JPS59501096A - 構造遺伝子の製造および発現 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 構造遺伝子の製造および発現 本発明は１畳こ遺伝物質の１清乍に、より具体的には、望みの蛋白質の生産を確 保する絹み侃え手順に有用な特定のＤＮＡ配列の製造に関する。 遺イ遍勿質田既括的に、細胞およびウィルスの組成分の縣をプログラムし誘導し 且つ細胞およびウィルスの反応を腓卸する化学物質として定義することができる 。デオキシリポ核酸（ＤＮＡ　）として知られる長鎖重合体物質は、り源側１　 （ＲＮＡ　）によってプログラムされるある種のウィルスを除いて、あらゆる生 細胞およびウィルスの遺伝物質を構成する。 ＤＮＡポリマーの反復単位は４つの異なるヌクレオチドであり、それらは各々燐 酸塩群がくっついたデオキシリポ核酸）唐頻Ｑこ結合したプリン（アデニンある いはグアニン）あるいはピリミジン（チミンあるいはノドノン）から成る。直線 状ポリマー内のヌクレオチ１の接合は、ｊつのヌクレオチドのｓ゛ｉｊ’ａ’ａ の別のヌクレオチドの３゛ヒＩロキノル基への融合による。１幾能ＤＮＡはヌク レオヂ１の一本鎖（デオキシオリゴヌクレオチドとして知られる）の安定した一 本鎖会合の形で生し、この会合はプリン塩基およびブリミジン塩基の間の水素結 合によって牛しる〔即ち、アデニン（八）とチミン（Ｔ）との間あるいはグアニ ン（Ｇ）とシトノン（Ｃ）との間に存在する「相補的」会合〕。慣習により、ヌ クレオチドはそれらを形成するフ刃ン塩基あるいはプリミジン塩基の名前で呼ば れ、二本鎖ＤＮＡの相補的列合卿ち、　Ａ−ＴおよびＣ−Ｃ）は「塩基対」と呼 ばれる。り月刻狡は１ポリヌクレオチドであり、アデニン、グアニン、シトノン 、および、チミンの代わりにウラノル（１１）から成り、これらはりホースおよ び側群に結合している。 最も簡ｌヤに云うと、Ｄ′り＾のプログラム疑能は一般に、特定のＤＮＡヌクレ オチド配列（遺伝子）が比較的に不安定なメノセンジ＋−ＲＮＡ　（ｍＲＮＡ） ポリマーに「転写Ｊされるプロセスによって達成されろ。州ＮＡは、一方、アミ ノ酸から構造、８雁Ｗおよび触媒蛋白質を生成する鋳型として役立つ。この翻訳 プロ（−）、（：は、小さなＲＮ八へ（ｔＲＮＡ）のイｍＪきが関連し。 ｔＲＮＡは個々のアミノ酸を送り込んでｍＲＮＡに、合って桿クリさせて、適切 なアミノ酸配列のポリペブチ１０ヰ戒を可能にする。ＤＮ＾から得られ、　ｔＲ ＮＡの供給と２０のアミノ酸の定位の基礎を定めてポリペブチ１の「発現ｊをも たらずｍＲＮＡのｒメノセージノは、トリジレノ１．ｒコドン」の形態−３つの ヌクレオヂ１−゛塩基の６＆ｌＪ的なグループ化をとる。ある意味では、蛋白質 の形成は、遺伝子のヌクレオチド必１」によってもたらされるプログラムされた 遺伝メツセージの「発現」の究極的な姿である。 ＤＮＡポリマー内で普通遺伝子のｌのに来る」あるＤＮＡ　醪１１は、　ｍＲＮ ＾への転写の開始謂立をもたらす。これらはｒプロモーターｊ配列と呼ばれる。 　ＤＮＡポリマー内で通常遺伝子のｒ上流ＪＧ！ＩＩち、先行）にあるその他の ＤＮＡ配列は、転写開始の頻度（あるいは肋を決定する蛋白質を結合する、これ らその他の配列はｒレギュレーター」配列と呼ばれる。 このように１機能ＤＮＡポリマーのなかで選択された遺伝子１つ（あるいは複数 の遺伝子の翫ソリ）に先立ち、且つ遺伝子の転写（およびその後の発現）が起き るか否かを決定する配列は、「プロモーター／レギュレーターＪあるいは「制御 Ｊ　’ＤＮＡ配列と総称される。ＤＮＡポリマー内で遺伝子に「続きＪ且っｍＲ Ｎ＾への転写の終了の信号をもたらすＤＮＡ翫汐すは「ターミスイクーＪ配列と 呼ばれる、 過去１舒ト近くの間、微生物学的プロセスの焦点は、望ましい生成物に関する遺 伝コード情報をもともとＤＮＡに持たない生物を用いて産業に、そして製薬に有 用な物質を製造することに向けられてきた。簡単に云うと、生成物の構造を定め る遺伝子は、「供与Ｊ生物から分離されるか、あるいは、化学的に合成され、そ して、安定的に別の生物に導入され。 前述の別の生物は自己複製単細胞微生物であることが望ましい。これが達成され れば、　ｒトランスフオームされた」宿主細胞内の遺イに子発現の既存の機序が 動いて望みの生成物を作り上げる。 この技術分野には１選択された宿主生物のトランスフォーメイションに使用する 遺伝物質の分階１合成３ｗＩ裂、および増幅のための「組み替えＤＮＡ　Ｊ方法 論に関する数多くの特許および文献が多い。例えば、　Ｃｏｈｅｎ等の特許番号 ４，２３７，２２４は１選択された外来性のＩＩＩＮＡ削汐すを含む「ハイブリ ッド」ウィルスＤＮＡあるいは環状プラスミドＤＮＡを用いた原核ｆｌ細胞宿主 生物のトランスフォーメイションに関連する。Ｃｏｈｅｎ等の特許の手順は、ま ず酵素的にウィルスＤＮＡある醤［ｄ犬プラスミドＤＮＡを切断して直線状ＤＮ Ａを形成することによる１−ランスフォーメイション・ベクターの製造に関す本 選択された外来性ＤＮＡ鎖は。 同様な酵素を使用することによって直線状に調製される。直線状のウィルスＤＩ ＩＡあるいはプラスミド胴は外来性ＤＮＡと共に結合酵素の存在のもとで培養さ れ、前述の酵素は修復プロセスを行う能力があり、　「ハイブリッド−ベクター が形成され、前述のベクターはウィルスＤＮＡあるいは環状ＤＮ八へラスミドに 「ヌプライスされたＪ外来性ＤＮＡ断片を含む。 和合性のある単細胞宿主生物のハイブリッド・ベクターによるトランスフォーメ イションは、宿主細胞内に外来性ＤＮＡの多数の複製を生し名湯台によっては、 目的は単に外来性ＤＮＡの増幅であり、収穫される「生成物ＪはＤＮＡである。 もっと多くの場合に、トランスフォーメイションの目標は、外来性のＤＮＡの宿 主細胞による発現であり、ｌＡ来性ＤＮＡによってコードが示された商業的に有 用な蛋白質あるいはポリペプチド断片を分離可能なほどの量だりＭＥＴＡＬこ合 成する形をとる。例えば４会衆国特許番号４，２６９，７３１’　（Ｓｈｉｎｅ 　）　。 ４．２７３，８７５　（Ｍａｎｉｓ　）および４，２９３，６５２　（Ｃｏｈｅ ｎ　）を参照のこと。 Ｃｏｈｅｎ等の特許に記載されたような手順の成功は、主にｒ制■エンドヌクレ アーゼ」酵素が容易に入手できることによるものであり、前述の酵素はハイブリ ッド化されない調温ベクター、および重要な外来竹五ツリを含む真核生物のＤＮ Ａ鎖等の特定の部位の切断を促進する。二本鎖直線状ＤＮＡ鎖に一本鎖相補性「 末端ｊを形成する切断の仕方は、　「結合Ｊｉｖ素の処理を受けたときの外来性 ＤＮＡのへククーへの殴能的組み込みの蓋然性を非電に高める。このような多数 の利尿エンドヌクレアーゼ酵素が現在商業的に入手可能である〔例えば、ヘエセ ツダ・リサーチ・ラボラトリーズ＋　ＩｎＣ−＋ガイザーズバーグ、メアリラン ド州のｒ１９８１／１９８２カタログＪに載ったｒＢＲＬ制限エンドヌクレアー ゼ参照表ｊを参照のこと。〕ハイブリッドの形成の確認は、クロマトグラフの手 法によって容易なものとなり、前述の手法は１例えば３分子量に基づいて非ハイ ブリッド・プラスミドとハイブリッド・プラスミドとを別けることができる。そ の他の有用な手法ハ輿■１ｏＮａハイプリント形成に関連するものである。 原核細胞のトランスフォーメイションの成功に大いに寄与した別の操作ｒ道具ｊ は、選択可能な「標ｉＲＪ遺伝壬すの使用である。簡潔に言うと、望ましい外来 性興へに加えて、トランスフオームされた宿主細胞をトランスフオームされない 宿主細胞から区別することの出来る形質特性を発現するコードをもつ１つあるい はそれ以上の開＾耐万すを含むハイブリッド　ベクター力９史用される。典型的 な標識遺伝子伍汐りは１　トランスフオームされた原核細胞が、トランスフオー ムされない宿主細胞を殺すかあるいはその増殖を甚だしく阻止する金属、抗生物 質、および同様のものを含む培地の中で生存し増殖することを可能とするもので ある。 トランスフオームされた宿主微生物内において外来性遺伝子が首尾よく発現する か否か−ター領域（例えば、リポゾーム結佃刑）を持つトランスフォーメイショ ン・ベクターに組み込めるか否かによって決ま゛る。遺伝子の１元のｊプロモー ター／レギュレーター領域が新しい宿主において高レベルの発現を許すことは珍 しい。従って、挿入しようとする遺伝子には、挿入に先立って新しい宿主に合わ せた転写および１尺ＭＮ＾配列をくっつりるが、あるいは、前述の遺伝子はベク ターＤＮＡの中で現存の転写および翻訳信号に制御される部位に挿入する必要が ある。 外来性遺伝子の例えば環状ｒｌＮＡプラスミド・ベクターへの挿入は、しばしば 、現存する転写および翻訳信号の直後のＨｎＬこおいて、あるいは宿主内で発現 の程度が高い比較的に大きな蛋白質のコードを持つ現存プラスミ「遺伝子内でお こなわれる。後者の場合は、このようにして形成された「融合遺伝子ｊの宿主に おける発萬は、望みの蛋白質配列（例えば、大きな蛋白質の化学的な切断によっ て分離出来る中間断片として）を含むｒ融合蛋白質」の高レベルの生成となる。 前述の手順は単に望みの調節上外来性遺伝子生成物の高レベルの発現を確実にす るにとどまらず、望みの蛋白質生成物を宿主に内在するプロテアーゼの攻撃から ある程度防御する。さらに、宿主生物によって異なるが、前述の手順は２望みの 蛋白質の宿主１ｌｌｌＩ胞から細胞培地への一種の「ビギーハ、りＪ輸送を可能 とし７て、望みの生成物を分離するために宿主細胞を破壊する必要をなくす。 公表された組み替えＤＮＡ方法に関してこれまでに一般化して述べたことがら、 これらプロセスはどちらかというと単純な、容易に実施でき且つ簡単に本剣正で きるもののように見えるかも知れないが２実際には、必要なりＮＡ翫汐すの操作 の娼叡ま非常に骨折りな困難なもので、望みの生成物の収率は殆ど例外なく非常 Ｑこ低いことを特徴とする。 州列を挙げると、宿主微生物のトランスフォーメイションに使用されるベクター に挿入するための遺伝子の最初の「調製」は非糸に難しいプロセスである場合が あるが、発現させようとする遺伝子がヒｌのような高等な生物に内在性のもので ある場合は特にそうである。