisuudet omaavaa polypeptidiä, jolla on taulukossa VII esitetty aminohapposekvenssi, ja että se on (a) taulukossa VII esitetty DNA-sekvenssi, (b) DNA-sekvenssi, joka hybridisoituu kohdassa (a) määritellyn 10 DNA-sekvenssin kanssa, tai (c) DNA-sekvenssi, joka koodaa polypeptidiä, jolla on sama aminohapposekvenssi kuin kohdassa (a) tai (b) määriteltyjen DNA-sekvenssien koodaama polypeptidi.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu 15 siitä, että se on genominen DNA-sekvenssi.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se on cDNA-sekvenssi.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se sisältää yhden tai useampia kodoneja, jotka ovat edullisia ilmen- 20 tymiselle E. coli-soluissa.
6. 5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se sisältää yhden tai useampia kodoneja, jotka ovat edullisia ilmentymiselle hiivasoluissa.
7. 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu : 25 siitä, että se koodaa ihmisen monitehoisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän polypeptidianalogia, jossa yksi tai useampia kysteii n itä hte itä on poistettu tai korvattu alaniini- tai seriinitähteillä.
8. 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa ihmisen monitehoisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan 30 tekijän (Ala1)-analogia. * .. 8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koodaa ihmisen monitehoisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän (Mef1)-analogia.
9. 9. Biologisesti toimintakykyinen plasmidi- tai virus-DNA-vektori, 35 tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-sekvenssin. • 105191 58 -
10. 10. Bakteeri- tai nisäkäsisäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu tai transfektoitu patenttivaatimuksen 1 mukaisella DNA-sekvenssillä tavalla, joka sallii isäntäsolun ilmentää mainittua polypeptidiä.
11. 11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen isäntäsolu, tunnettu 5 siitä, että se on E. coji.
12. 12. Menetelmä sellaisen polypeptidin tuottamiseksi, jolla on luonnossa esiintyvän, ihmisen monitehoisen granulosyyttipesäkkeitä stimuloivan tekijän hematopoieettiset, biologiset ominaisuudet, tunnettu siitä, että patenttivaatimuksessa 1 määritelty DNA-sekvenssi saatetaan ilmentymään 10 patenttivaatimuksen 10 mukaisessa isäntäsolussa ja eristetään halutut poly-peptidituotteet. * • · 1 « 59 · 105191