この技術において行われる１つの手間の掛かる一Ｈ １＋よ、ｒ供与」細胞の全ＤＮＡゲノムの組み替えプラスミドへの体系的なりロ ーニングであり、前述のクローニングは、ランダムなりＮＡ　ｉ９１■析片を持 つトランスフオームさねた細胞の膨大な「ライブラリー」を生み出すが、前述の ＤＮＡ配９＋Ｉｌ析片を明々に試験して望みの生成物が発現しているかを調べる 必要かあ／！：）。別の手順コニよると、全ｍ擢へは高発現供与細胞（望みの生 成物のためのコードを持−′１ｍＲ唱の多数の複製を含むもの）から分離され最 初に逆転写酵素によって一本鎖ｃＤＮＡに「複写」され、それからポリメラーゼ によって二本鎖に転写され、そしてクローニングされる。この手順も、トランス フオームされた細胞のライブラリーを生み出すが、このライブラリーは全ゲノム ・ライブラリーよりも幾分か］Ｘさく、望みの遺伝子の複製を含み且つ宿主微生 物による発現に大きく干渉するトランスフオームされない「イントロンｊを持た ない可能性がある。上記の時間のかかる遺伝子分離手順は実際に幾つかの蛋白質 を微生物に発現させるのに公表された組み替えＤＮＡ手順で使用されたものであ り、前述の蛋白質はラルプ２１１ロインシコ、リン　１ｒｉｃｈ等、　５ｃｉｅ ｎｃｅ　、　」９６　、　Ｉｌｐ、　１３１３−１３１８　（１９７７）　）　 。 ヒト繊維芽細胞インターフェロン（Ｇｏｅｄｅｌ１等＋　ｈ劇旦馳」ｃｉｄｓ　 Ｒｅ５ｅａｒｃｈ＋　８　＋　ｐｐ、　４０８７−１０９４　（１９８０）　） 　、マウスβ−エンドルフィン〔Ｓｈｉｎｅ等、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８５　、 　ｐｐ、　４５６−４６］（１９８Ｃｊ）　）　、およびヒト白血球インターフ ェロン（Ｇｏｅｄｅ＋　＋等、　ＮａＬｕｒｅ＋　２８７　、＋　ｐｐ、　４］ １−４１６　４１９８０）　；およびＧｏｅｄｅｌ１等＋　Ｎａｔｕｒｅ、　２ ９岨、　ｐｐ、　２Ｏ−２ｆｌ＋　（１９８１）　）を含む。 可能な場合は必ず、ヌクレオチド塩基を用いての望みの遺伝子の部分的なあるい は全部の縣は１組替えＤＮＡ方法で使用する遺伝子の調製のもっと望ましい手順 を持つ。そのような製〕告に必要なものは、当然のことながら、望みのポリペプ チドの正確なアミノ醗己列の知識である。この情や勤（あれば、蛋白質を生み出 すＤＮＡ配列コード（即ち、適切に配列された塩基トリブレット　コドン）を剖 画することが可能となり１対応する合成二本１１ｏ１１八配列を作ることができ る。製造方法とｃＤＮＡ合成方法との組合せがヒト成長ホルモン用の遺伝子を作 り出すのに使用されたと報告されている。特に、製造された７２ヌクレオチド塩 基対の直線状二す佃ＮＡ配列（望みの１９１アミノ酸ポリペプチドの最初の２１ アミノ酸を決めるコドンを持つもの）が、アミノ酸番号２５−１９１用のコート を持つｃＤＮＡｉＤＮＡミルに結合されて、変性ｐＢＲ３２２プラスミドのうｌ り・プロモーター／レギュレーター耐重りヵ印膓する遺伝子座に挿入された（Ｇ ｏｅｄｅｌ　１等、　Ｎａｔｕｒｅ、　２８］、Ｉ）ｐ、　５４４−５４８　４ １９８１）　）。 比較的に「短い」生物学的に機能するポリペプチド、例えば、ヒト・ソマトスタ チン（１４アミノ尚およびヒト・インツユリン（２］アミノ酸および３ｏアミノ 酸の２ポリペプチド鎖）用のコードを持つ遺伝子の製造にけ完全な合成手順が使 用されている。 ソマトスタチン遺伝子調製手順（Ｉ　ｔａｋｕｒａ等、　５ｃｉｅｎｃｅ　、　 １９８　、１１ｉｐ、　１０５６−１０６３　（１９７７）ｊにおいては１５油 基対遺伝子力詐られ、この遺伝子では、０塩基文＠壌憂な１４アミノ酸を定める コドンであり、そして、１０塩基対が追加されて、構造遺伝子を微住物トランス フォーメインヨン・ベクターに結合するのに用いられる「付着末端」−重鎖終末 領域の形成を可能としている。特に、この遺伝子はβガラクトシダーゼ酵素遺伝 子の末端近ぐに挿入され、その結果生しる融合遺伝子ハ翳合蛋白質として発現さ れ３この蛋白質から臭化ノアン切断によってソマトスタチンが分離される。ヒト ・インシュリン遺伝子の製造は、先に述べたように、２１アミノ酸鎖と３０アミ ノ酸鎖のコードを持つ遺伝子の調製を伴った。１８デオキシオリゴヌクレオチド 断片を結合して長い方の鎖用の遺伝子が作られ、１１断片を結合して短い方の鎖 の遺伝子力昨られた。各遺伝子はβガラクトンダーゼ遺伝子とともに融合遺伝子 を形成するのに使用され，ｎ＋ｉｌ々に発現したポリペプチド鎖は酵素的に分離 され結合されて完全なインシュリン分子を形成した。　（Ｇｏｅｄｅｌ　ｌ等＋ 　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．影直．，　７６，　ｐｐ ．　１０６−１１０　（１９７９）。〕上記の各手順において，デオキシオリゴ ヌクレオチド断片も詔易製され，そして，下記の＝般手順に従って順次結合され た。　〔例えば＋　Ａｇａｒｗａｌ等．　坤民．　２２７　，　ｐｐ．　１−７ 　＜１９７０）およびＫｈｏｒａｎａ，　Ｓｃｉｅｎｃｅ　２０３　，　ｐｐ． 　６１４−６７５　（１９７９）を参照のこと。〕最初の『頭Ｊ（ＩＩＩち，　 ５’−３’　Ｗ’ｊ３デオキシオリゴヌクレオチド断片は，酵素的に第２のｒ頭 Ｊ断片に結合された。これら２つのｒ頭』鎖の整列は，第１頭鎖の半分と第２頭 鎖の半分とに相補性を持つ塩基配ａ］を持つ『尾Ｊ（１１′］ち，３゛から５’ ＋”ｉｉ｛ｌ）鎖を使用することで可能になった。結合した後で，卯鎖の補｛利 ト結合の塩基は、形成された二重部分からｒ突き出す』。 第２の底鎖カリＪｌ１えられるが，この鎖は，突き出した頭鎖の５乃至６塩基補 体を含み，さらに追加の５乃至６塩基が加わるが，これは尾一本’ｉＭＲＦ／ｙ ｋとして突き出る。そして，２つの尾鎖は接合される。このような逐次的な付加 は完全な遺伝子配列が形成されるまで続けらわ。全羽距ま非常に時間力」卦かり 且つ非常に不能率である。 全遺伝子合成の前述の方法の時間が掛かるという特徴は，先に言及した２つの『 短い』インシュリン遺伝子の組み立てを行うのに少なくとも４人の研究考による ３カ月６こ渡る作業が必要であったという幸晧に良く例示されている。さらに． ヘクターの挿入に成功するには比較的に少量の製造された遺伝子が必要なだけで あるが、上記の合成手順は総収量が非常に低＜（Ｉ結合当たり２０％のオーダー ），処方に細心の注意を払って従っても選択された短い遺伝子のごく少量の分離 さえも保証されるものではない。合成可能な最大長の遺伝子は，ｌｌｌｉｌ々の 短い断片を接合する効率によって明らかに限度がある。そのような結合反応が旦 ほど必要であり，前述の各反応の収率が１であるとすると，得られる正し《合成 された遺伝物質の量はｙ１に比例する。この関係は｛帛賎関数的であるので川結 合反応当たりの収率の僅かな増加でも，合成できる最大遺伝子の長さは大幅に増 加することになる。 上記の方法の不能率さは，主に望ましくない中間生成物の形成によるものである 。雪列を挙げると，尾の『鋳型Ｊ鎖を伴うアニールされた頭鎖を形成する最初の 反応においては望ましい反応は， ｂ　→　ａｂ ？あろうが、カ族こ得られる生成物は −−−−引一一ｊし■■ａ−−一　・ あるいは，−−−一一且■一■Ｊｙ−−　−ｂ−あるいは同様のものであるかも 知れない。 さら乙乙個々のデオキシオリゴヌクレオチドが長くなればなるほど．それら力！ リノ学的に安定した自己会合，例えば，　『ヘアピン』あるいは集団を形成する 可能性が高まる。 合成効率を高めるための提案はこれまですくに出てくる状聾ではなく，最近に『 現在得られる方法によっては，約３０ユニットのアミノ酸よりも長いペブチトを 含成することは経済的に不可能であり，多くの臨床的に重要な蛋白質はもっと長 いものである」と報告された。　［Ａｈａｒｏｎｏｌ１ｉ　ｔｚ等。Ｓｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　，　２４５　．　Ｎｏ．　３，　ｐｐ．　１４ ０−１５２，　ｐ．Ｉ５１　（１９８１）。〕 大きな遺伝子の合成にかかわるｒ経済的実行可能性』の例が，ヒ１一白血球イン ターフェロンの全合成の努力の『成功Ｊの最近の発表にみることができる。　［ Ｅｄｇｅ等，　Ｎａｔｕｒｅ＋　２９２　，　ｐｐ．　７５６−７８２　（＋． ９８］．）。〕簡潔に要約すると，約１５塩基を含む６７の異なるデオキシオリ ゴヌクレオチ１一功恰成され，上記の種類の『５０％重なり」手順によって接合 されて１１の短い二重型を形成した。次ぎに，これらは４つのもっと長い二重型 に組み立てられ前述の二重型は最後に接合されて３１６６アミノ酸蛋白質のコー ドを持つ５１４塩基対遺伝子をもたらした。この手順は，著者等が『迅速』と特 徴付けたものであるが，５人の研究考の約１カ年に渡る努力を要したものと確実 に推定さね７糾み立て計画の効率は明らかに非常に低い。−９１１として，出発 点となった６７のデオキシオリゴヌクレオチドはそれぞｈＡｏ　ｐモルが用意さ れ，１１の中間サイズの二重型を形成するのに使用されたが．４つの大きな二重 型の組み立てが達成された頃には．全遺伝子を最終的に組み立てるのにイ吏用で きる長い二重型の収量は僅かにＩ’Ｊ．０１　ｐモルだけであったことを指摘す ることができよう。 したがって，本技術においては，約３０アミノ酸を超えるサイズのポリベブチド の合成を司る能力を持つ構造遺伝子の製造のための迅速な１効率的な，且つ経済 的な方法が必要である。 産業におよび製薬に重要な蛋白質の微生物による発現のための組み替えＤＮＡ技 術の実施の別の一面は，　『コドンの優先性』の現象である。遺伝的にトランス フメームされた宿主細胞内の遺伝子の発現の現存ずる機構が『働いて』望みの生 成物を作り上げることは既に述べたが，微生物内で達成される発現のレベルは大 きな変動を示す可能性があり，部分的には，挿入された外来性遺伝子内に存在す るアミノ酸仕様遺伝コードの特定の代替形によって変わる，，４つの可能なヌク レオチド塩基の『トリプレノト』　コトンは２６４の異なる形をとることができ る。これらの形屑菫か２０の異なるアミノ酸（さらに転写の開始および終了）の メノセージをもたらすということは，アミノ酸によっては２つり上のコトンによ ってコートを決めることが出来ることを意味する。苅祭のところ．アミノ酸によ っては６つもの『冗長な』代替フトンを持つものもあり，ｔＯ−の必要なフトン しか持たないものもある。いまだ完全には理解されていない理由によって，代替 コトンは異なる種類の細胞の内在性ＤＮＡ内にいささかも均一に存在しておらず ，ある種の細胞内のある種のフトンには，異なる自然の階Ｈ生．即ち，『優貫生 」が存在するように思われる。 一｛クリとして，アミノ酸ロイノンｉコ．　ＣＴＡ，　ＣＴＣ，　ＣＴＧ．　Ｃ ＴＴ，　ＴＴ八，およびＴＴＧ　（それぞわ苅Ｒ晶コドン，　ＣＩＪＡ，　ＣＵ Ｃ，　ＣＵＧ，　ＣＵＵ，　’ＵＩＪＡおよびＬＩＵＧニ対応ずル）　（７）　 ６　ＤＮＡ　’：Ｊ　Ｆ　７０）何れによっても仕様が決まる。微生物のゲノム ・コドン頻度のｉ膀戊的な解析によって，　Ｅ．　ｃ９Ｖｉ細菌の内在性ＩＩＮ ＡはＣＴＧロイシン仕様コドンを最も普通に含むことが判明し，嗣および変形菌 類のＤＮＡはＴＴＡロインン仕１ｐコドンを最も普通に含むこと力印ｊ明した。 この階層性にがん力場で，』ユ宿主によってロイノンに富んだボリペプチ１の高 レヘルの発現を得る可１冊生は１ある程度までコ１ンの使用の頻度によってｄ翼 、？・と一般に考えられている。 例えば．ＴＴ＾コドンの豊冨な遺伝子は，ます■ｉ違いな（　Ｆ，．　ｃｐ匂に おいては発現が少ないが，　ＣＴＧの豊富な遺伝子はポリベプチトをおそらく多 く発埃−１るであろう。　同様に，酵母細胞が１コイシンの豊富なポリベプヂト の発現のための予定トランスフォーメイソヨン宿主細胞である場合は，挿入され たＤＮＡで使用するのが望ましいフトンはＴＴＡであろう。例えば，　Ｇｒａｎ ｔｈａｍ等，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ＋　８　＋　ｐ ｐ．　ｒ４９−ｒ６２　（１９８０）　；　Ｇｒａｎｔｈａｍ等，均劇ｅｉｃ　 Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｇａｒｃｈ，　８　，　ＰＩＥ．　１８９３−１９］２　（ １９８０）　ｉ及びＧｒａｎｔｈａｍ等，　ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉ４ｑ　Ｒｅｓ ｅａ世！．　’ｊ　．　ｐｐ．　ｒ４３−ｒ７４　（１９８］）を参照のこと。 組み替えＤＮＡ手？去にコドンの優先性現象が意味するものは明白であり，そし て，この現象は首尾よく１−ランスフォームざれた宿主生物においてク■来性遺 伝イの高い発現を達成するのに失敗した過去の多くの例を説明するのに役立つ可 能性がある。即ち，『膀生』の低いコドンが，挿入された遺伝子に繰り返して存 在して．発現のための宿主細胞の機構が効率的に励かないのではないか。この現 象は．予定の宿主細ＩＩ勧｛洗するコ］ンを含むように言遅１された完全に製造 された遺伝子は組み替えＤＮＡ手法を実施するための外来性遺伝物質の望ましい 形態をもたらすとい’）　８ｍｋｔこ導く。このようなＴＡＩ＆Ｌこおいて，コ ドンの選択を可能とする迅速月．つ能率的な全遺伝子製造丁朋が存在しないこと は，この技術における進歩のまりａ咳りな障害を成しているように思われる。 ４・発明の背景におおきく関連するのは，β−エン｝ルフィンとして知られる生 物学的に活性のある鎮痛物質のクラスの調製およびイｙｘ＋ａ．＝関する技術の 現状である。　これらの化合物↓よ，もともと種々のｌｌ：ＩＣ７１Ｊｊ’．わ よび曳頌の下垂体組眠）ら分捕されたもので　３１アミノ酸のポリペプヂじであ り互いに同様なりＡ４Ｇ駅を持ち，若干のアミノ酸残基が異なるだけである。　 たとえば，ヒトβ−エン］ノレフィン（βト，　−Ｆ．Ｐ　）のアミノ百栖己夕 ＋４ｉよ，であると報４Ｌｉされており，マウスβ−コーンＩルフィンは［Ｔｈ ｒ　２７）残基ではな（　［ｌＩｉｓ　２７〕を持つ点でヒ］一のものと異なる 。β−コ−ントルフィンは　当然ながら，良く知られたノリフィールＩ手順（Ｍ ｅｒｒｉｆｉｃｌｄ．　Ｊ．　Ａｍ．．．Ｃｈｔ２ｍ．　Ｓｏｃ．＋　１３：、 １１１１．　２］４９−２１５４　（１９６３＞　］によって少量を合成するこ とが出来，最古前述の力法がそのβＬ　−　（Ｔｒｐ　２７）　−　Ｅ■〕およ び２−ニトロフ工ニノレスノレフィニノレ誘！屠本を；（甲傅ずろのに使用され た。 組み替えＤＮ八技術は．マウスβ　コーンＩ−ルフィンのｉＡ伝１′−を分離し 発現するのに使用された（Ｓｈｉｎｅ等，　Ｎａｔｐ匹．　２２７　．　ｐｐ． 　１７　（１９８０１）　）　。遺伝子はｌ：．ｑｏｌｉのなかでクローニング さわ一融合βガラクトンダーゼ−β−ユントルフィン蛋白質として発現された。 この遺伝子の調装の一般実験記ｉｐ＋ｊ：−’Ｆ記の通りである。遺伝子は，マ ウスＡＣＴＨ／β−１，聞前駆体蛋白質のコートを持つＩＩＲｔｌＡの逆転亙か らｉＭられたクローニングされたＩＩＮＡ　（ｃＤＮＡ）断片から分離された。 クローニングされたＤＮＡ断片から適切なＨｐａ　Ｉ＋およびｌｌｉｎｄｍ市； １限エントヌクレアーゼ断片が分離された。この断片は，マウスβ−エントルフ ィンの遺伝子と，マウスβ−１ｓｌ＋の遺伝子の一部分とを含んでいた。さらに 一連の反応および分離の後に、望みの遺伝子のみを含む断片が得られた。それか らこの遺伝子はβガラクトシダーゼの遺伝子を含む適切なプラスミドに挿入され 、ハイブリッド・プラスミドはＥ、　ｃｏｌｉ　）ランスフオーメイションに使 用された。この結果３　βガラクトシダーゼおよびマウスβ−エンドルフィンを 共に含む融合蛋白質力堰造された。β−エンドルフィンは、βガラクトシダーゼ を含まないように、融合蛋白質をシトラコン酸無水物を処理してからトリプツン で処理することによって分離された。この手順によって分離されたマウスβ−エ ンドルフィン生物学的なン藺生を示した。　（ｌ（ｉｓ　ｚｎ残基に加えて、″ ７ウスβ−エンドルフィン生成物は、アミノ酸を１つ多く、即ち１．アミかター ミナル・マルギニンを含んでいる点がヒトβ−エンドルフィンと異なった。 ヒトβ−王、ノドルフィンの金預充存１としての素晴らしい薬学的可６目もこも かかわらず、この物質の、あるいはその構造類似体の大規模生産のために組み替 えＤＮ八へ法を使用したという報告は無い。もっと具体的には、何等かの組み替 えＤＮＡ手法によって合成βＦ、−ＥＰ遺伝子（あるいはβト、−ＥＰと１つ以 上のアミノ酸残基の種類あるいは相対位置が異なるポリペプチドの発現を司る合 成遺伝子）の製造あるいはβｈ−ＥＰ蛋白質の生産がなされたという報告は無い 。 要約 本発明は、長さが最ノＪ’７２００ヌクレオチド塩基対までの直線状二本鎖ＤＮ Ａ配列の完全な製造のための新規な、迅速な且つ効率の高い手順を１眉共するも のであり、前述の配列は望ののポリペプチドの広範な異種の合成を司る構造遺伝 子で全て出来ている場合がある。 ＤＮＡ翫預りは、下記のステップから成る＝般的方法にらってヌクレオチド塩基 から製造される。即ら１ （１）２つ１ノ上の異なる直線状の二重型ＤＮＡ鎖を調製する。各二重型鎖は１ ２以上の選択された梱産り急基対を含み且つ鎖の一端に３つから７つの選択され た塩基の頭一本鎖終未配列および／あるいは鎖のもう一方の端に３つから７つの 選択された塩基の尾一本鎖終沫Ｊ＆１Ｊ（２）ステップ（１１で調製された各二 重型ＤＮＡ鎖をステップ（１１で調製さ和僻ｍｌ生一本鎖終未配列を持つ１つあ るいは２つの異なる二重型鎖にアニールする。これにより、単一の連続二本鎖Ｄ ＮＡ配列を形成するが、このＢＩＪは少なくとも２７の選択された塩基対の二重 型領域を持ち、この領域はステ、プ（１）で調製され且つ３つから７つの塩基か ら成るＯから２つの一本鎖頭或いは尾終末領域を持つ二重型ＤＮＡ鎖の一本鎖終 末領域の相禎性会台によって形成された少なくとも３つの塩基対を含む。 この一般的プロセスの望ましいｉ何列においては、少なくとも３つの異なる二重 型ＤＮＡがステップ＋１１によってｍ製さね。そして２個語された鎖はすべて単 一のアニーリング反応混合物のなかで同時にアニーリングされて単一の連続した 二本鎖ＤＮＡ　（ｉ汐りを形成し、この二本鎖ＤＮＡ配列は少なくとも４２の選 択された塩基対の二重型領域を持ち３これはステップ（ｔｉで調製された二重型 鎖の一本鎖終末領域の牟田市性会合によって形成された３つ以上の塩基対から成 る互いに隣接しない少なくとも２つの上用を含む。 二重型ＤＮＡＮ開鎖ステップｆｉｌは、望ましくは下記のステップから成る。 （ａ）　１５以上の塩基を選択された直線状の配列に持つ第１および第２の直線 状のチオキシオリゴヌクレオチド断片を作る。第２の断片の塩基の直線状の翫預 すは、第１の断片の塩基配列の完全な相補体から成るが、第２の断片の少なくと も一端は、第１断片を完全に相補するものに加えて３つから７つの選択された塩 基の追加直線４８１を１つ含むか、或いは、第１断片の終末配列に相補する３つ から７つの塩基の直線状配列を持たないかのいずれかであるが、但し、第２断片 は追加の塩ＭＲｕ旧つを持たず、或いはその両端に塩基配列を持たないことのな いものとする。 （ｂ）　第１断片と第２断片を断片間の二重型会合を促進するような条件のもと で組み合ねセで直線状二重型ＤＮＡ鎖を形成する。 本発明の大変望ましい裂鮒りにおいでは、形成された二本鎖ＤＮＡ配列内の塩基 の配列は、予定の宿主微生物２例えば酵母刹１胞あるいム鼾Ｉｌ！菌、特に」　 ９旦細菌におりるコドンの優先的発現の特性に基づき代替コドンから選択おれた １つ以上のトリプレット・コドンを含む。 本発明がさらにもたらすものは、新規の製造された遺伝子であり２それらには１ 例えば、ヒトβ−エンドルフィン、および、１つ以上のアミノ酸の１１顧あるい 番側且対位置が正真の蛋白質と異なるヒトβ−エンドルフィンの多くの類似体の 合成を司る能力を持つ新しい遺伝子および融合遺伝子が含まれる。新規の遺伝子 の発現によって生み出された種々の蛋白質生成物も本発明によってもたらされる 。 本発明のその他の特徴および長所は、下記の本発明の詳細な説明を考察すれば自 ずから明らかになろう。 群細ｌ説朋 本明細書で用いる場合は、　ＤＮＡ　ｉｌｌあるいは遺伝子に使われる「製造さ れた」の用語は、ヌクレオチド塩基の組み立てにより完全に化学的に合成される 生成物か、あるいはそのように化学的Ｇこ合成された生成物の生物学的反復複製 から得られる生成物を意味する。そのようなものであるので、この用語は生物学 的超厚の開始材料を用いるｃＤＮＡ方法あるいはゲノムのクローニング方法論に よって「合成ｊされた生成物を除外する。本明細書においては、アミノ酸を呼ぶ のに下記の略称が用いられる。了うニンーＡｈａ、アルギニン−Ａｒｇ、アスパ ラギン−へｓｎ、アスパラギン酸−Ａｓｐ、ンステイン−Ｃｙｓ　、グルタミン −６Ｉｎ、グルタミン酸−Ｇ　ｌ　ｕ、グリシン−ｃｒｙ、ヒスチジン−Ｈｌｓ 、イソロイシン−１ｉｅ、ロイシン−Ｌｅｕ、リジン−１ｙｓ。 メチオニン−Ｍｅｔ、フェニルアラニン−Ｐｈｅ、プロリン−ＰｒＯ＋セリンー ５ｅｒ＋　）レオニンーＴｈｒ＋トリプトファン−Ｔｒｐ、チロシン−Ｔｙｒ、 および、バリン−Ｖａｌ。下記の田Ｂ称がヌクレオチド塩基に使用される。Ａ− アデニン、Ｇ−グアニン、Ｔ−チミン、Ｕ−ウラシル、およびＣ−ノドシン。 本発明の理解を容易にするために、下記の第１表は、　ＤＮＡの６４のトリブレ ット　ヌクレオチド塩基コドンと２０のアミノ酸との相関関係表、およびそこに 指定される転写終了（「停止」）機能を示す。 第１表 第１位置　第２位置　第３位置 ＣＡＧ Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ｔ Ｔ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　ＣＬｅｕ　Ｓｅｒ　５ｔｏｐ　５ｔｏｐ 　ＡＬｅｕ　Ｓｅｒ　５ｔｏｐ　Ｔｒｐ　ＧＬｅｕＰｒｏＨｉｓＡｒｇＴ ＣＬｅｕＰｒｏＨｉｓＡｒｇＣ Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｉｎ　ＡｒｇＡ ＬｅｕＰｒｏＧ、ＩｎＡｒｇＧ １１ｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔ Ａ　Ｉｌｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｃ１１ｅ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ａ ＭｅｔＴｈｒＬｙｓＡｒｇＧ Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｔ Ｇ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｇａｙ　ＣＶａｌ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａ Ｖａｌ　Ａｈａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇ これから生成する望みのポリペプチドの構造が決まると５本発明の娼餠ま下記を 必要とする。蛋白質のコードを持つ長さが肋り２００塩基対までの特定の連続し た二本鎖ＤＮＡを製造すること。製造された配列を適切な微生物トランスフメー メイション・ヘクターに挿入すること。そして、ヘクターを用いて選択された微 生物宿主のトランスフオーメイションをすることである。合成された開Δ配列は ，発現の自律的な制御のためのプロモーター／レギュレーター領域を備えること が可能であり，あるいはヘクター内に存在するプロモーター／レギュレ〜クー翫 表りによる発現の制御が可能となるような仕方でヘクターに取り込まれることが 可能である。製ｊＮざれたＤＮＡ翫汐りは，ヘククー内に存在する遺伝子聞治遺 伝子を形成している）の中間位置に取り込まれて融合蛋白質として発現されるこ とも可能である。 本発明の望ましい実施形態においては，製ｊ告されたポリペプチドのサイズは， 約１５あるいは２０アミノ酸から最メ４勺７０のアミノ酸の範囲である。選択さ れたトランスフォームされ選択されたポリペブチト゛を仕様する二本鎖ＤＮＡ配 列の迅速且つ高能率の製造が．ユニークな手順によって達成されるが．この手順 は，デオキシオリゴヌクレオチｌから２つ以上の異なる直線状二宙型ＤＮＡ鎖を 組み立てることを含み．前述のｒｌＮＡ鎖はそれぞれ比較的に長い（１渾上の塩 基対）二本鎖領域を二本鎖の一端あるいは両端の比較的に短い（３から７塩基） 一本鎖領域とともに含む。本発明の望ましい実施形態においては，約１４から５ ０塩基対の二本鎖領域を持つ二重看劫箒成され　もつきも望ましい二重型は二本 鎖領域６こ１８から３０塩基対を含む。使用される二重型が長さが約１鮨基対だ けの二本鎖領域を持つ場合でも，−タ目担ま二本鎖領域の長さの１／３を通富は 超えない。 二本鎖領域は，望みのポリペプヂドの全アミノ酸がｊリの始めの２終末の，ある いは中間部分のテッセンブリーを仕様するのに必要なコドンを含むように作られ る。　可能な場合は，予定される宿主（例えば．Ｅ，ｃｏｌｉ）によって優’Ｍ Ｊ’Ｊに発現される代替コｌンが使川される。コドンの選択により大きな柔軟性 があることが本発明の手順の大切な長所である最終的に組み立てられたＤＮＡ　 Ｒリで占める相対的位置によって異なるが，用いられる二重型サイズの一本鎮領 域は，塩基の配列を持ち，この翫汐リも他の二重型鎖の塩基によって相補される と望みのポリペプチド翫汐リ内のアミノ酸を使用するコドンをもたらす。 本発明に従って形成された二重型鎖は，相補性の短い一本鎖領域を持つ１つある いは２つの異なる二重型鎖に酵素的に結合されて，望みのポリペプチド断片のコ ードを持つ望みの連続二本鎮ＤＮＡ配列を形成する。このように形成され６Ｂ＋ １は，構造遺伝子の全部あるいは一部分をもたらす。それは１つ以」二のｒ平４ あるいは『イ」着』末端を持つ可ｈ目生があり，また，プロモーター／レギュレ ーター領域をも持つ可能性がある。 全昏牙リの組み立ての高効率および迅速さは，３つ以上の二重型鎮の１つのアニ ーリング反応を実施することによって強化されるが，前述の二重型鎖の短い一本 鎖領域は，その他の二重型鎖のせいぜい１つの他の一本鎖領域の塩基嘆田市体と なる。その他の二重型の一本鎖領域１つだけを特定的に相補ずる短い一本鎖領域 を形成された全ての二重型鎖を用念ずることは，造伝コーｌ′の冗長性の範囲内 で，そして望まし７くは，予定される宿主生物のコトンの優先性を考慮して代替 コトンを選択ずることによって達成される。 下記は，正真のヒトβ−エントルフィンおよびその生物学的乙こ機能するポリベ ブヂ目１似体の合成を司るｆＥ’Ｊのある製造された遺伝子の形成における本発 明の実施の写実的な例である。これらの例から，本発明の遺伝子製造力法は，始 めて，発現されたη：Ｊ戊物の構造を串獅しなから変化させることを可能とする 非富に柔軟な枠組みのなかで本当に迅速な且つ高効率の遺伝子の合成および発現 のための総合的な合劇十画をもたらすものであり．絹み替えＤＮＡ　Ｊｆｆ打に 携わる研究者がこれまで入手出来なかったものであることは明らかであろう。 下記の−イ列は．望みの遺伝子の，例えば正真のβｈ−ＢＰの合成を司るものの 製造に役立つデオキシオリゴヌクレオチドの合成の＝般手順を示す。 第１例 ヒｌ−β−エン］ルフィン用の遺伝子を含むＤＮＡ配列を製造するのに使用する デオキシオリゴメクレｊチ｝のＢＲｔｌＪは．　Ｍｕｔｔｅｕｃｃｉ等，　Ｊ． 　Ａｍ．　Ｃｈｅｍ．　Ｓｏｃ．　＋　１０３、，　ｐｐ．　３］８５−３１９ ２（＋９８１）およびＢｅａｕｃａｇｅ等，　Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ−、Ｌｅ ｔｔｅｒｓ　，　２２．　ｐｐ．　１８５９−１８６２　（１９８１）およびそ ノ１，らにおいて参照された資料に公表された一般的方法に従って実施された。 合成は，高悟能液体クロマトグラフィ等級のシリカ　ゲルを誘導して適切に保護 ざれたヌクレオチＩ−を含むようにすることから始まる。デオキシオリゴヌクレ オヂドは，３゛−ヒドロキシル基を介して，シリカ・ゲルに共有結合しているカ ルポキシル酸機能基に結合される。この支持体に１つのヌクレオチドを付加する のに使用される化学的手順は下記の通りである。 ｆｌ．ｌ　ニトロメクン／メタノール内でＺｎＢｒ２を用いるデトリチレーショ ン（４分）。（２）支持体に結合されたヌクレオシドを持つ５゛−ジ−ｐ−アニ ンル−フェニルメヂル・デオキシヌクレオシド・３゛−メトキシーＮ，Ｎ−ジメ チルーアミノフメスフィンの凝縮（５分）。（３）未反応の支持体結合ヌクレオ シド・ヒドロキシル基を無水酢酸でブロノクする（５分）。（４）？リン酸塩を １２を用いてリン酸塩に酸化ずるく２分）。合成は簡単な半融ガラス漏斗の中で 一人の技術員によって実施される。１つの合成サイクルに要する時間は２０〜３ ０分であり，】５時間足らずで最大３０モノヌクレオチドを含むデオキソオリゴ ヌクレオチドを高収率で｛写ることが出来る。 可能な場合は必ず，遺伝コードの冗長性を利用して，何れのデオキシオリゴヌク レオチドのなかにも互いに相補性の塩基酉表りが遠くに離れて形成されないよう にし，塩基の相禎性によって鎖が『畳み込む』機会を無くすことによって望みの 直線１月債の収率を高める。 デオキシオリゴヌクレオヂドの積製および分離は下記の手順によって達成される 。酸によるターミナル・ジ−ｐ−アニシル−フェニルメヂル基の除去を含む最終 ６縮ステノプの後に．デオキシオリゴヌクレオチドを含んだシリカ・ゲルはメタ ノールで充分に洗われ，そして自然乾燥される。フメスフメ１・リエステルから メヂル基を除去するために，各ボリマ（ｔｏｏ　ｍｇ，オリゴヌクレオチド２〜 ５マイクロモルを含む）は，チオフェノール：ＥＬ３Ｎ　＝ジオキザノ（１　： 　２　：　２）　ｌ容ｌ夜２ｍβにより室温で７５分に渡って処理される。この ステノプに続いて，濃縮水酸化アンモニウムを用いて２０℃で２時間に渡って処 理してデオキシオリゴヌクレオチドを支持体に結合するエステルを加水分解する 。遠Ｉ已扮剣によってデオキシオリゴヌクレオチドを含む上澄み液を回収した後 に，塩基保護基はノールした試験管の中で５０℃に２４時間に渡ってあっため不 除去される。水酸化アンモニウム溶液はそれから蒸発乾燥される。残滓は１１■ ０２ｍｌ８に再溶解され，濾過され，そして酷夜は３度に渡ってｎ−ブタノール （３Ｘ２ｍρ）で洗われる。生成物の最終的な精製は．７Ｍ尿素を含むトリスー 硼酸緩衝液（ρＩ１８）を用いて２０％ポリアクリルアミト・ゲル上で電気泳動 によってなされる。８０％ポルムアミト３０μｒに含まれる＄１１４Ａ￥−１約 １０　０．０．ユニット（２６０　ｎｍ）が２．５ｃｍ幅のウェルに充填され． 　１６　Ｖ／ｃｍで電気泳動力怯旅される。ＤＮＡハンドを検出するには．ゲル は螢光ＴＬＣ板（シグマ・ケミカル・カンパニー）の−トに置かれ３長波紫外線 を照射されて２デオキシオリゴヌクレオチドが目視できるようになるが，それは 各レーンの強い吸収ハンドとして見える。望みのハントはゲルから切り取られて ，　ＤＩｌへは０．５Ｍ酢酸アンモニウム，　１０　ｍＭ　ＭｇＣＩ２　，　０ ．１％ＳＯＳ，および０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡを用いて熔出される。 。−フ゜クノーノレを用いて２度洗ったあと，デオキシオリゴヌクレオチドは． 　１０　ｍＭ　ＴＥＡＲ　（ｐＨ７．０）を用いてセファデソクスＧ５０／４０ コラム（４５Ｘ２．５　ｃｍ）上で塩分を除かれる。粗ＤＮＡ　＋０　０．０． ユニットから回収出来るの一般に１．０から２．０　０．０．ユニット（２６０ 　ｍｍ）の範囲である。 下記の例は特に２つの遺伝子，即ち，βｈ−ＥＰＯもの，およびβｈ−ＥＰボリ ベプチト類似体であるβｈ　−　（Ｌｅｕ　５　）−Ｐ．Ｐのものの製造に使用 するデオヰンオリゴヌクレオチドの言周製剖列示ずるものである。 第■り 正真のβｈ−ＥＰのアミノ酸配列に関する情報をもと６こして（前掲），正真の 蛋白質およびその（Ｌｅｕ　５　：ｌ　ｉ｛以体のコードを持つ２つの遺伝子の 製Ｊ九こ使用するために，全部で１３の異なるデオキシオリゴヌクレオチドが調 製された。第１例の一般手順に従って１　１８から２４モノヌクレオチドを含む ＋２１４ｆ片および１つのデオヰソデ力ヌクレオチ１が合成され分離された。 βｈ−ＥＰ遺伝了製Ｊ徂こ使用ずるために作られた１１断片は下記の配列を持っ た。 断片　］Ｅｎ　５’ｄ　（Ａ　Ａ　’Ｉ’　Ｔ　Ｃ　Ｃ　Ｔ　Ｇ　Ｃ　Ｔ　Ａ　 Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｃ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｇ　）１折片　２Ｅｎ　５ ’ｄ　（Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｃ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｃ　Ｃ　Ａ　Ｃ　Ｃ　 Ａ　Ｔ　Ａ　Ｇ　Ｃ　Ａ　Ｇ　Ｇ　）断片　３Ｅｎ　５’ｄ　（Ａ　Ｃ　Ｃ　Ｔ 　Ｃ　Ｃ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ｔ　Ｃ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｃ　Ｔ　）断片 　４Ｅｎ　５’ｄ　（Ａ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｔ　Ｃ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｇ　 Ａ　Ｃ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　１’　Ｃ　Ｇ　Ｇ　）断片　５Ｅｎ　５’ｄ　（Ｃ　Ｃ　 Ａ　Ｃ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ｃ　Ｔ　Ｃ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　）断片　６Ｅ ｎ　ｓ’ａ　（Ｔ　Ｔ　Ｃ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｃ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｔ　Ａ 　Ａ　Ｃ　Ｃ　）断片　７Ｅｎ　５’ｄ　（Ａ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｃ　Ｇ　Ｃ　 Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｃ　）断片　８Ｅ ｎ　ｓ’ｄ（Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｃ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｃ　Ｔ　Ｔ　Ａ　Ａ　 Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｇ　Ｃ　Ｇ　）断片　９Ｅｎ　５’ｄ　（Ｔ　Ｔ　Ａ　Ｃ 　Ａ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｇ　Ｃ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ａ　Ｇ 　）断片　］ＯＥｎ　５’ｄ（Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｃ　Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｃ　Ａ　Ｔ　 Ｔ　Ｃ　Ｇ　Ｃ　Ｃ　Ｃ　Ｔ　Ｔ　Ｃ　Ｔ　）断片　］ＩＥｎ　５’ｄ　（Ａ　 Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｃ　）βｈ　−　（Ｌｅｕ　５　）−ＥＰ遺 伝子合成の為の断片は，上記の断ハ３１・ｎがら］］Ｅｎまでを含み，そして， 断片］Ｅｎおよび２Ｅｎの代わりに１下記の断片を含んだ。 断片　１．’Ｅｎ　５’ｄ　（Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ａ　 Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｃ　Ｔ　Ｔ　Ｔ　Ｃ　Ｔ　Ｇ　）断片　２’Ｅｎ　５ ’ｄ　（Ａ　Ｇ　Ｇ　Ｔ　Ｃ　Ａ　Ｇ　Ａ　Ａ　Ａ　Ｇ　Ｃ　Ｃ　Ｔ　Ｃ　Ｃ　 Ａ　Ｔ　Ａ　Ｃ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　）奇数番の断片は（断片＋１Ｅｎは除外する ）３２アミノ酸蛋白質の合成に必要な全（１類）コドン配列を含み．（Ｒ故番の 配列は一緒になって榴市性の尾鎖を成ずこどが容易にお分りであろう。 上記のデオキシオリゴヌクレオチドの作成は以下に第Ｈ表に示すβｈ−ＥＰおよ びβｈ−（Ｌｅｕ　５　］　−ＥＰの合成の基本計画における最初のステノプで あった。 第１表 ＥｃｏＲＩ ＥｃｏＲシ　− ＋７　Ｑ−’　“・・ｉ’Ｊｉ’ｒミノ酸ポリペプチドのコードを持つ遺伝子を 組み立てるのに１０の大きなデオキ＞５　リボヌクレオチドを使用する必要があ る点には注意する必要がある。つい最近に発表された１０アミノ酸のα−ネオ− エンドルフィン・ポリペプチドのコードを持つ遺伝子の製造千順は１０のオリゴ ヌクレオチドの使用を必要とした。Ｔａｎａｋａ等、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　ＩＱ、　ｐρ、　１７４］、−１７５４（１９８２ ）を参照のこと。 一般に、コドンるよ」、薊のコドン（銃士を示す内在性の頻度解析に従って選択 された。例えば、前掲のＧｒａｎｔｈａｍ等の論文を参照のこと。β−エンドル フィン・アミノ酸伍ツ１」に翻訳可能なコドン配列をもたらすのに加えて、最終 生成物をＥ、　ｃｏｌｉ　トランスフォーミング・ヘククーへ取込みやすくする ように終末配列が設計された。この点に関して、　ｐＢＲ３２２プラスミドのβ ガラクトシダーゼ内の２つのＥｃｏＲ１制限訓立の１つにＤＮＡ　！すを挿入す ることを可能とする終末配列が用いられた。プラスミド市１］限部位の位置は２ 　βガラクトシダーゼ／βｈ−ＥＰの容易な形成を可能とするβガラクトシダー ゼ遺伝子の始めのメチオニン仕様コドンの下流の２４番目の塩基対、および対応 する融合蛋白質の合成のためのコードを持つβガラクトソダーゼ／βｈ　−（Ｌ ｅｕ　５　］　−ＥＰ融合遺伝子の下流３ｏ１ｍ目の塩基対である。 下記の例は、第２例で合成されたオリゴヌクレオチドの酵素的結合を例示する。 第１例 β−ＥＰ（ｒ二重型ＤＪ）およびβ　−（Ｌｅｕ　５　）　−ＥＰ　（’二重型 ＥＪ）のコードを持つ直線状の二本鎖ＤＮＡ配列の合成の七十画は下記の第■表 ｍ１ｌＪ略する。 第且表 断片５Ｅｎ、　６Ｅｎ、　７Ｅｎおよび３Ｅｎ二重型Ａ 二重型Ｂ 二重型Ｃ 第１Ｉ＋表には、二重型！Ｄを二重型Ｆに、そして二重型Ｅを二重型Ｇに変換す る手順もしめされている。二重型ＦおよびＧは、βガラクトシダーゼ遺伝子にア ミン・ターミナル　メチオニンから数えて３０１８番目の塩基対のＥｃｏＲ１部 位で融合されると、それぞれヒトβ−エン）゛ルフィンおよびその［Ｌｅａ　５ 　］珂坦体のコートを持つ。一方、二重型りおよびＥは。 βガラクｌツダーゼのアミかターミナル・メチオニンの下流の第２４塩基対Ｅｃ ｏＲ１部位に融合されると、それぞれヒトβ−エンドルフィンおよびそのＬｅｕ 　５　類似体のコー１′を持つ。従って、−Ｊａ勺な６４画は、酵素的に断片５ Ｅｎ、　６Ｅｎ、　７Ｅｎ、および８Ｅｎを結合して二重型へを形成することか ら始まる。それからこの二重型は断片３Ｅｎおよび４Ｅｎ”を付加されて二重型 Ｂに変換された。それから二重型Ｂは断片９Ｅｎおよび１０Ｅｎを付加されて二 重型Ｃに変換された。二３１Ｇは、ヒトβ−エンドルフィンおよびその（Ｌｅｕ 　５　）　類似体の双方Ｇこ共通なりＮＡ断片を含む。酵素によって断片］Ｅｎ および２Ｅｎを二重型りに付加することＧこより。 ヒトβ−エンドルフィンのコードを持つ最終的な１１８塩基対二重型である二重 型りが形成された。同様に、断片１’Ｅｎおよび２°Ｅｎを二重型Ｃに付加する ことにより、二重型Ｅが形成され、これはヒトβ−エンドルフィンの（Ｌｅｕ　 ５　］　ＵＱ（具体のコードを１寺っ。 二重型りおよびＥは（５゛リン酸化の後に）　ｐＰｃＯ２のようなプラノストを 用いるクローニングに直接にイ吏用出来る。このプラスミドはｆｗｌ・オペロン ・プロモーターおよびオペレーターおよびβガラクトシダーゼ遺伝子（βガラク トシダーゼ遺伝子断片の始めのメチオニン・コドンの下流第２４塩基対）にＤＮ Ａを挿入するための単一のＥｃｏＲ１部位を含む。しかしながら、　ｐｌａｃ５ 　（ＬＩＶ５　）からの４．４キロヘ一スＥｃｏＲＩ断片を含み且つランク・プ ロモーターおよびオペレーターおよびβガラクトシダーゼ遺伝子内（βガラクト シダーゼ遺伝子の始めのメチオニン・コドンから第凹１８＠の塩基対）にＤＮＡ を挿入するための単一のＥｃｏＲ１部位を持つその他のプラスミド、例えばｐＢ ＧＦ１２０．　ｐＥＷ］、９．およびｐＢＲ３２２は、βガラクトシダーゼ−β −エンドルフィン融合蛋白質の分離に利点がある。即ち、これらはβガラクトシ ダーゼ遺伝子のより大きな部分のコードを持つので、生しる融合蛋白質がより太 き（なり、」　９ｕ）“ロチアーゼによってｌ白化されにくくなる。しかしなが ら、この長所を活かすには、２つの融合遺伝子の読みの枠組みは、融合した遺伝 子の翻訳が望みの融合蛋白質を生み出すようなものでなければならない。この場 合はそうなっていない。従って。 この問題を解決するために、デオキシオリゴヌクレオチド、ｄ（Ａ−＾−Ｔ−Ｔ −Ｇ−八一八−Ｔ−ＴへＣへ）が合成され二重型りおよびＥと結合された。この 後に、結合生成物はＥｃｏＲＴによって消化され、β−エンドルフィン用の正し い読みの枠組みを備えた１１８塩基対二重型を生み出した。これらの二重型は、 ヒトβ−エンドルフィン用およびその［Ｌｅｕ　５　］　類似体用として、それ ぞれＦおよびＧと名付られた。二重型り、　Ｅ、　Ｆ、およびＧを合成するのに 実施されデオキシオリゴヌクレオチド（Ｉｎモル）　（３４μ７りは、　ＨＥＰ ＥＳ　（ｐＨ７，６）　５０　ｍＭ、ＭｇＣ＋２１０　ｍＭ、　ＤＴＴ　１０　 ｍＭ、およびＣｒ　３２−Ｐｌ　ＡＴＰ　（２ｎモル、　ｋｋｙＪ３ＪＨ能−２ −５ｘｔｏ　３ｃｐｍ／ｐモル）に熔解され、Ｔ４−ポリヌクレオチド・キナー ゼ１単位と共に３７℃で０分に渡ってインキュベートされた。反応混合物は５分 間に渡って７０℃に暖められ酵素が付活された。結合反応には、リン酸化デオキ シオリゴヌクレオチドがそれ以上の精製を行わずに直接使用された。下記の説明 においては、（５’−３２ｐ）は、デオキシオリゴヌクレオチドの５゛末端に放 射性標識を付けたリン酸塩を意味する。　（５’−３２３の接頭辞が無い断片が 示された場合は叩ち、　ＩＥｎ　）　、この断片は５′リン酸塩ではなり５゛ヒ ドロキシル基を含む。 Ｂ、二重型」を形成す盗人φΦ逝片」堕□６Ｅｎ　７Ｅｎ　および８Ｅｎの　・ （５’　−３２ｐ）　５Ｅｎおよび（５’−３２ｐ）　６Ｒｎ　（それぞ瀾Ｏｐ ％ル）は、１．５　ｍ　ＩＩの工７ベンドルフ管のなかで凍結乾燥された。デオ キシオリゴヌクレオチドは、　５０ｍＭ　ＢＥＰＥＳ　（ｐＨ７，６）　、１０ 　＋ｏＭ　ＭｇＣｌ２．および１０　ｓＭ　ＤＴＴの３０μＡに溶解された。第 ２の管のなかで、　〔５’　３２　ｐ）　７Ｅｎおよび（５’−３２ｐ）　８Ｅ ｎ　（それぞれ９部モル）は同じ緩衝液間μＥに溶解された。２つの管はそれぞ れ沸騰水のなかで１分間暖められ室温までゆっくりと冷却された。２つの混合物 は一緒にされ容量は上記の緩衝液を用いて１００μｌに調整された。 溶液は次に６℃で２分間暖められ　４℃に冷却された。八↑Ｐの濃度は１５０Ｒ ＩＭに調整されたに渡ってインキュベートされた。反応は、７Ｍ尿素を含むトリ ス−硼酸緩衝液（ｐＨ８，０）を用いて１２％ポリアクリルアミド・ゲルの上で 電気泳動をおこなってモニターされた。１１寺間後に１反応は完了したものとさ れ３反応溶液は二重型Ｂを調製するのに直接使用された〔５°−３２’ｐ）　３ Ｅｎおよび（５’−３２ｐ）　４Ｅｎ　（それぞａ５００ｐモル）は、　５０１ １Ｍ　ＨＥＰＥＳ　（ｐＨ７，６）　、　、１０　＠ＭＭｇＣ１ｚ　、および１ ０　ｍＭ　ＤＴＴの父μｌに熔解された。混合物は沸騰水浴のなかで１分間暖め られ室温までゆっＫりど冷却された。次にこの溶液は二重型りを含む結合混合液 に移された。この−緒になった溶液は４０：Ｃに２分間暖められ、４℃に冷やさ れた、ＡＴＰ濃度は１５０ｕＭに調節され、　１．Ｍ　ＤＴＴ　２．Ｌｌ　１． が加えられた。Ｔ４−　ＤＮＡリガーゼ５ｔＰＬ位を追加した後に９反応混合物 は４℃で１珊に渡ってインキュベートされた。アリコート（０，５μｌ）が１２ ％ポリアクリルアミド・ゲノ吐の電気泳動によりて分析された。この分析の結果 は、二重型Ｂが形成されたことを示した。二重型Ｂは、緩衝液として１０　ｍＭ 重炭酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ７，５＞を用いるセファデックスＧＩ５０ 　／４０　（２８ｘ０．５　ｅｌｌ）上のコラム・クロマトグラフィーによって 元の材料および種々の中間生成物から分離された二重型Ｂ　（１８０咥ｌし）は 、鵠−１１２ＰＥｓ　（ｐＨ７，６）　、　１０　ｍＭ　ＭαＣ１２、およびｌ ｏｄ叶Ｔのｎμｌに熔解された。第２の管の中で、（５°−３２ｐ）　９Ｅｎお よび１０Ｅｎ　（それぞわＪ６０ｒｔ−ル）が、　５５　ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　μ ＋　１１　ｍＭ　ＭｇＣｌ２および１１　ｍＭ　ＤＴＴ　（２２／’　ｌ＞に熔 解さａｉ液は沸騰水浴の中で１分間暖められた。室温まで冷却した後に、溶液は 二重型Ｂを含む管に移された。この−緒になった溶液は４５℃に５分間暖められ 、それからゆっくりと４℃に冷やされた。次に、最終濃縮物２５０．ｔ＋ＭにＡ ＴＰが加えられた。ＩＩ′ｌ［ｌＴＴ　１μｉおよびＴ４−リガーゼ５華位を加 えた後に１反応混合物は４℃で１流に渡ってインキュベートされた。了りコート （０，５μｌ）がポリアクリルアミド・ゲル上の電気泳動によって分析された。 この分析ｔｙ＞Ｎｎは、二重型Ｃが形成されたことを示し、た。 Ｅ、ニ　ノＤ　３　るための　二　Ｃ）Φ断片威酌惇度氷妊ｈ−ｈよび＝亜型上 を駿文支ξな屹＠−＝重型−ｐ重ｌ股よグ礼匣Φ酵素的接合二重型Ｃを含む結合 混合液（５０１りはそれぞれ２５μρづつの同量に分けられた。　〔５゛−３２ ｐ）　２ＥｎおよびＩＥｎ　（それぞれ１８０ｐモル、上記のように既にアニー リングされたもの）が１つに加えられた。（５’−３２ｐ）　２’Ｅｎおよび１ °Ｅｎ（それぞれ１８０ｐモル、上記のように既にアニーリングされたもの）が もう１つのものに加えられた。これらの反応混合液は訂°Ｃで２分間暖められ、 それからゆっくりと４℃に冷やされた。容管に７４−　ＤＮＡリガーゼ（５単（ ｆｆ、）が加えられ、結合混合液は４℃で１晴に渡ってインキュベートされた。 アリコ−）（０，５μｍ）が取られ、ポリアクリルアミド・ゲル上の電気泳動に よって分析された。正しい二重型が形成されたように思われた。結合混合液は、 緩衝液として１０ｍＭ重炭酸トリエラルアンモニウムを用いるセファデックスＧ Ｉ５０　／４０　（２８Ｘ０．５　ｃｎ）コラム上で塩分を除去された。このス テップは、結合混合物から元のモノマーも除去するが、未反応のＣ等の中間二重 型は除去しない。二重型０およびＥの計算収量はそれぞね、４５ｐモルおよび４ ２ｐモルであった。 Ｆ、二重型昔趣支釘メ捜ユ；Ｅ１ヒ９逝ｌ■ｎｇ泗鎚蔗合二重型Ｄ　（８ｐモル ）および断片１１ｅｎの５００ｐモルは、Ｃｒ−３２’ｐ）　ＡＴＰ　（２ｐモ ル）およびＴ４−ポリヌクレオチド・キナーゼ（１単（のを用いてリン酸化され た。反応混合液は、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、　１０　ｍＭ　ＭｇＣｌ２　、およ び１０　ｍＭ　ＤＴＴを含んだ。３７℃に部分量保った後に１反応混合液は６５ ℃に巧分間暖められ１それからゆっくりと４℃に冷やされた。　Ｔ４−　ＤＮＡ リガーゼ（５単（のおよび１？ｌ　ＤＴＴ　（０，５μｐ）が加えられ、混合物 は４”Ｃで１５時間に渡ってインキュベートされた。ＤＮＡはそれからＩ　酢酸 ナトリウム（３μｌ）およびエタノール（５００μ４）を加えて沈澱させられ、 −２０℃で一晩置力）れた。上澄み液は廃棄され、殊郭よ、２０１トリス−塩酸 （ｐＨ７，５）　、　７　ｎＭ　ＭｇＣｌ　２　、２　ｍＭ　２−メルカプトエ タノール、および閣ｍＭ　ＮａＣ１２００／ｊ　ＩＩに再熔解された。ＥｃｏＲ Ｉ　（５０単ｆｍが次に加えられ１反応は３７℃で４時間に渡っ７℃世れた。１ 時間毎にアリコートが取られ　ポリアクリルアミド・ゲル上での電気泳動によっ て反応の進捗度がモニターされた。４時間後に１反応は完了した。ＥｃｏＲＩ反 応混合物はそれから６５℃に５分間暖められ、それからセファデックス１５０／ ４０コラム上で塩分を除去された。二重型Ｇは、二重型Ｅおよび断片１１Ｅｎを 用いて同様な手順により調製出来る。 二重型ＦおよびＧは１それぞれプラスミドＭ１３ｍｐ８およびＭ１３＋ｎｐ７を 用いて」、並旦内でクローニングされた。これらのプラスミドはヘセスダ・リサ ーチ・ラボラトリーズ・Ｉｎｃがら入手された。二重型の提案された構造は、ク ローニングされたＤＮＡの配列を調べることによって確認された。配列を調べた 結果、二重型Ｆの頭鎖は下記の配列を持つことが確認された。即ち。 八−八　Ｔ−Ｔ−Ｇ−八−＾−Ｔ−丁シー八　八へＴ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｃ 丁−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ− Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Ａ４−＾−八へＧ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−へ一（、−Ｔ− Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−へ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ手へ− 八−Ｇ−Ａ−八−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ　Ａ　Ｔ　Ｃ−＾　Ｔ−Ｔ−＾−へ−［、−Ａ −へ−Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−八−Ｃ−八−Ａ−Ｇ−Ａ−＾−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｇ −八−＾−Ｔ−Ｇ−八−Ｔへ八−Ｇ−へ−Ａ−Ｔ−Ｔ−Ｇ−Δ−八へＴ−丁−Ｃ ０ さらに二％３＋＋（Ｈの備徂ま下記の配列を持つことが確認された。即ち。 八　へ手丁−６−八−八−Ｔ、、Ｔ−Ｃ−Ａ−＾−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｇ −Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ −Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−Δ−八へ八へ八へＧ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−＾−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ −Ｃ−Ｃ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ −八−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｃ−ＧＣ−Ｔ−＾手Ｃ−＾−Ｔ−Ｔ−＾−＾−Ｇ−へ− 八−Ｔ−β−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−八−Ａ−Ｇ−八−八−ＧへＧ−Ｇ−Ｃ−Ｇ− Ａ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−＾−Ｇ−八−へへＴ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ｔ−に Ａ９まで述べた手順は、Ｌし如実こ長い二重型領域と比較的に短い一本鎖領域と を含り二本鎖陽配列の幾分か順次的な組み立てにかかわるものであるが、一本鎖 領域の塩刀廼＆ｌＪの変種をざっと朋べると、全接合手順は単一の「散弾銃３反 応で１千うことが可能であること力と分力する６ 下記の例は、上記の二重型Ｅを微生物トランスフオーメインヨン・ベクターに挿 入する１訛前ｊ木の−、ククーのＥ、　ｃｏｉｉ宿主細胞のトランスフオーメイ ンヨンにおける使用、トランスフオームされた」、鉋細胞の適切な栄劉紀４功下 での増殖１培養された細胞からの融合蛋白質生成物の分離１および発現されたβ ｈ　−（Ｌｅｕ　５　）　−ＥＰの分離と生物学的活性の試験侶列示する。 ５１例 発現のために選ばれたベクターは、　ｐＢＲ３２２の全部から小さなＨｉｎｄｌ ｌｌからＥｃｏＲＩまでの断片を差し引いたものを利用するｐＢＲ３２２／λｐ ｌａｃ誘導体であった。それはβ−ラクタメーゼのためのプロモーター領域をも 含む。このベクターはｐＢＲ−１ａｃと名付られた。このベクターはＥｃｏＲＩ を用いて切り出され、二重型ＥはそれにＴ４リガーゼを用いて結合されて、　Ｂ ＥＬｌと呼ばれるハイブリッドを形成した。発現は、Ｉ）ＢＲ−１ａｃおよびＢ Ｐ、Ｌ　ｌによってトランスフオームされた」、９旦細胞をＡＭＰ　（２０μｚ ／ｍｅ）プレート上で一晩増殖させ、単一・のコロニーを（、培養基１（１ｍ！ に取って、３７℃で２５０〜３００　ｒｐｍの７エイカー内で８時間に渡って増 殖させることによって実証された。８弓ボ１賂養物を段！１前りに薄めたもの力 勺、プレートおよびＡＭＰ〕゛レート（２０ｘ１ｇ　／　Ｊ＞に置かれで、プラ スミドの損失力９＋量された。 両タイプの５ミリリツトルの細胞が遠ｒＬ’ｙ＋離され、ベレノｌ−は７０％蛯 酸／臭化ンアン（５ｍε／ｍ６）に再懸濁さ油℃において３０〜４０時間放置さ れた。サンプルは洗われ、凍結乾燥され、そして１ｍ６の酢酸に再懸濁された。 適切に調製されたづンブルには、ヒトβ−エンドルフィン（キット番号１６００ ．イミュノ　ニー１−クリ−？−コーポレーション１　ミネソタ）のラジオイミ コノ７．ノセイがなされた。負の対照く蛋白質無ドアのもの、および非パイプリ ッド　ヘクク一一二よってトランスフオームさねた一Ｅ、　ｇ０１λの蛋白質） は、　ｌ　１２５の標識１”ｌｔすた標準への抗体の結合を殆どあるいは全く阻 止しなかった。一方、　ＢＥＬ　Ｉ　）ランスフォーカされた細胞の蛋白質は、 標準曲線のし７ンから遥かに離れていた。 こねまで述べた例はβｈ　−ＥＰ　７１のただ１つのポリペプチド類似体の調製 を例示し７ているが２本発明は１つ以上のアミノ酸の種類あるいは相対的位置が 正真の蛋白質表両なる数多（のその他の丈μ叫イ・の調製の基礎を↑眉共するも のであることは明らかである。そのような類１り体の例はβｈ　−［Ｔｒｐ　２ ７）−ＥＰであり、それは、１．１等の論文、祠局において、ｊＥ真の蛋白質と 比較してより優れた鎮痛薬効を持ち、且つレセプター結合活性がより低いと指摘 されている。この怖具体の調製は、正真のβ「・−ＥＰの合成のための且己の一 ５′順によって達成することが可能である。ただ一つの例外は、断ハ９Ｅｎ苓調 梨するときに６４３　コ１ン１’ＧＧがコドンＴＡＣに代わることである（例え ば、断ｇ９Ｈｒ、　４）最初の５ヌクシ・セチｌがＴＴＡＣＡてはなくてＴＴＧ ＧＡとなることである）。断μ８Ｅｎ内の塩’９ｉ′、列のり１応ずＬ変更乃魂 されることになる。 本発明の生成物および／あるいはそれらの抗体は適切にｒ札を付けるＪことが可 能であり１例えば、酵素と結合されて放射性標識を付けるかく例えば、　ｌ　１ ２５を用いて）、あるいは螢光性標識を（４１Ｊるがして１体液サンプルのなか に存在する前述の生成物および／あるいは前述の抗体の定性的および／あるいは 定量的な湧１ｊ定のためのアッセイおよび／ある四訂侶折試験キットに有用頓茫 奢をもたらず。前述の抗体は１つ以トの動物種（（＋ｌｌえば。 マウス、ラビット、ヤギ、ヒト等）の接種あるいはモノクローンの抗体源から入 手出来る。前述の試薬材料はいずれも単独で、あるいは適切な培養基と共に１例 えばガラスあるいはプラスチックの粒あるいはビーズ上に塗布されたものと共に 使用することができる。 これまで述べた具体例を考慮すれば本技術に熟達された方々は本発明の実施の数 多くの改善あるいは変更を思いつかれるものと思われる。従って１本発明は添付 する請求の範囲に反映される範囲においてのみ限定されるもの見なされるものと する。 国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ヌクレオチド塩基から直線状の二本鎖ＤＮＡ　耐浸１を合成する方法で、下 記の２つのステップ、即ち。 （１）２つ以上の異なる直線状の二重型ＤＮＡ鎖剖貼皮するステップで、各二重 型鎮は１２にｌ上の選択された相補性塩基対の二本鎖領域１つを含み、さらに鎖 の一端に３つから７つの選択された塩基の頭一本鎖終未配列および／あるいは鎖 のもう一端に３つから７つの選択された塩基の尾一本鎖終末五ツリを含み、各二 重型ＤＮＡ鎮の各一本鎖終末九ｊＩＪは調製された他の二重型ＤＮＡ鎖のせいぜ い１つの一本鎖終未配列の全塩基相補体を含むもの、そして （２）ステップ（１）で調製された各二重型ＤＮＡ鎖を相補性の一本鎖終未配列 を持つステップ＋１１で調製された１つあるいは２つの異なる二重型鎖にアニー リングするステップで、それによって、単一の連続的な二本鎖ＤＮＡ配列を形成 し、この配列はステップ（１）で調製された二重型ＤＮＡ鎖の一一本鎖終末伍ツ リの相補性会合により形成された少なくとも３つの塩基対を含む少なくとも２７ の選択された塩基対から成る二重型領域を持ち、且つ３つから７つの塩基の一本 鎖頭あるいは尾終末領域を０から２つ持つものから成るもの。 ２、請求の範囲第１項の方法で、少なくとも３つの異なる二重型ＤＮＡ鎖がステ 、ノブｉｌ＋で調製され月つそのようにｍ製された全ての鎖が司時に単一のアニ ーリング反応混合物の中でアニーリングされて単一の連続的二本鎖ＤＮＡ翫７１ Ｊを形成し、前述の配列がステップ（＋１で調製された二重型鎖の一本鎖終未配 列の相補性会合によって形成された３つ以上の塩基対の少なくとも２つの互いに 隣接しない七ノドを含む少なくとも４２の選択された塩基対から成る二重型領域 を１つ持つもの。 ３　請求の範囲第１項の方法で、二重型１踊鎖調製ステツプ（１）が下記の２つ のステップ。 即ち。 （ａ）１５以上の塩基を選択された直線４がびり内に持つ第１および第２の直線 状のデオキシオリゴヌクレオヂドを構成するステップで、前述の第２の断片の直 線状塩基配列が前述の第１の断片の塩基配列の金相補体から成り、前述の第２の 断片の少なくとも一端は、前述の第１の断片を完全に相補するものに加えて３つ から７つの選択された塩基の追加直線状の酊ツリを含むか、あるいは前述の第１ の断片の終未配列に相補する３つから７つの塩基の直線状の配列を欠くかの何れ かであるが。 但し、前述の第２の断片は塩基の追加の配列を持たないものとし、あるいはその 両末端に塩基の＠びりを欠（ことがないものとするもの、および（ｂ）前述の第 １および第２の断片を断片間の相補性会合を促進する釧判こおいて組合せて直線 状の二重型ＤＮＡ鎖を形成するステップから成るもの。 全構造遺伝子から成るもの。 ５、請求の範囲第４項の方法で、形成される二本鎖ＤＮＡ　６汐すにおいて、塩 基の龜５１Ｊが、予定の宿主微生物内でのコドンの優先的発現特性に基づいて５ 同しアミノ酸を仕様する代替コドンから選択された１つ以上のコドンを含むもの 。 ６、選択された宿主微生物内においてヒトβ−エンドルフィン蛋白質の合成を司 る能力をンの（（詞的発現特性に基づいて、同しアミノ酸を仕様する代替コドン から選択された１つ以上のコドンを含むもの。 ８、請求の範囲第７項の製造された遺伝子で、塩基伍９１Ｊか、」、薊内でのコ ドンの優先的発現用土に基づいて、同しアミノ酸を仕様する代替コドンから選択 された１つ以上のコドンを含むもの。 ９、請求の範囲第６項の製造された遺伝子で、塩基配列が５頭鎖の５゛リン酸塩 末謳；で始ま・す、下記の翫汐ＩＪ、即ち。 Ｔ−＾−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ− Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−八−八−八−八−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ、Ｃ−八−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｔ− Ｃ−Ｃ−八−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ａ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ｔ−Ｔ−Ｔ− Ａ−八−６−八−Ａ−Ｃ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−八−Ｔ−、Ｃ−＾−Ｔ−Ｔ−八−八−Ｇ へＡへ　Ａ　Ｔ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−八−Ｃ−八−Ａ−Ｇ−八−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ− Ｃ−Ｇ−八−八−Ｔ−Ｇ−八−Ｔ−へ−Ｇ−＾−へを含み、層剤よその相補体で あるもの。 １０、請求の範囲第６項の製造された遺伝子を含む融合遺伝子で、正真のヒトβ −エンドルフィン蛋白質を含む融合蛋白質の合成を司ることを融合遺伝子に許す 仕方で第２の蛋白質の合成を司る能力を持つ第２の遺伝子に融合されたもの。 １１、請求の範囲第１０項の融合遺伝子で、前述の第２の遺伝子がβガラクトシ ダーゼあるいはβ−ラククメーゼ酵素の合成を司る遺伝子であるもの。 １２、請求の範囲第６項の製造された遺伝子を含む生物学的聞能ＤＮＡ微生物ト ランスフォーメイション・ヘククー。 １３、請求の範囲第１０項の融合遺伝子を含む化生が宵ｎ幾能ＤＮＡ微生物ｌ・ ランスフメーメイション・ヘククー。 】４．請求の範囲第１２項あるいは第１３項の生物学的機能ＤＮＡ　）ランスフ ォーメイション・ヘクターで１１Ｊ４火ＤＮＡフ“ラスミドであるもの。 １５、ヒトβ−エンドルフィンの製造のプロセスコ、適切な沫１彰Ｈ牛下で生物 学的機能ＤＮＡによってトランスフズームされた微生物を増殖することを含むも ので、前述のＤＮＡは請求の範囲第６項の製造された遺伝子を含め、それによっ て前述の微生物は前述の遺伝子を発現しヒ１−β−エンドルフィン蛋白質を生成 するもの。 】６．請求の範囲第１５項のプロセスで、増殖される微生物がＥ、　ｃｏｊｉｉ 放生物であるもの。 １７、ヒトβ−エンドルフィンの製造のプＩ７セスで、適切な栄粋牛下で、請求 の範囲第１０項の融合遺伝子を含む生物学的機能ＤＮ＾によってトランスフオー ムされた微生物を増殖することを含むもので、それによって前述の微生物は前述 の融合遺伝子を発現し１１のヒ］・β−エンドルフィンを含む肴石斧蛋白質を生 成するもの。 １８、蛋白質生成物の合成を司る能力のある製ｊ告された遺伝子で、前述の蛋白 質生成物が正真のヒトβ−エンドルフィン蛋白質と、ヒトβ−エンドルフィンア ミノ酸配列１１２Ｎ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−５ｅ ｒ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｇ　１ｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｔ ｈｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Δ１ａ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−八 Ｉａ−Ｔｙｒ−１，ｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−ＣＯＯＩＩ内の１つ以」− のアミノ酸のイを頭あるいは相対イカ置の点で異なるもの。 １９、請求の範囲第１８１’Ｍの製造された遺伝子で、馬用配列が、予定の宿主 微生物内でのコドンの優先的発現特性こ基づいて、同しアミ、・「俊を仕様する 代替コ１ンから選択された１つ以上のコドンを含むもの。 ２０、請求の範囲第１９項の製造された遺伝子で、塩１！ａが、」、イ内でのコ ドンの優先的発現特性に基づいて′同じアミノ酸を仕様する代替コドンから選択 された１つ以上のコドンを含むもの。 、２１．請求の範囲第１田頁の製造された遺伝子で、塩Ｗ１１が１頭鎖の５”リ ン酸塩末端で始まり、下記の配列１即ち。 Ｔ−Ａ−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｃ−Ｔ−Ｔ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｃ−Ｃ− Ｔ−Ｃ−Ｃ−Ｇ−＾−＾−＾−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｇ−八−Ｃ−Ｔ− Ｃ−Ｃ−＾−に−Ｔ−Ｇ−Ｇ−Ｔ−Ｔ：八−Ｃ−Ｔ−Ｃ−Ｔ−ＴへＴ−Ｔ−Ａ− Ａ−Ｇ−Ａ−八−Ｃ−Ｇ−Ｃ−、Ｔ−＾−Ｔ−Ｃ−Ａ−Ｔ−Ｔ−八−八−Ｇ−八 −八−ＴへＧへＣ−、Ｔ−Ｔ−八−Ｃ−Ａ−Ａ−Ｇ−八−Ａ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｃ− Ｇ−Ａ−八−Ｔ−Ｇ−Ａ−Ｔ−Ａ−Ｇ−Ａ−Ａを含み１尾鎖はその相補体である もの。 ２２、請求の範囲第１８項の製造された遺伝子から成る融合遺伝子で、１つ以」 二のアミノ酸の種類あるいは相対位置の点で正真のヒトβ−エンドルフィン蛋白 質と異なる蛋白質を含む融合蛋白質の合成を司ることを融合遺伝子に許す仕方で 第２の蛋白質の合成を司る能力を持つ第２の遺伝子に融合されたもの。 ２３、請求の範囲第２２項の融合遺伝子で、前述の第２の遺伝子がβガラクトシ ダーゼあるいはβ−ラクタメーゼ酵素の合成を司る遺伝子であるもの。 ２４、請求の範囲第１８項の裂３ｆｉされた遺伝子を含む生物学的機能ＩＷ悄微 生物トランスフメーメイション・ヘクター。 ２５、　請求の範囲第２２項の融合遺伝子を含む生物学的殿能ＤＮＡ微生物トラ ンスフォーメインヨン　ヘクター。 ２６、請求の範囲第２４項あるいは第２５項の生物学的機能１１ＮＡ微生物トラ ンスフメーメイション　ヘククーで、環状ＤＮＡプラスミドであるもの。 ２７．１つ以上のアミノ酸の種類あるいはイ・畝１的位置の点でヒトβ−エンド ルフィンと異なる蛋白質の製造のプロセスで、適切な栄餞牛下で、請求の範囲第 １田頁の製造された遺伝子を含む生物学的機能ＤＮＡによってトランスフオーム された微生物を増殖することを含むもので、それによって前述の微生物は前述の 遺伝子を発現し１つ以上のアミノ酸の種類あるいは＋ＩＭＪ的位置の点で正真の ヒトβ−エンドルフィンと異なる蛋白質を製造するもの。 ２、特許請求の範囲第２７項のプロセスで、増殖される微生物がＥ、　ｃｏｌｉ 微生物であるもの。 ２９．１つり上のアミノ酸の１範頃あるいし、材目対両立置の点でヒトβ−エン ドルフィンと異なる蛋白質の製造のプロセスで、適切な栄養条件下で、請求の範 囲第２２項の融合遺伝子を含む生物学的機能ＤＮＡによってトランスフオームさ れた微生物を増殖することを含むもので、それによって前述の微生物は存■述の 融合遺伝子を発現し１つ以上のアミノ酸の種類あるいは相対的位置の点で正真の ヒトβ−エンドルフィンと異なる蛋白質を含む融合蛋白質を製造するもの。 ３０、請求の範囲第２ツ頁のプロセスで、増殖される微生物が：　Ｅ、　ｃｏｌ ｉ微生物であるもの。 ３１゜請求の範囲第ｒ項の方法に従って製造される蛋白質生成物。 ３２、請求の範囲第２９項の方法に従って製凸される蛋白質生成物。 ３３、請求の範囲第３１項あるいは訝釣２項の生成物で、ヒトβ　−（Ｌｅｕ　 ５　）エンドルフィンであるもの。 ３４、請求の範囲第１ｒ＋４に従って放廿生標識を付けた製造された遺伝子から 成る試薬材料。 ３５、請求の範［３４項の試薬材料で、前述の放射性標識が１１２５であるもの 。 ３６、請求の範囲第２７項に従うポリペプチドの標識付き抗体から成句に菓材料 で５プラスチツク・ビーズの表面に塗布されたもの。